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I N F O R M A C I Ó N

I N F O R M A C I Ó N

I N F O R M A C I Ó N

I N F O R M A C I Ó N

I N F O R M A C I Ó N

José Javier García Medina Oftalmólogo. Doctor en Medicina y Cirugía (Universidad de Valencia). Unidad de Investigación Oftalmológica “Santiago Grisolía”. Hospital Universitario Doctor Peset. Valencia; Hospital La Inmaculada. S.A.S. Huercal-Overa. Almería

Manuel García Medina Oftalmólogo. Doctor en Medicina y Cirugía (Universidad de Cádiz). Complejo Hospitalario Torrecárdenas. S.A.S. Almería

María Dolores Pinazo Durán Oftalmólogo. Doctor en Medicina y Cirugía (Universidad de Valencia). Unidad de Investigación Oftalmológica “Santiago Grisolía”. Hospital Universitario Doctor Peset. Valencia; Hospital Punta de Europa, S.A.S. Algeciras. Cádiz

48 Noviembre 2007

RETINOPATÍA DIABÉTICA Y ESTRÉS OXIDATIVO

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Edita: Domènec Pujades

© José Javier García Medina, Manuel García Medina y María Dolores Pinazo Durán

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ISBN: 84-86600-19-7

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ÍNDICE

Estructura y función de la retina ....................... 4

Cambios en la retinopatía diabética .................. 5

¿Qué es el estrés oxidativo? ............................... 8

La retina como diana del estrés oxidativo .......... 8

Fuentes de los radicales libres en la diabetes ...... 9

¿Por qué son perjudiciales los radicales libres? ... 10

Evidencia de la participación del estrés oxidativo en la retinopatía diabética ............... 13

Estudios de terapias antioxidantes en la retinopatía diabética .............................. 14

Bibliografía ....................................................... 16

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Número 48. Noviembre 2007

AbreviAturAs utilizAdAs eN este Artículo:

ADN Ácido desoxirribonucleico

AGE Advanced Glycation Endproducts o productos finales de la glicación avanzada

AGP Ácido graso poliinsaturado

Ca++ Calcio

DM Diabetes Mellitus

EPR Epitelio pigmentario de la retina

H2O2 Peróxido de Hidrógeno

K+ Potasio

Na+ Sodio

O2•- Anión superóxido

OH• Radical hidroxilo

PKC-ß Proteín kinasa C-beta

RL Radical libre

SOD Superóxido Dismutasa

TBARS Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico

VEGF Vascular endotelial growth factor o Factor de crecimiento del endotelio vascular

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R E T I N O PAT Í A D I A B É T I C A Y E S T R É S O x I D AT I V O�

ESTRuCTuRA Y fuNCIóN DE lA RETINA

La retina se localiza en la superficie interna del globo ocular entre la coroides y el vítreo y está formada por dos capas. El epitelio pigmetario de la retina (EPR) que se localiza externamente y tiene como funciones la absorción de la luz para reducir la dispersión de la misma, la fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores y el reciclaje de rodopsina. La capa más interna es la neurorretina y está formada por una densa red de neuronas modificadas y células de la glía. Las neuronas modificadas son los fotorreceptores, células bipolares y células ganglionares, responsables de la recepción y transmisión de las señales luminosas. Las células de la glía (astrositos y células de Muller) se encargan del soporte metabólico y estructural (Figura 1).

La nutrición y oxigenación de la retina es tributaria de la arteria oftálmica desde dos fuentes (Figura 1). La retina más externa, que corresponde a células del EPR y fotorreceptores (conos y bastones), se nutre por difusión a través de la coriocapilar. La retina más interna es irrigada por los vasos sanguí-neos tributarios de la arteria central de la retina. Las arteriolas y las vénulas están localizadas en la capa de fibras nerviosas (células ganglionares).

Todas las células mencionadas mantienen importantes interacciones entre sí y con las células que forman la microvascularización.

Figura 1. esquema de los cuatro tipos de células retinianas. No aparecen representadas las células circulantes. las flechas del

borde izquierdo señalan el alcance de las corrientes nutricias (desde los vasos retinianos -roja- y desde la coroides -azul-).

Vasos retinianos

NEURONASCélulas ganglionares

Células bipolares

Células horizontales

Fotorreceptores

Células gliales

Astrocitos

Células de Muller

MicroglíaN U

T R

I C

I Ó

N

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CAmBIOS EN lA RETINOPATÍA DIABÉTICA

La microvascularización retiniana está compuesta por células endoteliales que se localizan en el interior de una membrana basal. Dicha membrana basal está a su vez rodeada de una capa de pericitos (Figura 2).

Las células endoteliales de la vascularización retiniana y las células del EPR constituyen barreras (barreras hematorretinianas interna y externa, respectivamente) que restringen el movimiento de líquido y moléculas desde la luz vascular hacia el tejido retiniano. En el desarrollo de la retinopatía diabética la microvascularización sufre cambios progresivos. Se puede dividir el desarrollo de la RD en dos etapas: la no proliferativa y la proliferativa.

La lesión histopatológica detectable más temprana en la RD no proliferativa es la pérdida de pe-ricitos1. Este hecho parece tener consecuencias importantes como un aumento de la proliferación de las células endoteliales y una alteración del soporte y la contractilidad vascular, dando lugar a los microaneurismas (Figura 3).

Figura 2. los capilares están estabili-

zados por la presencia de pericitos.

cuando estos pericitos desapare-

cen se forman microaneurismas (no

mostrados), el endotelio pierde sus

funciones, aparecen capilares acelu-

lares (compuestos sólo por membra-

na basal engrosada), oclusiones ca-

pilares por proliferación de células

endoteliales y, si los estímulos como

el veGF están sobreexpresados,

neovasos. Nótese el engrosamiento

de la membrana basal.

Figura 3. dilatación sacular del capi-

lar por pérdida de pericitos.

Célula endotelialMembrana basal

Pericito

ESTABLE INESTABLE

NEOVASOS

CAPILAR ACELULAR

OCLUSIÓN CAPILAR

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R E T I N O PAT Í A D I A B É T I C A Y E S T R É S O x I D AT I V O�

El crecimiento de las células endoteliales está afectado en el curso de la retinopatía diabética de dos maneras diferentes. Mientras que generalmente se observa una multiplicación acelerada de estas células que conduce a la obliteración de los capilares por una reducción de su luz en ciertos microvasos, se observa una disminución de células endoteliales por apoptosis que conduce a la formación de tubos capilares acelulares de membrana basal desprovistos de células2 (Figura 2).

Las células endoteliales también pierden progresivamente sus funciones en el curso de la retino-patía. De esta forma, las uniones intercelulares endoteliales, normalmente compactas, adquieren cierta laxitud que contribuye a la ruptura de la barrera hematorretiniana3. Tal fenómeno da lugar a la difusión de lípidos (exudados duros), sangre (hemorragias) y líquido (edema) (Figura 4). Si el edema afecta la mácula se produce una pérdida de agudeza visual.

Se constata asimismo un engrosamiento marcado de la membrana basal4. Este cambio puede con-tribuir a alterar la comunicación de las células endoteliales y los pericitos, la difusión de nutrientes (como el oxígeno), la contractilidad capilar o la adecuada interacción celular con las proteínas constituyentes de la membrana basal.

Figura 4. resumen de las lesiones macroscópicas que aparecen en la retinopatía diabética.

Vítreo

Neovasos

Microaneurisma

Hemorragias

Exudado

Retina

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Por otro lado, recientes estudios indican que la hiperglucemia desencadena un aumento de los factores contráctiles derivados del endotelio (Endotelina-1 y productos de la ciclooxigenasa) y una disminución de los factores relajantes derivados del endotelio (Óxido nítrico, prostaciclina y factor polarizante derivado del endotelio)5. De hecho, los pacientes diabéticos sin retinopatía tienen un flujo sanguíneo retiniano disminuido respecto a sujetos no diabéticos, lo que puede contribuir a la oclusión vascular6,7. Sin embargo, conforme se instaura la retinopatía y ésta avanza hacia la neovas-cularización, el flujo sanguíneo retiniano se encuentra por encima de lo normal de forma propor-cional al grado de retinopatía (predomina la vasodilatación). La principal causa de este fenómeno parece ser la hipoxia, ya que tras la panfotocoagulación se reduce el flujo sanguíneo retiniano8.

También aparece un estado de proagregación plaquetaria y adherencia de leucocitos contribu-yendo junto con la proliferación endotelial y a la disminución del flujo sanguíneo retiniano a la oclusión de los capilares9. Van apareciendo, por tanto, áreas localizadas de isquemia tisular que ocasionan una sobreproducción de factores de crecimiento (como el VEGF).

Estos factores estimulan la formación de neovasos en un intento de compensar la isquemia. En-tonces nos encontramos ante la etapa de RD proliferativa.

Los neovasos son frágiles, permeables y pueden crecer hacia la cavidad vítrea creando tracciones (Figura 4). Por tanto, la visión en este estadio está comprometida por las hemorragias vítreas, el ede-ma por fugas vasculares y el desprendimiento traccional de retina. La rubeosis iridis y el glaucoma neovascular acontecen por la formación de estos neovasos en el iris y en el ángulo de la cámara anterior10.

El daño de las células neuronales y gliales se produce en las etapas tempranas de la RD no prolife-rativa y se ha propuesto que puede ser incluso la causa de la aparición de las lesiones vasculares11. La pérdida neuronal y glial se traduce en pérdidas en la visión del color12, de la sensibilidad al contraste13 y de la pérdida de adaptación a la oscuridad en el electrorretinograma de pacientes diabéticos14,15.

A pesar de la mejoría en el control de la glucemia y de la presión arterial, la incidencia de ceguera en pacientes diabéticos ha ido progresivamente al alza en los últimos años16. La técnica establecida para el tratamiento de la RD es la fotocoagulación por láser, un procedimiento que disminuye la fuga vascular y revierte la neovascularización17. Este método es beneficioso pero se asocia a la des-trucción irreversible de la retina saludable y la pérdida del campo visual de la zona tratada.

Otras terapias preventivas, como la administración de antioxidantes para disminuir el estrés oxi-dativo, están emergiendo con resultados prometedores.

Retina

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R E T I N O PAT Í A D I A B É T I C A Y E S T R É S O x I D AT I V O�

¿QuÉ ES El ESTRÉS OXIDATIVO?

El estrés oxidativo se define como un exceso de formación y/o una insuficiente neutralización de moléculas altamente oxidantes denominadas radicales libres (radical superóxido, hidroxilo, peroxilo, hidroperoxilo, oxígeno singlete, óxido nítrico…) y de las moléculas inestables que dan lugar a radicales libres (peróxido de hidrógeno, peroxinitrito…). Se trata por tanto de un des-equilibrio entre moléculas prooxidantes y antioxidantes (superóxido dismutasa, catalasa, glutation peroxidasa, Vitaminas C y D, glutation…) (Figura 5).

lA RETINA COmO DIANA DEl ESTRÉS OXIDATIVO

La absorción de luz por las moléculas fotosensibilizables conduce a reacciones fotoquímicas con la formación de radicales libres como el oxígeno singlete y radicales superóxido18. En la retina, la presencia de moléculas fotosensibilizables19 se combina con la prolongada exposición a energía ra-diante, períodos de elevada actividad metabólica20 y elevado consumo de oxígeno21. Todo ello crea un ambiente en donde la producción de radicales libres es elevada y donde el nivel de sustratos del daño oxidativo es alto. En concreto, las membranas de los fotorreceptores son ricas en ácidos grasos poliinsaturados (AGP), particularmente en ácido docosahexaenoico, haciendo a estas célu-las muy susceptibles al daño por peroxidación lipídica (PL). De hecho, en la incubación de células retinianas en condiciones de alta glucosa se han demostrado cambios en los niveles de AGPs22 y un aumento de la PL23.

Figura 5. el estrés oxidativo es un disbalance entre las sustancias antioxidantes y los radicales libres.

ANTIOXIDANTES - Superóxido Dismutasa - Catalasa - Glutation Peroxidasa - Vitamina C - Vitamina E - Glutation

RADICALES LIBRES - Anión Superóxido - Peróxido de Hidrógeno - Radical Hidroxilo - Oxígeno Singlete

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fuENTES DE lOS RADICAlES lIBRES EN lA DIABETES

La hiperglucemia puede inducir una producción incrementada de radicales libres por varios meca-nismos:

1) El exceso de glucosa altera el sistema transportador de electrones en el ciclo del ácido tricar-boxílico (respiración mitocondrial), lo que da lugar a un exceso de producción de anión supe-róxido (O2•-) en la diabetes. En concreto la hiperglucemia bloquea el complejo III de la cadena transportadora de oxígeno causando un reflujo de electrones hacia el coenzima Q, que los dona al oxígeno generando radicales superóxido24 (Figura 6).

Se ha postulado recientemente que este fenómeno desencadena por sí solo la activación de

las cuatro vías etiopatogénicas que se asocian a las complicaciones en la diabetes: la vía de los polioles, la vía de la hexosamina, la generación de productos finales de la glicación avanzada (AGE) y la activación de la proteín kinasa C (PKC). Por tanto, hoy en día se considera el estrés oxidativo como el primer paso en los mecanismos que conducen a las complicaciones micro-vasculares y macrovasculares en la diabetes25-28.

2) Por otro lado, la glucosa puede ser autooxidada mediante una reacción catalizada por metales de transición en la cual se producen aniones superóxido (O2•-) (Figura 7)29. Éstos son precurso-res del peróxido de hidrógeno (H2O2) y del radical hidroxilo (OH•), muy reactivo, que puede dañar proteínas, lípidos o ácidos nucleicos.

3) El estrés oxidativo no sólo es desencadenante de la otras vías etiopatogénicas en las diabetes.

También se producen radicales libres como consecuencia de la activación de la vía de los polio-les, de la activación de la PKC y de la acción de los AGEs, con lo que se perpetúa y amplifica el círculo vicioso30.

Figura 6. la hiperglucemia induce el

bloqueo del complejo iii (cruz roja).

los electrones, que no pueden avan-

zar de forma normal (línea azul on-

dulante fina) retroceden al coenzima

Q (Q), que los cede a un átomo de

oxígeno (flecha azul gruesa), gene-

rándose los radicales superóxido.

RADICAL SUPERÓXIDO

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R E T I N O PAT Í A D I A B É T I C A Y E S T R É S O x I D AT I V O10

¿POR QuÉ SON PERjuDICIAlES lOS RADICAlES lIBRES?

Los radicales libres en condiciones fisiológicas funcionan como moléculas de señal intra e intercelu-lar, como mecanismos de defensa en la fagocitosis y como reguladores de la respuesta biogénica vas-cular. Sin embargo, en altas concentraciones pueden dañar lípidos, proteínas y ácidos nucleicos31.

Todas las membranas celulares, mitocondriales y del retículo endoplásmico son vulnerables a la oxidación debido a su alta concentración de AGP, especialmente en segmentos externos de los fo-torreceptores. Los AGP tienen sus dobles enlaces separados por grupos metileno, lo que hace que las uniones C-H sean extremadamente sensibles a la agresión por los RL.

La membrana mantiene la integridad de la célula y constituye una barrera para los iones, permi-tiendo mantener de forma activa un gradiente adecuado para que la célula no muera.

Lípidos

Proteínas

Ácidos nucleicos

Hidroxi-aldehído(ejemplo: glucosa)

Enediol

Radical enediol

Dicarbonilo

Proteína glicada

Proteína

Mn+

M(n-l)+

O2•–

O2

H2O2

OH O

R – C – C – H

H

OH O–

R – C = C – H

O– O–

R – C = C – H

O O

R – C – C – H

OH•

Figura 7. Autooxidación de la glucosa.

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11

De hecho los enzimas citoplasmáticos requieren una baja concentración de Na+ y Ca++ y una alta concentración de K+. Esto es tan importante que en todas las células una cantidad significativa (hasta el 50 %) de la energía producida se utiliza para mantener los gradientes iónicos de Na+, K+ y Ca++ a través de la membrana celular y a través de las membranas intracelulares. Esto se consi-gue principalmente mediante dos sistemas de bombas que consumen energía. El sistema Na+K+-ATPasa transporta continuamente sodio fuera de la célula y potasio dentro de ella. El otro sistema transporta también de forma activa Ca++ fuera de la célula (Figura 8).

Sin embargo, cuando la integridad de la bicapa lipídica está alterada por la lipoperoxidación lipídi-ca (daño por los radicales libres) dicho gradiente no se puede mantener (Figura 9), desencadenando cambios estructurales y funcionales severos (Figura 10).

Por otro lado, las proteínas son alteradas por los RL mediante fragmentación, entrecruzamiento y agregación de sus aminoácidos. También los ácidos nucleicos se ven afectados por el estrés oxi-dativo mediante fragmentaciones, delecciones y mutaciones en la cadena de ADN. Todas estas alteraciones pueden desencadenar una muerte celular no fisiológica (necrosis).

Sin embargo, los RL también pueden inducir una muerte celular programada y fisiológica (apoptosis) mediante la activación de las caspasas o proteínas de la familia BCl-2 según estudios recientes32.

Figura 8. Flujo de la célula sana. el

citoplasma es rico en potasio (K+)

y pobre en sodio (Na+) y calcio

(ca++) gracias a la integridad de

la bicapa lipídica y a bombas que

consumen energía.

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R E T I N O PAT Í A D I A B É T I C A Y E S T R É S O x I D AT I V O12

INFLUJO DE Na+

EFLUJO DE K+

TUMEFACCIÓN CELULAR

INFLUJO DE Ca++

Activación de fosfolipasasdependientes de calcio

Activación de Proteín Quinasas dependientes de Ca++

ALTERACIÓN EN EL CITOESQUELETO Y EN

LOS MECANISMOS DE TRANSPORTE

INTRACELULAR

CAMBIO EN EL ESTADO BIOQUÍMICO DE LA MEMBRANA CELULAR

FUNCIÓN ALTERADA

FLUJO ALTERADO DE IONES

Figura 10. consecuencias del flujo alterado de iones.

Figura 9. la pérdida de la integri-

dad de la bicapa lipídica induce la

pérdida del gradiente.

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EVIDENCIA DE lA PARTICIPACIóN DEl ESTRÉS OXIDATIVO EN lA RETINOPATÍA DIABÉTICA

La producción de radicales libres en los sistemas biológicos es medible. El aumento del estrés oxi-dante en la diabetes ha sido demostrado principalmente por un aumento de los daños causados por los radicales libres sobre proteínas y lípidos. El principal marcador del aumento de radicales libres es el aumento de los productos de la peroxidación lipídica. Varios estudios han evidenciado el aumento de productos de la peroxidación lipídica en la diabetes como los TBARS (Thiobarbi-turic acid reactive substances) o los isoprostanos33,34. El aumento de productos de peroxidación se ha correlacionado con la presencia de microangiopatías35.

En la retina se ha evidenciado un aumento de TBARS en ratas diabéticas35,37. También en el flui-do subrretiniano y en el humor vítreo de pacientes diabéticos se han encontrado niveles altos de marcadores del daño oxidativo38-40.

En el hombre los TBARS séricos se han encontrado significativamente aumentados en pacientes diabéticos que presentan retinopatía en relación a aquellos pacientes diabéticos sin ninguna com-plicación angiopática41.

Paralelamente se ha observado una disminución de las defensas antioxidantes en el curso de la dia-betes. Así se ha descrito una disminución de la capacidad antioxidante plasmática total (antioxi-dantes enzimáticos y no enzimáticos) en los pacientes diabéticos tanto tipo I como tipo II42,43. Así mismo, otro estudio ha demostrado la disminución de la superóxido dismutasa en los individuos diabéticos no insulino-dependientes, así como una reducción de las tasas de vitaminas E y C44.

La disminución de la actividad de las enzimas antioxidantes podría explicarse por la glicación como la descrita para la glutation peroxidasa y la superóxido dismutasa eritrocitarias45,46, la catalasa47 y la gluta-tion reductasa48. Por contra, varios trabajos muestran un aumento de las enzimas antioxidantes como la catalasa o la glutation peroxidasa en los pacientes diabéticos44,49, en ratas diabéticas50 o en células endoteliales incubadas en presencia de altas concentraciones de glucosa51. Estos resultados sugieren un mecanismo compensatorio de los tejidos frente a una producción elevada de radicales libres.

En la retina de los pacientes diabéticos se encuentran también modificaciones de las defensas antioxidantes que se encuentran o bien disminuidas o bien aumentadas probablemente por un mecanismo compensatorio. Así, en la retina de las ratas diabéticas se comprueba una disminución de las enzimas antioxidantes como la glutation reductasa, la glutation peroxidasa, la superóxido dismutasa o la catalasa37,52. Por otra parte, un estudio realizado con pericitos aislados de pacientes humanos con diabetes durante un periodo prolongado demostró que los niveles de superóxido dismutasa y glutation reductasa se encontraban reducidos53.

Además se ha correlacionado con la retinopatía diabética una disminución de los niveles séricos de vitamina C en el hombre41.

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ESTuDIOS DE TERAPIAS ANTIOXIDANTES EN lA RETINOPATÍA DIABÉTICA

En resumen, es patente que existe estrés oxidante en la diabetes puesto en evidencia por un au-mento de marcadores de peroxidación lipídica y una alteración de las defensas antioxidantes.

Estudios recientes que han utilizado antioxidantes inducen una corrección del estrés oxidante que permite atenuar e incluso revertir los efectos vasculares de la diabetes.

La administración oral a ratas diabéticas de Trolox, un antioxidante, ha permitido la conservación parcial de sus pericitos retinianos54. Por otro lado, la utilización de ácido lipoico, otro antioxidan-te, ha permitido mejorar la reactividad vascular y la morfología de los vasos de las ratas diabéti-cas55, y prevenir un aumento de VEGF en sus retinas56,57.

Por otra parte, la administración de antioxidantes en ratas diabéticas disminuye efectos deletéreos de la retinopatía diabética como la adhesión leucocitaria a las células endoteliales58, la permeabili-dad vascular57, la apoptosis de células retinianas59 y el engrosamiento de la membrana basal60.

Otro estudio mostró que la administración oral de una mezcla de antioxidantes (bien una dieta rica en vitamina C + vitamina E o bien un complejo vitamínico que contenía trolox + ß-tocoferol + N-acetilcisteína + ácido ascórbico + ß-caroteno + selenio) a ratas diabéticas un mínimo de 12 y un máximo de 18 meses permitió reducir a la mitad la pérdida de pericitos y el número de ca-pilares acelulares61. Se ha evidenciado también la inhibición de estos cambios en ratas diabéticas sometidas a suplementación con vitamina C y E62.

En humanos cabe destacar los resultados de un estudio reciente en que se siguió a un grupo de pacientes diabéticos con retinopatía no proliferativa durante cinco años (n= 220). Un subgrupo (n= 112) fue suplementado con un complejo antioxidante multivitamínico y otro no fue suple-mentado (n= 108). La suplementación con antioxidantes se reflejó en el mantenimiento y mejoría del estado antioxidante y el descenso paralelo de la actividad prooxidativa en plasma. Además, en el subgrupo suplementado no se observó progresión clínica en la retinopatía, a diferencia del grupo no suplementado, en que se evidenció un empeoramiento clínico63.

Como ya se ha mencionado, el flujo sanguíneo retiniano decrece en la diabetes temprana. El trata-miento con vitamina C mejora la vasodilatación derivada del endotelio en pacientes diabéticos64. El tratamiento con vitamina E de ratas diabéticas reduce los niveles retinianos de DAG, normaliza la activación de la PKC-ß retiniana, normaliza el flujo sanguíneo retiniano65 y restaura la relajación aórtica dependiente del endotelio mediada por óxido nítrico66 a pesar de la elevación mantenida de la hiperglucemia. En pacientes diabéticos que no tenían retinopatía o ésta era mínima la admi-nistración de altas dosis de vitamina E durante 4 meses normalizó el flujo sanguíneo retiniano a pesar de que el control de la glucemia permaneció sin cambio67. La vitamina E, además de reducir la cantidad de radicales libres, inhibe la PKC directamente con lo que su acción puede ser dual a nivel de ambas vías68, que por otra parte están muy interrelacionadas.

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1�

Por todo lo dicho, un aporte adecuado de antioxidantes es recomendable en los pacientes diabéti-cos para disminuir los riesgos de progresión de la retinopatía (Figura 11).

Figura 11. la suplementación antioxidante ayuda a restablecer el balance oxidativo, disminuyendo el daño celular en la reti-

nopatía diabética.

REEQUILIBRIO

SUPLEMENTACIÓNANTIOXIDANTE

AntioxidantesProoxidantes

Antioxidantes Prooxidantes

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