TECNOLÓGICO DE MONTERREY
Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud
Programa Multicéntrico de Especialidades Médicas
“Caracterización de la microbiota en la leche humana temprana de
madres de recién nacidos pretérmino tardíos”
Tesis para obtener el grado de:
Especialista en Neonatología
presenta:
Dalia Liliana Rodríguez Reyes
Director de tesis: Codirector de tesis:
Dr. Med. Víctor Javier Lara Díaz Dr. Med. Mario Rene Alcorta García
Monterrey, Nuevo León, México Octubre, 2019
II
Los Integrantes del Comité aprueban la tesis de DALIA LILIANA
RODRÍGUEZ REYES, que presenta para cubrir el requisito parcial de
obtención del grado de:
ESPECIALISTA EN NEONATOLOGÍA
Comité de Tesis
________________________ ______________________ Dr. Med. Víctor Javier Lara Díaz Dr. Bronson Osorio Martínez
Director de Comité de Sinodales Sinodal
_______________________ Dr. Med. Mario Rene Alcorta García
Sinodal
___________________________
Dr. Bronson Osorio Martínez
Director Académico del programa en Neonatología
III
Dedicatoria
Dedico este trabajo a mi madre Yolanda Reyes por su amor, abrigo y apoyo
durante todos estos años de formación; a mi hermana Yulia Rodríguez por estar siempre
dispuesta a ayudar y todo su cariño. También lo dedico a mis amigos Eduardo Jasso,
Dulce Trinidad, José Eduardo Mares y Ana Luisa Carrión, por estar presentes a pesar de
sus obligaciones y la distancia y seguir apoyándome a lo largo de este camino.
Este trabajo está dedicado con gran esperanza, a todos las personas que trabajan
con madres y niños y buscan su bienestar. Que sea la semilla, entre miles más de
investigaciones, que nos permita brindar conocimiento para mejorar su atención y salud.
IV
Agradecimientos
Agradezco muy especialmente al Dr. Med. Víctor Javier Lara Díaz, maestro y
mentor, por su apoyo durante todo el proceso de mi formación como especialista en
neonatología, por el invaluable apoyo durante la realización de este trabajo y sus palabras
de aliento y sabiduría que me brindó en cada encuentro a través de estos años.
Agradezco a mis colegas y compañeros Gelacio Jiménez Blanco y Alan Heriberto
Montoya Rincón, ya que este proyecto no podría haber culminado sin su arduo trabajo.
Fueron ejemplo y motivación constante que me permitió continuar hasta el final.
Agradezco a mis compañeros pasados y actuales de residencia: Alberto González,
Mario Vázquez, Dante Terrones, Karen González, Melissa Alanís, Tania Moreno, Eduardo
González, Ángela Ruiz y Jorge Moreno por su ejemplo y apoyo; y en especial a mis
compañeros de primer y segundo año por su comprensión y favor en las actividades clínicas
y académicas que nos dieron el tiempo para llevar a cabo este trabajo.
Agradezco a los médicos adscritos al servicio de neonatología del Hospital
Regional Materno Infantil de Alta especialidad, así como al equipo de Lactancia del
hospital por toda la ayuda y facilidades brindadas en este proyecto.
Finalmente, agradezco al equipo de biotecnología del ITESM, quienes tomaron el
control del proceso y análisis de muestras y que gracias a su experiencia en la materia,
lograron obtener material de calidad con las muestras recolectadas.
V
Glosario
ACOG Colegio Americano de Obstetras y Ginecologos (por sus siglas en
inglés)
ADN Ácido desoxirribonucleico
AAP Academia Americana de Pediatría
OMS Organización mundial de la salud
ADNr Ácido desoxirribonucleico ribosomal
AGL Ácidos grasos libres
IMA Álbumina Modificada por Isquemia (por sus siglas en inglés)
ARN Acido ribonucleico
ARNr Ácido ribonucleico ribosomal
CD Cúmulo de diferenciación
cm Centímetros
cm3 Centímetro cúbico
dL Decilitros
DMG Diabetes mellitus gestacional
DNA Ácido desoxirribonucleico (por sus siglas en inglés)
ECN Enterocolitis necrotizante
EGF Factor de crecimiento epidérmico (por sus siglas en inglés)
I-FABP Proteína ligadora de ácidos grasos intestinal (por sus siglas en inglés)
L-FABP Proteína ligadora de ácidos grasos hepática (por sus siglas en inglés)
FUM Fecha de última menstruación
G Fuerza G
g Gramos
g/L Gramos por litro
hMmSCs Células progenitoras de la leche materna humana (por sus siglas en
inglés)
HMO Oligosacáridos de leche humana (por sus siglas en inglés)
HMP Proyecto del Microbioma Humano (por sus siglas en inglés)
HRMIAE Hospital Regional Materno-Infantil de Alta Especialidad
FUT2 Alfa-fucosiltransferasa 2 (por sus siglas en inglés)
FUT3 Alfa-fucosiltransferasa 3 (por sus siglas en inglés)
Il Interleucina, expresada con un número posterior. Ej. Il2 (interleucina 2)
IgA Inmunoglobulina A
IgE Inmunoglobulina E
IMC Índice de masa corporal
Kcal Kilocalorías
Kg Kilogramo
Kg/m2 Kilogramo por metro cuadrado
LCPUFA Ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados (por sus siglas en inglés)
m2 Metro cuadrado
MCT Triglicéridos de cadena media (por sus siglas en inglés)
mg Miligramo
mg/dL Miligramos por decilitro
VI
mL Mililitro
mm Milímetros
mmol/L Milimoles por litro
MMP-8 Metaloproteasa de la matriz 8
MRSA Estafilococo aureus resistente a meticilina (por sus siglas en inglés)
VIH. Virus de inmunodeficiencia humana
VII
Índice de contenidos
Dedicatoria. ....................................................................................................................... III
Agradecimientos ............................................................................................................... IV
Glosario. ............................................................................................................................. V
Índice de contenidos ........................................................................................................ VII
Índice de tablas ................................................................................................................. XI
Índice de figuras ............................................................................................................... XII
“Caracterizacion de la microbiota en la leche humana temprana de madres de recién
nacidos pretérmino tardíos” .............................................................................................. 13
Capítulo 1. Planteamiento del problema ........................................................................... 14
Antecedentes ................................................................................................................ 14
Pregunta de investigación ............................................................................................. 14
Hipótesis ....................................................................................................................... 15
Objetivo general ........................................................................................................... 15
Justificación .................................................................................................................. 16
Alcance del estudio ...................................................................................................... 17
Capítulo 2. Marco Teórico ................................................................................................ 19
Introducción: ................................................................................................................ 19
Terminología ................................................................................................................ 19
Microbios ..................................................................................................................... 20
Microbiota del cuerpo humano .................................................................................... 22
Leche humana .............................................................................................................. 24
Desarrollo de la glándula mamaria .......................................................................... 25
Anatomía de la glándula mamaria ........................................................................... 27
VIII
Fisiología de la lactancia ......................................................................................... 27
Composición de la leche .......................................................................................... 28
Tipos de leche .......................................................................................................... 32
Microbiota de la leche humana .................................................................................... 33
Origen de la microbiota en la leche humana ........................................................... 34
Vía de nacimiento .................................................................................................... 36
Metagenoma de la leche humana ................................................................................. 36
RNA ribosomal 16S ................................................................................................ 37
Secuenciacion del exoma completo en “escopeta”.................................................. 37
Estudios actuales ..................................................................................................... 38
Caracterización del recién nacido pretérmino tardío .................................................... 41
Factores de riesgo .................................................................................................... 41
Complicaciones de la prematurez tardía .................................................................. 42
Dificultad respiratoria .............................................................................................. 43
Termorregulacion .................................................................................................... 43
Hipoglucemia .......................................................................................................... 44
Maduracion gastrointestinal .................................................................................... 44
Enterocolitis necrotizante ........................................................................................ 45
Hiperbilirrubinemia ................................................................................................. 48
Infecciones nosocomiales ........................................................................................ 49
Desarrollo de la microbiota intestinal en el prematuro........................................... 49
Capítulo 3. Metodología ................................................................................................... 52
Diseño del Estudio ....................................................................................................... 52
Participantes ................................................................................................................. 52
IX
Tamaño de muestra ...................................................................................................... 52
Entorno ......................................................................................................................... 53
Periodo del Estudio ...................................................................................................... 53
Factores ambientales por controlar .............................................................................. 53
Inclusión: ................................................................................................................. 53
Exclusión ................................................................................................................. 54
Eliminación: ............................................................................................................ 55
Variables Cuantitativas ............................................................................................ 55
Variables Cualitativas .............................................................................................. 55
Definición operacional de las variables ................................................................... 56
Muestras Biológicas ..................................................................................................... 57
Etiquetado de las muestras ...................................................................................... 57
Reclutamiento y recolección de las muestras .......................................................... 58
Métodos de conservación y traslado ........................................................................ 61
Organizacion ................................................................................................................ 62
Métodos analíticos ........................................................................................................ 63
Extracción de ADN ................................................................................................. 65
Preparación de bibliotecas y Secuenciación de 16S ................................................ 65
Fuente de los datos y detalles acerca de las mediciones: ............................................. 65
Análisis estadístico ....................................................................................................... 66
Aspectos éticos y regulatorios ...................................................................................... 66
Fondos: ......................................................................................................................... 67
Capítulo 4. Resultados ...................................................................................................... 68
Muestras eliminadas ..................................................................................................... 68
X
Características demográficas ........................................................................................ 70
Índice de masa corporal (IMC) ................................................................................ 71
Vía de nacimiento y uso de antibióticos .................................................................. 73
Características del recién nacido ............................................................................. 74
Características de las muestras de leche ....................................................................... 77
Determinación de ADN en leche materna .................................................................... 78
Capítulo 5. Análisis y discusión de resultados .................................................................. 80
Capítulo 6. Conclusión ...................................................................................................... 83
Apéndice ........................................................................................................................... 84
Apéndice 1. Formato de recolección de datos. ............................................................. 84
Apéndice 2. Formato de registro de muestras recolectadas. ........................................ 87
Apéndice 4. Carta de aprobación del comité de ética de la Escuela de Medicina ..... 101
Apéndice 5. Carta de aprobación del comité de Investigación de la Escuela de
Medicina ..................................................................................................................... 102
Apéndice 6. Carta de aprobación de Enmienda del comité de ética de la Escuela de
Medicina ..................................................................................................................... 103
Apéndice 7. Carta de aprobación de Enmienda del comité de investigación de la
Escuela de Medicina ................................................................................................... 104
Apéndice 8. Carta de aprobación del comité de ética e investigación del Hospital
Materno Infantil. ......................................................................................................... 105
Apéndice 9. Constancia de registro de protocolo ante la Secretaría de salud de Nuevo
León. ........................................................................................................................... 106
Apéndice 10. Curriculum vitae único de Conacyt ..................................................... 107
Bibliografía ..................................................................................................................... 108
Currículum vitae del investigador ................................................................................... 118
XI
Índice de tablas
Tabla 1 ................................................................................................................... 56
Tabla 2 ................................................................................................................... 56
Tabla 3 b ................................................................................................................ 71
Tabla 4 ................................................................................................................... 73
Tabla 5 ................................................................................................................... 73
Tabla 6 ................................................................................................................... 77
Tabla 7 ................................................................................................................... 78
XII
Índice de figuras
Figura 1: Taxones procariotas. .............................................................................. 21
Figura 2. Diagrama de elegibilidad ....................................................................... 69
Figura 3. Índice de masa corporal por grupo. Prueba de mediana, p=0.20. .......... 72
Figura 4. Índice de masa corporal por grupo. ...................................................... 72
Figura 5. Semanas de gestación completas por grupo.. ....................................... 74
Figura 6. Talla en centímetros por grupo .............................................................. 75
Figura 7. Peso en gramos por grupo. ..................................................................... 75
Figura 8. Talla en centímetros por grupo .............................................................. 76
Figura 9. Semanas de gestación completas por grupo. ......................................... 76
Figura 10. Volumen de leche obtenida por grupo. ................................................ 77
Figura 11. Información de muestras de calostro humano enviadas a secuenciar. . 79
13
“Caracterización de la microbiota en la leche humana temprana de
madres de recién nacidos pretérmino tardíos”
Los prematuros tardíos son una población de riesgo ya que tienen una
morbimortalidad alta en comparación de sus contrapartes de término. Hoy en día son
indiscutibles los grandes beneficios que ofrece la leche humana al neonato, pero no hay
suficiente información sobre el papel que juega la microbiota de la leche materna, si es que
hay alguno, en generar estos beneficios en diferentes circunstancias clínicas, y no existe
nada escrito sobre la leche materna de embarazos que culminaron en el nacimiento de
prematuros tardíos.
Se reclutaron dos grupos de binomios madre – hijo entre el 1 de febrero al 31 de
agosto del 2019 en el Hospital Regional Materno-Infantil. El primer grupo se consideró el
control, con madres sanas y embarazos de término (37 semanas). El segundo fue el grupo
de estudio, con madres de neonatos pretérmino tardíos (34 0/7 a 36 6/7 semanas).
Se obtuvo de cada binomio: leche, sangre total, suero y plasma maternos; líquido
amniótico en los casos de cesárea, tejido placentario, meconio, sangre total, suero y plasma
del neonato. Se caracterizó a la población y se extrajo el ADN de la leche materna, el cual
se envió a un proveedor tercero especializado para la elaboración de las librerías y la
secuenciación del gen de ARN ribosomal 16S para establecer el metagenoma.
Se logró establecer una cohorte de binomios materno-neonatales de pretérminos
tardíos y controles de la zona metropolitana de Monterrey, obteniendo ADN de pureza
óptima en todos los binomios. En una segunda etapa, con el análisis de la microbiota de la
leche temprana se determinará si ésta se modifica por los nacimientos prematuros tardíos.
14
Capítulo 1. Planteamiento del problema
Antecedentes
Existen ciertas condiciones en la salud materna bajo las cuales se compromete el
desarrollo fetal con alteraciones en el desarrollo, o por interrupción de la gestación en una
etapa temprana. El número de nacimientos prematuros se ha incrementado, incluyendo a
los prematuros tardíos. Los prematuros tardíos son una población neonatal de riesgo, ya
que tienen una morbilidad y mortalidad alta, en comparación con sus contrapartes de
término. Hoy en día son indiscutibles los grandes beneficios que ofrece la leche humana al
neonato, pero no hay suficiente información sobre el papel que juega la microbiota de la
leche materna, si es que existe alguno, en generar estos beneficios en diferentes
circunstancias clínicas y no existe nada escrito sobre la leche materna de embarazos que
culminaron en el nacimiento de prematuros tardíos.
Es importante conocer si una gestación que culmina en un nacimiento pretérmino
tardío tiene un impacto en la composición de la microbiota de la leche materna en
comparación con las madres que culminan su embarazo a término. Su posible importancia
radica en que comprender estas diferencias, nos ayudará a entender el impacto que tiene la
microbiota de la leche materna en el neonato y sus consecuencias a corto y largo plazo.
Pregunta de investigación
Las condiciones maternas bajo las cuales se origina y se desarrolla un embarazo
(Variable Independiente) ¿Son capaces de modificar el metagenoma de la lecha materna
temprana (Variable Dependiente)?
15
¿Es sensible la microbiota de la leche humana temprana (VD) a las condiciones maternas
bajo las cuales se origina y desarrolla un embarazo (VI)?
¿Qué efecto tiene la composición taxonómica de la microbiota de la leche materna de
madres de prematuros tardíos (VI) sobre la microbiota intestinal del bebé (VD)?
Hipótesis
Dado que se trata de un estudio observacional, descriptivo y transversal, no se
establece una hipótesis a priori.
Objetivo general
El presente trabajo corresponde a la primera sección de un trabajo de largo aliento,
en el cual se pretende estudiar y caracterizar los elementos diferenciales de la microbiota
de la leche humana temprana, obtenida de binomios madre-hijo de la zona metropolitana
de Monterrey, que cursaron con diversas patologías durante el embarazo. Las patologías
consideradas en el abordaje principal son: diabetes mellitus gestacional, obesidad materna,
preeclampsia, parto pretérmino, y obesidad en parto pretérmino.
El objetivo primario de la primera sección de este trabajo, consiste en establecer
una cohorte de binomios materno-neonatales, atendiendo a la representación en la misma
de las principales patologías asociadas al embarazo en nuestro país; de modo que en etapas
sucesivas de esta cohorte, se procederá al estudio y caracterización de los elementos
diferenciales de la microbiota de la leche humana temprana de binomios madre e hijo de la
zona metropolitana de Monterrey, que cursaron con alguna de esas patologías
16
mencionadas. En el caso de esta tesis, la patología de interés inmediato son los nacimientos
pretérminos tardíos, cuya importancia epidemiológica se describe posteriormente.
En una segunda etapa se caracterizará la microbiota de la leche humana de los
binomios obtenidos. Se determinará si existe diferencia en la proporción de géneros de los
microorganismos y su diversidad entre grupos, considerando a las mujeres sanas como el
grupo control. Asimismo, se caracterizará la microbiota materna de tejido placentario y
líquido amniótico, así como la microbiota intestinal de los neonatos con las muestras de
meconio recolectadas. Finalmente, se compararán los hallazgos de las diferentes muestras
biológicas del grupo de estudio y control.
Justificación
No existen al momento de realizar este trabajo, estudios en los cuales se haya
descrito la microbiota de la leche materna en mujeres que tuvieron nacimientos pretérmino
tardíos. En México, solo existe un estudio de caracterización de microbiota en leche,
realizado por Amezcua y colaboradores en el que únicamente se identificaron
microorganismos del tipo Lactobacillus, debido a que la tecnología utilizada no ofrecía
posibilidades más allá del cultivo de organismos ya conocidos; esto deja abierta la
posibilidad de no haber incluido todos los organismos no cultivables. No se hace tampoco
referencia de las características neonatales, por lo que desconocemos la duración del
embarazo y la edad gestacional de los nacidos en ese grupo de estudio.1
A nivel mundial, los trabajos acerca de la microbiota de neonatos pretérmino se han
enfocado principalmente en conocer los cambios asociados a enterocolitis necrotizante,
debido a la alta morbilidad asociada. En España, Pardo y coolaboradores realizaron un
17
estudio con el objetivo de ver el impacto del estadio de lactancia, la edad gestacional y la
vía de nacimiento en la microbiota de la leche humana. Se buscaba comparar neonatos de
término y pretérmino, pero aunque se pretendía incluir pretérminos tardíos, el grupo de
pretérminos reclutado fue <33.0 semanas de gestación. 2
El presente estudio pretende determinar los componentes taxonómicos diferenciales
de binomios madre-hijo de la microbiota de la leche materna de embarazos que culminaron
en el nacimiento de pretérminos tardíos y de la microbiota intestinal de estos neonatos, con
respecto a un grupo control de binomios sanos.
Alcance del estudio
Este trabajo se llevó a cabo en un hospital regional, que atiende a mujeres de la zona
metropolitana de Monterrey y el resto de los municipios de Nuevo León, por lo que tiene
una limitación geográfica a esa región del Noreste de México. Los hallazgos no se pueden
extrapolar a la población que se encuentra fuera del área descrita.
Una de las principales fortalezas del estudio, es la cantidad de pacientes que se
atienden, además de ser el primer estudio de caracterización de la microbiota de la leche
materna mediante técnicas de secuenciación de nueva generación, a partir de Ácido
desoxirribonucleico (ADN) extraído de la leche humana, realizado en mujeres mexicanas.
Debido a que es de los primeros estudios de su tipo, se trata de un estudio
exploratorio, transversal y descriptivo. Tendrá la capacidad de originar nuevas hipótesis y
preguntas de investigación a partir de los resultados obtenidos. Se identifica un área de
18
oportunidad en la posibilidad de dar seguimiento a los sujetos recolectados, y realizar
análisis de la microbiota de manera longitudinal, para ver las características de la
microbiota a través del tiempo; convirtiéndose de esta manera en un estudio de cohortes,
longitudinal.
19
Capítulo 2. Marco Teórico
Introducción:
Tradicionalmente, se consideraba que el feto humano sano se desarrollaba dentro
de un ambiente libre de bacterias, y al nacimiento, se exponía a una amplia variedad de
microbios, muchos de los cuales son provistos por la madre durante y después del pasaje a
través del canal de parto, un ecosistema ricamente colonizado por una variedad
relativamente limitado de taxones bacterianos. Actualmente sabemos que eso no podría
distar más de la realidad, el cuerpo humano, incluyendo la cavidad amniótica durante el
embarazo, es nicho para más de 1000 tipos diferentes de microorganismos, los cuales
interactúan con nosotros (su hospedero) armónicamente como simbiontes y cuando ocurre
una disrupción de este equilibrio, como patógenos.
Terminología
Disbiosis: distribución anormal y/o cantidad de especies de bacterias dentro de una parte
del cuerpo en particular.
Microbiota: conjunto de organismos presentes dentro de una comunidad, usualmente
referentes a un huésped animal/humano.
Microbioma: La totalidad de comunidad microbiana y sus genomas, que incluye
organismos comensales y patógenos.
Metagenoma: conjunto de genomas y genes de todos los componenes de la microbiota.
Metagenómica: El estudio de los microbios en su ambiente vivo natural y su respectiva
composición genómica usando metodología no basada en cultivos.3
Nutrientes: componente del alimento usado como bloque para constuir tejidos.
Inmunonutrientes: componente del alimento que tiene una función.
20
Metabolito: Puede tener un efecto funcional.
Microbios
Los microbios son organismos comensales, simbióticos y patogénicos que pueden
ser bacterias, hongos y virus. Forman una entidad ecológica e interactúan con un huésped
en particular. Aunque los hongos y virus son parte importante del microbioma, se ha escrito
poco sobre ellos. Se estima que existen más de 1000 tipos diferentes de microorganismos
dentro del cuerpo humano. Además de esto, tenemos 300 veces más genes de
microorganismos que de genes humanos. 4
A lo largo de este texto, para clasificar bacterias, hablaremos de taxones. La
taxonomía se ocupa de la clasificación de las formas de vida, basándose en sus
características comunes y, recientemente, en los datos de secuenciación del ADN
(filogenética molecular). Un taxón es un grupo de organismos con circunscripción,
posición y rango.
Todos los seres vivos se clasifican en tres dominios: eucariotas, arqueas
(procariotas) y bacterias (procariotas). Se subclasifican posteriormente en forma
descendente en reino, filo, clase, orden, familia, género y especie. Los seres humanos se
definen como pertenecientes a las categorías eucariota (dominio), animales (reino),
cordados (filo), mamíferos (clase), primates (orden), homínidos (familia), Homo (género)
y sapiens (especie); simplificado como Homo sapiens.5
21
Es importante reconocer que no existe una clasificación oficial para procariotas. En la
revisión de 2019 del último código de nomenclatura de procariotas del 2008 se menciona
que aunque las definiciones de las categorías taxonómicas pueden cambiar, no se debe de
alterar el orden. 6 Se presentan a continuacion de forma descendente los taxones para
procariotas:
Clase (-ia)
Orden(-ales)
Familia(-aceae)
Género
Especie
Subespecie (variedad)
Subgénero (se escribe en paréntesis)
Tribu (-eae)
Subfamilia(-oideae)
Subtribu (-inae)
Suborden (-inae)
Subclase (-idae)
Figura 1: Taxones procariotas.
22
El nombre del género o subgénero es un sustantivo o adjetivo usado como
sustantivo en singular y escrito con letra mayúscula inicial. Ej. Lactobacillus. El nombre
de la especie es una combinación binaria, se escribe con el género seguido de un epiteto
específico. Si el epiteto tiene más de una palabra, son unidas. Ej. Propionibacterium acidi-
propionici se corrige a Propionibacterium acidipropionici. El nombre de las subespecies
surge de una combinación ternaria conformado por el nombre del género, seguido de un
epiteto específico, la abreviacion “subsp.” (subespecies) y finalmente, el epiteto
subespecífico. Ej. Bacillus subtilis subsp. spizizenii. 6
Microbiota del cuerpo humano
Tradicionalmente se consideraba que algunas partes del cuerpo o cavidades eran
estériles. Hoy sabemos que están repletas de microorganismos que actúan en su mayoría
como comensales. Algunos están presentes en diferentes partes del cuerpo, lo cual sugiere
que se concectan en una especie de “red microbiana”. A continúan se menciona la
microbiota característica de los diferentes nichos en el cuerpo: 7
Piel: Propionibacteria es el genotipo más frecuente en piel sebácea. En la mastitis,
el agente patógeno más comúnmente asociado es Staphylococcus aureus, aunque muchos
casos son reportados como no infecciosos por la ausencia de patógenos aislados en cultivos.
Las áreas húmedas de la piel, como la fosa antecubital contienen Betaproteobacteria como
Burkholderia y Bordetella. Áreas secas, como la planta, contienen Gamaproteobacteria
como Pseudomonas. Otras bacterias como Staphylococcus, Streptococcus, Cutibacterium,
y Corynebacterium también predominan. 7,8
23
Cavidad oral / Saliva: Se han descrito Bifidobacterium y Lactobacillus. 7
Intestino: Las bacterias aisladas normalmente en heces son Proteobacteria y
Firmicutes. 8 El microbioma intestinal del neonato a término se caracteriza por Clostridia,
Bifidobacterium y otros Firmicutes. El del prematuro tiene una cantidad menor de
Bifidobacterium y Bacteroidetes e incremento de anaerobios facultativos, Staphylococcus,
Escherichia coli, Klebsiella y otras Enterobacteriacease.9
Vagina: Se asemeja al del cérvix y es dominado por Lactobacillales, pero también
lo componen Clostridiales, Bacteroidales y Actinomycetales. 4
Líquido amniótico: Se ha descrito por mucho tiempo como un ambiente estéril. Se
pensaba que se originaba solo del microbioma de la vagina y cérvix, pero actualmente se
sabe que los microbiomas de la cavidad oral, intestino y placenta maternos contribuyen al
microbioma del líquido amniótico vía hemátogena. Su importancia en la microbiota del
recién nacido radica en que éste deglute grandes cantidades de líquido amniótico y se
coloniza antes de nacer. Aunque existen estudios que podrían refutar esta teoría, donde se
encontró que neonatos <30 SDG, que deberían de tener mayor colonización por ingesta de
líquido amniótico, en las muestras de meconio tempranas, no tenían tanta diversidad de
microbiota, se requieren más estudios para esclarecer esto.4,10
Placenta: Alberga patógenos no comensales como Firmicutes, Tenericutes,
Proteobacetria, Prevotella, Neisseria, Bacteroidetes y Fusobacteria; pero también
especies potencialmente patógenas como Escherichia coli.11
24
Después del nacimiento, el recién nacido se coloniza por la microbiota vaginal,
intestinal y de la piel materna. Al conocer que la leche humana posee su propia
microbiota, se reconoce que ésta juega también un papel predominante en la colonización
del neonato y lactante.
Leche humana
La leche humana es el alimento de elección para todos los recién nacidos. La
Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Academia Americana de Pediatría (AAP)
recomiendan el inicio de lactancia materna desde la primera hora de vida y continuarla de
forma exclusiva por al menos 6 meses, seguido de lactancia con introducción de alimentos
complementarios. La AAP sugiere continuarla por un año o más según se deseo de la madre
y el niño. 12
Las contraindicaciones para la lactancia son limitadas e incluyen condiciones del
lactante y maternas. Las del lactante constituyen: enfermedad metabólicas como
galactosemia, enfermedad de orina de jarabe de maple y fenilcetonuria (en ésta puede
continuarse pero con cantidades menores). Las condiciones maternas son: seropositividad
para el virus linfotrófico de células T1 o 2, brucelosis, tuberculosis activa (infecciosa),
herpes activo en la piel de la glándula mamaria, varicela y uso de drogas onco-biológicas
activas. La lactancia está contraindicada en madres con virus de inmunodeficiencia humana
(VIH) positivo, ya que el riesgo de transmisión por la leche materna es del 16%; sin
embargo, en lugares donde no hay insumos disponibles para alimentación con fórmula
25
(agua potable, fórmula disponible y accesible) se indica continuar la lactancia. 13En madres
con varicela cinco días previo al nacimiento o dos días posteriores, aunque se recomienda
separar al recién nacido hasta la resolución de las lesiones, se puede continuar la lactancia
con la extracción de la leche, siendo ésta segura para el neonato. Se brinda la misma
recomendación que en varicela para madres con influenza por el virus H1N1, con
aislamiento de la madre solo por el componente infeccioso sin repercusiones en la
seguridad de la leche. El uso de drogras legales (alcohol y tabaco) e ilegales (cocaína,
cannabis, metanfetaminas, entre otras) no es una contraindicación absoluta para suspender
la lactancia.14,15
La leche se produce en la glandula mamaria, la cual es una glandula sudorípara
apocrina, muy especializada. Experimenta cambios dramáticos en tamaño, forma y función
desde el nacimiento hasta el embarazo, lactancia y posteriormente involución. Tiene dos
características diferenciales muy importantes: tiene la capacidad de respuesta hormonal y
esta modificada para producir leche.
Desarrollo de la glándula mamaria
Su desarrollo prenatal se puede clasificar en dos procesos principales; la formación
de un esbozo mamario primario y la formación de una glándula mamaria rudimentaria. Se
origina en la cuarta semana de gestación en la region ventral del embrion a cada lado de la
línea media, donde existe un engrosamiento que va de la axila a la ingle y que se denomina
cresta o línea mamaria. Entre la quinta a séptima semana de la gestacion la region pectoral
26
de este engrosamiento se hiperplasia formando el primordio mamario. Pueden quedar
vestigios de esta cresta mamaria primitiva, lo que explica la existencia de pezones o mamas
supernumerarias. Siendo este tejido mamario poco desarrollado, y aproximadamente en el
1 % de las mujeres se hace evidente por primera vez durante la lactancia.
Para la semana 16 de gestación se produce una etapa de segmentación con la
fornación de 15 a 25 cordones de epitelio en el tejido subcutáneo que representarán a los
futuros alvéolos secretores. Se desarrolla la musculatura del pezón y areola. Ocurre
apoptosis de las células epiteliales centrales y continúa la segmentación y canalización. 16
Alrededor de las 32 semanas de gestación aparecen los primeros conductos de leche
y el sistema mamario vascular está completamente desarrollado. Comienza el desarrollo
del primordio mamario secundario, seguido de la formación de folículos pilosos, glándulas
sebáceas y sudoríparas, así como glándulas de Montgomery. La diferenciación del pezón
y la areola ocurre entre las 12 a 16 semanas de gestación a partir de células mesenquimales.
Todos estos procesos se llevan a cabo independientes de hormonas maternas, es hasta la
semana 28 de gestación que las hormonas placentarias entran a la circulación fetal y juegan
un papel en el desarrollo embrionario de la glándula mamaria. . 17
Cerca de término se desarrollan 15 a 25 ductos mamarios. Coalescen ductos y
glándulas sebáceas cerca de la epidermis. La diferenciación del parénquima ocurre con el
desarrollo de las estrucutras lobulares-alveolares que contienen el calostro. Ocurre entre
las 32 a 40 semanas de gestación y se conoce como la estapa vesicular-terminal.16
27
Anatomía de la glándula mamaria
La glándula mamaria se localiza en la fascia superficial entre el segundo a sixto
espacio intercostal sobre la fascia del pectoral profundo que está superficial al pectoralis
mayor. Tiende a superponerse a este músculo inferiormente para devenir superficial a los
músculos oblicuo externo y serrato anterior. Mide alrededor de 10 a 12 centímetros (cm)
de diámetro. Horizontalmente se localiza de la línea medio axilar a la línea paraesternal.
El grosor central de la glándula es de 5 a 7 cm.18,19
El peso de la glándula madura de una mujer no embarazada es de 200 gramos (g).
Durante el embarazo aumenta de peso y tamaño; cerca de término pesa de 400 a 600 g.
Durante la lactancia se incrementa de 600 a 800 g. 20
Fisiología de la lactancia
Existen tres estapas de lactogénesis o produccción de leche. Las primeras son
iniciadas por hormonas y ocurrirán independientemente de que se lleve a cabo la lactancia
o no.
Lactogénesis I: ocurre entre la semana 15 a 20 de gestación. Es dependiente de
hormonas. Todas las mujeres en esta etapa serán capaces de sintetizar los componentes de
la leche. La producción del calostro comienza a la mitad del embarazo.
Lactogénesis II: También es conocida como “la bajada de la leche”. Se produce tras
el descenso brusco postparto de la progesterona y del lactogeno placentario. Inicia 30 a 40
28
horas después del nacimiento. En 25% de las madres ocurre después de 72 horas del
nacimiento del bebé. Comienza tras el retiro de la placenta, ya que cualquier tejido
placentario residual (progesterona) inhibiría o comprometería su inicio. Es producida por
el descenso de la progesterona y del lactógeno placentario. La hormona principal durante
esta etapa es la prolactina pero participan otras hormonas como la insulina, cortisol,
tiroxina y oxitocina. Puede retardarse o afectarse por condiciones médicas como obesidad,
diabetes, cesárea o nacimiento prematuro.
Lactogénesis III: ocurre y continúa solo con la lactancia materna por la producción
de leche (galactopoyesis). Está bajo control autócrino, controlada por la remoción de leche
de la glándula mamaria. 21
Se ha descrito que la falla primaria en la lactancia ocurre en el 1 a 5% de las mujeres. Esto
es debido a insuficiencia del tejido glandular y ausencia de crecimiento mamario durante
el embarazo. Aunque no es común, es importante conocerlo y reconocer que en este número
de madres, no obstante una adecuada asesoría y esfuerzo, no se podrá llevar a cabo la
lactancia.14
Composición de la leche
Aunque existe cierta variabilidad, el contenido energético de la leche humana
madura es de aproximadamente 20 kilocalorías (kcal) por onza o 0.67 kcal por mililitro
(mL) y está determinada principalmente por la cantidad de lípidos. 22
29
Lípidos
Son el mayor componente de la leche, contribuyen con 40-55% del total de su energía,
contiene 3.2 a 3.6 g/decilitros (dL) de lípidos. La grasa de la leche humana se presenta en
forma de globulos de grasa lactea compuestos principalmente por triglicéridos (98%),
fosfolípidos (1%), colesterol y ésteres de colesterol (5%). Los glóbulos de lípidos tienen
un diámetro de 1 a 10 micras (m) y están compuestos por un centro de triacilgliceroles y
recubiertos por una capa de fosfolípidos. Contiene alrededor de 200 ácidos grasos, dos son
acidos grasos esenciales: acido linoleico y acido alfa-linolénico, así como sus derivados de
cadena larga, acido araquidonico y acido docosahexaenoico. Debido a la actvidad
enzimática prematura del neonato, las cantidades requeridas de ácido araquidónico y
docosahexanoico deben de provenir de la leche materna. Los acidos grasos poliinsaturados
de cadena larga (cadenas largas de más de 20 átomos de carbono más dos o más enlaces)
constituyen el 2% de la leche humana. Los ácidos grados poliinstaturados son
principalmente triglicéridos esterificados en las posiciones sn-2 y sn-3 y pueden formar
parte de la fraccion fosfolipídica. La leche humana contiene lipasa estimulada por sales
biliares y acido palmítico en la posicion β de la molécula de los triglicéridos. Estos
componentes singulares incrementan la biodisponibilidad de grasa de la leche al mejorar
la absorcion y la digestion. 12,23
Hidratos de carbono
La lactosa es el hidrato de carbono predominante en la leche humana, que es de
6.2 a 7.2 g/dL y aporta 40 a 50% del contenido calorico. 23
30
Proteínas
Contiene 400 proteínas diferentes con distintas funciones como nutrición, actividad
antimicrobiana e inmunomoduladora. El contenido proteico y composicion en la leche
humana cambia durante toda la lactancia, de concentraciones de alrededor de 2 g/dL al
nacimiento a 1 g/ dL en la leche madura. Las proteínas de la leche se dividen en tres grupos:
caseínas, suero y mucinas. Las proteínas de suero se encuentra solubles en solución y las
caseínas están suspendidas en forma de micelas. Las proteínas del suero representatitivas
son alfa-lactoalbúmina, lactoferrina e inmunoglobulina secretora IgA; existen otras, como
albúmina, proteína de unión a folato y lisozima. La relación suero/caseína fluctúa entre
70/30 y 80/20 en la lactancia temprana y disminuye a 50/50 en la fase tardía. 12,23
Micronutrientes
Las cantidades varían dependiento de la dieta materna y reservas. Sin importar la
dieta, las cantidades de vitaminas D y K en la leche materna no completan los
requerimientos para el lactante. 22
Oligosacáridos de la leche humana (HMO)
En cuanto al efecto que la alimentacion puede tener en el desarrollo de la
microbiota, se sabe que la leche humana incluye una serie de componentes de los que
carecen las formulas, entre los cuales se incluyen inmunoglobulinas, citocinas, factores de
crecimiento, lisozima, lactoferrina y los oligosacaridos de la leche humana, conocidos
como HMO. En 1926 se les conocía con el nombre de “factor bifidus” porque promovía el
crecimiento del commensal Bifidobacterium bifidus. 3
31
Los HMO son el tercer componente mayor de la leche humana con 12.9 g/L en la
leche madura y 20.9 g/L en el calostro. Se han descrito mas de 200 HMO, la mayoría
contienen un nucleo de lactosa, modificado covalentemente por fucosilacion y/o
sialilacion; algunos comparten dominios estructurales de glicanos similares, los que se
piensa funcionan como senuelos que previenen la adhesion de patogenos a los enterocitos.
Los monosacáridos que componen los HMO son L-fucosa, D-glucosa, D-galactosa, N-
acetilglucosamina y ácido N-acetilneuramínico. Los HMO son carbohidratos
especialmente abundantes en la leche humana, con funcion similar a los prebioticos,
estimulan el crecimiento de Bifidobacterium spp y quiza de Lacobacillus spp de tal modo
que alteran la composicion microbiana del intestino del neonato y lactante. 24
La producción de HMO está mediada genéticamente como resultado de la expresión
de transferasas específicas en los lactocitos. Dos genes determinan la producción de estas
enzimas: los genes de grupos sanguíneos Secretor y Lewis. El gen secretor codifica para la
enzima alfa-fucosiltransferasa 2 (FUT2) y el gen Lewis para la enzima alfa-
fucosultransferasa 3 (FUT3). Según la expresión de estas enzimas, se han descrito cuatro
fenotipos: Se+/Le+, Se-/Le+, Se+/Le- y Se-/Le-. Diferentes receptores de patógenos tienen
afinidades distintias por estructuras de carbohidratos, así que de esta forma, los distintos
perfiles de HMO alteran la microbiota.23
32
Tipos de leche
Calostro (1 a 5 días): Se produce en cantidades pequeñas y es rico en componentes
inmunológicos como inmunoglobulina A, lactoferrina, leucocitos y factores del desarrollo,
como factor de crecimiento epidérmico. Contiene una baja cantidad de lactosa, potasio y
calcio y niveles mayores de sodio, cloro y magnesio. 25
Leche de transición (6 a 15 días): su principal función es nutricional. Aumenta la
cantidad de lactosa y potasio, disminuye la concentración de sodio. 22
Leche madura (15 a 19 días): su función continúa siendo nutricional pero su
composición permanece estable, salvo pequeñas variaciones. 22
Factores inmunológicos
La leche materna contiene una variedad de células como macrófagos, células T,
células madre y linfocitos. Cerca del 80% de las células en la leche temprana son
macrófagos. La bacterias intestinales pueden estimular a los elementos linfoides e
influenciar positivamente la maduración del sistema inmune innato y adaptativo. Pueden
estimular el desarrollo de las células B en las placas de Peyer incrementando la producción
de inmunoglobulina A. Los neonatos tienen una actividad de células T predominantemente
de T2 cooperadoras (Th2) que promueve la inmunidad humoral con la producción de
interleucina (II) 4, 6 y 21. La leche materna puede promover la maduración de la actividad
citotóxica de células T1 cooperadoras (Th1) y mejorar la respuesta a infecciones.25
33
Diferencias en el prematuro
La leche obtenida de madres de lactantes prematuros presenta un contenido mas
alto de proteínas y algunos minerales que la leche de mujeres que amamantan a lactantes
nacidos a término. 26
Microbiota de la leche humana
Tradicionalmente, se consideraba que el feto humano sano se desarrollaba dentro
de un ambiente libre de bacterias, y al nacimiento, se exponía a una amplia variedad de
microbios, muchos de los cuales son provistos por la madre durante y después del trayecto
a través del canal de parto, un ecosistema ricamente colonizado por una variedad
relativamente limitada de taxas bacterianas 27
Este concepto ha sido recientemente retado por Aagard y colaboradores, quienes
han demostrado que en placentas de embarazos considerados sanos, se alberga un
microbioma consistentemente diferente del de otras partes del cuerpo, limitado en variedad
pero muy rico en actividad metabolica, con un perfil semejante al del microbioma oral; y
que ademas, en condiciones específicas, éste guarda una fuerte asociacion en cuanto a su
composicion con antecedentes de infeccion urinaria materna en el primer trimestre del
embarazo y nacimiento pretérmino 11
34
La leche humana constituye una gran fuente de bacterias, ya que con el consumo
de 800 mL/día de leche, el lactante ingiere entre 1x105 a 1x107 bacterias. La microbiota de
la leche es peculiar ya que se caracteriza por su naturaleza transitoria: su desarrollo inicia
en el tercer trimestre e incrementa su complejidad al final de este, permanece casi constante
durante la lactancia y disminuye con el destete, desapareciendo rápidamente con la
ausencia de leche en la glándula mamaria. 27
En un inicio el calostro se caracteriza por la presencia de Staphylococcus,
Streptococcus, Lactobacillus y Weisella. La leche madura tiene un microbioma similar a
la cavidad oral: Veillonella, Leptotrichia y Prevotella.9
Origen de la microbiota en la leche humana
El origen de las bacterias en la leche humana es controversial, en un inicio se creía
que las bacterias provenían de la piel de la glándula mamaria. Pero los estudios realizados
sobre el microbioma de la leche en comparación con la piel del adulto no coinciden; aunque
se encuentran Staphylococcus, Corynebacteria y Propionibacteria como en la piel, lo están
en menor proporción. 28,29
Se ha encontrado mediante fotografía infrarroja cierto grado de reflujo de leche a la
glándula mamaria durante la succión, lo que permitiría paso de bacterias de la cavidad oral
del niño a la glándula y a la vez de la glándula mamaria a la cavidad oral del niño. 30 Existen
pocos estudios del microbioma de la saliva humana en niños, pero en adultos la especie
predominante es Streptococcus, la cual es el filotipo más abudante en el calostro de la leche
35
humana. 31–33 Apoyando esta teoría, Biagi y coolaboradores encontraron en una cohorte de
21 prematuros moderadamente tardíos (32-34 semanas de gestación (SDG)), como la
composición de la leche materna cambiaba a través del tiempo cuando se iniciaba la
alimentación del seno materno en comparación de la alimentación con leche extraída; esto
asociado con diferentes ecosistemas en intestino y cavidad oral de los neonatos.34
Respecto a las bifidobacterias, las cuales son anaerobias estrictas, se piensa que el
origen es el intestino a través de las células dendríticas a los nódulos linfáticos, sistema
linfático y finalmente a la glándula mamaria gracias a la regulación de hormonas
lactogénicas. No obstante, el mecanismo exacto no se ha elucidado aún, permaneciendo
estas como teorías. 35–38
Aún no se conoce el papel que juegan las hormonas maternas en la colonización de
la glándula mamaria en los primeros meses de vida y su impacto en la microbiota de la
leche humana. Se necestan más estudios para esclarecer esto. 7
Recientemente se arroja evidencia que muestra la importancia del ambiente físico
y social alrededor de la madre-niño como puntos importantes en el desarrollo de la
microbiota de la leche. Por ejemplo, número de cuidadores, qué tan frecuente lo hacen,
entre otros.39
36
Vía de nacimiento
Se sabe también que, independientemente de la vía de nacimiento, las comunidades
bacterianas que alojan los bebés son muy semejantes entre los diferentes sitios de su
organismo, a diferencia del individuo adulto, que alberga diferentes tipos de organismos
en diferentes sitios de su cuerpo. 10
También se ha descrito que los bebés nacidos por vía vaginal se colonizan
preferentemente por organismos semejantes a la microbiota del canal vaginal materno,
dominados por Lactobacillus, Prevotella, or Sneathia spp., en tanto que los nacidos por
cesarea alojan comunidades bacterianas semejantes a las de la piel de sus madres,
dominadas por Staphylococcus, Corynebacterium, y Propionibacterium spp. Estos
hallazgos establecen un fundamento para el estudio y rastreo del desarrollo del microbioma
en relacion a los diferentes modos de nacimiento. 40
Metagenoma de la leche humana
La metagenómica es el estudio de los microbios en su ambiente vivo natural y su
respectiva composición genómica usando metodología no basada en cultivos.
Anteriormente los cultivos eran el único medio para detectar bacterias; sin embargo, 60-
85% de las bacterias detectadas por metagenómica no crecerán en medios de cultivos
estándar. Actualmente la metagenómica hace uso de la secuenciación de nueva generación
para detectar secuencias de DNA mediante pirosecuenciación, RNA por secuenciación de
37
16S ácido ribonucleico ribosomal (rRNA) o secuenciacion del exoma completo “en
escopeta” (“shotgun”, en inglés). 3
RNA ribosomal 16S
Es la molécula más usada para el análisis filogenético ya que contiene genes conservados
en regiones variables. Posee una alta sensibilidad, ya que no requiere de cultivos. Realiza
secuenciación de 9 regiones hipervariables (V1-V9) de las bacterias, las cuales están
altamente conservadas filogenéticamente. Tiene como limitaciones que no puede
diferenciar entre especies relacionadas estrechamente por la homología de su secuencia, de
forma que la diferenciación de género es lo más confiable. Tampoco puede dar información
de la capacidad funcional de los microbios. 10
El número de secuencias largas obtenidas con 454 pirosecuenciación excede el método de
secuenciación convencional de Sanger y permite la detección de bacterias abundantes pero
raras.5
Secuenciación del exoma completo en “escopeta”
Genera numerosas secuencias que se asignan a genomas de referencia. Esto puede
representar un problema para organismos que no cuentan con estas referencias. A pesar de
las grandes ventajas en detección de bacterias que tienen estas técnicas, el cultivo debe de
permanecer siempre como complementario. Los cultivos ayudan a establecer el repertorio
de la microbiota normal del microambiente. Además, a diferencia de los estudios
moleculares ya descritos, pueden detectar organismos vivos. 3,7
38
Estudios actuales
El primer estudio basado en el microbioma de la leche humana fue realizado en
Estados Unidos por Hunt y colaboradores quienes secuenciaron las regiones V1-V2 del
16S rRNA de muestras de leche humana de 16 mujeres sanas en tres periodos de tiempo a
lo largo de 4 semanas. Encontraron que las bacterias que estaban presentes siempre en cada
muestra de leche eran Streptococcus, Staphylococcus, Serratia, Pseudomonas,
Corynebacteria, Ralstonia, Propionibacterium, Sphingomonas y Bradyrhizobiaceae, y
representaban alrededor del 50% del microbioma de la leche materna. 41
Se han encontrado también bacterias resistentes al calor y frío, lo que les ayudaría
a persistir en la leche extraíada, refrigerada y recalentada. Esto tiene particular importancia
en el advenimiento de bancos de leche y los criterios de pasteurización que utilizan. La
pasteurización de la leche tiene la finalidad de eliminar patógenos mientras preserva los
componentes bioactivos. En los bancos de leche que no pasteurizan del todo o de forma
adecuada, algunas bacterias podrían sobrevivir y cambiar el perfil de la microbiota para
mejorar la superviviencia, siento esto no necesariamiente de mayor beneficio.8,22
En el 2015 Jiménez y coolaboradores realizaron un análisis del metagenoma de la
leche humana de diez mujeres sanas y diez con mastitis. En las mujeres sanas los filum
principales fueron Proteobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes y los géneros
Stahpylococcus, Streptococcus, Bacteroides, Faecalibacterium, Riuminococcus,
Lactobacillus y Propionibacterium. Se buscaron otros microorganismos, encontrando
ADN de Malassezia en todas las muestras y Toxoplasma gondii en siete mujeres sin datos
39
de infección. Las arqueas solo se detectaron en ocho de las diez mujeres sanas. No se
dectectaron las mismas familias de virus en todas las muestras, pero los reportados fueron
Papillomaviridae, Retroviridae, Siphoviridae y Herpesviridae 42
El 26 de septiembre del 2017 inició un proyecto con el objetivo de caracterizar el
microbioma de las diferentes partes del cuerpo humano, este se llamó “Proyecto del
Microbioma Humano” (HMP), incluyó muestras de 48 sitios, 31,596 en total,
principalmente de heces, cavidad oral, vagina, pero ninguna de la glándula mamaria o leche
humana. Se puede consultar en la siguiente dirección: https://portal.hmpdacc.org.
Togo y coolaboradores realizaron una revisión sistémica de la microbiota de la
glándula mamaria y la leche humana del 1 de enero de 1953 al 31 de diciembre del 2017,
incluyeron 242 artículos (142 de leche humana y 100 de tejido mamario) de 38 países, con
11,124 madres y 15.489 muestras incluidas. Los métodos de detección eran por cultivos en
192 estudios o detección de ácido desoxirribunocleico (DNA), en 15 estudios (14 por 16S
rRNA y 1 por secuenciación del exoma completo). Encontraron 820 especies de bacterias
y arquea de 17 filum: Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria,
Deferribacteres, Deinococcus–Thermus, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria,
Gemmatimonadetes, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Synergistetes,
Tenericutes, Thermotogae y Verrucomicrobia; 33 clases; 72 órdenes; 137 familias y 303
géneros indentificados por cultivo o métodos moleculares. La mayoría de las bacterias eran
Proteobacteria (270 especies), Firmicutes (268 especies), Actinobacteria (203 especies) y
Bacteroidetes (47 especies). 7
40
En neonatos pretérmino, los estudios acerca de la microbiota se han enfocado
principalmente en conocer los cambios asociados a condiciones con alta morbilidad, como
la enterocolitis necrotizante, en los que se reporta que hay una reduccion en la diversidad
microbiana intestinal, comparando con neonatos pretérmino no enfermos, mientras que
otros estudios han reportado una proporcion mas abundante de Proteobacteria, incluyendo
Citrobacter spp. 10
Pardo y coolaboradores realizaron un estudio en Valencia, España, con el objetivo
de ver el impacto del estadio de lactancia, edad gestacional y vía de nacimiento con la
microbiota de la leche humana. Incluyeron 32 madres en el periodo de diciembre 2006 a
diciembre 2009. De esas madres, 13 tuvieron embarazos de término y 19 pretérmino.
Aunque en sus criterios de inclusión incluyeron pretérminos tardíos, su definición de estos
fue “mayor o igual a 32 semanas y menor de 37 semanas de gestacion”. En el grupo de
pretérmino el rango fue de 23 a 32.7 semanas de gestación, de forma que no se incluyeron
pretérminos tardíos en el estudio. 2
No existen artículos sobre metagenoma o microbioma de la leche humana con
enfoque en prematuros tardíos. Aunque un factor de riesgo importante es el embarazo de
adolescentes, nos limitaremos al estudio de binomios materno-fetales en madres adultas,
para minimizar la variabilidad asociada a las condiciones particulares al embarazo en la
adolescencia.
41
Caracterización del recién nacido pretérmino tardío
Se define al recién nacido pretérmino como aquél que nace entre las 34 0/7 y 36 6/7
semanas de gestacion. 43,44
La incidencia de recién nacidos prematuros oscila entre el 5 y 18% según lo
reportado en la literatura internacional, de estos aproximadamente 72% corresponden a
prematuros tardíos. Segun el INEGI en el 2018 se registraron 2,162,535 nacimientos en
México y de estos 93, 886 en el estado de Nuevo Leon; sin embargo, no existe un registro
confiable ni detallado de cuantos de estos nacimientos corresponden a recién nacidos
prematuros. 45,46
Factores de riesgo
Las razones para la presentación de embarazos pretérmino tardíos no está
comprendida del todo, aunque se considera que la principal causa es el trabajo de parto
pretérmino idiopático. Se han encontrado otros factores contribuyentes, como un
incremento en la incidencia de prematuros tardíos en madres menores de 20 anos y mayores
de 35 anos, en embarazos multiples, falta de control prenatal, gestaciones múltiples, bajo
estado socioeconomico y comorbilidades maternas como hipertension, preeclampsia,
eclampsia, diabetes gestacional, ruptura prematura de membranas, desprendimiento de
placenta y el uso de técnicas de reproduccion asistida. 47
42
El trabajo de parto prematuro es un síndrome resultado de múltiples causas como
infección o inflamación intrauterina, estrés, ambiente socioeconómico y sobredistensión
uterina. Aunque las vaginosis bacterianas incrementan el riesgo de parto prematuro, éstas
no se ven reducidas significativamente por el uso de antibióticos.48
Como ya se ha mencionado las infecciones intrauterinas como corioamnionitis, así
como la inflamación intrauterina, son causa de trabajo de parto prematuro, aún con
membranas amnióticas íntegras. Mujeres con cultivos amnióticos negativos y trabajo de
parto prematuro muestran marcadores inflamatorios como interleucina 6, otras citocinas
proinflamatorias, quimoquinas, factor de necrosis tumoral alfa o metaloproteasa 8 de la
matriz (MMP-8).49
Complicaciones de la prematurez tardia
El 34% de las admisiones a las unidades de cuidados intensivos neonatales son de
prematuros > 34.0 SDG y 66% de los prematuros tardíos requieren cuatro o mas días de
hospitalizacion. Se consideran un grupo de riesgo debido a que los problemas
transicionales persisten; tales como la pobre termorregulacion, dificultad para
alimentacion, hipoglucemia no detectada, dificultad respiratoria e hiperbilirrubinemia. 50
Debido al incremento en la morbilidad de los prematuros el Colegio Americano de
Obstetras y Ginecologos (ACOG) recomienda que las cesareas electivas se realicen solo a
partir de las 39 0/7 semanas de gestacion en embarazos con fechas de ultima menstruacion
confiables. 44,51
43
Las enfermedades inflamatorias representan la mayor amenaza para el prematuro
tardío y afectan todos los sistemas y órganos con consecuencias agudas y crónicas para su
salud. A pesar de que los antibióticos son utilizados para tratar las infecciones prenatales,
o postnatales ocasionadas por bacterias patogénas, no pueden reducir o prevenir la
inflamación concomitante ni las consecuencias de la disbiosis en la microbiota tras su uso.4
Dificultad respiratoria
El riesgo de dificultad respiratoria en los prematuros tardíos en comparacion con
los recién nacidos de término se incrementa de ocho a nueve veces. Existe una mayor
incidencia de taquipnea transitoria del recién nacido, hipertension pulmonar y falla
respiratoria. Del grupo de prematuros tardíos, el 23 a 30% requerira apoyo respiratorio y 3
a 4% algun tipo de ventilacion mecanica. 52 53
Termorregulacion
El principal motivo de ingreso a la unidad de terapia intensiva neonatal es la
hipotermia secundaria a la falla en la termorregulacion. Esto se origina por un aumento en
la pérdida de calor ya que el prematuro tardío posee una mayor area de superficie corporal
y menor deposito de tejido graso que su contraparte de término. Aunado a ello, la
hipotermia conduce a una pobre transicion respiratoria y exacerba la hipoglucemia
característica de este grupo de riesgo. 54
44
Hipoglucemia
La hipoglucemia es mas frecuente en recién nacidos pretérmino tardío en
comparacion con neonatos de término, con un incremento del riesgo de 2 a 3 veces. De
estos, el 8% desarrollan hipoglucemia que requerira tratamiento farmacologico. La
etiología de la hipoglucemia transitoria en este grupo de edad esta conformada por factores
maternos (preeclampsia, medicamentos, diabetes) y neonatales (embarazos multiples,
síndrome de dificultad respiratoria, sepsis, asfixia, hipotermia, policitemia, deficiencia de
transportador de glucosa específico y trombocitopenia isoinmune). 55,56
Maduracion gastrointestinal
La dificultad para la alimentacion ocurre en un 30 al 40% y disminuye con las
semanas postnatales. Se presenta debido a que existe una coordinacion inadecuada entre
succion y deglucion, ademas de hipotonía. Aunque han alcanzado mayor madurez
gastrointestinal y neurológica que los menores de 34 0/7 SDG, la lactancia materna
representa un gran desafío debido a periodos cortos de vigilia, pobre succion y falta de
coordinacion de succion - deglucion. Esto conlleva a una retroalimentacion negativa donde
debido a un estímulo de succion deficiente se produce menor cantidad de leche y los
periodos de succion disminuyen. 57,58
45
Enterocolitis necrotizante
La enterocolitis necrotizante (ECN) se caracteriza por edema y hemorragia de la
submucosa, infiltración de la pared intestinal por neutrófilos, disrupción de la arquitectura
de las vellosidades y en casos severos, necrosis del espesor completo de la pared intestinal
o perforación intestinal. Es una de las enfermedades con mayor morbilidad de los
prematuros. Se ha estudiado ampliamente su relación con la disbiosis de la microbiota
intestinal.
Tiene una prevalencia del 7% en neonatos entre 500-1500 g o una incidencia de 1.1
por cada 1000 nacidos vivos. La mortalidad estimada es del 20-30% siendo mayor en los
neonatos con peso bajo al nacer y aquellos que requieren cirugía. El peso también juega un
papel importante ya que aumenta la incidencia en un 10% en neonatos <1000 g. La
morbilidad se estima de un 25% con síndrome de intestino corto o retraso en el
neurodesarrollo.9
Aunque es una enfermedad ampliamente estudiada, no se ha podido establecer una
sola etiología, considerándosele multifactorial. Se ha asociado a diferentes factores como
alteración en la barrera gastrointestinal, factores bioquímicos, factores inmunes, regulación
circulatoria e inflamatoria alteradas, dismotilidad intestinal y disbiosis intestinal. Pero los
factores que se asocian más con su presentación son la prematurez y el peso bajo al nacer.
Su incidencia se asocia con una menor edad gestacional, presentándose en 57% de
los prematuros <29 SDG y solo 9% de los recién nacidos de término. La presentación en
46
los prematuros es usualmente entre la tercera y cuarta semana de vida y en los neonatos a
término se presenta antes, dentro de los primeros diez días de vida. 59
Respecto al tipo de alimentación, se ha encontrado que la alimentación a base de
fórmula en comparación a la basada en leche materna, incrementa el riesgo de desarrollar
entorocolitis necrotizante en 2.77 veces (95%, IC 1.4 a 5.46).60
El diagnóstico inicialmente era clínico, descrito por Bell y coolaboradores desde
1978 por la presencia de manifestaciones sistémicas (distermia, letargia, apnea,
bradicardia) así como manifestaciones gastrointestinales (disminución de la ingesta,
aumento de residuo alimenticio, vómito, distensión abdominal y sangre en heces) y
manifestaciones radiológicas. Fueron modificados en 1986 de forma que se provee una
definición uniforme acerca del cuadro clínico, mencionarlos está fuera del objetivo del
presente estudio.
Posteriormente se desarrollaron biomarcadores con el objetivo de diagnosticar la
enfermedad de forma temprana. Se han descrito biomarcadores no específicos: proteína C
reactiva, amiloide A sérico, procalcitonina, factor activador de plaquetas, citocinas (IL-6,
IL-8, IL-10, IP-10, RANTES), albúmina modificada por isquemia (IMA), factores de
crecimiento epidérmico (EGF), vascular endotelial (VEGF) y antígenos de superficie de
cumulos o “cluster” de diferenciación (CD) (CD69, CD64 y CD11b). También se han
desarrollado marcadores específicos como la calprotectina, S100A12 (calgranulina C),
proteínas ligadoras de ácidos grasos intestinal (I-FABP), hepática (L-FABP), FF3 factor
trefoil 3 (FF3), claudinas; ó herramientas como genómica, proteómica o metagenómica.61
47
El tratamiento puede ser médico o quirúrgico dependiendo de la clínica del
paciente. Actualmente se están estudiando la forma de prevenir la enfermedad. Se sabe que
los probióticos reducen la incidencia de enterocolitis (grado de evidencia A/B), aunque se
describen Bifidobacteria, Lactobacillus y Saccharomyces, hasta el día de hoy no existen
recomendaciones formales respecto al tiempo de inicio o la duración de la administración
de éstos. Se sugiere iniciarlos en la primera semana de vida y continuarlos al menos dos
semanas. 62
El manejo médico de la ECN es de apoyo, con líquidos intravenosos,
descompresión gástrica con el uso de sonda orogástrica y el uso de antibióticos de amplio
espectro. Los antibióticos recomendados son ampicilina, gentamicina y metronidazol;
ampicilina, cefotaxima y metronidazol o meropenem. Puede usarse vancomicina en lugar
de ampicilina si se sospecha de una infección por estafilococo aureus resistente a meticilina
(MRSA) o resistente a ampicilina. El uso de fluconazol o anfotericina se recomienda si el
frotis teñido con Gram o el cultivo sugieren infección por hongos.63
Se describe predominancia de bacterias gram negativas y disminución de anerobios
antes de la aparición clínica de enterocolitis. Se han encontrado cambios a nivel de fila en
el microbioma de 3 a 7 días antes del diagnóstico de enterocolitis, con incremento de
Enterobacteria. El microbioma de los neonatos con ECN se caracteriza por presencia de
Gammaproteobacteria, Citrobacter, Klebsiella spp., Proteobacteria y disminución de
Firmicutes, Propionibacterium. Hasta el día de hoy se desconoce si este cambio en el
microbioma es consecuencia de inmadurez gastrointestinal o inmunológica.3,4
48
Finalmente Denning y coolaboradores describen un tratamiento diferente, enfocado
en el microbioma. Lo dividen en 3 partes:
1) Aditivo, suplementación con cadenas específicas de organismos (probióticos).
2) Substractivo, remoción de miembros patógenos específicos del microbioma.
3) Modulatorio, administración de agentes no vivos (prebióticos) para modificar la
composición o actividad del microbioma. 9
Hiperbilirrubinemia
La hiperbilirrubinemia resulta del incremento en la produccion de bilirrubinas con
una eliminacion disminuida secundario a la inmadurez de la conjugación hepatica, lo que
contribuye a mayor prevalencia, severidad y duracion en prematuros tardíos. La inmadurez
gastrointestinal precipita la hiperbilirrubinemia debido a diversos grados de deshidratacion
e incremento de la circulacion enterohepatica de la bilirrubina. 53,64
Desarrollo neurocognitivo
El desarrollo del encéfalo continua con un incremento del 50% de volumen cortical
entre las semanas de gestación 34 y 40. Una cuarta parte del cerebelo se desarrolla pasada
la etapa de prematuro tardío. A las 34 semanas de gestacion el cerebro pesa solo el 65% en
comparación con el de término y la formacion de giros y surcos esta incompleta. El
volumen cortical aumenta 50% entre las 34 y 40 semanas y el 25% del desarrollo cerebelar
49
ocurre en este periodo. Los insultos con disminucion de flujo cerebral en esta etapa pueden
conducir a dano encefalico con secuelas neurologicas. 65–67
Infecciones nosocomiales
La piel de neonatos está colonizada por Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria
y Bacteroidetes. En su atención en la terapia neonatal la disrupción de la barrera dérmica
los pone en riesgo de infección por estos agentes. La microbiota intestinal confiere
protección de la translocación intestino-epitelial. 4,68
Existe una mayor prevalencia de bacterias intestinales en el prematuro como
Staphylococcus, Enterococcus y Enterobacteriacea y menor número de Bifidobacteria, lo
que predispone a infecciones. El uso de antibióticos pre y postnatales reduce la diversidad
de la microbiota, provocando un cambio de Firmicutes y Bacteroidetes a Proteobacteria y
Actinobacteria. 4
Desarrollo de la microbiota intestinal en el prematuro
El desarrollo de la microbiota en el prematuro difiere del recién nacido de término.
Arboleya y coolaboradores reportaron durante un estudio de 90 días que los prematuros
tienen menores niveles del grupo de bacterias Bacteroides y Atopobium pero niveles
mayores de Enterococcaceae y Lactobacillus comparado con los recién nacido de término.
69
50
Se describe el predominio en prematuros de géneros en el intestino como Anaerococcus,
Aquabacterium, Bacillus, Bifidobacterium, Corynebacterium, Micrococcus,
Oceanobacillus, Propionibacterium, Pseudomonas, Rothia, Sarcina, Sneathia y
Streptococcus. De forma general el micriobioma intestinal del prematuro está constituido
por Proteobacteria y de forma retardada por Clostridium y Vellonella.4
Especies como ureaplasma y mycoplasma, así como Aerococcaceae,
Bifidobacteriaceae y Fusobacteria están de forma predominante o casi exclusiva en las
membranas amnióticas del prematuro. Esta disbiosis bacteriana e inflamación de las
membranas fetales pueden presentarse sin trabajo de parto prematuro. Se ha documentado
que la infección intrauterina e inflamación con membranas íntegras son causa de trabajo
de parto prematuro. Bacterias como Streptococcus, Porphyromonas, Filifactor,
Campylobacter y Fusobacterium también se han relacionado con trabajo de parto
prematuro.4,49
En la colonización ascendente de las membranas amnióticas del tracto urogenital
que ocasiona inflamación y/o corioamnionitis se han aislado especies de bacterias del
género Streptococcus, E. coli, Gardnerella spp., Prevotella, Gonorrhea, Treponema,
Chlamydia, Ureaplasma y Mycoplasma, así como levaduras como Candida. Actualmente
con la mejora de la tecnología de detección bacteriana (metagenómica), se ha reportado
anaerobios como Fusobacteriaceae.70
Forsgren y coolaboradores describieron que la microbiota intestinal del recién
nacido de término se caracteriza por una alta frecuencia de bifidobacterias tras el
nacimiento. Bifidobacteria se detecto en todas las etapas del estudio siendo B. longum la
51
especie mas frecuente, seguido por especies de Clostridium; en cambio C. difficile se
detectaba solo a partir de los 6 meses de edad. 69
La colonizacion intestinal del prematuro tardío muestra un retraso en el desarrollo
en comparacion con el recién nacido de término. La frecuencia de Bifidobacterium es
significativamente menor, alcanzando los niveles del neonato de término hasta los 6 meses
de edad. 71
Aunque en el neonato de término el modo de nacimiento juega un papel importante
en el desarrollo de la microbiota, no es así en el pretérmino. Se sugiere que si existe un
cambio en el microbioma según la vía de nacimiento en prematuros, es por la causa de la
indicación materna de cesárea y no por la diferente vía de nacimiento. La variabilidad de
la microbiota intestinal del prematuro en etapas tempranas está dado por la edad
gestacional, uso de antibióticos maternos, ruptura prematura de membranas y tipo de
alimentación (leche materna contra fórmula).3,4,10
52
Capítulo 3. Metodología
Diseño del Estudio
Se trata de un estudio observacional, descriptivo, transversal y comparativo.
Participantes
Se reclutaron dos grupos de binomios, madre – hijo. El primer grupo se consideró
el grupo control, con madres sanas. El segundo grupo, fue el grupo de estudio, con madres
que tuvieron embarazos pretérmino tardíos (34 0/7 a 36 6/7 semanas de gestación). Se tuvo
como objetivo reclutar a 20 binomios en cada grupo.
El grupo control estuvo conformado por madres adultas, con edad entre 18 y 34
años, con índice de masa corporal entre 18.5 y 24.9, con embarazo a término (mayor o
igual a 37 semanas), sin eventos intercurrentes en el embarazo, con control prenatal
adecuado y que culminaran su embarazo en el Hospital Regional Materno-Infantil (HRMI).
El grupo de estudio estuvo conformado por madres adultas, con edad entre 18 y 34
años, con índice de masa corporal entre 18 y 24.9, en las condiciones de un embarazo
pretérmino tardío (34 0/7 a 36 6/7 semanas de gestación), con control prenatal adecuado y
que culminaron su embarazo en el HRMI.
Tamaño de muestra
Dado que se trata de un estudio exploratorio y que no se buscó contrastar ninguna
hipótesis en particular, no fue necesario realizar una estimación probabilística del tamaño
muestral. Debido a la disponibilidad de recursos financieros, se limitó el estudio a un
53
muestreo definido a conveniencia, de casos consecutivos (secuencial), no probabilístico y
no aleatorizado.
Entorno
Hospital Regional Materno-Infantil, de los Servicios de Salud del Estado de Nuevo
León, en la ciudad de Guadalupe, Nuevo León México.
Periodo del Estudio
Se reclutaron pacientes entre las fechas de 01 de febrero de 2019 y 31 de agosto de
2019.
Factores ambientales por controlar
Con el fin de controlar los efectos derivados del medio ambiente en la microbiota,
se incluyeron exclusivamente madres mexicanas, con residencia los últimos doce meses
previos al embarazo en la zona metropolitana de Monterrey (compuesta por los municipios
de Apodaca, García, Escobedo, Guadalupe, Juárez; Monterrey, San Nicolás, San Pedro y
Santa Catarina), y sus hijos recién nacidos, con los siguientes criterios:
Inclusión:
1. Cumplir las características de un solo grupo de estudio.
2. Que acepten la invitación a participar en el estudio, y firmen el documento de
consentimiento informado, con sus anexos.
3. Con domicilio en la zona metropolitana de Monterrey.
54
Exclusión
1. Haber recibido antibióticos durante los 3 meses previos al ingreso al hospital; o haber
estado sujetas a tratamientos antibióticos prolongados por más de 3 meses en cualquier
momento previo al nacimiento.
2. Haber recibido tratamiento con esteroides en dosis inmunosupresoras o
inmumoduladoras. No se incluye a la administración de agentes de maduración pulmonar.
3. Tener una dieta vegana, ovolactovegetariana, o que excluya algún grupo de nutrientes
(ej. Dieta cetogénica).
4. Antecedente de cirugía bariatrica.
5. Historia de trastornos de la alimentación. Anorexia nervosa, bulimia, comedora
compulsiva, etc.
6. Haber recibido tratamiento antineoplásico de cualquier tipo durante su vida.
7. Antecedente de haber tenido una cirugía complicada en los 12 meses previos a la toma
de muestra.
8. No tener una FUM confiable.
9. Haber recibido antagonistas de H2-histamina y/o inhibidores de bomba de protones.
10. Haber padecido diarrea durante las dos semanas previas al nacimiento.
11. Historia de uso de medicamentos biológicos (anticuerpos monoclonales).
12.Historia de cualquier enfermedad crónica no transmisible diferente a
sobrepeso/obesidad (enfermedades autoinmunes, insuficiencia renal, hipertensión arterial,
etc.) que requiera tratamiento, aunque no lo haya recibido.
55
Eliminación:
1. Recibir antibióticos (la madre) por vía parenteral por más de 24 horas después del
nacimiento.
2. Que madre o bebé requieran cuidado intensivo posterior al nacimiento.
3. Cualquier otra causa que impida la obtención de la muestra de leche.
Variables
Se analizaron variables de tipo cualitativo y cuantitativo.
Variables Cuantitativas
Volumen de leche recolectado, fecha de nacimiento del bebé, fecha de la extracción
de leche, edad materna, número de gestación, partos previos, cesáreas previas, abortos
previos, índice de masa corporal, fecha de última menstruación (FUM), edad gestacional.
Ruptura de membranas, peso del RN, talla del RN, perímetro cefálico del RN.
Variables Cualitativas
Tipo de leche recolectado, consumo de tabaco, consumo de alcohol, consumo de
otras drogas, portadora de tatuajes, antecedentes patológicos diferentes a los definidos en
la variable independiente, estado civil, diabetes mellitus gestacional, infección de vías
urinarias, cervicovaginitis, recibió antibióticos en los tres meses previos, recibió
antibióticos intraparto, presentó trabajo de parto, vía de nacimiento, fue cesárea de
urgencia, sexo del RN, embarazo a término, embarazo pretérmino, control prenatal
adecuado.
56
Definición operacional de las variables
Tabla 1
Definición operacional de las variables cualitativas. Variable Definición operacional
Tipo de leche Especificar si la muestra de leche recolectada corresponde a calostro, leche de
transición o leche madura.
Consumo de tabaco Consumo de tabaco antes o durante el embarazo.
Consumo de alcohol Consumo de alcohol antes o durante el embarazo.
Consumo de drogas Consumo de otras drogas diferentes a tabaco o alcohol antes o durante el embarazo.
Tatuajes Se ha realizado algún tatuaje.
Antecedentes
patológicos
Tiene alguna enfermedad diferente a la diabetes mellitus gestacional, preeclampsia u
obesidad. Sí o no, especificar en caso de respuesta afirmativa.
Estado civil Estado civil de la madre al momento de la entrevista. Soltera, casada, unión libre, viuda
o divorciada.
Infección de vías
urinarias
Presentó infección de vías urinarias durante el embarazo.
Cervicovaginitis Presentó cervicovaginitis durante el embarazo.
Antibióticos tres meses
previos
Recibió antibióticos en los tres meses previos al nacimiento, sin contar los
administrados durante el periodo intraparto.
Antibióticos intraparto Recibió antibióticos en el periodo intraparto, caracterizado por ± 2 horas de la fecha y
hora de nacimiento del producto. Sí o no.
Trabajo de parto Tuvo trabajo de parto.
Vía de nacimiento Vía de nacimiento por la que se obtuvo el producto.
Cesárea de urgencia La cesárea se tuvo que realizar en condiciones de urgencia, debido a alguna situación
que comprometía la seguridad del feto o la madre.
Sexo del RN Sexo del recién nacido. Masculino, femenino o indefinido.
Embarazo a término El embarazo llegó a término, definido como una duración mayor o igual a 259 días (37
semanas).
Embarazo pretérmino
tardío
El embarazo fue pretérmino tardío, definido como una duración mayor o igual a 238
días (34semanas) y menor a 259 días (37 semanas).
Control prenatal
adecuado
La madre recibió control prenatal adecuado durante el embarazo, definido como 5 o
más consultas prenatales.
Tabla 2
Definición operacional de las variables cuantitativas. Variable Definición operacional
Volumen de leche
recolectado
Cantidad de leche en microlitros que se logró recolectar.
Fecha de
nacimiento
Fecha de nacimiento del bebé, en el formato dd/mm/aa.
Fecha de la
extracción de leche
Fecha en que se realizó la extracción de leche materna, en el formato dd/mm/aa.
Edad materna Edad materna en años cumplidos.
Gesta Número de embarazos, incluyendo el actual.
Partos previos Número de partos previos, sin contar el actual.
57
Cesáreas previas Número de cesáreas previas, sin contar la actual.
Abortos previos Número de abortos previos.
Índice de masa
corporal
Índice de masa corporal en las unidades de Kg/m2, calculado al dividir el peso en
kilogramos, entre la talla en metros elevada al cuadrado. Número racional redondeado a la
décima mas cercana.
FUM Fecha en que presentó el primer día de la última menstruación. En el formato dd/mm/aa.
Edad gestacional Días transcurridos desde la fecha de última menstruación hasta la fecha de nacimiento.
Puede ser en días enteros o convertido a semanas y días.
Ruptura de
membranas
Diferencia de tiempo desde que se presenta la ruptura de membranas, hasta el momento
del nacimiento del bebé. En horas cumplidas.
Peso del RN Peso en gramos del recién nacido.
Talla del RN Talla en centímetros del recién nacido.
Perímetro cefálico
del RN
Perímetro de la cabeza en centímetros del recién nacido.
Muestras Biológicas
Se obtuvieron de cada binomio las siguientes muestras biológicas:
1. Sangre total, suero y plasma maternos
2. Leche materna temprana
3. Líquido amniótico en los casos de cesárea
4. Meconio
5. Sangre total, suero y plasma de la placenta, cara fetal
6. Tejido placentario.
Etiquetado de las muestras
Se utilizaron etiquetas autoadheribles previamente impresas en una etiquetadora
electrónica P-touch 1890, Brother®.
El formato de etiquetado fue el siguiente: el texto “CMH2019” para identificacion del
protocolo, seguido de un espacio y después el número de grupo, en numeración arábiga a
un dígito, seguido de una letra para designar si la muestra fue materna o fetal (letra “A”
58
para las muestras de la madre y letra “B” para las muestras del bebé), posteriormente un
guión, seguido del número secuencial de muestra, en numeración arábiga a tres dígitos. Por
ejemplo: “CMH2019 1A-001” para la muestra número uno del grupo uno. Al final del
código se incluyo con texto el tipo de muestra. Las muestras de la madre correspondieron
a sangre total, suero, plasma, líquido amniótico, placenta y leche materna. Las muestras
del bebé correspondieron a: sangre total, suero, plasma y meconio. Al momento de
recolectar una muestra, se registraba en ese momento en un formulario electrónico
(formularios de Google), el código y fecha de recolección para llevar un registro de las
muestras obtenidas.
Reclutamiento y recolección de las muestras
El reclutamiento se realizó en el área de labor y tococirugía del HRMI. A las madres
elegibles, se les invitó a participar en el estudio, y se les explicó a detalle en que consistía
el estudio, incluyendo el consentimiento informado. Una vez teniendo la autorización por
parte de la madre para la participación en el estudio, se inició la recolección de las muestras.
Al momento de reclutar al binomio al estudio, se le asignó un número de muestra de manera
consecutiva, correspondiente al grupo que pertenecía. La rotulación de los tubos se realizó
mediante las etiquetas previamente impresas.
Recolección de sangre materna.
Gracias al apoyo del personal de enfermería, se obtuvieron las muestras de sangre
materna en el mismo momento de la toma de muestras solicitadas por sus médicos tratantes.
No se realizó ninguna punción venosa adicional a la madre para la obtención de muestras
59
de sangre. El volumen extraído fue de aproximadamente 15 a 20 mililitros en total de
sangre materna, lo cual corresponde aproximadamente al 0.5% del volumen circulante de
sangre materno. Se tomaron tres tubos diferentes, aproximadamente 5 mL en cada tubo.
Primer tubo para sangre total, en tubos estériles BD Vacutainer® con EDTA K2 (tubo con
tapa lila). Segundo tubo para suero, en tubos estériles con gel separador BD Vacutainer ®
SSTM (tubo con tapa amarilla). Tercer tubo para plasma, en tubos estériles con gel
separador y EDTA K2, BD Vacutainer® PPTTM (tubo con tapa blanca). El tubo de sangre
total fue refrigerado inmediatamente posterior a la recolección, en un ambiente de 4 – 6ºC.
Los tubos de suero y plasma se llevaron al laboratorio para centrifugación a 10,000 G
durante 5 minutos, lo cual permitió la separación del suero y plasma de la masa eritrocitaria.
Posteriormente se llevaron a refrigerar ambos tubos a un ambiente de 4 – 6ºC.
Recolección de líquido amniótico
En aquellos nacimientos que culminaron en cesárea, se recolectó líquido amniótico.
Previo al inicio del procedimiento quirúrgico, se explicó el protocolo al equipo de
obstetricia y se solicitó su apoyo para la recolección del líquido amniótico al momento de
la punción del saco amniótico. El líquido fue recolectado con una jeringa estéril de 5 mL,
y posteriormente se depositó en un tubo de recolección de muestras plástico, estéril, y sin
aditivos BD Vacutainer®. Posterior a su recolección, fue etiquetado y llevado a un
refrigerador, en donde se almacenó a 4-6ºC.
Recolección de sangre de placenta
Mediante el uso de técnica estéril, se realizó punción venosa del cordón umbilical
unido a la placenta. Se obtuvieron aproximadamente 5 – 10 mililitros de sangre fetal. La
60
sangre obtenida de esta manera no representa extracción de sangre para el bebé. Se
distribuyó la sangre en tres tubos diferentes, aproximadamente 3 mL en cada uno, para la
obtención de sangre total, suero y plasma. Primer tubo para sangre total, en tubos estériles
BD Vacutainer® con EDTA K2 (tubo con tapa lila). Segundo tubo para suero, en tubos
estériles con gel separador BD Vacutainer ® SSTM (tubo con tapa amarilla). Tercer tubo
para plasma, en tubos estériles con gel separador y EDTA K2, BD Vacutainer® PPTTM
(tubo con tapa blanca). El tubo de sangre total fue refrigerado inmediatamente posterior a
la recolección, en un ambiente de 4 – 6ºC. Los tubos de suero y plasma se llevaron al
laboratorio para centrifugación a 10,000 G durante 5 minutos, lo cual permitió la
separación del suero y plasma de la masa eritrocitaria. Posteriormente se llevaron a
refrigerar ambos tubos a un medio de 4 – 6ºC.
Recolección de tejido placentario
Se recolectó tejido placentario en tubos plásticos, estériles, sin aditivos, a los que
previamente se les había adicionado con 3 mL de líquido RNA-later®. Se obtuvo la
muestra de placenta, mediante cortes limpios, en la cara fetal de la placenta, con una hoja
de bisturí estéril y nueva. El tamaño de tejido placentario obtenido fue de aproximadamente
1 centímetro cúbico (cm3) y posteriormente se introdujo en el tubo, para sumergirse por
completo en el líquido de RNA-later®. Las muestras fueron almacenadas temporalmente
a un refrigerador a 4 – 6 ºC.
Recolección de meconio
Se recolectó a partir de la primera o segunda evacuación. Fue en las primeras 48
horas de vida, previo al egreso. Con guantes y abatelenguas estériles se depositó en un tubo
61
estéril, sin aditivos. La cantidad recolectada fue aproximadamente de 2 - 5 gramos.
Posteriormente rotulado y almacenado en un refrigerador temporalmente a 4-6ºC.
Recolección de leche materna
La recolección de la leche se realizó con el apoyo del departamento de Clínica de
Lactancia. Al ser un nosocomio con la Iniciativa Hospital Amigo del Niño (IHAN), se
respetaron en todo momento los protocolos establecidos en el hospital. La secreción de
leche fue facilitada por un suave masaje circular que se realizó previamente por la madre
tras explicación por las asesoras de lactancia. Posterior al masaje, se realizó un aseo de las
glándulas mamarias con agua y gasas estériles, ya que por protocolo del hospital no se
permite el uso de jabones para el aseo de las glándulas mamarias. La enfermera especialista
fue la encargada de la extracción de leche, siguiendo la técnica de asepsia completa. Se
realizó una extracción manual de la leche materna de ambas glándulas mamarias. Se
depositó la muestra en tubos estériles Corning® de 15 mL. El volumen de leche materna
fue muy variable. Se intentó obtener al menos 0.5 mL en la mayoría de las muestras. Se
almacenó la muestra temporalmente en un refrigerador a 4-6ºC.
Métodos de conservación y traslado
La leche materna se recolectaba una o dos veces por semana, por parte del equipo
de biotecnología, y directamente llevada al laboratorio de Biotecnología en el Tecnológico
de Monterrey, campus Monterrey. Para una conservación adecuada, se congeló a -20ºC y
se mantuvo así hasta que fue el momento de la extracción de ADN.
62
EL resto de las muestras se almacenaron en el Laboratorio Nacional de Medicina de
Sistemas de Conacyt con sede en la Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud del
Tecnológico de Monterrey ubicado en el edificio CITES. El traslado de las muestras se
realizó una vez por semana, con ayuda de bolsas de hielo en gel y hielera. Una vez en el
laboratorio, se dejaron las muestras almacenadas según sus diferentes características. El
meconio y placenta se almacenaron a -80 ºC. El resto de las muestras, sangre total, suero,
plasma, y líquido amniótico se almacenaron a -20ºC. La totalidad de las muestras fueron
recolectadas por el equipo de biotecnología, para realizar la extracción y el análisis de
ADN.
Organizacion
Dalia Liliana Rodríguez Reyes. Pediatra. Residente de neonatología del Programa
Multicéntrico en Neonatología, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Campus
Monterrey, Tecnologico de Monterrey. Autor principal, elaboración de este documento y
recolección de muestras.
Dr. En medicina Víctor Javier Lara Díaz, Profesor-Investigador, Escuela de Medicina y
Ciencias de la Salud, Campus Monterrey, Tecnologico de Monterrey. Director de tesis.
Gelacio Jiménez Blanco. Pediatra, Residente de neonatología del Programa Multicéntrico
en Neonatología, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud , Tecnologico de Monterrey.
Apoyo en recolección de las muestras y autora de proyecto paralelo de microbiota de leche
materna en madre con diabetes gestacional.
Alan Heriberto Montoya Rincon. Pediatra, Residente de neonatología del Programa
Multicéntrico en Neonatología, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud , Tecnologico
63
de Monterrey. Apoyo en recolección de las muestras y autor de proyecto paralelo de
microbiota de leche materna en madre con obesidad.
Dr. En medicina Mario René Alcorta García, Pediatra y Neonatologo, Hospital Regional
Materno Infantil de Alta Especialidad, Servicios de Salud de Nuevo Leon, OPD.
Víctor Arízaga Ballesteros, Pediatra y Neonatologo, Hospital Regional Materno Infantil de
Alta Especialidad, Servicios de Salud de Nuevo Leon, OPD.
Marion E. G. Brunck, PhD, Profesor-Investigador, Centro de Biotecnología FEMSA,
Campus Monterrey, Tecnologico de Monterrey.
Cuauhtémoc Licona Cassani, PhD, Profesor-Investigador, Centro de Biotecnología
FEMSA, Campus Monterrey, Tecnologico de Monterrey.
Dr. En Ciencias José Manuel Aguilar Yanez, Profesor-Investigador, Centro de
Biotecnología FEMSA, Campus Monterrey, Tecnologico de Monterrey.
Fabiola Castorena Torres, PhD, Profesor-Investigador, Escuela de Medicina y Ciencias de
la Salud, Campus Monterrey, Tecnologico de Monterrey.
Manuel Alejandro Pérez López, Estudiante de Maestría en Biotecnología, Centro de
Biotecnología FEMSA, Campus Monterrey, Tecnológico de Monterrey.
July Stephanie Gámez Valdéz, Estudiante de Maestría en Biotecnología, Centro de
Biotecnología FEMSA, Campus Monterrey, Tecnológico de Monterrey.
Métodos analíticos
Estudios previos que han estudiado la microbiota intestinal durante el embarazo,
han utilizado técnica de reacción en cadena de polimerasa para ampliar la región V1 y V2
64
de la subunidad 16S de RNA ribosomal en muestras de heces y análisis de muestras
mediante pirosecuenciación.72
Se ha descrito además análisis de los HMO mediante el uso de cromatografía de
intercambio aniónico de alto desempeño. Así como análisis de la actividad bacteriana en
leche materna mediante la composición de ácidos grasos de cadena media.73
Jiménez y colaboradores describen la técnica utilizada para la determinación del
metagenoma de la leche materna en mujeres sanas y mujeres con mastitis. Realizaron una
recolección en tubos estériles, mediante extracción manual, utilizado guantes estériles.
Previamente se realizó un aseo de la areola y tejido mamario con jabón y agua estéril,
además de empaparlos con clorhexidina. Las primeras gotas (aproximadamente 500 µL)
fueron descartadas. Para la extracción de más de 500 nanogramos (ng) de ADN,
aproximadamente 10 mL de leche se centrifugaron a 11,000 G durante 5 minutos a 4 ºC.
Posteriormente se lavó con buffer y se suspende en acetato de sodio. La lisis mecánica se
realiza mediante agitación con granos de sílice y zirconio. Después sigue incubación, para
la cual se agrega proteinasa K durante 60 minutos. Se centrifuga nuevamente a 16,000 G
durante 5 minutos y el sobrenadante se separa. Se precipita el ADN mediante la adición de
isopropanol e incubación a -20 ºC durante 1 hora. Finalmente el ADN se peletiza mediante
centrífuga a 16,000 G durante 10 minutos y se lava con etanol al 70%.42
65
Extracción de ADN
Las muestras de leche correspondientes se descongelaron y posteriormente
centrifugaron a 10,000 G durante 10 minutos para separar las células y la grasa del suero.
Posteriormente, se aisló el ADN total de los gránulos utilizando el Kit de ADN QIAamp
Mini (Qiagen). Las muestras de heces fecales fueron procesadas con el mismo kit de
extracción de ADN.
El ADN se aisló a partir de muestras fecales utilizando un método de extracción de
fenol y cloroformo, combinado con la disrupción física de las células bacterianas y un kit
de limpieza de ADN comercial (Qiagen DNeasy® Blood and Tissue extracción kit,
Qiagen). El ADN fecal fue aislado y cuantificado usando un Nanodrop (Thermo Scientific,
Asheville, NC) antes de ser utilizado para el análisis microbiológico subsiguiente.
Preparación de bibliotecas y Secuenciación de 16S
Las extracciones de ADN fueron enviadas a un proveedor tercero especializado
para la elaboración de las librerías y la secuenciación del gen de ARN ribosomal 16S.
Fuente de los datos y detalles acerca de las mediciones:
El sesgo principal de este estudio es que las observaciones realizadas no permiten
generalizarlas al total de la población. Únicamente se pueden generalizar a la población
que es usuaria habitual de los servicios de salud del HRMI, y excluye, por ejemplo, a los
estratos socioeconómicos más altos, con ingreso superior a 8 salarios mínimos mensuales.
Tampoco se pueden aplicar los hallazgos a poblaciones que recientemente han migrado a
la región, ni a poblaciones en tránsito.
66
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con estadística descriptiva. Las variables continuas
se expresarán como medianas y rangos intercuartiles, las variables discretas como
frecuencias y proporciones. La distribución de los datos de nuestra población de estudio no
se apega a los criterios de normalidad, por tanto el análisis estadístico de las variables
numéricas lo presentamos en base a la prueba U de Mann-Whitney y la prueba de la
mediana; las variables categóricas se analizan con la prueba de x2 cuadrada y sus variantes
(prueba exacta de Fisher). Se consideró una significancia estadística con una p<0.05.
El análisis de la diversidad taxonómica de la microbiota se realizara mediante la
plataforma bioinformática QIMME. Los datos de secuenciación se filtrarán, se depurarán
y procesarán utilizando parámetros estándar para la selección de unidades de taxonomía
(OTU).
Aspectos éticos y regulatorios
Este protocolo se ha diseñado de acuerdo con las recomendaciones de la
Declaración de Helsinki74 y los acuerdos de Buenas Prácticas Clínicas de la ICH75. Se
apega a lo estipulado por la Ley general de Salud en materia de Investigación para la Salud
de los Estados Unidos Mexicanos, y a los lineamientos publicados acerca del Formato de
Consentimiento Informado.76
El estudio fue aprobado por los Comités de Ética y de Investigación de la Escuela
de Medicina y Ciencias de la Salud, del Instituto Tecnologico y de Estudios Superiores de
Monterrey, con número de registro del Comité de Etica en investigacion ante la Comision
Nacional de Bioética “CONBIOETICA 19 CEI 011-2016-10-17”. Se recibió autorización
67
por parte del Comité de ética en investigación del Hospital Regional Materno Infantil, y
posteriormente registrado ante la Secretaría de Salud de Nuevo León, con número de
registro “DEISC-PR-190118019”. El formato de consentimiento informado se puede
encontrar en los anexos de este documento.
El resguardo de las muestras biológicas se realizó bajo la premisa garantizada de
anonimato, ya que las muestras solamente serán identificadas por un código alfanumérico
de 5 campos, uno para el grupo de estudio, uno para la identificación de muestra materna
(A) o neonatal (B), y tres para el número consecutivo de muestra.
Las muestras serán utilizadas exclusivamente para los propósitos declarados en este
estudio, así como para estudios de caracterización génica y/o identificación de
biomarcadores futuros, pero no para la generación de líneas celulares inmortales. Se
conservarán por hasta 15 años, bajo ultra-congelación, en el Laboratorio Nacional de
Medicina de Sistemas de Conacyt con sede en la Escuela de Medicina y Ciencias de la
Salud. Estarán disponibles para la comunidad científica debidamente acreditada.
Fondos:
Los fondos para llevar a cabo este estudio se obtuvieron de una aportación de
FEMSA al equipo investigador.
68
Capítulo 4. Resultados
Muestras eliminadas
Se reclutaron 38 binomios, de los cuales en 26 se logró una recolección de muestra
de leche adecuada. Se eliminaron 12, nueve del grupo control y tres del grupo de estudio.
Dos se eliminaron al desarrollar criterios de eliminación, uno del grupo control por recibir
antibióticos más de 24 horas previo al nacimiento y uno del grupo de estudio por diferirse
nacimiento hasta edad gestacional de término. Cuatro se eliminaron al no lograrse
recolectar muestras de leche. Y finalmente, seis se eliminaron por no contar con volumen
suficiente de leche para realizar la extracción de DNA, cuatro del grupo control y seis del
grupo de estudio.
La eliminación se realizó tan pronto se cumplieron los criterios para ésta y se
continuó la recolección de muestras con un orden secuencial. Las muestras eliminadas no
se consideraron en el conteo de sujetos necesarios para alcanzar la muestra requerida.
69
Figura 2. Diagrama de elegibilidad
38 binomios elegibles
36 binomios incluidos
32 binomios incluidos en
análisis
26 binomios incluidos en
análisis
18 binomios en el grupo control
8 nacimientos vía cesárea
10 nacimientos vía parto
8 binomios en el grupo de estudio
1 nacimiento vía cesárea
7 nacimientos vía parto
6 eliminados por bajo rendimiento en
extracción de DNA
4 eliminados , por incapacidad de
recolectar muestra
2, criterios de eliminación
Consentimiento informado
70
Características demográficas
Se encontró que los grupos estudiados no tuvieron diferencias estadísticas
significativas en la mayoría de las características demográficas. Las diferencias maternas
se encontraron solamente en el IMC y uso de antibióticos intraparto.
Tabla a
Características de la madre.
La distribución de los datos de nuestra población de estudio no se apega a los
criterios de normalidad, por tanto el análisis estadístico de las variables numéricas lo
presentamos en base a la prueba U de Mann-Whitney y la prueba de la mediana; las
Control
(n = 18)
Pretémino
(n = 8)
Valor de p
Edad materna, años a 23 (22 – 26) 22 (18 – 25) 0.361
Índice de masa corporal, kg/m2 a 22.4 (21 – 24) 20.3 (19 – 23) 0.021
Número de gesta a 2 (1 – 3) 2 (1.2 – 3) 0.981
RPM previa al nacimiento, horas a 0 (0-2.7) 1.5 (0-8) 0.461
Estado civil (unión libre) b 18 (100) 5 (62.5) 0.142
Antecedentes patológicos positivos b 1 (5.6) 0 (0) 0.852
Consumo de Tabaco b 1 (5.6) 0 (0) 0.852
Consumo de Alcohol b 1 (5.6) 0 (0) 0.852
Consumo de Drogas b 1 (5.6) 0 (0) 0.852
Portadora de Tatuajes b 5 (27.8) 0 (0) 0.282
IVU durante el embarazo b 6 (33.3) 1 (12.5) 0.372
CV durante el embarazo b 3 (16.7) 1 (12.5) 0.592
Tuvo trabajo de parto b 17 (94.4) 8 (100) 0.462
Recibió antibióticos intraparto b 9 (50) 4 (50) <0.0012
Vía de nacimiento (parto) b 10 (55.6) 7 (87.5) 0.192
Anotaciones. Variables: aMediana (Rangos intercuartiles, RIC), b Frecuencias (porcentajes). Kg/m2,
kilogramos sobre metro cuadrado. RPM, Ruptura prematura de membranas; IVU, infección de vías
urinarias; CV, cervicovaginitis.
Valor de p: 1 Prueba U de Mann Whitney, 2Prueba exacta de Fisher.
71
variables categóricas se analizan con la prueba de x2 cuadrada y sus variantes (prueba
exacta de Fisher). Se consideró una significancia estadística con una p<0.05.
Al comparar las características del recién nacido se encontró diferencia
significativamente estadística en edad gestacional en semanas y días, así como
somatometría (peso, talla y perímetro cefálico), semanas de gestación completas y en días.
Tabla 3 b
Características del recién nacido.
Índice de masa corporal (IMC)
El índice de masa corporal difirió entre grupos con una mediana de 22.4 (RIC 21-
24) en el control y 20.3 (RIC 19-23) en el grupo de estudio, p=0.02 con la prueba de U de
Mann-Whitney. Para la prueba de mediana se obtuvo una p=0.20.
Control (n = 18) Pretémino (n = 8) Valor de p
Edad gestacional, días a 277 (269 – 286) 252 (246 – 254) <0.0011
Edad gestacional, semsa 39 (38 – 40) 36 (35 – 36) <0.0011
Talla, cm a 50 (50.0 – 52.0) 48 (48.0 – 49.2) 0.0041
Perímetro cefálico, cm a 34 (331 – 35.7) 33 (32 – 33) 0.0031
Peso, gramos a 3330
(3077.5 – 3605.0)
2690
(2387.5 – 3007.5)
0.0021
Sexo del recién nacido b
Femenino 9 (50.0) 5 (62.5) 0.682
Masculino 9 (50) 3 (37.5)
Anotaciones. Variables: aMediana (Rangos intercuartiles, RIC), b Frecuencias (porcentajes). RPM,
Ruptura prematura de membranas; cm, centímetros; sems, semanas.
Valor de p: 1 Prueba U de Mann Whitney, 2Prueba exacta de Fisher.
72
Figura 3. Índice de masa corporal por grupo. Prueba
de mediana, p=0.20.
Figura 4. Índice de masa corporal por grupo. Prueba de U de Mann-Whitney,
p=0.02.
73
Vía de nacimiento y uso de antibióticos
No se encontró diferencia entre los grupos según la vía de nacimiento. Del total de
los binomios analizados, 17 culminaron en parto (65.4%) y nueve en cesárea (34.6%).
Tabla 4
Vía de nacimiento
Control
(n=18)
Pretérmino
(n=8)
Valor de p
Parto 10 (55.6) 7 (87.5) 0.19
Cesárea 8 (44.4) 1 (12.5)
Anotaciones: variables en frecuencias (porcentajes).
Valor de p: Prueba exacta de Fisher.
Estimamos la correlación bivariada del uso de antibióticos intraparto y la vía de
nacimiento. Se observó una Rho de Spearman de 0.728 con una p <0.001. Residuo
tipificado de 3.7 para cesárea. El riesgo de uso de antibióticos durante el trabajo de parto
fue mayor en cesáreas con un Odds Ratio de 3.25 (IC del 95% de 1.43 a 7.34).
Tabla 5
Correlación de uso de antibióticos intraparto y vía de nacimiento.
Cesárea
(n=9)
Parto
(n=17) Valor de p
OR
(IC 95%)
Antibióticos
intraparto
Sí 9 (100) 4 (23.5) P <0.001 3.25
(1.43 – 7.34)
No 0 (0) 13 (76.5)
Anotaciones: variables en frecuencias (porcentajes). AB, antibióticos.
Valor de p: Prueba x2. OR, odd ratio; IC, intervalo de confianza.
74
Características del recién nacido
Como se mencionaba anteriormente y se ejemplificó en la tabla 3b, dentro del
diseño de este estudio esperábamos que nuestros grupos de estudio fueran diferentes en
edad gestacional y somatometría. Se agregan a continuación las tablas correspondientes a
las pruebas de mediana y U de Mann-Whitney que lo ejemplifican.
La prueba de U de Mann-Whitney para talla tuvo una diferencia significativa con
p=0.004, no así la prueba de mediana (p=0.19). En la gráfica de mediana para talla se
observó un outlayer correspondiente al recién nacido del binomio 2-003 con 41 cm,
percentila 0.6 y -2.5 Z-score. Las mediciones para peso (2390 g, percentila 47, -0.05 z-
score) y perímetro cefálico (31.5 cm, percentila 43.1 y -0.17 z-score) se encontraron dentro
de límites normales para sus 35 1/7 semanas de edad gestacional. De forma que se sospecha
un error en la medición del recién nacido tras el nacimiento.
Figura 5. Semanas de gestación completas por grupo. Prueba de U de Mann-
Whitney, p<0.001.
75
Figura 7. Peso en gramos por grupo. Prueba de mediana, p=0.03.
Figura 6. Talla en centímetros por grupo Prueba de mediana, p= 0.19.
76
Figura 8. Talla en centímetros por grupo Prueba U de Mann-Whitney,
p= 0.04.
Figura 9. Semanas de gestación completas por grupo. Prueba de
mediana, p=0.03.
77
Características de las muestras de leche
La mediana de tiempo de recolección de la muestra de leche fue de 1 día, sin
diferencia significativa entre grupos, ni vía de nacimiento. La totalidad de las muestras
analizadas correspondió a calostro.
Tabla 6
Cantidad de leche extraída
Grupo control
(n = 18)
Pretérmino
(n = 8)
Valor de p
Volumen
extraído
1975
(1025.0 – 2937.5)
2000
(1937.5 – 2137.5)
0.37
Variables en medianas (rangos intercuartiles). µL, microlitros.
Valor de p: U de Mann-Whitney
0
1
2
3
4
5
6
7
Volumen de leche recolectada en microlitros
GRUPO CONTROL GRUPO DE ESTUDIO
Figura 10. Volumen de leche obtenida por grupo.
78
Determinación de ADN en leche materna
Se obtuvieron muestras de leche, con un promedio de 339.5 ng de ADN por cada
microlitro de leche. Se eliminaron seis muestras por bajo rendimiento en la extracción de
ADN. Todas las muestras restantes se consideraron de pureza óptima para realizar
secuenciación de ADN.
Tabla 7
Concentración y pureza de ADN.
Grupo control
(n = 18)
Pretérmino
(n = 8)
Concentración ADN 88.78
(44.04 – 117.7)
80.28
(74.38 – 88.14)
Relación 260 /280 2.50
(2.28 – 2-72)
2.56
(2.48 – 2.58)
Relación 260/230 1.91
(1.89 – 1.97)
1.89
(1.84 – 1.91)
Anotaciones: Variables en medianas (rango intercuartil). Concentración ADN en ng/µL. ADN, ácido desoxirribonucleico, ng, nanogramos; µL, microlitros.
Pureza óptima de ADN: Relación 260/280 > 1.7. Relación 260/230 1.5.
El ADN de las 56 muestras del todos los grupos del protocolo, incluyendo los del
presente estudio (controles y prematuros tardíos) se envio a secuenciar a Servicios
Genomicos Cinvestav- Langebio en la ciudad de Irapuato.
Los resultados obtenidos tras la extraccion de ADN con la técnica de fenol-
cloroformo, así como también los datos enviados a secuenciar a Servicios Genomicos
Cinvestav- Langebio Irapuato de las muestran incluidas en este protocolo se muestran a
continuación.
79
Una vez obtenidos los datos de la secuenciacion de las muestras de leche materna,
se procedera a la parte bioinformatica, con la cual se generara informacion de las bacterias
presentes en las muestras. Se continuara con la estandarizacion de los protocolos para la
extraccion de ADN de las muestras de meconio, líquido amniotico y placenta, para su
posterior secuenciacion y analisis bioinformatico.
Figura 11. Información de muestras de calostro humano enviadas a secuenciar.
80
Capítulo 5. Análisis y discusión de resultados
Logramos establecer una cohorte de binomios materno-neonatales de pretérminos
tardíos y controles, con las características ya mencionadas. Aunque debido al carácter
exploratorio del estudio no fue necesario realizar una estimación muestras, se tenía como
objetivo el reclutamiento de 20 binomios por grupo, los cuales no se lograron conseguir
para todos los grupos durante esta primera etapa.
A lo largo del proceso de recolección de muestras de leche materna hemos
encontrado inconvenientes por los criterios estrictos de inclusión y exclusión,
especialmente en el grupo de neonatos pretérmino tardíos. Se ha descrito que infecciones
activas como cervicovaginitis e infección de vías urinarias, así como la ruptura prematura
de membranas pueden desencadenar el trabajo de parto. De acuerdo con las prácticas
clínicas del servicio de Obstetricia del HRMI, estos pacientes son candidatos a recibir
antibióticos; si su uso prolonga más de 24 horas antes del nacimiento, esto representa un
criterio de exclusión para nuestro grupo. Un paciente del estudio que había cumplido los
criterios de inclusión tuvo que ser eliminado ya que se pudo diferir el nacimiento hasta una
edad gestacional de término. Estas prácticas por parte del servicio de Obstetricia impactan
favorablemente en la evolución del paciente, pero limitan el número de binomios del grupo
de pretérminos tardíos.
En el HRMI debido a la Iniciativa del Hospital Amigo del Niño, la mayoría de las
mujeres tienen lactancia exclusiva. La extracción de leche se realizó en las primeras 24-48
81
horas, correspondiendo a calostro. Esto limitó la cantidad de mililitros extraídos por
ocasión, contando de esa forma con menos volumen para la extracción de ADN. Son pocas
las madres que reciben suplementación con fórmula durante su estancia en el hospital, ya
que solo se puede suplementar por indicación médica y valoración por Clínica de Lactancia
para su autorización. De forma que la muestra extraída corresponde a una fracción
(alrededor del 2-3%) del alimento exclusivo del neonato en las primeras 24-48 horas de
vida; algunas madres manifestaban su preocupación al brindar muestra y se negaban a una
segunda recolección. Otro motivo de la dificultad en la extracción de leche fue la falta de
un área privada para la recolección, los cuartos de alojamiento conjunto tienen capacidad
en promedio de seis camas, estando usualmente al 100% de su capacidad; notamos que se
lograba una recolección más sencilla en horas del día con menos visitantes a los cuartos o
al ser trasladadas al consultorio de Clínica de Lactancia. Una estrategia que facilitaría las
extracciones subsecuentes sería establecer un protocolo para garantizar la comodidad y
privacidad de las madres.
Las muestras de leche se almacenaron a una temperatura de 4°C, hasta su transporte.
Se recolectaba en una o dos veces por semana para ser almacenadas a -20ºC en el
laboratorio de Biotecnología en el Tecnológico de Monterrey, campus Monterrey hasta la
extracción del ADN. Desconocemos de qué forma esto afectó la calidad de las muestras.
Igualmente, aunque no es el objetivo en esta primera etapa es importante mencionar que
las condiciones de temperatura ideales para el resto de las muestras maternas (sangre,
suero, plasma, placenta, líquido amniótico) y neonatales (sangre, suero, plasma, meconio)
se obtuvieron hasta su traslado al Laboratorio Nacional de Medicina de Sistemas de
82
Conacyt con sede en la Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud del Tecnológico de
Monterrey ubicado en el edificio CITES. El traslado de las muestras se realizó una vez por
semana, con ayuda de bolsas de hielo en gel y hielera. Con el objetivo de mejorar la
integridad de las muestras se puede acortar el tiempo de la recolección al traslado o contar
con un congelador que brinde la temperatura óptima para las muestras en el HRMI.
La concentración y la pureza de una muestra de DNA se determinó conforme a lo
reportado en la literatura, basandose en la capacidad de absorbancia de un compuesto en
una solucion a una longitud de onda determinada. La concentración de la muestra se calcula
teniendo en cuenta el valor de absorbancia obtenido a una longitud de onda de 260 nm. La
pureza de las muestras se determinó en relacion de absorbancias A260/280 y A260/230.
La relacion A260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza optima tiene
un valor entre 1.8-2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relacion
A260/280 > 1.7. Un valor A260/280 < 1.7 indica una posible contaminacion por
compuestos aromaticos como fenoles y proteínas. Un radio A260/280 > 2.1 podría deberse
a la presencia de ARN en la muestra.
A 230 nm absorben contaminantes como sales caotropicas, fenoles o carbohidratos. En
general, se considera que el ADN es puro cuando el ratio A260/230 se situa en torno 1.5-
2.2. Un ratio menor de 1.5 indicaría presencia de contaminantes en la muestra. No obstante,
esta relacion resulta mucho mas variable que la relacion A260/280 dependiendo de factores
como la concentracion de ADN o de la composicion del tampon de resuspension de la
muestra. 77
83
Capítulo 6. Conclusión
Se cumplió el objetivo principal de este estudio el cual es establecer una cohorte de
binomios materno-neonatales de pretérminos tardíos y controles de la zona metropolitana
de Monterrey, estableciendo sus características demográficas y recolectando leche humana
temprana.
La totalidad de las muestras de calostro enviadas a análisis de ADN de nuestro
estudio cuenta con las características establecidas en la literatura para considerarse de
pureza óptima. Esto permitirá conocer si los nacimientos prematuros tardíos modifican la
microbiota de la leche humana temprana.
En etapas subsecuentes se caracterizará la microbiota materna de tejido placentario
y líquido amniótico, así como la microbiota intestinal de los neonatos con las muestras de
meconio recolectadas. Finalmente, se compararán los hallazgos de la leche humana y las
muestras biológicas mencionadas del grupo de estudio y control.
84
Apéndice
Apéndice 1. Formato de recolección de datos.
85
86
87
Apéndice 2. Formato de registro de muestras recolectadas.
88
07/09/19 18(11Muest ras recolectadas
Página 5 de 5ht tps://docs.google.com/forms/d/1mD…ct re8vBEnmKGQUC2uU5Dv5F3Q/print form
Con la tecnología de
12. Líquido amniotico
Marca solo un óvalo.
Si
No
Pendiente
13. Leche materna
Marca solo un óvalo.
Si
No
Pendiente
14. Meconio
Marca solo un óvalo.
Si
No
Pendiente
89
Apéndice 3. Hoja de información y formato de consentimiento informado.
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
Apéndice 4. Carta de aprobación del comité de ética de la Escuela de Medicina
102
Apéndice 5. Carta de aprobación del comité de Investigación de la Escuela de Medicina
103
Apéndice 6. Carta de aprobación de Enmienda del comité de ética de la Escuela de
Medicina
104
Apéndice 7. Carta de aprobación de Enmienda del comité de investigación de la Escuela
de Medicina
105
Apéndice 8. Carta de aprobación del comité de ética e investigación del Hospital Materno
Infantil.
106
Apéndice 9. Constancia de registro de protocolo ante la Secretaría de salud de Nuevo
León.
107
Apéndice 10. Curriculum vitae único de Conacyt
108
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118
Currículum vitae del investigador
CVU Conacyt: 724851
EDUCACIÓN
2017- Presente Programa
Institución Subespecialidad en Neonatología
Instituto Tecnológico y de Estudios
Superiores de Monterrey.
2014 - 2017 Programa
Institución
C.P.
Especialidad en Pediatría
Hospital Universitario “Dr. José
Eleuterio Gonzalez”, UANL
11204875
2006-2013 Programa
Institución
C.P.
Médico Cirujano y Partero
Facultad de Medicina, UANL
Monterrey, Nuevo León, México
8525927
DOCENCIA
2017 Diplomado en Actualización de
Conocimientos Médicos para el ENARM
2017. Instituto Verum Vitae S.C. (5 horas de
docencia), San Pedro, N.L., México.
2009-2012 Instructor del curso Genómica, para
estudiantes de la Facultad de Medicina,
UANL, Monterrey, N.L., México.
2008-2012 Instructor del curso Genética Médica, para
estudiantes de la Facultad de Medicina,
UANL, Monterrey, N.L., México.
CERTIFICACIONES MÉDICAS
2017 Neonatal Advanced Life Support (NALS).
2017 Curso Soporte Vital Basico (BLS)
Soporte Vital Avanzado Pediatrico (PALS)
2017 Consejo Mexicano de Certificación de Pediatría,
A.C. (No. 20775).
IDIOMAS
Inglés Fluido (escrito y oral). Certificado de EXCI
(English Proficiency Test) en el 2009 y TOEFL ITP
(English Proficiency Test) 587 puntos, Junio 2016.
Francés Intermedio (escrito y oral). Centro de idiomas,
Facultad de Filosofía y Letras, UANL, Monterrey,
N.L., (2009 - 2012).
Dalia Liliana
Rodríguez Reyes
Fecha de nacimiento 10 de enero de 1989
Nacionalidad Mexicana
Sexo Femenino
Estado civil Soltera
CURP RORD890110MNLDYL07
RFC
RORD890110B32
Dirección Maya #1128 Col.
Unidad Modelo,
Monterrey, N.L.,
C.P. 64140
Celular 8117849073
E-mail [email protected]
1
PRESENTACIONES EN CONGRESOS
2017 Presentacion de Poster “Síndrome de Volkmann Neonatal: Reporte de caso”, XIX Congreso
Nacional de Neonatología, Mérida, Yucatán, México.
2016 Presentación de Poster “Enfermedad cerebrovascular isquémica fatal secunda- ria a displasia
fibromuscular en un nino de 2 anos: Reporte de caso”, XXV Reunion Anual de la Sociedad
Mexicana de Neuro- logía Pediatrica, A.C., Puebla, Puebla.
2016 Presentación de Poster “Prevalencia de anemia ferropénica en lactantes de 6 a 18 meses de
edad en control del nino sano”, LVII Congreso Nacional de la Agrupacion Mexicana para el
Estudio de la Hematología, A.C., Mérida, Yucatan. Revista de Hematología Mex
2016;17:Suplemento 1.
2015 Presentación de Poster “Reporte de caso: encefalocele”, XXVIII Congreso Nacional de
Investigacion en Medicina, Dr. César Leon Flores Gonzalez, Monterrey, Nuevo Léon,
México.
CURSOS Y TALLERES
2019 Ciclo de actualización en Microbiota. Campus Virtual IntraMed (20 horas).
2019 Programa de Atencion Integral al Trauma Pediatrico IAPeT, Hospital Regional Materno
Infantil, Guadalupe, Nuevo León (30 horas).
2019 Modulo de Neurotrauma del Programa de Atencion Integral al Trauma Pediatrico IapE,
Hospital Regional Materno Infantil, Guadalupe, Nuevo León (8 horas).
2019 Curso de evento hostil con incidente de víctimas masivas y tirador activo, Hospital Regional
Materno Infantil, Guadalupe, Nuevo León (3 horas).
2019 Taller: Emergencias, comunicación y manejo de conflicto. XV Congreso Internacional de
Pediatría, “Monterrey 2019”, Monterrey, Nuevo Leon, México.
2019 XV Congreso Internacional de Pediatría, “Monterrey 2019”, Monterrey, Nuevo Leon,
México.
2019 Taller de Liderazgo, Gestión de Cambio y Educación para Jefes de Residentes. Escuela de
Medicina y Ciencias de la Salud TecSalud y Royal College of Physicians and Surgeons of
Canada.
2018 Estrategias para mejorar el estado nutricional del prematuro. Federación Nacional de
Neonatología de México, A.C.
2018 Aspectos bioéticos con pacientes recién nacidos. Comisión Nacional de Bioética.
2018 3er Curso de Neonatología y 1er Curso de Medicina Perinatal, Ciudad de México, México.
2018 V Curso de Simulación Avanzada, PRACTICUM Script de Pediatría. Programa internacional
de entrenamiento del razonamiento clínico (120 horas).
2018 BELLA Breastfeeding: Provider Training, OPENPediatrics.
2017 XIX Congreso Nacional de Neonatología, Mérida, Yucatán, México.
2016 Post Graduate Program in Pediatric Nutrition, Boston University School of Medicine.
EXPERIENCIA INTERNACIONAL
2010 Intercambio de Investigacion IFMSA (International Federation of Medical Students’
Association) en el proyecto “Analisis molecular de los genes implicados en el síndrome de
Cornelia de Lange”, Universidad de Zaragoza, Espana. A cargo del Dr. Juan Pié Juste.
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