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La industria láctea y los bacteriofagos: tópicos de interés actual

Andrea Quiberoni

Workshop de Agroalimentos, Centro Binacional Argentino Uruguayo en Agroalimentos Buenos Aires, 25 y 26 de octubre de 2012

Instituto de Lactología Industrial (INLAIN, UNL-CONICET)

Bacterias probióticasBacterias probióticasDr. Jorge ReinheimerDr. Jorge Reinheimer

Fagos en la industria lácteaFagos en la industria láctea

TECNOLOGÍA

QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

MICROBIOLOGÍA

La bioconversión de sustratos en compuestos de mayor valor La bioconversión de sustratos en compuestos de mayor valor agregado es el proceso básico de una amplia variedad de industriasagregado es el proceso básico de una amplia variedad de industrias

Cualquier población bacteriana es susceptible a Cualquier población bacteriana es susceptible a infecciones fágicasinfecciones fágicas

Las Las bacteriasbacterias representan el pilar fundamental de los procesos representan el pilar fundamental de los procesos

La mayoría de las La mayoría de las industrias fermentativasindustrias fermentativas experimentan experimentan contaminaciones fágicascontaminaciones fágicas

Graves consecuenciasGraves consecuencias de estas infecciones para todos los de estas infecciones para todos los sectores sectores industrialesindustriales (elevados costos y tiempo para identificar el origen e implementar (elevados costos y tiempo para identificar el origen e implementar

medidas correctivas)medidas correctivas)

Bacteriofagos Industria fermentativa

(Emond & Moineau, 2007)(Emond & Moineau, 2007)

Infecciones fágicas en la industria fermentativa

Infecciones fágicas en la industria fermentativa

(Emond & Moineau, 2007)(Emond & Moineau, 2007)

Los grandes volúmenes de Los grandes volúmenes de leche crudaleche cruda procesados diariamente constituyen procesados diariamente constituyen la la vía principal de ingreso de fagos a las plantasvía principal de ingreso de fagos a las plantas

La elevada frecuencia de La elevada frecuencia de mutaciónmutación es origen de creciente es origen de creciente diversidaddiversidad

Entre el Entre el 0,1 y el 10% de los 0,1 y el 10% de los batchsbatchs están comprometidos por las están comprometidos por las infeccionesinfecciones

Bacteriofagos Industria láctea fermentativa

PRÁCTICAMENTE INEVITABLE

PRESENCIA DE FAGOS EN EL AMBIENTE INDUSTRIAL

Se han aislado fagos específicos para todos los géneros de bacterias Se han aislado fagos específicos para todos los géneros de bacterias lácticas (BAL) que utiliza la industrialácticas (BAL) que utiliza la industria

Starters para elaboración Starters para elaboración de quesos duros y leches de quesos duros y leches fermentadas fermentadas

LactobacillusLactobacillus(incluye especies probióticas)(incluye especies probióticas)

BAL más ampliamente utilizada BAL más ampliamente utilizada como starter (nivel mundial)como starter (nivel mundial) LactococcusLactococcus

Starters para elaboración de Starters para elaboración de leches fermentadas y quesosleches fermentadas y quesos Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus

LeuconostocLeuconostocStarters para elaboración de Starters para elaboración de quesos azulesquesos azules


Células de Células de LactobacillusLactobacillus sp. sp.

infectadas por un fago infectadas por un fago

Lisis celular

90 min después de la infección

0 1 2 3 4 5 6 7 84.5

5.0

5.5

6.0

6.5

Control m.o.i.=1

m.o.i.=10-1

m.o.i.=10-2

pH

Tiempo (h)

Fallas en el proceso de Fallas en el proceso de acidificaciónacidificación

Ausencia de cultivos Ausencia de cultivos lácticos y probióticoslácticos y probióticos

CONSECUENCIAS

Acidificación en leche: Lb. helveticus en presencia de fagos

LECHES FERMENTADAS QUESERÍAS

Calentamiento Calentamiento de la leche a de la leche a

mayor temperatura mayor temperatura (90°C)(90°C),,

Proceso relativamente aséptico,Proceso relativamente aséptico,

Ausencia Ausencia de drenaje y circulación de drenaje y circulación

de suero.de suero.

Calentamiento suaveCalentamiento suave de la de la

materia prima materia prima (63°C, 72°C),(63°C, 72°C),

Numerosas etapas Numerosas etapas (utensilios, (utensilios,

operarios)operarios),,

Separación de Separación de suerosuero y y

generación de generación de bioaerosoles.bioaerosoles.

ELEVADA FRECUENCIA DE INFECCIONES FÁGICAS

BAJA FRECUENCIA DE INFECCIONES FÁGICAS


CULTIVOS CULTIVOS

INICIADORESINICIADORES LECHE CRUDALECHE CRUDA RUPTURA DE RUPTURA DE

BARRERAS FÍSICASBARRERAS FÍSICASCULTIVOS CULTIVOS

INICIADORESINICIADORES

FAGOS FAGOS

PRODUCTOS LÁCTEOS PROBIÓTICOS

¿VÍAS DE INGRESO?¿VÍAS DE INGRESO?

Procesos altamente controlados Procesos altamente controlados (microbiológica y (microbiológica y

tecnológicamente)tecnológicamente), ,

Empleo de cepas ‘únicas’ y especializadas,Empleo de cepas ‘únicas’ y especializadas,

Importantes inversiones en I+D.Importantes inversiones en I+D.

FAGOS

ELEVADA FRECUENCIA DE INFECCIONES FÁGICAS


Los bacteriofagos en la industria láctea Estrategias para disminuir el riesgo de infecciones

Fermentaciones Fermentaciones lácticaslácticas

Tratamientos térmicos de Tratamientos térmicos de la materia primala materia prima

Empleo de cultivos de Empleo de cultivos de inoculación directa inoculación directa

Empleo de medios Empleo de medios inhibidores de fagos (PIM)inhibidores de fagos (PIM) Programas de rotación de Programas de rotación de

cultivoscultivos

Higiene y diseño de Higiene y diseño de la plantala planta

Empleo de cultivos multicepaEmpleo de cultivos multicepa

Empleo de cepas con Empleo de cepas con fagorresistencia mejoradafagorresistencia mejorada


1. Mejoramiento de la fagorresistencia de cepas a través de 1. Mejoramiento de la fagorresistencia de cepas a través de herramientas naturalesherramientas naturales

2. Termorresistencia extrema de fagos: implicancias 2. Termorresistencia extrema de fagos: implicancias tecnológicas y analíticastecnológicas y analíticas

3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos

4. Inactivación fágica: diseño de nuevas tecnologías4. Inactivación fágica: diseño de nuevas tecnologías

5. Secuenciación genómica y proteómica5. Secuenciación genómica y proteómica

Mag. Viviana SuárezMag. Viviana Suárez

Dra. Ma. Luján CapraDra. Ma. Luján Capra

Dra. Daniela GuglielmottiDra. Daniela Guglielmotti

Dr. Diego MercantiDr. Diego Mercanti

Ing. Mariángeles Briggiler MarcóIng. Mariángeles Briggiler Marcó

Lic. Silvina PujatoLic. Silvina Pujato

Dr. Jorge ReinheimerDr. Jorge Reinheimer

Dra. Andrea QuiberoniDra. Andrea Quiberoni

GRUPO DE TRABAJOGRUPO DE TRABAJO

Prof. Hans-Wolfgang AckermannProf. Hans-Wolfgang Ackermann

Prof. Sylvain MoineauProf. Sylvain Moineau

Dr. Orlando AlfanoDr. Orlando Alfano

Tec. Antonio NegroTec. Antonio Negro

Prof. Horst NeveProf. Horst Neve

Prof. Zeynep AtamerProf. Zeynep Atamer

1. Mejoramiento de la fagorresistenciaEmpleo de herramientas naturales

OBJETIVOS

Aislar mutantes espontáneos Aislar mutantes espontáneos

fagorresistentes fagorresistentes (idénticas propiedades (idénticas propiedades

a la cepa madre)a la cepa madre) para su uso como para su uso como

fermentos en la elaboración de fermentos en la elaboración de

productos lácteos.productos lácteos.

Lb. casei / paracaseiLb. casei / paracasei(Capra et al. 2011)

(Briggiler Marcó et al. 2011)

RESULTADOS

Variantes útiles, Variantes útiles, sin restricciones sin restricciones

legaleslegales..

Interesantes candidatos para Interesantes candidatos para

elaboración de elaboración de productos lácteos productos lácteos

probióticos probióticos (“strain claims”)(“strain claims”)..

S. thermophilusS. thermophilus

Lb. Lb. helveticushelveticus

Lb. Lb. plantarumplantarum

Lb. Lb. delbrueckiidelbrueckii

(Binetti et al. 2007)

(Quiberoni et al. 1998)

(Guglielmotti et al. 2006)

Aumento y diversificación de Aumento y diversificación de poblaciones fágicas que resisten los poblaciones fágicas que resisten los

tratamientos térmicostratamientos térmicos

(Capra et al. 2009, Mercanti et al. 2011)

LactobacillusLactobacillus

(Binetti et al. 2000)

Streptococcus Streptococcus thermophilusthermophilus

(Suárez and Reinheimer 2002, Müller-Merbach et al. 2005,

Atamer et al. 2009

Lactococcus lactisLactococcus lactis

(Atamer et al. 2011)

LeuconostocLeuconostoc

2. Termorresistencia extrema de fagosImplicancias tecnológicas y analíticas

TECNOLÓGICAS ANALÍTICAS

FagosFagos vehiculizados en la vehiculizados en la leche leche

crudacruda (10(1011-10-1044 UFP/ml), UFP/ml),

FagosFagos que que resisten los resisten los

tratamientos térmicostratamientos térmicos,,

Contaminación Contaminación del ambiente del ambiente

(planta, laboratorios)(planta, laboratorios) y de productos. y de productos.

Muestras Muestras conteniendo elevados conteniendo elevados

niveles de niveles de fagosfagos,,

Mayor Mayor frecuenciafrecuencia de aislamiento de aislamiento

de de fagos termorresistentes,fagos termorresistentes,

InconvenientesInconvenientes durante los durante los

análisis análisis de laboratorio. de laboratorio.

2. Termorresistencia extrema de fagosImplicancias tecnológicas y analíticas

TECNOLOGÍAS ALTERNATIVAS PARA DESINFECCIÓN

ACTUALIZACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS ANALÍTICAS

Estudios moleculares de estas Estudios moleculares de estas especies demostraron que los especies demostraron que los profagos son muy frecuentesprofagos son muy frecuentes

Lb. casei / paracaseiLb. casei / paracasei(Lo et al. 2005; Ventura et al. 2006;

Capra et al. 2008)

Lb. Lb. johnsoniijohnsonii

(Ventura et al. 2003; Denou et al. 2008)

Lb. Lb. plantarumplantarum(Ventura et al. 2003)

Lb. Lb. rhamosusrhamosus

(Brandt & Alatossava 2003; Durmaz et al. 2008)

(Ventura et al. 2006)

Lb. Lb. gasserigasseri

3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos

Estudios para dilucidar Estudios para dilucidar su rol en la evolución desu rol en la evolución de

PROFAGOS EN BACTERIAS PROBIÓTICAS

(Lepage et al., 2008;(Lepage et al., 2008; Alemayehu et al. 2009)Alemayehu et al. 2009)

No se consideran entidades No se consideran entidades inertes en el cromosoma bacterianoinertes en el cromosoma bacteriano

Cepas hospedadoras Cepas hospedadoras lisógenaslisógenas

Equilibrio del Equilibrio del ecosistema intestinalecosistema intestinal

Fagos virulentos en Fagos virulentos en ambientes industrialesambientes industriales

3. Infecciones fágicas en lactobacilos probióticos

¿Antagonistas de los efectos

benéficos?

¿Co-responsables de los efectos benéficos?

La fotocatálisis (UV/TiOLa fotocatálisis (UV/TiO22) es una alternativa atractiva para la desinfección del ) es una alternativa atractiva para la desinfección del

aire ambientalaire ambiental

Potencialidad dePotencialidad de inactivación viral en bioaerosoles inactivación viral en bioaerosoles (principal (principal via de dispersión de via de dispersión de

fagos en el ambiente industrial)fagos en el ambiente industrial)

POTENCIALIDAD DE APLICACIÓN

Inactivación de una Inactivación de una amplia diversidad de fagosamplia diversidad de fagos

Tecnología Tecnología eficiente y seguraeficiente y segura (UV-A)(UV-A)

Posibilidad de Posibilidad de aplicación continuaaplicación continua en ambientes de en ambientes de planta y laboratorioplanta y laboratorio

Mecanismos de inactivación fágicaMecanismos de inactivación fágica

INVESTIGACIONES EN CURSO

Diseño y adaptación de equipos para uso industrialDiseño y adaptación de equipos para uso industrial

Ensayo de un prototipo a escala de laboratorioEnsayo de un prototipo a escala de laboratorio Equipos para Equipos para purificación de airepurificación de aire

4. Inactivación fágicaDiseño de nuevas tecnologías

OBJETIVOS

Aumentar el conocimiento sobre Aumentar el conocimiento sobre

diversidad y evolucióndiversidad y evolución para fagos para fagos

de bacterias lácticas y probióticasde bacterias lácticas y probióticas

Lb. casei / paracaseiLb. casei / paracasei

Lb. Lb. plantarumplantarum

5. Secuenciación genómica y proteómica

(Briggiler Marcó et al., 2012)

Los bacteriofagos

Entidades biológicas más Entidades biológicas más abundantes sobre el planeta abundantes sobre el planeta (10(1030 – 30 – 101032 32 partículas fágicas) partículas fágicas)

Pool de agentes biológicos Pool de agentes biológicos con potencialidad inexplorada con potencialidad inexplorada

REGULACIÓN DE POBLACIONES BACTERIANAS

EVOLUCIÓN DEL PLANETA