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Enzimas de restricción y electroforesis

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Enzimas de restricción

• Son endonucleasas específicas capaces de reconocer secuencias palindrómicas de DNA y cortar los enlaces fosfodiéster del material genético en un punto específico.

• Palindrómicas quiere decir que leen en direcciones opuestas el mismo orden de nucleótidos.

5’ G T T A A C 3’

3’ C A A T T G 5’

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Tipos de endonucleasas

• Endonucleasa Tipo I – corta lejos de la sucuencia que reconoce, ya sea río arriba o río abajo.

• Endonucleasa Tipo II – cortan dentro de la secuencia que reconocen.

• Endonucleasa Tipo III – cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen.

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Enzimas de restricción

• Son suceptibles a cambios en temperatura, pH, etc.• Estas enzimas se obtienen de células bacterianas.• El nombre de estas está dado según el género y la

especie de la bacteria de dónde se aisló por primera vez esta enzima.

• La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, la cuarta letra indica la cepa y el número al final indica el número de enzima que se ha aislado de esa cepa.

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Enzimas de restricción

• Por ejemplo:

EcoRI

• Otros ejemplos:– BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de

Bacillus amyloliquefaciens

– SmaI – la primera que se aisló de Serratia marcesens

– HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de Haemophilus influenzae

Escherichia(género)

coli(especie) cepa R

Primera enzima aisladade ese organismo.

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Tipos de corte • “Sticky” o pegajosos – es

más fácil para volver a ligarse los extremos.– Ejms.

• EcoRI

• Bam HI

• HindIII

• “Blunt” o abruptos– Ejm.

• SmaI

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Enzimas de restricción

• Las endonucleasas son de gran importancia para la ingeniería genética, ya que permiten desarrollar técnicas de clonación.

• Además, te permite realizar mapas de restricción y determinar si existe homología entre otras moléculas de DNA.

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Electroforesis

• Se define como el movimiento de partículas de carga bajo la influencia de un campo eléctrico a través de un medio semisólido.

• Este medio puede ser de agarosa o de poliacrilamida.

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Electroforesis• El DNA es de carga

negativa, por lo que las partículas migran del electrodo negativo (cátodo) al electrodo positivo (ánodo).

• Esta migración es inversamente proporcional al peso molecular de las muestras.

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Electroforesis

• Materiales necesarios para llevar a cabo una electroforesis:– Gel de agarosa –

generalmente se utiliza de 1% - 2% de agarosa.

– Cámara de electroforesis – contiene los electrodos

– “Power supply” – genera el campo eléctrico

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Electroforesis

– Amortiguador de electroforesis - usualmente TBE 1X; facilita la migración de DNA y mantiene una estabilidad

– Bromuro de etidio – compuesto carcinógeno que se entrecruza entre las moléculas de DNA y cuando se irradia con luz ultravioleta emite fluorescencia.

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Electroforesis

– “Loading dye” – compuesto que se añade a las muestras de DNA; contiene glicerol, que le da peso a la muestra y no permite que se salgan de la fosa, y bromofenol azul que tiñe la muestra de color azul y sirve como indicador de migración

– Lámpara de UV – permite ver las bandas generadas

– Cámara – para tomar una foto de la gel

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