Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno matematički fakultet

Doktorski studij kemije

Kombinatorne strategije razvoja fluorescentnih

proba

4.10.2017.

Moris Mihovilović

Sadržaj

1. Uvod .................................................................................................................................... 3

2. Baze senzora zasnovanih na meti........................................................................................ 4

2.1. Probe za metale ............................................................................................................ 4

2.1.1. Baze nukleinskih kiselina ..................................................................................... 4

2.1.2. Baze peptida ......................................................................................................... 5

2.1.3. Baze malih molekula ............................................................................................ 6

2.1.4. Baze polimera ....................................................................................................... 7

2.2. Baze fluorescentnih senzora za saharide ..................................................................... 8

2.3. Baze fluorescentnih senzora za ATP i peptide ............................................................ 9

2.4. Baze fluorescentnih senzora za hlapljive analite ....................................................... 10

3. Baze senzora zasnovane na raznolikosti ........................................................................... 10

3.1. Kombinatorna derivatizacija poznatih fluorescentnih okosnica ................................ 11

3.1.1. Paladijem-katalizirani coupling .......................................................................... 11

3.1.2. Huisgenova 1,3-dipolarna cikloadicija ............................................................... 12

3.1.3. Knoevenagel kondenzacija, stvaranje amida i nukleofilna supstitucija ............. 13

3.2. De novo konstrukcija fluorescentnih okosnica .......................................................... 14

3.3. Kruto-fazne baze fluorescentnih senzora temeljena na raznolikosti ......................... 14

3.3.1. Baze malih molekula .......................................................................................... 15

3.3.2. Baze peptida i nukleinskih kiselina .................................................................... 15

4. Trendovi i perspektive ...................................................................................................... 17

4.1. Izazov identifikacije mete .......................................................................................... 17

4.2. Dizajn novih kemijskih arhitektura ........................................................................... 17

4.2.1. Višebojne i višemodalne probe .......................................................................... 17

4.2.2. Dinamičke kombinatorne baze senzora .............................................................. 18

5. Zaključci ........................................................................................................................... 18

6. Literatura ........................................................................................................................... 20

3

1. Uvod

Potreba za razumijevanjem osnovnih događaja prepoznavanja u kemiji i biologiji je

usmjerila značajan trud prema razvoju kemijskih probi. Fluorescentne probe su privlačni i

svestrani alati za analitičke senzore zbog svoje visoke osjetljivosti, brzog odziva i tehničke

jednostavnosti. Međutim, mehanizmi koji reguliraju njihovu interakciju s metama često su

slabo poznati, stoga je sposobnost predviđanja strukturnih potreba i dizajna novih

fluorescentnih senzora korištenjem računalnih izračuna ograničena.

Kombinatorni pristupi, prvo korišteni u području pronalaska lijekova pri sintezi velikog

broja strukturno sličnih kandidata, nedavno su poboljšali pripravu i optimizaciju

fluorescentnih probi, posebice u slučaju kompleksnih znanstvenih problema koji ostaju

nedefinirani na razini molekulskog prepoznavanja. Kombinatorne strategije postale su

alternativa racionalnom dizajnu i proširile opseg fluorescentnih senzora na mete koje

prethodno nisu bile dostupne (stanični fenotipovi, makrostrukture i sl.)

Nekoliko revijalnih radova opisalo je efikasnost fluorescentnih proba za razne primjene

(unutarstanični pH indikatori, senzori za reaktivne kisikove i dušikove specije, senzori za

metale, dijagnostički alati) i mehanizme, kao i njihovu sintezu iz određenih kemijskih

struktura (peptidi, aptameri, biomolekulski građevni blokovi, senzorski materijali, DNA-

multikromofori). Jedno od najbrže rastućih područja je upotreba kombinatorne kemije na

fluorescentnim okosnicama te brzi automatizirani screening čijom kombinacijom dolazi do

otkrića velikog broja potencijalnih senzora.1

4

2. Baze senzora zasnovanih na meti

Konvencionalni rad priprave baze fluorescentnih proba baziranih na meti započinje

odabirom analita koji će biti meta. Sljedeći korak je pretraga receptora i elemenata na koji bi

se proba trebala vezati i njihov odnos sa odašiljačima koji provode signal. Takav se signal

može manifestirati različitim mehanizmima kao što su fluorescentno quenchanje, transfer

fluorescentne rezonantne energije, fluorescentna anizotropija, fotoinducirani transfer

elektrona, kelacijom pojačana fluorescencija, osjetljivost na okolinu, metal-bazirana

fluorescencija i drugi. Receptor pojedinog analita može biti unaprijed poznat pa je zadatak

strategije razvoja probe optimirati odašiljač ili mehanizam prijenosa informacije. Češći je

slučaj da receptor reagira na čitavu klasu analita pa se baze senzora grade s ciljem poboljšanja

receptora koji selektivno veže analit od interesa. Kombinatorne strategije mogu nadvladati

ograničenja racionalnog dizajna kad je malo informacija o molekularnom prepoznavanju

dostupno. Mnoge fluorescentne probe razvijene su iz baza senzora baziranim na metama, a u

sljedećim poglavljima biti će svrstane u grupama prema molekulskoj strukturi.1

2.1. Probe za metale

2.1.1. Baze nukleinskih kiselina

Probe za metale su od dugotrajnog interesa zbog njihove biološke i ekološke važnosti.

Potencijal kombinatornih strategija dobro se može prikazati primjenom nukleinskih kiselina

zbog njihove iznimne modulacije, kompatibilnosti sa PCR (polimerazna lančana reakcija)

metodom i automatizirane sinteze koja je dovela do vrlo brojnih baza nukleinskih kiselina, do

1014

u broju specija.1

Jedan od takvih senzora je katalitički senzor za olovo razvijen je baziran na prvom DNA

enzimu u području (slika 1). Takav je senzor mnogo selektivniji za metalne ione, oko 40000

puta od prethodno objavljenih senzora za Pb2+

ione koji su također bazirani na DNA

enzimima.2

5

Slika 1. DNA enzim za selektivno vezivanje Pb2+

kationa

Takav je pristup korištenja DNA enzima primijenjen i na metalne katione Ca2+

i Zn2+

.

Glavni izazov tog područja je pronaći senzor spozoban za specifično i snažno vezanje metala.

Prednost kombinatorne strategije očitala se u korištenju tehnike in vitro odabira koja je

olakšala nalaženje katalitičke DNA koja može vezati željeni metalni ion specifično i snažno.

Nova strategija dala je usavršene rezultate, a riječ je o „negativnom odabiru“ pomoću koje se

odbacuje DNA koja veže metale koji su u kompeticiji za vezanje traženog analita.

Označavanjem probrane katalitičke DNA parom fluorofor/quencher, pronađena je nova klasa

DNA biosenzora za metalne ione.3

2.1.2. Baze peptida

Porast broja peptidnih senzora također se može pripisati mogućnosti modificiranja

strukture i automatizaciji njihove sinteze. Peptidi i proteini sastavljeni su od velikog broja

aminokiselina stoga su njihove baze podosta velike i često uz veću raznolikost nego što je

slučaj kod nukelinskih kiselina.1

Jedan od primjera peptidnih senzora su peptidi koji imaju uklopljen fluorofor 8-hidroksi-

5-(N,N-dimetilsulfonamido)-2-metilkinolin u svoju strukturu za mogućnost in vitro

dijagnostiku Zn2+

iona (slika 2). Kvantna iskorištenja takvih derivata mnogo su bolja od

sličnih kinolinskih proba objavljenih u literaturi. Afiniteti takvih jednostavnih specija prema

cinku čine ih korisnim probama staničnih zbivanja povezanima s visokim razinama cinka.

Spomenuti derivati su dobri kandidati za kasniju inkorporaciju u dizajne senzora sa

proširenim superstrukturama za osjetljivu i selektivnu detekciju cinka u biološke i ekološke

svrhe.4

6

Slika 2. Poznati fluorofor za Zn+ koji je korišten u kombinaciji s peptidima

2.1.3. Baze malih molekula

Smanjena kompleksnost i veličina malih molekula često su najveće prednosti njihovog

korištenja kao proba. Vrlo su korisne kao in vivo fluorescentne probe zbog niske molekulske

mase, visoke kemijske stabilnosti i relativno dobre stanične permeabilnosti. S druge strane,

njihova ograničena mogućnost modifikacije i nedostatak automatizacije sinteze za posljedicu

ima smanjenu veličinu baza takvih probi u odnosu na prethodno spomenute klase.1

Korištenje kombinatorne strategije kao nadogradnja rezultata postignutih racionalnim

dizajnom može se prikazati sljedećim primjerom. Probe za Hg2+

ione razvijene dodatkom na

fluorescentnu jezgru postignute su kombinatornom strategijom koja je uključila

funkcionalizaciju tioureom i selektivno prepoznavanje analita (slika 3). Do konačne strukture

grupa je došla obrnutim redoslijedom nalaska proba, korištenjem fluorescencije postojećih

struktura za nalaženje vezivnih mjesta i konstrukcijom kemosenzorske baze koja koristi novi

mehanizam signalizacije, ograničenu biarilnu torziju fluorofora.5

7

Slika 3. Senzor dobiven kombinacijom racionalnog dizajna i kombinatorne varijacije

2.1.4. Baze polimera

Fluorescentni sintetski polimeri odličan su izvor okolišnih senzora zbog svoje stabilnosti u

grubim uvjetima mogućnosti korištenja u dugotrajnim eksperimentima. Jedinstven način

njihove primjene leži i u pripremi krutih materijala ili membrana koji mogu biti integrirani u

instrumente za detekciju ili optička vlakna. Konjugirani fluorescentni polimeri pokazali su

pojačanu osjetljivost zbog mogućnosti korištenja kao transportni medij, a i zahvaljujući

kolektivnom sistemskom odazivu. Polimerni senzori kompatibilni su s kombinatornom

kemijom zbog mnogih varijabli koje definiraju njihova svojstva, međutim, njihova

manipulacija može biti komplicirana čak i kod primjene sofisticirane automatizacije, stoga

njihove baze znaju biti manje od dosad spomenutih klasa spojeva.1

Primjer sinteze polimernih senzora su fenolni polimeri pripravljeni katalizom

peroksidaznim enzimom soje koji su korišteni kao komponente senzora za metale u nizu

polimera. Polimerni nizovi za Fe3+

, Cu2+

Co2+

i Ni2+

razvijeni su sadržavajući 15 fenolnih

homopolimera i kopolimera generiranih iz pet fenolnih monomera peroksidazom

kataliziranom polimerizacijom. Signalizacija je bazirana na promjeni intrinzične

fluorescencije polifenola uslijed dodavanja metalnog iona ili smjese vodenoj otopini

polifenola. Odaziv kopolimera u nekim se slučajevima drastično razlikovao od odaziva

homopolimera i ovisio je o omjeru konstituirajućih monomera. Takav rezultat potvrđuje da je

velik broj nizova senzora moguće pripraviti iz malog broja fenolnih monomera. Identifikacija

8

određenih metalnih iona izvodi se očitavanjem rezultata i usporedbom sa histogramima

konstuiranim statističkom analizom provedenih eksperimenata.6

2.2. Baze fluorescentnih senzora za saharide

Brojnost bioloških procesa koji uključuju saharide potaknula je intenzivno istraživanje

prema razvoju senzora za ove biomolekule. Dizajn proba visoke specifičnosti i selektivnosti

ostaje zahtjevan zadatak najviše zbog ograničenog broja funkcionalnih skupina, nedostatka

ionske nabijenosti i dinamičkih konfomacijskih stanja. Nadalje, velik broj prisutnih

hidroksilnih skupina ograničava mehanizme prepoznavanja na vodikove veze, što je uvelike

ugroženo od strane kompeticije molekulama vode.1

Jedan od primjera koji je nadvladao izazov vezivanja u vodenim otopinama je korištenje

boronskih estera. Vodikova veza zamijenjena je reverzibilnom kovalentnom, odnosno

stvaranjem cikličkih estera iz diola u bazičnom vodenom mediju (slika 4). Saharidi su odličan

kontinuirani niz cikličkih alkohola što je učinilo strategiju vrlo primijenjivom. Definirajuće

svojstvo ovakvih sustava je ovisnost prisutne specije o pH medija što za uzrok ima i promjenu

odaziva. Korištenje spomenute strategije dalo je značajan doprinos razvoju senzora za

saharide.7

Slika 4. Korištenje boronskih kiselina za vezivanje na saharide

9

2.3. Baze fluorescentnih senzora za ATP i peptide

Svestranost molekule ATP-a i njegova ključna uloga u mnogim metaboličkim

mehanizmima kao i visoka sličnost molekuli GTP-a čine ga zahtjevnim analitom u razvoju

proba. Mnogi radovi u području razvoja ovakvih senzora koriste se SELEX metodologijom

koja predstavlja tehniku kombinatorne kemije koja proizvodi oligonukleotide ili dijelove

RNA ili DNA za selektivno vezivanje za određeno aktivno mjesto.1

Slično nukleotidima, mali peptidi predstavljaju ključnu ulogu u većini staničnih sustava.

Njihova molekulska sličnost izazvala je korištenje kombinatorne kemije kao glavni pristup

otkrivanju novih senzora za takve molekule.1 Kao jedan od primjera mogu se navesti senzori

bazirani na kaliksarenima koji su kombinatornim pristupom sintetizirani za pronalazak proba

za peptide. S obje strane kaliks[4]arena vezani su nizovi aminokiselina koji čine

peptidokaliksarene (slika 5). Nakon pretrage velikog broja pripravljenih kaliksarena (153)

odabrani su oni koji su selektivno vezali peptid koji je odabran kao analit na sebe. Oni s

najznačajnijim rezultatima izdvojeni su i okarakterizirani s ciljem daljnje optimizacije.8

Slika 5. Kaliksarenska okosnica i aminokiselinski lanci kao senzori za peptide

10

2.4. Baze fluorescentnih senzora za hlapljive analite

Hlapljivi analiti predstavljaju izazov zbog mogućeg utjecaja na stabilnost kemijskih proba.

Zbog spomenutog razloga, za senzore takvih specija najčešće se koriste polimeri.1

Jedan od primjera je serija pripravljenih π-konjugiranih polimera od fenilenvinilenskih,

fenilenetinilenskih, fluorenskih i tiofenskih derivata sa bipiridil ili terpiridilnim supstituentima

unutar ili na strani π-konjugirane okosnice (slika 6). Takvi ligandno modificirani kopolimeri

služe kao makromolekularne osnove za vodljive metalopolimere, a u konkretnom slučaju

istražena su optička i fotoluminiscentna svojstva polimera i odgovarajućih bakrovih

metalopolimera. Takav metalopolimer reducira se iz Cu2+

stanja u Cu+ stanje reakcijom s

dušičnim oksidom uz velike emisijske promjene koje variraju od 50% smanjenja do 320%

povećanja. Najbolji su rezultati uočeni pri metalopolimerima koji su imali Cu2+

vezanu na

bipiridilne jedinice unutar okosnice što predstavlja najbolje kandidate za senzore dušičnog

oksida.9

Slika 6. Senzor za dušični oksid na bazi metalopolimera

3. Baze senzora zasnovane na raznolikosti

Uspjeh baza senzora temeljenih na metama ovisi o uključenju afiniteta probe prema meti

(receptorski elementi i molekulske interakcije) kao i o prilagodbi mehanizama koji prevode

događaj prepoznavanja u fluorescentni signal. S ciljem promjene metodologije i povećanog

11

broja pronalazaka efikasnih senzora, baze zasnovane na raznolikosti koriste kombinatornu

kemiju za generiranje baza molekula koje imaju obje uloge, receptorsku i odašiljačku. Takav

pristup nudi nekoliko prednosti: širi opseg uporabe i korištenje bez prethodnog znanja o

strukturi mete i nedostatak potrebe za dodatnim mehanizmom odašiljanja. S druge strane,

manjkavost tog sustava leži u potrebi za pretraživanjem mnogo većeg opsega modifikacija na

postojeće i otkriće novih struktura kako bi se otkrili pouzdani senzori. Grana kojoj ovaj

pristup najviše pogoduje je kombinatorna kemija malih molekula, originalno korištena u

okviru pronalaska lijekova. Dva su glavna pristupa, derivatizacija poznatih fluorescentnih

okosnica komercijalno dostupnim materijalima i konvencionalnim metodama sinteze ili

sinteza višekomponentnim, „one-pot“ ili tandemskim reakcijama kojima se pristupa de novo

fluorescentnim strukturama.1

Slika 7. Poznate okosnice korištene kao fluorescentni senzori

3.1. Kombinatorna derivatizacija poznatih fluorescentnih okosnica

3.1.1. Paladijem-katalizirani coupling

Jedan od prvih primjera baze su dobivene derivatizacijom kumarinske okosnice

paladijem-kataliziranim couplingom. Takve su reakcije kompatibilne sa raznim

funkcionalnim skupinama (alkeni, alkini, boronske kiseline) stoga su korisne u okviru

kombinatorne strategije.1

12

Jedan od zapaženijih radova u području je iskoristio mogućnosti couplinga

derivatizacijom 3-bromokumarina Heck, Sonogashira i Suzuki reakcijom (slika 8). Dobiveni

produkti produljili su π-sustav postojećeg kromofora i dali obećavajuće rezultate. Efikasnost

kombinatornog pristupa ovisila je o kompatibilnosti komponenata couplinga i mogućnost

korištenja u sličnim reakcijskim uvjetima. Koristeći spomenute reakcije, na osnovnu strukturu

uvedeni su arenski, etinilenski i etenilenski elementi. Pročišćenim specijama dobivene baze

ispitana su spektroskopska svojstva i dobiveni rezultati apsorpcijskih maksimuma (314 – 430

nm) i emisijskih maksimuma (400 – 569 nm) vrlo su širokog raspona. Količina prikupljenih

podataka je dovoljna za detaljnu analizu korelacije geometrijskih i elektronskih struktura

dobivenih molekula što omogućuje olakšani racionalni dizajn molekula sličnih svojstava koja

mogu sadržavati planirano željene karakteristike.10

Slika 8. Defivati kumarina dobiveni paladijem kataliziranim couplingom

3.1.2. Huisgenova 1,3-dipolarna cikloadicija

Kao jedan od prototipova „klik-kemije“ Huisgenova cikloadicija može se pohvaliti

jednostavnošću, visokom efikasnošću i blagim reakcijskim uvjetima. Zbog svega se

navedenog vrlo često koristi u bazama senzora temeljenih na raznolikosti.1

Primjer korištenja kombinatorne strategije u ovom kontekstu ponovo uključuje

kumarinske produkte sintetizirane u velikim količinama. Visoka reaktivnost aromatskih azida

također korištenih u sintezi omogućila je laku pripravu brojnih različitih produkata koji mogu

biti vezani na biomolekule, polimere, nanočestice i razne druge površine. Takve dobivene

boje prve su koje koriste kombinatornu azido-alkinsku sintezu. Blagi reakcijski uvjeti i

13

jednostavna obrada olakšali su paralelnu sintezu čime je dobiven veliki broj molekula širokog

raspona apsorpcijskih i emisijskih maksimuma. Količina prikupljenih podataka korisna je i za

analizu odnosa strukture i spektroskopskih svojstava.11

Slika 9. Derivati kumarina dobiveni 1,3-Huisgenovom dipolarnom cikloadicijom

3.1.3. Knoevenagel kondenzacija, stvaranje amida i nukleofilna supstitucija

Knoevenagelove kondenzacije imaju poseban značaj u kombinatornoj fluorescentnoj

kemiji zbog couplinga aromatskih aldehida koji obično rezultira produženom π-konjugacijom

koja uzrokuje crveni pomak emisijskih valnih duljina fluorescentnih okosnica.1

Spomenutom kondenzacijom sintetizirana je prva baza BODIPY spojeva reakcijom

dimetil-BODIPY okosnice sa 160 različitih benzaldehida (slika 10). Korištenjem dobivenih

molekula, obavljen je screening različitih staničnih linija i pronađena je specija nazvana

Glucagon Yellow koja je selektivno označavala AlphaTC1 stanice. Selektivnost je potvrđena

in vitro usporedbom promjene intenziteta fluorescencije u prisutsnoti 19 različitih biološki

relevantnih analita. Rezultati su pokazali potencijalnu upotrebu kao agens za označavanje u

živim stanicama i tkivima.12

Slika 10. Derivati BODIPY spojeva s benzaldehidima

14

3.2. De novo konstrukcija fluorescentnih okosnica

S obzirom na ograničen broj fluorescentnih okosnica koje se mogu smatrati sintetski

fleksibilnima, više je istraživačkih grupa krenulo u konstrukciju novih fluorescentnih specija s

ciljem razlikovnosti.1

Jedan od uspješnih pokušaja je sinteza dihidropirolo[3,4-β]indolizin-3-ona koji je pokazao

odlična svostva i primijenjivost. Promjenom suspstituenata emisijski maksimumi dobivenih

produkata potpuno su podesivi kroz cijeli spektar vidljivog zračenja (slika 11). Supstituenti se

razlikuju po elektronskim svojstvima, a dobiveni su „one-pot“ reakcijama koje su vrlo

efikasno generirale kompleksnost iz jednostavnog skeleta. Novootkriveni fluorofori imaju

odlična fotofizička i fotokemijska svojstva, zadovoljavajuća kvantna iskorištenja, neovisnost

o pH medija, velike Stokes-ove pomake, visoku lipofilnost i permeabilnost membrana.13

Slika 11. Nova fluorescentna okosnica s podesivim odzivima

3.3. Kruto-fazne baze fluorescentnih senzora temeljena na raznolikosti

Korištenje krute faze u konstrukciji baza senzora komplementira kemiju razvijenu u

otopinskoj fazi. Dobro je ustanovljena sinteza nukleinskih kiselina i peptida u krutoj fazi, a

screening na zrncima (on-bead screening) predstavlja najpraktičniji i direktniji način procjene

takvih baza. Mali molekulni senzori na zrncima nailaze na prepreke u obliku smetnji krute

površine u događaju prepoznavanja, pa optimizacija takvih sustava zahtijeva mnogo više

vremena. Umjesto toga, male molekule pripremljene u krutoj fazi usmjerene su prema

povećanju kemijske raznolikosti proba i pojednostavljenju postupka njihovog pročišćavanja.1

15

3.3.1. Baze malih molekula

Napredak u polju baza malih molekula pristupom kruto-fazne kemije učinjen je sintezom

benzopiranilnih derivata. Cilj istraživanja bio je povećanje molekulske raznolikosti u

paralelnoj kruto-faznoj sintezi korištenjem pristupa „od baze do baze“. Modifikacija skeleta

efikasno je postignuta raznim kemijskim transformacijama ključnih intermedijera, vinilnih

trilfata. Primjeri navode Suzuki arilaciju, Stille vinilaciju i kasniju dijastereoselektivnu Diels-

Alderovu reakciju, Negishi alkinilaciju koju slijedi Huisgenova cikloadicija. Navedenim

reakcijama pripravljena su tri temeljna skeleta čija je daljnja funkcionalizacija kruto-faznom

paralelnom sintezom omogućila više od 400 specija za analizu bioloških i spektroskopskih

svojstava.14

Slika 12. Derivati malih molekula vezani na krute nosače

3.3.2. Baze peptida i nukleinskih kiselina

Konvencionalne metodologije za kruto-faznu sintezu peptida i nukleinskih kiselina

pogodovale su njihovom screeningu kao čvrste platforme. Smetnje nosača u procesu

prepoznavanja u slučaju peptida i nukleinskih kiselina su najčešće zanemarive jer su probe

obično velike makromolekule. Za razliku of fluorofora ili sintetski konjugiranih polimera,

16

peptidi i nukleinske kiseline inače ne fluoresciraju i više je strategija prema njihovoj

funkcionalizaciji u tom smjeru. Jedna od strategija je screening na zrncima prema

fluorescentnim metama kako bi rezultirajuća fluorescentna zrnca mogla biti sortirana i

analizirana nakon pranja viška supstrata. Takav je pristup primijenjiv na brojne mete: male

molekule, antibiotike, proteine i stanice. Kao alternativa, nudi se označavanje baza peptida na

zrncima.1

Jedni od senzora izgrađenih od nukleinskih kiselina su oligodeoksifluorozidi, kratki

oligomeri nalik DNA u kojem su nukleotidne bae zamijenjene fluoroforima. Neke od takvih

sekvenci mogu reagirati na male organske molekule u plinovitoj fazi, praćene uz promjenu

fluorescencije. Baza od više od 2 tisuće različitih tetramera sintetizirana je kombinatornom

metodom i obavljen je screening za 10 različitih hlapljivih organskih spojeva raznolikih

funkcionalnih skupina, kiselina, baza, aromatskih i alifatskih. Izdvojeni su najbolje reagirajući

senzori i dodatno karakterizirani. Neki od senzora fluorescirali su u prisutnosti osam od 10

analita i dali različite odzive za svaki od njih uz vrlo jaki signal, čak i za vrlo slične analite

poput akroleina i akrilonitrila.15

Slika 13. Oligomerni senzori za hlapljive spojeve

17

4. Trendovi i perspektive

4.1. Izazov identifikacije mete

Nakon uspješnog otkrića fluorescentnih proba za organele, fenotipove ili stanična stanja,

istraživači su pred zahtjevnim zadatkom identifikacije makromolekula koje se vežu za te

probe i odgovorne su za njihovu selektivnost. Identifikacija mete ostaje jedna od

najdugotrajnijih faza kemijske genetike. Taj se izazov odnosi i na kemijske fluorescentne

probe, s jedinom prednošću što njihova intrinzična fluorescencija podržava i izolaciju

proteina. Iako postoje mnogi alati (probe bazirane na aktivnostima, afinitetna kromatografija,

fotocross-linking reagensi i bioortogonalna klik kemija) koji mogu ubrzati taj proces,

kemijske modifikacije koje kompromitiraju selektivnost fluorescentnih proba su obično

potrebne za identifikaciju molekularne mete. Baze molekula temeljene na raznolikosti koje

razmatraju inkorporaciju kemijskih alata za identifikaciju mete u svojem dizajnu mogle bi

ponuditi brži prijelaz iz automatiziranog screeninga na velikom broju meta do otkrića meta

vezivanja.1

4.2. Dizajn novih kemijskih arhitektura

4.2.1. Višebojne i višemodalne probe

Rastući interes u razvijanju alata za snimanje aktivirao je primjenu fluorescentnih proba u

vizualizaciji kompleksnih molekulskih događaja in vivo. Višebojni alati omogućavaju

istovremeno praćenje nekoliko (do 5) bioloških procesa. Peptidima funkcionalizirane kvantne

točke za višebojno označavanje pojedinih stanica i NIR-označeni dendrimeri za in vivo

vizualizaciju limfnih čvorova su reprezentativni primjeri. Budući kombinatorni primjeri mogli

bi uključiti više spektralnih mogućnosti fluorescentnih molekula ili njihovu kombinaciju sa

sličnim svojstvima (Raman raspršivanje) za pripravu proba poboljšane selektivnosti i

osjetljivosti.1

Još jedan rastući trend u in vivo snimanju tiče se konstrukcije višemodalnih probi koje

kombiniraju optičko snimanje s anatomskim informacijama (magnetska rezonancija, pozitron-

emisijska tomografija, ili komputirana tomografija). Iako postoje objavljene višemodalne

probe koje kombiniraju fluorofore, kvantne točke, nanočestice željezovog oksida, materijale

18

na bazi gadolinija ili radioizotope, njihova prilagodba kombinatornoj sintezi ili

automatiziranom screeningu još zahtijeva značajnu optimizaciju.1

4.2.2. Dinamičke kombinatorne baze senzora

Dinamičke baze senzora otvorile su pristup novim fluorescentnim arhitekturama koje

rijetko mogu biti dostignute ostalim kombinatornim srategijama. Takve su baze konstruirane

iz građevnih blokova koji su reverzibilno vezani iminskim, hidrazonskim, acetalnim ili

disulfidnim poveznicama. Takvi blokovi asociraju se u kompleksnije ravnotežne smjese

spojeva s koncentracijama koje odgovaraju njihovoj ravnotežnoj stabilnosti. Nakon što se

analit izloži takvoj smjesi, uspostavlja se novo globalno stanje ravnoteže koje odgovara

komponentama s najvišim afinitetom za analit (Slika 14).1

Slika 14. Uspostavljanje ravnoteže dinamička kombinatorna baza senzora

5. Zaključci

Primjena kombinatorne kemije u razvoju fluorescentnih senzora doživjela je značajni

porast u posljednjih 5-10 godina. Nekoliko je ciljeva ispunjeno: prilagodba okosnica malih

molekula paralelnoj sintezi, inkorporacija fluorescentnih elemenata u automatiziranu pripravu

nukleinskih kiselina i peptida, integracija profiliranih i evolucijom baziranih strategija s

ciljem poboljšanja selektivnosti i osjetljivosti senzora kao i značajna tehnološka dostignuća u

području automatiziranog snimanja i prikupljanja podataka. Navedenim napretkom,

konvencionalne baze temeljene na meti proširene su prema onima temeljenim na raznolikosti

i proširile opseg pronalaska fluorescentnih senzora. Takve su nove baze uspješne u

19

identifikaciji novih strukturnih motiva vezivanja, posebno za mete koje prethodno nisu mogle

biti proučavane.

Porast de novo konstrukcije fluorescentnih okosnica i dinamičke kombinatorne kemije su

dobri primjeri priprave novih i kompleksnih senzora. Baze potencijalnih probi također moraju

uzeti u obzir izazov prepoznavanja mete od početnog dizajna zbog kemijskih modifikacija

koje se događaju nakon uspješnog porepoznavanja koje mogu narušiti njihovu selektivnost i

usporiti proces identifikacije.1

Rastući broj tehnoloških napredaka u području, brzine obavljenih mjerenja, a i sinteze

samih potencijalnih senzora obećava još efikasniju pretragu i veći broj pronalazaka takvih

molekula u bliskoj budućnosti.

20

6. Literatura

1. M. Vendrell, D. Zhai, J. C. Er, Y. Chang, Chem. Rev. 112 (2012) 4391–4420.

2. T. Lan, K. Furuya, Y. Lu, Chem. Commun. 46 (2010) 10466.

3. Y. Lu, J. Liu, J. Li, P. J. Bruesehoff, C. M. B. Pavot, A. K. Brown, Biosens.

Bioelectron. 18 (2003) 529.

4. D. A. Pearce, N. Jotterand, I. S. Carrico, B. Imperiali, J. Am. Chem. Soc. 123 (2001)

5160-5161.

5. J. V. Mello, N.S. Finney, J. Am. Chem. Soc. 127 (2005) 10124-10125 6. X. Wu, J. Kim, J. S. Dordick, Biotechnol. Prog. 16 (2000) 513. 7. T. D. James, K. R. A. S. Sandanayake, S. Shinkai, Angew. Chem. Int. Ed. 35 (1996)

1910. 8. H. Hioki, M. Kubo, H. Yoshida, M. Bando, Y. Ohnishi, M. Kodama, Tetrahedron

Lett. 43 (2002) 7949. 9. R. C. Smith, A. G. Tennyson, A. C. Won, S. J. Lippard, Inorg. Chem. 45 (2006) 9367. 10. M. Schiedel, C. A. Briehn, P. Bäuerle, Angew. Chem. Int. Ed. 40 (2001) 4024-4680. 11. K. Sivakumar, F. Xie, B. M. Cash, S. Long, H. N. Barnhill, Q. Wang, Org. Lett. 6

(2004) 4603-4606. 12. J.Lee, N. Kang, Y. K. Kim, A. Samanta, S. Feng, H. K. Kim, M. Vendrell, J. H. Park,

Y. Chang, J. Am. Chem. Soc. 131 (2009) 10077–10082. 13. E. Kim, M. Koh, J. Ryu, S. B. Park, J. Am. Chem. Soc. 130 (2008) 12206–12207. 14. S. Oh, H. J. Jang, S. K. Ko, Y. Ko, S. B. Park, J. Comb. Chem. 12 (2010) 548–558. 15. F. Samain, N. Dai, E. T. Kool, Chem. Eur. J. 17 (2011) 174 – 183.