Transcript
Page 1: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah

asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem.

Specializirani hematološki laboratorij kliničnega oddelka za hematologijoUniverzitetni klinični center Ljubljana

Page 2: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Mieloproliferativne novotvorbe (MPN) So skupina kronično potekajočih klonskih krvnih

bolezni, pri katerih je zvečano nastajanje krvnih celic zaradi motnje na ravni matične krvotvorne celice esencialna trombocitemija (ET), prava policitemija ali policitemija rubra vera (PV), primarna mielofibroza (PM) kronična mieloična levkemija (KML)

(Dameshek,1951) kronično nevtrofilno levkemijo, kronično eozinofilno levkemijo, mastocitozo in neklasificirane MPN

(Vardiman, JW, Thiele, J, Arber DA et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes Blood, 2009; 114: 937-951)

Page 3: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Značilnosti MPN Kostni mozeg je hipercelularen in v njem je prekomerna

razrast ene ali več hematopoetskih celic.

Hematopoetske nezrele celice iz kostnega mozga ali periferne krvi rastejo v celičnih kulturah brez zunanjega hematopoetskega rastnega dejavnika.

Možen prehod iz ene oblike MPN v drugo in v akutno levkemijo (redko).

Potek je večinoma dolgotrajen, razen pri KML.

Page 4: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Protein tirozin kinaze pri različnih novotvorbah hematopoetskega tkiva

Opomba: na sliki uporabljena stara klasifikacija SZO

Page 5: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Somatska mutacija Janus kinaza 2 (JAK2) V617F

Baxter EJ et al., Lancet 2005; 365: 1054-1061

Levine RL et al. Cancer Cell 2005; 7(4): 387-397

somatska mutacija JAK2V617F večina bolnikov s pravo policitemijo (PV) (65-97 %)

pribl. 50 % bolnikov z esencialno trombocitemijo (ET)(33-57 %)

pribl. 50 % primarno mielofibrozo (35-50 %)

pribl . 50 % bolnikov z refraktarno anemijo s prstanastimi sideroblasti in trombocitozo

redko: ostale mieloproliferativne in mielodisplastične bolezni

pri zdravih je niSkoda, R. Biological basis of myeloproliferative neoplasms. Hematology Education: the education programme for the annual congress of the European Hematology Association 2010; 4: 183-188.

Page 6: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Janus kinaza 2 (JAK2)

protein iz družine znotraj celičnih tirozin kinaz: JAK 1,JAK 2, JAK 3 in TYK 2.

Vključen v prenos signalov iz različnih receptorjev zarastne dejavnike

Gen JAK2 se nahaja na kromosomu 9p24.

Page 7: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

mutacija JAK2V617F

točkovna mutacija v domeni pseudokinaze JH2 (ekson 14; G>T). Zamenjava AK valin (V) v fenilalanin (F) na mestu 617 AK zaporedja.

Stalna aktivacija in delovanje JAK2 tirozin kinaze

Preobčutljivost za citokine in hitra proliferacija

Najdena v celicah mieloične vrste (granulociti, trombociti), limfocitih ne

Page 8: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Najpogostejši načini ugotavljanja mutacije JAK2V617F

Molekularno genetski načini:

Alelno-specifična verižna reakcija s polimerazo (alelno-specifičen PCR)

PCR in restrikcija pridelkov z restriktazo

PCR v realnem času

sekveniranje dela DNA gena JAK2, kjer se nahaja mutacija

Page 9: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Primer: alelno-specifičen PCR

Vz. VzorecK+ pozitivna klonalna kontrola (Homozigot pozitiven JAK2

V617F, Ipsogen, Francija)K- negativna kontrola NTC vodaM označevalev velikosti DNA (100 do 1000 bp) + pozitiven rezultat (364 bp in 203-bp velik produkt)

M + + + + +

2 % agarose gel

364 bp (interna kontrola)

203 bp (mutiran alel)

Metoda po Baxter EJ et al., Lancet 2005; 365: 1054-1061

Page 10: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Občutljivost načina alelno-specifičnega PCR JAK2V617F

M 1 10-1 10-2 10-3 10-4

10-kratna zaporedna redčitev klonalne homozigot pozitivne JAK2V617F DNA(InVivoScribe Technologies) v vzorec normalne DNA.

2,0 % agarose E-gel (Invitrogen)

Kvantitativni PCR (qPCR)- Bolj občutljiv kot alelno-specifični PCR- Določimo delež JAK2V617F pozitivnega alela -dražja preiskavauporabimo komplet od Ipsogen, Francija.

Page 11: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Mutacija v eksonu 12 gena JAK2 pri bolnikih s PV ali izolirano eritrocitozo pri katerih niso

dokazali mutacije JAK2V617F Pojavnost: do 83 % bolnikov neg. za JAK2V617F in potrjeno diagnozo

PV, odstotek je nižji pri bolnikih z izolirano eritrocitozo)

niso ugotovili pri ostalih MPN in so močno povezane s fenotipom PV

spremenijo različna nukleotidna mesta v bližini kodona 539. Pogosto opazimo delecijo 1 do 3 kodonov.

nekatere najpogostejše mutacije: N542-E543del, H538QK539L, F537-K539delins, K539L

prisotne tudi duplikacije npr. duplikacija 11 kodonov (V536-F547dup)

Scott et al. NEJM 2007;356:459-68.

Schnittger S et al. Haematologica 2009;94: 414-418

Skoda, R. Hematology Education: the education programme for the annual congress of the EHA 2010; 4: 183-188.

Page 12: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Načini ugotavljanja mutacije v eksonu 12 gena JAK2-naš pristop PCR v realnem času z dvojno hibridizacijsko sondo in

analiza talilne krivulje pomnožene cDNA (analiza kodonov od mesta 535 do 555) (Schnittger S et al. Haematologica 2009;94: 414-418)

PCR in agarozna gelska elektroforeza (duplikacije)

sekveniranje dela DNA gena JAK2, kjer se nahaja mutacija

Page 13: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Preliminarni izsledki-mutacije v eksonu 12 JAK2 N=5 , 3 PV, 1 eritrocitoza, 1 ni podatka vsi JAK2V617F neg. 2 pozitivna (oba PV) po načinu PCR v realnem času z dvojno

hibridizacijsko sondo in analiza talilne krivulje pomnožene cDNA (metoda po

Schnittger S et al. Haematologica 2009;94: 414-418)

Oba pozitivna z PCR in agarozno gelskoelektroforezo

Vidni dodatni madeži na elektroforezi-duplikacija ?

Sekveniranje (v obdelavi)

mutacija

Duplikacija ?

Vz1. vz.2

Nemutiran genotip

Page 14: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Mutacije v eksonu 16 gena za JAK2

Pri bolnikih z Downovim sindromom in z B-ALL

povezane z novotvorbo B-celične vrste ob prisotnosti dodatnega kromosoma 21

Za izražen fenotip bolezni ali celo drugo obliko bolezni so zraven mutacije v genu JAK2 pomembni še dodatni dejavniki

Skoda, R. Biological basis of myeloproliferative neoplasms.

Hematology Education: the education programme for the

annual congress of the European Hematology Association 2010; 4: 183-188.

Page 15: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Mutacije v genu za trombopoetinski receptor pri 3 do 5 % bolnikov z ET in pri 5 do 8 % bolnikov z

PM gen za trombopoetinski receptor se nahaja na

kromosomu 1p34 (Myeloproliferative Leukemia Virus Oncogene, MPL)

najpogostejše mutacije zamenjavi aminokisline tripofan za levcin (MPL W515L), lizin (MPL W515K) ali alanin (MPL W515A) na mestu 515 AK

mutacija najverjetneje povzroči, da je beljakovina aktivna brez vezanega liganda Skoda, R. Biological basis of myeloproliferative neoplasms.

Hematology Education: the education programme for the annual congress of the European Hematology Association 2010; 4: 183-188.

Page 16: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Preliminarni izsledki Izvedba:

DNA granulocitov periferne krvi, uporaba reagenčenga kompleta MPL MutaScreen Kit

(Ipsogen, Francija), verižna reakcija s polimerazo v realnem času z analizo alelne diskriminacije Omejitev preiskave: samo mutaciji MPL W515L in MPL W515K

N=80 (77 ET, 3 PM vsi JAK2V617F Neg.; 20 moških, 60 žensk, mediana starosti 48, razpon 18 do 89 let)

Rezultat: 3 poz. za MPL W515L Vsi ET 1 poz. za MPL W515K ET 76 negativnih za MPL W515L/K Pojavnost 3,75 %

Page 17: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Mutacija KITD816VMastocitoza Mutacija KITD816V

Opredelitev bolezni (minor criteria) Rezistenca za inhibitor tirozin kinaze

Načini ugotavljanja-naš pristop Alelno-specifični PCR (DNA)

90 bp

184 bpNTCm

M S01w S01m S02w S02m Kw+ Km+ Kw- Km- NTCw M

Page 18: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Nove mutacije v različnih genih

gen »Ten Eleven Translocation 2« (imenovan tudi »tet oncogene family member 2«, TET2), kromosom 4q24

MPN, MDS, AML Delovanje proteina ni poznano, morda ima pomembno

vlogo pri nastanku in napredovanju MPN

gen »Casitas B-cell lymphoma« (CBL), kromosom 11q23.3.

Vpleten v razpad tirozin kinaz

drugi geni: »Additional Sex Combs-Like 1« (ASXL1), za encim isocitrat dehidrogenazo (IDH1 in IDH2) »IKAROS family zinc finger 1« (IKZF1).

Page 19: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Zaključek Določitev mutacij v genu JAK2, MPL in KIT z

molekularno genetskimi načini so pomembne preiskave, ki jih opravimo za opredelitev MPN.

Te mutacije so povezane s povečano proliferacijo krvnih celic, najverjetneje so vpletene v nastanek bolezni.

Pomembne so in bodo najverjetneje tudi pri izbiri zdravljenja z novejšimi zdravili, predvsem pri napredovalih oblikah MPN.

Znane so nove mutacije v različnih genih; njihova vloga in pomen se še raziskuje

Page 20: Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah T j10.pdf · Pridobljene mutacije pri mieloproliferativnih novotvorbah asist.dr.Tadej Pajič, spec.med.biokem. Specializirani

Zahvala Anica Mihajlović Marija Jedrt Mandelc Mazaj Martina Fink Urška Ribič Špela Žula Leonida Kovačič (študentka) Nejc Lamovšek (študent) in drugi


Recommended