ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

BIOL 3306 – LAB DE GENÉTICAJA CARDÉ, PHDUPR – AGUADILLA

OBJETIVOSAl completar esta presentación los estudiantes podrán:• Definir lo que son las enzimas de

restricción• Describir los criterios para su

nomenclatura• Explicar los factores que afectan

la actividad de estas.• Mencionar algunas aplicaciones

de importancia de estas.• Preparar una reacción de

digestión de DNA con enzimas de restricción

INTRODUCCIÓN:VECTORES• 70’s: se crean exitosamente las

primeras moléculas recombinantes

• Se ligan fragmentos de DNA de orígenes distintos

• Se logra introducir moléculas recombinantes dentro de células

• Una vez en célula huésped, • se replica • produce varias copias idénticas

del gene• se expresa• esto se le llama clonación.

INTRODUCCIÓN: VECTORES• Para clonar un gen la fuente para el gen

es el DNA cromosómico del organismo que lo tiene.

• Para hacerlo llegar al interior de la nueva célula hay que usar un vehículo o vector

• Los vectores comúnmente usados en experimentos de clonación derivan de plásmidos o de virus

• La mayoría son plásmidos, pequeños, circulares, naturales en algunas células, confieren fenotipos observables• Ori• Secuencias marcador• MCS

VECTOR

ENZIMAS• Proteínas• Aceleran reacciones químicas• Reducen la E de activación• E + S ES E + P• Ejemplos

• Proteasas• Lipasas• amilasas• Dehidrogenasas• Girasas• Ligasas• Peptidasas• NUCLEASAS

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN• Descubiertas 1970, Daniel Nathans• Cortan el enlace azucar-fosfato del

DNA, en ambas cadenas• Aisladas de bacterias, cientos• Función: mecanismo de defensa

de la bacteria contra DNA extraño (fagos)

• Sistema de restricción/modificación• Restricción/Metilación • Nombre, quien la produce• EcoRI – Escherichia coli (cepa RY13)• Hind II – Haemophilus influenzae• XhoI – Xanthomonas holcicola

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: PALINDROME?• Reconocen palíndrome,

específicas• Secuencia que lee lo mismo en

ambas cadenas, en orientación opuesta• 5’3’• 3’5’• 4, 6, 8 bp• 1/256bp, 1/4096bp• Isoesquisomeros • ambiguos-(Py-Pu)• DNA learning center

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Cortan el enlace fosfodiester• Blunts ends

• Enzima corta simétricamente, en sitios opuestos en ambas cadenas

• Sticky or cohesive ends• - enzima corta asimétricamente, un pedacito SS se extiende desde

el 5’ o desde el 3’

• 5’ overhangs

• 3’ overhangs

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Cuidados:• Caras, se venden por unidades

• Unidad: cantidad de enzima necesaria para digerir 1µg de DNA según las condiciones del fabricante

• Sensitivas al calor• -20oC o hielo siempre

• Contaminación cruzada• Pipeteo: punta nueva siempre!!!

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Reacción, mezclar y sedimentar bien.

• DNA: limpio de contaminantes: fenol, cloroformo, etanol o sales

• 1µg/µl de volumen (no mas)• Amortiguador: iones, sales, pH, distintos para cada

enzima• 10X 1X: dilución 1:10 con el volumen

• Enzima: de acuerdo al palíndrome o para averiguar si esta presente

• 1U/µg de DNA• Agua para completar volumen• Incubadora a 37oC por 30-60 minutos

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Factores que afectan la reacción:

• Composición del amortiguador• Fuerza iónica: [sales] y Na o K, pH (8)

• Temperatura de incubación• 37C, termofílicas a 50-65oC• Termolábiles, 25oC

• Metilación• Cepa de E coli, asegurarse de su actividad de

metilasas

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Aplicaciones

• Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector

• Cortar vector y cortar inserto• Mapas de restricción

• Determinar lugares de restriccion para enzimas en algun vector o en una secuencia a clonar

• Southern Blot• Detectar la presencia de un gen o una

secuencia dada en una mezcla de fragmentos de DNA cromosomal

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Aplicaciones

• Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector- cortar el vector

- cortar DNA fuente del inserto de interés

- mezclar y ligar

- transformar

- cultivar en medio de selección por el antibiótico

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Aplicaciones

• Mapas de restricción- aislar el vector

- incubar muestras de este con la enzima de interés o con combinaciones de estas

- analizar la reacción por electroforesis (fragmentos se separan por tamaños)

- comparar estos con un marcador y determinar sus

tamaños

- deducir (lógica) el mapa del vector

Tutorial

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Aplicaciones

• Southern Blot- Aislar genoma

- Cortar con enzimas

- Electroforesis

- Transferencia

- Incubar con sonda radioactiva

- Autoradiografía

- Cuantas copias hay en un genoma?

- Hay deleciones?

- Se parecen estos genes

- Zoo blot (parecido entre especies)

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Aplicaciones

• Southern Blot- Edward Southern -1975

cuantas copias de un gen hay en un genoma?

- detección de deleciones pequeñas (diagnostico clínico)

- identificación de familias de genes (varios genes derivados de uno común.

- identificar genes homólogos en distintas especies

- el gen de interés estará clonado para usarlo como sonda marcada para buscar en la mezcla de fragmentos por complementariedad

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• MaterialesMicrotubos

Micropipetas y puntas

Incubadora

Agua ultrapura

DNA a cortar (x ugs)

Buffer de la enzima de restricción

Enzima de restricción

Hielo

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Protocolo1. Analizar la reacción a realizar

2. Calcular los volúmenes a servir en la reacción de cada uno de los reactivos

3. Rotular 2 microtubos de 500µl o 1.5 ml, Control y: 1G, 1P, 2G, 2P, etc, según aplique.

4. Descongelar los reactivos a utilizar en la reacción

5. Cuidar que la enzima siempre este en hielo

6. Añadir en cada tubo, observando cuidadosamente que se mezclan, las cantidades correspondientes en el siguiente orden:

• Agua• Buffer• DNA• Enzima

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:• Protocolo7. Mezclar con finger-vortex

8. Centrifugar en la micro-centrifuga 30 seg

9. Incubar por 1 hora a 37oC

10. Guardar a -20oC

11. Analizar por electroforesis de agarosa.

• Ejemplo de ReacciónReactivo Conc Inicial Conc Final Vol (µl)Buffer 10X 1X 4

DNA 4µg/µl 0.5

Enzima 10U/µl 0.5

Agua 35

Total 40

PREGUNTASComo es mas específico para clonar un fragmento de DNA en un vector, con una o con dos enzimas? Porque? Mencione ventajas o desventajas de cada forma.

Si una enzima viene a 22000 U/ml, cuantos µl necesito para digerir 4 µg de DNA?

Porque las bacterias no digieren su propio DNA con sus enzimas de restricción?

Derive una formula para calcular cuantos fragmentos de DNA salen de una molécula de DNA cortada con una enzima de restricción, si la molécula es lineal vs si es circular?

REFERENCIASBrooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis & Principles. (Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc.

Alberts, et. Al, (2013). Essential Cell Biology, Garland Sciences Publishing, New York.

http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html

http://www.restrictionmapper.org/

http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/renzymes.html