Examenul bacteriologic

Examenul bacteriologic presupune izolarea, cultivarea si identificarea germenilor bacterieni din diferite alimente suspecte de contaminare. Fata de examenul microscopic, care permite decelarea prezentei agentului etiologic, metodele bacteriologice complexe permit, pe lânga izolare si cercetarea diferitelor insusiri biologice care-l caracterizeaza. Faptul are o deosebita importanta si din punct de vedere epidemiologic, prin aceste examene evitindu-se, de exemplu darea în consum a unor produse animaliere care pot provoca la om infectii sau toxiinfectii, uneori cu evolutie grava. Este suficient sa se aminteasca perico lul pe care-l prezinta, mai ales carnea animalelor sacrificate de necesi tate, la care intreruperea procesului patologic, prin sacrificare, face ca modificarile organoleptice si organice sa nu trezeasca suspiciune la examinare. Un examen bacteriologic insa poate pune in evidenta agentii unei salmoneloze, leptospirozei, antraxului etc. toate transmisibile la om. Examenul bacteriologic da adesea si indicii referitoare la sursa de infectie si permite deci, eliminarea ei.

Ca tehnici de insamintare pot fi aplicate mai multe procedee:

a) Cu pipeta Pasteur. Se cauterizeaza suprafafa probei cu o spa-tula incalzita, se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si easi racita, o cantitate de lichid organic din profunzime si se insaminteazaintâi pe mediul lichid (bulion), iar apoi pe mediul solid (agar inclinat, agarcu singe, agar ou ser etc.). La inchiderea si des-chiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare a sterilitatii, flam-bând gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere.

b) Cu ajutorul acului de insamintare drept. Se cauterizeaza supra-faţa organului si se sterilizeaza acul prin incalzire la rosu (tija se trecesi ea de 3 ori prin flacara), iar dupa racire se inteapa organul prin supra-faţa cauterizata, facând câteva miscari spre interior. Se scoate acul dinorgan si se face insamântarea prin clatirea acestuia in mediul lichid.Fara a se flamba, acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid, facân-du-se pe suprafaţa acestuia miscari in zig-zag, incepând de la baza me-diului spre partea superioara, sau se clateste acul in lichidul de conden-sare, dupa care se umecteaza intreaga suprafaţa a mediului cu acest li-chid, prin inclinari repetate. Dupa fiecare proba, acul se sterilizeaza prininrosire la flacara.

c) Cu porţiuni de organ. Când organul a fost recoltat in conditii desterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la secţio-narea unor bucaţi cu ajutorul unor instrumente sterile, iar cu una dinsuprafeţele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe suprafaţa uneiplaci cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnica este folosita aproapein exclusivitate.

d) Prin introducerea direct, in mediu a portiunilor de organ. Metodase foloseste mai rar, in special cind se banuieste saracia in germeni a

Tehnica îsamânţarii

materialului patologic. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa se faca in conditii de sterilitate perfecte.

Ca principiu general, se va evita deschiderea organelor sau secţionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul bacteriologic.

Tehnica transplantarilor. Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor germeni in stare pura, fie menţinerea lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de colectie).

Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de insamintare. In primul caz, se recolteaza o cantitate arbitrara (câteva picaturi) din cultura veche, care apoi se insamânteaza in mediul proaspat. In cel de al doilea, se introduce ansa flambata si racita in cultura veche, dupa care se face insamântarea pe mediile proaspete (intâi in mediul lichid si apoi in mediul solid, daca este cazul).

Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa, raclând o cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proaspete.

In timpul insamântarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere câteva reguli general valabile:

- însămânţările se execută în boxe sterile sau în hote speciale care permit sterilizarea periodică şi nu permit formarea de curenţi de aer în timpul lucrului;

- în timpul operaţiunilor de însămânţare se evită pe cât posibil conversaţia şi orice mişcare de prisos în jurul operatorului;

- ansa cu care se execută însămânţarea nu trebuie să fie atinsă de nici un obiect nesteril (mână, halat, masă de lucru, etc.);

- însămânţările se vor executa cât mai repede, cu scopul de a reduce la minim contactul materialului de însămânţat cu atmosfera ambiantă;

- în timpul cât recipientele sau tuburile de cultură, sterile sau însămânţate sunt deschise, vor fi ţinute în poziţie înclinată cât mai aproape de flacără pentru a evita contaminarea cu germeni sau spori din atmosferă;

- imediat după însămânţare se face notarea tuburilor cu creioane speciale fără a se omite data însămânţării.

Mediile de culture folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de bacterii

Pentru a pune un diagnostic bacteriologic corect, sigur si prompt, folosirea unor medii de cultivare corespunzatoare este de o importanta hotărâtoare. Cunoscându-se insusirile germenilor cautati, conditiile lor optime de dezvoltare, bacteriologul trebuie sa foloseasca mediile cele mai eficiente si indicate de izolare, in funcţie de specia microorganismului in cauza.

Un mediu de cultura trebuie sa asigure substratul nutritiv pentru cresterea si multiplicarea microbilor, sa aibe un pH care sa permita desfasurarea normala a proceselor metabolice microbiene (in general 7,2—7,4), sa asigure condiţiile de aerobioza sau anaerobioza, sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alti microbi si sa fie usor de manevrat. In general, microbii patogeni se dezvolta optim la temperature corpului speciei de la care sunt izolati.

Sunt insa si specii microbiene care prefera temperaturi mai joase ( ex. leptospirele se multiplica la 28—30°C).

Mediile de cultura se pot imparti in doua categorii:

medii uzuale (obişnuite), pe care se dezvolta majoritatea germenilor patogeni. Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaerobe; — medii speciale, destinate izolarii, cultivarii si cercetarii insusirilor biologice ale anumitor specii de germeni. Ele pot fi: de izolare, de imbogatire, selective, diferentiale ;

mediile speciale de izolare favorizeaza dezvoltarea anumitor germeni, care nu se pot cultiva de la inceput pe mediile obisnuite, ei necesitând anumite condiţii speciale sau anumiţi ,,factori de plecare".

Mediile de imbogăţire sunt folosite pentru cazurile in care in produsul patologic de examinat se bănuieste o cantitate mica de germeni patogeni si un numar mare de germeni din flora de asociaţie. Astfel de medii sint mediul Kaufmann—Muller (pentru enterobacteriaceae), mediul Chapman (pentru stafilococi patogeni).

Mediile selective favorizeaza, prin compoziţia lor chimica, dezvoltarea anumitor germeni. Astfel sint mediul Wilson—Blair si Drigalski (pentru salmonele), mediul Istrati—Meitert (pentru Escherichia, Shigella, Salmonella), mediile Czapek, Sabouraud (pentru ciuperci).

Mediile diferenfiale permit cresterea diferenţiata a unor specii microbiene sau pun in evidenţa anumite particularitati metabolice cu semnificaţie diagnostică. Ele evidenţiaza anumite procese biochimice caracteristice metabolismului anumitor specii de bacterii, permitând in acest fel identificarea lor (fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreductoare etc.). Includerea in componenţa acestor medii a unor substanţe indicatoare sau revelatoare este menita sa faca vizibil procesul respectiv.

Dupa starea lor fizica mediile se pot imparti in: solide, semisolide, lichide.

Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe. Exista si medii ,,sintetice" bazate pe componente cunoscute din punctul de vedere al structurii lor chimice. In comparatie cu bulionul, agarul sau alte medii ale caror componente nu sunt identificate chimic in totalitate, mediile sintetice au avantajul ca permit anumite determinari capabile sa ofere relatii asupra metabolismului bacterian (prin dozarea inainte si dupa cultivare a diferitelor componente se poate cunoaste ce anume a fost consumat in cursul multiplicarii si in ce cantitate).

Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sunt :

Apa peptonata - este unul din cele mai simple medii de cultura, dar care are largi utilizari, in special când i se adauga zaharuri, in vederea determinarii spectrului zaharolitic al diferitelor specii de bacterii. Se prepara din:

- apa distilata 100,0 ml

- peptona 1,0 g

- NaCl 0,5 g

Se ajusteaza pH-ul la 7,2—7,4, se incalzeşte 15 minute la 115°C pentru precipitare, se filtreaza prin hârtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav.

Când se adauga zaharurile, acestea se pun in proportie de 1% in balonane separate, se adauga albastru de bromtimol (12 ml la 1 litru de mediu) ca indicator si se sterilizeaza prin tindalizare 30 de minute, 3 zile consecutiv. Soluţia de albastru de bromtimol folosita in acest scop se prepara din: 1 g albastru de bromtimol + 25 ml NaOH n/10 + 475 ml apa distilata.

Bulionul de carne se prepara mai ales din came de bovine şi cabaline, mai rar din cea de pasare. Muschii se curaţa de aponevroze, tendoane, fascii si grasime, se taie bucati mici, sau se toaca la masina de tocat came. La 500 g tocatura, se adauga 1000 ml apa de robinet, se tine 24 de ore la rece, pentru macerare, apoi se fierbe 30 minute, se decanteaza şi se stoarce, iar lichidul obtinut se filtreaza prin mai multe straturi de tifon si se completeaza cu apa la volumul iniţial. Se incalzeste la 80—90°C si se adauga peptona 10 g si NaCl 5 g la 1000 ml lichid.

Se ajusteaza pH-ul cu o solutie de NaOH n :1 (la 7,2—7,6) prin metoda colorimetrica. Se incalzeste la autoclav la 115°C timp de 15 minute. Incalzirea in prezenta NaOH produce o precipitare abundenta, ceea ce impune o filtrare prin hirtie de filtru. Apoi se face repartizarea in tuburi, in cantitate de cca 5 ml, in sticle sau baloane, care se astupa cu dopuri de vata si se sterilizeaza 30 minute la auitoclav la 115°C.

Pentru repartizare se pot folosi pipete de 25—50 mil, dar cel mai practic este sa se folosesca dispozitive speciale constând din vase cu tubulura inferioara sau pâlnii suspendate, prevazute cu un tub de cauciuc si clemă. In unele laboratoare exista dispozitive automatizate care asigura un debit constant, reglabil (aşa numitele turnătoare de medii).

Bulionul astfel preparat are un aspect asemanator cu untdelemnul si trebuie sa fie perfect limpede.

Pastrarea lui se poate face vreme indelungata in vase bine inchise, in incaperi reci si la adapost de lumina.

La ora actuala, este din ce in ce mai raspindita folosirea extractelor de carne care sint livrate in stare deshidratata, purificata si standardizata, ceea ce asigura obţinerea unor medii de o calitate superioara (extractele Merck, Oxoid etc.).

Agarul nutritiv (geloza) este un mediu solid obtinut prin adaugarea la bulionul de carne a agarului (fibre sau pulvis). Acesta nu are nici un rol nutritiv, dar determina solidificarea mediului.

La 1 litru de bulion, se calculeaza 30 g agar fibre sau 25 g agar pulvis, care se topeste apoi prin incalzire la 115°C, timp de 15 minute la autoclav. Se filtreaza prin vata, in autoclavul cu capacul deschis (pentru a evita solidificarea pe parcursul filtrarii).

Se repartizeaza in eprubete sau alte recipiente unde urmeaza a fi pastrat. Se astupa cu dopuri de vata, se sterilizeaza 20 de minute la 120°C dupa care eprubetele se pun in pziţie inclinata pentru solidificare.

Pastrarea se poate face in flacoane inchise etans pentru a evita pierderea apei, dar in general este bine sa nu se prepare sarje prea mari pentru a dispune de mediu cât mai proaspat.

Examenul caracterelor culturale

Dezvoltarea germenilor bacterieni pe mediile de cultura ia aspecte diferite in functie de specia in cauza, mediul folosit si uneori condiţiile de cultivare. Pentru unele specii, o serie de caractere culturale reprezinta particularitati deosebit de pretioase pentru identificarea lor.

In mediile lichide, in aprecierea dezvoltarii bacteriilor se au in vedere turbiditatea, depozitul si formatiunile de suprafaţa.

Turbiditatea poate fi pronuntata, discreta sau poate sa lipseasca.

Depozitul ia nastere prin depunerea la fundul tubului a germeni lor care s-au dezvoltat in mediu. El poate fi discret sau abundent, granular, viscos sau pulverulent, omogenizabil sau neomogenizabil prin agitare, aderent sau nu la fundul tubului.

Suprafata mediului poate oferi aspectul unei membrane de grosimi variabile, rugoasa, granulara, incretita sau neteda, sau al unui inel de grosimi variabile la suprafata lichidului.

Pe mediile solide, germenii constituie, prin multiplicare, aglomerări cunoscute sub numele de colonii, vizibile cu ochiul liber sau cu lupa. In aprecierea lor, se au in vedere: dimensiunile, forma in ansamblu, profilul, suprafata, marginile, culoarea, opacitatea, consistenta, emulsionabilitatea.

Sub aspectul dimensiunii, coloniile pot fi de talie variabila, pina la ciţiva milimetri diametru.

Forma poate fi circulara, ovalara, radiata sau neregulata.

Profilul (in secţiune prezumtiva) poate avea un aspect plat, convex, concav, ombilicat, mamelonat sau papiliform.

Suprafata poate fi neteda, aspra, granulara, lucioasa sau mata.

Marginile pot fi uniforme, neregulate sau cu prelungiri.

Culoarea coloniilor este diferita in funcţie de prezenta si natura pigmentului pe care eventual il conţin (alb, galben, verde, rosu, portocaliu etc.).

Sub raportul opacitatii, coloniile pot fi translucide sau opace, intre ele existind grade intermediare.

Consistenta este si ea variabila: untoasa, viscoasa, uleioasa, grun-joasa, friabila, filanta, ea determinind cel mai adesea si gradul de aderenta la suprafaţa mediului. In timp ce coloniile de consistentă

untoasa şi granulara se desprind cu usurinta, cele visooase adera, determinind o dificultate in desprinderea lor.

Emulsionabilitatea poate fi usoara sau dificila si face ca suspensiile care se practica sa fie omogene sau neuniforme. Citeva exemple in acest sens, pot fi edificatoare.

In medii lichide:

mediul poate fi tulbure omogen (salmonele, stafilococi); mediul poate fi tulbure cu un inel pe perete la limita superioara a

mediului (E. coli); mediul poate fi clar, insa la fund prezinta un depozit grunjos

sau nisipos (streptococi); mediul poate fi clar, cu un depozit floconos si aderent la fundul

tubului (bacilul antraxului); mediul prezinta un val subtire la suprafaţa (vibrionul holeric); mediul prezinta o membrana uscata la suprafata (Bacillus subtilis); mediul prezinta o membrana groasa, rugoasa, plisata la suprafaţa,

restul lichidului raminând limpede (M. tuberculosis); mediul este colorat in verde-albastrui (b.piocianic).

Pe medii solide:

E. coli da colonii rotunde cu margini si suprafeţe netede de3—5 mm diametru, de culoare alba-laptoasa, lucioase;

Pasteurella da, de regula, colonii mici, abia vizibile, transparente,uneori usor albastrui, aderente la mediu;

antraxului da colonii cu suprafata aspra si cu margini avindprelungiri laterale, efilate, care privite cu lupa, au aspectul unor ondu-la^ii ale firelor de par;

stafilococii dau colonii rotunde, bombate, cu margini si suprafe|;enetede, unele din ele pigmentate in alb, auriu sau citrin;

streptococii dau colonii mici bombate; b. tuberculozei umane produce colonii rugoase, uscate, cu mar

gini neregulate.Bacteriile anaerobe ofera şi ele aspecte variabile in functie de mediul folosit

in cultivarea lor.

In cazul mediilor lichide, in general, se produce o tulburare uniforma cu sau fara producţie de gaze, vizibile sub forma unor bule fie in intimitatea lui, fie la suprafata.

In cazul mediilor semisolide (geloza Veillon) se pot forma doua tipuri de colonii, in functie de difuzibilitatea germenilor in mediu, insusire legata de prezenta mobilitatii . Bacteriile mobile ( Cl. tetani ) produc colonii pufoase de aspect sferoid , in timp ce cele imobile ( Cl. perfringens ) produc colonii de aspect lenticular , de talie variabila

Tehnica efectuarii frotiurilor

Frotiul este un preparat expeditiv, efectuat din diferite produse patologice (organe, lichide patologice etc.), sau din culturi ale diferitilor germeni, care permite punerea in evidenta a formatiunilor celulare şi cerecetarea însuşirilor lor morfologice si tinctoriale.

Tehnica efectuarii frotiurilor diferă în funcţie de materialul din care se face şi de natura germenilor in cauză.

Din lichide frotiurile se realizeaza prin intinderea materialului respectiv intr-un strat subtire, cu ajutonil unei anse bacteriologice sau a unei lame şlefuite pe lame de microscop obişnuite. Pelicula de material patologic este recomandabil sa fie cit mai fina şi sa aibe o intindere mai redusa decat marginile lamei de microscop.

Dacă este vorba de frotiuri ce se practica din culturi, in cazul mediior lichide frotiul se face cu ansa bacteriologica, sau cu pipeta Pasteur, din mediul de cultura, iar in cazul mediilor solide se face prelevarea cu ansa bacteriologica a unei cantitati reduse de cultura care se emulsionează bine intr-o picatura de apa distilata, pusa in prealabil pe o lama de microscop bine degresata si apoi se intinde suspensia in strat subtire.

In cazul culturilor in medii solidificate in pozitie verticală (de exemplu geloza Veillon) se recurge la o pipeta Pasteur la care se adapteaza un tub de cauciuc, in asa fel ca el sa permita manipularea pipetei in profunzimea mediului sub control vizual. Materialul microbian se recolteaza prin aspirarea coloniilor izolate, care se gasesc in diferite puncte ale mediului.

Din organe, frotiul se poate realiza in mod diferit in functie de natura acestora. Cel mai frecvent se face prin aplicarea unei lame de microscop pe suprafafa de sectiune a probei de examinat, in acest fel raminind o impresiune corespunzatoare formei suprafetei atinse (metoda amprenta). Este bine ca pe aceeasi lama sa se practice mai multe amprente, pentru a se putea examina frotiurile mai subtiri ( ultimile amprente sunt intotdeauna mai fine).

Se poate recurge, de asemenea, la glisarea unei portiuni de organ, tăiată geometric, pe suprafaţa unei lame de microscop, avându-se grijă de a nu se atinge marginile lamei. Si în acest caz se prefera frotiurile cit mai fine.

Uneori, frotiurile se executa prin strivirea intre doua lame (in cazul unor leziuni de tip nodular. In acest scop, se depune o formatiune nodulara suspecta pe o lama si cu o a doua se striveşte prin compresiune.

Efectuarea frotiului din organe

In cazul unor organe bogate in lichide (sânge, exsudate) frotiul se poate face prin depunerea cu ajutorul unei anse bacteriologice sau a unei pipete Pasteur pe lama de microscop a unei cantitati reduse de material patologic si etalarea lui in strat subtire.

Frotiurile astfel obtinute se fixeaza dupa uscare la flacara şi se coloreaza. Fixarea este necesara pentru a realiza o buna aderenta a materialului patologic pe lama si implicit evitarea desprinderii de catre solutiile colorante a materialului de examinat pe de o parte si inactivarea germenilor etalati pe de alta. Fixarea se poate obtine prin mijloace termice sau chimice.

Fixarea termica presupune trecerea frotiului uscat de 3—4 ori prin flacara unui bec de gaz sau a unei lampi cu alcool, având grija ca lama sa fie orientata spre flacara cu partea opusa celei pe care s-a etalat materialul. Viteza de trecere este moderata, in asa fel ca in final temperatura lamei sa fie in jur de 60°C.

Fixarea termica se poate face si prin flambare, punând pe frotiu citeva picaturi de alcool etilic, metilic sau alcool-acetona (din bateria de colorare Gram) si dindu-li-se foc imediat dupa scurgerea excesului de alcool.

Fixarea chimica se realizeaza prin folosirea unor substance fixatoare (alcool etilic, amestec de alcool etilic, eter si alcool metilic). Acestea se pun in cantitate suficienta pentru a acoperi pelicula de material de pe lama si se lasa pâna la evaporarea totala.

Trebuie mentionat ca unii coloranti (de exemplu soluţia Giemsa din metoda cu acelasi nume) au si capacitates de a fixa frotiurile, asa incit in acest caz nu mai este necesara fixarea prealabila.

Dupa fixarea si racirea frotiului urmeaza colorarea, care este bine sa se faca cât mai curând dupa efectuarea frotiurilor.

Metodele cele mai importante de colorare pentru examenul bacteriologic

Prin colorare se pot stabili unele particulariţi morfologice ale germenilor (dimensiuni, forma, afinitati tinctoriale) ca si relaţiile cu ţesuturile în care se afla, facilitindu-se in acest fel precizarea diagnosticului.

Metodele de colorare sunt diverse si se aplica in mod diferentiat, in funcţie de scopul urmarit. Exista metode care se aplica în mod curent si metode speciale, mai pretentioase si aplicate numai in anumite situatii.

Coloratia Gram se foloseste pentru diferentierea germenilor Gram pozitivi de cei Gram negativi din frotiurile efectuate din diferite tesuturi sau din culturi microbiene. Este o metoda de baza in practica bacteriologica. Ea consta in:

colorare cu solute de violet de Gentiana lo/0 timp de 1 minut varsarea colorantului de pe lama tratarea frotiului cu solutie Lugol timp de 2 minute decolarea cu amestec de alcool-acetona pâna cind ameste-

cul ce se scurge de pe lama nu mai este colorat spalare cu apa de robinet recolorare cu fucsina diluata 1/10 timp de 20—30 secunde spalare cu apa de robinet uscare examinarea la microscop.

Germenii Gram pozitivi vor aparea colorati in albastru-violet iar cei Gram negativi in rosu. Aceasta diferenta de colorare rezulta din faptul ca germenii Gram pozitivi fixeaza violetul de Gentiana in asa fel incit prin tratarea cu solutia de alcool-acetona nu se decoloreaza, in timp ce cei Gram negativi se decoloreaza si apar ca urmare colorari in rosu cu cel de al doi-lea colorant (fucsina diluata). Sporii bacterieni apar sub forma de vacuole.

Coloratia cu albastru de metilen (Loffler) - se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor intr-un material patologic, fara a-i dife rentia sub raportul afinitatii lor tinctoriale.

In acest scop se acopera frotiul fixat cu o solutie de albastru de metilen 3% şi, dupa 2—5 minute, se spala cu apa, se usuca, se examineaza. Germenii vor aparea colorati in albastru, uniform. Metoda permite si observarea unor particularitati morfologice cum ar fi prezenta capsulei si sporului. Capsula se coloreaza in roz-pal, iar sporul apare sub forma unei vacuole.

Coloraţia Ziehl—Neelsen - se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor acidorezistenti, care nu se coloreaza prin metodele obisnuite (mai ales micobacteriile):

acoperirea frotiului, in prealabil fixat la flacara, cu soluţie defucsina Ziehl

incalzirea la flacara pâna la aparitia vaporilor si mentinerea prinincalziri repetate timp de 5—10 minute (se va avea grija ca soluţia colo-ranta sa nu fiarba si sa se completeze in caz că s-a evaporat de pe anu-mite portiuni de frotiu)

varsarea colorantului decolorarea cu o solutie de acid sulfuric 1/4 sau acetic 1/3, timp

de cca 2 minute spalare cu apa tratare cu alcool absolut timp de 5 minute spalare cu apa recolorare cu solutie de albastru de metilen 1% timp de 2—3

minute spalare cu apa uscare si examinare cu imersie.

La examenul frotiurilor, germenii se pot prezenta coloraţi in roşu (acidorezistenti) sau in albastru (neacidorezistenti). Primii fixeaza fucsina Ziehl si nu se decoloreaza sub acţiunea acidului, in timp ce ceilalţi se decoloreaza sub influenza tratarii cu acid. Acidorezistenta rezida in structura chimica particulara a peretelui celular al germenilor, in sensul ca in cazul acidorezistenţilor acesta fiind bogat in substanţe lipoide impiedica patrunderea acidului decolorant ca dealtfel si a coloranţilor (fucsina patrunde datorita concentraţiei ridicate si a caldurii). Pentru acest motiv, germenii acidorezistenti nu sunt colorabili prin metode obisnuite.

Alte metode de colorare:

Coloratia Koster - se foloseste pentru colorarea brucelelor Metoda Koslovski - se foloseste pentru colorarea brucelelor; Metoda Tribondeau—Fontana - se foloseste pentru colorarea

leptospirelor Pentru colorarea capsulei bacteriene: coloraţia Giemsa,

metoda de colorare negativa a capsulei cu tus de China, etc.; Pentru colorarea sporilor: Metoda Moller, Metoda Pooman, Metoda

cu verde de malahit Pentru colorarea cililor - Metoda Casares—Gill

Determinarea bacteriilor din genul Salmonella

Metoda stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene din genul Salmonella în produsele cercetate, acestea fiind un pericol pentru sănătatea consumatorului în cazul consumului de alimente contaminate.

Metoda se aplică următoarelor produse:

- Lapte crud- Lapte praf- Produse lactate praf pentru copii- Produse lactate acide (iaurt, smântână fermentată, lapte bătut,

kefir, sana)- Iaurt cu fructe- Smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută- Brânzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (caş, telemea

proaspătă)- Brânzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (caş, telemea

proaspătă)- Brânză proaspătă din zer- Brânză maturată în saramură din lapte pasteurizat- Brânză maturată în saramură din lapte nepasteurizat- Brânză fermentată cu pastă tare (svaiţer), semitare (moeciu),

moale (Camembert, taga, nasal)- Brânzeturi cu pastă filată (caşcavaluri), afumate şi neafumate- Brânzeturi fermentate- Unt- Margarină de consum- Margarină cu lapte- Îngheţată, torturi de îngheţată- Praf de îngheţată- Lapte concentrat cu zahăr- creme vegetală (înlocuitori de frişcă)- Carne tocată şi semipreparate din carne tocată (hamburger,

pastă de mititei, cârnaţi proaspeţi etc.)- Preparate din carne sărate şi/sau afumate- Mezeluri (prospături, salamuri semiafumate)- Mâncăruri gătite congelate şi mâncăruri gătite, servite calde- Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregătite, care se

consumă reci, fără altă prelucrare (piftii, pateuri din carne şi organe, biftec)

- Produse crude (şniţel, caşcavaş pane)- Peşte proaspăt, decapitat şi eviscerat

- Produse semiconservate (marinate reci, marinate calde nepasteurizate, marinate calde pasteurizate, produse din icre şi din lapţi)

- Icre sărate- Salată de icre cu adaos de ulei- Peşte sărat- Peşte sărat cu ceapă- Peşte afumat la cald, peşte afumat la rece- Preparate culinare din peşte- Ouă umplute, salate cu maioneză- Gelatină alimentară- Prăjituri cu cremă- Torturi cu diferite creme, frişcă, fructe- Maioneză- Pulberi de maioneză (înlocuitori de maioneză)- Vegetale congelate- Vegetale deshidratate- Prafuri de budinci şi creme deshidratate, înlocuitori de frişcă- Paste făinoase (macaroane, fidea)- Paste făinoase cu umplutură (ciuperci, carne brânză)- Condimente şi amestecuri- Băuturi răcoritoare şi sucuri de fructe cu termen de valabilitate

mai mic de 14 zile- Pulberi pentru sucuri- Ape minerale şi carbogazoase, ghiaţă artificială- Bere nepasteurizată, filtrată şi nefiltrată- Bere pasteurizată- Făinuri alimentare altele decât făinuri pentru panificaţie (făină de

orez, orezin, fosfarin)- Produse de panificaţie cu umpluturi- Derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb, orez,

produse expandate)- Biscuiţi uscaţi şi biscuiţi glazuraţi- Biscuiţi, pateuri- Fursecuri, napolitane cu diferite creme- Cacao, pudră, ciocolată tablete, ciocolată cu adaos, bomboane

fine şi extrafine de ciocolată- Ciocolată umplută cu cremă- Specialităţi din ciocolată umplute cu cremă grasă sau de tip

fondant- Bomboane altele decât ciocolată- Jeleuri, rahat, gemuri, şerbeturi, dulceţuri, fructe confiate- Arome alimentare naturale sau sintetice- Emulsie pentru băuturi răcoritoare- Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne)- Oţet alimentar

- Ceai (plantă)- Borş- Cafea crudă prăjită şi instant- Melanj din ouă praf- Produse din grâu germinat- Fructe de mare refrigerate- Pepsină (pulbere în maestec cu sare)- sandviciuri, mâncăruri tip fast-food.

Documente de referinţă:- ISO 17025/2001- SR EN 12824/2001- ISO 6887/96

- ISO 7218

Principiul metodei:

Germenii din genul Salmonella pot fi prezenţi în număr mic şi sunt deseori însoţiţi de un număr mult mai mare de alte microorganisme din familia Enterobacteriaceae sau din alte familii. În consecinţă este necesară îmbogăţirea selectivă în plus deseori este necesară preîmbogăţirea pentru a evidenţia acei germeni Salmonella care au fost supuşi alterării.

Aparatură şi sticlărie folosită

- Termostat 35oC; 37o +-0,5oC; 42oC – aparat electric pentru

dezvoltarea microbiană

- Etuvă 160 – 180oC - asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă, porţelan, hârtie, vată, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute

- Autoclav - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute

- Lampă U.V. - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru

- Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei

- Sterilizator electric pentru instrumente

- Stomacher 1000 ml, pungi de material plastic pentru stomacher, turmix tip Atomix de înaltă turaţie (15-20.000 7/min), cu cupe sterilizabile

- Baie de apă reglabilă la temperatură 35oC sau 37oC, 45oC, 55oC şi 70oC

- Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm

- Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml

- Aparat pentru sterilizare uscată sau umedă ISO 7218

- Etuvă ventilată prin convecţie reglabilă la 37oC şi la 55oC

- pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la 25o C

- Anse bacteriologice cu bucla cu diam de 3 mm din platină-iridiu sau nichel-crom

- Eprubete de 16 x 160 mm sterile

- Flacoane pentru medii de cultură

- Eprubete cu diam de 8/160 mm

- Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml

- Mojar cu pistil, sterile

- Eprubete gradate

- Baloane erlenmayer cu capacitatea de 90, 150 şi 250 ml

Eşantionarea - este important ca laboratorul să primească un eşantion cu adevărat reprezentativ, nealterat sau modificat în timpul transportului sau depozitării în corelaţie cu standardul internaţional specific al produsului.

Reguli de procedură

- Modul de analiză, acceptare şi înregistrare a comenzilor – eşantioanele trebuie să fie etichetateşi iar procesul verbal de prelevare probe să conţină următoarele date:produsul recoltat, examenul cerut, locul prelevării, ziua şi data prelevării, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevării, cine a prelevat proba.

- Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute.

- Pregătirea eşantionului pentru analiză. Eşantionul se pregăteşte conform standardului internaţional specific al

produsului respective: lapte materie primă şi produse lactate – se cântăresc 25 g eşantion într-un balon Erlenmayer steril peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire (APT), lapte praf, zer dulce şi lactoză – se cântăresc 25 g eşantion într-un balon erlenmayer steril peste care se adaugă 225 g mediu de preîmbogăţire, brânza şi brânza topită – se cântăresc 25 g probă într-un mojar steril, se mojarează, se transferă într-un balon steril, peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire, untul – se cântăresc 25 g eşantion într-un balon erlenmayer steril, se încălzeşte într-o baie de apă la 45oC peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire. Alimentul cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici înainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc în mojar 25 g. Se mojarează, se transferă într-un balon erlenmayer steril peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire (ATP)

Acţiuni şi/sau măsuri preventive

Protecţia personalului

- Obligatorie purtarea halatului- Folosirea lampei de U.V. (înainte şi după însămânţare)- Folosirea hotei de însămânţare- Pipetele sunt prevăzute cu dop de vată nehidrofilă pentru a

preveni aspirarea accidentală a eşantionului- Flambarea ansei se face întâi la baza flăcării şi apoi la vârf

pentru a împiedica râspăndirea germenilor- Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante

Protecţia mijloacelor de încercare şi/sau măsurare

- Sticlăria sterilă se păstrează în dulapuri speciale- Sticlăria sterilă se foloseşte maxim 6 zile- Executarea periodică a serviciilor de întreţinere şi curăţire zilnică

a aparaturii- Verificarea şi înregistrarea temperaturii din încăperea de lucru

Modul de lucru

Pregătirea eşantionului pentru analiză - se efectuează conform standardului internaţional pentru produsul de analizat.

Însămânţare şi incubare

1. Faza de preîmbogăţire neselectivă.

Se cântăresc 25 g produs într-un balon erlenmayer steril peste care se adugă 225 ml mediu APT . Se incubează la temperatura de 35o 37oC timp de 16-20 h.

2. Faza de îmbogăţire selectivă

Din cultura obţinută conform 10.3.1. se trec 0,1 ml în 10 ml mediu RV şi 10 ml într-un flacon ce conţine 100 ml mediu SC. Se incubează cele două medii însămânţate după cum urmează:.

a) mediul RV însămânţat la temperatura de 42oC timp de 24 hb) mediul SC însămânţat la temperatura de 35o 37oC (conform

acordului)timp de 48 h

3. Izolare şi identificare.

Din cultura obţinută în mediu RV după 24 h de incubare cu o ansă bacteriologică se însămânţează suprafaţa primului mediu de însămânţare selectivă (ARFVB) în cutii Petri sterile. Se procedează la fel cu cel de-al doilea mediu de izolare selectivă (AMC) folosindu-se o altă prelevare cu ansa bacteriologică şi cutii Petri sterile de dimensiuni adecvate.Se incubează cele două medii selective însămânţate la temperatur de 35o 37oC timp de 24 h.

Din cultura obţinută în mediu SC, după 48 h incubare se repetă operaţiunile descrise mai sus.După 24 h incubare în ambele situaţii se examinează cutiile pentru a cerceta prezenţa coloniilor caracteristic de Salmonella.

Interpretare

Coloniile caracteristice de Salmonella dezvoltate pe mediu ARFVB provoacă virarea culorii mediului de la roz la roşu. Dacă dezvoltarea este slabă sau nu se evidenţiază coloniile caracteristice de Salmonella cutiile Petri însămânţate se incubează în continuare la temperatura de 35o 37oC (conform acordului) timp de 18-24 h.Se reexaminează cutiile Petri pentru a cerceta prezenţa coloniilor caracteristice de Salmonella.

Test de confirmare

Pentru confirmare, din fiecare cutie Petri din fiecare din cele două medii selective se recoltează câte 5 colonii considerate caracteristice sau suspecte. Dacă se găseşte o cutie cu mai puţin de 5 colonii caracteristice sau suspecte, se reţin toate coloniile caracteristice sau suspecte.Se striază coloniile selecţionate pe suprafaţa agarului nutritiv din cutii Petri în prealabil uscate astfel încât să se obţină o dezvoltare de colonii bine izolate. Se incubează cutiile astfel

însămânţate la temperatura de 35o 37oC, timp de 18-24 h. Pentru conformările biochimice şi serologice se utilizează culturi pure.

Confirmări biochimiceCu ajutorul ansei efilate se însămânţează mediile indicate de la până la

cu fiecare din culturile obţinute din coloniile reţinute1. Agar TSI Se însămânţează coloana agarului TSI prin striere, iar

panta prin trasare. Se incubează la temperatura de 35o 37oC timp de 24 h. Se interpretează modificările care se produc în mediu în modul următor:

Baza mediului – galbenă – glucoză pozitiv (fermentarea glucozei)- roşie sau nemodificată – glucoză negativ (lipsa fermentării

glucozei)- neagră – formare de hidrogen sulfurat- bule de gaz sau fisuri-formare de gaz din glucoză

Panta mediului – galbenă – lactoză şi/sau zaharoză pozitiv- roşie sau nemodificată lactoză şi zaharoză negativ (neutilizarea

lactozei şi a zaharozei

Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roşie) cu formare de gaz şi a unei baze acide (galbenă) cu formarea (90% din cazuri) hidrogenului sulfurat (înnegrirea agarului. Atunci când se izolează o Salmonella lactoză pozitiv panta agarului TSI este galbenă, În consecinţă o confirmare preliminară a culturilor de Salmonella nu trebuie să se bazeze doar pe rezultatele obţinute pe agarul TSI.

2. Agar cu uree.

Se însămânţează panta agarului în striuri. Se incubează la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h şi se examinează din când în când. În cazul reacţiei pozitive descompunerea ureei produce degajarea amoniacului, făcând să vireze roşu de fenol la roz apoi la roşu închis Reacţia este deseori vizibilă după 2 până la 4 h.

3. Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei

Se însămânţează mediul lichid sub suprafaţă. Se incubează la 35o sau 37oC timp de 24 h. O culoare violet apărută după incubare indică o reacţie pozitivă. O culoare galbenă indică o reacţie negativă.

4. Evidenţierea betagalactozidazei

Se dispersează o ansă din colonia suspectă într-o eprubetă ce conţine 0,25 ml soluţie salină, se adaugă o picătură de toluen şi se agită eprubeta. Se introduce eprubeta în baie de apă reglată la 35o sau 37oC (conform acordului) şi se lasă să stea câteva minute. Se adaugă 0,25 ml Reactiv pentru evidenţierea betagalactozidazei şi se amestecă. Se reintroduc eprubetele în baia de apă la

35o sau 37oC (conform acordului) şi se lasă 24 examinându-le din timp în timp. O culoare galbenă indică o reacţie pozitivă, deseori reacţia este vizibilă în 20 minute. În cazul folosirii discurilor de hârtie gata preparate se respectă instrucţiunile fabricantului.

5. Mediu pentru reacţia VP

Se dispersează o ansă din colonia suspectă într-o eprubetă conţinând 0,2 ml VP, se incubează la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. După incubare se adaugă 2 picături din soluţia de creatină, 3 picături din soluţia alcoolică de l-naftol şi apoi 2 picături din soluţia de hidroxid de potasiu agitând după adăugarea fiecărui reactiv. Formarea unei coloraţii roz până la roşu aprins într-un interval de 15 minute indică o reacţie pozitivă

6. Mediu pentru evidenţierea indolului

Se însămânţează o eprubetă ce conţine 5 ml mediu triptonă-triptofan cu colonia suspectă Se incubează la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. După incubare se adaugă 1 ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel roşu indică o reacţie pozitivă. Formarea unui inel galben brun indică o reacţie negativă.

Tabelul 1

Test1) Reacţie pozitivă sau negativă

Procentajul însămânţărilor de

Salmonella care prezintă reacţia2)

Glucoză,TSI (formare de acid)Glucoză, TSI (formare de gaz)

Lactoză, TSI

Zaharoză, TSI

Hidrigen Sulfurat, TSI

Descompunerea ureei

Decarboxilarea lizinei

Evidenţierea betagalactozidazei

Reacţia Voges Prostkauer

Evidenţierea Indolului

pozitiv +

pozitiv +

negativ –

negativ –

pozitiv +

negativ –

pozitiv +

negativ –

negativ –

negativ -

100

99,93)

99,24)

99,5

91,6

99,0

94,65)

98,54)

100

98,9

2) – Aceste procentaje indică doar faptul că toate speciile de Salmonella nu dau reacţii pozitive sau negative. Acest procentaj poate varia de la o ţară la alta şi de la un produs la altul3) – Salmonella typhi este anaerogenă (nu produce gaze în anaerobioză)

4) – Germeni Salmonella din subgenul 3(arizona) dau reacţie lactoză pozitiv sau negativ, dar sunt betagalactozidază pozitiv. Germenii Salmonella din subgenul 2 dau reacţie lactoză negativ, dar dau reacţia betagalactozidază pozitiv. Pentru studiul speciilor poate fi utilă efectuarea unor teste biochimice suplimentare.

5) – Salmonella paratyphi A este negativ

Confirmare serologică

Cercetarea prezenţei antigenelor O Vi sau H de Salmonella se efectuează prin aglutinare pe lamă cu seruri adecvate din colonii pure şi după eliminarea tulpinilor autoaglutinabile.

Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Se depune pe o lamă de sticlă curată o picătură de soluţie salină, se dispersează în această picătură o fracţiune din colonia de testat aşa fel încât să se obţină o suspensie omogenă şi tulbure prin mişcarea lamei timp de 30-60 secunde. Dacă bacteriile se adună în grămezi, tulpina este considerată autoaglutinabilă şi nu mai trebuie supusă examinărilor ulterioare. Examinarea se face cu ajutorul unei lupe pe fond negru

Evidenţierea antigenelor O. Dintr-o colonie pură cunoscută ca neaglutinabilă se procedează ca mai sus, dar în locul soluţiei saline se foloseşte o picătură de antiser O. Dacă se produce aglutinarea reacţia este considerată pozitivă. Se utilizează serurile poli şi monovalente unul după altul.

Evidenţierea antigenelor Vi. Se procedează ca mai sus utilizând o picătură de antiser Vi. Dacă se produce aglutinarea reacţia este pozitivă.

Evidenţierea antigenelor H. Se însămânţează un agar nutritiv semisolid cu o colinie pură neautoaglutinabilă, se incubează la 35o 37oC timp de 24 h, se utilizează această cultură pentru examenul antigenelor H procedâmd ca mai sus, dar folosind o picătură antiser H.Dacă se produce aglutinarea reacţia este considerată pozitivă.

Interpretarea reacţiilor biochimice şi serologice

Tabelul prezintă interpretrarea testelor de confirmare pe colonii selecţionate.

Reacţii biochimice

Autoaglutinare Reacţii serologice Interpretare

tipice

tipice

tipice

lipsa reacţiilor tipice

lipsa reacţiilor tipice

nu

nu

da

nu

nu

antigene O, Vi sau H pozitive

toate reacţiile negative

neefectuate

antigene O,Vi sau H pozitive

toate reacţiile negative

tulpini considerate ca fiind Salmonella

ar putea fi Salmonella

nu sunt considerate ca fiind Salmonella

Confirmare definitivă

Tulpinile considerate ca fiind Salmonella sau că ar putea fi Salmonella (a se vedea tabelul 2) se trimit la un centru agreat pentru identificarea germenilor din genul Salmonella, pentru determinarea definitivă a serotipului. Această expediere trebuie însoţită de toate informaţiile disponibile referitoare la tulpină (tulpini).

Exprimarea rezultatelor

În funcţie de rezultatele interpretării se indică prezenţa sau absenţa germenilor din genul Salmonella în x grame de probă de analizat.

Genul Salmonella

Salmonella este genul cel mai mare din familia Enterobacteriaceae, cuprinzand peste 2400 serotipuri. Datorita patogenitatii pe care membrii acestui gen o prezinta pentru om si faptulu ca ei contamineaza frecvent cele mai diverse produse alimentare, genul Salmonella prezinta interes deosebit pentru microbiologia alimentelor, in special a celor de origine animala.

Taxonomia genului Salmonella ramane incerta. Totusi, in prezent, pentru scopuri practice se foloseste clasificarea propusa de Popoff si Le Minor care admit existenta a doua specii: S.enterica si S.bongori. S.enterica include 6 subspecii diferentiate pe criterii enzimatice: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae si indica. S.bongori nu are subspecii.

S.enterica subspecia enterica este cea mai cuprinzatoare, incluzand 1435 serotipuri din cele 2435 descrise pana in 1997. Ea reprezinta peste 90 % din izolatele de la om si animalele cu sange cald. Celelalte subspecii, ca si S.bongori reprezinta un procent redus si se izoleaza mai ales de la pasari, animale cu sange rece si din mediul inconjurator, de unde pot contamina rareori omul si mamiferele.

Ponderea numerica a serotipurilor de Salmonella pe specii şi subspecii este redata in tabelul următor:

Specia Subspecia Numar de serotipuri

enterica Enterica 1435485943216911

bongori / 20TOTAL 2435

Bacteriile din acest gen au forma de bastonase sau cocobacili, de 2-3/0,6 microni, sunt acapsulogene, asporogene, Gram negative, mobile, cu exceptia unui serotip (S.gallinarum (pullorum)) sau a unor mutante imobile.

Se dezvolta bine pe mediile nutritive obisnuite cu pH in jur de 7,0, la temperatura de 37°C.

In bulionul nutritiv produce o turbiditate uniforma destul de evidenta, cu depozit neaderent. Pe suprafata agarului nutritiv formeaza colonii netede, cu diametrul de 2-4 mm la cele mai multe serotipuri sau de 1mm (colonii pitice) la cateva serotipuri (S.abortus equi, S.typhi si S.abortus ovis) , semitransparente, cu un usor reflex albastrui, fcarte puţin bombate, nepigmentate. Se dezvolta in medii in a caror compozitie intra diferite substante inhibitoare pentru bacteriile Gram pozitive, pentru bacteriile Gram negative ce nu apartin familiei Enter -obacteriaceae sau chiar pentru unii membrii ai acestei familii. Aceste substanţe sunt: bila, sarurile biliare, dezoxicolatul, verdele de briliant. sulfitul de bismut, selenitul, tetrationatul s.a. folosite pentru prepararea mediilor de imbogatire selectiva si de izolare a

salmonelelor din alimente sau alte produse, unde se afla in numar mic si in asociatie cu cantitati mult mai mari de alte organisme.

Salmonelele fermenteaza glucoza cu producere de gaze - (exceptii S.typhi si S. gallinarum care nu produc gaze) -, maltoza, manitolul si folosesc citratul ca unica sursa de carbon (exceptii: S.paratyphi A si unele tulpini de S.gallinarum). Produc hidrogen sulfurat (exceptii: S.paratyphi A, S.abortus equi, S.abortus ovis, S.cholerae suis si unele tulpini de S.typhi si S.gallinarum). Nu fermenteaza lactoza, nu produc indol, nu efaboreaza ureaza si gelatinaza.

Salmonelele sunt microorganisme sensibile la factorii de mediu. Temperaturile mai mari de 60°C le distrug in cateva minute. Adaugarea de trehaloza le mareste capacitatea de a se dezvolta la temperaturi inalte, datorita stabilizarii proteinei. Congelarea si decongelarea distrug o parte din celulele unei populatii. Un singur ciclu de congelare-decongelare reduce numarul celulelor vii dintr-o cultura in bulion cu 3-4 logaritmi, cultura sterilizandu-se dupa 4-5 asemenea cicluri. Distrugerea este cu atat mai accentuata cu cat congelarea se face mai lent si la temperaturi nu prea coborate (la - 7-10°C distrugerea este mai mare decat la -18 - -20°C). Salmonelele nu se multiplică la temperaturi mai mici de +8 - +10°C. Sunt relativ rezistente in mediu cu pH moderat acid, dar nu se inmultesc in medii cu pH mai mic de 4,5 - 5,0.

Sunt distruse relativ repede in mediul extern sub influenta luminii solare si a uscaciunii. Desinfectantele obisnuite le distrug in scurt timp. Persists timp indelungat pe alimentele depozitate in conditii obisnuite de pastrare.

Salmonelele se gasesc in tubul digestiv al omului sj animalelor bolnave trecute prin boala sau complet sanatoase. Starea de purtator de salmonele la om si animale este foarte frecventa, intereseaza cele mai diverse serotipuri şi constituie o veriga importanta in lantul epidemiologic al salmonelelor in natura. Bolnavii, ca si purtatorii sanatosi, contamineaza mediul exterior, solul, apa, furajele si alimentele.

Salmonelele işi exercita patogenitatea prin ambele mecanisme cunoscute la bacterii: virulenta si toxicitate. Invazia epiteliului intestinal de catre salmonele determina un aflux pronuntat de fagocite in peretele intestinal, ceea ce produce fenomene inflamatorii locale insotite de hipersecretie de mucus §i eliberarea de prostaglandine. Se blocheaza astfel retroresorbtia sodiului din lumenul intestinal ceea ce determina acumularea de lichid la acest nivel.

Virulenta reprezinta mecanismul major de agresiune a salmonelelor şi consta din capacitatea lor de a se ataşa, multiplica si invada peretele intestinal. Inflamatia peretelui sj acumularea lichidelui in intestin accelereaza peristaltismul intestinal şi aparitia crampelor. instalarea diareei s.i a varsaturilor.

Toxigenitatea salmonelelor este determinata de cele doua tipuri de toxine pe care ea le produc: exotoxine şi endotoxine.

Exotoxinele sunt reprezentate de enterotoxina si citotoxina. Enterotoxina este o termolabila de 90 - 110 kDa, cu configurate asemanatoare enterotoxinei LT de V.cholerae, dar determinata de alte gene codificante (cromosomale §i ice). Ea este constituita din doua subunitati: B cu care se fixeaza gangliozidul G84; din peretele celulei epiteliului intestinal si A care patrunde in celula s.i activeaza ciclaza. In acest mod se blocheaza mecanismele energetice ale celulei gazda, ca rezultat blocarea retroabsorbtiei Na+ din lumenul intestinal, acumularea de lichid şi diareea.

Endotoxinele salmonelice eliberate in urma fagocitarii bacteriei exercita rolul toxic prin lipopolizaharidele componente pe mai multe cai:

- activarea complementului ce are ca efect citoliza urmata de coagulariintravasculare si eliberarea de mediatori vaso-paralitici;- declansarea unor efecte citolitice in lant prin eliberarea TNF de catre macrofage sicelule epiteliale;- declansarea febrei prin factorii eliberati de macrofage.Datorita efectului toxic al endotoxinelor apar fenomenele clinice care variaza

ca de la sindromul febril caracteristic la coagularea intravasculara diseminata, in febra tifoida §i in cazurile grave de toxiinfectie alimentara (213).

Izolarea salmonelelor din cazurile septicemie este simpla şi consta in inocularea in nutritive obişnuite (bulion şi agar nutritiv inclinat) a unei picaturi de sange (bolnavi) sau fragmente de tesut din organe (splina, ficat) sau de maduva osoasa, recoltate de la cadavre in conditii stricte de asepsie. Dupa 24 ore incubare, culturile dezvoltate se testeaza direct prin cateva examene minimale, din care seroaglutinarea cu seruri specifice este cea mai importanta, reprezentand si mijloc de confirmare.

Izolarea salmonelelor din alimente sau diferite materiale patologice contaminate cu microflora de asociatie impune totdeauna faza de imbogajire selectiva şi strierea culturii. obtinute pe medii agarizate selective si indicatoare. Aceste operatiuni necesita timp indelungat pana la cunoaşterea rezultatelor, pentru scurtarea caruia s-au pus la punct matode rapide.

Controlul curent al alimentelor pentru detectarea salmonelelor se face conform metodelor stabilite de standarde, din care mentionam pe cea descrisa in SR/ISO/6579/1995

Preimbogatire: 25g (ml) proba + 225 ml pa peptonata tamponata, incubare 16 - 20 ore la 35° sau 37°C;

Imbogafire selectiva: a) 0,1 ml cultura obtinuta in faza de preimboga|ire + 10 ml mediu Rappaport Vasiliadis se incubeaza 24 ore la 42°C;

b) 10 ml cultura obtinuta in faza de preimbogatire + 100 ml bulion selenit-cistina se incubeaza 24 ore la 35°- 37°C;

Izolare pe medii selective agarizate: a) o ansa de cultura obtinuta in mediul Rappaport Vasiliadis se striaza pe agar cu rosu fenol si verde briliant Edel si Kampelmacher si se incubeaza 24 - 48 ore la 35°- 37°C;

b) o ansa de cultura obtinuta in bulionul

selenit-cistina se striaza pe al doilea agar selectiv de izolare (Istrati-Meitert, Leifson s.a.) si se incubeaza 24 - 48 ore la 35°- 37°C;

Identificare-confirmare: 5 colonii caracteristice din fiecare cutie cu agar selectiv se tree pe agar nutritiv inclinat care se incubeaza 18-24 ore la 35°- 37°C. Cultura obtinuta se supune testelor biochimice si serologice specifice §i se interpreteaza rezultatele obtinute.

In ultimul timp s-au pus la punct mai multe tehnici imunoenzimatice si de genetica moleculare, suficient de sensibile pentru detectarea salmonelelor in alimente (73, 236

Metoda se aplică următoarelor produse:

- Lapte crud- Lapte praf- Produse lactate praf pentru copii- Produse lactate acide (iaurt, smântână fermentată, lapte bătut,

kefir, sana)- Iaurt cu fructe- Smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută- Brânzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (caş, telemea

proaspătă)

- Brânzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (caş, telemea proaspătă)

- Brânză proaspătă din zer- Brânză maturată în saramură din lapte pasteurizat- Brânză maturată în saramură din lapte nepasteurizat- Brânză fermentată cu pastă tare (svaiţer), semitare (moeciu),

moale (Camembert, taga, nasal)