PROTEIN ALERGEN BELALANG SAWAH (Oxya chinensis)

DAN HASIL OLAHANNYA

SKRIPSI

ANNISA THAHARAH

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2018 M / 1440 H

PROTEIN ALERGEN BELALANG SAWAH (Oxya chinensis)

DAN HASIL OLAHANNYA

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mempreroleh Gelar Sarjana Sains

Program Studi Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Oleh:

ANNISA THAHARAH

11140960000052

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2018 M / 1440 H

Scanned by CamScanner

Scanned by CamScanner

Scanned by CamScanner

ABSTRAK

ANNISA THAHARAH. Protein Alergen Belalang Sawah (Oxya chinensis) dan

Hasil Olahannya. Dibimbing oleh SRI YADIAL CHALID dan HENDRA

WIJAYA.

Alergi adalah suatu reaksi yang dialami oleh tubuh ketika terpapar salah satu jenis

alergen yang berikatan dengan IgE spesifiknya. Alergen pangan diantaranya

adalah protein hewani dan nabati. Belalang sawah (Oxya chinensis) diduga

memiliki protein alergen. Penelitian ini dilakukakan untuk identifikasi profil

protein alergen pada belalang. Sampel belalang sawah (Oxya chinensis) pada

penelitian ini dilakukan beberapa proses pengolahan, yaitu, goreng, rebus, dan

rendang. Protein diekstraksi menggunakan phosphate buffer saline. Kadar protein

diuji dengan metode Bradford. Protein belalang dikarakterisasi berdasarkan berat

molekul menggunakan metode elektroforesis pada tegangan 90 V selama 120

menit. Alergenisitas protein belalang diuji dengan metode immunoblotting

menggunakan darah dari responden yang memiliki riwayat alergi. Hasil penelitian

didapatkan kadar protein dari belalang mentah, rendang, rebus, dan goreng yaitu

7222,25; 1123,08; 893,97; 703,43; ppm. Profil protein yang dihasilkan pada

belalang sawah berkisar antara 9 sampai dengan >250 KDa. Hasil immunoblotting

menujukkan bahwa belalang sawah mengandung protein alergen. Protein alergen

terdeteksi pada bobot molekul 24, 66, 70, 86, 150, dan >250 KDa. Proses

pengolahan pada belalang sawah dapat meningkatkan alergenisitasnya. Belalang

mentah menghasilkan jenis protein alergen paling sedikit yang dapat berikatan

dengan IgE spesifik pada serum darah manusia.

Kata kunci: Alergen, belalang, elektroforesis, immunoblotting, protein.

ABSTRACT

ANNISA THAHARAH. Protein Allergens Allergens on Grasshopper processing

(Oxya chinensis) and The Processed Products. Supervised by SRI YADIAL

CHALID and HENDRA WIJAYA.

Allergy is a reaction by the body when exposed one type of allergen which

binding to the human specific IgE. The specification of food allergens are animal

and vegetable protein. Grasshopper (Oxya chinensis) is suspected of having

allergen protein. This research was conducted to identify protein profiles of

allergen in grasshopper. Grasshopper (Oxya chinensis) sample in this research

performed some processing i.e fried, boiled, and rendang. The protein extract was

obtained by using phosphate buffered saline centrifuged at 2500 rpm, 4 °C for 25

minutes. The concentration of protein was tested by Bradford method. The protein

extract was characterized by molecular weight using electrophoresis method at a

voltage of 90 V for 120 min. Allergen protein extract of grasshopper was tested by

allergenicity with immunoblotting using blood from respondents who have

allergy. The result on this research obtained concentration of protein raw,

rendang, fried, and boiled are 7222,25; 1123,08; 893,97; 703,43; ppm. The range

protein profile of grasshopper between 9 until >250 KDa. The result of

immunoblotting showed grasshopper contain an allergen protein. Protein allergen

identified in weight molecule 24, 66, 70, 86, 150, dan >250 KDa. Processing of

grasshoppers can increase the level of allergenicity. Raw grasshoppers produces a

little type of allergen protein, which can be binding with specific IgE on human

blood serum.

Keywords: Allergen, electrophoresis, grasshoppers, immunoblotting, protein.

viii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmaanirrohim

Assalamualaikum Warahmatullah Wabarakatuh

Puji dan syukur penulis haturkan kehadirat Allah SWT, karena atas rahmat

dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat serta salam

semoga selalu dilimpahkan kepada junjungan kita nabi Muhammad SAW. Skripsi

ini berjudul Protein Alergen Belalang Sawah (Oxya chinensis) dan Hasil

Olahannya.

Penulisan skripsi ini mendapat banyak bantuan, bimbingan, dan arahan

dari berbagai pihak, sehingga pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan

ucapan terimakasih kepada :

1. Dr. Sri Yadial Chalid, M.Si. selaku pembimbing I yang selalu memberikan

bimbingan, nasihat dan arahan kepada penulis.

2. Dr. Hendra Wijaya, M.Si selaku pembimbing II yang telah memberikan ilmu

pengetahuan, bimbingan dan arahan kepada penulis dalam penelitian ini.

3. Drs. Dede Sukandar, M.Si selaku ketua prodi kimia Fakultas Sains dan

Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Dr. Agus Salim, M.Si. selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

5. Dr. Sandra Hermanto, M.Si selaku pembimbing akademik, atas bimbingan

dan masukannya selama perkulihan.

6. Ayahanda (alm) Refri, Ibunda tersayang Radianti, kakak Aldhi Aulia Rachim,

adik Nabila Iffatulnisah dan Puti Intan Karina yang selalu memberikan

ix

dukungan kepada penulis baik secara material maupun moril, dan juga selalu

memberikan semangat dan keceriaan kepada penulis.

7. Widyaningsih rekan seperjuangan dalam riset di laboratorium yang selalu

membantu dan memberikan semangat.

8. Teman-teman kimia UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2014 yang

selalu memberikan semangat, doa, dan keceriaan bagi penulis.

Penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi kita semua.

Wassalamualaikum, Wr. Wb.

Jakarta, Oktober 2018

Annisa Thaharah

x

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ................................................................................. viii

DAFTAR ISI ................................................................................................ x

DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xii

DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiv

BAB I PENDAHULUAN ............................................................................ 1

1.1 Latar Belakang ........................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................... 4

1.3 Hipotesis Penelitian ................................................................................. 4

1.4 Tujuan Penelitian .................................................................................... 4

1.5 Manfaat Penelitian .................................................................................. 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................. 5

2.1 Protein ..................................................................................................... 5

2.2 Alergi dan Alergen .................................................................................. 7

2.3 Belalang Sawah (Oxya chinensis) ........................................................... 15

2.4 Karakterisasi Protein dengan SDS-PAGE .............................................. 17

2.5 Protein Alergen dengan Immunoblotting ................................................ 20

BAB III METODE PENELITIAN ............................................................ 24

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................. 24

3.2 Alat dan Bahan ........................................................................................ 24

3.3 Diagram Alir Penelitian .......................................................................... 26

3.4 Prosedur Penelitian.................................................................................. 27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................... 35

4.1 Identifikasi Bahan Baku ......................................................................... 35

4.2 Ekstrak Protein Terlarut .......................................................................... 41

4.3 Profil Protein dengan Elektroforesis ....................................................... 43

4.4 Protein Alergen dengan Immunoblotting ................................................ 48

BAB V PENUTUP ...................................................................................... 59

5.1 Simpulan ................................................................................................. 59

5.2 Saran ........................................................................................................ 59

xi

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 60

LAMPIRAN ................................................................................................ 65

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Empat bentuk struktur protein ................................................... 7

Gambar 2. Ikatan antara alergen dan IgE .................................................... 9

Gambar 3. Bentuk struktur Immunoglobulin (IgE) .................................... 12

Gambar 4. Mekanisme reaksi tipe I ............................................................ 14

Gambar 5. Belalang sawah (Oxya chinensis) .............................................. 16

Gambar 6. Reaksi pembentukan poliakrilamida ......................................... 18

Gambar 7. Tahapan immunoblotting ........................................................... 21

Gambar 8. Diagram alir penelitian .............................................................. 26

Gambar 9. Belalang sawah (Oxya chinensis) .............................................. 35

Gambar 10. Reaksi mailard ......................................................................... 40

Gambar 11. Hasil SDS-PAGE ekstrak protein ............................................ 43

Gambar 12. Hasil immunoblotting belalang mentah ................................... 50

Gambar 13. Hasil immunoblotting belalang rebus ...................................... 51

Gambar 14. Hasil immunoblotting belalang goreng ................................... 53

Gambar 15. Hasil immunoblotting belalang rendang .................................. 55

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Nilai nutrisi protein dan lemak berbagai macam ternak................. 16

Tabel 2. Komposisi kimia bahan baku belalang sawah ................................ 36

Tabel 3. Kadar protein ekstrak belalang ....................................................... 41

Tabel 4. Berat molekul protein belalang dengan SDS-PAGE ...................... 44

Tabel 5. Riwayat alergi responden berdasarkan hasil kuesioner .................. 49

Tabel 6. Berat molekul protein alergen pada belalang rebus ....................... 52

Tabel 7. Berat molekul protein alergen pada belalang goreng ..................... 54

Tabel 8. Berat molekul protein alergen pada belalang rendang ................... 55

Tabel 9. Bobot molekul rotein alergen belalang sawah (Oxya chinensis)

dan olahannya................................................................................. 56

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Pembuatan buffer posfat ......................................................... 65

Lampiran 2. Pembuatan pereaksi bradford.................................................. 66

Lampiran 3. Pembuatan larutan kerja SDS-PAGE ..................................... 67

Lampiran 4. Pembuatan larutan kerja immunoblotting ............................... 69

Lampiran 5. Lembar kusioner responden .................................................... 70

Lampiran 6. Hasil identifikasi belalang sawah ........................................... 75

Lampiran 7. Kurva standar BSA ................................................................. 76

Lampiran 8. Nilai mobilitas relatif (Rf), logaritma berat molekul (Log BM

dan berat molekul protein standar ......................................... 77

Lampiran 9 Contoh perhitungan berat molekul .......................................... 78

Lampiran 10. Hasil perhitungan berat molekul belalang mentah .............. 80

Lampiran 11. Hasil perhitungan berat molekul belalang rebus .................. 81

Lampiran 12. Hasil perhitungan berat molekul belalang goreng ................ 82

Lampiran 13. Hasil perhitungan berat molekul belalang rendang ............. 83

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Alergi adalah reaksi hipersensitifitas yang dihasilkan oleh sistem imun dari

dalam diri manusia yang disebabkan oleh subtansi asing atau alergen (Campbell et

al., 2000). Penyakit alergi merupakan salah satu penyakit yang berbahaya pada

saat-saat tertentu dan bisa menimbulkan kematian (Pawankar et al., 2011).

Lembaga penelitian swasta di Inggris menyatakan bahwa sebanyak 152.504.237

orang penduduk dunia mengalami alergi terhadap beberapa sumber alergen

pangan. Asia tercatat menjadi wilayah dengan penderita alergi pangan terbanyak

dibandingkan dengan benua lainnya (Elucidare, 2011). Kasus alergi pangan di

Indonesia menunjukkan jumlah yang belum pasti, namun selalu meningkat tiap

tahunnya (Candra & Rengganis, 2011 ). Alergi dapat menyebabkan gejala ringan

seperti gatal-gatal, pembengkakan, ruam pada tubuh, dan dapat menyebabkan

reaksi yang cukup berat seperti anafilaksis.

Alergen yang biasa ditemukan adalah glikoprotein yang larut dalam air

dengan berat molekul antara 10-70 KDa (Cianferoni & Jonathan, 2009). Sumber

alergen utama adalah protein yang terdapat dalam kacang tanah, kacang pohon

(tree nuts), susu sapi, ikan, kerang, telur, kedelai dan gandum (Gupta et al., 2013).

Protein yang terdapat pada serangga juga dapat disebut sebagai protein alergen.

Beberapa alergen serangga adalah tungau, ulat bulu, jangkrik dan belalang.

Belalang sawah termasuk serangga yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan

makanan dan telah banyak diolah menjadi belalang goreng, rendang, kerupuk dan

nugget. Bagi masyarakat Gunung kidul, Yogyakarta dan Sijunjung, Sumatera

2

Barat makanan dari belalang sudah tidak asing lagi. Belalang memiliki kandungan

protein yang cukup tinggi dan dapat disetarakan dengan protein utama lainnya.

Kandungan protein yang tinggi dan banyaknya masyarakat mengkonsumsi

belalang menjadi ketertarikan utama untuk dilakukan penelitian tentang protein

alergen pada belalang.

Berbagai macam makanan dapat ditemukan saat ini dari berbagai binatang

yang ada di sekitar, dan belalang merupakan salah satu sumber makanan tersebut.

Belalang adalah binatang yang halal untuk dikonsumsi, seperti dijelaskan pada

hadist berikut ini:

مانفالكبد والط حال االد والجراد وأم وت االميتتانفالح أ حلتلناميتتانودمانفأم

Dihalalkan bagi kami dua bangkai dan dua darah. Dua bangkai yaitu

belalang dan ikan. Adapun dua darah yaitu ati dan limpa (HR. Ahmad 2:97 dan

Ibnu Majah no. 3314).

Hadist di atas membuktikan bahwa belalang diperbolehkan untuk

dikonsumsi bagi umat Islam. Menurut Durst et al., (2010) cukup tingginya protein

yang terkandung di dalam belalang yaitu mencapai angka 24% dapat dijadikan

sumber protein utama mengingat harganya yang masih relatif murah. Di sisi lain

adanya beberapa kasus yang menyatakan bahwa terdapat alergi yang disebabkan

oleh belalang.

Lierl et al (1994) menyatakan bahwa serangga dapat memicu terjadinya

reaksi alergi pada manusia. Lopata et al (2005) menyatakan bahwa spesies

serangga Locusta migratoria mengandung protein alergen pada rentang berat

molekul 30-70 KDa. Penelitian lainnya yang dilakukan oleh Chen et al (2012)

3

yang menyatakan bahwa pada serangga Locusta migratoria mengandung protein

alergen pada kisaran berat molekul 19-130 KDa.

Penelitian mengenai proses pengolahan mempengaruhi sifat alergenisitas

pada bahan pangan telah dilakukan pada beberapa penelitian sebelumnya.

Menurut Phiriyangkul (2015) proses pengolahan dapat meningkatkan sifat

alergenisitas protein alergen, alergen yang digunakan adalah serangga spesies

Patanga succinta. Penelitian Knulst & Bruijnzeel (2017) pada serangga spesies

Tenebrio molitor menyatakan bahwa proses pengolahan dapat meningkatkan sifat

antigeniknya.

Mengacu kepada beberapa penelitian tersebut, maka penelitian ini dilakukan

karena adanya dugaan bahwa serangga dengan jenis belalang sawah (Oxya

chinensis) memiliki protein alergen. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui

profil protein alergen pada belalang sawah (Oxya chinensis) dan pengaruh proses

pengolahannya terhadap tingkat alerginisitas protein belalang. Belalang diolah

dengan cara merebus, menggoreng dan merendang. Hal ini dilakukan dikarenakan

pada beberapa penelitian menunjukkan bahwa proses pengolahan dapat

mempengaruhi alergenisitas pangan.

Metode yang dilakukan dalam penelitian ini adalah identifikasi jenis spesies

dan uji proksimat pada bahan baku. Ekstraksi protein menggunakan phosphate

buffer saline. Analisa kadar protein dilakukan dengan metode Bradford.

Karakterisasi profil protein dengan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-

Polyacrylamide Gel Electrophoresis) dan uji alergenisitas dengan immunoblotting

4

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah belalang sawah (Oxya chinensis) mengandung protein alergen?

2. Apakah proses pengolahan dapat mempengaruhi sifat alergenisitas belalang

sawah (Oxya chinensis)?

1.3 Hipotesis Penelitian

1. Belalang sawah (Oxya chinensis) mengandung protein alergen.

2. Proses pengolahan dapat mempengaruhi sifat alergenisitas pada belalang

sawah (Oxya chinensis).

1.4 Tujuan Penelitian

1. Menentukan profil protein alergen belalang sawah (Oxya chinensis) dengan

SDS-PAGE.

2. Menentukan pengaruh proses pengolahan belalang sawah (Oxya chinensis)

terhadap sifat alergenisitasnya.

1.5 Manfaat Penelitian

Memberikan informasi kepada masyarakat umum tentang protein alergen

yang terkandung pada belalang dan bagi penderita alergi dapat menghindari

pengolahan yang meningkatkan alergenisitas.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Protein

Protein adalah senyawa yang mengandung nitrogen yang diyakini sebagai

faktor penting untuk fungsi tubuh (Muchtadi, 2010). Protein merupakan

makromolekul yang terdiri dari asam amino yang dihubungkan oleh ikatan

peptida, gabungan dari dua asam amino disebut dipeptida, 4-10 asam amino

disebut oligopeptida, dan lebih dari 10 asam amino disebut polipeptida (Gandy et

al., 2014). Tiap jenis protein mempunyai perbedaan jumlah dan distribusi asam

amino penyusunnya. Berdasarkan susunan atomnya, protein mengandung 50-55%

atom karbon (C), 20-23% atom oksigen (O), 12-19% atom nitrogen (N), 6-7%

atom hidrogen (H), dan 0,2-0,3% atom sulfur (S) (Estiasih, 2016).

Protein dibuat dari satu atau lebih rantai polipeptida yang terdiri dari banyak

asam amino yang dihubungkan oleh rantai peptida. Berat molekul protein

bervariasi mulai dari 5000 hingga satu juta atau lebih. Semua protein tanpa

memperlihatkan fungsi atau jenis dari sumbernya dibuat dari dua puluh asam

amino, yang disusun dari rangkaian yang bervariasi (Lehninger, 1976). Dalam

setiap sel hidup, protein merupakan bagian yag sangat penting. Pada sebagian

besar jaringan tubuh, protein merupakan komponen terbesar setelah air (Winarno,

2002).

6

Struktur protein ditampilkan pada Gambar 1. Berdasarkan struktur molekul

protein dibagi atas 4 (Fatchiyah et al., 2011), yaitu:

1. Struktur primer

Struktur primer protein menggambarkan sekuen linier residu asam amino

dalam suatu protein. Sekuen asam amino selalu dituliskan dari gugus terminal

amino ke gugus terminal karboksil.

2. Struktur sekunder

Struktur sekunder dibentuk karena adanya ikatan hidrogen antara hidrogen

amida dan oksigen karbonil dari rangka peptida. Struktur sekunder utama

meliputi α-heliks dan β-strands (termasuk β-sheets).

3. Struktur tersier

Struktur tersier menggambarkan rantai polipeptida yang mengalami folded

sempurna dan kompak. Beberapa polipeptida folded terdiri dari beberapa

protein globular yang berbeda yang dihubungkan oleh residu asam amino.

Struktur tersier distabilkan oleh interaksi antara gugus R yang terletak tidak

bersebelahan pada rantai polipeptida. Pembentukan struktur tersier membuat

struktur primer dan sekunder menjadi saling berdekatan.

4. Struktur kuartener

Struktur kuartener melibatkan asosiasi dua atau lebih rantai polipeptida yang

membentuk multisubunit atau protein oligomerik. Rantai polipeptida

penyusun protein oligomerik dapat sama atau beda.

7

Gambar 1. Empat bentuk struktur protein (Berg et al., 2002)

Sumber protein di dalam makanan dapat dibedakan atas dua sumber yaitu,

protein hewani dan nabati. Struktur fisik dan kimia protein hewani sama dengan

yang dijumpai pada tubuh manusia. Protein yang berasal dari hewan mengandung

semua asam amino dalam jumlah yang cukup untuk membentuk dan memperbaiki

jaringan tubuh manusia (Budiyanto, 2004).

2.2 Alergi dan Alergen

2.2.1 Alergen

Alergen merupakan protein asing pemicu timbulnya reaksi alergi, dapat

terlarut cepat, dan sebagian besar berukuran kecil (≤60 KDa) sehingga dapat

menembus membran sel manusia (Denburg, 1998). Alergen yang utama pada

makanan adalah protein, glikoprotein atau polipeptida dengan berat molekul yang

berkisar dari 3 sampai 160 kDa (umumnya 20 sampai 40 KDa), larut air, tahan

panas, dan tahan enzim proteolitik (Adelman et al., 2002). Alergen pangan

biasanya hanya sebagian kecil dari keseluruhan protein yang terdapat dalam

makanan. Kemampuan suatu alergen untuk menginduksi sintesis IgE

8

(Immunoglobulin E) dan kemudian memicu respon klinis disebut dengan

alergenisitas (Mills et al., 2004).

Penderita alergi seringkali memiliki sensitivitas terhadap lebih dari satu

macam alergen (Gunawan, 2010). Alergen mengacu pada antigen nonparasit yang

mampu menstimulasi respon hipersensitifitas tipe I pada individu atopik. Atopik

adalah individu yang cenderung mudah mengalami reaksi hipersensitifitas tipe I

jika terpapar oleh antigen atau alergen. Respon abnormal IgE pada idividu atopik

sebagian disebabkan oleh faktor genetik (Kindt et al., 2007).

Alergen yang mampu bereaksi dengan 50% IgE serum individu penderita

alergi disebut dengan alergen mayor. Alergen minor hanya dapat bereaksi dengan

10% IgE serum atau bahkan tidak begitu kuat untuk menyebabkan alergi. Alergen

mayor antara lain β-laktalbumin, kasein, α-laktalbumin susu dan antigen I, antigen

II pada udang. Laktoferin, laktoperoksidase, alkalifosfatase dan katalase susu

merupakan jenis protein yang tergolong sebagai alergen minor (Bush & Hefle,

1996).

Alergen yang dikonsumsi oleh penderita alergi, pertama masuk ke dalam

tubuh melalui intestinal. Protein alergen memiliki kemampuan yang tahan

terhadap kondisi asam dalam lambung, dan tahan terhadap enzim protease dalam

saluran pencernaan. Alergen yang dikonsumsi oleh penderita alergi, akan masuk

ke dinding mukosa usus halus, sehingga akan terjadi gejala alergi (Garn & Renz,

2007). Alergen yang berikatan dengan IgE spesifik mempunyai ikatan yang mirip

seperti “lock and key” (Gambar 2). Ikatan tersebut kemudian akan melepaskan

mediator–mediator sehingga menyebabkan gejala alergi (Soedarto, 2012).

9

Gambar 2. Ikatan antara alergen dan IgE (Abbas & Litchtman, 2009)

Bagian spesifik dari alergen yang mengikat antibodi IgE pada reaksi alergi

disebut epitop. Epitop merupakan bagian dari molekul yang secara spesifik

dikenali oleh paratop atau binding sites dari molekul antibodi (Yuliati, 2005).

Epitop dapat menentukan alergenisitas suatu protein. Ikatan antara IgE dengan

alergen umumnya terjadi bila protein alergen mengandung lebih dari 1 epitop

(Nowak-wegrzyn, 2003). Jumlah epitop dalam satu alergen berbeda dengan

jumlah epitop alergen lain. Semakin banyak jumlah epitop suatu protein alergen

yang berikatan dengan IgE, maka semakin parah gejala alergi yang ditimbulkan

(Shreffler et al., 2004).

2.2.2 Alergi

Alergi adalah respon yang berlebihan atau hipersensitif terhadap suatu

alergen (Campbell et al., 2000). Hipersensitifitas merupakan reaksi imun yang

patologik karena dapat menimbulkan kerusakan jaringan tubuh (Baratawidjaja &

Rengganis, 2006). Antibodi adalah immunoglobulin (Ig) yang merupakan

golongan yang dibentuk oleh sel plasma yang berasal dari poliferasi sel B akibat

adanya kontak dengan antigen. Antibodi termasuk kelompok protein yang

10

menurut perbedaan struktur dan aktivitas biologis, antibodi dibedakan menjadi 5

subkelas:

1. Immunoglobulin G

Paling banyak ditemukan dalam cairan tubuh terutama ekstravaskular untuk

menerangi mikroorganisme dan toksiknya. IgG merupakan komponen utama

immunoglobulin serum, kadarnya dalam serum merupakan 75% dari semua

immunoglobulin. IgG dapat menenmbus plasenta masuk ke janin dan berperan

pada imunitas bayi sampai umur 6-9 bulan. IgG dan komponen bekerja saling

membantu sebagai opsonin pada pemusnahan antigen.

2. Immunoglobulin A

IgA kadarnya terbanyak ditemukan dalam cairan sekresi saluran nafas, cerna

dan kemih, air mata, keringat, ludah, dan air susu ibu yang lebih berupa IgA

sekretori (sIgA) yang merupakan bagian terbanyak. IgA dapat bekerja sebagai

opsonin, yaitu dapat meningkatkan efek bakteriolitik komplemen dan

menetralisasi toksin serta dapt mengaglutinasikan kuman, mengganggu

motilitasnya sehingga memudahkan fagositosis.

3. Immunoglobulin M

IgM merupakan immunoglobulin paling efisien dalam aktivitas komplemen.

IgM dibentuk dahulu pada respon imun primer terhadap kabanyakan antigen

dibanding dengan IgG. IgM dapat mencegah gerakan mikroorganisme pathogen,

memudahkan fagositosis dan merupakan aglutinator poten antigen.

4. Immunoglobulin D

IgD ditemukan dalam serum dengan kadar yang sangat rendah. IgD

merupakan komponen permukaan utama sel B dan pertanda dari diferensiasi sel B

11

yang lebih matang. IgD merupakan 1% dari total immunoglobulin dan banyak

ditemukan pada membran sel B bersama IgM yang dapat berfungsi sebagai

reseptor antigen pada aktivitas sel B.

5. Immunoglobulin E

IgE mudah diikat sel mast, basofil, eosinophil yang memiliki reseptor untuk

fraksi Fc dari IgE. IgE dibentuk setempat oleh sel plasma dalam selaput lendir,

saluran nafas, dan cerna.

Immunoglobulin E atau IgE adalah faktor yang berperan dalam mekanisme

alergi. Bentuk struktur IgE ditampilkan pada Gambar 3. Antibodi IgE diproduksi

oleh limfosit B dalam jumlah sedikit yaitu sekitar 0,001-0,002% dari total

immunoglobulin dalam serum. Peranan IgE yaitu sebagai perantara respon alergi.

Reaksi alergi terjadi ketika seseorang yang telah menghasilkan antibodi IgE

sebagai respon terhadap antigen atau alergen yang sama. Alergen memicu aktivasi

sel mastosit pengikat IgE di jaringan yang terpapar, yang menyebabkan

serangkaian respon yang merupakan karakteristik alergi (Janeway et al., 2001).

IgE terdiri dari dua rantai berat yang identic (heavy chain) dan dua rantai

ringan yang identik (light chain), serta memiliki area yang konstan. IgE tersusun

dari lebih kurang 110 asam amino dalam susunan beta dengan tiga atau empat

rantai beta yang membentuk seperti huruf C. IgE tersusun dari beberapa jenis

protein seperti FcεRI yang merupakan reseptor dengan afinitas tinggi terhadap

IgE, CD23 (sebagai FcεRII) yang merupakan reseptor dengan afinitas rendah

terhadap IgE, galactin-3 yang merupakan protein pengikat IgE dan FcεRI.

Pengikatan antara IgE dan FcεRI pada sel mastosit dan sel basofil akan

menginduksi sinyal sel dan merangsang degranulasi sel mastosit, sehingga

12

mediator inflamasi akan dilepaskan. Pelepasan berbagai mediator tersebut

berperan dalam mengaktivasi eosinofil dan mempertahankan keberadaannya

seperti pada asma atopi (Boteman & Jithoo, 2007).

Gambar 3 . Bentuk struktur Immunoglobulin E (IgE) (Kindt et al., 2007)

Reaksi alergi terbagi menjadi 4 tipe, yaitu tipe I (reaksi cepat) yang terjadi

segera setelah terpapar alergen. Tipe ini diperantarai oleh IgE yang terikat pada

permukaan sel mast atau basofil. Hal ini menyebabkan dilepaskannya mediator

kimia seperti, bradikinin, histamin, prostagladin. Reaksi tipe II diperantai IgG,

reaksi yang menyebabkan kerusakan pada sel tubuh karena antigen menyerang

secara lansung pada permukaan sel. Reaksi tipe II adalah reaksi yang terjadi

karena deposit yang berasal dari kompleks antigen antibodi berada di jaringan.

Reaksi tipe IV disebabkan oleh antigen ekstrinsik atau instrinsik. Reaksi ini

melibatkan sel-sel imunokompeten (Kindt et al., 2007).

Mekanisme Alergi

Reaksi alergi makanan bisanya terjadi pada mekanisme reaksi tipe I atau

bisa juga disebut dengan hipersensitifitas segera. Hipersensitifitas segera adalah

13

reaksi jaringan yang terjadi secara cepat (bisanya dalam beberapa menit) setelah

interakasi antara antigen dan antibodi IgE pada permukaan sel mast pada individu

yang tersensitasi. Reaksi dimulai dengan masuknya antigen, yang disebut alergen

kerena memicu alergi. Banyak alergen yang berasal dari lingkungan yang tidak

berbahaya untuk sebagian besar individu yang terpapar. Beberapa individu

tampaknya menurunkan gen yang menyebabkan mereka rentan terhadap alergi

(Kumar et al., 2013).

Mekanisme alergi melibatkan produksi antibodi IgE secara berlebih,

dikarenakan terjadi paparan berulang terhadap antigen (alergen). Ikatan silang

antara IgE dan alergen akan memicu sel mastosit untuk melepaskan mediator –

mediator seperti histamin dan mediator lainnya, sehingga mempengaruhi

permeabilitas vaskular dan menyebabkan gejala alergi (Kumar et al., 2012).

Individu yang cenderung alergi, paparan terhadap beberapa antigen akan

menyebabkan aktivitas sel Th2 (allergen-specific T helper 2) dan produksi IgE.

Individu normal tidak mempunyai respon yang kuat terhadap sebagian besar

antigen asing. Ketika individu terpapar antigen seperti protein tertentu, makanan,

racun, obat, dll. maka respon sel T yang dominan adalah pembentukan Th2.

Hipersensitivitas tersebut terjadi akibat dari aktivasi sel Th2 yang berespon

terhadap antigen protein. Antigen yang menimbulkan reaksi hipersensitivitas tipe

cepat (reaksi alergi) sering disebut sebagai alergen (Munasir & Dadi, 2010).

Reaksi hipersensitivitas tipe I terjadi akibat adanya antigen berupa alergen.

Paparan pertama alergen pada sel B dengan bantuan allergen-specific T helper 2

(Th2) akan mendiferensiasi sel B menjadi sel plasma. Sel plasma selanjutnya

memproduksi IgE. IgE merupakan golongan immunoglobulin (antibodi) yang

14

berperan pada reaksi alergi. IgE yang telah diproduksi kemudian menempel pada

sel mastosit. Paparan ulang dengan alergen yang sama akan membentuk reaksi

silang yang menyebabkan lepasnya mediator – mediator pada sel mastosit

sehingga akan menimbulkan gejala alergi. Secara garis besar, mekanisme alergi

tertera pada Gambar 4. berikut.

Gambar 4. Mekanisme reaksi tipe I (Kumar et al., 2013)

Tahap paparan pertama alergen hingga pembentukan reaksi silang IgE

dengan FcℇRI (reseptor Fc IgE) pada permukaan sel mastosit disebut fase

sensitisasi. IgE yang telah terpapar alergen secara berulang kali dan berikatan

silang akan melepaskan mediator - mediator. Tahap tersebut disebut fase aktivasi.

15

Sel mastosit memiliki peran penting pada reaksi alergi, karena pada sel mastosit

akan melepas mediator – mediator yang akan bereaksi dengan target organ dan

menyebabkan timbulnya gejala alergi. Mediator – mediator tersebut meliputi

histamin, eosinophil chemotactic factor of anaphylactic (ECF-A), dan neutrophil

chemoctatic factor (NCF). Tahapan pelepasan mediator tersebut disebut fase

efektor. Pelepasan mediator ini akan menyebabkan gejala reaksi alergi beberapa

menit setelah paparan (fase cepat) dan 6-24 jam setelah paparan berulang dengan

alergen (fase lambat) (Munasir & Dadi, 2010).

Gejala awal alergi makanan berupa rasa gatal pada mulut, kesulitan menelan

dan bernapas. Saat mencapai kulit, alergen akan menyebabkan terjadinya eksim.

Alergen menyebabkan asma bila mencapai paru - paru. Gejala alergi yang paling

membahayakan tubuh adalah anafilaktik syok yang ditandai dengan tekanan darah

yang menurun, kesadaran menurun, dan bila tidak ditangani segera dapat

menyebabkan kematian (Prawitasari & Spa, 2007).

2.3 Belalang Sawah (Oxya chinensis)

Belalang sawah (Oxya chinensis) termasuk ke dalam Ordo Orthoptera,

Subordo Caelifera, Famili Acrididae, Subfamili Oxynae, Genus Oxya, spesies

Oxya chinensis. Belalang sawah (Oxya chinensis) yang digunakan ditampilkan

pada Gambar 5. Belalang ini umum ditemukan di sawah dan kadang menjadi

hama pada tanaman padi. Oxya chinensis merupakan salah satu hama pertanian

yang paling serius dan banyak ditemukan pada tanaman padi, tebu, jagung,

graminae, padang rumput dan tanaman lainnya.

16

.

Gambar 5. Belalang sawah (Oxya chinensis) (Dokumentasi pribadi, 2017).

Belalang tidak mempunyai telinga, akan tetapi dapat mendengar. Alat

pendengar pada belalang disebut dengan tympanum dan terletak pada abdomen

dekat sayap. Tympanum berbentuk menyerupai disk bulat besar yang terdiri dari

beberapa prosesor dan saraf yang digunakan untuk memantau getaran di udara,

secara fungsional mirip dengan gendang telinga manusia. Belalang bernafas

dengan trakea. Belalang punya 5 mata (2 compound eye, dan 3 ocelli). Belalang

termasuk dalam kelompok hewan berkerangka luar (exoskeleton). Hewan lain

dengan exoskeleton adalah kepiting dan lobster. Lama hidup Oxya chinensis rata-

rata 73,1 hari dengan kisaran 55 hingga 106 hari (CPC, 2000).

Tabel 1. Nilai nutrisi protein dan lemak berbagai macam ternak

Hewan Protein (%) Lemak (%)

Sapi 15,8 24,3

Domba 14,6 30,5

Babi 13,0 33,3

Unggas 20,5 4,3

Belalang 24,4 1,5

Sumber: (Durst et al., 2010)

17

Kandungan protein belalang senilai 24,4 % lebih tinggi dibandingkan

protein yang terkandung pada sapi, domba, babi dan unggas. Kadar lemak pada

belalang menghasilkan nilai paling rendah yaitu 1,5 %. Protein belalang dapat

dijadikan sumber protein utama di kalangan masyarakat mengingat kadar protein

yang tinggi, kadar lemak rendah dan harganya yang relatif masih murah.

Protein yang terkandung pada belalang sawah dinyatakan memiliki

kandungan protein yang tinggi. Protein tinggi pada umumnya dapat berpotensi

sabagai protein alergen. Belalang sawah dapat diduga memiliki protein alergen

dikarenakan pada beberapa penelitian terdahulu telah terdeteksi beberapa protein

alergen pada belalang. Lopata et al., (2005) menyatakan bahwa Locusta

migratoria mengandung protein alergen pada rentang berat molekul 30-70 KDa.

2.4 Profil Protein dengan SDS-PAGE

Elektroforesis merupakan suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi

campuran berdasarkan atas pergerakan partikel-partikel koloid yang bermuatan, di

bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis pada umumnya digunakan untuk

menentukan berat molekul (BM), mendeteksi kemurnian dan kerusakan protein

atau asam nukleat, dan lainnya (Bintang, 2010). Sodium Dodecy Sulphate –

Polyacrylamide Gel Electrphoresis merupakan salah satu metode untuk

menganalisis protein dengan memisahkan pita-pita protein berdasarkan berat

molekulnya (Berg et al., 2002).

Analisis dengan SDS-PAGE ini, menggunakan gel poliakrilamid yang

terdiri dari stacking gel dan separating gel. Gel poliakrilamid merupakan medium

yang tepat untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran berat molekul karena

18

ukuran pori-pori kecil yang memungkinkan untuk memperlambat gerakan

molekul. Stacking gel terdapat well yang berfungsi sebagai tempat meletakkan

sampel sedangkan separating gel merupakan tempat protein akan bergerak kearah

anoda (Rachmania, et al., 2017).

Reaksi pembentukan gel poliakrilamid dapat dilihat pada Gambar 6. Gel

poliakrilamid terbentuk dari hasil polimerisasi monomer akrilamida (CH2=CH-

CO-NH2)-CH2 menjadi poliakrilamid dan memiliki iktan silang N’ N’ methylene

bisacrylamide (CH2-CH-CO-NH2)-CH2. Medium penyangga atau buffer dinuat

dari reaksi polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida yang dikatalis oleh

ammonium persulfat (APS) dan tetrametilendiamin (TEMED) (Alberts, et al.,

2002).

Akrilamid N’ N’ methylene bisacrylamide Poliakrilamid

Gambar 6. Reaksi pembentukan poliakrilamid

Metode SDS-PAGE dikondisikan agar memberikan pemisahan yang

sempurna untuk protein dengan kisaran berat molekul dari 10 KDa hinggan 200

KDa karena umumnya protein alergen berada pada kisaran BM tersebut. Faktor

penting yang berkaitan dengan elektroforesis dalam memisahkan protein dengan

berat molekul tertentu adalah konsentrasi akrilamida. Konsentrasi akrilamida

untuk memisahkan protein dengan berat molekul antara 10-200 KDa adalah 5-

20% (Bollag & Edelstein, 1991).

APS

(Inisiator)

TEMED

(Katalis)

19

Elektroforesis pada sampel dilakukan dengan melarutkan sampel ke dalam

larutan sampel buffer dan dipanaskan. Larutan sampel buffer mengandung SDS

dan merkaptoetanol. SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein dalam bentuk

protein kompleks (kuartener, tersier, dan sekunder) menjadi bentuk yang lebih

sederhana (primer atau linear) (Bintang, 2010). Merkaptoetanol berfungsi untuk

memutus ikatan disulfida yang ada pada protein. Sebelum elektroforesis,

dilakukan pemanasan pada sampel yang bertujuan untuk membantu proses

denaturasi protein dan akan menghasilkan molekul linier yang akan bermigrasi

berdasarkan berat molekulnya. Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi proses

migrasi protein adalah konsentrasi akrilamid, voltase, waktu konsentrasi protein

dan pemanasan bahan baku (Wijaya & Rohman, 2001).

Protein marker adalah suatu standar yamg digunakan untuk mendeteksi

profil protein apa saja yang terdapat di dalam suatu protein. Protein marker

digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari campuran polipeptida.

Marker protein yang digunakan memiliki rentang berat molekul 10 kDa - 250

kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat sejumlah pita protein yang memiliki

ketebalan berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan dan intensitas warna

yang lebih besar dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap varietas

disebut protein mayor (Wijaya & Rohman, 2001).

Salah satu cara mengamati pita-pita protein yang terbentuk adalah mewarnai

hasil elektoforesis menggunakan Commasie brilliant blue. Pewarna ini termasuk

kedalam zat warna anionik, sebagian strukturnya berupa gugus non polar.

Pewarna ini biasanya digunakan dalam larutan metanol dan asam asetat.

Commasie brilliant blue dapat berikatan dengan protein. Kelabihan pewarna yang

20

terkumpul di dalam gel dapat dihilangkan dengan aquades atau dengan campuran

metanol dan asam asetat. Protein akan terdeteksi sebagai pita berwarna biru

dengan latar belakang jernih (Lebendiker, 2002).

Pita-pita protein terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya

pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya

protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita

yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni

molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik,

molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau

pita yang sama atau berdekatan (Sudarmadji, 1989).

2.5 Protein Alergen dengan Immunoblotting

Immunoblotting adalah suatu modifikasi dari prinsip immunoelektroforesis.

Metode yang popular dari immunoblotting salah satunya adalah western blotting.

Western blotting dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan protein alergen

dalam suatu sampel. Immunoblotting juga digunakan untuk identifikasi dan

pencirian antigen dari campuran antigen yang tidak diketahui serta uji alergi.

Metode ini menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein

berdasarkan berat molekulnya. Protein tersebut kemudian ditransfer dari gel hasil

elektroforesis ke dalam suatu membran nitroselulosa, yang akan diuji

menggunakan antibodi yang spesifik terhadap protein tersebut (Carson et al.,

2012).

Tahapan immunoblotting dapat dilihat pada Gambar 7. Immunolotting

dilakukan melalui 3 tahap, yaitu elektroforesis, elektrotransfer, dan deteksi. Tahap

21

elektroforesis, protein yang diinginkan dipisahkan dari sampel secara

elektroforesis. Elektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran

molekul dalam suatu tegangan listrik. Elektroforesis, biasanya sampel yang

mengandung protein biasanya dicampur dengan SDS. SDS merupakan suatu

detergen yang memiliki muatan negative. Muatan negatif SDS tersebut

mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi. Protein-

protein yang ada dalam sampel membentuk suatu rantai polipeptida lurus.

Semakin besar berat molekul suatu protein, maka rantai polipeptida tersebut

semakin panjang.

Gambar 7. Tahapan immunoblotting (Kindt et al., 2007)

Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus tersebut dimasukkan dalam

suatu membran poliakrilamid yang dialiri arus listrik. Protein yang bermuatan

negatif bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif. Laju pergerakan protein

dalam membran poliakrilamid tersebut berbeda-beda tergantung pada daya

hambat antara protein dan membran. Protein yang berukuran lebih besar akan

22

memiliki daya hambat lebih besar sehingga pergerakannya menjadi lebih lambat

dibandingkan pergerakan protein yang berukuran lebih kecil.

Setelah dialiri arus listrik selama beberapa waktu, masing-masing protein

akan terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. Protein yang lebih kecil atau yang

memiliki berat molekul rendah akan bergerak lebih jauh dibanding protein yang

lebih besar. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-pita yang

merupakan protein-protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul.

Tahap kedua adalah pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel

transfer. Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus listrik sebagai pendorong

transfer protein. Proses pemindahan tersebut disebut juga elektrotransfer.

Elektrotransfer menggunakan media gel transfer untuk pemindahan pita. Gel

transfer yang umum digunakan ada dua, yaitu nitroselulosa dan nilon.

Nitroselulosa lebih umum digunakan karena relative tidak mahal, bloking mudah

dan cepat dilakukan (Bollag & Edelstein, 1991).

Transfer protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer merupakan tahap

yang sangat penting. Bebera faktor yang harus diperhatikan dalam proses transfer

protein tersebut, adalah :

1. Arus listrik yang digunkan harus diperhatikan karena arus yang terlalu

tinggi dapat menghasilkan panas selama transfer yang dapat emnimbulkan

masalah.

2. Kekuatan ion buffer transfer yan rendah dapat digunakan pada tegangan

listrik yang tinggi tanpa perlu khawatir menghasilkan panas yang tinggi.

3. Arus listrik yang dapat digunakan salah satunya adalah 200 mA selam 120

menit.

23

4. Transfer protein dengan ukuran besar, penggunaan gel dengan konsentrasi

poliakrilamid yang rendah.

Tahap ketiga merupakan deteksi protein yang telah dipindahkan ke

membran transfer. Dteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen

dan antibodi yang bersifat spesifik. Variasi metode-metode tersebut terutama

terletak pada penggunaan antibodi primer dan antibodi sekunder. Metode deteksi

terdiri dari dua, yaitu lansung dan tidak lansung. Metode lansung menggunakan

antibodi primer yang telah terkonjugasi dengan molekul marker. Metode tidak

lansung menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder . Antibodi primer

berfungsi mengikat protein target, sedangakan antibodi sekunder berfungsi

mengikat antibodi primer dan terkonjugasi dengan molekul penanda. Molekul

penanda yang digunakan diantaranya adalah enzim alkalin fosfatase (AP) dan

enzim horedish peroksidase (HRP) (Bollag & Edelstein, 1991)..

Pita protein alergen yang tercetak dalam membran nitroselulosa dapat

diidentifikasi dengan menginkubasi membran dalam serum darah pasien yang

positif alergi, sehingga protein tersebut akan berikatan secara spesifik dengan IgE.

Interaksi tersebut dapat terlihat setelah membran direaksikan dengan substrat yang

dapat berpendar, sedangkan berat molekulnya diketahui dari migrasinya pada gel

SDS-PAGE (Carson et al., 2012).

24

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kimia Balai Besar Industri Agro,

Cikaret, Bogor, Jawa Barat. Penelitian dilakukan selama 9 bulan, mulai dari bulan

November 2017 hingga Agustus 2018.

3.2 Alat dan Bahan

Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender, sentrifuse,

panci, penggorengan, kompor, SDS-PAGE Bio-Rad Mini-Protean II,

immunoblotting Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer, spektrofotometer

UV-VIS, water bath, freeze drier, inkubator, evaporator, nitrocellulose

membranes for blotting pore size 0.45 μm, size 15 cm x 15 cm (Sigma N8267),

vacuum blood tube (EDTA.K3), timbangan analitik, pH meter, vortex, stirrer,

termometer, labu takar, gelas ukur, gelas piala, tabung Eppendorf, mikropipet 5

μL hingga 1000 μL, kertas saring Whatman No.1 dan kertas saring biasa.

Bahan utama yang digunakan adalah belalang sawah yang diperoleh dari

Kabupaten Sijunjung, Sumatera Barat. Serum darah manusia dari 15 subyek

penderita alergi dan satu subyek normal yang tidak memiliki riwayat alergi

sebagai control negatif. Kuesioner responden terdapat di Lampiran 5.

Bahan kimia yang digunakan antara lain, phosphate buffer saline pH 7.5,

buffer tris pH 8,8 dan pH 6,8, NaOH, HCl, Na3PO4, (NH4)2S2O8, CH3OH, K2SO4,

C2H5OH 95%, H3PO4, CH3COOH, akuades, tween-20, TEMED (N,N,N',N'-

25

tetramethyl-ethane-1,2-diamine), tris base, SDS (sodium dodecyl sulphate), BSA

(bovine serum albumin), C3H5NO (akrilamida), C2H5NO2 (glisin), TBS (tris bufer

saline, akuabides, coomasie brilliant blue G-250, antibodi anti IgE manusia

berlabel enzim HRP (Horseradish Peroksidase), substrat DAB (3,3-

Diaminobenzidine), substrat TMB (3,3′,5,5′Tetramethylbenzidine), N,N-metilen-

bisakrilamid, marker protein Precision Plus Protein™ Dual Color Standards

(Berat molekul: 250, 150, 100, 75, 50, 35, 25, 20, 15, 10 KDa).

26

3.3 Diagram Alir

Belalang

sawah

Karakterisasi

(Identifikasi dan uji

proksimat)

20 gram digoreng

(100 0C, 5 menit)

20 gram

mentah

20 gram direbus

(>170 0C, 5 menit)

20 gram

rendang

olahan

Ektraksi protein

(phosphate buffer saline)

Supernatan

Ekstrak protein

Analisis kadar

protein metode

Bradford

Analisis profil

protein metode

SDS-PAGE

Analisis protein

alergen metode

immunoblotting

Gambar 8. Digram alir penelitian

27

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Preparasi Bahan Baku

Ditimbang sebanyak 500 gram bahan baku belalang sawah (Oxya

chinensis), sebelum dilakukan ekstraksi protein dilakukan beberapa proses

pengolahan yang berbeda, yaitu digoreng, direbus dan direndang.

3.4.1.1 Belalang Rebus

100 gram belalang sawah ditimbang dalam cawan, kemudian direbus

didalam air mendidih suhu 100 0C selama 5 menit.

3.4.1.2 Belalang Goreng

100 gram belalang sawah ditimbang dalam cawan, kemudian digoreng

selama 5 menit didalam minyak mendidih suhu 150-300 0C (Winarno, 2002).

3.4.1.3 Belalang Rendang

100 gram belalang rendang olahan ditimbang dalam cawan, dipastikan

bumbu rendang tidak terlalu banyak dalam sampel. Hal ini dilakukan dengan cara

memisahkan bumbu yang terlalu banyak dan menggumpal pada tubuh belalang.

Bumbu rendang merupakan rempah-rernpah yang terdiri dari bawang merah,

bawang putih, lengkuas, jahe, kemiri, cabe merah, ketumbar, kunyit, daun kunyit,

daun jeruk, serai dan asam kandis.

3.4.2 Karakterisasi Bahan Baku

3.4.2.1 Identifikasi Bahan Baku

Identifikasi dilakukan di Bidang Zoology Pusat Penelitian Biologi LIPI

Cibinong.

28

3.4.2.2 Uji Proksimat Bahan Baku

Uji proksimat dilakukan di Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta. Uji proksimat yang dilakukan yaitu mengukur kadar air,

abu, protein, lemak, dan karbohidrat.

Kadar Air (AOAC, 1992)

Bahan baku ditimbang sebanyak 2 gram, kemudian dihaluskan. Bahan

baku diletakkan di dalam cawan, kemudian dioven selama 3 jam pada suhu 105

0C. Bahan baku yang telah dioven didinginkan dalam desikator, kemudian

ditimbang dan dihitung kadar airnya.

Kadar air = ( ) ( )

x 100%

Kadar Abu (AOAC, 1992)

Bahan baku ditimbang sebanyak 2-3 gram di cawan porselen, kemudian

dibakar pada pembakar hingga asap habis. Bahan baku kemudian ditanur pada

suhu 600 0C selama 4-5 jam, setelah selesai kemudian dimasukkan ke dalam

desikator. Bahan baku ditimbang dan dihitung kadar abunya.

Kadar abu =

x 100%

Kadar Protein (AOAC, 1992)

Analisa dilakukan terhadap belalang mentah, rebus, goreng dan rendang.

Tahapan analisis total nitrogen terdiri dari tiga tahap yakni destruksi, destilasi dan

titrasi. Tahap destruksi dilakukan dengan cara memasukkan sebanyak 0.5 gram

sampel ke dalam labu Kjeldahl dan ditambahkan 2 gram campuran katalis (SeO2

29

+ K2SO4 + CuSO4), selanjutnya didestruksi selama 2.5 jam dengan kenaikan suhu

secara bertahap sampai cairan menjadi berwarna hijau tosca dan didinginkan.

Sampel hasil destruksi diencerkan dengan akuades sampai 100 mL. Tahap

destilasi dilakukan dengan memasukkan 25 mL sampel hasil destruksi

ditambahkan 25 mL larutan NaOH 30% dan 3 tetes indikator phenol phthalein.

Letakkan kondensor dibawah erlenmeyer 250 mL yang berisi 25 mL larutan asam

borat dan 3 tetes indikator conway. Destilasi dilakukan hingga 20 menit setelah

tetesan pertama hingga destilat menjadi hijau tosca.

Tahap titrasi dilakukan dengan cara larutan hasil destilasi dititrasi dengan

larutan HCl 0.05 N yang sebelumnya telah di standarisasi dengan menggunakan

larutan boraks 0.05 N. Titrasi dilakukan sampai terjadi perubahan warna dari hijau

toska sampai warna merah seulas. Selanjutnya diukur volume HCl yang terpakai

untuk titrasi sampel protein. Sebelumnya, dilakukan standarisasi terhadap N HCl

menggunakan Na-boraks.

[HCl] N =

%N =

x 100% x FP

Kadar protein = %N x Faktor konversi

Kadar Lemak (AOAC, 1992)

Labu lemak dikeringkan dalam oven, didinginkan dalam desikator dan

ditimbang sebagai a gram. Sampel sebanyak 5 gram ditimbang dalam kertas

saring kemudian diletakkan dalam alat ekstraksi soxhlet. Alat kondensor dipasang

di atasnya dan labu bulat di bawahnya. Dituangkan pelarut heksana kedalam labu

30

dan dilakukan refluks selama minimal 5 jam. Selesai ekstraksi pelarut dikeluarkan

dari labu lemak. Labu lemak hasil ekstraksi dikeringkan dalam oven 105 0C,

kemudian didinginkan dan ditimbang sebagai b gram.

Kadar lemak (%) =

x 100%

Kadar Karbohidrat (by difference)

Pengukuran kadar karbohidrat menggunakan metode by difference

dilakukan dengan cara mengurangkan 100 % dengan nilai total dari kadar air,

kadar abu, kadar protein, kadar lemak dalam satuan %b/b. Kadar karbohidrat

ditentukan dengan rumus berikut:

Karbohidrat (%) = 100% - (Kadar air+kadar abu+kadar protein+kadar lemak)

3.4.3 Ekstraksi Bahan Baku (Hashimoto et al., 1979)

Belalang mentah, rebus, goreng dan rendang masing-masing ditimbang

sebanyak 20 gram dan dimasukkan ke dalam blender, kemudian ditambahkan 200

mL buffer posfat pH 7,5 (Lampiran 1). Larutan dihomegenisasi sebanyak 3 kali

masing-masing selama 1 menit. Campuran yang terbentuk disentrifugasi dengan

kecepatan 4200 rpm selama 25 menit pada suhu 4 0C. Hasil sentrifugasi terdiri

dari lapisan atas berupa supernatan lapisan bawah berupa endapan. Supernatan

diambil dan dimasukkan dalam centrifuge tube 50 ml, cairan ini merupakan

ekstrak protein. Ekstrak yang dihasilkan yaitu, ekstrak protein belalang mentah,

rebus, goreng, dan rendang. Ekstrak protein disimpan di dalam lemari pendingin

suhu -20 0C.

31

3.4.4 Analisis Kadar Protein Terlarut (Bradford et al., 1976)

Sebanyak 100 µL ekstrak protein dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung

reaksi gelap, kemudian ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford (Lampiran 2).

Larutan divorteks dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-VIS

pada λ = 595 nm setelah 5 menit. Larutan standar BSA dan sampel diukur secara

bersamaan. Pembuatan larutan standar terdapat pada Lampiran 2.

3.4.5 Analisis Profil Protein dengan SDS – PAGE (Laemmli, 2011)

Masing-masing ekstrak protein belalang mentah, belalang rebus, belalang

goreng, dan belalang rendang dianalisis profil proteinnya dengan elektroforesis

menggunakan gel akrilamida. Gel terdiri atas dua bagian, yaitu stcking gel dan

separating gel. Konsentrasi akrilamida yang digunakan pada stacking gel adalah

5% dan separating gel 12%. Tahapan yang dilakukan adalah sebagai berikut:

Separating gel

Sebanyak 4,8 mL larutan A (Lampiran 3) dipipet ke dalam gelas piala,

kemudian ditambakan 3 mL larutan B (Lampiran 3) dan 4,02 mL akuades.

Campuran kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala.

Selanjutnya, sebanyak 60 µL APS 10% (Lampiran 3) dan 4 µL TEMED

ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran

dimasukkan ke dalam lempengan kaca (mini slab) tanpa menimbulkan gelembung

udara dengan menggunakan mikro pipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan.

Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk.

Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 60-120 menit.

32

Stacking gel

Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan

tissue. Akuades, larutan A (Lampiran 3) dan larutan C (Lampiran 3) masing-

masing sebanyak 2,3 mL; 0.67 ml dan 1.0 ml dicampurkan ke dalam gelas piala

dan diaduk perlahan dengan cara menggoyangkan gelas piala. APS 10%

(Lampiran 3) sebanyak 30 µl dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran

dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam mini slab,

kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara.

Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Sisir diangkat

dari atas gel dengan perlahan setelah gel berpolimerisasi dan slab ditempatkan ke

dalam wadah elektroforesis. Bufer elektroforesis (Lampiran 3) dimasukkan ke

dalam wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam.

Preparasi dan injeksi sampel

Sebanyak 40 µl ekstrak protein sampel dimasukkan ke dalam microtube dan

ditambahkan 40 µl bufer sampel (Lampiran 3). Larutan dipanaskan selama 5

menit dalam air mendidih 100°C. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam

sumur menggunakan mikropipet sebanyak 10 µl. Salah satu sumur diinjeksikan

protein marker sebanyak 5 µl, protein marker digunakan sebagai standar.

Running SDS-PAGE

Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik

dinyalakan dan dijaga konstan pada 90 V. Running dilakukan selama 120 menit

sampai migrasi tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar. Aliran listrik dimatikan dan katup

elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda.

33

Staining gel

Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi

pewarna coomasie briliant blue (Lampiran 3) sebanyak 20 ml, kemudian

didiamkan selama 10 menit.

Destaining gel

Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades sebanyak 3 kali masing-

masing selama 5 menit. Larutan destaining solution (Lampiran 3) ditambahkan

dan digoyangkan sekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Larutan

penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.

Penentuan berat molekul protein

Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara

mobilitas relatif protein marker (penanda protein) dengan logaritma dari berat

molekul marker yang diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan

membandingkan jarak migrasi protein diukur dari garis awal separating gel

sampai ujung pita protein yang dibandingkan dengan jarak migrasi pewarna.

Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai persamaan berikut :

Rf =

3.4.6 Preparasi Serum Penderita Alergi (Zakaria et al., 1998)

Serum darah diambil dari 15 penderita alergi dan 1 orang normal atau tidak

alergi yang diketahui melalui kuisioner dan persetujuan responden (Lampiran 5).

Kualifikasi responden yang dipilih adalah yang mempunyai riwayat alergi

serangga dan bahan pangan lainnya, setiap orang diambil darahnya sebanyak 10

mL. Darah ditempatkan dalam tabung mengandung EDTA. Darah penderita alergi

34

dibawa ke laboratorium untuk dipisahkan serumnya dengan cara sentrifugasi.

Darah tersebut diinkubasi selama 1 jam, lalu disentrifugasi pada kecepatan 2500

rpm selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh sebanyak ± 5 mL dan

merupakan serum yang mengandung IgE. Serum disimpan pada suhu -20 °C.

3.4.7 Immunoblotting (Bollag & Edelstein, 1991)

Gel hasil elektroforesis yang tidak diwarnai ditransfer ke membran

nitroselulosa (0.45 μm). Gel dan membran nitroselulosa disusun dalam alat

transblotting, lalu diisi dengan bufer transfer (Lampiran 4). Blotting ini dilakukan

pada 90 V selama 90 menit. Tahap selanjutnya membran dilepas dari rangkaian

alat dan direndam atau difiksasi dengan metanol 50% selama 2 menit, lalu diblok

dengan susu skim 5% dalam PBST (Lampiran 4) selama 1 jam pada suhu kamar.

Membran dicuci dengan PBST 3 (Lampiran 4) kali, masing-masing selama

5 menit. Setelah dicuci, membran ditambah serum penderita alergi serangga

dengan pengenceran 1:10 dalam PBST (Lampiran 4), selanjutnya diinkubasi

selama 2 jam pada suhu kamar. Pencucian dilakukan lagi dengan PBST

(Lampiran 4) sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, lalu diberi antibodi

HRP conjugated monoclonal mouse anti-human IgE (pengenceran 1:3000 dalam

PBST) dan diinkubasi selama 1 jam sambil digoyang. Membran dicuci kembali

dengan PBST (Lampiran 4) sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit, dan

ditambah substrat DAB (Lampiran 4). Hasil deteksi positif kompleks protein

alergen dengan serum ditandai dengan terbentuknya pita berwarna coklat pada

membran nitroselulosa.

35

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Bahan Baku

4.1.1 Hasil Identifikasi Bahan Baku

Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah belalang sawah

yang berasal dari Sijunjung, Sumatera Barat. Identifikasi dilakukan di Bidang

Zoology Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong dan didapatkan data bahwa

spesies belalang sawah yang digunakan merupakan Oxya chinensis. Tujuan

identifikasi adalah untuk mengetahui jenis spesies belalang yang digunakan.

Gambar 9 menunjukkan belalang sawah yang digunakan sebagai bahan baku di

penelitian ini. Hasil identifikasi spesies terdapat pada Lampiran 6.

Gambar 9. Belalang sawah (Oxya chinensis) (Dokumentasi pribadi, 2017).

Belalang sawah yang digunakan memiliki tubuh berwarna hijau dan

terdapat corak hitam pada bagian punggung atas tubuh. Tubuh belalang terdiri

36

dari 3 bagian utama, yaitu kepala, dada dan perut. Belalang memiliki 2 mata, 6

enam kaki bersendi, 2 sayap, dan 2 antena. Kaki belakang yang panjang

digunakan untuk melompat sedangkan kaki depan yang pendek digunakan untuk

berjalan. Belalang tidak memiliki telinga, akan tetapi dapat mendengar.

4.1.2 Kandungan Proksimat

Uji proksimat dilakukan di Laboratorium Pangan Pusat Laboratorium

Terpadu (PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Uji proksimat terdiri dari uji

kadar air, abu, protein, lemak dan karbohidrat. Bagian tubuh belalang sawah

(Oxya chinensis) yang digunakan pada penelitian ini adalah keseluruhannya tanpa

terkecuali. Hal ini dikarenakan semua anggota tubuh belalang sawah dapat

dikonsumsi.

Tabel 2. Komposisi kimia belalang sawah (Oxya chinensis)

Bahan Baku

(Belalang)

Komponen (%)

Air Abu Protein Lemak Karbohidrat

Mentah 67,70±0,77 1,46±0,14 23,18±0,01 6,02±0,28 1,64±0,16

Rebus 71,93±0,08 0,78±0,17 19,8±0,07 7,3 ±0,04 0,66±0,13

Goreng 19,5±0,18 1,69±0,08 17±0,14 41,31±0,21 20,5±0,33

Rendang 7,62±0,13 4,97±0,64 17,4±0,03 55,44±0,06 14,57±0,60

Hasil uji proksimat belalang sawah ditampilkan pada Tabel 2. Penelitian

sebelumnya uji komposisi kimia pada bahan baku sejenis telah pernah dilakukan

oleh Kim et al., (2017). Penelitan tersebut menyatakan bahwa pada spesies Oxya

chinensis sinuosa mengandung kadar protein 74,2; lemak 3,03; abu 4,4; dan

karbohidrat 18,2%. Hasil kadar lemak dan kadar abu pada belalang mentah

memiliki nilai 6,02 dan 1,46%, hasil ini tidak berbeda jauh dengan penelitian Kim

et al., 2017. Perbedaan yang signifikan terdapat pada kadar protein dan kadar

37

karbohidrat. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya jenis belalang

yang tidak spesifik sama dan lingkungan hidup yang berbeda.

Kadar Air

Belalang mentah memiliki kadar air yang cukup tinggi yaitu 67,70%. Hal ini

menunjukkan bahwa belalang yang masih mentah tanpa dilakukan proses

pengolahan memiliki kandungan air yang cukup tinggi. Kadar air tertinggi

terdapat pada sampel belalang rebus. Hal ini diduga karena perlakuan perebusan

menyerap air yang lebih banyak selama pengolahan dilakukan.

Kadar air pada belalang goreng 19,5% dan belalang rendang 7,62%

mengalami penurunan yang sangat signifikan. Penurunan kadar air yang terjadi

dapat diperkirakan karena adanya proses pengolahan yang dialami oleh belalang.

Proses pengolahan goreng yang melibatkan minyak dan panas diperkirakan dapat

menghilangkan kandungan air yang terdapat di dalam belalang. Suhu panas yang

terjadi pada penggorengan dapat menguapkan air. Belalang rendang juga

mengalami penurunan kadar air dikarenakan belalang dimasak dengan waktu yang

cukup lama berkisar antara 4-6 jam pada suhu panas yang stabil. Hal ini diduga

dapat mengakibatkan menguapnya kadar air yang terkandung di dalam belalang

tersebut.

Fitriani (2008) menyatakan bahwa semakin lama waktu pemasakan pada

bahan pangan maka kadar air akan menurun. Hal ini menyebabkan penguapan air

lebih banyak sehingga kadar air dalam bahan semakin kecil. Menurut Winarno

(2002), semakin tinggi suhu yang digunakan semakin banyak pula molekul-

molekul air yang keluar dari permukaan dan menjadi gas. Penggunaan panas pada

proses pemasakan bahan pangan sangat berpengaruh pada nilai gizi pangan.

38

Proses penggorengan merupakan pengolahan pangan menggunakan suhu tinggi

yang dapat menurunkan kandungan lemak dan merusak vitamin dan mineral

(Winarno, 1980).

Kandungan air dalam produk makanan akan mempengaruhi daya tahan

produk makanan terhadap serang mikroba. Air yang terdapat dalam bahan

makanan akan dipergunakan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Kadar

air yang tinggi dalam bahan makanan akan menyebabkan produk makanan mudah

rusak (Winarno, 2002).

Kadar Abu

Semakin tinggi kadar abu maka semakin tinggi pula kadar mineral dalam

bahan pangan tersebut. Unsur mineral merupakan zat anorganik atau yang dikenal

sebagai kadar abu (Winarno, 2002). Kadar abu pada belalang rebus mengalami

penurunan hal diduga karena kandungan air masih banyak didalam belalang.

Menurut Sundari et al., (2015) masing-masing organisme memiliki kemampuan

yang berbeda-beda dalam meregulasikan dan mengabsorpsi logam. Kadar abu

pada belalang goreng megalami peningkatan, hal ini diduga karena proses

pemanasan dapat menghilangkan kandungan air. Tinggi rendahnya nilai kadar abu

pada bahan pangan yang digoreng tergantung dari lama waktu dan suhu

penggorengan. Kenaikan kadar abu pada bahan pangan yang digoreng disebabkan

oleh suhu tinggi sehingga kandungan air banyak hilang (Sumiati, 2008).

Kadar abu tertinggi dihasilkan dari belalang rendang. Hal ini diduga

karena masih banyak mineral-mineral yang terserap dari bumbu rendang pada

belalang. Proses pengolahan rendang melibatkan proses pengolahan pengeringan.

Proses pengeringan mengakibatkan terjadinya penguraian komponen ikatan

39

molekul air (H2O) dan juga memberikan peningkatan terhadap kandungan gula,

lemak, mineral sehingga mengakibatkan terjadinya peningkatan kadar abu

(Hadipernata et al., 2006).

Kadar Protein

Belalang mentah memiliki kadar protein yang paling tinggi yaitu 23,18%.

Hal ini diperkirakan karena belalang mentah belum mendapat perlakuan proses

pengolahan. Penurunan kadar protein pada belalang rebus diperkirakan karena

adanya pemanasan yang dapat merusak komposisi protein yang terkandung di

dalam belalang. Kadar protein pada belalang rebus 19,8%, kadar proteinnya

mengalami penurunan dibandingkan belalang mentah. Hal ini diduga karena

penggunaan suhu tinggi pada saat proses pengolahan dapat merusak kandungan

gizi pada bahan pangan. Perebusan dapat menurunkan kadar protein karena

pengolahan dengan menggunakan suhu tinggi akan menyebabkan denaturasi

protein sehingga terjadi koagulasi dan menurunkan solubilits atau daya

kemampuan larutnya (Sundari et al., 2015).

Kadar protein yang didapatkan pada belalang goreng 17% adalah yang

paling rendah. Hal ini diduga karena suhu yang digunakan pada penggorengan

cukup tinggi dan protein akan rusak dengan panas yang sangat tinggi. Menurut

Sundari et al., (2015) penggorengan dapat menurunkan kadar protein karena pada

proses penggorengan sebagian minyak goreng akan menempati rongga-rongga

bahan pangan menggantikan posisi air yang menguap sehingga konsentrasi

protein per satuan berat bahan menjadi lebih kecil.

Protein pangan terdenaturasi jika dipanaskan pada suhu 60–90 0C selama

satu jam. Pemanasan protein dapat menyebabkan berbagai reaksi, diantaranya

40

denaturasi dan kehilangan aktivitas enzim. Proses pemanasan menyebabkan

protein yang tersusun dari beberapa asam amino yang mempunyai gugus reaktif

akan berikatan dengan komponen lain seperti gula pereduksi yang menyebabkan

reaksi Mailard (Palupi et al., 2007). Reaksi mailard ditampilkan pada Gambar 10.

Gambar 10. Reaksi mailard (Blackweel, 2012)

Rendahnya kadar protein pada belalang goreng dapat diduga dikarenakan

terjadinya reaksi Mailard. Menurut (Vaclavik & Christian, 2007) reaksi Mailard

ini sering terjadi selama pemanasan. Reaksi Mailard meningkat tajam pada saat

suhu yang digunakan cukup tinggi (Winarno, 2002). Reaksi Mailard yaitu reaksi

antara gugus amino dari suatu asam amino bebas residu rantai peptida atau protein

dengan gugus karbonil dari suatu karbohidrat apabila keduanya dipanaskan

(Lakshmi, 2014). Reaksi Mailard dapat merusak lisin dan sistein, menurunkan

ketersediaan semua asam-asam amino termasuk isoleusin yang paling stabil. Pada

akhir reaksi terbentuk pigmen coklat melanoidin yang memiliki bobot molekul

besar. (Palupi et al., 2007).

41

Kadar Lemak

Kadar lemak belalang sawah meningkat jauh setelah mengalami proses

pengolahan kecuali pada belalang rebus. Kadar lemak pada belalang rendang

55,44% dan belalang goreng 41,31%, relatif lebih tinggi dibandingkan belalang

mentah. Hal ini diduga oleh adanya minyak yang terserap oleh belalang sawah

tersebut yang mengakibatkan kadar lemak pada belalang sawah menjadi

bertambah. Tingginya kadar lemak pada belalang rendang diduga karena lemak

yang berasal dari bumbu rendang juga terdeteksi dalam uji kadar lemak.

Proses pengolahan pada bahan pangan menyebabkan terjadinya kerusakan

lemak. Kerusakannya sangat bervariasi tergantung pada suhu yang digunakan dan

lamanya waktu proses pengolahan. Makin tinggi suhu yang digunakan, maka

semakin spesifik kerusakan lemak (Sundari et al., 2015).

4.2 Ekstrak Protein Terlarut

Ekstrak protein sampel belalang sawah yang diekstraksi menggunakan

phosphate buffer saline, diukur kadar protein dengan metode Bradford. Hasil

perhitungan kadar protein pada belalang sawah dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Kadar protein esktrak protein terlarut belalang sawah

Bahan baku Konsentrasi akhir (ppm)

Belalang mentah 7222,25±0,00

Belalang rebus 893,97±0,02

Belalang goreng 703,43±0,05

Belalang rendang 1123,08±0,00

Kadar protein tertinggi diperoleh pada belalang rendang, sedangkan kadar

protein terendah dihasilkan pada proses pengolahan goreng. Pemanasan pada

bahan makanan akan menurunkan kadar protein. Menurut Sundari et al., (2015)

42

reaksi yang terjadi saat pemanasan protein tersebut dapat merusak kondisi protein,

sehingga kadar protein menurun. Pernyataan ini bertolakbelakang dengan hasil

yang diperoleh pada belalang rendang.

Hal ini diduga bahwa adanya faktor pengaruh protein yang dihasilkan dari

bumbu rendang yang mengakibatkan tingginya kadar protein yang dihasilkan.

Pada belalang rendang adanya bumbu yang terdiri dari berbagai macam rempah-

rempah yaitu bawang merah, bawang putih, lengkuas, jahe, kemiri, cabe merah,

keturnbar, kunyit, daun kunyit, daun jeruk, serai dan asam kandis.

4.3 Profil Protein dengan Elektroforesis

Hasil profil protein ekstrak protein belalang ditampilkan pada Gambar 11.

Konsentrasi akrilamida yang digunakan yaitu, stacking gel 5% dan separating gel

12%. Pita protein yang didapat dari hasil SDS-PAGE menghasilkan beberapa pita

yang tipis, diduga karena konsentrasi protein pada rentang tersebut sangat rendah.

Tebal tipisnya pita protein yang terbentuk pada SDS-PAGE menunjukkan

banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama, yang berada pada

posisi pita yang sama. Hal ini sesuai dengan prinsip pergerakan molekul

bermuatan yaitu molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh

medan listrik. Molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi

pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Sudarmadji, 1989)

43

h

M A B C D

Gambar 11. Hasil SDS-PAGE Ekstrak Protein: (A) belalang mentah, (B)

belalang rebus, (C) belalang goreng, (D) belalang rendang dan M

adalah protein marker

Ekstrak protein belalang mentah memiliki banyak pita protein dibandingkan

sampel yang lain. Hal ini diduga karena sampel yang digunakan tidak dilakukan

proses pengolahan. Protein yang terkandung di dalam belalang mentah belum

mengalami kerusakan, sehingga protein dapat larut sempurna pada saat ekstraksi.

Penelitian Kamath et al., (2013) mendapatkan hasil yang sama dengan penelitian

ini. Profil protein ekstrak moluska yang dilakukan proses pengolahan

menghasilkan pita protein yang lebih sedikit dibandingkan yang mentah.

250 KDa

150 KDa

100 KDa

75 KDa

50 KDa

37 KDa

25 KDa

20 KDa

15 KDa

10 KDa

44

Tabel 4. Berat molekul protein belalang sawah dengan SDS-PAGE

Marker Belalang

mentah

Belalang

rebus

Belalang

goreng

Belalang

rendang

Rf BM

(KDa) Rf

BM

(KDa) Rf

BM

(KDa) Rf

BM

(KDa) Rf

BM

(KDa)

0,097 250 0,048 >250 0,048 >250 0,048 >250 0,048 >250

0,145 150 0,194 116 0,145 150 0,145 150 0,145 150

0,210 100 0,210 111 0,290 86 0,306 81 0,323 77

0,282 75 0,226 105 0,371 66 0,323 77 0,516 42

0,379 50 0,242 100 0,387 63 0,339 73 0,565 36

0,484 37 0,258 95 0,532 39 0,516 42 0,661 26

0,645 25 0,274 90 0,548 38 0,677 25 0,677 25

0,726 20 0,290 86 0,677 25 0,984 9 0,694 24

0,903 15 0,355 70 0,694 24 1,000 9 0,694 24

1,000 10 0,403 60 0,855 14 0,726 21

0,435 54 0,919 11 0,790 17

0,452 51 0,935 11 0,855 14

0,516 42 0,984 9 0,871 13

0,548 38 1,000 9 0,919 11

0,565 36 0,935 11

0,581 34 0,984 9

0,597 32 1,000 9

0,613 31

0,629 29

0,645 28

0,661 26

0,677 25

0,694 24

0,806 16

0,823 16

0,839 15

0,855 14

0,935 11

0,984 9

1,000 9

Hasil perhitungan berat molekul belalang mentah, rebus, goreng dan

rendang ditampilkan pada Tabel 4. Berat molekul yang dihasilkan diperoleh dari

perhitungan dengan perbandingan pada marker. Contoh perghitungan yang

dilakukan untuk mendapat berat molekul pada bahan baku terdapa pada Lampiran

9.

45

4.3.1 Profil Protein Belalang Mentah

Belalang mentah yang telah diekstraksi kemudian dianalisa profil

proteinnnya menggunakan SDS-PAGE. Pita protein yang dihasilkan pada

belalang mentah yaitu sebanyak 31 pita (Gambar 11). Berat molekul protein

belalang mentah yang ditampilkan pada Tabel 4 menunjukkan beberapa nilai yang

berdekatan. Hal ini disebabkan oleh adanya pita-pita yang berdekatan dan

menumpuk pada gel elektroforesis. Protein yang memiliki ketebalan dan intensitas

warna yang lebih besar dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap varietas

disebut protein mayor (Wijaya & Rohman, 2001). Protein mayor pada belalang

(Oxya chinensis) mentah diduga terdapat pada protein dengan berat molekul 60,

70, 11, 14, 15 KDa.

Menurut penelitian Roy & Ghosh (2016) serangga Oxya hyla hyla memiliki

protein pada berat molekul 111, 36, 38, 31, 28, 26, 25, 15, dan 14 KDa. Menurut

Yi & Gillott (1999) serangga Melanoplus sanguinipes memiliki protein pada berat

molekul 24, 25, 26, 28, 29, 31, 42 KDa. Menurut Sieminska et al., (2015)

serangga Melanoplus sanguinipes memiliki protein pada berat molekul 15, 24, 25,

34, 36, 38, 42, 54, dan 70 KDa. Hal ini membuktikan bahwa serangga dengan

spesies yang berbeda akan tetapi dengan family sama, dapat memiliki beberapa

jenis protein dengan berat molekul yang sama.

4.3.2 Profil Protein Belalang Rebus

Proses pengolahan pada belalang sawah yang pertama dengan menggunakan

media air dan pemanasan, yaitu direbus. Jumlah pita protein yang dihasilkan pada

belalang rebus mengalami penurunan dibandingkan dengan pita protein pada

belalang mentah. Pita protein yang dihasilkan pada belalang rebus yaitu sebanyak

46

14 pita (Gambar 11). Setengah bagian dari pita protein pada belalang mentah tidak

terdeteksi pada belalang rebus. Hal ini menunjukkan bahwa adanya protein yang

rusak pada saat sampel dilakukan proses pengolahan dalam hal ini yaitu

perebusan.

Menurut Sundari et al., (2015), proses perebusan dapat menurunkan kadar

protein dalam bahan pangan, dikarenakan pengolahan menggunakan suhu tinggi

akan menyebabkan denaturasi protein sehingga terjadi koagulasi dan menurunkan

solubilitas atau daya kemampuan larutnya. Pemanasan protein dapat

menyebabkan terjadinya banyak reaksi. Reaksi tersebut diantaranya, denaturasi,

hidrasi, perubahan warna dan derivitasi residu asam amino.

Denaturasi yang terjadi pada protein belalang rebus dapat menyebabkan

kelarutan protein berkurang. Hal ini menyebakan tidak semua protein yang

terdapat di dalam belalang rebus larut pada saat ekstraksi protein. Ekstrak protein

yang dihasilkan mengandung sedikit jenis protein, sehingga menyebabkan pita

protein yang terdeteksi pada SDS-PAGE juga lebih sedikit.

Protein pada belalang rebus memiliki beberapa berat molekul protein yang

sama dengan beberapa jenis serangga lainnya. Menurut Roy & Ghosh (2016)

serangga Oxya hyla hyla memiliki protein pada berat molekul 66, 38, 25, dan 14

KDa. Menurut Yi & Gillott (1999) serangga Melanoplus sanguinipes memiliki

protein pada berat molekul 66, 25, dan 24 KDa. Menurut Sieminska et al., (2015)

serangga Melanoplus sanguinipes memiliki protein pada berat molekul 24, 25, 38,

dan 39 KDa. Hal ini membuktikan bahwa serangga dengan proses pengolahan

dapat memiliki protein pada berat molekul yang sama dengan serangga lain tanpa

proses pengolahan.

47

4.3.3 Profil Protein Belalang Goreng

Proses pengolahan pada belalang sawah yang pertama dengan menggunakan

media minyak dan pemanasan, yaitu digoreng. Pita protein pada belalang goreng

adalah sampel yang menghasilkan pita paling sedikit. Pita protein yang dihasilkan

pada belalang goreng adalah 9 pita (Gambar 11). Menurut Yi & Gillott (1999),

serangga Melanoplus sanguinipes memiliki protein pada berat molekul 25 dan 42

KDa. Menurut Sieminska et al., (2015), serangga Melanoplus sanguinipes

memiliki protein pada berat molekul 25 dan 42 KDa. Jenis protein pada belalang

goreng yang berat molekulnya sama dengan serangga lainnya terdeteksis hanya

pada beberapa saja. Hal ini diduga karena protein pada belalang goreng telah

mengalami kerusakan disebabkan oleh proses pengolahan.

Kerusakan protein yang terjadi pada pengolahan penggorengan dua kali

lipat dibandingankan perebusan. Proses penggorengan bahan pangan menurunkan

kadar protein lebih tinggi dibanding perebusan karena suhu yang digunakan

sangat tinggi dan protein akan rusak dengan panas yang sangat tinggi. Proses

penggorengan menyebabkan sebagian minyak goreng akan menempati rongga –

rongga bahan pangan menggantikan posisi air yang menguap sehingga konsentrasi

protein persatuan berat bahan menjadi lebih kecil (Sundari et al., 2015).

4.3.4 Profil Protein Belalang Rendang

Proses pengolahan pada belalang sawah yang pertama dengan

menggunakan media bumbu dari rempah-rempah dan pemanasan yang cukup

lama, yaitu direndang. Pita profil protein yang dihasilkan pada sampel belalang

rendang terdeteksi lebih banyak dibandingkan belalang goreng. Pita protein yang

dihasilkan pada belalang goreng adalah 17 pita (Gambar 11). Hal ini diduga

48

dikarenakan adanya campuran protein yang dihasilkan dari bumbu rendang yang

dapat meningkatan nilai protein dari belalang rendang. Adanya bumbu rendang

yang terserap ke dalam belalang mengakibat protein yang terdeteksi pada

elektroforesis kemungkinan tidak begitu murni.

Menurut Roy & Ghosh (2016), serangga Oxya hyla hyla memiliki protein

pada berat molekul 36, 26, 25, dan 14 KDa. Menurut Yi & Gillott (1999),

serangga Melanoplus sanguinipes memiliki protein pada berat molekul 21, 24, 25,

26, dan 42 KDa. Menurut Sieminska et al., (2015), serangga Melanoplus

sanguinipes memiliki protein pada berat molekul 24, 25, 36, dan 42 KDa. Jenis

protein pada belalang goreng yang berat molekulnya sama dengan serangga

lainnya terdeteksi hanya pada beberapa saja. Hal ini diduga karena protein pada

belalang goreng telah mengalami kerusakan disebabkan oleh proses pengolahan.

4.4 Profil Protein Alergen dengan Immunoblotting

Pengumpulan responden yang diambil darahnya dilakukan dengan mengisi

kuesioner seperti pada Lampiran 5. Hasil pengisian kuesioner responden yang

mempunyai riwayat alergi ditampilkan pada Tabel 5. Darah yang diambil

kemudian dipisahkan dan diambil serum darahnya yaitu plasma darah yang

berwarna putih. Serum darah tersebut disimpan dalam freezer -20 0C. Uji

alergenisitas dilakukan dengan cara ekstrak protein belalang sawah diuji

kemampuannya berikatan dengan IgE spesisifik yang terkandung dalam serum

darah responden. Belalang sawah dengan berbagai macam proses pengolahan

diuji alergenisitas dengan metode immunoblotting.

49

Tabel 5. Riwayat alergi responden berdasarkan hasil kuesioner

Kode

Jenis

Kelamin

/

Umur

Penyebab Alergi Gejala yang timbul

1 p/34th Belalang, daging kambing, udang Gatal-gatal di dalam mulut

2 p/40th Belalang, udang, hujan Sakit perut, diare

3 p/23th Belalang, daging sapi, daging kambing Gatal-gatal, sakit perut

4 p/31th Belalang, daging sapi Gatal-gatal

5 p/41th Belalang, daging sapi Gatal-gatal di kerongkongan

6 l/23th Belalang, lebah, udang, kepiting hitam Gatal-gatal, pusing, muntah,

diare

7 l/30th Belalang, udang Gatal-gatal, psuing, mual, diare

8 l/27th Belalang, udang Gatal-gatal

9 l/35th Belalang, kacang, ikan, telur, mie instan Gatal-gatal, asma, mual, diare

10 l/29th Belalang, udang telur Gatal-gatal asma, mual

11 p/22th Tonkol, udang sawah, dingin, udara Gatal-gatal

12 l/22th Debu Batuk-batuk

13 l/22th Debu Bersin-bersin

14 p/22th Debu Jerawat

15 l/22th Debu Ruam pada wajah

Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah protein belalang sawah

merupakan golongan yang memiliki protein alergen. Protein alergen dapat

menyebabkan reaksi alergi pada manusia apabila manusia tersebut mengkonsumsi

bahan pangan yang mengandung protein tersebut. Uji alergenisitias ini

menggunakan metode immunoblotting dengan cara menggunakan serum darah

responden yang alergi terhadap beberapa bahan pangan sehari hari.

4.4.1 Protein Alergen Belalang Mentah

Ekstrak protein belalang mentah di immunoblotting dengan 15 serum

darah responden yang alergi dengan beberapa bahan pangan.

50

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Gambar 12. Hasil immunoblotting ekstrak protein belalang mentah dengan

serum subjek alergi dan M adalah protein marker.

Hasil immunoblotting serum darah positif alergi protein belalang mentah

dapat dilihat pada Gambar 12. Belalang mentah memiliki jenis protein alergen

paling sedikit dan berikatan dengan igE spesifik responden paling sedikit

dibandingkan dengan sampel lain. Serum darah yang diuji sebanyak 15 orang.

Responden yang terdeteksi positif alergi protein belalang mentah hanya satu

orang, yaitu pada responden (1). Responden (1) memiliki antibodi IgE yang

mengikat protein alergen dengan berat molekul 70 KDa. Protein alergen yang

diperoleh pada belalang sawah (Oxya chinensis) mentah sama dengan protein

alergen pada beberapa serangga di penelitian sebelumnya.

Penelitan Lopata et al., (2005) menyatakan bahwa jenis serangga Locusta

migratoria mendeteksi adanya protein alergen pada berat molekul 70 KDa. Chen

et al., (2012) menyatakan bahwa serangga Locusta migratoria terdeteksi adanya

profil protein alergen pada berat molekul 70 KDa. Pener (2016) juga menyatakan

adanya protein alergen dengan berat molekul 70 KDa pada serangga jenis Acheta

domesticus. Hal ini mebuktikan bahwa adanya protein alergen dengan berat

molekul yang sama pada serangga berbeda spesies dengan family yang sama.

51

Protein alergen dengan berat molekul 70 KDa pada serangga Locusta

migratoria menurut Allergome nama alergen tersebut adalah Loc m 7. Protein

alergen dengan berat molekul kisaran 70 KDa ini merupakan protein tropomiosin

pada insekta. Protein tropomiosin merupakan alergen mayor (Rounge & Barre,

2017). Hal ini menyebabkan adanya dugaan bahwa protein alergen pada belalang

sawah dengan berat molekul 70 KDa termasuk protein tropomiosin.

Serum darah responden yang mengalami alergi belalang diketahui

sebanyak 10 orang, akan tetapi pada saat diuji hanya satu orang yang

menghasilkan positif alergi. Hal ini diduga bahwa protein yang murni dari dari

belalang sawah tanpa adanya proses pengolahan menghasilkan lebih sedikit

protein alergen. Kandungan protein yang terdapat pada belalang mentah belum

mengalami kerusakan struktur protein yang diduga dapat menjadi penyebab suatu

protein menjadi protein alergen.

4.4.2 Protein Alergen Belalang Rebus

Ekstrak protein belalang rebus di immunoblotting dengan 15 serum darah

responden yang alergi dengan beberapa bahan pangan.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Gambar 13. Hasil immunoblotting ekstrak protein belalang rebus dengan

serum subjek alergi dan M adalah protein marker

52

Serum darah yang diuji sebanyak 15 orang. Responden yang terdeteksi

positif alergi protein belalang rebus yaitu 9 orang (Gambar 13). Berat molekul

protein alergen yang diperoleh pada belalang rebus ditampilkan pada Tabel 6.

Tabel 6. Berat molekul protein alergen pada belalang rebus

Kode Subjek

Responden

Berat Molekul Pita Protein Alergen (KDa)

Ke-1 Ke-2 Ke-3 Ke-4

1 >250 150 86 66

2 150

3 150

7 >250

11 >250

12 150

13 150

14 150

15 >250

Responden (1) memiliki IgE yang mampu berikatan dengan protein alergen

pada berat molekul >250, 150, 86 dan 66 KDa. Responden (2), (3), (12), (13), dan

(14) masing-masing memiliki IgE yang mampu berikatan dengan protein alergen

pada berat molekul 150 KDa. Responden (7), (11) dan (15) mempunyai IgE yang

mampu berikatan dengan protein alergen pada berat molekul >250 KDa.

Alergen yang utama pada makanan adalah protein, glikoprotein atau

polipeptida dengan berat molekul yang berkisar dari 3 sampai 160 kDa (Adelman

et al., 2002). Protein alergen yang diperoleh pada sampel ini adalah yang memiliki

bobot melukul diatas 100 KDa, yaitu 150 dan 250 KDa. Penelitian terdahulu juga

menyatakan terdapat beberapa serangga yang terdeteksi memiliki protein alergen

dengan berat molekul yang tinngi.

Menurut Chen et al., (2012) pada serangga jenis Locusta migratoria

menghasilkan protein alergen pada 130 KDa. Penelitian Jarolim et al., (2015)

pada serangga Locusta migratoria mendeteksi adanya protein alergen dengan

53

berat molekul 80, 125, >250 KDa. Penelitian Jarolim et al., (2015) pada serangga

Anacridium aegyptium mendeteksi adanya protein alergen dengan berat molekul

90 dan 152 KDa. Penelitian Phiriyangkul (2015), pada serangga Patanga succinta

mendeteksi adanya protein alergen dengan berat molekul 65 KDa.

Protein alergen yang terdapat pada belalang sawah rebus memiliki beberapa

jenis protein alergen yang sama dengan serangga spesies lainnya. Hal ini diduga

bahwa epitop yang tebentuk pada saat denaturasi pada belalang rebus memiliki

kesamaan bentuk dengan epitop pada protein jenis serangga lain tanpa

didenaturasi. Adanya proses pengolahan mengakibatkan jenis epitop baru yang

terbentuk menyerupai epitop yang telah ada pada jenis serangga lainnya, sehingga

sifat antigeniknya meningkat.

4.4.3 Protein Alergen Belalang Goreng

Ekstrak protein belalang goreng di immunoblotting dengan 15 serum darah

responden alergi beberapa bahan pangan.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Gambar 14. Hasil immunoblotting ekstrak protein belalang goreng dengan serum

j subjek alergi dan M adalah protein marker

54

Sebanyak 15 serum darah responden yang diuji didapatkan hasil 6 orang

yang positif alergi (Gambar 14). Berat molekul protein alergen yang diperoleh

pada protein belalang goreng ditampilkan pada tabel 8.

Tabel 7. Berat molekul protein alergen belalang goreng

Kode Subjek Berat Molekul Pita Protein Alergen (KDa)

Ke-1

2 150

11 150

12 150

13 150

14 150

15 >250

Responden (2), (11), (12), (13), (14) masing-masing memiliki IgE yang

berikatan dengan protein alergen pada berat molekul 150 KDa. Responden (15)

memiliki IgE yang dapat berikatan dengan protein alergen pada berat molekul

>250 KDa. Penelitian Jarolim et al., (2015) pada serangga Locusta migratoria

mendeteksi adanya protein alergen dengan berat molekul 80, 125, >250 KDa.

Penelitian Jarolim et al., (2015) pada serangga Anacridium aegyptium mendeteksi

adanya protein alergen dengan berat molekul 90 dan 152 KDa.

Penelitian Phiriyangkul (2015), didapatkan hasil bahwa protein pada

serangga yang digoreng menghasilkan protein alergen yang lebih banyak

dibandingkan yang mentah. Pada Patanga succincta mentah menghasilkan 3 jenis

protein alergen, sedangkan Patanga succincta goreng menghasilkan 4 jenis

protein alergen. Sesuai dengan hasil penelitian ini, protein alergen pada belalang

mentah lebih sedikit dibandingkan belalang goreng. Hal ini membuktikan bahwa

dengan adanya proses pengolahan, terdapat epitop linear yang tidak dapat dirusak

oleh denaturasi dan adanya epitop baru yang terbentuk akibat denaturasi.

55

4.4.4 Profil Protein Belalang Rendang

Ekstrak protein belalang rendang di blotting dengan 15 serum darah

responden alergi beberapa bahan pangan.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Gambar 15. Hasil immunoblotting ekstrak protein belalang rendang dengan

serum subjek alergi dan M adalah protein marker

Serum darah yang diuji sebanyak 15 orang. Responden yang terdeteksi

positif alergi protein belalang rendang yaitu 7 orang (Gambar 15). Berat molekul

protein alergen yang didapatkan ditampilkan pada Tabel 9.

Tabel 8. Berat molekul protein alergen pada belalang rendang

Kode Subjek Berat Molekul Pita Protein Alergen (KDa)

Ke-1

2 150

3 24

11 150

12 150

13 150

14 150

15 >250

Responden (2), (11), (12), (13), (14) masing-masing memiliki IgE yang

berikatan dengan protein alergen pada berat molekul 150 KDa. Responden (15)

memiliki IgE yang dapat berikatan dengan protein alergen pada berat molekul

>250 KDa. Responden (3) memiliki IgE yang dapat berikatan dengan protein

alergen pada berat molekul 24 KDa.

56

Penelitian Jarolim et al., (2015) pada serangga Locusta migratoria

mendeteksi adanya protein alergen dengan berat molekul 25 KDa. Penelitian

Jarolim et al., (2015) pada serangga Anacridium aegyptium mendeteksi adanya

protein alergen dengan berat molekul 152 KDa. Hal ini membuktikan bahwa

protein alergen yang terdapat pada belalang sawah rendang masih memiliki

beberapa jenis protein alergen yang sama dengan serangga tanpa proses

pengolahan lainnya.

Protein alergen yang dihasilkan pada belalang sawah (Oxya chinensis)

terdapat pada beberapa berat molekul. Belalang sawah dapat disimpulkan

mempunyai potensi sebagai penyebab alergi. Belum ada laporan penelitian

lainnya yang berkaitan dengan alergenisitas belalang sawah. Data alergen

belalang sawah belum terdapat di dalam database Allergome, sehingga belum

dapat diketahui karakter dan nama protein alergen belalang sawah.

Tabel 9. Berat molekul protein alergen belalang sawah (Oxya chinensis) dan h

j olahannya

Kode

responden

Berat molekul protein alergen (KDa)

Belalang

mentah Belalang rebus

Belalang

goreng

Belalang

rendang

1 70

>250

150

86

66

- -

2 - 150 150 150

3 - - - 24

4 - - - -

5 - - - -

6 - - - -

7 - >250 - -

8 - - - -

9 - - - -

10 - - - -

11 - >250 150 150

12 - 150 150 150

13 - 150 150 150

14 - 150 150 150

15 - >250 >250 >250

57

Berat molekul protein alergen pada belalang sawah mentah, rebus, goreng

dan rendang ditampilkan pada Tabel 10. Protein alergen yang dihasilkan pada

belalang sawah olahan menghasilkan protein alergen yang lebih banyak. Dapat

disimpulkan bahwa hasil proses pengolahan pada belalang sawah dapat

meningkatkan sifat alergenisitas. Beberapa penelitian terdahulu terkait tingkat

alergenisitas dengan proses pengolahan mendapatkan hasil yang sama.

Penelitian Phiriyangkul (2015), pada serangga spesies Patanga succinta

menyatakan bahwa proses pengolahan dapat meningkatkan sifat alergenisitas.

Menurut Kamath et al., (2013), pada ekstrak crustacean dan moluska, proses

pengolahan dapat meningkatan deteksi antibodi pada tropomiosin. Penelitian

Knulst & Bruijnzeel (2017), pada serangga spesies Tenebrio molitor menyatakan

bahwa proses pengolahan meningkatkan sifat antigeniknya. Menurut Kamath et

al., (2014) proses pengolahan pada kerang dapat meningkatkan efek pengikatan

antibodi IgE dan reaktivitas tropomiosin dan alergen tahan panas lainnya.

Berdasarkan penelitian ini, maka protein belalang sawah (Oxya chinensis)

dapat diklasifikasikan sebagai salah satu sumber protein alergen. Metode

pengolahan makanan dapat meningkatkan, mengurangi atau menghilangkan

potensi alergi makanan (Wal, 2003). Alergen yang berasal dari hewan umumya

memiliki sifat termostabilitas yang tinggi, sehingga sifat alerginisitas pada protein

yang dipanaskan akan meningkat (Boye & Godefroy, 2010).

Protein alergen pada belalang yang mengalami proses pengolahan terlihat

lebih banyak berikatan dengan IgE spesifik responden. Hal ini dapat disebabkan

oleh adanya denaturasi protein pada saat proses pengolahan yang dapat

mempengaruhi epitope pada alergen. Epitop pada alergen terdiri dari dua bentuk

58

yaitu linear dan konformasi. Denaturasi protein yang memiliki epitop dapat

merubah konformasinya sehingga dapat menghilangkan sifat antigeniknya atau

justru membentuk epitop baru. Epitop yang berbentuk linear tidak dapat dirusak

oleh denaturasi, akan tetapi denaturasi membuat struktur sekunder suatu protein

keluar sehingga antigeniknya semakin bertambah (Kindt et al., 2007).

Pada saat dilakukan proses pengolahan maka terjadi denaturasi pada

protein. Denaturasi menyebabkan protein alergen pada belalang sawah olahan

lebih banyak terdeteksi dibandingkan belalang sawah mentah. Denaturasi protein

yang terjadi menyebabkan protein pada belalang sawah menjadi semakin

antigenik.

59

BAB V

PENUTUP

5.1 Simpulan

1. Belalang sawah (Oxya chinensis) dan olahannya mengandung protein alergen

pada berat molekul 24, 66, 70, 86, 150, dan >250 KDa.

2. Proses pengolahan dari belalang sawah (Oxya chinensis) akan berpengaruh

pada sifat alergenisitasnya, yaitu terjadi peningkatan. Hal ini dilihat dari

banyaknya IgE spesifik responden yang dapat berikatan dengan protein

alergen pada belalang sawah olahan dibandingkan belalang mentah.

5.2 Saran

Saran dari penelitian ini adalah agar dilakukan penelitian lebih lanjut untuk

mendapatkan nama spesifik dari protein alergen pada belalang sawah (Oxya

chinensis) yang telah teridentifikasi. Metode lanjutan yang dilakukan yaitu

metode ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Protein alergen yang

ditemukan dilaporkan pada pihak allergome. Nama alergen akan dimunculkan

pada database allergome. Dalam lingkungan medis ekstrak protein alergen dapat

digunakan untuk membuat skin prick test dan immunostick untuk uji klinik alergi.

60

DAFTAR PUSTAKA

Abbas, A.K.,&Litchtman, A.H. (2009). Basic Immunology Functions and

Disorders of the Immune System. Philadelphia: WB Saunders Elsevier.

Adelman, D., Casale, T., & Corren, J. (2002). Manual of Allergy & Immunology

(5th ed.). California: Lippincot Williams & Wilkins.

Alberts, B., Johnson, & Lewis, J. (2002). Molecular Biology of the Cell (4th ed.).

New York: Gartand Science.

Baratawidjaja, K.G., & Rengganis, I. (2006). Imunologi Dasar (9th ed.). Jakarta:

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

Bateman, E.D., Jithoo, A. (2007). Asthma and Allergy A Global Perspective in

Allergy. Europe Journal Allergy Clinic Immunology, 62(3),213-5.

Berg, J., Tymoczko, J., & Stryer, L. (2002). Biochemistry (5th ed.). New York:

W.H Freeman.

Bintang, M. (2010). Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga.

Blackweel, Wiley. (2012). Food Biochemistry and Food Processing. 2nd (ed).

New York.

Bollag, D., & Edelstein, S. (1991). Protein Method. New York: Willey-Liss.

Boye, J. I., & Godefroy, S. B. (2010). Allergen Management in the Food Industry.

San Fransisco: Health.

Bradford, M. M., Pedroche, J., Yust, M.M., Girón-Calle, J., Alaiz, M., Millán, F.,

& Vioque, J. (1976). A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of

Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye

Binding. Analytical Biochemistry, 72(1–2), 248–254.

Budiyanto, A. K. (2004). Gizi pada anak. In Dasar Dasar Ilmu Gizi. Universitas

Muhammadiyah: UMM Press.

Bush, R.K., & Hefle, S. (1996). Food Allergens. Critical Reviews in Food Science

and Nutrition, 36(S), 119–163.

Campbell, N., Jane, B., & Laewrence, M. (2000). Biology. (W. Manalu, Ed.) (5th

ed.). Jakarta: Erlangga.

Carson, S., Miller, H.B., & Witherow, D.S. (2012). Molecular Biology

Techniques (3rd ed.). London: Elsevier.

Candra, Y., Setiarini, A., & Rengganis, I. (2011). Gambaran Sensitivitas Terhadap

alergen makanan. Makara Kesehatan, 15(1), 44–50.

61

Chen, Y.K., Wu, Y.L., & Liu, Z.G. (2012). Purification and Identification of

Allergens in Locusta Migratoria manilensis. Chinese Journal of Applied

Entomology, 49, 244–247.

Cianferoni, A., & Jonathan, M. (2009). Food Allergy: Revie, Classification and

Diagnosis. Allergol Int, 58(4), 457–466.

CPC (Crop Protection Compendium). (2000). Commonwealth Agricultural

Bureau (CAB).

Durst, P.B., Johnson, D.V, Leslie, R., & Shono, K. (2010). Forest Insects As

Food: Humans Bite Back. Bangkok: Food and Agriculture Organization of

the United Nations.

Estiasih, T. (2016). Kimia dan Fisik Pangan. Jakarta: Bumi Aksara.

Fatchiyah. (2011). Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.

Fitriani, S. (2008). Pengaruh Suhu dan Lama Pengeringan Terhadap Beberapa

Mutu Manisan Belimbing Wuluh Kering. Jurnal Teknologi Pangan, 7, 72–

77.

Gandy, J., Madden, A., & Holdsworth, M. (2014). Gizi dan Dietika (2nd ed.).

Jakarta: Buku Kedokteran EGC.

Gunawan, D. (2010). Pengobatan Cara Medis, Herbal, Alternatif untuk Alergi

Rhinitis. Baltimore: University of Maryland Medical Centre.

Gupta, R., Ashley, A., Namrita, J., & Matthew, J. (2013). Childhood Food

Allergies: Current Diagnosis, Treatment, And Management Strategies. Mayo

Clinic Proceedings, 88(5), 512–526.

Hadipernata, M., Rachmat, R., & Widaningrum. (2006). Pengaruh Suhu

Pengeringan Pada Teknologi Far Infrared Terhadap mutu jamur Merang

Kering (Volvariella volvaceae). Buletin Teknologi Pascapanen Pertanian.

Hashimoto, K., Watabe, S., Kono, M., & Shiro, K. (1979). Muscle Protein

Composition of Sardine and Mackerel. Bulletin of the Japanese Society of

Scientific Fisheries, 45(11), 1435–1441.

Huby, R.D.J., Dearman, R J., & Kimber, I. (2000). Why Are Some Proteins

Allergens?. Toxicological Sciences, 55(2), 235–246.

Janeway, Murphy, K., & Weaver, C. (2001). Immunobiology. New York: Garland

Publishing.

Jarolim, E.J., Scholl, I.P., Jensen, Sebastian, A.F., Robibaro, B., Kinaciyan,

Tamar. (2015). Reptile Pets Shuttle Grasshopper Allergy and Asthma Into

Homes. World Allergy Organization Journal, 8(24), 1-4.

62

Kamath, S., Abdel, R.A., Komoda, T., & Lopata, A. (2013). Impact of Heat

processing on The Detection of The Major Shellfish Allergen Tropomyiosin

in Crustaceans and Molluscs Using Specific Monoclonal Antibodies. Food

Chemistry, 141, 59-85.

Kamath, S., Voskamp, A., Komoda, T., Rolland, J., O’Hehir, R., & Lopata, A.

(2014). Effect of Heat Processing on Antibodi Reactivity to Allergen

Variants and Fragments of Black Tiger Prawn. Molecular Nutrition and

Food Research, 58, 110-142.

Kim, S., Weaver, C.M., & Choi, M. (2017). Proximate Composition and Mineral

Content of Five Edible Insects Consumed in Korea. Journal of Food, 15(1),

143–146.

Kindt, Thomas J., Richard A Goldsby, Barbara Anne Osborne, and J. K. (2007).

Immunology (6th ed.). New York: W. H. Freeman and Company.

Knulst, A.C., & Bruijnzeel, K. (2017). Allergenic Risks of Mealworm and Other

Insects. In Allergenic Risks of Mealworm and Other Insects (pp. 31–50).

Netherlands: Broekman.

Kresno, S. B. (2002). Imunologi : Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Jakarta:

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

Kumar, V., Abbas, A.K., & Aste, J.C. (2013). Robbins Basic Pathology (9th ed.).

Canada: Elsevier.

Laemmli. (2011). Laemmli SDS PAGE Fanglian He Carnegie Institution at

Stanford, 1, 3–6.

Lakshmi, C. (2014). Food Colouring: The Natural Way. Research Journal of

Chemical Science, 4(2), 87–96.

Lebendiker, M. (2002). The Protein Prufication Facility. Jerusalem: The Hebrew

University of Jerusalem.

Lehninger, A. L. (1976). Biochemistry. The Moleculer Basis of Cell Structure and

Function. (Second Edi). New York: Worth Publ.Inc.

Lierl, M. B., Riordan, M. M., & Fischer, T. J. (1994). Prevalence Of Insect

Allergen-Specific IgE In Allergic Asthmatic Childern In Cincinnati Ohio.

Journal Allergy, 72(1), 45–50.

Lopata, A. L., Fenemore, B., Gade, G., & Potter, P. (2005). Occupational Allergy

In Laboratory Workers Caused By The African Migratory Grasshopper

Locusta Migratoria. European Journal Of Allergy And Clinical Immunology,

60(2), 200-205.

63

Mills, E., Valovirta, E., Madsen, C., Taylor, S.L., & Vieths, S. (2004). European

Union Forum: Information Provision For Allergic Consumers Where Are We

Going With Food Allergen Labelling. Journal Allergy, 59, 1262–1268.

Muchtadi, D. (2010). Teknik Evaluasi Nilai Gizi Protein. Bandung: Alfabeta.

Munasir, Z., & Dadi, S. E. (2010). Reaksi Hipersensitivitas. In Buku Ajar Alergi-

Imunologi Anak (3rd ed., pp. 115–131). Jakarta: Ikatan Dokter Anak

Indonesia.

Nowak-wegrzyn, A. (2003). Future Approaches to Food Allergy. Pediatrics,

(111).

Palupi, N. S., Zakaria, F. R., & Prangdimurti, E. (2007). Pengaruh Pengolahan

Terhadap Nilai Gizi Pangan. Modul E-Learning ENBP, Departemen Ilmu &

Teknologi Pangan-Fateta-IPB.

Pawankar, R., Canonica, G.W., Holgate, S., & Lockey, R. (2011). White Book on

Allergy. World Allergy Organization.

Pener, M.P. (2016). Allergy To Crickets: A Review. Journal of Orthoptera, 25(2),

91–95.

Phiriyangkul, P. (2015). Effect of Food Thermal Processing on Allergenicity

Proteins in Bombay Locust (Patanga Succincta). International Journal of

Food Engineering, 1(1), 23–28.

Prawitasari, T., & Spa, K. (2007). Alergi Makanan. Jakarta. Gramedia.

Rachmania, R.A., Wahyudi, P., Wardani, A.M., & Insani, D.R. (2017). Profil

Berat Molekul Enzim Protease Buah Nanas dan Pepaya Menggunakan

Metode SDS-PAGE. Alchemy Jurnal Penelitian Kimia, 13(1), 52–65.

Rounge, P., & Barre, A. (2017). Allergy to Edible Insect. In Future Foods (pp.

71–88). France: University Paul Sabatier.

Roy, A.S., & Ghosh, D. (2016). Protein Profile of Three Developing Stage

Chorion (Eggshell) of Oxya hyla hyla (Orthoptera: Acrididae). Philippine

Journal of Science, 145(3), 211–214.

Shreffler, W. G., Beyer, K., & Chu, T. T. (2004). Microarray Immunoassay:

Association Of Clinical History , In Vitro Ige Function , And Heterogeneity

Of Allergenic Peanut Epitopes. Journal Allergy Clinic Immunology, 113,

776–782.

Sieminska, E., Andres, J., Todd, C., & Erlandson, M. (2015). Characterization of

Melanoplus sanguinipes Oviposition Stimulating Protein Expression and Re-

examination of Its Potential Role in Stimulating Oviposition. Journal of

Insect Physiology, 73, 37–46.

64

Soedarto. (2012). Alergi dan Penyakit Sistem Imun (1st ed.). Jakarta: Sagung Seto.

Sudarmadji, S. (1989). Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta:

Liberty Yogyakarta.

Sumiati, T. (2008). Pengaruh Pengolahan Terhadap Mutu Cerna protein Ikan

Mujair. Jurnal Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor.

Sundari, D., Almasyhuri, & Lamid, A. (2015). Pengaruh Proses Pemasakan

Terhadap Protein. Media Litbangkes, 25(4), 235–242.

Vaclavik, V., & Christian, E. (2007). Essentials of Food Science. New York:

Springer.

Wal, J. (2003). Thermal Processing and Allergenicity of Foods. Allergy, 58(727–

9).

Wijaya, S., & Rohman, L. (2001). Fraksinasi dan Karakterisasi Protein Utama Biji

Kedelai. Jurnal Ilmu Dasar, 2(1), 49–54.

Winarno, F. G. (1980). Pengantar Teknologi Pangan. Jakarta: Gramedia.

Winarno, F. G. (2002). Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka

Utama.

Yi, S.X., & Gillott, C. (1999). Purification and Characterization of An Oviposition

Stimulating Protein of The Long Hyaline Tubules in The Male Migratory

Grasshopper (Melanoplus sanguinipes). Journal of Insect Physiology, 45,

143–150.

Yuliati, A. (2005). Identifikasi Epitop dari Streptococcus mutans terhadap

sekretori Imunoglobulin A saliva. Jurnal Majalah Kedokteran Gigi, 38, 103–

107.

Zakaria, F., Ispurwanto, & Rahman. (1998). Telaah Sifat Alergenisitas Proteim

Udang Putih (Penaeus Merguensis) Untuk Produksi Isolat Alergen. Bulletin

Teknologi Dan Industri Pangan, 2(IX), 54–59.

65

LAMPIRAN

Lampiran 1. Pembuatan Buffer Posfat

Ditimbang sebanyak 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g NA2HPO4, 0,24 g

KH2PO4, kemudian dilarutkan dalam 800 mL akuades. Larutan ditambahkan HCl

hingga pH mencapai 7,4. Larutan ditambahkan akuades sampai batas tera labu

1000 mL. larutan disimpan di dalam lemari pendingin.

66

Lampiran 2. Pembuatan Larutan Analisis Kadar Protein

a. Pembuatan larutan Bradford

Sebanyak 100 mg pewarna coomasie brilliant blue G-250 dilarutkan ke

dalam 50 mL etanol 95%. Kemudian ditambahkan 100 mL asam fosfat 85% dan

ditepatkan hingga 1 L menggunakan akuades. Larutan kemudian disaring

menggunakan kertas Whatman No. 1, lalu larutan disimpan dalam botol gelap

pada suhu refrigerasi.

b. Pembuatan Larutan Standar BSA

Larutan induk BSA dibuat dengan cara, ditimbang 0,01 g BSA dilarutkan

dalam 10 mL akuades. Larutan ini merupakan larutan induk BSA 1000 ppm.

Deret larutan standar BSA dibuat dengan menggunakan larutan induk BSA ke

dalam tabung reaksi gelap sehingga konsentrasinya 100-1000 mg/L kemudian

ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford. Larutan divorteks dan diukur secara

spektrofotometri pada λ = 595 nm setelah 5 menit. Untuk blanko sebanyak 100 µL

akuades ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford dan diukur dengan cara yang sama.

Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel.

67

Lampiran 3. Pembuatan Larutan Kerja SDS-PAGE

a. Larutan A ( akrilamida dan N,N’ –metilen-bisakrilamid)

Sebanyak 30 g akrilamid dan 0.8 g N,N’ –metilen-bisakrilamid dilarutkan

dengan akuades dalam labu ukur 100 ml, kemudian ditambahkan akuades hingga

tanda tera. Larutan akrilamid dapat disimpan selama beberapa bulan dalam lemari

pendingin bersuhu 4 0C.

b. Larutan B (tris base dan SDS pH 8,8)

Sebanyak 18.17 g Tris base dan 4 mL SDS 10% dilarutkan dengan akuades.

Larutan ditepatkan pada pH 8.8 dengan HCl 1 N, kemudian dimasukkan ke

dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan akuades hingga tanda tera. Larutan

dapat disimpan selama beberapa bulan dalam lemari pendingin bersuhu 4 0C.

c. Larutan C (tris base dan SDS pH 6,8)

Sebanyak 6.05 g Tris base dan 4 mL SDS 10% dilarutkan dengan akuades

dan ditepatkan pada pH 6.8 dengan HCl 1 N. Larutan dimasukkan ke dalam labu

ukur 100 mL, kemudian ditambahkan akuades hingga tanda tera.

d. Ammonium proksodisulfat (APS)

Dibuat baru setiap kali akan melakukan eletroforesis dengan cara melarutkan

0.025 g ammonium persulfat dalam 0.25 mL akuades kemudian di vortex.

e. Buffer sampel

Sebanyak 12,5 mL larutan C , 30 mL SDS 10%, 10 mL gliserol, 5 mL 2-

mercaptoetanol, dan 10 mg bromophenol blue dilarutakan menggunakan akuades.

Larutan tersebut dimasukkan kedalam labu ukur 100 mL, kemudian

ditamabahkan akuades hingga tanda tera.

68

f. Buffer elektroforesis

Sebanyak 3 g Tris base, 14.4 g glisin, dan 1 g SDS dilarutkan dengan akudes.

Ketiga larutan tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 mL, kemudian

ditambahkan akuades hingga tanda tera.

g. Larutan pewarna (staining)

Sebanyak 1 g coomasie brilliant blue R-250, 450 mL metanol, dan 100 mL

asam asetat glasial dilarutkan dalam 450 mL akuades.

h. Larutan penghilang warna (distaning)

Sebanyak 100 mL metanol dan 100 mL asam asetat glasial dilarutkan dalam

800 mL akuades.

69

Lampiran 4. Pembuatan Larutan Kerja Immunoblotting

a. Pembuatan buffer transfer

Sebanyak 2.9 g Tris base dan 14.5 g glisin dilarutkan dalam 500 mL akuades

dan ditambah 200 mL methanol, kemudian volumenya ditepatkan sampai 1 L.

larutan disimpan pada suhu 4 0C.

b. Pembuatan phosphate buffer saline (PBS)

10x konsentrasi (untuk 1 L)

Ditimbang sebanyak 100 g NaCl, 2.5 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.5 g KH2PO4,

kemudian dilarutkan dengan akuades sampai 1 L, lalu disterilkan dengan

menggunakan autoclave.

1x konsentrasi

Untuk membuat PBS 1x, diambil PBS 10x sebanyak 100 mL, lalu

ditambakan akuades sampai 1 L.

c. Pembuatan PBS-Tween 20 0.005%

Diambil 1 L PBS 1x, lalu ditambahkan 0.5 mL Tween-20, kemudian larutan

diaduk sampai Tween-20 larut sempurna.

d. Pewarna amido black

Ditimbang amido black sebanyak 0.1 g, lalu ditambah metanol 20 mL dan

asam asetat glasial 10 mL, kemudian ditambah akuades sampai 100 mL dan

diaduk sampai larut sempurna.

e. Pembuatan substrat DAB

500 mL larutan DAB ditambah 450 mL larutan peroksida, kemudian larutan

divortex.

70

Lampiran 5. Lembar kuisioner responden

KUISIONER ALERGI

Nama :

Jenis Kelamin :

Umur :

No. Tlp :

1. Apakah anda memiliki riwayat alergi makanan?

a. Ya

b. Tidak

2. Jenis makanan apa yang membuat anda alergi ?

a. Kacang – kacangan : ……………………………………………..

b. Serangga : ……………………………………………..

c. Produk laut lain : ……………………………..........................

d. Makanan lain : ……………………………………………..

3. Apakah anda selalu mengalami alergi setiap memakan makanan tersebut?

a. Ya

b. Kadang – kadang

4. Bagaimana gejala alergi yang anda alami?

a. Gatal – gatal

b. Asma

c. Lain – lain : …………………………………

5. Berapa lama waktu yang diperlukan dari makan hingga timbulnya gejala

alergi?……………….jam atau …………………….. hari.

6. Bagaimana anda mengatasi alergi yang anda alami?

a. Dengan meminum obat anti alergi.

b. Dibiarkan saja

c. Lain – lain : ……………………………………………

7. Apakah anda memiliki keluarga yang juga mengalami alergi?

a. Ya, yaitu: ………………………

b. Tidak

(………………………………….)

71

NASKAH PENJELASAN UNTUK MEMPEROLEH PERSETUJUAN

RESPONDEN DAN FORMULIR PERSETUJUAN SETELAH

PENJELASAN (INFORMED CONSENT)

Pengambilan Darah Responden Alergi Belalang dan Serangga Untuk Uji

Alerginisitas Protein Alergen Belalang

Kami mengundang Anda bersama beberapa orang lainnya untuk turut

terlibat dalam program “Pengambilan Darah Responden Alergi Belalang dan

Serangga Untuk Uji Alerginisitas Protein Alergen Belalang”. Kami akan

menjelaskan beberapa informasi terkait dngan keikutsertaan Anda pada penelitian

ini :

Kesediaan untuk berpartisipasi

Anda tidak akan dipaksa untuk ikut serta dalam program ini, jika Anda

tidak menghendakinya. Bila Anda memutuskan untuk berhenti berpartisipasi, tak

seorangpun boleh memaksa Anda untuk berubah pikiran. Dokter dapat

memutuskan bahwa Anda tidak boleh lagi ikut serta dalam program ini, terlepas

dari keinginan Anda untuk tetap berpartisipasi atau tidak. Keputusa ini diambil

dengan selalu memperhatikan hal yang terbaik bagi Anda. Yaitu untuk melindungi

kemungkinan gangguan kesehatan.

Dasar Pemilihan Responden

Anda dipilih sebagai responden atau subjek dalam penelitian ini

berdasarkan kriteria yaitu umur 18- 40 tahun dengan berat badan normal dan

dalam keadaan sehat, anda pernah mengalami alergi, anda bukan pemabuk, tidak

perokok berat, tidak mengikuti donor darah atau kehilangan darah sebanyak 300

ml atau lebih sebelum pelaksanaan penelitian ini. Anda tidak sakit kulit seperti

panu, kudis, kurap dan urtikaria.

Anda tidak diperbolehkan minum obat yang mengandung antihistamin

satu minggu da selama penelitian berlangsung kecuali atas anjuran dokter

penanggungjawab. Antihistamin adalah obat yang digunakan untuk mencegah

pelepasan histamin suatu zat yang dilepaskan oleh sel mastosit sebagai sistem

72

pertahanan tubuh dan akan menimbulkan reaksi gatal dan merah pada kulit. Anda

tidak akan dikenakan biaya atas pengambilan darah ini.

Tujuan dan Manfaat

Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan data tentang protein alergen

yang terkandung pada belalang. Data tersebut akan menambahkan informasi bagi

masyarakat umum dan bagi penderita alergi untuk meminimalisir konsumsi

belalang atau serangga. Data tersebut juga dapat diteliti lebih lanjut dan berpotensi

untuk dikembangkan sebagai bahan alergen untuk mendeteksi penyakit alergi

makanan dengan metode imunostick.

Prosedur Penelitian

Pada program selama 1 hari, Anda diminta untuk memberikan ±10 ml

darah yang akan diambil oleh tenaga medis. Darah yang telah diambil, kemudian

dipisahkan dan diambil bagian tengah yang berupa serum darah. Profil protein

alergen yang terkandung pada belalang akan diketahui menggunakan metode

imunoblotting dengan bantuan serum darah. Metode imunobloting merupakan

metode uji alerginisitas menggunakan arus listrik dan penyangga berupa kertas

nitroselulosa. Kertas nitroselulosa yang telah terdapat protein alergen, kemudian

direaksikan dengan darah yang Anda berikan, hasil warna hitam atau coklat

merupakan hasil positif bahwa sampel anak ikan nila atau belalang mengandung

protein alergen yang dapat bereaksi dengan darah Anda.

Kemungkinan resiko dan perawatan

Tidak ada resiko yang terjadi pada pengambilan darah ini, karena kami

hanya menggunakan jarum yang steril dan pengambilan darah dilakukan oleh

tenaga kesehatan terlatih.

Kerahasiaan

Catatan mengenai identitas dan hasil pemeriksaan Anda akan dirahasiakan.

Pertanyaan – pertanyaan

Bila ada pertanyaan mengenai program ini, mengenai hak – hak Anda

harap Anda melapor kepada Annisa Thaharah yang dapat dihubungi melalui

nomor handphone 085356272627 atau melalui email di annisa.thhrh@gmail.com

Keputusan untuk berpartisipasi

Anda tidak akan dipaksa untuk ikut serta dalam program ini bila Anda

tidak menghendakinya. Bila Anda memutuskan untuk berhenti berpartisipasi, tak

seorang pun boleh memaksa Anda untuk berubah pikiran. Dokter dapat

73

memutuskan bahwa Anda tidak boleh lagi ikut serta dalam program ini, terlepas

dari keinginan Anda untuk tetap betpartisipasi atau tidak. Keputusan ini diambil

dengan selalu memperhatikan hal yang terbaik bagi Anda. Yaitu untuk melindungi

kemungkinan gangguan kesehatan.

Insentif

Sebagai rasa terimakasih atas partisipasi Anda pada program ini, kami

akan memberikan roti dan susu setelah proses pengambilan darah selesai. Dan

kami berdoa semoga semua urusan Anda dipermudah oleh Allah SWT., karena

Anda telah mempermudah urusan orang lain.

Tanda Tangan

Bila Anda sudah paham dengan penjelasan tentang program ini, maka

Anda diminta untuk mebubuhkan tanda tangan pada lembaran Persetujuan

Berpartisipasi (Informed Consent) yang telah kami sediakan.

74

Formulir Persetujuan Berpartisipasi (Informed Consent)

Pengambilan Darah Responden Alergi Belalang dan Serangga Untuk Uji

Alerginisitas Protein Alergen Belalang

Saya telah membaca apa yang tertera pada Naskah Penjelasan

Memperoleh Persetujuan Responden di atas. Saya memahami program ini, maka

saya :

Nama Responden : ………………………………………………………….

Alamat : ………………………………………………………….

………………………………………………………….

………………………………………………………….

Nomor Kontak : ………………………………………………………….

Saya menegaskan bahwa secara sukarela dan penuh kesadaran

keikutsertaan saya pada program ini dengan catatan semua data mengenai diri

saya dirahasiakan, dan bila suatu saat pada program ini saya dirugikan dalam

bentuk apapun maka saya berhak membatalkan persetujuan ini

Sijunjung, 2 Maret 2018

Mengetahui, Yang Membuat Pernyataan

Peneliti, Responden,

(Annisa Thaharah) (………………………….)

75

Lampiran 6. Hasil identifikasi Belalang oleh Zoologi Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia

76

Lampiran 7. Kurva standard uji Bradford

y = 0,0046 + 0,0006x

R² = 0,9935

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0 200 400 600 800 1000

Ab

sorb

ansi

konsentrasi (mg/ml)

Kurva Standar BSA

77

Lampiran 8. Nilai mobilitas relatif (Rf), logaritma berat molekul (Log BM) dan

berat molekul protein standar

Jarak Pita (cm) BM (KDa) Rf (X) Log BM (Y)

0,6 250 0,097 2,398

0,9 150 0,145 2,176

1,3 100 0,210 2,000

1,75 75 0,282 1,875

2,35 50 0,379 1,699

3 37 0,484 1,568

4 25 0,645 1,398

4,5 20 0,726 1,301

5,6 15 0,903 1,176

6,2 10 1,000 1,000

78

Lampiran 9. Contoh perhitungan Rf pada sampel dengan SDS-PAGE

Contoh perhitungan pada pita protein kedua pada belalang mentah:

Rf sebagai sumbu x, yang diperoleh dari perhitungan :

Rf = Jarak migrasi protein

Jarak migrasi pewarna

= 1,2

6,2

= 0,194

Log BM sebagai sumbu y, yang diperoleh dari Log berat molekul pada

protein marker,

Sehingga diperoleh persamaan,

Y = a – b x

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

0,097 0,145 0,210 0,282 0,379 0,484 0,645 0,726 0,903 1,000

Series1

y= 2,335 - 1,387 R2= 0,955

79

= 2,335 – 1,387 x

Y = 2,335 – 1,387 (0,194)

= 2,335 – 0,2690

= 2,066

Nilai berat molekul protein diporeleh dari antilog Y

Antilog Y = Berat molekul

Antilog 2,066 = 117

Berat molekul yang didapatkan adalah 117 KDa

80

Lampiran 10. Hasil perhitungan berat molekul belalang mentah

Jarak Rf (x) Log BM BM (KDa)

0,3 0,048 2,268 >250

1,2 0,194 2,066 116

1,3 0,210 2,044 111

1,4 0,226 2,022 105

1,5 0,242 1,999 100

1,6 0,258 1,977 95

1,7 0,274 1,955 90

1,8 0,290 1,932 86

2,2 0,355 1,843 70

2,5 0,403 1,775 60

2,7 0,435 1,731 54

2,8 0,452 1,708 51

3,2 0,516 1,619 42

3,4 0,548 1,574 38

3,5 0,565 1,552 36

3,6 0,581 1,529 34

3,7 0,597 1,507 32

3,8 0,613 1,485 31

3,9 0,629 1,462 29

4 0,645 1,440 28

4,1 0,661 1,417 26

4,2 0,677 1,395 25

4,3 0,694 1,373 24

5 0,806 1,216 16

5,1 0,823 1,194 16

5,2 0,839 1,171 15

5,3 0,855 1,149 14

5,8 0,935 1,037 11

6,1 0,984 0,970 9

6,2 1,000 0,948 9

81

Lampiran 11. Hasil perhitungan berat molekul belalang rebus

Jarak Rf (x) Log BM BM (KDa)

0,3 0,048 2,268 >250

0,9 0,145 2,176 150

1,8 0,290 1,932 86

2,3 0,371 1,820 66

2,4 0,387 1,798 63

3,3 0,532 1,596 39

3,4 0,548 1,574 38

4,2 0,677 1,395 25

4,3 0,694 1,373 24

5,3 0,855 1,149 14

5,7 0,919 1,059 11

5,8 0,935 1,037 11

6,1 0,984 0,970 9

6,2 1,000 0,948 9

82

Lampiran 12. Hasil perhitungan berat molekul belalang goreng

Jarak Rf (x) Log BM BM (KDa)

0,3 0,048 2,268 >250

0,9 0,145 2,176 150

1,9 0,306 1,910 81

2 0,323 1,887 77

2,1 0,339 1,865 73

3,2 0,516 1,619 42

4,2 0,677 1,395 25

6,1 0,984 0,970 9

6,2 1,000 0,948 9

83

Lampiran. 13. Hasil perhitungan berat molekul belalang rendang

Jarak Rf (x) Log BM (y) BM (KDa)

0,3 0,048 2,268 >250

0,9 0,145 2,176 150

2 0,323 1,887 77

3,2 0,516 1,619 42

3,5 0,565 1,552 36

4,1 0,661 1,417 26

4,2 0,677 1,395 25

4,3 0,694 1,373 24

4,3 0,694 1,373 24

4,5 0,726 1,328 21

4,9 0,790 1,238 17

5,3 0,855 1,149 14

5,4 0,871 1,127 13

5,7 0,919 1,059 11

5,8 0,935 1,037 11

6,1 0,984 0,970 9

6,2 1,000 0,948 9