Medizinische Fakultät
der
Universität Duisburg-Essen
Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie
G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPR) 15 – ein neuer
Rezeptor für die Migration von T-Zellen in das Colon von
Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
I n a u g u r a l - D i s s e r t a t i o n
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
durch die Medizinische Fakultät
der Universität Duisburg-Essen
Vorgelegt von Daniel Gageik
aus Aachen
2017
2
Dekan: Herr Univ.-Prof. Dr. med. J. Buer
1. Gutachter: Frau Univ.-Prof. Dr. rer. nat. A. Westendorf
2. Gutachter: Herr Priv.-Doz. Dr. rer. nat. B. B. Singer
Tag der mündlichen Prüfung: 30. August 2018
3
Teile dieser Dissertation wurden in der Publikation Differential expression of GPR15
on T cells during ulcerative colitis (Adamczyk et al., 2017) in der Fachzeitschrift JCI
Insight (2017;2(8):e90585) bereits veröffentlicht.
Inhaltsverzeichnis
4
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ........................................................................................................ 6
1.1. Das Immunsystem..................................................................................... 6
1.1.1. Angeborene Immunabwehr ................................................................ 6
1.1.2. Adaptive Immunabwehr ...................................................................... 8
1.1.3. Mukosales Immunsystem ................................................................. 10
1.2. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen ........................................... 11
1.2.1. Ätiologie und Pathophysiologie ......................................................... 11
1.2.2. Klinik ................................................................................................. 14
1.2.3. Therapie ........................................................................................... 16
1.3. Darmspezifisches homing und GPR15.................................................... 18
1.4. Zielsetzung .............................................................................................. 21
2 Material und Methoden.................................................................................. 22
2.1. Studienpopulation ................................................................................... 22
2.1.1. Soziodemographische Daten ............................................................ 22
2.1.2. Blutproben ........................................................................................ 22
2.1.3. Darmbiopsien.................................................................................... 23
2.1.4. Buffy-Coat-Leukozyten ..................................................................... 23
2.2. Material ................................................................................................... 24
2.2.1. Puffer, Medien und Lösungen ........................................................... 24
2.2.2. Chemikalien und Enzyme ................................................................. 24
2.2.3. Primer ............................................................................................... 25
2.2.4. Fluorochrome.................................................................................... 26
2.2.5. Antikörper ......................................................................................... 26
2.2.6. Geräte ............................................................................................... 27
2.3. Molekularbiologische Methoden .............................................................. 27
2.3.1. RNA-Isolierung ................................................................................. 27
2.3.2. cDNA-Synthese ................................................................................ 27
2.3.3. Semiquantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ........................ 28
2.3.4. Quantitative Real-Time PCR ............................................................ 29
2.4. Zellbiologische Methoden ........................................................................ 30
2.4.1. Gewinnung von Einzelzellsuspensionen ........................................... 30
2.4.2. Isolierung von Lymphozyten aus Darmbiopsien ............................... 30
2.4.3. Bestimmung von Zellzahlen .............................................................. 31
2.4.4. Durchflusszytometrie ........................................................................ 31
2.4.5. Färbung gegen Oberflächenproteine ................................................ 32
2.4.6. Intrazelluläre Färbung ....................................................................... 32
2.4.7. Sortieren von Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie ........... 33
Inhaltsverzeichnis
5
2.4.8. Proliferationsassay von Lymphozyten .............................................. 33
2.4.9. Detektion sezernierter Zytokine ........................................................ 34
2.5. Statistik .................................................................................................... 34
3 Ergebnisse .................................................................................................... 35
3.1. GPR15 im Blut von gesunden Spendern ................................................. 35
3.1.1. GPR15-Expression auf unterschiedlichen Immunzellen ................... 35
3.1.2. Funktionelle Eigenschaften von GPR15 ........................................... 38
3.1.3. Höhere GPR15-Expression auf regulatorischen T-Zellen ................. 40
3.2. GPR15 bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ........................ 41
3.2.1. Veränderte GPR15-Expression im Blut ............................................ 41
3.2.2. Koexpression von GPR15 und Integrin α4β7 ..................................... 43
3.2.3. Unterscheidung von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa .................. 44
3.3. GPR15-Expression im Colon bei Colitis ulcerosa ................................... 46
3.3.1. Genexpressionsanalysen von GPR15 im Colon ............................... 46
3.3.2. GPR15-Expression von regulatorischen T-Zellen des Colons .......... 47
4 Diskussion ..................................................................................................... 50
5 Zusammenfassung ........................................................................................ 58
6 Literaturverzeichnis ....................................................................................... 59
7 Anhang .......................................................................................................... 66
7.1. Abbildungsverzeichnis ............................................................................. 66
7.2. Tabellenverzeichnis................................................................................. 67
7.3. Abkürzungsverzeichnis ........................................................................... 68
Danksagung ...................................................................................................... 71
Lebenslauf ........................................................................................................ 72
Einleitung
6
Einleitung
1.1. Das Immunsystem
Das Immunsystem ist ein Abwehrsystem des Körpers gegen Mikro-
organismen wie Viren, Bakterien, Pilze oder Parasiten, gegen körperfremde
Moleküle wie beispielsweise Toxine und nicht zuletzt auch gegen maligne entartete
Körperzellen. Daher verhindert es eine Gewebeschädigung durch Krankheits-
erreger und stellt die Funktionsfähigkeit und körperliche Unversehrtheit sicher. Für
diese komplexe Aufgabe verfügt das Immunsystem zum einen über zelluläre
Abwehrmechanismen in Form von Immunzellen, die im Blut und Gewebe des
Körpers patrouillieren, und zum anderen über eine humorale Abwehr bestehend aus
Antikörpern, antimikrobiellen Enzymen und Interleukinen, die als Botenstoffe eine
komplexe Interaktion der unterschiedlichen Bestandteile des Immunsystems
ermöglichen. Zum besseren Verständnis dieser Vorgänge und besonders in Bezug
auf die in dieser Arbeit thematisierten Vorgänge und Zusammenhänge wird das
Immunsystem in drei Bereiche eingeteilt: die unspezifische, angeborene
Immunabwehr, die spezifische, adaptive Immunabwehr und das mukosale bzw.
intestinale Immunsystem, welches sowohl Aspekte der angeborenen, als auch der
adaptiven Immunabwehr beinhaltet, aber hier separat vorgestellt wird.
1.1.1. Angeborene Immunabwehr
Das angeborene Immunsystem ist die vorderste Abwehrlinie des Körpers zur
Bekämpfung von Krankheitserregern oder anderen körperfremden Makro-
molekülen. Die besondere Effektivität der angeborenen Immunabwehr liegt darin,
1
Einleitung
7
dass sie in der Lage ist, sehr schnell zu reagieren und äußerst gut zwischen
körpereigenen und körperfremden Zellen zu unterscheiden. Deshalb führen die
zahlreichen Mikroorganismen, mit denen ein gesunder Mensch täglich in Kontakt
tritt, nur selten zu einer Infektion und werden stattdessen bereits innerhalb von
Minuten bis wenigen Stunden eliminiert. Die wichtigsten Bestandteile des
angeborenen Immunsystems werden dazu kurz vorgestellt:
Die Haut nimmt als eines der größten und vielseitigsten Organe des Körpers
eine besondere Rolle in diesem Zusammenhang ein, da sie nicht bloß eine
epitheliale Barrierefunktion aufweist, sondern aktiv und dynamisch an
immunologischen Prozessen mitwirkt. Zum einen verhindern Phagozyten das
Eindringen von pathogenen Mikroorganismen, zum anderen sind es Mikro-
organismen selbst, die im Zusammenspiel mit dem Immunsystem zu einer Hautflora
führen, die wesentlich an der Abwehr von Krankheiten beteiligt ist, wie neuere
Studien zeigen konnten (Belkaid et al., 2014). Wie schaffen es aber Phagozyten
des angeborenen Immunsystems, pathogene Erreger und fremde Strukturen zu
entdecken? Dazu verfügen sie über Mustererkennungsrezeptoren (engl. pattern
recognition receptor, PRR), die entweder auf der Zelloberfläche gebunden oder
innerhalb der Zelle vorliegen und das Erkennen von pathogen-assoziierten
molekularen Mustern (engl. pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)
ermöglichen. Ein besonders wichtiger Vertreter aus der Gruppe der PRRs ist der
Toll-ähnliche Rezeptor (engl. toll-like receptor, TLR), der bei Infektionen durch
verschiedene Mikroorganismen von zentraler Bedeutung ist. Nach der
Identifizierung von Krankheitserregern können Zellen der angeborenen
Immunabwehr diese eliminieren oder eine Entzündungsreaktion einleiten, um
weitere Immunzellen zu rekrutieren. Dazu gehören Granulozyten, die im Blut den
größten Teil ausmachen und durch Sekretion unterschiedlicher Stoffe bei der
Entzündungsreaktion von entscheidender Bedeutung sind, Makrophagen, die im
Gewebe patrouillieren, Eindringlinge erkennen und phagozytieren, sowie Natürliche
Killerzellen. Als letztes werden die humoralen Bestandteile des angeborenen
Immunsystems vorgestellt, die aus unterschiedlichen Plasmaproteinen bestehen,
welche entweder im Blut oder im Gewebe frei zirkulieren. Dazu gehört zum einen
das Komplementsystem, das aus vielen Proteinen besteht, die teils als Proteasen
fungieren und an Krankheitserreger binden können, um diese unschädlich zu
machen. Zum anderen gehören auch Zytokine des Immunsystems zur
Einleitung
8
angeborenen Immunabwehr und stellen als körpereigene Botenstoffe ein gutes
Beispiel für die Verzahnung sowie die komplexe Interaktion zwischen dem
angeborenen und adaptiven Immunsystem dar. Zu den Zytokinen gehört auch die
Gruppe der Interleukine, welche sehr heterogene Eigenschaften zeigen. Im
Einzelnen können sie stimulierende, aber auch hemmende Wirkungen auf das
Wachstum sowie die Reifung und Teilung von Immunzellen haben
(zusammengefasst aus Janeway Immunologie (Janeway et al., 2009)).
1.1.2. Adaptive Immunabwehr
Das adaptive oder auch erworbene Immunsystem ist im Gegensatz zum
angeborenen Immunsystem in der Lage, durch seine ausgefeilten Mechanismen
bestimmte Krankheitserreger ganz spezifisch zu erkennen. Neben zellständigen
Rezeptoren oder im Plasma gelösten Antikörpern dient dazu auch die Bildung eines
immunologischen Gedächtnisses, welches bei erneuter Infektion mit dem gleichen
Erreger eine gezielte und schnelle Reaktion einleitet, sodass der Körper eine
adaptive Immunität ausbildet. Zunächst ermöglichen antigenpräsentierende Zellen
(engl. antigen-presenting cell, APC), wie zum Beispiel dendritische Zellen (engl.
dendritic cell, DC) oder Makrophagen, das Erkennen von eingedrungenen
Mikroorganismen und leiten durch Aktivierung von Lymphozyten, den Zellen des
adaptiven Immunsystems, eine spezifische Immunantwort ein. Diese hoch-
spezifischen Immunzellen werden je nach Ort der Ausreifung in B-Lymphozyten und
T-Lymphozyten bzw. T-Zellen eingeteilt, wobei letztere anhand ihrer Oberflächen-
antigene (engl. Cluster of Differentiation, CD) weiter unterteilt werden in
beispielsweise CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxische T-Zellen. Die Spezifität
der T-Zellen liegt nun darin, dass sie sich alle in ihrem T-Zellrezeptor (TCR)
unterscheiden, da durch genetisches Rearrangement während der Zellreifung
festgelegt wird, gegen welches Antigen jeder TCR gerichtet ist. Aktiviert wird die
T-Zelle dann, wenn sie ihr spezifisches Antigen auf einer antigenpräsentierenden
Zelle erkennt und es gleichzeitig zu einer antigenunabhängigen Costimulation
kommt. Die Präsentation von Antigenen durch APCs erfolgt über Moleküle des
MHC-Komplexes (engl. major histocompatibility complex, dt. humanes Leukozyten-
Antigen, HLA), welche in MHC Klasse I- und MHC Klasse II-Moleküle unterschieden
werden. Während alle kernhaltigen Zellen MHC Klasse I-Moleküle auf ihrer
Einleitung
9
Oberfläche binden können, welche dann von CD8+ zytotoxischen T-Zellen erkannt
werden können, sind nur die „professionellen“ antigenpräsentierenden Zellen, wie
beispielsweise Makrophagen und dendritische Zellen, in der Lage, MHC Klasse II-
Moleküle zu präsentieren, die von CD4+ T-Helferzellen erkannt werden können.
Dies zeigt auch die besondere Bedeutung der Helferzellen, die eine Art Schaltstelle
in der Immunabwehr darstellen (zusammengefasst aus Janeway Immunologie
(Janeway et al., 2009)). Die CD4+ T-Zellen können weiter unterteilt werden in die
einzelnen TH-Zelltypen und regulatorische T-Zellen, die sich funktionell und
phänotypisch unterscheiden:
TH1-Zellen: T-Helferzellen von Typ 1 exprimieren den Transkriptionsfaktor
Tbet und produzieren die Zytokine Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interferon-γ
(IFN-γ) sowie Interleukin-2 (IL-2) (Mosmann et al., 1989). Diese
proinflammatorischen Zytokine führen zur Aktivierung von Makrophagen und leiten
dadurch eine zelluläre Abwehrreaktion ein. IL-12 wiederum, das von Makrophagen
ausgeschüttet wird, fördert die Reifung von naiven T-Zellen zu TH1-Zellen (Jager et
al., 2010). Während physiologischerweise dadurch eine kompetente Immunreaktion
gegen virale und bakterielle Infektionen gewährleistet wird, können TH1-Zellen aber
auch eine Bedeutung für das Auftreten von autoimmunologischen Erkrankungen
wie Morbus Crohn spielen, worauf später genauer eingegangen wird (Fuss et al.,
1996).
TH2-Zellen: T-Helferzellen von Typ 2 sind charakterisiert durch die
Expression des Transkriptionsfaktors GATA-3 und sezernieren typischerweise die
Zytokine IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10 (Zheng et al., 1997). Im Vordergrund steht eine
humorale Immunabwehr, besonders gegen extrazelluläre Krankheitserreger wie
Parasiten, durch Differenzierung von B-Zellen und Antikörperbildung (Ansel et al.,
2006). TH2-Zellen können durch eine pathologisch gesteigerte Immunreaktion zur
Entstehung von chronischen Erkrankungen wie Colitis ulcerosa führen (Fuss et al.,
2004).
TH17-Zellen: Der jüngste Vertreter der T-Helferzellen ist vom Typ 17, benannt
nach dem Zytokin IL-17, das größtenteils von TH17-Zellen gebildet wird (Wan et al.,
2009). Während die genaue Charakterisierung noch immer Gegenstand aktueller
Forschung ist, konnte bereits gezeigt werden, dass TH17-Zellen den
Transkriptionsfaktor RORγt exprimieren und über die Aktivierung von neutrophilen
Einleitung
10
Granulozyten eine besondere Rolle bei der Abwehr von extrazellulären Krankheits-
erregern wie Pilzen spielen (Vautier et al., 2010).
Regulatorische T-Zellen: TREGs zeigen im Vergleich zu T-Helferzellen
suppressive Eigenschaften, wodurch sie andere Immunzellen hemmen können und
von zentraler Bedeutung bei autoimmunologischen Erkrankungen sind (Sakaguchi
et al., 1995). TREGs exprimieren den intrazellulären Transkriptionsfaktor FoxP3 und
lassen sich darüber effektiv differenzieren (Fontenot et al., 2003). Die anti-
inflammatorischen Eigenschaften von regulatorischen T-Zellen sind auf die
Sekretion der Zytokine IL-10 und den transformierenden Wachstumsfaktor-β (engl.
transforming growth factor-ß, TGF-β) zurückzuführen und spielen eine zentrale
Rolle für die Ausbildung der immunologischen Toleranz, was im Folgenden näher
beschrieben wird (Groux et al., 1997).
1.1.3. Mukosales Immunsystem
Wie bereits für die Haut beschrieben, spielen auch die Schleimhäute eine
entscheidende Rolle in der Immunabwehr. Der Magen-Darm-Trakt beherbergt auf
seiner extrem großen Oberfläche zum einen zahlreiche Lymphozyten in diffusen
Ansammlungen und organisierten Verbänden (Lymphfollikel), welche zusammen
auch als darmassoziierte lymphatische Gewebe (engl. gut associated lymphoid
tissue, GALT) bezeichnet werden; zum anderen finden sich über 1014 kommensale
Bakterien, die als Darmmikrobiota von wesentlicher Bedeutung für Verdauung,
Nahrungsaufnahme und Aufrechterhaltung einer immunologischen Homöostase
sind (Eckburg et al., 2005; Palm et al., 2015).
Während zuvor erklärt wurde, welche Mittel dem angeborenen und adaptiven
Immunsystem zur Verfügung stehen, um auf das Eindringen von pathogenen
Krankheitserregern adäquat zu reagieren, soll im Folgenden beschrieben werden,
wie das Immunsystem auf den Kontakt mit harmlosen Antigenen aus der Nahrung
bzw. auf die große Anzahl von kommensalen Bakterien reagiert und warum eine
Immunabwehr ausbleibt.
Dazu entwickelt das Immunsystem und im Speziellen die T-Lymphozyten
eine orale Toleranz gegen Nahrungsmittelproteine und Bestandteile von
kommensalen Bakterien. Darunter versteht man einen sehr komplexen Vorgang,
dessen Mechanismus immer noch Gegenstand aktueller Forschung ist, der jedoch
Einleitung
11
maßgeblich durch die Aktivierung und Vermehrung von CD4+ regulatorischen
T-Zellen (TREGs) abläuft (Pabst et al., 2012). Das bedeutet, dass es bei der
Präsentation von luminalen Antigenen durch die APCs nicht zur Aktivierung von
T-Effektorzellen kommt, die eine Entzündungsreaktion einleiten würden, sondern
stattdessen CD4+ TREGs aktiviert bzw. induziert werden. Gleichzeitig kommt es zu
einer Anergie und Deletion von antigenspezifischen T-Effektorzellen. CD4+ TREGs
sind also Kernbestandteil der Ausbildung einer oralen Toleranz und stehen durch
weitere immunsuppressive Zytokine wie IL-10 in ständiger Interaktion mit pro- und
antiinflammatorischen Zellen des mukosalen Immunsystems. Dadurch kann man
ein physiologisches Gleichgewicht zwischen der Aktivierung und der Hemmung von
Entzündungsreaktionen ableiten, das auch als intestinale Homöostase bezeichnet
wird (Westendorf et al., 2010).
1.2. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen
Während zuvor lediglich die physiologischen Abläufe des darmassoziierten
Immunsystems beschrieben wurden, wird im Folgenden auf die überschießende
Immunreaktion der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, kurz CED (engl.
inflammatory bowel disease, IBD), eingegangen. Im Zentrum der Immun-
pathogenese von CED steht ein Ungleichgewicht zwischen pro- und anti-
inflammatorischen Prozessen, was deutlich macht, wie bedeutsam jene zuvor
beschriebene Balance des mukosalen Immunsystems für den Körper ist. Zu den
chronisch entzündlichen Darmerkrankungen zählen Morbus Crohn (MC) und Colitis
ulcerosa (CU), welche sich immunologisch und pathologisch zwar deutlich
unterscheiden, sich aber von ihrem klinischen Erscheinungsbild, den Symptomen,
der Diagnostik sowie Therapie sehr ähneln, sodass es sich als sinnvoll erwiesen
hat, diese Krankheitsbilder gemeinsam zu betrachten (de Souza et al., 2016).
1.2.1. Ätiologie und Pathophysiologie
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen haben in Europa eine Prävalenz
von bis zu 322 pro 100.000 für Morbus Crohn bzw. 505 pro 100.000 für Colitis
ulcerosa, zeigen ein Nord-Süd-Gefälle mit hohen Erkrankungsraten in Skandinavien
und geringeren Prävalenzen in den Mittelmeerländern, sind aber in allen westlichen
Einleitung
12
Industrienationen deutlich überrepräsentiert (Molodecky et al., 2012). Trotz
intensiver Forschungen im Laufe der vergangenen Jahrzehnte ist die Ätiologie im
Einzelnen noch nicht vollständig verstanden. Wichtig bei der Entstehung von
chronisch entzündlichen Darmerkrankungen sind vor allem folgende vier Aspekte:
Mikrobiota, Immunbiologie, Genetik und Umweltfaktoren. Wie bereits angedeutet,
zeigen neuere Studien einen immer größer werdenden Einfluss der kommensalen
Bakterien auf eine physiologische Darmfunktion und intestinale Homöostase (de
Souza et al., 2016). Eine veränderte Mikrobiota, durch beispielsweise die Einnahme
von antibiotischen Arzneimitteln, kann dramatische Folgen für den Körper haben,
wie das Krankheitsbild der antibiotikaassoziierten Kolitis eindrucksvoll demonstriert.
Die veränderte Mikrobiota von CED-Patienten soll durch moderne Therapieansätze
wie Stuhltransplantation normalisiert werden, um den Krankheitsprozess zu
limitieren (Colman et al., 2014). Besonders zur Behandlung der Antibiotika-
assoziierten Clostridium difficile-Infektion wurde vielfach an diesem Verfahren
experimentiert; dabei erregte der antegrade Versuch, Fremdfäkalien über eine
Nasensonde in den Dünndarm einzubringen, vor einigen Jahren viel
Aufmerksamkeit und konnte einen therapeutischen Vorteil zur konservativen
Therapie nachweisen (van Nood et al., 2013).
Die immunologische Bedeutung bei der Entstehung von CED ist besonders
auf die fehlende Inhibierung und damit überschießende Immunantwort auf luminale
Antigene und kommensale Bakterien zurückzuführen. Dabei muss man zwischen
einer TH1-abhängigen Immunreaktion, die vermehrt bei Morbus Crohn auftritt, und
einer TH2-abhängigen Reaktion bei Colitis ulcerosa unterscheiden; ebenfalls bei CU
findet man eine TH17-Aktivierung, welche sowohl pro- als auch antiinflammatorische
Folgen haben kann (de Souza et al., 2016; Hundorfean et al., 2012). Vereinfacht
dargestellt zeigt Abbildung 1.1, welche Zellen über welche Mechanismen an der
Entstehung und Aufrechterhaltung der Entzündungsvorgänge beteiligt sind und
welche physiologischen Abläufe stattfinden sollten. Dennoch muss man ergänzen,
dass die immunpathogenetischen Prozesse multifaktoriell und komplexer sind, als
hier in der Theorie dargestellt.
Einleitung
13
TH17 TREGTH2TH1
IFNγ
TNFα
IL-4
IL-5
IL-6
IL-10
IL-17A
IL-17F
IL-10
TGFβ
T-b
et
GA
TA
-3
RO
Rγt
FoxP
3
MC CU
Abbildung 1.1 – Schematische Darstellung der intestinalen Homöostase. (A) Läsionen in der epithelialen Barriere der Darmschleimhaut führen zum Eindringen von kommensalen Bakterien und Nahrungsproteinen und deren Aufnahme durch antigenpräsentierende Zellen. Es kommt zur Ausreifung von naiven T-Zellen in T-Helferzellen und zur Zytokinausschüttung. Dadurch werden Lamina epithelialis und tight junctions weiter geschädigt und mehr luminale Antigene dringen in die Mukosa ein und unterhalten den Entzündungsprozess weiter entsprechend eines „Circulus vitiosus“. Alternativ kann es zum Ausreifen von regulatorischen T-Zellen (TREGs) kommen, die über IL-10 und TGF-β immunsuppressiv wirken und eine intestinale Homöostase gewährleisten. (B) Ist dieses Gleichgewicht gestört, wie bei Morbus Crohn (MC) und Colitis ulcerosa (CU), überwiegen die durch T-Effektorzellen sezernierten Zytokine, wie symbolisch durch eine Waage dargestellt. TH17-Zellen stehen dabei in der Mitte, weil diese pro- und antiinflammatorische Wirkungen haben können (modifiziert nach Turner, 2009).
Darüber hinaus spielen auch genetische und äußere Faktoren eine Rolle bei
der Entstehung und Schwere von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Ein
Verlust oder Defekt im NOD2-Gen beispielsweise ist in hohem Maße mit Morbus
Crohn assoziiert, da es dadurch zu einer gestörten oralen Toleranz und verringerten
IL-10 Ausschüttung kommt (de Souza et al., 2016). Davon abgesehen stehen aber
meist polygenetische Veränderungen im Vordergrund statt isolierte Mutationen. Als
Umweltfaktoren werden unter anderem übermäßige Hygiene, unterschiedliche
Ernährungshypothesen und frühkindliches Stillen diskutiert, welchem ein protektiver
Wert bei der Entstehung von CED nachgewiesen wurde (Klement et al., 2004).
Dennoch mangelt es immer noch an einer evidenzbasierten Ernährungs-
empfehlung, da es zu große interindividuelle Unterschiede gibt, die vermutlich durch
eine Diversität in der Mikrobiota begründet sind (Ananthakrishnan, 2015).
Einleitung
14
Als Letztes wird an dieser Stelle auch kurz auf den Einfluss des Risikofaktors
Tabakrauchen eingegangen. Interessanterweise ist beschrieben, dass das Risiko
für die Entstehung von Morbus Crohn bei Rauchern etwa verdoppelt wird (OR 1.76,
95 % CI 1.40–2.22), während Colitis ulcerosa invers mit dem Tabakrauchen
korreliert (OR 0.58, 95 % CI 0.45–0.75), weshalb ihm sogar ein gewisser protektiver
Effekt zugesprochen wird (Ananthakrishnan, 2015). Gründe für die
unterschiedlichen Zusammenhänge werden stark diskutiert und neuere Studien
lassen eine Wechselwirkung des Tabakrauchens mit genetischen Polymorphismen
bzw. der Mikrobiota vermuten (Ananthakrishnan et al., 2014; Biedermann et al.,
2014).
1.2.2. Klinik
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen können sich aufgrund ihrer
unterschiedlichen immunpathogenetischen Ursachen auch in der klinischen
Ausprägung deutlich unterscheiden. Der Morbus Crohn kann sich im gesamten
Magen-Darm-Trakt manifestieren, hauptsächlich ist aber das terminale Ileum
betroffen. Dagegen ist die Colitis ulcerosa auf das Rektum und Colon beschränkt,
was sich auch im Namen der Erkrankung widerspiegelt. Morbus Crohn zeigt eine
diskontinuierliche Entzündung, die alle Schichten des Darms betrifft. Das Auftreten
von entzündeten neben gesunden Arealen wird als skip lesions bezeichnet. Im
Gegensatz dazu breitet die Colitis ulcerosa sich kontinuierlich von aboral nach oral
aus, betrifft aber nur die oberflächliche Schleimhaut. Aus der unterschiedlichen
Lokalisation der Entzündung erklären sich die verschiedenen Symptome der
Erkrankungen. Da Morbus Crohn häufig den Dünndarm befällt, klagen Patienten
über wässrige, nicht blutige Durchfälle. Dies liegt zum einen an einer direkten
Sekretion von Flüssigkeit in das Darmlumen durch entzündliche Veränderungen der
Darmwand und zum anderen an osmotischen Veränderungen aufgrund einer
Malabsorption, worunter man die mangelhafte Aufnahme von Nahrungs-
bestandteilen versteht. Die Durchfälle bei der Colitis ulcerosa sind eher blutig-
schleimig und beruhen auf einer exsudativen Sekretion als Folge der chronischen
Entzündung. Während es bei Morbus Crohn nur zu einer gering erhöhten
Stuhlfrequenz kommt, ist diese bei Colitis ulcerosa stark erhöht. Bei beiden
Erkrankungen kommt es zu Tenesmen und Abdominalschmerzen, welche sich je
Einleitung
15
nach Entzündungslokalität typischerweise im rechten und linken Unterbauch
präsentieren. Dies ist besonders bei Erstmanifestation einer chronisch
entzündlichen Darmerkrankung von entscheidender Bedeutung. Differenzial-
diagnostisch sollte bei Verdacht auf Morbus Crohn eine akute Appendizitis
ausgeschlossen werden, während die Colitis ulcerosa klinisch einer Sigma-
divertikulitis ähneln kann. (zusammengefasst aus Klinische Pathophysiologie
(Siegenthaler et al., 2006)).
Colitis ulcerosa Morbus CrohnGesundes Colon
Abbildung 1.2 – Endoskopische Aufnahmen von gesunder und entzündeter Schleimhaut des Colons. Das gesunde Colon zeigt ein regelrechtes Schleimhautrelief mit Gefäßzeichnung und keinem Anhalt für entzündliche Veränderungen. Bei Colitis ulcerosa erkennt man eine Pancolitis mit diffuser Rötung, kontaktvulnerabler Schleimhaut sowie Ulzerationen und Pseudopolypen. Die Koloskopie bei Morbus Crohn zeigt tiefe, landkartenartige Ulzerationen und Schleimhaut-veränderungen im Sinne eines Pflastersteinreliefs (Aufnahmen bereitgestellt von Prof. Langhorst, Knappschafts-Krankenhaus, Essen (Gesundes Colon) bzw. modifiziert nach Baumgart & Sandborn, 2007 (Colitis ulcerosa und Morbus Crohn)).
Die typischen makroskopischen Veränderungen der Schleimhaut, die auch
von hoher diagnostischer Bedeutung sind, werden in Abbildung 1.2 dargestellt.
Darüber hinaus sind besonders das klinische Erscheinungsbild, die körperliche
Untersuchung sowie die laborchemische und apparative Diagnostik für die
Diagnosestellung wichtig (Dignass A. et al., 2012; Preiß et al., 2014).
Beide Erkrankungen gehen mit Komplikationen einher, die in intestinal und
extraintestinal eingeteilt werden können. Da bei Morbus Crohn alle Schichten der
Schleimhaut betroffen sind, kann es zu intestinalen Stenosen, Abszessen und
Fisteln, besonders im Analbereich, kommen. Außerdem sind entzündlich bedingte
Verwachsungen mit Einbeziehung des Darms möglich, welche als
Konglomerattumore von außen teils sogar tast- und sichtbar sein können. Colitis
ulcerosa hingegen führt zu einem vermehrten Auftreten von kolorektalen
Einleitung
16
Karzinomen (Baumgart & Sandborn, 2007). Durch chronische Blutverluste und ein
Malabsorptionssyndrom kann es auch zu einer Anämie, Gewichtsverlusten und
Wachstumsstörungen kommen. Auch extraintestinale Manifestationen treten bei
beiden Erkrankungen auf und beruhen zum Teil auf Autoimmunreaktionen. Bei
Morbus Crohn kommt es typischerweise zu einer Gelenkbeteiligung im Rahmen
einer enteropathischen Arthritis, zum Beispiel als Sakroiliitis im Kreuzbein-
Darmbein-Gelenk. Eine entzündliche Beteiligung der Haut und Augen gehört
ebenfalls zu den häufigen extraintestinalen Komplikationen. Colitis ulcerosa
hingegen geht häufiger mit einer Beteiligung der Leber, und zwar der primär
sklerosierenden Cholangitis, einher bzw. zeigt ausgeprägte intestinale
Komplikationen wie in seltenen Fällen eine Beteiligung des Dünndarms, die
sogenannte backwash ileitis, oder das akut lebensbedrohliche toxische Megakolon
(Herold, 2017). Beide Erkrankungen sind durch einen chronisch-rezidivierenden
Verlauf charakterisiert, bei dem es schubweise zu einer Symptomzunahme kommt
und eine sofortige Therapie mit dem Ziel der Remission, also Abnahme der
Symptome, eingeleitet werden muss. Gelingt dies nicht, kann es zu einem
chronisch-aktiven Verlauf kommen mit Persistenz der Symptomatik. Als Sonderform
wird ein akuter Verlauf beschrieben, der mit plötzlichem Krankheitsbeginn und
fulminanter Klinik einhergeht. Ein Beispiel hierfür wäre für die Colitis ulcerosa das
bereits genannte Krankheitsbild eines toxischen Megakolons mit Perforations- und
Peritonitisgefahr, was einer raschen, notfalls auch operativen, Intervention bedarf
(Dignass A. et al., 2012).
1.2.3. Therapie
Neben den supportiven Maßnahmen wie individueller Ernährungs-
empfehlung, psychosomatischer Beratung und komplementärmedizinischen
Verfahren wie Akupunktur, steht die medikamentöse und immunsuppressive
Therapie im Vordergrund. Nur in besonders schweren Fällen und beim Auftreten
von Komplikationen ist die chirurgische Therapie indiziert. Dazu stehen die
darmerhaltende Minimalchirurgie, die üblicherweise bei Morbus Crohn im Falle
ausgeschöpfter konservativer Therapieoptionen Verwendung findet, und eine
definitive chirurgische Behandlung zur Verfügung. Letztere spielt hauptsächlich bei
Colitis ulcerosa eine Rolle, wo beispielsweise im Rahmen einer Proktokolektomie
Einleitung
17
neben dem Rektum auch das gesamte Colon entfernt wird, um die Erkrankung
damit operativ zu heilen. Dies ist bei Morbus Crohn deshalb nicht möglich, weil der
gesamte Magen-Darm-Trakt potentiell betroffen ist und nur bei Colitis ulcerosa die
Entzündung auf das Colon limitiert ist.
Das Prinzip der konservativen Therapie ist die Immunsuppression, das heißt
die Hemmung der proinflammatorischen Immunantwort im Magen-Darm-Trakt und
Beendigung der Entzündung. Dazu unterscheidet man die Therapie während eines
akuten Schubs von der Remissionserhaltung, die eine möglichst lange Latenz bis
zum nächsten Schub gewährleisten soll. An dieser Stelle werden jedoch nur die
allgemeinen Therapieansätze mit Verweis auf die aktuellen Leitlinien vorgestellt
werden (Dignass A. et al., 2012; Preiß et al., 2014).
Die Steroidtherapie steht aufgrund ihrer potenten, aber unspezifische
Immunsuppression im Zentrum der akuten Behandlung. Dazu sind systemische
Glukokortikoide, oral oder intravenös, und topische Substanzen, die lediglich am
Entzündungsort wirken sollen, möglich. Dennoch sind die Nebenwirkungen einer
längerfristigen Steroidbehandlung sehr belastend für die Patienten. Je nach Höhe
der Dosis kommt es zu kosmetischen Nebenwirkungenn (Akne, Ödeme,
Mondgesicht, Striae), Schlafstörungen, Stimmungsschwankungen, Dyspepsie und
Glukoseintoleranz. In der Dauertherapie finden auch andere Substanzgruppen wie
die Aminosalicylate Mesalazin oder Sulfasalazin, Calcineurininhibitoren oder sogar
Zytostatika Verwendung, zeigen aber oftmals nicht weniger Nebenwirkungen,
weshalb Patienten Medikamente häufig absetzen oder wechseln müssen.
Der neuste Therapieansatz ist molecularly targeted therapy (gezielte
Therapie) mit monoklonalen Antikörpern, den sogenannten Biologika (engl.
Biologicals), die wesentlich spezifischer an den krankheitsrelevanten Strukturen der
Immunkaskade binden und vielversprechende Therapieerfolge zeigten. Als
wichtigster Vertreter aus dieser Gruppe kommen Antikörper gegen das stark
proinflammatorische Zytokin TNF-α zum Einsatz. Dazu zählen die Wirkstoffe
Infliximab und Adalimumab, die in Studien ihre Wirkung bereits hinreichend gezeigt
haben (Colombel et al., 2007; Hanauer et al., 2002) und trotz der hohen Kosten
heutzutage als leitliniengerechte Therapie eingesetzt werden. Ein weiterer Ansatz
der Therapie mit monoklonalen Antikörpern ist der Arzneistoff Vedolizumab, der
ebenfalls für die Behandlung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
zugelassen ist und auf dessen andere Wirkweise an dieser Stelle kurz eingegangen
Einleitung
18
werden soll (Feagan et al., 2013). Vedolizumab ist ein humanisierter Antikörper, der
sich selektiv gegen das Adhäsionsmolekül α4β7-Integrin auf der Oberfläche von
Lymphozyten richtet. Dadurch wird verhindert, dass die α4β7-tragenden aktivierten
Lymphozyten an das Adressin MAdCAM-1 (engl. mucosal addressin cell adhesion
molecule 1) binden, welches gewebespezifisch auf dem Endothel von Blutgefäßen
im Darm vorkommt. Die Verhinderung dieser Zellmigration, die auch als homing
bezeichnet wird, führt zur Abnahme mukosaler Effektorlymphozyten und zur
Hemmung der Entzündungsreaktion.
1.3. Darmspezifisches homing und GPR15
Unter dem Begriff homing bezeichnet man in der Immunologie die Rückkehr
von Lymphozyten, beispielsweise über die Lymphbahnen, zurück in das
entsprechende Gewebe. Um die genauen Abläufe der Immunzellen dabei besser
nachvollziehen zu können, ist in Abbildung 1.3 dieser Zyklus eines mukosalen
Lymphozyten beispielhaft dargestellt. Naive Lymphozyten aus Thymus und
Knochenmark gelangen über hoch-endotheliale Venolen (HEV) in das darm-
assoziierte lymphatische Gewebe (GALT). Über den Rezeptor CCR7 können naive
Lymphozyten, bei denen es zu keinem Antigenkontakt kommt, das lymphatische
Gewebe wieder verlassen. Dies wird durch die Chemokine CCL19 und CCL21
kontrolliert, welche an den Rezeptor binden (Habtezion et al., 2016). Treffen die
Lymphozyten jedoch auf ihr Antigen, kommt es zur Aktivierung und verminderten
Expression von CCR7 und L-Selektin; folglich verlieren sie ihre Präferenz für das
lymphatische Gewebe und sind als mukosale Effektorlymphozyten auf dem Weg in
die Schleimhäute und den eigentlichen Entzündungsort (Butcher et al., 1996).
Einleitung
19
Abbildung 1.3 – Zirkulation und Aktivierung von Lymphozyten. Nachdem es in der Schleimhaut zur Antigenerkennung durch Makrophagen (MP) und anschließend in den Peyer-Plaques oder mesenterialen Lymphknoten (MLN) zur Antigenpräsentation durch dendritische Zellen (DCs) kommt, werden naive T-Zellen (TN) zu T-Effektorzellen (TE) aktiviert und es kommt zur gewebespezifischen Migration anhand von Adhäsionsmolekülen wie α4β7-Integrin oder CCR9 für den Dünndarm (Small intestine) bzw. CCR10 oder GPR15 für das Colon. Dieser Prozess wird auch als „homing“ bezeichnet (modifiziert nach Habtezion et al., 2016).
Zu diesem Zweck kommt es bei der Aktivierung von Lymphozyten zur
Expression spezifischer homing-Moleküle, wie dem bereits erwähnten α4β7-Integrin,
welches an MAdCAM-1 auf dem Endothel von Gefäßen im Darm bindet und die
Leukodiapedese von Immunzellen steuert (Butcher et al., 1996). Spezifischer ist
noch der Chemokinrezeptor CCR9 auf T- und B-Lymphozyten, dessen Ligand
CCL25 von Epithelzellen des Dünndarms gebildet wird und so eine äußerst
differenzierte Migration ermöglicht (Agace, 2010). Die besondere Stimulation zur
Expression darmspezifischer homing-Rezeptoren erfolgt durch dendritische Zellen
des mukosalen Immunsystems und Retinolsäure (Vitamin-A-Säure) (Iwata et al.,
2004). Während diese Mechanismen im Dünndarm bereits gut beschrieben und
medikamentöse Ansätze entwickelt wurden (siehe Kapitel 1.2.3.), ist noch unklar,
Einleitung
20
welche Moleküle und Rezeptoren im Detail für die Migration von Immunzellen in das
Colon verantwortlich sind (Habtezion et al., 2016).
Daher war es umso bedeutender, als vor wenigen Jahren der amerikanische
Immunologe Dan R. Littman zeigen konnte, dass der G-Protein gekoppelte
Rezeptor (GPR) 15 von zentraler Bedeutung für die Migration von TREGs in das
Colon von Mäusen ist und dass eine GPR15-Deletion in entsprechenden
knockout-Mäusen verheerende Konsequenzen für die Aufrechterhaltung der
Immunhomöostase und Bekämpfungen von Infektionen hat (Kim et al., 2013).
GPR15 wurde 1996 entdeckt und zunächst als Corezeptor für HIV (Humanes
Immundefizienz-Virus) und SIV (Simianes Immundefizienz-Virus) unter der
Bezeichnung BOB (engl. brother of bonzo) beschrieben (Deng et al., 1997; Heiber
et al., 1996). Erst die Entdeckung seiner Bedeutung für das homing von
Lymphozyten führte in den letzten Jahren zu einer rasanten Zunahme des
immunologischen Interesses. Es konnte gezeigt werden, dass GPR15 beim
Menschen verstärkt von Effektorlymphozyten, besonders TH2-Zellen, exprimiert
wird und dass es große Unterschiede zwischen der humanen und murinen GPR15-
Expression gibt (Nguyen et al., 2015). Auch wenn die geringe Datenlage weitere
Studien erforderlich macht, ist nicht auszuschließen, dass GPR15 für künftige
therapeutische Ansätze in der Behandlung oder Prävention chronisch entzündlicher
Darmerkrankungen von Bedeutung sein wird.
Einleitung
21
1.4. Zielsetzung
Aufgrund der steigenden Inzidenz chronisch entzündlicher
Darmerkrankungen (CED) und gleichzeitig immer noch fehlender Möglichkeiten
einer kausalen Therapie müssen die genauen immunologischen Vorgänge und
pathophysiologischen Zusammenhänge von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa
weiter aufgeschlüsselt werden. Dazu erscheint die Erforschung des G-Protein
gekoppelte Rezeptors (GPR) 15 als vielversprechender Ansatz zum besseren
Verständnis der Migration von Lymphozyten in das Colon, den entscheidenden
Entzündungsort für Colitis ulcerosa und auch Morbus Crohn. Aufgrund der äußerst
geringen Datenlage und erst kürzlich veröffentlichten Erkenntnisse über die
tatsächliche Bedeutung von GPR15 in diesem Zusammenhang hat die vorliegende
Arbeit das Ziel, die Expression des homing-Rezeptors GPR15 bei gesunden
Menschen sowie an CED erkrankten Patienten zu charakterisieren. Zunächst wird
unter physiologischen Bedingungen untersucht, welche Immunzellen im Blut
GPR15 exprimieren und welche funktionellen Konsequenzen dies für die Zellen hat.
Anschließend sollen diese Ergebnisse mit Blutproben von CED-Patienten
verglichen werden, um zu differenzieren, wie sich die Expression unter
pathologischen Bedingungen verändert bzw., ob sie sogar für diese relevant sein
könnte. Zuletzt wird auch die GPR15-Expression am Ort des Geschehens, also in
der entzündeten Schleimhaut des Colons, untersucht und mit dem nicht
entzündeten Gewebe verglichen.
Zusammenfassend besteht das Ziel der Arbeit in einer deskriptiven
Charakterisierung von GPR15 auf unterschiedlichen Immunzellen bei gesunden
Spendern und bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, um
seine Bedeutung für die Migration besser verstehen zu können.
Material und Methoden
22
Material und Methoden
2.1. Studienpopulation
2.1.1. Soziodemographische Daten
Die soziodemographischen Informationen der Kontrollgruppe aus gesunden
Spendern und der Patienten, die an chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
(CED) leiden, ist in der Tabelle 2.1 zusammengefasst.
Tabelle 2.1 – Soziodemographische Merkmale der Studienpopulation
Kontrollgruppe
(Blut)
[n = 18]
CED-Patienten
(Blut)
[n = 12]
CED-Patienten
(Darmbiopsie)
[n = 20]
Alter: Ø ± SD 36,94 ± 13,17 34,67 ± 9,93 46,45 ± 17,90
Geschlecht: w/m 13/5 8/4 10/10
Morbus Crohn: - 4 0
Colitis ulcerosa: - 8 20
Raucher: 3/18 0/12 0/20
Ø = Durchschnitt, SD = standard deviation (Standardabweichung); w = weiblich; m = männlich
2.1.2. Blutproben
Im Rahmen dieser Arbeit wurden EDTA-antikoagulierte Vollblutproben von
freiwilligen Spendern (Kontrollgruppe) verwendet. Zudem wurden durch die
Medizinische Klinik I, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Lübeck, Blutproben
von Patienten, die unter den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen Morbus
Crohn bzw. Colitis ulcerosa leiden, bereitgestellt. Dabei entsprachen die
Diagnosekriterien dem Standard der aktuellen Leitlinien („Diagnostik und Therapie
2
Material und Methoden
23
des M. Crohn“ 2014, DGVS, bzw. „Colitis ulcerosa: Diagnostik und Therapie“ 2011,
DGVS).
2.1.3. Darmbiopsien
Gewebeproben aus dem Colon wurden während der Koloskopie von
Patienten mit Colitis ulcerosa im Zentrum für Integrative Gastroenterologie, Kliniken
Essen-Mitte, entnommen. Dabei wurden ein makroskopisch entzündlich
veränderter Bereich des Colons und zum Vergleich ein gesunder Bereich zur
Gewebeentnahme gewählt. Zur Aktivitätsbeurteilung wurde bei allen Patienten der
endoskopische Index nach Rachmilewitz (EI) bestimmt (Rachmilewitz, 1989;
Ristvedt et al., 2003). Für diese Studie wurde ein Aktivitätsindex von EI ≥ 3 als
Einschlusskriterium angewandt. Die Patienten wurden mit Corticosteroiden,
5-Amino-salicylsäure, Thiopurinen und Biologika behandelt.
Die Zustimmungen der Ethikkommissionen der Medizinischen Fakultät der
Universität Lübeck für die Blutproben von CED-Patienten und der Medizinischen
Fakultät der Universität Duisburg-Essen für die Darmbiopsien von CED-Patienten
liegen vor.
2.1.4. Buffy-Coat-Leukozyten
Buffy-Coats (dt. Leukozytenfilm) wurden von erwachsenen Blutspendern
während der Vollblutspende durch das Institut für Transfusionsmedizin,
Universitätsklinikum Essen, entnommen und durch das Universitätsklinikum Essen
zur wissenschaftlichen Verwendung genehmigt.
Material und Methoden
24
2.2. Material
2.2.1. Puffer, Medien und Lösungen
FACS-Puffer 2 % (v/v) FCS
2 mM EDTA
1 x PBS-Puffer
PBS-Puffer Phosphatgepufferte Salzlösung
8 g/l Natriumchlorid
0,2 g/l Kaliumchlorid
1,44 g/l Na2HPO4 x H2O
0,2 g/l KH2PO4
IMDM-Komplettmedium Iscove's Modified Dulbecco's Medium
mit GlutaMAXTM und 25 mM Hepes
(Invitrogen, Karlsruhe)
10 % hitzeinaktiviertes FCS
100 U/ml Penicillin
0,1 mg/ml Streptomycin
25 μM 2-Mercaptoethanol
TBE-Puffer 89 mM Tris
89 mM Borsäure
2,53 mM EDTA
TE-Puffer (10/1) 10 mM Tris/HCl (pH 8.0)
1 mM EDTA
2.2.2. Chemikalien und Enzyme
Tabelle 2.2 – Chemikalien und Enzyme
Chemikalien/Enzyme Hersteller
Agarose Biobudget, Krefeld
AutoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Biocoll Separating Solution Biochrome AG, Berlin
Borsäure Carl Roth, Karlsruhe
Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth, Karlsruhe
dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Fermentas, St. Leon-Rot
Ethanol, absolut Carl Roth, Karlsruhe
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Carl Roth, Karlsruhe
Material und Methoden
25
Ethidiumbromid Carl Roth, Karlsruhe
Fötales Kälberserum (FCS) Biochrom, Berlin
Gene Ruler 100 bp Ladder Plus Fermentas, St. Leon-Rot
GoTaq Flexi 5 x Puffer Promega, Mannheim
GoTaq Hot Start Polymerase Promega, Mannheim
Magnesiumchlorid [MgCl2] Promega, Mannheim
M-MLV Reverse Transkriptase Promega, Mannheim
M-MLV-RT 5x Puffer Promega, Mannheim
Penicillin Sigma Aldrich, Darmstadt
Power SYBR Green Master Mix Life Technologies, Waltham, USA
Streptomycin Sigma Aldrich, Darmstadt
Tris Carl Roth, Karlsruhe
Trypanblau Invitrogen, Karlsruhe
2.2.3. Primer
Alle Primerpaare wurden von der Firma Eurofins Genomics (Ebersberg)
bezogen. Die Spezifität der Primersequenzen wurde mithilfe von BLAST (engl.
Basic Local Alignment Search Tool) kontrolliert. In der unten stehenden Tabelle sind
die Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärtsprimer für das jeweilige Gen und die
annealing temperature Ta angegeben.
Tabelle 2.3 – Oligonukleotidprimerpaare zur quantitativen Expressionsanalyse
Gen Sequenz Temperatur
AHR 5‘- CAAATCCTTCCAAGCGGCATA-3‘ 58° C
5‘- CGCTGAGCCTAAGAACTGAAAG-3‘
FOXP3 5‘- GAACGCCATCCGCCACAACCTGA-3‘ 58° C
5‘- CCCTGCCCCCACCACCTCTGC-3‘
GATA-3 5‘- GCATCCAGACCAGAAACCGAAAAA-3‘ 58° C
5‘- GCATGTGGCTGGAGTGGCTGAAG-3‘
GPR15 5‘- CCATTGTGTGGCCAGTCGTA-3‘ 58° C
5‘- GAAGAGTAGGCAACCCCAGC-3‘
IL33 5‘- GGAAGAACACAGCAAGCAAAGCCT-3‘ 58° C
5‘- TAAGGCCAGAGCGGAGCTTCATAA-3‘
RORc 5‘- CTGGGCATGTCCCGAGATG-3‘ 58° C
5‘- GAGGGGTCTTGACCACTGG-3‘
RPS-9 5‘- CGCAGGCGCAGACGGTGGAAGC -3‘ 58° C
5‘- CGAAGGGTCTCCGCGGGGTCACAT-3‘
Material und Methoden
26
2.2.4. Fluorochrome
Tabelle 2.4 – Fluorochrome für die Durchflusszytometrie
Fluorochrom Absorption Emission
APC (Allophycocyanin) 650 nm 660 nm
APC Cy7 650 nm 785 nm
Brilliant Violet (510) 405 nm 510 nm
eFluor 670 647 nm 670 nm
FITC (Fluoresceinisothiocyanat) 494 nm 520 nm
PB (Pacific Blue) 401 nm 455 nm
PE (Phycoerythrin) 496 nm 578 nm
PerCP-Cy5.5 (Peridinin chlorphyll protein) 482 nm 695 nm
2.2.5. Antikörper
Tabelle 2.5 – Antikörper für die Durchflusszytometrie
Epitop Fluorochrom Klon Hersteller
β7-Integrin APC FIB504 BioLegend, San Diego, USA
FOXP3 APC PCH101 eBioscience, San Diego, USA
GPR15 APC 367902 R&D Systems, Wiesbaden
GPR15 PE 367902 R&D Systems, Wiesbaden
CD4 FITC RPA-T4 eBioscience, San Diego, USA
CD4 PB RPA-T4 BD Pharmingen, San Jose, USA
CD8a PB RPA-T8 BD Pharmingen, San Jose, USA
CD11b APC ICRF44 BD Pharmingen, San Jose, USA
CD11c PerCP-Cy5.5 3.9 BioLegend, San Diego, USA
CD14 FITC M5E2 BD Pharmingen, San Jose, USA
CD19 PerCP-Cy5.5 HIB19 eBioscience, San Diego, USA
CD25 APC BC96 eBioscience, San Diego, USA
CD25 PerCP-Cy5.5 M-A251 BD Pharmingen, San Jose, USA
CD49d
(α4-Integrin)
BV510 9F10 BioLegend, San Diego, USA
CD127 PB RDR5 eBioscience, San Diego, USA
CD304
(Neuropilin)
APC 446921 R&D Systems, Wiesbaden
Material und Methoden
27
2.2.6. Geräte
Konventionell im Labor verwendete Geräte sind nicht aufgeführt.
Durchflusszytometer: FACSCanto II, BD Bioscience, Heidelberg
Hämatologie-Analysator: SYSMEX KX-21N, Norderstedt
qRT-PCR: 7500 Fast Real-Time PCR System,
Applied Biosystems, Waltham, USA
Spektrophotometer: NanoDrop, Thermo Scientific,
Waltham, USA
Thermocylcer: Biometra, Göttingen
Zellseparator: Miltenyi autoMACSTM
Pro Separator,
Bergisch Gladbach
FACSAria III, BD Bioscience, Heidelberg
Multiplex Elisa LX200™, Luminex Cooperation, Austin,
USA
2.3. Molekularbiologische Methoden
2.3.1. RNA-Isolierung
Um Genexpressionsanalysen durchzuführen, wurde RNA aus Gewebe-
proben des Colons mithilfe des RNeasy Mini Kit (Quiagen, Hilden) gemäß
Herstellerangaben isoliert. Die Konzentration der extrahierten RNA wurde nach
erfolgreicher Isolierung an einem Spektrophotometer (NanoDrop, Thermo Scientific,
Waltham, USA) bestimmt.
2.3.2. cDNA-Synthese
Bis zu 1 µg isolierter RNA wurde für die reverse Transkription verwendet. Zur
Anlagerung der Primer wurde die RNA mit 0,25 µg Oligo(dt) und 1,5 µg Random
Primern (Invitrogen, Karlsruhe) im Thermocylcer (T3, Biometra, Göttingen) für 10
Minuten bei 70 °C inkubiert. Anschließend wurde die Probe auf Eis gestellt und der
Material und Methoden
28
Master Mix aus 200 U M-MLV Reverse Transkriptase, M-MLV-RT 5 x Puffer
(Promega, Mannheim) und 2,5 mM dNTP-Mix (Fermentas, St. Leon-Rot)
hinzugegeben. Die Synthese der komplementären cDNA-Stränge erfolgte im
Thermocycler für 1 Stunde bei 42 °C. Anschließend wurde das Enzym für 5 Minuten
bei 95 °C inaktiviert, die Probe in TE-Puffer 1:1 verdünnt und bei – 20 °C zur
weiteren Verwendung gelagert.
2.3.3. Semiquantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Um die Menge der cDNA für die quantitative Real-Time PCR anzupassen,
wurde zunächst eine semiquantitative PCR mit spezifischen Primern für das
Haushaltsgen RPS-9 durchgeführt. Zur Amplifikation der cDNA wurde eine
hitzestabile DNA-Polymerase (GoTaq Polymerase, Promega, Mannheim)
verwendet und folgender Reaktionsansatz hergestellt:
• bis zu 40 ng cDNA
• 1 x GoTaq Flexi 5x Puffer
• 1 mM dNTP-Mix
• 1,5 mM MgCl2
• 5 μM Vorwärtsprimer
• 5 μM Rückwärtsprimer
• 0,5 U GoTaq Polymerase
• ad 20 μl MilliQ H2O
Folgendes PCR-Programm wurde am Thermocylcer zur Amplifikation
verwendet:
Initiation der Polymerase
(94°C für 10 min)
Finale Elongation
(94°C für 10min)
Annealing der Primer
(58 C für 45s)
Elongation
(72 C für 60s)
Denaturierung der dsDNA
(94 C für 45s)
30x
Die semiquantitative Bestimmung der Expression von RPS-9 erfolgte
anschließend mittels Agarose-Gelelektrophorese.
Material und Methoden
29
2.3.4. Quantitative Real-Time PCR
Um die Expressionsunterschiede der untersuchten mRNA genauer zu
untersuchen, wurde eine quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-
PCR) durchgeführt. Auf Basis der semiquantitativen PCR und Gelelektrophorese
wurde die Templatemenge der cDNA angeglichen und anschließend in Duplikaten
eingesetzt. Eine Standardkurve wurde für jedes untersuchte Gen angelegt. Die
qRT-PCR Analyse wurde unter Verwendung des 7500 Fast Real-Time PCR mit der
7500 Fast Real-Time System Software durchgeführt (Applied Biosystems,
Waltham, USA). Folgender Reaktionsansatz wurde hergestellt:
• ~20 ng cDNA-Template
• 1 x Power SYBR Green Master Mix
• 50 – 900 nM Vorwärtsprimer
• 50 – 900 nM Rückwärtsprimer
• ad 20 μl MilliQ H2O
Die Amplifikation erfolgte unter Verwendung des unten stehenden PCR-
Programms:
Initiation der Polymerase
(95°C für 10 min)
Annealing der Primer
(58 C für 15s)
Elongation
(72 C für 30s)
Denaturierung der dsDNA
(95 C für 15s) Dissoziationskurve
95°C für 15s
60°C für 60s45x
Die relative Expressionsstärke jedes Gens wurde aus dem Quotienten der
Expressionsmenge des Zielgens und der Expressionsmenge für das Haushaltsgen
RPS-9 berechnet.
Material und Methoden
30
2.4. Zellbiologische Methoden
2.4.1. Gewinnung von Einzelzellsuspensionen
Zur Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (engl.
Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMCs) wurde eine Dichtegradienten-
zentrifugation unter Verwendung einer Biocoll (Biochrom AG, Berlin) Trennlösung
durchgeführt. Dazu wurden 15 ml Biocoll in einen 50 ml Ficoll Falcon vorgelegt und
eine Minute bei 375 * g und 20 °C zentrifugiert, sodass sich das Medium
anschließend unterhalb der Filterscheibe befand. Nun wurden 20 ml heparinisiertes
Vollblut vorsichtig auf den Filter gegeben und danach bei 550 * g und 20 °C für zehn
Minuten zentrifugiert. Biocoll besteht aus dem Polysaccharid Ficoll, ein stark
verzweigtes Polymer aus Saccharosemonomeren, gelöst in Wasser und
Natriumdiatrizoat und weist eine Dichte von 1,077 g/ml auf. Die Zellseparation
während der Zentrifugation entsteht durch den Dichtegradienten der
unterschiedlichen Zellen im peripheren Blut. Die mononukleären Zellen des
peripheren Blutes (Lymphozyten und Monozyten) sammeln sich aufgrund der
geringeren Dichte in der Interphase zwischen Biocoll und Plasma, während sich die
meisten Granulozyten und Erythrozyten unterhalb des Filters am Boden des Falcon
wiederfinden. Die PBMCs wurden vorsichtig in ein leeres 50 ml Falcon überführt
und es folgten mehrere Waschschritte mit PBS. Die Bestimmung der Lymphozyten-
Zellzahl erfolgt mithilfe des automatischen Hämatologie-Analysators KX-21N
(SYSMEX, Norderstedt). Die Zellen wurden in 1 ml Fötalem Kälberserum (engl. fetal
calf serum, FCS) mit 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgenommen und unter
Verwendung eines Isopropanol-Gefrierbehälters (Mr. Frosty™, Thermo Scientific,
Waltham, USA) bei – 80 °C eingefroren. Nach 24 Stunden wurde die Probe bis zur
weiteren Verwendung in einem Stickstofftank bei – 196 °C gelagert.
2.4.2. Isolierung von Lymphozyten aus Darmbiopsien
Die Gewebeproben wurden kurzfristig in IMDM-Komplettmedium auf Eis
gelagert und unmittelbar nach der endoskopischen Entnahme aufgearbeitet. Dazu
wurde das Gewebe zunächst schonend durch ein 100 µm Zellsieb gerieben (BD
Cell Strainer, Heidelberg), gewaschen und zentrifugiert. Die Zellsuspension wurde
zur anschließenden Analyse in FACS-Puffer resuspendiert.
Material und Methoden
31
2.4.3. Bestimmung von Zellzahlen
Es wurde eine Neubauer-Zählkammer verwendet, um unter dem
Lichtmikroskop (Zeiss, Jena) die Anzahl und Viabilität der Zellen zu bewerten. Dazu
wurden die Zellen mit Trypanblau gefärbt. Unter dem Mikroskop erschienen die
toten Zellen tiefblau, da der Perforationsfarbstoff Trypanblau durch die nicht mehr
intakte Zellmembran diffundieren kann und sich im Zellinneren ansammelt. Die
lebenden Zellen konnten lichtmikroskopisch ausgezählt werden und die Zellzahl
bestimmt werden.
2.4.4. Durchflusszytometrie
Mithilfe der Durchflusszytometrie lassen sich genaue Aussagen über Größe,
Granularität und spezifische Oberflächenmerkmale von einzelnen Zellen innerhalb
einer komplexen Population machen.
Laser
FSC-Diode
SSC-Diode
Optisches
System
Fluoreszenz-
kanäle
Computer
Probe
Abbildung 2.1 – Schematische Darstellung der Durchflusszytometrie. Die in der Probe enthaltenen Zellen werden einzeln von monochromatischem Licht des Lasers erfasst und das gestreute Licht von den Dioden analysiert. Dabei geben FSC-Diode (engl. forward scatter, Vorwärtsstreulicht), SSC-Diode (engl. side scatter, Seitwärtsstreulicht) und Fluroeszenz-Diode unterschiedliche Informationen über Größe, Granularität oder Bindung von Fluorochrom gekoppelten Antikörpern (modifiziert nach T. Rowley, 2012).
Material und Methoden
32
Dabei wird jede Zelle während der Aufnahme der Probe einzeln von einem
Laserstrahl erfasst und das von dieser Zelle gestreute Licht analysiert. Das
Durchflusszytometer ist mit einem Argonionenlaser ausgestattet, der mono-
chromatisches Licht der Wellenlänge 488 nm emittiert. An den forward scatter
(FSC)- und side scatter (SSC)-Dioden wird das Streulicht analysiert, das entweder
die Zelle vorwärts passiert und somit Informationen über die Größe erlaubt
(Vorwärtsstreulicht) oder aber von der Zelle seitwärts abgelenkt wird und damit
Aufschluss über Dichte und Granularität gibt (Seitwärtsstreulicht). Die Fluoreszenz-
kanäle 1–4 verfügen jeweils über spezifische Filter und detektieren nur Licht einer
bestimmten Wellenlänge. Wird eine Zelle mit einem Fluorochrom gekoppelten
Antikörper gegen bestimmte Oberflächenmoleküle konjugiert, kann das
monochromatische Licht des Lasers den Fluoreszenzfarbstoff anregen, selber Licht
einer bestimmten Wellenlänge, je nach Fluorochrom, zu emittieren. Durch
teildurchlässige Spiegel innerhalb des optischen Systems kann das von den
Fluorochromen emittierte Licht im entsprechenden Fluoreszenzkanal detektiert
werden.
2.4.5. Färbung gegen Oberflächenproteine
Für die Färbung spezifischer Oberflächenproteine wurden bis zu 1 x 106
Zellen in 100 µl Antikörperlösung (in FACS-Puffer verdünnte Antikörper)
resuspendiert und für 10–30 Minuten im Dunkeln bei 4 °C inkubiert. Zur
Diskriminierung von toten Zellen wurden 0,025 µl/ml Fixable Viability DyeTM 780
(eBioscience, San Diego, USA) zu der Antikörperlösung zugefügt. Dieser
Vitalitätsfarbstoff ermöglichte den Ausschluss von toten Zellen, auch wenn diese für
intrazelluläre Färbungen fixiert und permeablisiert werden. Anschließend wurden
die Zellen mit FACS-Puffer gewaschen, in 200–300 µl FACS-Puffer aufgenommen
und am BD FACSCanto II (BD Bioscience, Heidelberg) durchflusszytometrisch
analysiert.
2.4.6. Intrazelluläre Färbung
Für intrazelluläre Färbungen wurden die Zellen nach der Oberflächenfärbung
mit PBS gewaschen und in 100 µl Fixation/Permeabilization-Lösung (eBioscience,
San Diego, USA) im Dunkeln bei 4 °C für eine Stunde inkubiert. Die fixierten und
Material und Methoden
33
permeabilisierten Zellen wurden mit 1 x Permeabilisierungs-Puffer (Perm-Puffer;
eBioscience, San Diego, USA) gewaschen, in 100 µl in Perm-Puffer verdünntem
Antikörper gegen FoxP3 (eBioscience, San Diego, USA) resuspendiert und für 30
Minuten im Dunkeln bei 4 °C inkubiert. Nach anschließendem Waschen mit Perm-
Puffer konnten die intrazellulär gefärbten Zellen ebenfalls in 200–300 µl FACS-
Puffer aufgenommen und durchflusszytometrisch am BD FACSCanto II analysiert
werden.
2.4.7. Sortieren von Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie
Um funktionelle Eigenschaften von GPR15+ und GPR15- CD4+ T-Zellen zu
analysieren, wurden diese immunmagnetisch separiert und im Anschluss
durchflusszytometrisch sortiert. Zunächst wurden CD4+ T-Zellen aus buffy coats von
gesunden Spendern mittels CD4 T-cell Isolation Kit am autoMACSTM Pro Separator
(beide Milteny Biotec, Bergisch Gladbach) angereichert. Anschließend wurden die
Zellen gewaschen, mit Fluorochrom gekoppelten Antikörpern gegen Oberflächen-
proteine markiert und am BD FACSAria III Cellsorter unter Verwendung der BD
DIVA Software (beide BD Bioscience, Heidelberg) durchflusszytometrisch sortiert.
Die Reinheit der sortierten Zellen lag in der Regel bei ≥ 95 %.
2.4.8. Proliferationsassay von Lymphozyten
Zur Analyse der Proliferation von GPR15+ und GPR15- CD4+ T-Zellen
durchflusszytometrisch separierten Zellpopulationen wurde der Cell Proliferation
Dye eFluor® 670 (eBioscience, San Diego) verwendet. Für die Färbung wurden
1 x 107 Zellen bei Raumtemperatur in 2 ml PBS aufgenommen und mit 2 ml
Färbelösung (4 µl eFluor® 670 in 2 ml PBS) für 10 Minuten bei Dunkelheit und 37 °C
inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 ml kaltem FCS gestoppt und für
5 Minuten bei 4 °C inkubiert. Die mit eFluor® 670 markierten Zellen wurden mit
IMDM-Komplettmedium gewaschen und gezählt. Jeweils 1 x 105 markierte
CD4+ T-Zellen wurden in 100 µl IMDM aufgenommen und mit 1 x 105 Tregs-
Supression-Inspector-beads (Milteny Biotec, Bergisch Gladbach) im Brutschrank
inkubiert. Nach 2–4 Tagen wurde die Proliferation anhand der Abnahme der
Fluoreszenzintensität des eFluor® 670 durchflusszytometrisch bestimmt.
Material und Methoden
34
2.4.9. Detektion sezernierter Zytokine
Überstände aus Primärkulturen von GPR15+ und GPR15- CD4+ T-Zellen
wurden an Tag 2, 3 und 4 nach Stimulation entnommen und mittels Polystyrol-
basiertem Luminex Assay (R&D Systems, Wiesbaden) entsprechend nach
Herstellerangaben analysiert. Die Analyse der Zytokinsekretion erfolgte unter
Verwendung der Luminex IS Software an dem Luminex Gerät LX200™ (Luminex
Cooperation, Austin, USA)
2.5. Statistik
Die statistische Auswertung der Daten wurde mit der Software GraphPad
Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, USA) durchgeführt. Zur Bestimmung der
Signifikanz dienten folgende in den jeweiligen Abbildungen angegebene
Testverfahren: Zweistichproben-t-Test (engl. Student´s t-test) bzw. abhängigen
t-Test (auch Paardifferenzentext, engl. paired t-test) und one-way ANOVA mit
anschließendem Tukey-Test.
Ergebnisse
35
Ergebnisse
3.1. GPR15 im Blut von gesunden Spendern
Während die Migration von T-Zellen aus dem peripheren Blut in das
lymphatische Gewebe des Dünndarms bereits hinreichend beschrieben wurde und
mit der Expression von α4β7 und CCR9 assoziiert ist, fehlt es noch immer an
detaillierten Kenntnissen über die Migrationsprozesse ins Colon (Agace, 2010).
Kürzlich konnte der G-Protein gekoppelte Rezeptor (GPR) 15, der zuvor lediglich
als HIV-Corezeptor beschrieben wurde, als homing-Rezeptor von regulatorischen
T-Zellen der Maus identifiziert werden (Kim et al., 2013). Im Gegensatz dazu wurde
beim Menschen gezeigt, dass in erster Linie CD4+ Effektorzellen GPR15
exprimieren und dass es speziesabhängige Unterschiede bei der Expression und
Funktion von GPR15 zu geben scheint (Nguyen et al., 2015). In der vorliegenden
Arbeit wurde die Expression von GPR15 bei gesunden Spendern und bei Patienten,
die an chronisch entzündlichen Darmerkrankungen leiden, untersucht. Dabei wurde
die Expression im Blut und im Colon analysiert und auch funktionelle Eigenschaften
untersucht, um die Funktion von GPR15 beim Menschen näher zu charakterisieren.
3.1.1. GPR15-Expression auf unterschiedlichen Immunzellen
Zunächst wurde die Expression von GPR15 auf verschiedenen Immunzellen
des peripheren Blutes von gesunden Spendern untersucht. Dabei wurden bereits
deutliche Unterschiede zwischen den einzelnen Zellpopulationen festgestellt. Wie
Nguyen et al. bereits zeigen konnten, ist die GPR15-Expression stark auf T-Zellen
limitiert. Hauptsächlich CD4+ T-Zellen exprimierten GPR15 auf ihrer Oberfläche,
3
Ergebnisse
36
während nur ein geringer Teil der CD8+ T-Zellen und noch weniger B-Zellen GPR15
exprimierten.
CD4+
CD8+
B-Zellen Monozyten cDCs pDCs0
5
10
15
20
T-Zellen
% G
PR
15
+
CD4+ T-Zellen
CD
4
GPR15
6,2% 2,3%
CD
8
GPR15
0,9% 0,1% 0,5% 0,4%
CD8+ T-ZellenPBMCs
SS
C
FSC
FV
D
FSC
Lebende Zellen
cDCs
CD
11c
GPR15
CD
304
GPR15
pDCsB-Zellen
CD
19
GPR15
CD
14
GPR15
Monozyten
Abbildung 3.1 – GPR15-Expression auf unterschiedlichen Immunzellen im Blut gesunder Spender. Die Lymphozytenpopulation wurde anhand der Größe und Granularität im FSC (forward scatter) und SSC (side scatter) identifiziert, eine Diskriminierung toter Zellen erfolgte durch den Ausschluss von FVD (Fixable Viability DyeTM) exprimierenden Zellen und die Expression von GPR15 wurde auf diversen Zellpopulationen anhand immunphänotypischer Oberflächenmerkmale (engl. Cluster of Differentiation, CD) analysiert: CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen (CD19+), Monozyten (CD14+ CD11b+), konventionelle dendritische Zellen (cDCs, CD11c+ CD123-) und plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs, CD11c- CD123+ BDCA-2+). Zur Identifizierung der Monozyten und dendritischen Zellen (cDCs und pDCs) wurde im FSC und SSC eine größere Zellpopulation gewählt. Dargestellt sind repräsentative dot plots jeder Zellpopulation mit einer Zusammenfassung der GPR15-Expression als Punktdiagramm mit Mittelwert und Standardfehler der Proben (n = 15 – 18).
Ergebnisse
37
Auf Monozyten, konventionellen und plasmazytoiden dendritischen Zellen konnte
keine GPR15-Expression detektiert werden (Abbildung 3.1). Außerdem zeigten die
Expressionsanalysen eine hohe Varianz und große interindividuelle Unterschiede
beim Anteil an GPR15+ Zellen zwischen den einzelnen Spendern.
Ein wichtiger Einflussfaktor auf die GPR15-Expression ist das Tabakrauchen,
wie kürzlich mehrere Studien zeigten (Su et al., 2016). Dabei wurde gezeigt, dass
durch eine veränderte Methylierung die Expression von GPR15 auf T-Zellen derartig
gesteigert sein kann, dass dies sogar von klinischer Bedeutung für Patienten mit
Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa zu sein scheint (Koks et al., 2015). Eine
Auftrennung der Expressionsanalysen von gesunden Spendern nach dem Kriterium
Raucher gegen Nichtraucher ergab auch hier deutliche Unterschiede im Anteil
GPR15+ Zellen bei sowohl T-Zellen als auch B-Zellen (Abbildung 3.2). Da für die
weiteren Expressionsanalysen die gesteigerte Expression von GPR15 durch das
Tabakrauchen einen kritischen Faktor darstellt, wurden für alle folgenden
Expressionsanalysen ausschließlich Nichtraucher untersucht.
T-Z
elle
n
+
CD4
T-Z
elle
n
+
CD8
B-Z
elle
n
Monozy
ten
cDCs
pDCs
T-Z
elle
n
+
CD4
T-Z
elle
n
+
CD8
B-Z
elle
n
Monozy
ten
cDCs
pDCs
0
5
10
15
20
% G
PR
15
+
Nichtraucher Raucher
Abbildung 3.2 – GPR15-Expression unter Tabakrauchen. PBMCs von gesunden Spendern wurden isoliert und die Expression von GPR15 wurde auf diversen Zellpopulationen anhand immunphänotypischer Oberflächenmerkmale (engl. Cluster of Differentiation, CD) analysiert: CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen (CD19+), Monozyten (CD14+ CD11b+), konventionelle dendritische Zellen (cDCs, CD11c+ CD123-) und plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs, CD11c- CD123+ BDCA-2+). Die GPR15-Expression von Nichtrauchern (n = 12 – 15) links ist gegen Raucher (n = 3) rechts nebeneinander als Punktdiagramm mit Mittelwert und Standardfehler aufgetragen.
Ergebnisse
38
3.1.2. Funktionelle Eigenschaften von GPR15
Nach der rein deskriptiven Analyse der Expression von GPR15 auf
unterschiedlichen Immunzellen stellte sich die Frage, welche funktionellen
Unterschiede es zwischen GPR15+ und GPR15- CD4+ T-Zellen gibt. Um dies zu
beantworten, wurden CD4+ T-Zellen aus buffy coats (dt. Leukozytenfilm) verwendet,
die aus der Vollblutspende gesunder Blutspender gewonnen wurden. GPR15+ und
GPR15- CD4+ T-Zellen wurden durchflusszytometrisch sortiert, mit dem
Proliferationsfarbstoff eFluor® 670 (engl. cell proliferation dye eFluor® 670) markiert
und für 2 bis 4 Tage mit αCD3/αCD28 beladenen Partikeln in vitro stimuliert. Die
Proliferationsanalysen ergaben an Tag 2, 3 und 4 nach Stimulation keine
signifikanten Unterschiede zwischen GPR15+ und GPR15- CD4+ T-Zellen
(Abbildung 3.3 A). Neben der Proliferation wurde auch die Zytokinproduktion der in
vitro stimulierten GPR15+ und GPR15- CD4+ T-Zellen untersucht. Die
Zytokinmessungen der an Tag 3 nach Stimulation abgenommenen Überstände
zeigten einige Unterschiede in der Sekretion von Zytokinen, die mit bestimmen
T-Helferzellen assoziiert sind, und legten damit verschiedene funktionelle
Eigenschaften von GPR15+ und GPR15- CD4+ T-Zellen nahe (Abbildung 3.3 B).
Sowohl die Konzentration des Zytokins IFN-γ, welches mit der Aktivierung von
TH1-Lymphozyten assoziiert ist, als auch die Konzentration des von
TH2-Lymphozyten sezernierten IL-4 waren in den Überständen von stimulierten
GPR15- CD4+ T-Zellen signifikant höher. Dagegen konnte bei den GPR15+
CD4+ T-Zellen eine signifikant höhere Konzentration an IL-17 in den Überständen
gemessen werden. Das proinflammatorische CCL5 (engl. CC-chemokine ligand 5)
wurde wiederum signifikant mehr von GPR15- CD4+ T-Zellen ausgeschüttet. Die
Untersuchung weiterer Zytokine, das heißt IL-1, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70 und
TNF-α ergab keine signifikanten Unterschiede in der Sekretion zwischen den beiden
Zellpopulationen.
Ergebnisse
39
Proliferationsfarbstoff eFluor 670
Zellanzahl
d2
d2
d3
d3
d4
d4
GPR15-
GPR15+
d2 d3 d40
20
40
60
80
100
GPR15-
GPR15+
ns
ns
% p
rolif
eri
ert
A
B INF-
0
50
100
150 *
[pg
/ml]
IL-1
0
2
4
6
8
10
[pg
/ml]
IL-4
0
5
10
15
20
25 *
[pg
/ml]
IL-5
0
100
200
300
400
[pg
/ml]
IL-6
0
10
20
30
40
50
[pg
/ml]
IL-10
0
500
1000
1500
[pg
/ml]
IL-12p70
0
500
1000
1500
2000
2500
[pg
/ml]
IL-17
0
500
1000
1500 *
[pg
/ml]
TNF-
0
500
1000
1500
2000
2500
[pg
/ml]
CCL5
0
1000
2000
3000
4000
5000
GPR15+
GPR15-*
[pg
/ml]
INF-γ IL-1 IL-4 IL-5
IL-6 IL-10 IL-12p70 IL-17
TNF-α CCL5
Abbildung 3.3 – Funktionelle Unterschiede zwischen GPR15+ und GPR15- CD4+ T-Zellen. GPR15+ und GPR15- CD4+ T-Zellen aus PBMCs von gesunden Spendern wurden durchfluss-zytometrisch sortiert, mit dem Proliferationsfarbstoff eFluor® 670 (engl. cell proliferation dye eFluor® 670) markiert und für 2– 4 Tage mit αCD3/αCD28 beladenen Partikeln in vitro stimuliert. (A) Die Proliferation wurde an Tag 2 (n = 1), Tag 3 (n = 11) und Tag 4 (n = 2) anhand des Intensitätsverlustes vom Proliferationsfarbstoff eFluor® 670 analysiert und durch repräsentative Histogramme mit Mittelwert und Standardfehler dargestellt. (B) An Tag 3 (n = 11) nach Stimulation wurden Überstände der Primärkultur entnommen und sekretierte Zytokine wurden mithilfe der Luminex®-Technologie detektiert. Die Ergebnisse sind als Punktdiagramme mit Mittelwert und Standardfehler zusammengefasst. Zur statistischen Analyse wurde der Student´s t-test verwendet (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ns = nicht signifikant).
Ergebnisse
40
3.1.3. Höhere GPR15-Expression auf regulatorischen T-Zellen
Zur weiteren Charakterisierung von GPR15 ist seine Bedeutung für pro- und
antiinflammatorische Immunprozesse relevant. Daher wurde die Expression von
GPR15 auf regulatorischen CD4+ T-Zellen (TREGs), die durch Expression des
Transkriptionsfaktors FoxP3 charakterisiert sind, mit der GPR15-Expression auf
konventionellen FoxP3- CD4+ T-Zellen verglichen. Untersucht wurden PBMCs von
gesunden Spendern, die keinen Tabak rauchten. Es konnte gezeigt werden, dass
die Expression von GPR15 bei den TREGs signifikant höher war als bei
konventionellen CD4+ T-Zellen (TCONV) (Abbildung 3.4). Diese höhere GPR15-
Expression auf TREGs legt seine Relevanz für die Migration dieser Zellen nahe und
deutet die Tragweite von GPR15 auch für humane TREGs an. Um diese Fragestellung
näher zu beleuchten, wurde daher im Weiteren die Analyse der GPR15-Expression
über gesunde Spender hinaus auf Patienten mit chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen ausgeweitet, um Migrationsprozesse besonders unter
pathologischen Bedingungen besser verstehen zu können.
CD4+ FoxP3+
TREGs
FoxP
3
GPR15
Fo
xP
3
GPR15
CD4+ FoxP3-
TCONV
6,8% 4,7%
TREGs TCONV
0
2
4
6
8 ***
%G
PR
15
+
Abbildung 3.4 – Erhöhte GPR15-Expression auf regulatorischen im Vergleich zu konventionellen T-Zellen. PBMCs aus dem Blut gesunder Spender (n = 15) wurden isoliert, mit Fluorochrom gekoppelten Antikörpern gegen CD4, GPR15 und intrazellulär gegen FoxP3 markiert und durchflusszytometrisch analysiert. Dargestellt sind repräsentative dot plots für FoxP3- T-Zellen (TCONV), FoxP3+ T-Zellen (TREGs) und eine Zusammenfassung des Mittelwerts mit Standardfehler der Expression von GPR15 als Balkendiagramm. Zur statistischen Analyse wurde der Student´s t-test verwendet (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001).
Ergebnisse
41
3.2. GPR15 bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
Als nächstes wurde untersucht, wie sich die GPR15-Expression auf T-Zellen
verändert, wenn die immunologische Homöostase im Gastrointestinaltrakt im Zuge
chronischer Entzündungsprozesse gestört wird und das Gleichgewicht zwischen
pro- und antiinflammatorischen Signalen zugunsten der Entzündung verschoben
wird, wie es bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) Morbus
Crohn und Colitis ulcerosa der Fall ist (Baumgart & Carding, 2007; Baumgart &
Sandborn, 2007). Während diese fehlgeleiteten Immunantworten gegen
kommensale Mikroorganismen der Darmflora zu einem komplexen Zusammenspiel
vieler Zellen des mukosalen Immunsystems führen, werden im Folgenden nur die
CD4+ T-Zellen untersucht, weil sie eine einzigartige Rolle für die Entstehung und
Aufrechterhaltung der chronischen Entzündungsvorgänge bei diesen Krankheiten
besitzen (de Souza et al., 2016).
3.2.1. Veränderte GPR15-Expression im Blut
Zunächst wurde der prozentuale Anteil von CD4+ T-Zellen und FoxP3+
regulatorischen T-Zellen (TREGs) sowohl im Blut von gesunden Spendern,
zusammengefasst in der Kontrollgruppe (KG), als auch im Blut von CED-Patienten
untersucht (Abbildung 3.5 A). Die CED-Patienten befanden sich zu diesem
Zeitpunkt in einem aktiven Krankheitsschub, dennoch zeigten sich zwischen beiden
Gruppen keine Unterschiede beim prozentualen Anteil an CD4+ T-Zellen und TREGs.
Anschließend wurde die GPR15-Expression auf CD4+ T-Zellen und CD4+ Sub-
populationen gemessen (Abbildung 3.5 B). Bereits der Vergleich der GPR15-
Expression der gesamten CD4+ T-Zellpopulation zeigte einen signifikanten Anstieg
an GPR15+ Zellen bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen.
Als nächstes wurden regulatorische und konventionelle T-Zellen betrachtet. Der
Prozentsatz an GPR15+ TREGs war bei den CED-Patienten ebenfalls signifikant
höher als bei den gesunden Kontrollen und der Unterschied war hier noch deutlicher
als bei der Betrachtung der gesamten CD4+ T-Zellpopulation. Auch bei den
konventionellen T-Zellen war die GPR15-Expression bei den CED-Patienten
signifikant höher als bei den Kontrollen, wobei hier der Unterschied etwas
schwächer ausgeprägt war. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass es bei Patienten,
Ergebnisse
42
die an Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa leiden, im Blut zu erhöhter Expression
von GPR15 auf CD4+ T-Zellen und im Besonderen auf TREGs kommt.
FoxP
3
43,8% 41,2%
KG CED
CD4
3,0% 3,4%
6,8% 17,2%
FoxP
3
4,7% 8,8%
KG CED
KG CED0
10
20
30
40
50
%C
D4
+
vo
n l
eb
en
den
Zell
en
KG CED0
5
10
15
20
25**
%G
PR
15
+
vo
n C
D4
+T
-Zellen
KG CED0
1
2
3
4
5
%F
oxP
3+
vo
n C
D4
+T
-Zellen
KG CED0
5
10
15
20
25**
%G
PR
15
+
vo
n F
oxP
3+
TR
EG
s
KG CED0
5
10
15
20
25*
%G
PR
15
+
vo
n F
oxP
3-T
CO
NV
FoxP
3A
B
GPR15
GPR15
GPR15
9,5%4,7%
CD
4S
SC
CD4
Abbildung 3.5 – Erhöhte GPR15-Expression im Blut von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. PBMCs von gesunden Spendern aus der Kontrollgruppe (KG mit n = 15) und von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED mit n = 12) wurden durchflusszytometrisch analysiert. Der Anteil an (A) CD4+ bzw. FoxP3+ T-Zellen und (B) GPR15+ CD4+ bzw. GPR15+ FoxP3+ (TREGs) und GPR15+ FoxP3- T-Zellen (TCONV) wurde bestimmt und in repräsentativen dot plots dargestellt. Der jeweilige Mittelwert mit Standardfehler der Expression ist als Balkendiagramm zusammengefasst. Zur statistischen Analyse wurde der Student´s t-test verwendet (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001).
Ergebnisse
43
3.2.2. Koexpression von GPR15 und Integrin α4β7
Während die Rolle von GPR15 für die Migration von Lymphozyten in das
mukosale Lymphgewebe des Colons erst vor wenigen Jahren beschrieben wurde
(Kim et al., 2013), und der Mechanismus aufgrund aktuell noch ausstehender
Identifikation des Liganden von GPR15 immer noch nicht ganz verstanden ist,
wurde das Zelloberflächenprotein α4β7, das zur Gruppe der Integrine gehört, bereits
detaillierter beschrieben. Zudem konnten therapeutische Ansätze für die
Behandlung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen durch Blockade von
α4β7 schon entwickelt und erfolgreich eingesetzt werden (Thomas et al., 2012). Aus
dem Grund wurde eine mögliche Koexpression von GPR15 und α4β7 im Blut von
Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im Vergleich zu
gesunden Kontrollen untersucht. Zunächst wurde überprüft, ob sich die Expression
von α4β7 im Blut von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen von
der Expression von α4β7 im Blut von gesunden Kontrollen unterscheidet (Abbildung
3.6 A). Es konnte gezeigt werden, dass es keine signifikanten Unterschiede beim
Anteil von α4β7+ CD4+ T-Zellen zwischen CED-Patienten und gesunden Kontrollen
gibt. Vergleicht man die α4β7-Expression beider Gruppen auf TREGs und TCONV, findet
man zwar ebenfalls keine Signifikanz in den Unterschieden, doch kann man eine
gewisse Tendenz erkennen, dass bei Patienten mit chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen α4β7 auf regulatorischen T-Zellen geringfügig höher exprimiert
und auf konventionellen T-Zellen etwas reduziert exprimiert war. Dies konnte in
anderen Studien bereits deutlicher gezeigt werden (Fischer et al., 2016). Als
nächstes wurde die Koexpression beider Migrationsmoleküle gemessen
(Abbildung 3.6 B). Dafür wurde der Anteil an den α4β7+ Zellen unter den
GPR15+ CD4+ T-Zellen als auch vice versa der Anteil von GPR15+ Zellen unter den
α4β7+ CD4+ T-Zellen gemessen und jeweils zwischen den CED-Patienten und den
gesunden Kontrollen verglichen. Zum einen konnten keine signifikanten
Unterschiede in beiden Darstellungsformen gezeigt werden und zum anderen
erscheint die Anzahl von α4β7+ GPR15+ Zellen mit 6 bis 9 % bzw. 14 bis 16 % je
nach Darstellung sehr gering.
Ergebnisse
44
KG CED0
10
20
30
%
4
7+
vo
n G
PR
15+
T-Z
ell
en
KG CED KG CED0
5
10
15
20
25 ns ns
%
4
7+
vo
n C
D4+
T-Z
ell
en
KG CED0
5
10
15
20
25
%
4
7+
vo
n C
D4+
T-Z
ell
en
T-Zellen TREGs TCONV GPR15+ α4β7+
KG CED0
5
10
15
20
25
%G
PR
15
+
vo
n
4
7+ C
D4
+ T
-Zell
en
A B
Abbildung 3.6 – α4β7-Expression im Blut von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und die Koexpression mit GPR15. PBMCs der Kontrollgruppe (KG mit n = 4) und von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED mit n = 12) wurden isoliert, mit Fluorochrom gekoppelten Antikörpern gegen CD4, GPR15, α4 bzw. β7 sowie intrazellulär gegen FoxP3 markiert und durchflusszytometrisch analysiert. (A) Als Balkendiagramm sind zum einen der prozentuale Anteil an α4β7
+ Zellen von den CD4+ T-Zellen bei den CED-Patienten im Vergleich zu den gesunden Kontrollen dargestellt und zum anderen der Prozentsatz der α4β7-Expression innerhalb der FoxP3+ CD4+ TREGs bzw. innerhalb der FoxP3- CD4+ TCONV. (B) Die Koexpression ist sowohl als prozentualer Anteil von α4β7
+ Zellen unter allen CD4+ GPR15+ T-Zellen als auch in umgekehrter Weise als der prozentuale Anteil von GPR15+ Zellen unter allen CD4+ α4β7
+ T-Zellen dargestellt. Die Werte sind zusammengefasst als Median mit unterem und oberem Quartil (25 % bis 75 % der Werte) sowie der Varianz (minimaler bis maximaler Ausreißer). Zur statistischen Analyse wurde der Student´s t-test verwendet (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ns = nicht signifikant).
3.2.3. Unterscheidung von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa
Während die bisherigen Vergleiche bei der GPR15-Expression nur zwischen
gesunden Kontrollen und Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
durchgeführt wurden – gleich ob Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa – stellt sich
nun die Frage, ob es Unterschiede zwischen diesen beiden Krankheitsbildern in
Bezug auf den hier untersuchten Migrationsrezeptor gibt. Bei beiden Krankheiten
kommt es zu einer entzündlichen T-Zell-Reaktion im Zusammenhang mit
kommensalen Bakterien und Versagen von regulatorischen Mechanismen (de
Souza et al., 2016). Vereinfacht betrachtet, kann man zwischen einer TH1-
abhängigen Reaktion bei Morbus Crohn mit Produktion von IFN-γ und TNF-α und
einer TH2- bzw. TH17-abhängigen Immunantwort bei Colitis ulcerosa, die durch
Sekretion der Zytokine IL-4, IL-5 bzw. IL-17 charakterisiert ist, differenzieren
(Janeway et al., 2009).
Wie bereits in Kapitel 3.2.1 gezeigt, gab es keinen Unterschied im
prozentualen Anteil an FoxP3+ CD4+ T-Zellen zwischen gesunden Kontrollen und
Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Dagegen konnte gezeigt
Ergebnisse
45
werden, dass der Anteil an GPR15+ T-Zellen bei den CED-Patienten höher ist als
bei den gesunden Kontrollen. Dies gilt im Besonderen für regulatorische T-Zellen.
Daraufhin wurden die Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
differenziert in Morbus Crohn und Colitis ulcerosa (Abbildung 3.7) und es bestätigte
sich das Ergebnis, dass es keine Unterschiede im prozentualen Anteil an TREGs im
Blut gibt, gleich um welche chronisch entzündliche Darmerkrankung es sich handelt.
Der Anteil an GPR15+ regulatorischen T-Zellen ist sowohl bei Morbus Crohn als
auch bei Colitis ulcerosa signifikant höher als bei den gesunden Kontrollen, sodass
die zuvor gezeigte höhere GPR15-Expression der TREGs für beide Krankheiten gilt.
Bei den FoxP3- CD4+ T-Zellen zeigt sich lediglich für Morbus Crohn eine signifikant
erhöhte Expression von GPR15, während für Colitis ulcerosa nur eine Tendenz zur
höheren Expression auszumachen war. Gleichzeitig war aber auch eine höhere
Streuung, hier dargestellt als Standardfehler, bei der GPR15-Expression von
Morbus Crohn-Patienten im Vergleich zu den Blutproben der Colitis ulcerosa-
Patienten zu detektieren.
FoxP3+ GPR15+ TREGs GPR15+ TCONV
KG MC CU0
2
4
6
8
10
%F
oxP
3+
vo
n C
D4
+T
-Zellen
KG MC CU0
10
20
30
40
50 ***
%G
PR
15
+ v
on
Fo
xP
3+
CD
4+ T
-Zell
en
KG MC CU0
10
20
30
40
50 *
ns
%G
PR
15
+ v
on
Fo
xP
3-C
D4
+ T
-Zell
en
Abbildung 3.7 – Vergleich der GPR15-Expression im Blut von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa. PBMCs von gesunden Spendern aus der Kontrollgruppe (KG mit n = 15), von Patienten mit Morbus Crohn (MC mit n = 4) und von Patienten mit Colitis ulcerosa (CU mit n = 8) wurden isoliert, mit Fluorochrom gekoppelten Antikörpern gegen CD4, GPR15 sowie intrazellulär gegen FoxP3 markiert und durchflusszytometrisch analysiert. Der Anteil von FoxP3+ CD4+ T-Zellen, GPR15+ FoxP3+ CD4+ TREGs bzw. GPR15+ FoxP3- CD4+ TCONV wurde jeweils als Punktdiagramm mit Mittelwert und Standardfehler dargestellt. Die statistische Analyse erfolgte mittels one-way ANOVA und anschließendem Tukey-Test (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ns = nicht signifikant).
Ergebnisse
46
3.3. GPR15-Expression im Colon bei Colitis ulcerosa
3.3.1. Genexpressionsanalysen von GPR15 im Colon
Wie aktuelle Studien im Mausmodell zeigten, scheint GPR15 für die Migration
von regulatorischen T-Zellen in das Colon verantwortlich zu sein (Kim et al., 2013),
sodass als nächstes untersucht wurde, ob die erhöhte GPR15-Expression im Blut
von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen auch das
Migrationsverhalten in das Colon beeinflusst. Hierzu wurden aus dem Colon von
Patienten mit Colitis ulcerosa während eines akuten Krankheitsschubes
koloskopisch Biopsien aus einem gesunden, proximalen Teil des Colons und aus
einem stark entzündeten, distalen Teil entnommen. Abbildung 3.8 zeigt
beispielhafte Fotographien während der Endoskopie für die jeweiligen Bereiche im
Colon, die der Probenentnahme dienten. Die Gewebeproben wurden anschließend
molekularbiologisch zur Genexpressionsanalyse untersucht. Die relative
Expression für den Transkriptionsfaktor FoxP3 war im entzündeten Bereich der
Schleimhaut signifikant höher als im gesunden Teil, was sich mit anderen Studien
deckte, die bereits zeigen konnten, dass die Expression von FoxP3 bzw. der Anteil
von TREGs in entzündeter Schleimhaut von CED-Patienten höher ist als in der
Schleimhaut von gesunden Kontrollen (Maul et al., 2005). Im Kontrast dazu war die
Expression von GPR15 signifikant niedriger im entzündeten Colon. Die quantitative
Analyse des Transkriptionsfaktors GATA-3, der von zentraler Bedeutung bei der
Differenzierung von TH2-Zellen ist, zeigte keinen signifikanten Anstieg im
entzündeten Bereich des Colons, was im Kontrast zu aktuellen Studien steht, die
zeigen konnten, dass die Expression von GATA-3 im entzündeten Gewebe des
Colons von Colitis ulcerosa-Patienten höher ist als im Gewebe von gesunden
Kontrollen (Popp et al., 2015).
Ergebnisse
47
Regelrechtes Schleimhautrelief
des Colons (gesund)
Entzündetes Colon mit fibrin-
belegten Ulcera (entzündet)
gesund entzündet0
1
2
3 ns
GA
TA
3
[rela
tive E
xp
ressio
n]
gesund entzündet0
1
2
3 *
GP
R15
[rela
tive E
xp
ressio
n]
gesund entzündet0
1
2
3 *
Fo
xP
3
[rela
tive E
xp
ressio
n]
FoxP3 GPR15 GATA-3
Abbildung 3.8 – Genexpressionsanalyse von Biopsien aus dem Colon von Colitis ulcerosa-Patienten. Biopsien von gesunder und entzündeter Schleimhaut des Colons von Patienten mit Colitis ulcerosa (n = 10–13) wurden während der Koloskopie entnommen und die mRNA isoliert. Anschließend wurde mittels quantitativer Real-Time PCR die Expression von FoxP3, GPR15 und GATA-3 analysiert. Eine Normalisierung der Werte wurde gegen das Haushaltsgen RPS-9 durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Säulen- und Punktdiagramme mit Mittelwert und Standardfehler dargestellt, wobei die jeweiligen Probenpaare eines Patienten verbunden sind. Zur statistischen Analyse wurde der paired Student´s t-test verwendet (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ns = nicht signifikant; endoskopische Aufnahmen bereitgestellt von Prof. Langhorst, Knappschafts-Krankenhaus, Essen).
3.3.2. GPR15-Expression von regulatorischen T-Zellen des Colons
Zuvor konnte gezeigt werden, dass der Anteil an GPR15+ TREGs im Blut von
Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen höher liegt als bei den
gesunden Kontrollen. Anschließend jedoch wurde in der entzündeten Colon-
schleimhaut von Colitis ulcerosa-Patienten eine geringere GPR15-Expression als in
Ergebnisse
48
der gesunden Schleimhaut gemessen. Dies macht deutlich, dass aufbauend auf die
Genexpressionsanalysen differenziert gezeigt werden muss, welche Zellen für die
niedrigere GPR15-Expression im entzündeten Gewebe verantwortlich sind. Dazu
wurden CD4+ T-Zellen durchflusszytometrisch analysiert, um einzelne
Subpopulationen, das heißt FoxP3+ und FoxP3- CD4+ T-Zellen, in der Expression
von GPR15 unterscheiden zu können. Zunächst konnte gezeigt werden, dass der
Anteil an CD4+ T-Zellen signifikant und der Anteil von FoxP3+ TREGs tendenziell im
entzündeten Schleimhautgewebe des Colons anstieg (Abbildung 3.9). Dies passt
zu den zuvor gezeigten Genexpressionsanalysen aus Kapitel 3.3.1. Die Analyse der
FoxP3+ regulatorischen T-Zellen im Vergleich zu den FoxP3- konventionellen
T-Zellen in Hinblick auf ihre GPR15-Expression zeigte zwar für beide
Subpopulationen einen Abfall der GPR15+ Zellen, was sich ebenfalls mit den
Ergebnissen der vorherigen Experimente deckte, doch wesentlich größer schien
dieser Effekt für die TREGs zu gelten, bei denen die GPR15-Expression signifikant
abfiel und sich von 6,5 % auf 3,9 % GPR15+ TREGs nahezu halbierte. Bei den
konventionellen T-Zellen wurde beim Vergleich von gesunder zu entzündeter
Colonschleimhaut ein tendenzieller Abfall der Expression von GPR15 ohne
Signifikanz festgestellt.
Zusammenfassend konnte bei Analyse von CD4+ T-Zellen aus dem
peripheren Blut von gesunden Spendern gezeigt werden, dass GPR15 sowohl von
TREGs als auch von konventionellen T-Zellen exprimiert wird und es funktionelle
Unterschiede zwischen GPR15+ und GPR15- T-Zellen in Hinblick auf differenzielle
Zytokinsekretion gibt. Bei CED-Patienten wurde eine deutlich verstärkte Expression
von GPR15 auf TREGs im peripheren Blut detektiert. Abschließend wurden Biopsien
aus dem entzündeten Colon von Patienten untersucht, die an Colitis ulcerosa
leiden, und eine signifikant reduzierte Genexpression von GPR15 im entzündeten
Gewebe gemessen. Auf zellulärer Ebene bestätigte sich dies und es konnte
beschrieben werden, dass obwohl der Anteil an FoxP3+ regulatorischen T-Zellen im
entzündeten Gewebe zunimmt, die Expression von GPR15 auf den TREGs
gleichzeitig abnimmt.
Ergebnisse
49
CD4+ T-Zellen FoxP3+ CD4+ T-Zellen
28,7% 38,7%
CD4
FoxP
3
11,7% 20%
GPR15+ TREGs GPR15+ TCONV
6,5% 3,9% 3,9% 2,9%
gesund entzündet0
20
40
60
80*
%C
D4
+ v
on
leb
en
den
Zell
en
gesund entzündet0
10
20
30
40
50ns
%F
oxP
3+ v
on
CD
4+ T
Zell
en
gesund entzündet0
5
10
15
20*
%G
PR
15
+ T
RE
Gs
gesund entzündet0
5
10
15
20ns
%G
PR
15
+T
CO
NV
GPR15
FoxP
3
CD4
SS
C
GPR15
FoxP
3gesund entzündet gesund entzündet
gesund entzündet gesund entzündet
A B
C
Abbildung 3.9 – Durchflusszytometrische Analyse von Biopsien aus dem Colon von Colitis ulcerosa-Patienten. Gewebeproben aus makroskopisch gesunden und entzündeten Bereichen des Colons von Colitis ulcerosa-Patienten (n = 8–10) wurden während der Koloskopie entnommen, unmittelbar danach aufgearbeitet, mit Fluorochrom gekoppelten Antikörpern gegen CD4, GPR15 sowie intrazellulär gegen FoxP3 markiert und der prozentuale Anteil an (A) CD4+ T-Zellen, (B) FoxP3+ CD4+ T-Zellen und (C) GPR15+ von FoxP3+ CD4+ T-Zellen (TREGs) bzw. GPR15+ von FoxP3- CD4+ T-Zellen (TCONV) durchflusszytometrisch bestimmt. (A–C) Repräsentative dot plots der durchflusszytometrischen Analysen der verschiedenen Zellpopulationen sind dargestellt. Die Expressionswerte sind zusammengefasst als Säulen- und Punktdiagramme mit Mittelwert und Standardfehler, wobei die jeweiligen Probenpaare eines Patienten verbunden sind. Zur Berechnung der Signifikanz wurde der paired Student´s t-test verwendet (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ns = nicht signifikant).
Diskussion
50
Diskussion
Der G-Protein gekoppelte Rezeptor 15 (GPR15) wurde erstmalig 1996 als
HIV-Corezeptor beschrieben (Heiber et al., 1996). Ähnlich wie die
Chemokinrezeptoren CCR5 und CXCR4 kann GPR15 vom HI-Virus gebunden
werden, um mit der Oberflächenmembran von CD4+ T-Helferzellen zu fusionieren
und die Zelle zu infizieren (Deng et al., 1997). Mit den beiden oben genannten
Chemokinrezeptoren der CC- und CXC-Familie teilt GPR15 aber nicht nur seine
Bedeutung als HIV-Corezeptor bzw. eine strukturelle Ähnlichkeit (Joost et al., 2002),
sondern im Besonderen auch seine Funktion als Migrationsrezeptor, wie jüngere
Studien zeigen konnten und auch diese Arbeit bestätigt.
Chemokine und ihre Rezeptoren haben hoch spezifische Aufgaben in der
Kontrolle und Balance immunologischer Prozesse und zeigten sich seit ihrer
Entdeckung wachsender Beliebtheit auch für therapeutische Ansätze, besonders
bei entzündlichen Erkrankungen mit überschießender Immunreaktion (Sallusto et
al., 2008; Wells et al., 2006). So könnte auch GPR15 in Zukunft eine
vielversprechende Möglichkeit zur Immunmodulation darstellen. Die ersten Studien
zur Bedeutung von GPR15 als Migrationsrezeptor zeigten, dass im Mausmodell
GPR15 auf regulatorischen T-Zellen (TREGs) exprimiert ist und durch Migration
dieser die Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase fördert (Kim et al., 2013).
In folgenden Studien konnte ergänzt werden, dass auch murine T-Effektorzellen
vom TH1- und TH17-Typ GPR15 exprimieren und dass beim Menschen GPR15 im
Colon anders als bei der Maus auf TH2-Zellen exprimiert wird (Nguyen et al., 2015).
In der vorliegenden Arbeit konnte zunächst gezeigt werden, dass im Blut von
gesunden Kontrollen die Expression von GPR15 innerhalb der unterschiedlichen
myeloiden und lymphatischen Immunzellen auf letztere und besonders auf die
4
Diskussion
51
CD4+ T-Zellen beschränkt ist. Interessanterweise konnte eine große Varianz der
Expression von GPR15 auf CD4+ T-Zellen festgestellt werden und es stellte sich
heraus, dass gesunde Kontrollen, die regelmäßig Tabak rauchen, durch deutlich
höhere Expressionen von GPR15 gekennzeichnet waren. Während die
proinflammatorischen und immunsuppressiven Effekte des Rauchens bereits lange
bekannt sind, zeigen neuere Studien auch eine durch Tabakrauchen vermittelte
Veränderung der DNA-Methylierung an sogenannten CpG-Inseln (Abkürzung für
Cytosin-phosphatidyl-Guanin), welche für die Regulation verschiedenster Gene von
Bedeutung sind. In ihrer Studie konnten Su et al. zeigen, dass die durch Rauchen
induzierte epigenetische Modifikation des GPR15-Genlokus zur erhöhten
Expression von GPR15 auf T-Zellen führt (Su et al., 2016). Zur detaillierten
Expressionsanalyse von GPR15 war es daher sehr bedeutsam, diesen Faktor zu
berücksichtigen, sodass Raucher aus den Expressionsanalysen ausgeschlossen
wurden. Gleichwohl stellt sich die Frage, welchen Einfluss die durch Tabakrauchen
erhöhte Expression von GPR15 auf die Pathogenese von chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen nehmen könnte: Betrachtet man den Einfluss des
Tabakrauchens auf Morbus Crohn und Colitis ulcerosa im Vergleich, so zeigten
umfangreiche Metaanalysen, dass nur Morbus Crohn-Patienten unter den
proinflammatorischen Effekten des Rauchens leiden, da Häufigkeit und Schwere
der Erkrankung mit dem Tabakkonsum korrelieren; während Colitis ulcerosa-
Patienten weniger Symptome und ein klinisch milderes Krankheitsbild bei
gleichzeitigem Tabakrauchen zeigten (Mahid et al., 2006). Ein Zusammenhang, der
lange paradox erschien, aber in Zusammenhang mit der Expression von GPR15
erstmals befriedigend erklärt werden könnte. Eine Hypothese wäre, dass das
Rauchen die GPR15-Expression induziert und zu einer vermehrten Migration von
T-Zellen, insbesondere TREGs, in das Colon führt, wodurch die Aufrechterhaltung der
intestinalen Homöostase gefördert und Entzündungsreaktionen bei CU unter
Umständen verhindert werden. Da MC häufiger in anderen Teilen des
Gastrointestinaltraktes manifestiert ist, überwiegen hier unspezifische
proinflammatorische Effekte, die den Unterschied zwischen den beiden chronisch
entzündlichen Darmerkrankungen bezogen auf den Risikofaktor des
Tabakrauchens erklären könnten. Dieser hypothetische Mechanismus wurde
bereits von Genetikern diskutiert, doch sind hier weitere Untersuchungen und
detaillierte Erkenntnisse zu GPR15 nötig (Koks et al., 2015).
Diskussion
52
Darüber hinaus konnte diese Arbeit zeigen, dass die GPR15-Expression
weder im Blut noch im darmassoziierten lymphatischen Gewebe auf regulatorische
oder konventionelle T-Zellen (TCONV) beschränkt ist, wie vorherige Studien
andeuteten (Bilsborough et al., 2015). Jedoch konnten signifikante Unterschiede im
prozentualen Anteil von GPR15+ TREGs im Vergleich zu TCONV gezeigt werden. Von
besonderem Interesse war auch die funktionelle Analyse von GPR15+ Zellen zur
weiteren Charakterisierung. Zwar gab es keine Unterschiede im
Proliferationsverhalten, doch zeigten GPR15+ CD4+ T-Zellen nach der in vitro
Stimulation eine differenzielle Zytokinausschüttung. Die typischerweise von
TH1-Zellen produzierten Zytokine TNF-α und IFN-γ wurden überwiegend von
GPR15- T-Zellen sezerniert; und auch die TH2-assoziierten Interleukine IL-4, IL-5
und IL-6 zeigten tendenziell höhere Konzentrationen bei den GPR15- T-Zellen. Das
einzige der hier untersuchten Zytokine, welches signifikant mehr von
GPR15+ T-Zellen sezerniert wurde, war IL-17. Dies stützt zum einen die vorherigen
Ergebnisse, dass die GPR15-Expression nicht auf eine bestimmte Subpopulation
von beispielsweise nur TH2-Effektorzellen beschränkt sei, sondern auf
unterschiedlichen T-Zellen zu finden ist; zum anderen deutet es aber auch eine
besondere Rolle für die TH17-Zellen in diesem Zusammenhang an. Während diese
Analysen mit PBMCs von gesunden Blutspendern durchgeführt wurden, konnten
die Ergebnisse in weiterführenden Untersuchungen auch für Colitis ulcerosa-
Patienten bestätigt werden (Adamczyk et al., 2017). In anderen Studien konnte
bereits gezeigt werden, dass es funktionelle Ähnlichkeiten zwischen TREGs und
TH17-Zellen gibt und gerade in Zusammenhang mit einem entzündlich veränderten
Milieu FoxP3+ TREGs IL-17 produzieren können, was durch verminderte suppressive
Eigenschaften der TREGs die Entzündung weiter fortschreiten lässt (Beriou et al.,
2009). Während bisher der Fokus bei der Charakterisierung von GPR15 auf
regulatorischen T-Zellen bzw. den klassischen TH1- und TH2-Effektorzellen lag,
zeigten die hier dargestellten Zytokinprofile, dass auch TH17-Zellen eine unter
Umständen entscheidende Rolle spielen. Da bei den untersuchten GPR15+
CD4+ T-Zellen nicht zwischen TREGs und TCONV unterschieden wurde, scheint die
signifikant erhöhte Sekretion von IL-17 durch GPR15+ T-Zellen eine interessante
und neue Eigenschaft von GPR15-exprimierenden T-Zellen zu sein.
Anschließend stellte sich die Frage, welche Bedeutung die Expression von
GPR15 für das Auftreten und die Schwere von CED hat, und ob deren
Diskussion
53
Immunpathogenese, die durch eine massiv gesteigerte Migration von
T-Lymphozyten in die Schleimhaut des Gastrointestinaltraktes gekennzeichnet ist,
in Zusammenhang mit GPR15 stehen könnte (Macdonald et al., 2005). Deshalb
wurde die GPR15-Expression von gesunden Kontrollen und CED-Patienten
verglichen, wobei sowohl Blutproben von Morbus Crohn- als auch Colitis ulcerosa-
Patienten verwendet wurden. Im Blut von Patienten, die an chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen leiden, fanden sich signifikant mehr GPR15+ T-Zellen und am
deutlichsten war der Unterschied bei regulatorischen T-Zellen. Unterscheidet man
noch weiter zwischen MC und CU, zeigten die Expressionsanalysen trotz
Ausschluss der Raucher immer noch eine große Varianz durch weitere
interindividuelle Einflüsse. Aus diesem Grund sollten in weiteren Untersuchungen
mit höheren Patientenzahlen diese Ergebnisse verifiziert werden. Die Auswertung
der Expressionsanalysen lassen bereits vermuten, dass GPR15 durchaus eine
klinisch relevante Bedeutung für den Verlauf der Erkrankung hat und künftig für
neue Ansätze zur spezifischen Immuntherapie dienen könnte. Der Einsatz von
therapeutischen monoklonalen Antikörpern begann bereits 1997 mit dem Wirkstoff
Infliximab, der als Antikörper gegen das proinflammatorische Zytokin TNF-α bei
rheumatoiden Erkrankungen und auch chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
eingesetzt wurde (Targan et al., 1997). Im Gegensatz zu den zuvor verwendeten
unspezifischen Immunsuppressiva waren die Ergebnisse für monoklonale
Antikörper, oder auch Biologika genannt, vielversprechend und sind heute trotz der
hohen Kosten fester Therapieinhalt von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa
(Baumgart & Sandborn, 2007). Neben Antikörpern gegen Zytokine steht besonders
die Blockade der Zellmigration und Adhäsion im Fokus der Therapieansätze durch
Integrinantikörper wie Natalizumab, Vedolizumab oder Etrolizumab. Das zuerst
entwickelte Natalizumab verhinderte die Zellmigration durch eine Blockade des
Integrin α4 und wirkte dadurch antiinflammatorisch. Im Verlauf zeigte sich jedoch ein
erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer progressiven multifokalen
Leukenzephalopathie, welche durch JC-Viren (JC-Polyomavirus) verursacht wurde
und damit zusammenhängt, dass Natalizumab auch die Zelladhäsion von α4β1+
T-
Zellen im Gehirn beeinflusst (Yousry et al., 2006). Im Zusammenhang mit chronisch
entzündlichen Darmerkrankungen ist eine spezifischere Blockade nötig, und so
wurden die Wirkstoffe Vedolizumab und Etrolizumab entwickelt, die durch eine
Blockade von α4β7 bzw. β7 lediglich auf die intestinale Zelladhäsion wirken sollen
Diskussion
54
(Akiho et al., 2015). Aussichtsvolle Ergebnisse der Therapie mit Integrin-
antagonisten in den letzten Jahren lassen vermuten, dass diese eine gleichwertige
Rolle neben den etablierten TNFα-Blockern einnehmen könnten, und, dass sich
langfristig die Entwicklung weiterer Medikamente zur Beeinflussung der Migration
lohnt. Auch in dieser Arbeit wurde die α4β7-Expression im Blut von gesunden
Kontrollen und CED-Patienten untersucht und in Hinblick auf die GPR15-
Expression konnte gezeigt werden, dass es nur eine sehr geringe Koexpression der
Migrationsmoleküle gibt. Es liegt also die Vermutung nahe, dass es funktionelle
Unterschiede zwischen GPR15+ und α4β7+ T-Zellen gibt. Auch dies unterstreicht die
therapeutische Bedeutung von GPR15. Ferner gilt für viele aktuell therapeutisch
eingesetzten Biologika, dass einige Patienten als sogenannte Non-Responder
(dt. nicht reagieren) kein adäquates Ansprechen auf den Einsatz eines Biologikums
zeigen und unterschiedliche Medikamente getestet werden müssen, bevor es zu
einer Symptombesserung kommt (Akiho et al., 2015; Roda et al., 2016). Die
Entwicklung neuer Arzneimittel in der Therapie von CED ist also weiterhin von
klinischer Relevanz und GPR15 stellt sich als ein interessanter neuer
Therapieansatz dar.
Die Schleimhaut des Gastrointestinaltraktes ist der entscheidende Ort des
Geschehens für chronisch entzündliche Darmerkrankungen, bei denen es zur
massiven Infiltration von T-Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen kommt (de
Souza et al., 2016; Wadwa et al., 2016). Auch in dieser Arbeit wurden
Gewebeproben aus der Schleimhaut von Patienten mit Colitis ulcerosa untersucht.
Die Genexpressionsanalysen von Colonbiopsien aus entzündeten und nicht
entzündeten Bereichen von Colitis ulcerosa-Patienten zeigten erwartungsgemäß
eine Zunahme der Expression von FoxP3, doch überraschenderweise eine
Abnahme der GPR15-Expression. Durchflusszytometrisch konnte dies auch auf
zellulärer Ebene bestätigt werden und differenziell gezeigt werden, dass besonders
auf TREGs die GPR15-Expression im entzündeten Bereich abnimmt. Die Analysen
von GATA-3 zeigten keine Unterschiede. Leider standen zu wenig Proben von
Morbus Crohn-Patienten zur Verfügung, da oft andere Teile des Gastrointestinal-
traktes entzündlich betroffen sind als das Colon, das sich während einer Koloskopie
leicht zur Entnahme von Schleimhautproben eignet. Daher wurden für diese Arbeit
nur die Analysen der Colonbiopsien von Colitis ulcerosa-Patienten vorgestellt. In
Diskussion
55
weiteren Studien ist zu überprüfen, ob für Morbus Crohn die gleichen Aussagen
getroffen werden können.
In einer kürzlich erschienenen Studie konnte in Experimenten mit
humanisierten Mäusen gezeigt werden, dass humane T-Effektorzellen GPR15-
abhängig und regulatorische T-Zellen α4β7-abhängig in das Colon von Mäusen
einwandern (Fischer et al., 2016). In der gleichen Arbeit konnten Fischer et al. eine
höhere Expression von GPR15 auf TREGs und einen deutlichen Anstieg von GPR15+
TREGs bei CED-Patienten zeigen, was sich mit den hier vorgestellten Ergebnissen
deckt. Ob die verringerte Expression von GPR15 im Colon tatsächlich daran liegt,
dass GPR15 nicht für die Migration von regulatorischen T-Zellen verantwortlich ist
oder ob andere Gründe dafür verantwortlich sind, wie ein Herunterregulieren des
Rezeptors nach erfolgreicher Bindung an den Liganden, bleibt aktuell leider unklar.
In einem anderen Zusammenhang wurde die Bedeutung von GPR15 auf
sogenannten DETCs (dendritic epidermal T cells, dendritische epidermale T-Zellen)
untersucht, einer Subpopulation von γδ T-Lymphozyten, die sich in ihrem
T-Zellrezeptor von den hier untersuchten CD4+ T-Zellen unterscheiden (Lahl et al.,
2014). Es konnten in Mausexperimenten hohe GPR15-Expressionen auf DETC-
Vorläuferzellen gezeigt werden, welche dann als DETCs in die Haut der Maus
auswanderten, wonach die GPR15-Expression rapide abnahm.
Die Bedeutung der Darmflora bzw. Mikrobiota für das Auftreten und den
Verlauf von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen scheint eine immer größer
werdende Rolle zu spielen (Ananthakrishnan, 2015; de Souza et al., 2016; Palm et
al., 2015). Auch wenn man weder Morbus Crohn noch Colitis ulcerosa ein
spezifisches mikrobielles Profil zuschreiben kann, da es große interindividuelle
Unterschiede gibt, konnte man bei CED-Patienten ein deutliches Missverhältnis
zwischen physiologisch auftretenden Bakterien und potentiell schädlichen Spezies
feststellen (Walker et al., 2011). Die amerikanische Behörde FDA (Food and Drug
Administration), die neben der Überwachung von Lebensmitteln auch für die
Zulassung neuer Arzneimittel verantwortlich ist, wird aktuell dazu angehalten
Lebensmittel, die direkten Einfluss auf die Mikrobiota haben, entsprechend als MDF
(engl. microbiota-directed foods, dt. Mikrobiota-steuernde Lebensmittel) kenntlich
zu machen (Green et al., 2017). Es wäre denkbar, dass künftig Lebensmittel nicht
nur mit ihren Inhaltsstoffen, Nährwerten oder Vitaminen gekennzeichnet werden,
sondern auch der Einfluss auf die Mikrobiota deutlich gemacht wird und eine ganze
Diskussion
56
Sparte von medical food (medizinische Lebensmittel) entsteht, wie bereits mit dem
Verkauf von Probiotika ein erster Versuch unternommen wurde (Hungin et al.,
2013). Für Patienten, die an Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa leiden, stehen auch
Verfahren zur Verfügung, die Mikrobiota durch Stuhltransplantation direkt zu
beeinflussen. Metaanalysen zeigen besonders für Colitis ulcerosa eine signifikante
Remissionsinduktion und belegen in Analysen der Mikrobiota eine höhere
Biodiversität bei den CED-Patienten nach Transplantation (Paramsothy et al.,
2017). Weitere Untersuchungen, besonders randomisierte kontrollierte Studien,
sind in diesem Gebiet nötig, um die Wirksamkeit und eventuelle Risiken von
Stuhltransplantationen näher zu erforschen. Eine besondere Rolle der Mikrobiota
ist die Metabolisierung von organischen kurzkettigen Fettsäuren, sogenannten
SCFAs (engl. short-chain fatty acids), welche durch bestimmte Bakterien aus
unverdaulichen Ballaststoffen in der Nahrung gebildet werden. Spezielles
Augenmerk wird dabei auf die Fettsäure Butyrat gelegt, die durch Stabilisierung der
epithelialen Barrierefunktion bereits eine antiinflammatorische Wirkung bei CED-
Patienten gezeigt hat (Kovarik et al., 2011). Es konnte auch gezeigt werden, dass
SCFAs zu einer vermehrten Präsenz von regulatorischen T-Zellen führen können
und darüber ebenfalls eine überschießende Entzündungsreaktion supprimieren
sowie die immunologische Balance fördern können (Smith et al., 2013). Im
Zusammenhang mit GPR15 konnten Adamczyk et al. zeigen, dass zum einen in
Stuhlproben von Colitis ulcerosa-Patienten weniger SCFAs und speziell weniger
Butyrat zu finden war. Zum anderen führte eine Kultivierung von regulatorischen T-
Zellen in Anwesenheit von SCFAs zu einer signifikanten Erhöhung von GPR15.
Daraus wurde die Hypothese formuliert, dass die verringerte GPR15-Expression
von TREGs im entzündeten Colon von CU-Patienten mit der dort veränderten
Mikrobiota und geringeren Konzentration an SCFAs zusammenhängen kann. Da
der Vergleich von Stuhlproben aus entzündeten und nicht entzündeten Bereichen
des Darms schwer möglich ist, konnte dies nicht abschließend bestätigt werden
(Adamczyk et al., 2017). Auch konnte bereits gezeigt werden, dass eine
Behandlung mit Antibiotika bei Mäusen zu einer verringerten GPR15-Expression
führt, was den Einfluss der Mikrobiota auf GPR15 nahelegt (Kim et al., 2013). Für
andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren konnten SCFAs bereits als Liganden
identifiziert werden. Darüber hinaus gewinnen sie auch als Therapeutika bei
Diskussion
57
entzündlichen wie neoplastischen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes
zunehmend an Bedeutung (Sun et al., 2017).
Zusammenfassend konnte demonstriert werden, dass es bei chronisch
entzündlichen Darmerkrankungen zu einer veränderten GPR15-Expression auf
regulatorischen und konventionellen CD4+ T-Lymphozyten kommt. Im Blut konnte
eine Zunahme der Expression und in der Mukosa eine Abnahme gezeigt werden.
Es wäre darüber hinaus interessant, Blut- und Gewebeproben an denselben
Patienten zu untersuchen, statt dazu zwei Kohorten zu verwenden, sodass der
Einfluss von interindividuellen Störfaktoren verringert werden kann. Auch sollte in
weiteren Studien überprüft werden, wie sich die GPR15-Expression im
Krankheitsverlauf verändert und ob die erhöhte Expression im Blut während eines
akuten Schubs reversibel ist und sich innerhalb einer Remission beispielsweise
wieder normalisiert. Der wichtigste Schritt zum besseren Verständnis von GPR15
ist jedoch die Identifizierung von möglichen Liganden mit der Aussicht, den exakten
molekularen Mechanismus aufzudecken. Durch in vivo Induktion von GPR15 auf
TREGs könnte unter Umständen deren Migration ins entzündete Gewebe gefördert
und die Regulierung eines Entzündungsprozesses eingeleitet werden. Das
Entwerfen von Antikörpern könnte auch bestätigen, dass die Rezeptorbindung zu
einem Herunterregulieren führt, wie in dieser Arbeit diskutiert wurde. Neuere
Studien zeigen ebenfalls, dass die Expression von GPR15 nicht stabil zu sein
scheint (Okamoto et al., 2017). Welcher konkrete klinische Nutzen in der
Beeinflussung des G-Protein-gekoppelte Rezeptors 15 liegt, werden künftige
Arbeiten beantworten, doch kann man heute schon sagen, dass die Erforschung
von Migrationsvorgängen sowohl zum immunologischen Grundverständnis als auch
zur Entwicklung neuer Therapieansätze beiträgt.
Zusammenfassung
58
Zusammenfassung
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED), wie Morbus Crohn (MC)
oder Colitis ulcerosa (CU), werden durch eine überschießende Immunantwort von
T-Lymphozyten vermittelt. Dabei spielt die Migration dieser Zellen in das Colon eine
entscheidende Rolle für die Pathogenese und rückt daher immer stärker in den
Fokus von neuen Therapieansätzen. GPR15 wurde vor kurzem als neuer
homing-Rezeptor für T-Zellen in das Colon beschrieben. Allerdings wird seine Rolle
bei der Migration von pro- und antiinflammatorisch wirkenden Immunzellen
kontrovers diskutiert.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass im peripheren Blut von
gesunden Kontrollen GPR15 sowohl von regulatorischen T-Zellen (TREGs) als auch
von konventionellen T-Zellen (TCONV) exprimiert wird. Außerdem konnten
verschiedene Zytokinproduktionen und funktionelle Unterschiede zwischen GPR15+
und GPR15- T-Zellen identifiziert werden. Interessanterweise ist bei Patienten mit
CED eine deutlich verstärkte Expression von GPR15 auf TREGs im peripheren Blut
detektierbar. Gleichzeitig ist die Expression von GPR15 auf TREGs in der
entzündeten Schleimhaut des Colons signifikant reduziert, obwohl der Anteil an
TREGs im entzündeten Gewebe zunimmt. Ob die erhöhte Expression von GPR15 auf
TREGs im peripheren Blut von CED-Patienten für die Migration dieser Zellen in das
Colon verantwortlich ist, muss in weiteren Studien geklärt werden.
5
Literaturverzeichnis
59
Literaturverzeichnis
1. Adamczyk, A., Gageik, D., Frede, A., Pastille, E., Hansen, W., Rueffer, A., Buer, J., Buning, J., Langhorst, J.,Westendorf, A. M. (2017). Differential expression of GPR15 on T cells during ulcerative colitis. JCI Insight 2
2. Agace, W. (2010). Generation of gut-homing T cells and their localization to the
small intestinal mucosa. Immunol Lett 128, 21-23. 3. Akiho, H., Yokoyama, A., Abe, S., Nakazono, Y., Murakami, M., Otsuka, Y.,
Fukawa, K., Esaki, M., Niina, Y.,Ogino, H. (2015). Promising biological therapies for ulcerative colitis: A review of the literature. World J Gastrointest Pathophysiol 6, 219-227.
4. Ananthakrishnan, A. N. (2015). Epidemiology and risk factors for IBD. Nat Rev
Gastroenterol Hepatol 12, 205-217. 5. Ananthakrishnan, A. N., Nguyen, D. D., Sauk, J., Yajnik, V.,Xavier, R. J. (2014).
Genetic polymorphisms in metabolizing enzymes modifying the association between smoking and inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis 20, 783-789.
6. Ansel, K. M., Djuretic, I., Tanasa, B.,Rao, A. (2006). Regulation of Th2
differentiation and Il4 locus accessibility. Annu Rev Immunol 24, 607-656. 7. Baumgart, D. C.,Carding, S. R. (2007). Inflammatory bowel disease: cause and
immunobiology. The Lancet 369, 1627-1640. 8. Baumgart, D. C.,Sandborn, W. J. (2007). Inflammatory bowel disease: clinical
aspects and established and evolving therapies. The Lancet 369, 1641-1657. 9. Belkaid, Y.,Segre, J. A. (2014). Dialogue between skin microbiota and immunity.
Science 346, 954-959. 10. Beriou, G., Costantino, C. M., Ashley, C. W., Yang, L., Kuchroo, V. K., Baecher-
Allan, C.,Hafler, D. A. (2009). IL-17-producing human peripheral regulatory T cells retain suppressive function. Blood 113, 4240-4249.
6
Literaturverzeichnis
60
11. Biedermann, L., Brulisauer, K., Zeitz, J., Frei, P., Scharl, M., Vavricka, S. R.,
Fried, M., Loessner, M. J., Rogler, G.,Schuppler, M. (2014). Smoking cessation alters intestinal microbiota: insights from quantitative investigations on human fecal samples using FISH. Inflamm Bowel Dis 20, 1496-1501.
12. Bilsborough, J.,Viney, J. L. (2015). GPR15: a tale of two species. Nat Immunol
16, 137-139. 13. Butcher, E. C.,Picker, L. J. (1996). Lymphocyte homing and homeostasis.
Science 272, 60-66. 14. Colman, R. J.,Rubin, D. T. (2014). Fecal microbiota transplantation as therapy
for inflammatory bowel disease: a systematic review and meta-analysis. J Crohns Colitis 8, 1569-1581.
15. Colombel, J. F., Sandborn, W. J., Rutgeerts, P., Enns, R., Hanauer, S. B.,
Panaccione, R., Schreiber, S., Byczkowski, D., Li, J., Kent, J. D.,Pollack, P. F. (2007). Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology 132, 52-65.
16. de Souza, H. S.,Fiocchi, C. (2016). Immunopathogenesis of IBD: current state
of the art. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 13, 13-27. 17. Deng, H. K., Unutmaz, D., KewalRamani, V. N.,Littman, D. R. (1997).
Expression cloning of new receptors used by simian and human immunodeficiency viruses. Nature 388, 296-300.
18. Dignass A., Preiss J.C., Aust D.E., Autschbach F., Ballauff A., Barretton G.,
Bokemeyer B., Fichtner-Feigl S., Hagel S., Herrlinger K.R., Jantschek G., Kroesen A., Kruis W., Kucharzik T., Langhorst J., Reinshagen M., Rogler G., Schleiermacher D., Schmidt C., Schreiber S., Schulze H., Stange E., Zeitz M., Hoffmann J.C.,A., S. (2012). Aktualisierte Leitlinie zur Diagnostik und Therapie der Colitis ulcerosa 2011. Z Gastroenterol 50, 271-272.
19. Eckburg, P. B., Bik, E. M., Bernstein, C. N., Purdom, E., Dethlefsen, L., Sargent,
M., Gill, S. R., Nelson, K. E.,Relman, D. A. (2005). Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 308, 1635-1638.
20. Feagan, B. G., Rutgeerts, P., Sands, B. E., Hanauer, S., Colombel, J. F.,
Sandborn, W. J., Van Assche, G., Axler, J., Kim, H. J., Danese, S., Fox, I., Milch, C., Sankoh, S., Wyant, T., Xu, J., Parikh, A.,Group, G. S. (2013). Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med 369, 699-710.
21. Fischer, A., Zundler, S., Atreya, R., Rath, T., Voskens, C., Hirschmann, S.,
Lopez-Posadas, R., Watson, A., Becker, C., Schuler, G., Neufert, C., Atreya, I.,Neurath, M. F. (2016). Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut 65, 1642-1664.
Literaturverzeichnis
61
22. Fontenot, J. D., Gavin, M. A.,Rudensky, A. Y. (2003). Foxp3 programs the
development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Immunol 4, 330-336.
23. Fuss, I. J., Heller, F., Boirivant, M., Leon, F., Yoshida, M., Fichtner-Feigl, S.,
Yang, Z., Exley, M., Kitani, A., Blumberg, R. S., Mannon, P.,Strober, W. (2004). Nonclassical CD1d-restricted NK T cells that produce IL-13 characterize an atypical Th2 response in ulcerative colitis. J Clin Invest 113, 1490-1497.
24. Fuss, I. J., Neurath, M., Boirivant, M., Klein, J. S., de la Motte, C., Strong, S. A.,
Fiocchi, C.,Strober, W. (1996). Disparate CD4+ lamina propria (LP) lymphokine secretion profiles in inflammatory bowel disease. Crohn's disease LP cells manifest increased secretion of IFN-gamma, whereas ulcerative colitis LP cells manifest increased secretion of IL-5. J Immunol 157, 1261-1270.
25. Green, J. M., Barratt, M. J., Kinch, M.,Gordon, J. I. (2017). Food and microbiota
in the FDA regulatory framework. Science 357, 39-40. 26. Groux, H., O'Garra, A., Bigler, M., Rouleau, M., Antonenko, S., de Vries, J.
E.,Roncarolo, M. G. (1997). A CD4+ T-cell subset inhibits antigen-specific T-cell responses and prevents colitis. Nature 389, 737-742.
27. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H.,Butcher, E. C. (2016). Leukocyte
Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology 150, 340-354. 28. Hanauer, S. B., Feagan, B. G., Lichtenstein, G. R., Mayer, L. F., Schreiber, S.,
Colombel, J. F., Rachmilewitz, D., Wolf, D. C., Olson, A., Bao, W.,Rutgeerts, P. (2002). Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. The Lancet 359, 1541-1549.
29. Heiber, M., Marchese, A., Nguyen, T., Heng, H. H., George, S. R.,O'Dowd, B.
F. (1996). A novel human gene encoding a G-protein-coupled receptor (GPR15) is located on chromosome 3. Genomics 32, 462-465.
30. Herold, G. (2017): Innere Medizin. Köln: Herold, Gerd. 31. Hundorfean, G., Neurath, M. F.,Mudter, J. (2012). Functional relevance of T
helper 17 (Th17) cells and the IL-17 cytokine family in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 18, 180-186.
32. Hungin, A. P., Mulligan, C., Pot, B., Whorwell, P., Agreus, L., Fracasso, P.,
Lionis, C., Mendive, J., Philippart de Foy, J. M., Rubin, G., Winchester, C., de Wit, N.,European Society for Primary Care, G. (2013). Systematic review: probiotics in the management of lower gastrointestinal symptoms in clinical practice -- an evidence-based international guide. Aliment Pharmacol Ther 38, 864-886.
Literaturverzeichnis
62
33. Iwata, M., Hirakiyama, A., Eshima, Y., Kagechika, H., Kato, C.,Song, S. Y. (2004). Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity 21, 527-538.
34. Jager, A.,Kuchroo, V. K. (2010). Effector and regulatory T-cell subsets in
autoimmunity and tissue inflammation. Scand J Immunol 72, 173-184. 35. Janeway, C., Murphy, K., Travers, P.,Walport, M. (2009): Janeway Immunologie
(7. Auflage). Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag. 36. Joost, P.,Methner, A. (2002). Phylogenetic analysis of 277 human G-protein-
coupled receptors as a tool for the prediction of orphan receptor ligands. Genome Biology 3
37. Kim, S. V., Xiang, W. V., Kwak, C., Yang, Y., Lin, X. W., Ota, M., Sarpel, U.,
Rifkin, D. B., Xu, R.,Littman, D. R. (2013). GPR15-mediated homing controls immune homeostasis in the large intestine mucosa. Science 340, 1456-1459.
38. Klement, E., Cohen, R. V., Boxman, J., Joseph, A.,Reif, S. (2004).
Breastfeeding and risk of inflammatory bowel disease: a systematic review with meta-analysis. Am J Clin Nutr 80, 1342-1352.
39. Koks, G., Uudelepp, M. L., Limbach, M., Peterson, P., Reimann, E.,Koks, S.
(2015). Smoking-induced expression of the GPR15 gene indicates its potential role in chronic inflammatory pathologies. Am J Pathol 185, 2898-2906.
40. Kovarik, J. J., Tillinger, W., Hofer, J., Holzl, M. A., Heinzl, H., Saemann, M.
D.,Zlabinger, G. J. (2011). Impaired anti-inflammatory efficacy of n-butyrate in patients with IBD. Eur J Clin Invest 41, 291-298.
41. Lahl, K., Sweere, J., Pan, J.,Butcher, E. (2014). Orphan chemoattractant
receptor GPR15 mediates dendritic epidermal T-cell recruitment to the skin. Eur J Immunol 44, 2577-2581.
42. Macdonald, T. T.,Monteleone, G. (2005). Immunity, inflammation, and allergy in
the gut. Science 307, 1920-1925. 43. Mahid, S. S., Minor, K. S., Soto, R. E., Hornung, C. A.,Galandiuk, S. (2006).
Smoking and inflammatory bowel disease: a meta-analysis. Mayo Clin Proc 81, 1462-1471.
44. Maul, J., Loddenkemper, C., Mundt, P., Berg, E., Giese, T., Stallmach, A., Zeitz,
M.,Duchmann, R. (2005). Peripheral and Intestinal Regulatory CD4+CD25high T Cells in Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology 128, 1868-1878.
45. Molodecky, N. A., Soon, I. S., Rabi, D. M., Ghali, W. A., Ferris, M., Chernoff, G.,
Benchimol, E. I., Panaccione, R., Ghosh, S., Barkema, H. W.,Kaplan, G. G. (2012). Increasing incidence and prevalence of the inflammatory bowel diseases with time, based on systematic review. Gastroenterology 142, 46-54 e42; quiz e30.
Literaturverzeichnis
63
46. Mosmann, T. R.,Coffman, R. L. (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of
lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 7, 145-173.
47. Nguyen, L. P., Pan, J., Dinh, T. T., Hadeiba, H., O'Hara, E., 3rd, Ebtikar, A.,
Hertweck, A., Gokmen, M. R., Lord, G. M., Jenner, R. G., Butcher, E. C.,Habtezion, A. (2015). Role and species-specific expression of colon T cell homing receptor GPR15 in colitis. Nat Immunol 16, 207-213.
48. Okamoto, Y.,Shikano, S. (2017). Differential phosphorylation signals control
endocytosis of GPR15. Mol Biol Cell 49. Pabst, O.,Mowat, A. M. (2012). Oral tolerance to food protein. Mucosal Immunol
5, 232-239. 50. Palm, N. W., de Zoete, M. R.,Flavell, R. A. (2015). Immune-microbiota
interactions in health and disease. Clin Immunol 159, 122-127. 51. Paramsothy, S., Paramsothy, R., Rubin, D. T., Kamm, M. A., Kaakoush, N. O.,
Mitchell, H. M.,Castano-Rodriguez, N. (2017). Faecal Microbiota Transplantation for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. J Crohns Colitis
52. Popp, V., Ho, I. C., Neurath, M. F.,Weigmann, B. (2015). Die entscheidende
Rolle des Transkriptionfaktors GATA-3 bei der Entstehung von TH2-ell vermittelter Colitis ulcerosa. Z Gastroenterol 53, PP4.
53. Preiß, J. C., Bokemeyer, B., Buhr, H. J., Dignass, A., Hauser, W., Hartmann,
F., Herrlinger, K. R., Kaltz, B., Kienle, P., Kruis, W., Kucharzik, T., Langhorst, J., Schreiber, S., Siegmund, B., Stallmach, A., Stange, E. F., Stein, J., Hoffmann, J. C.,German Society of, G. (2014). Aktualisierte S3-Leitlinie – „Diagnostik und Therapie des Morbus Crohn“ 2014. Z Gastroenterol 52, 1431-1484.
54. Rachmilewitz, D. (1989). Coated mesalazine (5-aminosalicylic acid) versus
sulphasalazine in the treatment of active ulcerative colitis: a randomised trial. BMJ 298, 82-86.
55. Ristvedt, S. L., McFarland, E. G., Weinstock, L. B.,Thyssen, E. P. (2003).
Patient preferences for CT colonography, conventional colonoscopy, and bowel preparation. Am J Gastroenterol 98, 578-585.
56. Roda, G., Jharap, B., Neeraj, N.,Colombel, J. F. (2016). Loss of Response to
Anti-TNFs: Definition, Epidemiology, and Management. Clin Transl Gastroenterol 7, e135.
57. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M.,Toda, M. (1995).
Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2
Literaturverzeichnis
64
receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol 155, 1151-1164.
58. Sallusto, F.,Baggiolini, M. (2008). Chemokines and leukocyte traffic. nature
immunology 9, 949-952. 59. Siegenthaler, W.,Blum, H. E. (2006): Klinische Pathophysiologie (9. Auflage).
Stuttgart: Thieme. 60. Smith, P. M., Howitt, M. R., Panikov, N., Michaud, M., Gallini, C. A., Bohlooly,
Y. M., Glickman, J. N.,Garrett, W. S. (2013). The microbial metabolites, short-chain fatty acids, regulate colonic Treg cell homeostasis. Science 341, 569-573.
61. Su, D., Wang, X., Campbell, M. R., Porter, D. K., Pittman, G. S., Bennett, B. D.,
Wan, M., Englert, N. A., Crowl, C. L., Gimple, R. N., Adamski, K. N., Huang, Z., Murphy, S. K.,Bell, D. A. (2016). Distinct Epigenetic Effects of Tobacco Smoking in Whole Blood and among Leukocyte Subtypes. PLoS One 11, e0166486.
62. Sun, M., Wu, W., Liu, Z.,Cong, Y. (2017). Microbiota metabolite short chain fatty
acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol 52, 1-8. 63. Targan, S. R., Hanauer, S. B., van Deventer, S. J., Mayer, L., Present, D. H.,
Braakman, T., DeWoody, K. L., Schaible, T. F.,Rutgeerts, P. J. (1997). A short-term study of chimeric monoclonal antibody cA2 to tumor necrosis factor alpha for Crohn's disease. Crohn's Disease cA2 Study Group. N Engl J Med 337, 1029-1035.
64. Thomas, S.,Baumgart, D. C. (2012). Targeting leukocyte migration and
adhesion in Crohn's disease and ulcerative colitis. Inflammopharmacology 20, 1-18.
65. van Nood, E., Vrieze, A., Nieuwdorp, M., Fuentes, S., Zoetendal, E. G., de Vos,
W. M., Visser, C. E., Kuijper, E. J., Bartelsman, J. F., Tijssen, J. G., Speelman, P., Dijkgraaf, M. G.,Keller, J. J. (2013). Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. N Engl J Med 368, 407-415.
66. Vautier, S., Sousa Mda, G.,Brown, G. D. (2010). C-type lectins, fungi and Th17
responses. Cytokine Growth Factor Rev 21, 405-412. 67. Wadwa, M., Klopfleisch, R., Adamczyk, A., Frede, A., Pastille, E., Mahnke, K.,
Hansen, W., Geffers, R., Lang, K. S., Buer, J., Buning, J.,Westendorf, A. M. (2016). IL-10 downregulates CXCR3 expression on Th1 cells and interferes with their migration to intestinal inflammatory sites. Mucosal Immunol 9, 1263-1277.
68. Walker, A. W., Sanderson, J. D., Churcher, C., Parkes, G. C., Hudspith, B. N.,
Rayment, N., Brostoff, J., Parkhill, J., Dougan, G.,Petrovska, L. (2011). High-throughput clone library analysis of the mucosa-associated microbiota reveals dysbiosis and differences between inflamed and non-inflamed regions of the intestine in inflammatory bowel disease. BMC Microbiol 11, 7.
Literaturverzeichnis
65
69. Wan, Y. Y.,Flavell, R. A. (2009). How diverse--CD4 effector T cells and their functions. J Mol Cell Biol 1, 20-36.
70. Wells, T. N., Power, C. A., Shaw, J. P.,Proudfoot, A. E. (2006). Chemokine
blockers--therapeutics in the making? Trends Pharmacol Sci 27, 41-47. 71. Westendorf, A. M., Fleissner, D., Hansen, W.,Buer, J. (2010). T cells, dendritic
cells and epithelial cells in intestinal homeostasis. Int J Med Microbiol 300, 11-18.
72. Yousry, T. A., Major, E. O., Ryschkewitsch, C., Fahle, G., Fischer, S., Hou, J.,
Curfman, B., Miszkiel, K., Mueller-Lenke, N., Sanchez, E., Barkhof, F., Radue, E. W., Jager, H. R.,Clifford, D. B. (2006). Evaluation of patients treated with natalizumab for progressive multifocal leukoencephalopathy. N Engl J Med 354, 924-933.
73. Zheng, W.,Flavell, R. A. (1997). The transcription factor GATA-3 is necessary
and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell 89, 587-596.
Anhang
66
Anhang
7.1. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1 Schematische Darstellung der intestinalen Homöostase
(modifiziert nach Turner, 2009). 13
Abbildung 1.2 Endoskopische Aufnahmen von gesunder und entzündeter Schleimhaut des Colons (von Prof. Langhorst, Knappschafts-Krankenhaus, Essen bzw. Baumgart & Sandborn, 2007).
15
Abbildung 1.3 Zirkulation und Aktivierung von Lymphozyten (modifiziert nach Habtezion et al., 2016).
19
Abbildung 2.1 Schematische Darstellung der Durchflusszytometrie (modifiziert nach T. Rowley, 2012; Quelle: https://www.labome.com/method/Flow-Cytometry-A-Survey-and-the-Basics.html).
31
Abbildung 3.1 GPR15-Expression auf unterschiedlichen Immunzellen im Blut gesunder Spender.
36
Abbildung 3.2 GPR15-Expression unter Tabakrauchen. 37
Abbildung 3.3 Funktionelle Unterschiede zwischen GPR15+ und GPR15- CD4+ T-Zellen.
39
Abbildung 3.4 Erhöhte GPR15-Expression auf regulatorischen im Vergleich zu konventionellen T-Zellen.
40
7
Anhang
67
Abbildung 3.5 Erhöhte GPR15-Expression im Blut von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen.
42
Abbildung 3.6 α4β7-Expression im Blut von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und die Koexpression mit GPR15.
44
Abbildung 3.7 Vergleich der GPR15-Expression im Blut von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa.
45
Abbildung 3.8 Genexpressionsanalyse von Biopsien aus dem Colon von Colitis ulcerosa-Patienten.
47
Abbildung 3.9 Durchflusszytometrische Analyse von Biopsien aus dem Colon von Colitis ulcerosa-Patienten.
49
7.2. Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1 Soziodemographische Merkmale der Studienpopulation 22
Tabelle 2.2 Chemikalien und Enzyme 24
Tabelle 2.3 Oligonukleotidprimerpaare zur quantitativen Expressions-analyse
25
Tabelle 2.4 Fluorochrome für die Durchflusszytometrie 26
Tabelle 2.5 Antikörper für die Durchflusszytometrie 26
Anhang
68
7.3. Abkürzungsverzeichnis
APC (Zelle) engl. antigen presenting cell, Antigen-präsentierende Zelle
APC (Farbstoff) Allophycocyanin
bzw. beziehungsweise
CCR Chemokinrezeptor
CCL CC-Chemokin-Ligand
CD engl. cluster of differentiation
cDNA komplementäre DNA (Desoxyribonukleinsäure)
CED Chronisch entzündliche Darmerkrankung
CU Colitis ulcerosa
CpG Cytosin-phosphatidyl-Guanin
DC engl. dendritic cell, dendritische Zelle
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
DSS Dextran-Sodium-Sulfat
dt. deutsch
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
engl. englisch
et al. lat. et altera, und andere
FACS engl. fluorescence activated cell sorting, Durchflusszytometrie
FCS engl. fetal calf serum, Fötales Kälberserum
FITC Fluoresceinisothiocyanat
Foxp3 engl. forkhead box protein 3
GALT engl. gut associated lymphoid tissue, darmassoziiertes lymphatisches Gewebe
GPR15 engl G-protein coupled receptor 15
H2O Wasser
HIV Humanes Immundefizienz-Virus
HEV engl. high endothelial venule, Hochendotheliale Venole
IFN Interferon
IL Interleukin
Anhang
69
IMDM engl. iscove's modified dulbecco's medium, Komplettmedium
lat. lateinisch
MAdCAM-1 engl. mucosal addressin cell adhesion molecule 1
MACS engl. magnetic activated cell separation
MC Morbus Crohn
MHC engl. major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex
MLN mesenteriale Lymphknoten
mRNA messenger RNA
NOD2 engl. nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2
ns nicht signifikant
PAMP engl. pathogen-associated molecular pattern, Pathogen-assoziierte molekulare Muster
PB Pacific Blue
PBMC engl. peripheral blood mononuclear cell, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
PBS engl. phosphate buffered saline, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PCR engl. polymerase chain reaction, Polymerase Kettenreaktion
PE Phycoerythrin
PRR engl. pattern recognition receptor, Mustererkennungsrezeptoren
qPCR quantitative Real-Time PCR
RNA Ribonukleinsäure
RPS-9 ribosomales Protein S9
RT reverse Transkription
SCFA engl. short-chain fatty acids, kurzkettige Fettsäuren
SD engl. standard deviation, Standardabweichung
SIV Simianes Immundefizienz-Virus
TCONV konventionelle T-Zelle
TCR engl. T-cell receptor, T-Zellrezeptor
TGF engl. transforming growth factor
TH1-Zelle Typ1-T-Helferzelle
TH2-Zelle Typ2-T-Helferzelle
TH17-Zelle Typ17-T-Helferzelle
TLR engl. toll-like receptor
Anhang
70
TNF-α engl. tumor necrosis factor alpha
TREG regulatorische T-Zelle
U engl. unit
z.T. zum Teil
Danksagung
71
Danksagung
Zunächst möchte ich mich bei Prof. Dr. rer. nat. Astrid Westendorf bedanken für die
Bereitstellung dieses spannenden Themas, die tolle Unterstützung und intensive
Betreuung während der gesamten Planung und Durchführung dieser Arbeit.
Bei Dr. rer. nat. Alexandra Adamcyzk möchte ich mich besonders für die äußerst
geduldige Hilfe und sehr gute Zusammenarbeit bedanken.
Des Weiteren möchte ich mich bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppen Westendorf
und Hansen für die nette Atmosphäre, die zahllosen Tipps und praktischen Hilfen
im Labor bedanken.
Auch dem Graduiertenkolleg 1949 „Immunantwort in Infektionskrankheiten -
Regulation zwischen angeborener und erworbener Immunität“ durch die Deutsche
Forschungsgemeinschaft möchte ich für Förderung dieser Arbeit sehr danken.
Prof. Dr. med. Jost Langhorst und Prof. Dr. med. Jürgen Büning gilt mein
besonderer Dank für die Bereitstellung von Blut- bzw. Gewebeproben und der
kollegialen Zusammenarbeit.
Auch meiner Familie und meinen Freunden, die mich während dieser Arbeit zu jeder
Zeit unterstützt haben, möchte ich meinen Dank aussprechen, im Besonderen
meinen guten Freunden Olga Haan und Tobias Houben.
Nicht zuletzt möchte ich meiner Frau Lisa danken, die mir während des Verfassens
dieser Arbeit stets zur Seite stand und mir immer den nötigen Rückhalt bot.
Lebenslauf
72
Der Lebenslauf ist in der Online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht
enthalten.
Lebenslauf
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