UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE GRIGORE T. POPA IAI

FACULTATEA DE MEDICIN

CERCETRI PENTRU OPTIMIZAREA

DIAGNOSTICULUI, MANAGEMENTULUI I PROFILAXIEI BOLILOR CROMOZOMIALE

- Tez de doctorat (Rezumat)

Conductor tiinific Prof. univ. dr. COVIC Mircea

Doctorand ZANET (CABA) Lavinia

Iai 2013

Cuprins

INTRODUCERE: MOTIVATIA STUDIULUI DOCTORAL SI OBIECTIVE 3

1. BOLILE CROMOZOMIALE 5

1.1. Tipurile anomaliilor cromozomiale 5 1.2. Frecvena i cauzele anomaliilor cromozomiale 5 1.2.1. Frecvena anomaliilor cromozomiale 5 1.2.2. Cauzele i mecanismele de producere ale

aneuploidiilor 6 1.2.3. Cauzele anomaliilor cromozomiale de structur 7 1.3. Consecinele fenotipice ale anomaliilor cromozomiale 9

2. DIAGNOSTICUL CLINIC I CITOGENETIC AL BOLILOR CROMOZOMIALE 11

2.1. Diagnostic clinic 11 2.1.1. Semne comune bolilor cromozomiale 11 2.1.2. Scoruri de diagnostic n sindroamele cu

microdeleii 11 2.1.3. Dismorfia facial n sindroamele cu microdeleii 14 2.2. Diagnostic citogenetic 18 2.2.1. Tehnici de analiz cromozomial 18 2.2.2. Indicaii i strategii de diagnostic citogenetic 20

3. MANAGEMENTUL BOLILOR CROMOZOMIALE 25

3.1. Profilaxia bolilor cromozomiale 25 3.2. Sfatul genetic n bolile cromozomiale 25 3.2.1. Sfatul genetic n anomaliile cromozomiale

numerice 25 3.2.2. Sfatul genetic n anomaliile cromozomiale

structurale 26 3.3. Screening-ul prenatal n sindromul Down 27 3.4. Diagnostic prenatal 27 3.4.1. Indicaiile diagnosticului prenatal n bolile

cromozomiale 27 3.4.2. Tehnici curente de diagnostic prenatal 27 3.4.3. Tehnici speciale de diagnostic prenatal 33

4. LOTURI I METODE DE STUDIU 39

4.1. Loturi de studiu 39 4.2. Metode de studiu 40

5. DIAGNOSTICUL POSTNATAL AL BOLILOR CROMOZOMIALE 43

5.1. Analiza global a lotului investigat citogenetic postnat 43 5.1.1. Rezultate 43 5.1.2. Discuii 46 5.1.3. Concluzii 47 5.2. Studii citogenetice i epidemiologice n sindromul

Down 48 5.2.1. Loturi i metode de studiu 48 5.2.2. Rezultate 49 5.2.3. Discuii 57 5.2.4. Concluzii 62 5.3. Optimizarea diagnosticului clinic 63 5.3.1. Corelaii genotip-fenotip n cazurile de cromozomi

inelari autozomali 63 5.3.2. Variabilitatea fenotipic n sindromul Patau

(trisomia 13) 79 5.4. Optimizarea diagnosticului citogenetic 84 5.4.1. Optimizarea diagnosticului citogenetic prin

hibridizare fluorescent in situ n sindroamele cu microdeleii 84

5.4.2.. Optimizarea diagnosticului citogenetic prin hibridizare fluorescent in situ n cazuri cu anomalii cromozomiale incerte 88

5.5. Optimizarea profilaxiei n bolile cromozomiale 101 5.5.1. Sfatul genetic n aneuploidii autosomale 101 5.5.2. Sfatul genetic n aneuploidiile gonozomale 103 5.5.3. Sfatul genetic n anomaliile structurale echilibrate 105

6. DIAGNOSTICUL PRENATAL AL BOLILOR CROMOZOMIALE 124

6.1. Diagnostic prenatal invaziv 124 6.1.1. Loturi i metode de studiu 124 6.1.2. Rezultate 124

6.1.3. Discuii 131 6.1.4. Concluzii 133 6.2. Diagnostic prenatal neinvaziv 133 6.2.1. Lot i metode de studiu 134 6.2.2. Rezultate 139 6.2.3.Discuii 146 6.2.4. Concluzii 147 6.3. Dileme i controverse etice n diagnosticul prenatal

invaziv versus noninvaziv 147

7. DISCUII FINALE 151

CONCLUZII GENERALE 157

BIBLIOGRAFIE 159

ANEXA 1 LISTA LUCRARILOR PUBLICATE 173 Teza de doctorat cuprinde - 177 de pagini (partea general 35 pagini, partea personal 119 pagini); - 60 tabele - 57 figuri - 314 referine bibliografice - 1 anex - 3 articole tiinifice ISI i 1 articol B+ Not: prezentul rezumat red selectiv bibliografia i iconografia n text, respectnd numerotarea i cuprinsul din tez.

INTRODUCERE:

MOTIVAIA STUDIULUI DOCTORAL I OBIECTIVE Bolile cromozomiale sunt afeciuni produse prin anomalii

cromozomiale (de numr i de structur) neechilibrate (monosomii/trisomii, complete sau pariale) vizibile la microscopul optic (prin tehnici speciale), deci 4 Mb (Covic, 2011).

Frecvena global a anomaliilor cromozomiale este de aproximativ 1% nn vii (Covic, 2011); frecvena real la om este foarte probabil mai mare deoarece: (1) evaluarea actual se bazeaz pe tehnici clasice, iar cercetrile din ultimii ani au identificat (prin tehnici de citogenetic molecular) numeroase sindroame noi cu microdeleii/microduplicaii; (2) numeroi fetui cu anomalii cromozomiale neechilibrate sunt eliminai nainte de natere (50% din avorturile spontane; 10% din nou-nscuii mori) (Covic, 2011, Gorduza, 2007, Meza- Espinoza et al., 2008). Se poate conchide c anomaliile i bolile cromozomiale sunt relative frecvente.

Anomaliile cromozomiale produc modificri fenotipice diverse i deseori grave cu efecte majore (morbiditate i mortalitate ridicate; handicap cronic), ntr-o arie larg de specialiti medicale (pediatrie, psihiatrie, endocrinologie, obstetric i ginecologie etc). Aceasta justific interesul major pentru identificarea i optimizarea diagnosticului clinic i citogenetic.

Toate aceste date justific alegerea temei tezei de doctorat bolile cromozomiale sunt o problem de sntate public i justific principalele direcii de aciune: optimizarea diagnosticului clinic (pentru identificarea unor posibile afeciuni i orientarea spre utilizarea anumitor teste), perfecionarea mijloacelor de diagnostic citogenetic (n special prin tehnici moleculare) i mbuntirea managementului pacienilor diagnosticai cu boli cromozomiale i a familiilor lor (prin sfat genetic i diagnostic prenatal). Exist premize ca prin realizarea acestor obiective s se obin un spor de cunoatere n acest domeniu i o ameliorare a practicii medicale (n diferite specialiti).

1

Capitolul 5 DIAGNOSTICUL POSTNATAL AL BOLILOR

CROMOZOMIALE

5.1. Analiza global a lotului investigat citogenetic postnatal Analiza global a lotului de pacieni investigai postnatal are ca obiective stabilirea proporiilor diverselor anomalii decelate n lotul A i eventuale corelaii cu mecanismele de formare a anomaliilor.

5.1.1. Rezultate Analiza global a lotului A a artat c n categoria anomaliilor

cromozomiale identificate prin analiza cromozomial cea mai mare frecven au avut-o aneuploidiile 849 de cazuri (85,58%), restul fiind anomalii structurale echilibrate/neechilibrate.

Aneuploidiile autozomale au fost cele mai frecvente - 711 cazuri - 83,74% din totalul aneuploidiilor, iar dac ne raportm la numrul total de cazuri din lotul A acestea au reprezentat 71,67%. n cadrul aneuploidiilor autozomale procentele au fost direct proporionale cu sperana de via diferit n funcie de gravitatea anomaliilor congenitale: 672 cazuri de trisomie 21 (94,52%), trisomie 13 i 18 (cte 2,53% fiecare) i trisomie 8, 9, 22 - cte un caz (0,14%). Trisomiile omogene au fost mai frecvent observate dect trisomiile n mozaic: 644 cazuri (90,57%) versus 39 de cazuri (5,49%). De remarcat este i faptul c au fost trisomii evideniate doar n forma omogen (trisomia 18 i 22), sau doar n mozaic (trisomia 8, trisomia 9).

Aneuploidiile gonozomale reprezint doar 16,26% (138 de cazuri). Forma omogen este prioritar - 88 de cazuri (63,77%), mozaicurile reprezentnd restul de 36,23%. Mozaicurile de numr s-au ntlnit n 29 cazuri (21,01% din totalul aneuploidiilor gonozomale), iar mozaicurile de structur la 21 de pacieni (15,21%). Ca i fenotip, monosomia X (Sindromul Turner) a fost cea mai frecvent (63,04%), urmat de sindromul Klinefelter (28,98%), iar sindroamele cu poli X/poli Y au fost diagnosticate citogenetic n 11 cazuri (7,97%).

Anomaliile structurale neechilibrate (lot A.2.1) au fost diagnosticate n 72 de cazuri (7,25% din totalul anomaliilor cromozomiale). Frecvene egale n aceast categorie au fost observate pentru deleii i material suplimentar de origine necunoscut - cte 30 cazuri (41,67%), procente mai mici fiind nregistrate pentru cromozomi

2

inelari - 6 cazuri (8,34%), izocromozomi - 4 (5,55%) i duplicaii - 2 cazuri (2,77%).

Anomaliile de structur echilibrate (lot A.2.2) au fost evideniate la 71 de pacieni (7,16% din totalul cazurilor cu anomalii cromozomiale). Au fost diagnosticate citogenetic 39 cazuri de inversie (54,92%), 17 cazuri de translocaii reciproce (23,96%), 4 cazuri (5,64%) translocaii robertsoniene (translocaiile robertsoniene formele neechilibrate au fost incluse n lotul cu aneuploidii autozomale) i 10 cazuri de inserii (14,08%). Cele mai frecvente inversii au fost inversiile pericentrice de cromozom 9 - 33 cazuri (84,62%); alte inversii: cromozom 1 - 2 cazuri (5,13%), cromozom 10 - 1 caz (2,56%), cromozom 15 - 2 cazuri (5,13%) i cromozom 16 - 1 caz (2,56%).

Analiza global a lotului B a artat c efectuarea analizei MLPA+/FISH a nsemnat certificarea diagnosticului citogenetic n 26/187 cazuri (13,90%). Folosirea tehnicii FISH a confirmat diagnosticul prezumtiv clinic de sindrom cu microdeleie (velo-cardio-facial, Williams, Prader-Willi, Wolf Hirschorn) n 16/58 cazuri (27,58%). Testul MLPA s-a efectuat cu kituri diferite i a diagnosticat microdeleii n 20 de cazuri, o parte fiind confirmate prin testul FISH.

5.1.2. Discuii Lotul studiat este unul preselecionat pe baza

fenotipului/riscului de anomalie cromozomial derivat din anamneza familial, astfel c o comparaie ntre frecvenele anomaliilor cromozomiale diagnosticate citogenetic n lotul nostru i frecvenele din literatur (raportate la momentul naterii/prenatal) este inoportun.

n lotul studiat aneuploidiile au fost aproximativ de 6 ori mai frecvente dect anomaliile cromozomiale structurale - 85,58% versus 14,42% din totalul anomaliilor cromozomiale certificate prin diagnosticul citogenetic convenional. Aneuploidiile autozomale au o inciden de 1,4-2,09 la nou-nscui, iar cele gonozomale de 2,3-2,41 (Covic, 2011). n studiul nostru, cele autozomale au fost de circa cinci ori mai frecvente dect aneuploidiile gonozomale (83,74% versus 16,26%). Diferena mare dintre frecvena aneuploidiilor i cea a anomaliilor structurale poate fi explicat i prin mecanismul de formare n cazul aneuploidiilor ce are loc preponderent n meioz i este dependent de vrsta matern i este n concordan cu creterea vrstei materne la conceperea unui copil n societatea actual. Totodat aneuploidiile produc dezechilibre genetice cu efect fenotipic important

3

comparativ cu anomaliile structurale care pot exista n forma echilibrat i descoperirea lor este fortuit.

Exist diferene n ceea ce privete proporia de aneuploidii omogene i n mozaic n lotul aneuploidiilor autozomale i a celor gonozomale n sensul n care anomaliile de numr autozomale omogene sunt de aproximativ 18 ori mai frecvente dect cele n mozaic (90,57% versus 5,49%), dar n grupul anomaliilor gonozomale cele omogene sunt doar de circa 5 ori mai frecvente (63,77% fa de 12%). Aceste diferene se pot explica prin aceea c 94,52% din aneuploidiile autozomale sunt reprezentate de trisomia 21 (cea mai frecvent anomalie cromozomial - 1:769 nscui vii) (Gorduza et al., 2007), iar n cadrul acesteia n lotul nostru 90,77% sunt trisomii omogene rezultate printr-un mecanism de nedisjuncie cromatidian/cromozomial n meioz care are ca factor de risc vrsta matern avansat. Pentru trisomiile 18 i 13 (fiecare reprezentnd cte 2,53% din totalul aneuploidiilor autozomale) - 100%, respectiv 83,34% - sunt forme omogene.

Anomaliile structurale echilibrate (2,04-4,30 de nou-nscui) i neechilibrate (0,63-1,00 de nou-nscui) au avut ponderi sensibil egale raportat la totalul anomaliilor cromozomiale, respectiv 7,16% versus 7,25%. Dac ne raportm la proporia dintre anomaliile structurale echilibrate i neechilibrate la natere putem concluziona c un procent important din anomaliile echilibrate nu sunt diagnosticate cu mare probabilitate din cauza fenotipului normal sau neinvestigrii cazurilor cu risc de anomalie cromozomial neechilibrat din familia unui purttor de anomalie echilibrat/pacient cu anomalie neechilibrat sau neinvestigrii genetice n cazurile de sterilitate/infertilitate. n cadrul anomaliilor structurale echilibrate, mai mult de 50% au fost reprezentate de inversii, urmate de translocaii reciproce, inserii i translocaii robertsoniene. Dintre inversii (prezente la nou-nscui cu o frecven de 0,19-0,80) (Covic, 2011), inversia de cromozom 9, considerat polimorfism cromozomial, a avut o frecven de 3,32% din totalul anomaliilor cromozomiale.

Translocaiile reciproce, prezente la natere cu o inciden de 0,93-2,50 (Covic, 2011), au reprezentat n lotul nostru aproximativ un sfert din anomaliile de structur, iar din totalul anomaliilor cromozomiale decelate 1,71%. Translocaiile robertsoniene - inciden la nou-nscui de 0,91-1,23 (Covic, 2011) au fost prezente doar n 0,4% din cazurile cu anomalii cromozomiale.

4

Deleiile i materialul suplimentar de origine necunoscut au fost majoritare n cadrul anomaliilor cromozomiale neechilibrate (fiecare n proporie de 41,67%), iar din total au reprezentat 3,02%. Aceast frecven mai mare dect frecvena translocaiilor reciproce i a translocaiilor robertsoniene este n conformitate cu fenotipul modificat n trisomiile/monosomiile pariale corespondente materialului suplimentar/deleiilor pe de o parte i fenotipul normal n majoritatea cazurilor n cazul translocaiilor. Tehnicile de analiz molecular utilizate n laboratorul nostru au elucidat diagnosticul n 26 de cazuri (13,9%), dar la un procent important de 86,1% din pacienii din lotul B.2. nu a fost diagnosticat o anomalie cromozomial cu secvena de diagnostic citogenetic cariotip-MLPA+/FISH. n aceste cazuri ar fi necesare tehnici citogenetice cu rezoluie mai mare care ar putea mbunti rata de diagnosticare.

5.2. Studii citogenetice i epidemiologice n sindromul Down 5.2.1. Loturi i metode de studiu

Pacienii cu sindrom Down, analizai n acest studiu, au fost selecionai din baza de date a Laboratorului de Citogenetic a Centrului de Patologie Genetic (CPG) Iai, n perioada 2000-2012. Lotul 1 cuprinde 672 de pacieni, din toate judeele rii, la care prin analiza citogenetic s-a stabilit diagnosticul de trisomie 21. Analiza cromozomial s-a efectuat prin metode citogenetice standard cu marcaj G. Lotul 2 cuprinde 280 de pacieni diagnosticai citogenetic cu trisomie 21, nscui n perioada 1 ianuarie 2000 31 decembrie 2008 care au domiciliul ntr-unul din judeele Moldovei.

Obiectivele acestui studiu vizeaz trei aspecte principale: stabilirea frecvenei tipului citogenetic al trisomiei 21 i al riscului de recuren avnd n vedere c riscul de recuren este mai mare n trisomiile prin translocaie robertsonian, iar n aceste familii este necesar s se efectueze diagnostic prenatal la urmtoarele sarcini; urmrirea realizrii dezideratului precocitii diagnosticului citogenetic 0-1an i 1-4 ani; estimarea numrului de cazuri testate citogenetic versus numrul de cazuri estimate pe o anumit perioad de timp.

5.2.2. Rezultate Sex ratio la pacienii cu SD inclui n lotul de studiu a fost de

1,13:1. Analiza cromozomial tipuri de trisomie 21 a relevat

urmtoarele anomalii citogenetice n lotul studiat: trisomia 21 omogen - 610 cazuri (90,77%), trisomie 21 n mozaic - 36 de cazuri (5,36%) i

5

trisomie 21 prin translocaie robertsonian 21/alt acrocentric - 26 de cazuri (3,87%).

Din punct de vedere al tipului de cromozom acrocentric implicat n translocaia robertsonian analiza acestor cazuri a artat prezena translocatiei robertsoniene 13/21 n dou cazuri (0,3%), rob 14/21 n 15 cazuri (2,23%), rob 15/21 ntr-un caz (0,15%), rob 21/21 n 7 cazuri (1,04%) i rob 21/22 ntr-un caz (0,15%).

Analiza cazurilor de sindrom Down diagnosticate citogenetic (lot 1) pe ani a artat o medie anual de 50,92 ( 15,28) cu un minimum de 19 cazuri n anul 2000 i un maximum de 77 cazuri n anul 2009, diferenele fiind semnificativ statistic (p0,05). Analiza corelaiei dintre numrul de cazuri diagnosticate i anul diagnosticului arat diferene ntre judee. Astfel, pentru judeele Botoani, Suceava i Vrancea exist o corelaie pozitiv bun (r>0,5) i semnificativ statistic (p

10,43%) i Bacu, Botoani, Suceava i Vaslui (

5.3. Optimizarea diagnosticului clinic 5.3.1. Corelaii genotip-fenotip n cazurile de cromozomi inelari

autozomali Cazurile de cromozomi inelari autozomali analizate au fost

selecionate din dou laboratoare din Romnia: Laboratorul de citogenetic al Universitii de Medicin i Farmacie Grigore T. Popa Iai, Laboratorul de citogenetic Prof. Dr. Alfred Rusescu Institutul Naional al Mamei i Copilului Bucureti. Metodele folosite sunt reprezentate de analiza cromozomial cu marcaj G (la proband i genitori) i analiza fluorescence in situ hybridization (FISH).

5.3.1.2. Rezultate n 7328 cariotipuri efectuate n cele dou laboratoare au fost identificai 6 pacieni cu cromozomi inelari autozomali; anomalia este rar dar comparativ cu frecvena n populaie (1/30000-1/60000) este mai frecvent, deoarece loturile noastre sunt selecionate pe baza fenotipului anormal. Distribuia pe cromozomi a fost urmtoarea: 1 cromozom inelar de 5, 1 cromozom inelar de 13, 3 cromozomi inelari de 18 i unul de 21.

5.3.1.3. Discuii Fenotipul pacientului cu cromozom inelar 5 a fost sugestiv

pentru sindromul Cri-du-chat. Pacientul prezint asimetrie facial uoar i o anomalie unilateral a urechii (ureche dreapt malformat, mic, jos implantat) - criterii minimale de diagnostic pentru spectrul oculo-auriculo-vertebral (OAVS). Conform criteriilor stabilite de Tasse et al. pacienta asociaz cele dou entiti (Gorlin, 2001, Tasse et al., 2007), asociere descris anterior i sunt autori care sugereaz c unele gene de pe braul 5p ar fi implicate n patogenia OAVS (Choong et al., 2003, Dyggve et al., 1965, Ladekarl,1968, Neu et al, 1982). Defectele cardiace au fost raportate n OAVS n 5,0-58,0% din cazuri n diferite studii. Aceste tipuri de anomalii cardiace apar de asemenea n sindromul Cri-du-Chat i au fost frecvent asociate cu deleia prii distale de bra lung 5q i deleiile 5q35-5qter n cromozomii inelari (Basinko et al., 2012).

Lorentz et al. au fcut o clasificare a cazurilor cu cromozom inelar de 13 (Lorentz et al., 2002). Raportnd cazul 2 la clasificarea amintit, acesta poate fi ncadrat n grupul C (Gorduza et al., 2010). Prezena cromozomului dicentric poate fi explicat prin fenomenul de sister chromatid exchange la cromozomul inelar monocentric dup replicare. n acest caz cromozomul inelar dicentric 13 are

8

configuraie Tai Chi n corelaie cu mecanismul propus de Hoo et al. (Hoo et al., 2007).

Pentru cazurile de cromozom inelar 5 i 13, prezena liniei monosomice ca parte a mozaicismului dinamic influeneaz parial fenotipul, mai ales creterea (ambii pacieni au retard de cretere). Kosztolnyi a postulat c structura i comportamentul cromozomului inelar sunt responsabile de deficitul de cretere (Kosztolnyi, 1987). Predominana cromozomilor inelari de 18 (3/6 cazuri) nu este ntmpltoare dat fiind faptul ca deleia de 18q, 18p i cromozomul inelar de 18 sunt cele mai frecvente deleii autozomale (Stankiewicz et al., 2001). Fenotipul sindromului de cromozom inelar de 18 reunete cteva elemente principale: retard al dezvoltrii/ dizabilitate intelectual, semne faciale tipice, anomalii majore i probleme imunologice (Lo-Castro et al., 2011). Fenotipul n toate cele trei cazuri are semne specifice mai ales pentru sindromul 18q- i mai puin pentru 18p-. Stankiewicz et al. apreciaz c exist dou tipuri de cromozom inelar de 18 n concordan cu punctele de ruptur (Stankiewicz et al., 2001) Toate cele trei cazuri cu cromozom inelar 18 aparin celei de-a doua categorii. Cteva din semnele prezente la cele 3 cazuri analizate sunt n concordan cu regiunile hrii fenotipice revizuite de Feenstra (Feenstra et al., 2007). Lipsa unei linii diploide normale sugereaz c inelarul de 18 s-a format n meioz.

Cromozomul inelar de 21 a fost citat n dou forme: de novo sau motenit. Cazul analizat se ncadreaz n tipul II descris de Grouchy i Turleau (de Grouchy, 1984) corespondente pierderea regiunii 21q22.3 sau o parte din aceasta n procesul de formare a cromozomului inelar.

5.3.2. Variabilitatea fenotipic n sindromul Patau (trisomia 13)

Sindromul Patau este determinat de trisomia 13 (Patau et al, 1960) care produce un sindrom plurimalformativ ale crui semne cardinale sunt despictura labio-palatin, microftalmia/anoftalmia i polidactilia postaxial.

Obiectivul studiului nostru a fost analiza variabilitii fenotipice pentru identificarea semnelor clinice care impun analiza cromozomial n scopul unui diagnostic corect i sfat genetic adecvat.

5.3.2.1. Lot i metode de studiu Studiul nostru a fost un studiu retrospectiv clinic i citogenetic

efectuat pe un lot format din 14 cazuri de sindrom Patau, confirmate

9

citogenetic i investigate n Centrul de Patologie Genetic Iai, n perioada 2000 - 2012.

5.3.2.2. Rezultate Am identificat trei cazuri diagnosticate postmortem (2 avortoni

i un nou-nscut mort) i 11 cazuri diagnosticate n perioada neonatal. Majoritatea cazurilor au fost de sex feminin, sex ratio fiind : : = 10 :4. Diagnosticul clinic a fost confirmat de analiza cromozomial.

5.3.2.3.Discuii n cazul studiului nostru am gsit un sex ratio : = 2,5,

aspect care este discordant n raport cu majoritatea studiilor de literatur (Alberman et al., 2012, Huether et al., 1996, Bugge et al., 2007), explicaia posibil fiind dimensiunea mic a lotului. Dintre anomaliile congenitale ce pot fi gsite n sindromul Patau, cele mai grave sunt cele ale sistemului nervos central. Dintre acestea se remarc n special holoprozencefalia (HPE) care n lotul nostru a fost prezent n 4/14 cazuri (28,57%). Conform lui Cassidy prezena HPE este un element de prognostic negativ n trisomia 13 (Cassidy, 2010) - HPE a fost evideniat la cei doi avortoni, la nou-nscutul mort i la un pacient decedat n perioada neonatal. n lotul studiat, microftalmia/anoftalmia au fost depistate la 50% din cazuri, aspect concordant cu datele de literatur (Firth, 2005, Morrison et al., 2002). Prezena polidactiliei n sindromul Patau reprezint unul din elementele cheie de diagnostic, fiind descoperit n 60-70% din cazuri (Firth, 2005). n lotul nostru, polidactilia a fost prezent la jumtate din pacieni. Anomaliile cardiace reprezint un element caracteristic trisomiei 13, fiind prezente la 80% dintre pacieni (Cassidy, 2010, Firth, 2005), situaie similar i n lotul studiat - 71,42% din cazuri (10/14).

Despicturile labiale i labio-palatine izolate sunt anomalii frecvente n sindromul Patau - 60-70% din cazuri (Stoll et al., 1991, Milerad et al., 1997), iar n lotul de studiu 42,85%. La 6 din cei 14 pacieni a fost prezent cutis aplasia. Anomaliile nazale au fost ntlnite la 71,42% din cazuri i anomaliile urechii la 78,57%.

5.4. Optimizarea diagnosticului citogenetic

5.4.1. Optimizarea diagnosticului citogenetic prin hibridizare fluorescent in situ n sindroamele cu microdeleii

Sindroamele de microdeleie/microduplicaie se produc prin

pierderea/ctigul unor fragmente cromozomiale mici (1-4 Mb),

10

existnd posibilitatea deteciei lor doar prin FISH i microreele-CGH. Selecia cazurilor pentru testul FISH se face folosind scoruri de diagnostic clinic i necesit o selecie riguroas.

Obiectivele acestui studiu sunt stabilirea ratei de diagnosticare prin FISH a sindroamelor cu microdeleii Velo-cardio-facial (VCF), Williams (WS), Prader-Willi (PWS), Wolf-Hirschorn (WHS) i compararea cu datele de literatur.

5.4.1.1. Lot i metode de studiu n lotul studiat am identificat 58 de cazuri la care s-a efectuat

analiza FISH n perioada 2000-2012 n laboratorul nostru pentru diagnosticul unor sindroame cu microdeleii: 33 cazuri Velo-cardio-facial, 12 cazuri Williams, 8 cazuri Prader-Willi, 5 cazuri Wolf-Hirschorn.

5.4.1.2. Rezultate Diagnosticul s-a confirmat n 9/33 cazuri (27,3%) cazuri din

sublotul pacienilor testai pentru sindrom VCF. Dintre pacienii testai pentru sindrom Williams, microdeleia 7q11 a fost confirmat la 5/12 (41,7%). Diagnosticul de sindrom Prader-Willi a fost confirmat la 2/8 (25%) dintre pacienii testai pentru microdeleia 15q11-13. n lotul pacienilor cu sindrom Wolf-Hirschhorn nu a fost confirmat deleia la nici unul dintre cazuri.

5.4.1.3. Discuii Rata de detecie prin FISH a deleiilor n regiunea critic pentru

VCF este de aproximativ 95%, cele dou sonde comerciale TUPLE1 i N25 fiind echivalente ca i rat de detecie. Deleia cea mai frecvent care se ntlnete la 85% din pacieni include intervalul dintre regiunile de duplicaie segmental A i D, restul de 15% fiind deleii atipice. Sondele TUPLE1 i N25 sunt situate n regiunea dintre duplicaiile segmentale A i B, iar 34% dintre deleiile atipice nu includ segmentul dintre regiunile A i B (GeneReviews ).

n patogenia sindromului Prader-Willi sunt implicate i alte mecanisme n afar de deleia regiunii critice i rezultatul negativ la testul FISH poate s fie un rezultat fals negativ pentru diagnosticul final, de aceea se impune efectuarea celorlaltor teste pentru analiza complet, n scopul verificrii disomiei uniparentale, defectelor centrului de amprentare. Aproximativ 70% din indivizii cu PWS au o deleie ce implic regiunea 15q11.q13, astfel c proporia cazurilor detectate prin FISH este de 65-75%. Dac deleiile sunt mici/atipice

11

atunci testul FISH poate fi fals negativ. Rat de detecie foarte bun (99%) au analizele de metilare i MS-MLPA.

Deleia regiunii critice pentru sindromul Williams-Beuren are aproximativ 1,55 Mb la 95% din pacieni i 1,84 Mb la 5% din pacieni (Bayes et al., 2003). n lotul studiat remarcm o rat de detecie pentru sindromul Williams de aproape 50% (5/12 cazuri 41,7%) ceea ce dovedete o folosire mai puin riguroas a scorurilor de diagnostic clinic pentru selecia cazurilor n vederea testelor de citogenetic molecular.

n sindromul WHS 55% dintre pacieni au o deleie pur identificabil prin analiz cromozomial convenional cu marcaj G sau FISH, 40-45% au o translocaie neechilibrat soldat cu deleia segmentului distal 4p i restul sunt rearanjri cromozomiale complexe (South et al., 2008). Testul FISH detecteaz 95% din cazurile de WHS cu sonde pentru regiunea critic WHSCR. Dac proba hibridizeaz n afara regiunii critice atunci rezultatul este fals negativ. Rata de diagnosticare zero obinut n lotul nostru poate nsemna un diagnostic prezumtiv clinic greit, dar i o rearanjare cromozomial nedetectat prin analiza cromozomial convenional sau un rezultat fals negativ prin hibridarea necorespunztoare a probelor.

5.4.2. Optimizarea diagnosticului citogenetic prin hibridizare fluorescent in situ n cazuri cu anomalii cromozomiale incerte

Hibridizarea fluorescent in situ implic hibridarea unei sonde marcat fluorescent cu segmentul cromozomial int. Sondele utilizate fiind sonde centromerice specifice unui cromozom, specifice de locus sau telomerice, analiza poate fi utilizat complementar analizei cromozomiale convenionale cu/fr alte teste pentru elucidarea unor cazuri incerte.

5.4.2.1. Lot i metode de studiu n acest lot am inclus un numr de 14 cazuri la care s-a efectuat testul FISH cu diverse sonde n scopul precizrii diagnosticului citogenetic n cazuri cu anomalii cromozomiale incerte.

Rezultate i discuii n dou cazuri a fost confirmat translocaia reciproc 5/21,

respectiv 5/22, n 3 cazuri a fost infirmat trisomia 21 i ntr-un caz sindromul dublu Y, iar n dou situaii a fost confirmat trisomia 21, n 3 cazuri a fost confirmat cromozomul inelar de X i ntr-un caz duplicaia cu inversie a cromozomului 21. De asemenea testul FISH a adus beneficii diagnostice n dou cazuri de stri intersexuale.

12

5.5. Optimizarea profilaxiei n bolile cromozomiale Sfatul genetic este parte integrant a consultului genetic. Sfatul

genetic n aneuploidii cu estimarea riscului de recuren presupune cunoaterea formei de anomalie cromozomial (omogen, mozaic, prin translocaie) i n cazul anomaliilor structurale suplimentar stabilirea caracterului motenit (sexul printelui)/de novo. Loturile de studiu

Loturile de studiu au cuprins: 711 aneuploidii autozomale, 138 aneuploidii gonozomale, anomalii structurale echilibrate (17 translocaii reciproce, 4 translocatii robertsoniene, 39 cazuri de inversie i 10 cazuri de inserii). Rezultate i discuii:

Riscurile de recuren n aneuploidii au variat de la 0,1% la 100% fiind dependente de vrsta matern i tipul de anomalie, precum i caracterul motenit/de novo al anomaliilor structurale, dar n toate cazurile se impune diagnosticul prenatal la urmtoarele sarcini. Acelai management trebuie aplicat i n cazul purttorilor de translocaii reciproce (calculul teoretic/la caz folosind raportarea la HAL haploid autosomal length) a artat c n cazurile din lotul de studiu poten a artat c n cazurile din lotul de studiu poteialii urmai pot fi viabili, unii cu anomalii congenitale. O anomalie aparte sunt inversiile cu risc mic de apariie a urmailor dezechilibrai genetic, dar trebuie identificate aceste cazuri si supuse diagnosticului prenatal prin analiz cromozomial.

Capitolul 6

DIAGNOSTICUL PRENATAL AL BOLILOR CROMOZOMIALE

6.1. Diagnostic prenatal invaziv Metodele clasice de diagnostic prenatal presupun analiza

cromozomial fetal. Principalul avantaj al metodei este acurateea, tehnica permind detecia cvasitotal a anomaliilor cromozomiale, iar dezavantajul primordial este timpul lung de 10-14 zile, impus de cultura celular (Faas et al, 2011, Shaffer, Bui, 2007) precum i riscurile globale (avort, hemoragie, malformaii) (Covic, 2011, Evans, Wapner, 2005, Gekas et al, 2011, Gorduza, 2007). Testele de citogenetic molecular permit analiza direct a celulelor, sunt rapide, dar detecteaz intit doar

13

anumii cromozomi sau regiuni cromozomiale, fiind imposibil identificarea tuturor anomaliilor.

Obiectivele acestui studiu au fost identificarea motivaiilor realizrii diagnosticului prenatal n corelaie cu anomaliile cromozomiale decelate i identificarea unor probleme de diagnostic prenatal i managementul acestora.

6.1.1. Loturi i metode de studiu Lotul C este format din 359 de cazuri la care s-a efectuat

diagnostic prenatal invaziv n perioada ianuarie 2012-februarie 2013 n Laboratorul de Diagnostic Prenatal din cadrul Spitalului Clinic de Obstetric- Ginecologie Cuza Vod Iai i laboratorul privat Cytogenis din Iai. A fost mprit n: sublotul C.1 (pacienii la care s-a fcut diagnostic prenatal (DP) prin FISH 279 de cazuri), sublotul C.2 (DP s-a fcut prin FISH i analiza cromozomial fetal 46 de cazuri) i sublotul C.3 (DP s-a realizat doar prin analiza cromozomial fetal 34 de cazuri).

6.1.2. Rezultate Motivaiile efecturii diagnosticului prenatal n lotul C.1. au fost sintetizate n figura 6.1.

729 34

1 4 12 7

3646 58

35

100

10

20

30

40

50

60

Num

ar d

e ca

zuri

TTP+

DTP

TTP

+VM

A

DTP

+VM

A

TTP+

Eco

DTP+

Eco

VMA+

Eco

3 co

nditi

i

TTP

DTP

VMA

ECO

alte

Motivatia diagnostica

Fig. 6.1. Motivaiile efecturii diagnosticului prenatal n sublotul

C.1. n 11 cazuri (3,94%) s-au diagnosticat aneuploidii la ft. Acestea au fost reprezentate de: trisomie 21 (6 cazuri, dintre care 5 cazuri de trisomie omogen i un caz de trisomie n mozaic), monosomie X (3 cazuri), trisomie 18 (1 caz), trisomie XXY (1 caz).

n sublotul C.2. motivaiile efecturii diagnosticului prenatal au fost redate n figura 6.3.

14

1 14

0 0 1 05

9 1012

30

2

4

6

8

10

12

Num

ar d

e ca

zuri

TTP+

DTP

TTP+

VMA

DTP

+VM

A

TTP+

Eco

DTP

+Eco

VMA

+Eco

3 co

nditi

i

TTP

DTP

VMA

ECO

alte

Motivatia diagnostica

Fig. 6.3. Motivaia diagnostic n lotul C.2.

A fost decelat o singur anomalie cromozomial ntr-un caz n care diagnosticul prenatal s-a efectuat din cauza existenei n antecedente a unui copil cu trisomie 21. Anomalia decelat a fost reprezentat de o translocaie robertsonian ntre cromozomii 13 i 14 i prezena unui cromozom marker: 46,XX,der(13;14)(q10;q10),+mar ce a impus investigaii suplimentare.

n sublotul C.3 DP s-a efectuat pentru motivaiile prezentate n figura 6.4.

02

5

0 0 1 1

73

85

2012345678

Num

ar d

e ca

zuri

TTP+

DTP

TTP+

VMA

DTP

+VM

A

TTP+

Eco

DTP

+Eco

VMA

+Eco

3 co

nditi

i

TTP

DTP

VMA

ECO

alte

Motivatia diagnostica

Fig. 6.4. Motivatia diagnostic n lotul C.3.

Anomaliile cromozomiale decelate n lotul C.3. au fost reprezentate de trei aneuploidii (trisomie 21, trisomie 18 i monosomie X) i dou cazuri de anomalii structurale echilibrate (translocaii reciproce) - 46,XX,der(5)t(1;5)(q32;p15.3) i 46,XX,t(5;8)(p15.3;q21.2).

6.1.3. Discuii Anomaliile ecografice decelate n lotul C au valoare

diagnostic diferit pentru anomaliile cromozomiale. Chistul de plex coroid a fost prezent n 17 cazuri n lotul C.1.,

n 8 cazuri n C.2. si ntr-un singur caz n C.3 (n total la 26 cazuri ceea ce reprezint 7,24%) . Chistul de plex coroid este un marker uor

15

sugestiv pentru trisomia 18, dar nu i pentru trisomia 21 sau fei normali (Walkinshaw, 2000, DiPietro et al., 2011). n nici unul din cazurile la care s-a decelat ecografic chist de plex coroid nu s-a evideniat o anomalie cromozomial.

Pliul nucal patologic a fost ntlnit n 7 de cazuri din lotul C (1,94%). Creterea translucenei nucale este un marker ecografic minor care are sensibilitate mare n detecia aneuploidiilor mai ales n primul semestru de sarcin, fr a fi ns specific pentru trisomia 21. Studii recente arat faptul c aproximativ 90% din feii cu trisomie 18 prezint n primul trimestru pliu nucal patologic (Sepulveda et al., 2010). n lotul studiat la 2/7 fei cu pliu nucal patologic s-au evideniat trisomii autozomale (trisomie 21 i trisomie 18), fapt concordant cu datele de literatur. Asocierea pliului nucal patologic cu analiza fraciunii libere a gonadotrofinei corionice umane (hCG) i proteina plasmatic asociata sarcinii (PAPP-A) crete rata de detecie la 90% pentru trisomia 21, 100% pentru trisomia 13/18 (Spencer, 2007).

Scurtarea femurului i a humerusului, ventriculomegalia, higroma chistic, intestinal hiperecogen au fost anomalii ecografice care nu s-au asociat cu anomalii cromozomiale n lotul C.

Hidropsul fetal are etiologie cromozomial (monosomie X, trisomie 21, triploidie sau rearanjri cromozomiale) n 13,2% din cazuri. n lotul studiat a fost identificat 1 caz cu hidrops fetal i la care prin testul FISH s-a stabilit diagnosticul de monosomie X.

Osul nazal hipoplazic/absent este un marker ecografic semnificativ n sensul n care se ntlnete cu frecvene mari n aneuploidii 70% n trisomia 21, 55% n trisomia 18 i 34% n trisomia 13 (Covic, 2011). Din cele dou cazuri la care aceast anomalie a fost evideniat ecografic ntr-un caz testul FISH a evideniat o trisomie 21.

Anomaliile cardiace izolate sau asociate cu alte anomalii denot o probabilitate de 9% ca ftul s aib o anomalie cromozomial, iar dintre acestea anomaliile de duct venos sunt markeri ecografici semnificativi decelai n 3 cazuri, iar ntr-un caz au fost asociate cu trisomia 21 la ft.

Vrsta matern avansat crete riscul pentru infertilitate, avorturi spontane, aneuploidii, gemeni dizigoi (Firth, 2008). n lotul C, vrsta matern avansat izolat a fost motivaie de diagnostic n 77 de cazuri, dar doar n 3 cazuri s-a asociat cu aneuploidii (dou cazuri de trisomie 21 i un caz de trisomie XXY). Asocierea cu alte motivaii diagnostice crete riscul de detecie a anomaliilor, situaie evideniat i

16

n lotul nostru: din cele 14 cazuri de aneuploidii decelate, n 5 cazuri motivaia diagnostic a fost vrsta matern avansat asociat cu anomalii ecografice/teste de screening biochimic modificate.

Testele de screening biochimic, dei constituie motivaie diagnostic important, nu deceleaz cu sensibilitate mare sarcinile cu anomalii cromozomiale. La nici un pacient din cei 106 de pacieni cu valori modificate la triplu/dublu test nu a fost decelat aneuploidie. Asocierea cu vrsta matern a crescut rata de detecie n sensul n care la 2/14 sarcini cu aneuploidii, diagnosticul prenatal s-a efectuat datorit testelor de screening biochimic modificate i a vrstei materne avansate.

6.2. Diagnostic prenatal neinvaziv:Studiu privind cuantificarea ADN-ului fetal metilat - o nou abordare n diagnosticul prenatal

neinvaziv al trisomiei 21 6.2.1. Lot i metode de studiu

Studiul a fost efectuat n cadrul grantului intern 28210/16.12.2011 al Universitii de Medicin i Farmacie Grigore T. Popa Iai - Cuantificarea ADN-ului fetal metilat o nou abordare n diagnosticul prenatal neinvaziv al trisomiei 21. Lotul de studiu este alctuit din 12 gravide investigate n perioada 1 ianuarie 2012 30 noiembrie 2012. Criteriile de includere n studiu au fost: gravidele au acceptat s participe la studiu i au semnat un consimmnt informat (avizat de Comisia de Bioetic a UMF Grigore T. Popa Iai) dup acordarea sfatului genetic, s-a efectuat diagnostic prenatal prin tehnica FISH/analiza cromozomial (metoda de obinere a materialului fetal fiind una invaziv - amniocenteza). Metoda folosit pentru diagnostic prenatal neinvaziv a fost cea stabilit de Papageorgiou et al (Papageorgiou 2011). Protocolul de lucru are 6 etape: extracia ADN-ului total (matern i fetal), fragmentarea ADN-ului, imunoprecipitarea ADN-ului metilat, splare, izolarea ADN-ului i qPCR pentru ADN-ul imunoprecipitat. Pentru evalurea rezultatelor au fost calculai urmtorii parametri: CT, CT normalizat, valoarea fraciei per prob i valoarea fraciei per DMR, valoarea de discriminare D. Pentru a evidenia mai bine rezultatele obinute am realizat fig. 6.10, care reflect reprezentarea grafic a valorii D pentru cele 10 cazuri pe care le-am luat n considerare. Toate sarcinile cu fei fr trisomie 21 au fost corect identificate prin obinerea unei valori de discriminare negativ, valoarea lui D variind ntre -1,74 i -6,32.

17

n cinci din cele 6 probe cu trisomie 21 luate n calcul n analiza final, a existat o concordan ntre prezena trisomiei i valoare pozitiv a factorului D: proba 2 - D = 1,56; proba 3 - D = 1,41; proba 4 - D = 12,40; proba 5 - D = 0,34, proba 11 - D = 1,02. Singurul caz la care am identificat valori negative ale factorului D a fost proba 6 - D = -2,96, aspect discordant n raport cu prezena trisomiei.

Fig. 6.10. Reprezentarea grafic a valorilor factorului D pentru cele 10

cazuri analizate

Toate sarcinile cu fei fr trisomie 21 au fost corect identificate prin obinerea unei valori de discriminare negativ, valoarea lui D variind ntre -1,74 i -6,32.

n cinci din cele 6 probe cu trisomie 21 luate n calcul n analiza final, a existat o concordan ntre prezena trisomiei i valoare pozitiv a factorului D: proba 2 - D = 1,56; proba 3 - D = 1,41; proba 4 - D = 12,40; proba 5 - D = 0,34, proba 11 - D = 1,02. Singurul caz la care am identificat valori negative ale factorului D a fost proba 6 - D = -2,96, aspect discordant n raport cu prezena trisomiei.

6.2.3.Discuii Testele fcute de noi au permis, cu excepia unui caz, obinerea

unei concordane ntre rezultatele diagnosticului prenatal clasic (aplicat prin tehnica FISH pe amniocite n interfaz/cariotip fetal) i cele furnizate de tehnica de detecie a diferenelor de metilare ntre ADN-ul fetal i cel matern. Astfel pentru toate cazurile la care diagnosticul prenatal a indicat absena trisomiei 21, metoda descrisa de Papageorgoiu a furnizat valori negative concordante cu prezena a doi cromozomi 21. Referitor la cazurile de trisomie 21 detectate prenatal prin metoda FISH, menionm c, exceptnd un singur caz (proba 6, fig. 6.10), valorile obinute de noi sunt pozitive, aspect ce poate fi corelat cu

18

excesul de ADN fetal hipermetilat, datorit existenei a 3 cromozomi 21.

Studiul efectuat a indicat c metoda folosit ar putea avea valoare practic, permind discriminarea ntre o sarcin normal i una patologic, caracterizat de prezena trisomiei 21. Aceste date sunt concordante cu cele prezentate de Papageorgiu et al. (Papageorgiou et al, 2011, Papageorgiou et al, 2012). Dei studiul a fost limitat, fiind bazat pe doar ase cazuri de trisomie 21 i patru cazuri de euploidie, putem sublinia dou aspecte pozitive. n primul rnd la toate sarcinile fr ft cu trisomie 21, valorile factorului D obinute au fost negative, aspect ce sugereaz absena rezultatelor fals pozitive (specificitate de 100%). Pe de alt parte, din ase cazuri de trisomie 21, n cinci situaii am obinut valori pozitive ale factorului D, aspect concordant cu excesul de ADN fetal. Astfel, chiar dac lotul nu este semnificativ statistic putem afirma c sensibilitatea metodei este destul de mare, aspect corelat cu prezena unui singur rezultat fals negativ. Absena unei sensibiliti de 100% a fost de altfel citat de Tong, care ntr-un studiu efectuat n Hong Kong, folosind aceeai metod ca cea utilizat de noi, a indicat c valoarea factorului D a fost negativ la dou cazuri din cele trei cu trisomie 21 (Tong et al, 2012). innd cont de cele expuse mai sus este evident faptul c pentru validarea metodei sunt necesare ndeplinirea mai multor condiii. O prim condiie este aplicarea metodei pe un numr sporit de cazuri, astfel nct datele obinute s poat fi valide din punct de vedere statistic. n plus, prin identificarea unui factor de corecie s-ar putea realiza o uniformizare att a rezultatelor pozitive, ct i a celor negative, ceea ce ar permite o discriminare mai bun ntre cele dou categorii de rezultate, cu creterea sensibilitii i specificitii metodei spre 100%.

6.3. Dileme i controverse etice n diagnosticul prenatal invaziv versus neinvaziv

Diagnosticul prenatal invaziv, dar i cel neinvaziv n mod special implic dileme etice precum beneficiu versus vtmare, autonomia cuplului versus autonomia ftului. Introducerea testelor de diagnostic prenatal neinvaziv poate avea mai multe consecine asupra profilaxiei bolilor cromozomiale: va fi un test intermediar ntre evaluarea prin screening a riscului i testarea prin diagnostic invaziv a sarcinilor cu risc nalt, va nlocui testele actuale de screening prenatal, va nlocui testele invazive de diagnostic prenatal sau NIDP va deveni

19

singura metodologie de diagnostic prenatal, ultima variant fiind cea mai plauzibil n opinia majoritii autorilor (de Jong et al., 2010).

CONCLUZII GENERALE 1. n lotul la care s-a efectuat diagnostic postnatal al bolilor

cromozomiale, aneuploidiile au fost mai frecvente dect anomaliile cromozomiale structurale (85,58% versus 14,42%), iar cele autozomale mai frecvente dect cele gonozomale. Anomaliile de structur echilibrate i neechilibrate au avut aceeai frecven probabil prin subdiagnosticarea celor echilibrate. Se poate concluziona c e necesar o mbuntire a depistrii persoanelor cu risc de a fi purttor al unei anomalii structurale echilibrate.

2. Analiza unui lot semnificativ statistic format din 672 de pacieni diagnosticai cu sindrom Down din regiunea Moldovei a artat frecvenele formelor citogenetice (trisomie 21 omogen 90,77%, trisomie 21 n mozaic 5,36%, trisomie 21 prin translocaie robertsonian 3,87%) uor diferite de alte studii din strintate, dar similare cu studiul anterior din regiunea Moldovei n sensul unui procent mai ridicat de trisomie 21 n mozaic. Aceast observaie ar putea reprezenta o caracteristic populaional. 3. Rata global de diagnosticare n sindromul Down estimat n regiunea Moldovei a fost de 43,34%, o rat mic avnd n vedere faptul c diagnosticul clinic n sindromul Down este facil i ghidurile europene de bun practic stipuleaz obligativitatea efecturii diagnosticului citogenetic att pentru diagnostic de certitudine, dar i pentru acordarea unui sfat genetic adecvat cu rsunet asupra profilaxiei primare n sindromul Down. Totui n ultimii ani procentul de diagnosticare a crescut la categoria de vrst 0-1 lun i 1 lun-1 an.

4. Cromozomii inelari sunt anomalii rare cu fenotip determinat de materialul genetic deletat i instabilitatea genetic a cromozomului inelar, dar pentru realizarea unei corelaii genotip-fenotip este necesar o evaluare complex combinat cariotip - tehnici de citogenetic molecular. Analiza celor trei cazuri de cromozom inelar de 18 i revizuirea literaturii a permis o aprofundare a aspectului fenotipic al sindromului.

5. Sindromul Patau este o boal cromozomial grav, cu un tablou clinic polimorf, care poate genera dificulti de diagnostic clinic. Cunoaterea variabilitii fenotipice, depistarea cazurilor atipice sunt importante pentru un diagnostic clinic corect i evaluarea cromozomial pentru confirmarea diagnosticului i acordarea sfatului genetic adecvat.

6. Rata relativ mic de diagnosticare a sindroamelor cu microdeleii prin FISH este un argument pentru necesitatea seleciei clinice riguroase prin utilizarea scorurilor de diagnostic clinic, dar i folosirea altor tehnici de diagnostic pentru

20

sindroamele n a cror patogenie intervin i alte mecanisme precum amprentarea genetic.

7. FISH este test complementar analizei cromozomiale convenionale n elucidarea unor cazuri cu anomalii cromozomiale incerte.

8. n lotul cu diagnostic prenatal invaziv motivaiile cele mai frecvente de efectuare a diagnosticului au fost vrsta matern avansat, semnele ecografice de alarm pentru boal cromozomial, testele de screening biochimic modificate. Asocierea mai multor factori de risc crete riscul de detecie a aneuploidiilor la ft. Testul FISH interfazic este un test eficient pentru detecia aneuploidiilor, dar analiza cromozomial fetal permite diagnosticarea unor anomalii cromozomiale structurale motenite sau de novo cu implicaii pentru acordarea unui sfat genetic corect.

9. Sfatul genetic n bolilor cromozomiale i managementul familiei pacientului cu boal cromozomial necesit analiza cromozomial la persoanele cu risc i uneori diagnostic secvenial cu folosirea n cascad a testelor n funcie de diagnosticul de etap.

10. Studiul efectuat pe un lot restrns de 10 gravide a confirmat fiabilitatea unei metode de diagnostic prenatal neinvaziv, bazat pe compararea statusului de metilare a ADN-ului fetal versus matern, ceea ce n viitor ar putea constitui o alternativ la actualele metode de diagnostic prenatal invaziv, marcate de variate incidente, cele mai grave fiind avortul spontan i hemoragia obstetrical. 11. Diagnosticul prenatal invaziv se caracterizeaz printr-o serie de dileme etice dintre care pot fi citate beneficiu versus vtmare, autonomia cuplului versus autonomia ftului. Bibliografie selectiv: Cassidy SB, Allanson JE. Management of genetic syndromes. Wiley-

Blackwell, 2010. Covic M, tefnescu D, Sandovici I. Genetic medical, ediia a II-a. Iai:

Editura Polirom, 2011. de Grouchy J, Turleau C. Syndrome r(21). Clinical Atlas of Human

Chromosomes. New York: John Wiley and Sons, 1984, 350-355. de Jong A, Dondorp WJ, de Die-Smulders CE et al. Non-invasive prenatal testing: ethical issues explored. Eur J Hum Genet 2010; 18(3): 272-7. De Souza E, Halliday J, Chan A et al. Recurrence risks for trisomies 13,

18, and 21. Am J Med Genet A 2009; 149 A(12): 2716-2722.

21

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Jong%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19953123http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dondorp%20WJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19953123http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Die-Smulders%20CE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19953123http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Non-invasive%20prenatal%20testing%3A%20ethical%20issues%20explored##http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=De%20Souza%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19921649http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Halliday%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19921649http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chan%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19921649http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=de+souza+2009+Recurrence+risks+for+trisomies+13%2C+18%2C+and+21 \# \ American journal of medical genetics. Part A.

Feenstra I, Vissers LELM, Orsel M et al. Genotype-phenotype mapping of chromosome 18q deletions by high-resolution array CGH: an update of the phenotypic map. Am J Med Genet A 2007; 143A(16): 1858-1867.

Firth HV, Hurst JA, Hall JG. Oxford desk reference: clinical genetics. New York: Oxford University Press, 2005.

Gardner RGM, Sutherland GR. Chromosome Abnormalities and Genetic Counseling, 4th ed. New York: Oxford University Press, 2012.

Gorduza E.V. Compendiu de genetic uman si medical. Iasi: Ed. Tehnopress, 2007.

Gorduza EV, Covic M, Stoica O et al. Studii clinice, epidemiologice i citogenetice pe un lot de 221 pacieni cu sindrom Down. Rev Med Chir 2007; 111 (2), 363-372.

Gorlin RJ, Cohen MM Jr, Hennekam R. Branchial arch and oral-acral disorders. Syndromes of the Head and Neck, 4th ed. New York: Oxford University Press, 2001:790-798.

Hoo JJ, Stein CK. Zwilling versus Tai Chi configuration of double-sized ring chromosome. Am J Med Genet A 2007; 143(8): 903-905.

Kosztolnyi G. Does ring syndrome exist? An analysis of 207 case reports on patients with a ring autosome. Hum Genet 1987; 75(2): 174-179.

Lo-Castro A, El-Malhany N, Galasso C et al. De novo mosaic ring chromosome 18 in a child with mental retardation, epilepsy and immunological problems. Eur J Med Genet 2011; 54(3): 329-332.

Meza- Espinoza JP, Anguiano LO, Rivera H. Chromosomal Abnormalities in Couples with Reproductive Disorders. Gynecol Obstet Invest 2008; 66(4): 237-240.

Papageorgiou E A, Karagrigoriou A, Tsaliki E et al. Fetal-specific DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21. Nat Med 2011 ; 17(4):510-513.

Stankiewicz P, Brozek I, Hlias-Rodzewicz Z et al.. Clinical and molecular-cytogenetic studies in seven patients with ring chromosome 18. Am J Med Genet 2001; 101(3):226-239.

Stankiewicz P, Brozek I, Hlias-Rodzewicz Z et al.. Clinical and molecular-cytogenetic studies in seven patients with ring chromosome 18. Am J Med Genet 2001; 101(3):226-239.

Tasse C, Majewski F, Bhringer S et al. A family with autosomal dominant oculo-auriculo-vertebral spectrum. Clin Dysmorphol

22

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fetal-specific%20DNA%20methylation%20ratio%20permits%20noninvasive%20prenatal%20diagnosis%20of%20trisomy%2021##

23

2007; 16(1): 1-7. Tasse C, Majewski F, Bhringer S et al. A family with autosomal

dominant oculo-auriculo-vertebral spectrum. Clin Dysmorphol 2007; 16(1): 1-7.

Tong YK, Chiu RW, Chan KC et al. Technical concerns about immunoprecipitation of methylated fetal DNA for noninvasive trisomy 21 diagnosis. Nat Med 2012; 18(9):1327-1328.

Tong YK, Chiu RW, Chan KC et al. Technical concerns about immunoprecipitation of methylated fetal DNA for noninvasive trisomy 21 diagnosis. Nat Med 2012; 18(9):1327-1328.

Warburton D , Dallaire L , Th angavelu M , Ross L , Levin B , Kline J . Trisomy recurrence: a reconsideration based on North American data . Am J Hum Genet 2004; 75(3): 376 385.

Warburton D , Dallaire L , Th angavelu M , Ross L , Levin B , Kline J . Trisomy recurrence: a reconsideration based on North American data . Am J Hum Genet 2004; 75(3): 376 385.

INTRODUCERE:DIAGNOSTICUL POSTNATAL AL BOLILOR CROMOZOMIALE 5.1. Analiza global a lotului investigat citogenetic postnatal5.1.1. Rezultate5.1.2. Discuii

5.2. Studii citogenetice i epidemiologice n sindromul Down5.2.1. Loturi i metode de studiu5.2.2. Rezultate

5.3. Optimizarea diagnosticului clinic5.3.1. Corelaii genotip-fenotip n cazurile de cromozomi inelari autozomali

5.4. Optimizarea diagnosticului citogenetic5.4.1. Optimizarea diagnosticului citogenetic prin hibridizare fluorescent in situ n sindroamele cu microdeleii5.4.2. Optimizarea diagnosticului citogenetic prin hibridizare fluorescent in situ n cazuri cu anomalii cromozomiale incerte

5.5. Optimizarea profilaxiei n bolile cromozomiale

DIAGNOSTICUL PRENATAL AL BOLILOR CROMOZOMIALE6.1. Diagnostic prenatal invaziv6.1.1. Loturi i metode de studiu6.1.2. Rezultate6.1.3. Discuii

6.2. Diagnostic prenatal neinvaziv:Studiu privind cuantificarea ADN-ului fetal metilat - o nou abordare n diagnosticul prenatal neinvaziv al trisomiei 216.2.1. Lot i metode de studiu6.2.3.Discuii

6.3. Dileme i controverse etice n diagnosticul prenatal invaziv versus neinvaziv