UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

CICLUL 1. LICENTA IN BIOCHIMIE

Biochimie metabolica

Catabolismul principalelor tipuri de biomolecule (proteine, polizaharide si lipide) parcurge in celulele aerobe 4 faze

I

II

III IV

I – hidroliza la unitati de baza: aminoacizi, monozaharide, acizi grasi - in citosol

II – scindarea unitatilor de baza la acetil CoA - in mitocondrie

III – oxidarea gruparii acetil la 2 moli de CO2 in ciclul Krebs (in prezenta NAD+, FAD) – in mitocondrie

IV - refacerea NADH si FADH2 in cadrul catenei transportoare de electroni mitocondriale (CTEM) – proces exergonic cuplat cu fosforilarea ADP (fosforilarea oxidativa)

3

4

Glicogen

Glucozo P glucoza

Piruvat

Acetil CoA

CO2, H2O, ATP

glicogenoliza

glicoliza

ATP

Hexokinaza/ glucokinaza

Complexul piruvat dehidrogenazei

Ciclul Krebs + fosforilarea oxidativa

Lactat Lactat DHaza

Etanol

CO2

Alcool DHaza

Pentozo P

+ NADPH

suntul pentozo P

zaharoza

lactoza

fructoza

galactoza

Catabolismul glucidelor

5

GLICOLIZA

Calea Embden Mayerhof Parnas – 10-11 etape enzimatice

Cea mai veche cale metabolica – legatura cu fermentatiile

In citoplasma animalelor, plantelor, majoritatii bacteriilor

Viteza maxima – in celulele musculare, unde furnizeaza energie (ATP) pt

contractia musculara

Glicoliza aeroba

C6H12O6 + 2NAD+ + 2 (ADP + Pi) 2 PIRUVAT + 2 NADH+ 2 ATP

Glicoliza anaeroba

C6H12O6 + 2 (ADP + Pi) LACTAT + 2 ATP

6

Prima faza a glicolizei C6 2 C3 consumatoare de 2 moli ATP cuprinde 5 etape enzimatice:

4 % 96 %

C6H12O6 + 2 ATP

2 GAP + 2 ADP

7

Glucoza

Glucozo 6-P

Fructozo 6-P

Fructozo 1,6-bisP

Dihidroxiaceton P

DHAP

Gliceraldehid P

GAP

ATP

ADP Hexokinaza/glucokinaza

fosfoglucomutaza

fosfofructokinaza

1

3

2

ATP

ADP

aldolaza

fosfotriozoizomeraza

4

5

Enzimele reglatoare catalizeaza reactii ireversibile 1 si 3

è

A doua faza a glicolizei este formatoare de ATP

Coeficienti stoichiometrici X 2 deoarece C6 2 C3

GAP

1,3-difosfoglicerat

1,3-DPG

3-fosfoglicerat

3-PG

2-fosfoglicerat

2-PG

Fosfoenol piruvat

PEP

Piruvat

NAD+

NADH GAP DHaza

H3PO4 6

Fosfoglicerat kinaza 7

8 Fosfoglicerat mutaza

9 Enolaza H2O ADP ATP

Piruvat kinaza 10

Reactia 6

R-CHO + NAD+ + H2O→ R-COOH + NADH+H+

ΔGo’= ─ 10,3 kcal/mol a

R-COOH + H3PO4 → R-CO~OPO3H2 + H2O

ΔGo’= + 11,8 kcal/mol

b

Suma a + b ΔGo’= +1,5 kcal/mol

aproape 0, reactie reversibila

8

ADP

ATP

Suma reactiilor 1 - 6 Glucoza + 2 NAD+ + 2 ATP 2 x 1,3-DPG + 2 NADH+2H+ + 2 ADP + 2Pi

Suma reactiilor 6 + 7 R-CHO + NAD+ + Pi + ADP R-COOH + NADH+H+ + ATP

Componenta exergonica Componenta endergonica

reprezinta o fosforilare oxidativa la nivel de substrat

Bilantul total al glicolizei C6H12O6 + 2 NAD+ + 2 (ADP + Pi) 2 PIRUVAT + 2 NADH+2H+ + 2 ATP

Etapa exergonica: C6H12O6 + 2 NAD+ 2 PIRUVAT + 2 NADH+2H+

ΔGo’= ─ 47 kcal/mol

Etapa endergonica: 2 ADP + 2 Pi 2 ATP + 2 H2O ΔGo’= + 14,6 kcal/mol

ΔGo’total = ─ 47 + 14,6= ─ 32,4 kcal/mol reactie ireversibila

Randamentul glicolizei: η = 14,6/47 x 100 = 31 % tinand seama de valorile ΔGo’

In realitate randamentul glicolizei ~ 53 % (in functie de valorile ΔG)

9

Reglarea glicolizei

1)  La nivelul transportorilor glucozei GLUT

2)  La nivelul hexokinazei

3)  La nivelul fosfofructokinazei

4)  La nivelul piruvat kinazei

1) La nivelul transportorilor GLUT

10

Glucoza din sange patrunde in celula prin difuzie facilitata de proteinele transportor GLUT- codificate de gene distincte, expri- mati intr-o maniera tesut-specifica

Glucoza este transporta- ta in sensul gradientului de concentratie, nu nece sita energie (ATP)

Schema structurii transporto-rilor GLUT – catena polipeptidica de ~ 500 resturi de aminoacizi, 12 segmente de α-helix

sGLUT 1 – exprimat majoritar in mucoasa intestinala si tubulii renali, co-transporta o molecula de Glc sau Gal impreuna cu 2 ioni Na+. Nu transporta Fru

GLUT 1 – exprimat in multe tipuri celulare (creier, eritrocite, celule endoteliale, testuri fetale); transporta Glc (cu o inalta afinitate) si Gal. Nu transporta Fru

11

sGLUT 1, GLUT 1, GLUT 2, GLUT 3, GLUT 4, GLUT 5

GLUT 2 – exprimat de celule β pancreatice, hepatocite, etc; are o mica afinitate si inalta capacitate de transport; KM ~ 15-20 mM; functioneaza ca un sensor al glicemiei in celulele β pancreatice; transporta Glc, Gal si Fru Viteza de intrare a Glc proportionala cu nivelul glicemiei

GLUT 4 – exprimat de celule musculare si adipocite, sensibil la insulina, inalta afinitate pentru Glc; KM 5 mM; creste viteza preluarii glucozei

Cand nivelul insulinei in sange creste, se leaga la IR care induce t r a n s l o c a r e a G L U T 4 ( s i fosforilarea) din citosol pe membrana favorizand preluarea de glucoza de catre celula din sange (efect hipoglicemiant)

Cand nivelul insulinei scade transportori i GLUT 4 sunt translocati de la membrana in citoplasma

12

GLUCOZA

eritrocit

creier

ficat rinichi

GLUCOZA

INSULINA + +

muschi cord adipocit

13

B. Transportul glucozei sensibil la insulina (GLUT-4)

A. Transportul glucozei insensibil la insulina (GLUT 1 sau sGLUT1

Controlul glicolizei la nivelul enzimelor reglatoare

14

2) Reglarea glicolizei la nivelul hexokinazei

hexokinaza/glucokinaza

Glucoza + ATP Glucozo 6-P + ADP

Hexokinaza Glucokinaza

D-Glc,Fru, Man, GlcNH2 D-Glc

Enzima reglatoare Enzima comuna

Inhibata de Glc-6-P Neinhibata

+ Muschi Absenta in muschi

+ Ficat +++ Ficat

KM 1 x 10-4 M (Glc) KM 1 x 10-2 M (Glc)

In sange [Glc] 5 mM hexokinaza complet saturata;

cand [Glc] creste - intervine glucokinaza hepatica

In diabet – glucokinaza insuficienta!!! 15

16

Hexokinaza – enzima musculara, implicata in glicoliza aeroba sau anaeroba

Glucokinaza – enzima implicata in sinteza glicogenului in muschi sau ficat, atunci cand glicemia este crescuta

Hexokinaza este inhibata de fondul metabolic de glucozo 6-P existent in muschi; glicoliza de la glicogen fiind mai avantajoasa energetic

glicogen Glc-6-P Piruvat Lactat

3) Reglarea glicolizei la nivelul fosfofructokinazei

La nivelul ficatului, fosfofructokinaza 1 (PFK-1) este:

i) Inhibata de [ATP]mari

ATP se leaga la un situs reglator, diferit de centru catalitic activ, inhibitia este reversata de AMP

[ATP]/[AMP] scazut – stimuleaza PFK-1, stimuleaza glicoliza

ii) Inhibata de [H+] crescuta, forma-rea excesva de lactat scade pH sangvin produce acidoza

iii) Inhibata de [citrat] mari iv) Activata de Fru-2,6-bis fosfat, creste afinitatea PFK-1 pentru Fru-6-P, scade efectul inhibitor al ATP, deplaseaza echilibrul T R

Fru-6-P Fru-2,6 P2 hipoglicemie

PFK-2

PS

PS-fosfataza specifica

ATP ADP

H2O Pi

1 32

Domeniu reglator PFK2

250

PS

470 Enzima bifunctionala de 55 kDa, cu ambele activitati PFK2 si PS

17

Fru-6-P"

Fru-1,6-P2"

F-2,6-P2!

glicoliza"

+!

PFK-2!

PFK-1"

Glucagonul (ficat) sau epinefrina (muschi) cresc nivelul cAMP, activeaza PKA. In ficat aceasta conduce la scaderea [Fru-2,6-P2] si inhiba glicoliza.

In muschi, epinefrina are un efect opus activeaza glicoliza!!!!!! 18

Enzima bifunctionala este fosforilata de PKA la nivelul unui rest Ser din domeniul reglator:

activitatea PS creste

activitatea PFK-2 scade

Hipoglicemie glucagon cAMP PKA

Enzima bifunctionala

Fru 2,6 bis P Fru 6-P

Scade glicoliza

Hiperglicemie Creste glicoliza 19

Insulina – scade nivelul cAMP, creste nivelul Fru-2,6 P2. stimuleaza

glicoliza

La nivelul muschilor, fosfofructokinaza este inhibata de concentratii mari de:

ATP, citrat, acizi grasi superiori, H+

4) Reglarea glicolizei la nivelul piruvat kinazei (PyrK)

Constructii tetramerice din monomeri L (liver) – ce predomina in ficat, M (muscle) ce predomina in muschi si A (other tissues)

Hipoglicemie Glucagon cAMP PKA PyrK (L)-OH

PyrK (L)-OP inactiveaza

PEP + ADP PYR + ATP

PyrK (L)-OH

PyrK (L)-OP H2O

Pi ATP

ADP

PKA

+ - ATP, ALA Fru-1,6-bis P Efectori alosterici

20

Transformarile piruvatului

1

21

2

3

1) Transformarea piruvatului in lactat

Reactia 11 a glicolizei, catalizata de lactat dehidrogenaza

Piruvat L-lactat

Cand ecuatia totala a glicolizei devine:

Glucoza + 2 ADP + 2 P1 2 Lactat + 2 ATP

In ecuatie nu mai intervine NAD+/NADH datorita cuplarii reactiilor 6-11 care permite refacerea NAD+

In lipsa etapei 11 a glicolizei refacerea NAD+ se realizeaza prin oxidarea NADH in cadrul CTEM

22

Izoenzime

Cord Lac Pyr Acetil CoA H4 Muschi Pyr Lac M4

23 Glucoza

Glc-6-P

Fru-6-P

Fru-1,6-P2

DHAP GAP

6

1,3-DPG

3-PG 2-PG PEP

Pyr

Lactat

11

NAD+

NADH+

Acetaldehida

Etanol

11 12

Fermentatia alcoolica

Fermentatia lactica

Muschi

Contractia musculara necesita mult ATP care sustine contractia musculara

Lactatul format poate produce dureri musculare, poate fi transportat in ficat unde participa la glucogeogeneza

Bacterii lactice

Realizeaza fermentatia homolactica

24

2) Transformarea piruvatului in etanol

11 12

Ecuatia totala a glicolizei este:

C6H12O6 + 2 (ADP + Pi) 2 Etanol + 2 CO2 + 2 ATP

In ecuatie nu mai intervine NAD+/NADH datorita cuplarii reactiilor 6-12 care permite refacerea NAD+

25

Piruvat decarboxilaza are tiamin pirofosfatul (TPP) ca grupare prostetica

Alte TPP enzime:

Transcetolaza Componenta A a piruvat dehidrogenazei

Piruvat decarboxilaza

- prezenta la microorganisme

- absenta la om si animale

26

Alcool dehidrogenaza prezenta la

- drojdii α4 1 Zn2+/mer

- om (ficat) α2 2 Zn2+/mer – metabolizeaza alcoolul ingerat

CH3-CH2-OH CH3-CHO CH3-COOH CH3-CO~SCoA

CO2,H2O, ATP

Grasimi

NAD+ NADH NAD NADH ATP AMP,Pi

alcool aldehid acetil CoA

dehidrogenaza dehidrogenaza sintetaza

27 v.p.20 3. Transformarea piruvatului in acetil CoA

piruvat NAD+ CoASH

Acetil CoA CO2

NADH

Complexul piruvat

dehidrogenazei

Va fi discutat ulterior !

INTRAREA OLIGOZAHARIDELOR, FRUCTOZEI SI GALACTOZEI IN GLICOLIZA

Invertaza-zaharaza-sucraza lactaza-β galactozidaza

28

Fructoza

Adipocit

[Fru] >>> [Glc]

Fru 6-P Fru 1-P

DHAP Gliceraldehida

GAP

Ficat

[Glc] >>> [Fru]

hexokinaza

ATP ATP

fructokinaza

Fru 1-P aldolaza (tip B)

ATP Gliceraldehid kinaza

G L I C O L I Z A

29

galactokinaza

Gal + ATP Gal-1-P + ADP

uridilil transferaza

Gal 1-P + UDP-Glc Glc 1-P + UDP-Gal

4-epimeraza

UDP-Gal UDP-Glc

Fosfoglucomutaza

Glc 1-P Glc 6-P

Gal + ATP Glc 6-P + ADP

30

31

Intoleranta la fructoza

Maladie genetica, deficienta in aldolaza tip B, acumulari de Fru 1-P, bolnavii nu suporta glucide, Fru nu alimenteaza glicoliza

Galactozemie

32

Maladie genetica, poate lipsi orice enzima din calea de alimentare a glicolizei cu Gal, mai frecvent uridilil transferaza, Gal nu alimenteaza glicoliza

Acumularea de Gal toxica

aldozo reductaza

Galactoza galactitol (toxic, acumulari in ochi, cataracta)

Simptome

Cataracta, crestere lenta, retardare mentala, insuficienta hepatica, voma, diaree, icter, moarte

Se impune scoaterea Gal (laptelui) din dieta

UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

CICLUL 1. LICENTA IN BIOCHIMIE

Biochimie metabolica

3

4

5 Glicogenul

Forma de stocare a energiei metabolice

Structura ramificata care expune capetele nereducatoare la nivelul carora actioneaza enzimele metabolismului glicogenului

Muschi: 1-2 % din greutate

Ficatul: 10 % din greutate

Resturi de α-glucoza

Legaturi α-1,4 si α-1,6 glucozidice

O ramificare la 8-10 resturi glucoza legate α-1,4

Glicogenul organizat in granule citoplasmatice cu un diametru de 100-400 Å, pe care sunt sorbite enzimele si proteinele neenzimatice implicate in metabolismul glicogenului. Dupa masa >10% greutatea ficatul reprezinta glicogen

6

7

Scindeaza legaturi α-1,4

Fosforoliza

Stopeaza actiunea la 5 resturi inaintea ramificatiei

Glicogen fosforilaza

Scindeza legaturi α-1,6

Are 2 activitati catalitice: hidrolazica si transferazica

Catalizeaza izomerizarea Glc-1-P ↔ Glc-6-P

Enzima de deramificare

fosfoglucomutaza

ENZIMELE GLICOGENO-LIZEI

Glicogenoliza in muschi si ficat

Muschi

Glicogen Glc 1-P Glc 6-P Glicoliza ATP

contractie

Ficat

Glicogen Glc 1-P Glc 6-P Glucoza Reglarea glicemiei

Glucoza

Insulina Lipide

Glicogen Lactat

Lactat CO2 + H2O

Fat

Alte tesuturi

Glucoza

8

Glicogen fosforilaza (GP)

Actioneaza la capatul nereducator al moleculei glicogenului

Reactie reversibila in vitro

Fosforoliza ireversibila in vivo, evita consumul de energie (ATP), celula capteaza Glc 1-P

GP din muschii scheletici are structura α2, Mα 97 kDa, 1 mol PALP/subunitate, unde PALP – catalizator acido-bazic

9

Glicogen fosforilaza exista in doua forme convertibile a si b

GPb (Ser-OH) GPa (Ser-O-P)

2ATP 2 ADP

Fosforilaza kinaza

Putin activa Total activa

2 H2O 2 Pi Fosfoprotein fosfataza 1 (PP 1)

In situsul catalitic activ este un rest de Ser per fiecare monomer

10

AMP

Activator alosteric

Reglarea activitatii glicogen fosforilazei

In cazul GP din muschi

Concentratii mari de ATP si Glucozo 6-P favorizeaza trecerea GPb intr-o forma total inactiva T (tense)

Concentratii mari de AMP – stare energetica mica – favorizeaza trecerea GPb intr-o forma partial activa R (relaxed)

Activarea GPb de catre AMP are o importanta fiziologica – in conditii cu pO2 mici

In cazul GP din ficat

AMP nu activeaza GPb

niveluri mari de glucoza favorizeaza inactivarea GPa, deplasand echilibrul RT

11

Fosforilaza kinaza

In muschii scheletici, enzima are o structura (αβγδ)4 si are 1200 kDa

αβ - sunt subunitati tinta pentru PKA

γ - subunitatea catalitica

δ- calmodulina, se leaga tranzitoriu la enzima si-I confera sensibilitate la Ca2+

Fosforileaza Ser-14 din GP si activeaza GPb GPa

12

Fosforilaza kinaza este activata partial de Ca2+ si total prin fosforilare (PKA)

Fosf kinaza

inactiva

Fosf kinaza

Partial activa

Impuls nervos Ca2+ Ca2+

Fosf kinaza PKA

cAMP Hormon

Total activa

13

14 Reglarea glicogenolizei la nivelul fosfoprotein fosfatazei 1

Exista mai multe Ser/Thr fosfoprotein fosfataze: PP-1, PP-2A, PP-2B si PP-2C care se deosebesc prin specifici-tate si efectori

PP-1 are:

o subunitate catalitica PP-1c (37 kDa) si

o subunitate reglatoare PP-1G (160 kDa)

PP-1G (glycogen binding subunit)creste capacitatea de legare la glicogen, creste capacitatea catalitica a subunitatii PP-1c

PKA fosforileaza PP-1G – previne asocierea cu PP-1c – inhiba activitatea PP-1

Epinefrina (adrenalina) semnalizeaza cresterea fluxului glicogenolizei prin inhibitia PP-1 (doua mecanisme)

Al doilea mecanism:

PKA fosforileaza un inhibitor al PP-1, activandu-l.

I-P creste gradul de inhibitie al PP-1

15

Insulina inhiba glicogenoliza actionand tot asupra PP-1

Insulina semnalizeaza la nivelul celulelor insulin sensibile care contin receptorul IR

IR activat are activitate tirozin kinazica si induce activarea unei protein kinaze insulin-sensibile care fosforileaza PP-1G la un alt situs, activand PP-1

Insulina stimuleaza reactiile de defosforilare ale glicogen fosforilazei a si fosforilazei kinazei a

16

Enzima de deramificare

o singura catena polipeptidica de 160 kDa, cu dubla specificitate: transferaza si α-glucozidaza

Actiunea fosforilazei este stopata cu 5 resturi inaintea unui punct de ramificatie

Dextrina limita este substratul transferazei – catalizeaza transferul unui grup de 3 resturi Glc de pe un brat pe altul

α-1,6 glucozidaza scindeaza legatura α-1,6-glucozidazica conducand la o structura lineara care poate fi meta-bolizata total de fosforilaza

17

Actiunea α-1,6 glucozidazica 18

Fosfoglucomutaza

Glicogenoliza este o cale catabolica de scindare a glicogenului la glucozo 6-P

Amplificarea semnalului in cascada de activare a glicogen fosforilazei

20