FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
Núcleo de Ciências e Tecnologia
Programa de Mestrado em Desenvolvimento Regional
e Meio Ambiente
CALOGÊNESE EM Annona glabra L. ANNONACEAE
ANDRINA GUIMARÃES SILVA BRAGA
Porto Velho (RO)
2012
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
Núcleo de Ciências e Tecnologia
CALOGÊNESE EM Annona glabra L. ANNONACEAE
ANDRINA GUIMARÃES SILVA BRAGA
Orientador: Prof. Dr. Maurício Reginaldo Alves dos Santos
Dissertação de Mestrado apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente, Área de Concentração em Ambiente, Saúde e Sustentabilidade, para obtenção do título de Mestre em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente.
Porto Velho (RO)
2012
ANDRINA GUIMARÃES SILVA BRAGA
CALOGÊNESE EM Annona glabra L. ANNONACEAE
Comissão Examinadora
_______________________________________ Dr. Maurício Reginaldo Alves dos Santos
Orientador Fundação Universidade Federal de Rondônia/Embrapa Rondônia
________________________________________ Dra. Maria das Graças Rodrigues Ferreira
Titular Embrapa Rondônia
__________________________________________ Dr. Alexandre Martins Abdão dos Passos
Titular Fundação Universidade Federal de Rondônia/Embrapa Rondônia
____________________________________________ Dra. Carolina Rodrigues da Costa Doria
Suplente Fundação Universidade Federal de Rondônia
Porto Velho, 27 de Agosto de 2012.
Resultado: Aprovada.
D E D I C A T Ó R I A Dedico a Deus, presença divina em minha vida, e ao meu querido e amado esposo Paulo Leandro Braga.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela vida, grandes conquistas e oportunidades concedidas;
À minha família, base da minha vida;
Ao meu orientador Dr. Maurício Reginaldo Alves dos Santos, por ter aceitado me
orientar no Programa de Pós-Graduação da Universidade, por seus ensinamentos,
paciência dispensada e seu exemplo como professor e pesquisador;
À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) pela oportunidade de
estágio e pelo suporte físico e material no desenvolvimento desta pesquisa;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
suporte financeiro durante o mestrado;
À coordenação, corpo docente e funcionários do Programa de Pós-Graduação em
Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente da Fundação Universidade Federal de
Rondônia;
Aos meus queridos pais, Sebastião e Alcilene, presença especial em minha vida;
À minha maninha, Adriele, pelo apoio e amizade;
Ao meu grande amigo M. Renato Abreu Lima pela solidariedade, respeito, apoio e
amizade verdadeira;
Às minhas queridas sogra e cunhada, Adelina e Ana Paula Braga, pelo respeito,
companheirismo, risadas e conselhos;
Ao Técnico do Laboratório de Biotecnologia Vegetal Tiego, pela ajuda prestada em
todo o desenvolvimento do trabalho.
Às meninas do laboratório de Biotecnologia Vegetal, Daniele, Eloisa, Jaqueline,
Josilene, Laiza, Milene, Sandra e Sâmela, obrigada pelas conversas, risadas, diversão e
conselhos.
Ao Engenheiro Florestal Francisco Airton dos Santos pela disponibilização de tempo e
ajuda ao manusear o GPS.
E aqueles que contribuíram direta ou indiretamente com este trabalho, sou muito grata!.
Ficha catalográfica elaborada por: Daniela Maciel
CRB 638/11
B813c Braga, Andrina Guimarães Silva.
Calogênese em Annona glabra L. Annonaceae / Andrina Guimarães Silva Braga. -- 201.
46f. : il.
Orientadora: Maurício Reginaldo Alves dos Santos. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente)
– Área de Concentração em Ambiente, Saúde e Sustentabilidade, Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho. Banca: Dra. Maria das Graças Rodrigues Ferreira, Dr. Alexandre Martins Abdão dos Passos, Dra. Carolina Rodrigues da Costa Doria
1. Desenvolvimento Rural. 2. Sistemas Agroflorestais. 3. Agroecologia. 4. Solo – Indicadores de qualidade. 5. Rondônia. I. Título.
CDD (21.ed.) 571.538
EPÍGRAFE
“Sucesso é uma questão de não desistir, e fracasso é uma questão de desistir cedo demais.” (Walter Burke).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Análise de variância referente aos tratamentos de desinfestação de
explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa-Rondônia, 2012.
30
Tabela 2. Análise de variância referente aos efeitos dos reguladores de
crescimento TDZ e 2,4-D na calogênese em explantes foliares de A. glabra. Porto
Velho-RO, Embrapa-Rondônia, 2012.
33
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Planta da espécie A. glabra, no campo experimental da Embrapa-RO. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga.
18
Figura 2. Flor de A. glabra, (A) uma fechada e duas que sofreram aborto. (B) Flor iniciando a sua abertura. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga.
19
Figura 3. Folhas de A. glabra. (A) Adaxial. (B) Abaxial. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga. .
19
Figura 4. Fruto verde de A. glabra. Foto: Laiza Nunes Limana.
20
Figura 5. Efeito das combinações de tempo de imersão e concentração de hipoclorito de cálcio na desinfestação de explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa Rondônia, 2012.
31
Figura 6. Desenvolvimento dos segmentos foliares, quanto à indução de calos. Avaliação em sete dias (A); avaliação em 14 dias (B); explante com 21 dias (C) e com 28 dias de inoculação (D) e calo com mais de 28 dias (E). Foto: Andrina Guimarães Silva Braga.
37
RESUMO
BRAGA, A.G.S. Calogênese em Annona glabra L. Annonaceae. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente). 2012. 46f. Porto Velho. Fundação Universidade Federal de Rondônia. 2012. Annona glabra L. é uma espécie nativa da América Tropical, muito utilizada como porta enxerto, devido à tolerância do sistema radicular a condições de excesso de umidade no solo e à indução de nanismo, possuindo potencial fitofarmacológico, apresentando propriedades antibactericidas, antifúngicas, inseticidas e citotóxicas. A propagação tradicional desta espécie é limitada devido à transmissão de doenças no método de estaquia e à variabilidade genética da propagação por sementes. O objetivo deste trabalho foi realizar o estabelecimento in vitro de explantes de A. glabra L. e promover a indução e formação de calos friáveis em explantes foliares com a utilização de combinações de reguladores de crescimento, visando contribuir com o futuro estabelecimento de um protocolo de completo micropropagação da espécie. Foram coletadas folhas jovens, no campo experimental da Embrapa-Rondônia, os quais foram submetidos a teste de desinfestação com imersão em hipoclorito de cálcio a 5 e 10% (p/v), por 15 e 30 minutos. Após a desinfestação, as folhas foram segmentados em fragmentos de 1 cm2, os quais foram inoculados em meio Murashige & Skoog modificado com metade das concentrações de nutrientes e sem regulador de crescimento. Sete dias após, foi avaliada a porcentagem de contaminação dos explantes. Para a indução de calos foi empregada a mesma metodologia, sendo que os fragmentos foliares foram inoculados em meio MS contendo uma combinação fatorial de 2,4-D (0, 2, 4 e 8 mg.L-1) e TDZ (0, 2, 4 e 8 mg.L-1). Os cultivos foram mantidos no escuro, em sala de crescimento, a 24 ± 2ºC. Aos 28 dias foi realizada a avaliação quanto à indução de calos. A desinfestação mais eficiente foi a imersão em hipoclorito de cálcio a 10% por 30 minutos, resultando em 90% de desinfestação dos explantes. A maior porcentagem de indução de calos foi de 100% nos tratamentos com 4 e 8 mg.L-1 de TDZ, na ausência de 2,4-D. Assim, recomenda-se o TDZ a 4mg.L-1 para a indução de calos em explantes foliares da espécie A. glabra. Palavras-chave: Micropropagação; Reguladores de Crescimento Vegetal; Cultura de Tecidos Vegetais.
ABSTRACT
BRAGA, A.G.S. Calogenesis in Annona glabra L. Annonaceae. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente). 2012. 46f. Porto Velho. Fundação Universidade Federal de Rondônia. 2012. Annona glabra L. is popularly known as araticunzeiro-do-brejo and is an Amazonian species native of Tropical America with wide geographic distribution. The traditional propagation of this species is limited by transmission of diseases in cuttings and genetic variability in seed propagation. The objective of this study was the in vitro establishment of A. glabra L. and to promote the induction and formation of friable callus in leaf explants aiming the achievement of a micropropagation protocol of this species. Young leaves were collected from trees at the experimental field of Embrapa Rondonia and submitted to disinfection tests using immersion in calcium hypochlorite solution at 5 and 10% (w/v) during 15 and 30 minutes. After disinfection, leaves were cut in 1 cm2 fragments which were inoculated in Murashige & Skoog medium modified with half the concentration of nutrients and without growth regulators. Seven days after, the percentage of contamination was evaluated. For callus induction the same methodology was used and the leaf explants were inoculated in MS medium with factorial combination of 2,4-D (0, 2, 4, and 8 mg.L-1) and TDZ (0, 2, 4, and 8 mg.L-1). All the cultures were incubated in a growth chamber at 24 ± 2ºC in the dark. Forty-nine days after the induction of callus was evaluated. The most efficient disinfection was obtained with immersion in calcium hypochlorite solution at 10% for 30 minutes, which resulted in 90% of disinfected explants. The highest percentage of callus induction was 100% in the media supplemented with TDZ at 4.0 and 8.0 mg.L-1, without 2,4-D. Key words: Micropropagation; Growth Regulators; Plant Tissue Culture.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
11
2. OBJETIVOS 14
2.1. GERAL 14
2.2. ESPECÍFICOS
14
3. REVISÃO DE LITERATURA 15
3.1. A FRUTICULTURA NO BRASIL 15
3.2. ASPECTOS BOTÂNICOS 16
3.3. DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE Annona glabra 17
3.4. CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS 21
3.4.1. Micropropagação 22
3.4.2. Hormônios e Reguladores de Crescimento 24
3.5. SUBSÍDIOS PARA O DESENVOLVIMENTO REGIONAL E MEIO
AMBIENTE
26
4. MATERIAL E MÉTODOS 28
4.1. ESTABELECIMENTO IN VITRO 28
4.2. DESINFESTAÇÃO DOS EXPLANTES 28
4.3. INDUÇÃO DE CALOS
29
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 30
5.1. DESINFESTAÇÃO DOS EXPLANTES 30
5.2. INDUÇÃO DE CALOS
33
6. CONCLUSÕES
38
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
39
1. INTRODUÇÃO
O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo (estimado em 43,01
milhões de toneladas), depois da China e Índia (ANUÁRIO BRASILEIRO DA
FRUTICULTURA, 2008). A produção brasileira está voltada para frutas tropicais,
subtropicais e de clima temperado, graças a sua extensão territorial, posição geográfica,
solo e condições climáticas. No país são exploradas 500 variedades de plantas
produtoras de frutas comestíveis e 220 espécies de frutíferas nativas somente na
Amazônia (ANUÁRIO BRASILEIRO DA FRUTICULTURA, 2008).
Essas frutíferas nativas brasileiras podem constituir uma alternativa em nichos
de mercado que buscam novidades e com uma renda adicional para os pequenos
produtores. Entretanto, pouco se conhece sobre a grande maioria das espécies
(LATTUADA, 2010).
A Amazônia possui uma grande diversidade de fruteiras nativas, na qual estão
incluídas espécies vegetais com grande potencial econômico ainda não domesticadas,
como é o caso do araticum, árvore de pequeno porte, encontrada às margens inundáveis
dos rios e lagos da Bacia Amazônica (VILLACHICA, 1996).
A família Annonaceae, de distribuição pantropical, caracterizada por árvores e
arbustos, tem cerca de 130 gêneros e aproximadamente 2.300 espécies identificadas
(MABBERLEY, 1997; PIRES & TRESENS, 2001). No Brasil, foram registrados 26
gêneros, compreendendo cerca de 260 espécies (MAAS et al., 2001). Dentre essas,
situa-se a Annona glabra L., comumente conhecida no Brasil como Araticum-do-brejo
ou Araticum-bravo (CHRISTIAN, 2007).
O araticunzeiro-do-brejo (Annona glabra L.) é uma espécie nativa da América
Tropical, com ampla distribuição geográfica. No Brasil ocorre espontaneamente, desde
a Amazônia até o estado de Santa de Catarina (BRAGA, 1976), ocupando, com maior
frequência, áreas periodicamente inundadas (PAULA & ALVES, 1997).
O método de propagação mais utilizado para esta espécie é através de sementes,
resultando em grande variabilidade genética, devido à recombinação genética. Em
decorrência da utilização desse tipo de muda, os pomares formados resultam em plantas
desuniformes, de baixa produtividade e dando origem a frutos de má qualidade.
Outra forma de propagação seria por estaquia. A propagação vegetativa de
plantas frutíferas é a mais recomendada, pois possibilita a manutenção das boas
características da planta. A multiplicação de plantas frutíferas por via vegetativa pode
ser feita de várias maneiras, sendo que cada espécie se adapta a cada uma delas
(RIBEIRO, 2007). Porém nesta espécie a estaquia resultaria na transmissão de doenças
para as novas plantas.
Tradicionalmente, muitas espécies de frutíferas são propagadas vegetativamente
e um grande interesse tem sido manifestado na utilização da cultura de tecidos como
método de propagação em várias espécies de pequenas frutas e frutos nativas. Tal
método permite propagar espécies de difícil multiplicação pelos métodos clássicos, tais
como estaquia, e ainda obter mudas sadias, livres de vírus e outros patógenos,
produzindo assim um material de alta qualidade genética e sanitária o ano todo. Um
aspecto fundamental para realizar a micropropagação de uma planta frutífera é o
domínio da tecnologia de propagação em laboratório, chamada de protocolo, o qual
consiste nos resultados obtidos em relação aos fatores que afetam o crescimento e o
desenvolvimento das plantas in vitro (RIBEIRO, 2007).
O desenvolvimento de uma planta depende da interação de fatores internos,
como as substâncias orgânicas, os hormônios, que desempenham importante função na
regulação do crescimento, e externos como a luz, a temperatura e o fotoperíodo. Na
cultura de tecidos vegetais, as correlações existentes entre os diversos órgãos de uma
planta intacta são rompidas, sendo necessário o fornecimento dos fatores que regulem o
crescimento e o desenvolvimento (SCHUCH & ERIG, 2005).
O emprego destas técnicas, especialmente no processo da propagação in vitro
(micropropagação), tem sido amplamente utilizado, principalmente quando a
propagação generativa é insatisfatória, quando a progênie obtida é muito heterogênea ou
em casos em que a propagação por sementes não ocorre naturalmente. Por outro lado, é
muito importante ressaltar sua grande utilidade em programas de conservação e
melhoramento, dada a economia de tempo na multiplicação de variedades, assim como
produção de clones promissores e livres de patógenos.
Entretanto, a multiplicação in vitro e em larga escala de anonáceas ainda tem se
confrontado com algumas limitações. A contaminação endógena dos explantes
(SANTANA et al., 2003), a alta concentração de compostos fenólicos em seus tecidos e,
principalmente, a abscisão foliar precoce (LEMOS, 2000), ocasionada pelo acúmulo de
etileno nos tecidos confinados no ambiente in vitro, prejudicando o vigor e o
crescimento das brotações, são os principais exemplos. Para Lemos (2000), solucionar
essa dificuldade representa o grande desafio na obtenção de um protocolo consistente
para a micropropagação de anonáceas.
O objetivo deste trabalho foi realizar o estabelecimento in vitro de A. glabra L. e
promover a indução e formação de calos friáveis em explantes foliares, visando a uma
posterior regeneração de plantas para a propagação em larga escala desta espécie.
2. OBJETIVOS
2.1. GERAL:
Desenvolver um protocolo para a indução de calos em segmentos foliares
de Annona glabra L., visando contribuir com estabelecimento de um sistema de
micropropagação da espécie.
2.2. ESPECÍFICOS:
Estabelecer culturas assépticas in vitro de segmentos foliares de Annona
glabra L.;
Avaliar o efeito de combinações de reguladores de crescimento na
calogênese em explantes foliares.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. A FRUTICULTURA NO BRASIL
A fruticultura pode ser conceituada como sendo um conjunto de técnicas e
práticas aplicadas adequadamente com o objetivo de explorar a produção de frutas
comestíveis comercialmente (FACHINELLO et al., 1996).
O Brasil é uns dos maiores produtores mundiais de frutas in natura ou frescas.
Pela diversidade de clima e solos, apresenta condições ecológicas para produzir frutas
de ótima qualidade e com uma variedade de espécies que passam pelas frutas tropicais,
subtropicais e temperadas (FACHINELLO et al., 1996).
As plantas frutíferas englobam grande quantidade de espécies, com considerável
diversidade quanto ao modo de reprodução, período juvenil, ciclo da planta e aos
métodos de propagação (BRUCKNER, 2002).
O comércio internacional de frutas (frescas e processadas) está entre os de maior
dinamismo e perspectivas futuras, com boas possibilidades dos agricultores familiares
se integrarem aos mercados de frutas frescas, polpa e sucos. O grande consumo de
frutas tropicais nos estratos inferiores permite concluir que existe grande potencial de
crescimento do mercado doméstico de frutas, principalmente em conjunturas
econômicas mais favoráveis em termos de trabalho e renda (MALUF, 2000).
Segundo o MAPA (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E
ABASTECIMENTO, 2008), o Brasil é o terceiro maior produtor mundial de frutas, com
produção superando 38 milhões de toneladas anuais, cultivadas em 3,4 milhões de
hectares.
Em 2007, as exportações brasileiras de frutas frescas atingiram cerca de 920 mil
toneladas, com valor de US$ 643 milhões (preço FOB), aproximadamente. Os maiores
volumes exportados foram de melões, bananas, manga, maçãs e uvas. No mesmo ano,
foram importados 280 mil toneladas de fruta fresca, principalmente peras com
aproximadamente 49% do volume total importado (IBRAF – INSTITUTO
BRASILEIRO DE FRUTAS, 2008).
Essas frutíferas nativas brasileiras podem constituir uma alternativa em nichos
de mercado que buscam novidades e uma renda adicional para os pequenos produtores.
Entretanto, muito pouco se conhece sobre a grande maioria destas espécies
(LATTUADA, 2010).
3.2. ASPECTOS BOTÂNICOS DA FAMÍLIA ANNONACEAE
A família Annonaceae é importante tanto evolutiva, ecológica, como
economicamente. Em número de espécies, Annonaceae é de longe a mais sobressalente
dentro da ordem das Magnoliales, as quais se encontram entre as angiospermas mais
primitivas. Geralmente estão distribuídas entre as áreas tropicais da América, África e
Ásia (CHATROU, 1999).
A família Annonaceae possui 132 gêneros e 2.300 espécies de acordo com Pires
& Tresens (2007). A maioria das plantas é de origem tropical, com exceção daquelas do
gênero Asimira, nativas de clima temperado e que ocorrem na América do Norte; e a
espécie Annona cherimola Mill., de origem dos altiplanos andinos, cultivada em
diversas regiões do mundo e considerada como a mais saborosa das frutas. Muitas das
demais espécies são nativas do Brasil (KAVATI, 1992).
No Brasil, a família Annonaceae compreende 26 gêneros e aproximadamente
260 espécies, desempenhando um importante papel na composição da vegetação
(MAAS et al., 2001). Na fruticultura são importantes dois gêneros de anonáceas, sendo
Rollinia e Annona. Mahddeen (1990), menciona mais de 100 espécies do gênero
Annona e 65 em Rollinia.
A família é constituída por árvores, arbustos, e raramente por arbustos
escandentes, que se caracterizam por apresentar flores vistosas, andróginas, solitárias,
ou em inflorescências, axilares ou terminais, opositifólias ou não; cálice de três sépalas,
corola de seis pétalas bisseriadas, geralmente carnosas ou crassas, estames numerosos,
gineceu dialicarpelar; fruto sincárpico ou apocárpico, muricado ou não; carpídios
sésseis ou estipitados, secos ou carnosos, deiscentes ou indeiscentes; sementes com
endosperma ruminado. O indumento das espécies é composto de tricomas simples,
estrelados ou escamosos (PONTES et al., 2004). As flores das plantas da família
Annonaceae apresentam uma clara dicogamia protogínica e também heterostilia. O fruto
é um sincarpo procedente de uma única flor, formado pela fusão de muitos carpelos
simples em torno de um receptáculo central, constituindo uma massa sólida.
A maioria das espécies de Annonaceae encontra-se vegetando e produzindo
frutos em clima tropical e subtropical, poucas são as espécies nativas de clima
temperado (NAKASONE & PAULL, 1998; JANICK & PAULL, 2006.) Annona L., é o
gênero mais importante já que, dentro de centenas de espécies no mundo, apenas sete e
um híbrido são plantados comercialmente, abrangendo as espécies Annona cherimola
Mill., Annona diversifolia Saff., Annona glabra L., Annona muricata L., Annona
reticulata L., Annona senegalensis Pers., Annona squamosa L. e o híbrido Annona
squamosa x Annona cherimola. Um gênero desta família que é muito próximo de
Annona é Rollinia A.St.-Hil., cujas espécies também possuem frutos explorados
comercialmente (NAKASONE & PAULL, 1998).
3.3. DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE Annona glabra L.
Annona glabra L., comumente conhecida no Brasil como Araticum-do-brejo ou
Araticum-bravo é uma árvore de pequeno porte, semidecídua, encontrada em todo o
território brasileiro, principalmente nas áreas costeiras, e alcança aproximadamente 12 a
15 metros de altura. Um espécime possui normalmente tronco único, porém as sementes
germinam em grupo, dando aparência de moitas com vários caules (Figura 1) (SIEBRA,
2007). Necessita de solo úmido para crescimento e beneficia-se de inundações
regulares, porém não permanentes.
Cresce naturalmente nas Américas do Norte, do Sul e Central, além do oeste
Africano, em regiões alagadas, salobras ou não. Seu crescimento ocorre em habitats que
estão periodicamente ou permanentemente inundados, ou seja, ao longo de rios,
margens de lagos e em regiões salobras próximas ao litoral (CROAT, 1978). A
adaptação a esses ambientes se deve às várias características estruturais da planta, como
intumescimento da base de seu tronco, raízes adventícias, aerênquima nas raízes, tronco
pequeno, frutos que bóiam e à dispersão das sementes na água (ZOTZ et al., 1997).
Consegue sobreviver em períodos de seca, porém seu crescimento torna-se severamente
comprometido.
Figura 1. Planta da espécie A. glabra, no campo experimental da Embrapa-RO. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga.
As flores, raramente observadas, porém muito atrativas, geralmente possuem
dois a três cm de diâmetro, variando de amarelo pálido a creme, com três pétalas
maiores externas encouraçadas e três pétalas pequenas internas (figura 2) (SIEBRA,
2007).
Figura 2. Flor de A. glabra, (A) uma fechada e duas que sofreram aborto. (B) Flor iniciando a sua abertura. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga.
As folhas possuem de sete a 12 cm de comprimento, pecíolo cilíndrico, lâmina
oblonga, cartácea, base obtusa, ápice acuminado, margem plana, com nove a 13 pares
de nervuras secundárias. A maturidade reprodutiva é atingida após aproximadamente
dois anos, quando se inicia a floração e a produção de frutos (figura 3) (SIEBRA, 2007).
Figura 3. Folhas de A. glabra. (A) Adaxial. (B) Abaxial. Foto: Andrina Guimarães Silva Braga.
O fruto é esférico, com cerca de cinco a 15 cm de diâmetro, naturalmente verde.
Após sua queda, torna-se amarelado, escurecendo em seguida. Contém pouco mais de
100 sementes, de aspecto semelhante aos da abóbora, com aproximadamente um
centímetro de comprimento (Figura 4) (SIEBRA, 2007). No Brasil, os frutos caem nos
A B
A B
meses de março e abril, permanecendo viáveis por alguns meses em água doce ou
salobra. Para que ocorra a germinação, a semente necessita de ambiente alagadiço ou
úmido. Uma vez estabelecida a germinação, a planta pode sobreviver em altos níveis de
salinidade, possuindo, na fase adulta, considerável tolerância a ambientes salinos
(SIEBRA, 2007).
Figura 4. Fruto verde de A. glabra. Foto: Laiza Nunes Limana.
O araticunzeiro-do-brejo tem recebido a atenção de pesquisadores, pois pode ser
usado como porta-enxerto ananizante. No Brasil, a espécie tem sido indicada como
porta-enxerto para a graviola (Annona muricata L), por apresentar excelente grau de
compatibilidade (FERREIRA & CLEMENT, 1987; PINTO & SILVA, 1994; PINTO,
2005). O interesse por este material é devido à tolerância do sistema radicular a
condições de excesso de umidade no solo e à indução de nanismo à copa enxertada.
Além disso, possui potencial fitofarmacológico, apresentando propriedades
antibactericidas, antifúngicas, inseticidas e citotóxicas. Desenvolve-se bem em regiões
alagadas, salobras ou não (LEITE, 2011).
3.4. CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
A biotecnologia vegetal tem contribuído de forma relevante para o setor
produtivo a partir do impulso, na década de 1990, das pesquisas para a produção de
plantas livres de vírus, para a propagação clonal e o desenvolvimento de genótipos
resistentes a estresses bióticos e abióticos via engenharia genética (TORRES et al.,
1998).
A cultura de tecidos vegetais é uma técnica com grandes aplicações na
agricultura. Nessa técnica, pequenos fragmentos de tecido vivo, chamados explantes,
são isolados de um organismo vegetal, desinfestados e cultivados assepticamente, por
períodos indefinidos em um meio de cultura apropriado. O objetivo é obter novas
plantas idênticas à original, ou seja, realizar uma clonagem vegetal que é definida como
uma propagação assexuada de células ou organismos de modo a obter novo indivíduo,
mantendo-se o genótipo idêntico àquele do ancestral comum (TORRES et al., 2000).
O cultivo in vitro é um método viável para propagação de diversas espécies
frutíferas, podendo ser utilizada também com as espécies nativas proporcionando a
formação de pomares com populações de plantas homogêneas além de acelerar os
métodos de propagação convencional (SOUZA et al., 2007).
Assim, é uma excelente ferramenta para clonar plantas em escala comercial,
além de colaborar na realização de estudos de transformação genética e conservação de
espécies vegetais. Permite ainda aperfeiçoar a interação entre fatores abióticos
(nutricionais, luminosos, temperatura, etc.) e bióticos (hormonais e genéticos),
resultando em plantas sadias, vigorosas e geneticamente superiores, que podem ser
multiplicadas massivamente (ALVES et al., 2012).
Essa técnica é considerada importante para a propagação de várias espécies
lenhosas e vem sendo utilizada com sucesso (LANDA et al., 2000). A propagação por
meio de cultura de tecidos pode ser feita por via direta ou indireta, esta última via
formação de calos, que é considerada uma forma potencial de propagação em massa
(PIERIK, 1987; LANDA et al., 2000). Estudos com calos devem ser desenvolvidos para
determinar as condições de cultura que os explantes requerem para sobreviver e crescer
(SIQUEIRA & INOUE, 1992).
O cultivo de calos pode ser utilizado para se estudar o desenvolvimento celular,
explorar produtos provenientes do metabolismo primário e secundário, obter suspensão
celular e propagação via formação de gemas ou embriões somáticos (LANDA et al.,
2000). O uso de múltiplas brotações tem sido amplamente utilizado para a propagação
em massa de diversas espécies, e estas técnicas de cultura de tecidos têm sido
geralmente realizadas através da formação de brotos, via calos (TSURO et al., 2000).
Estas técnicas, em muitas espécies lenhosas, têm permitido a obtenção de calos, através
dos quais é possível obter embriões somáticos e/ou induzir respostas morfogênicas
capazes de produzir plântulas com características agronômicas desejáveis.
Espécies arbóreas nativas têm sido amplamente utilizadas em programas de
revegetação de áreas degradadas de cerrados e matas ciliares, requerendo uma produção
contínua de um grande número de mudas. No entanto, algumas destas espécies
apresentam sementes com algum tipo de dormência, dificultando sua propagação,
tornando importante a obtenção de mudas de forma assexuada. Várias espécies nativas
têm problemas com o baixo poder de germinação, muitas vezes são dormentes ou sem
reservas. Assim, técnicas alternativas de propagação assexuada, como a cultura de
tecidos, devem ser estudadas para se obter um número expressivo de mudas de espécies
ecológica e comercialmente importantes (SANTOS et al., 2005).
3.4.1 Micropropagação
A micropropagação baseia-se no fenômeno da totipotência das células vegetais,
ou seja, cada célula possui a capacidade de gerar uma nova planta, permitindo a
manutenção plena das características da planta-mãe, de modo uniforme, rápido
crescimento e matéria-prima homogênea, uma vez que é possível obter várias cópias
geneticamente idênticas de um mesmo indivíduo, livre de contaminações (GAMBORG
& SHYLUCK, 1981; CALDAS et al., 1990).
Métodos de propagação vegetativa seriam uma alternativa para a produção de
mudas com características idênticas à planta matriz, permitindo a formação de pomares
homogêneos quanto à produtividade, qualidade do fruto, precocidade e tolerância às
pragas e doenças, além da antecipação do início da produção comercial, a partir da
redução da fase juvenil da planta (LIRA et al., 2007).
Micropropagação é o desenvolvimento de novas plantas em um meio artificial
sob condições assépticas, in vitro, a partir de pequenos propágulos (explantes) livres de
microrganismos. Para a micropropagação de frutíferas, as partes mais empregadas são
os ápices caulinares, micro-estacas, embriões, calos celulares, entre outros. A cultura de
tecidos difere dos métodos tradicionais, principalmente nas condições sob as quais a
propagação é efetuada, mas não difere destes quanto aos seus princípios. As diferenças
óbvias referem-se ao fato de a micropropagação empregar propágulos pequenos,
controle asséptico, controle do meio ambiente e rápida multiplicação das frutíferas,
garantindo a manutenção das características agronômicas essenciais das cultivares
(FACHINELLO et al., 1994; TREVISAN et al., 2004).
Murashige (1974) propôs três diferentes estágios para a micropropagação:
estágio I: seleção de explantes, desinfestação e cultivo destes em meio nutritivo, sob
condições assépticas; estágio II: multiplicação dos propágulos por meio de sucessivos
subcultivos, em meios de cultura apropriados e; estágio III: transferência das partes
aéreas produzidas para meio de cultura com reguladores de crescimento indutores de
raízes e o posterior transplantio das mudas produzidas para substrato ou solo. Um
protocolo completo de propagação de plantas consiste em descrever esses três estágios
do processo para uma determinada espécie.
A produção industrial de plantas in vitro é uma prática bastante usada em
agroindústrias de flores em países como Estados Unidos e Europa. É um método
biotecnológico já consagrado, que pode produzir plantas (mudas) mais sadias e
uniformes, com uma velocidade muito mais rápida do que os métodos convencionais.
Esta tecnologia pode ser usada para produção de todas as plantas que normalmente
propagam-se vegetativamente. Hoje a produção industrial de plantas in vitro, a
biofabricação de plantas, já não se limita a flores e plantas ornamentais. Outras plantas
de valor econômico, como café, batata, banana, abacaxi, eucalipto, pinus, cana-de-
açúcar, entre outros, têm sido produzidas em biofábricas no mundo inteiro (RIBEIRO et
al., 2010).
Muitos são os fatores que influenciam o comportamento do explante no meio de
cultura, incluindo o órgão que serve como fonte de tecido, a idade fisiológica e
ontogenética do órgão, o tamanho do explante e, acima de tudo, a qualidade da planta
doadora (THORPE & PATEL, 1984). O controle da qualidade do material vegetal em si
e a manipulação deste antes de se isolar o explante são aspectos importantes na cultura
de tecidos. Esta manipulação inclui o manejo cultural e ambiental da planta matriz, pois
os estados nutricional, fisiológico e fitossanitário desta têm grande influência no
posterior comportamento do explante e da cultura. Plantas nutridas sem sintomas de
deficiência nutricional ou hídrica, em geral, fornecem explantes de melhor qualidade
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
3.4.2. Hormônios e Reguladores de Crescimento
De acordo com a maioria dos fisiologistas de plantas, o hormônio vegetal,
também chamado de fitohormônio, é um composto orgânico sintetizado em uma parte
da planta e translocado para outra parte, onde, em baixa concentração, causa uma
resposta fisiológica (promoção ou inibição). O termo regulador de crescimento é
normalmente empregado para compostos naturais (fitohormônio e substâncias naturais
de crescimento) ou sintéticos (hormônio sintético e regulador sintético) que exibem
atividade no controle do crescimento e desenvolvimento da planta. Para Lamas (2001),
o termo regulador de crescimento define substâncias químicas sintéticas que têm efeito
sobre o metabolismo vegetal.
A composição e concentração de hormônios no meio são fatores determinantes
no crescimento e no padrão de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultura de
tecidos (CALDAS et al.,1998).
Reguladores de crescimento também podem ser utilizados em fases iniciais da
cultura com objetivo de melhorar a germinação, emergência e o desenvolvimento inicial
das plantas. Na fase de estabelecimento da lavoura, diversos fatores podem influenciar
negativamente o desempenho das plantas, como: desuniformidade de germinação e
lento desenvolvimento do sistema radicular. Existe alta correlação entre o
desenvolvimento inicial das plântulas e a produtividade da lavoura, por isso é necessária
a adoção de práticas que possam ajudar a superar os estresses existentes nas primeiras
fases de seu desenvolvimento (BECKER et al., 1999).
O uso de reguladores de crescimento nas diferentes fases do processo pode ser
considerado como essencial para a realização dos trabalhos. De acordo com França
(2001), a presença de reguladores de crescimento no meio de cultura propiciou amplo
avanço das técnicas que constituem a biotecnologia atual. O uso de citocininas é muito
favorável na fase de multiplicação in vitro, sendo o tipo e a concentração os principais
fatores que influenciam no processo (SOUZA et al., 2003).
As citocininas são reguladores de crescimento que desempenham um papel
fundamental no crescimento e cultura de tecidos, estimulando a divisão celular, bem
como a indução e a proliferação de gemas axilares, além de quebrarem a dominância
apical (HU & WANG, 1983). O tipo de citocinina e sua concentração são os fatores que
mais influenciam o sucesso da multiplicação in vitro (SCHUCH & ERIG, 2005). O
thidiazuron (TDZ) tem sido usado na micropropagação, pois, segundo Huetteman &
Preece (1993), é um excelente estimulante para formação de calos.
As auxinas são substâncias quimicamente relacionadas com o ácido indol-3-
acético (AIA), que é a auxina principal de várias plantas. Essas substâncias têm em
comum a capacidade de atuar na expansão e no alongamento celular, ajudando também
na divisão celular em cultura de tecidos, principalmente no enraizamento
(KRIKORIAN, 1991). Entre outras substâncias usadas para o enraizamento in vitro
estão o ácido naftaleno acético (ANA), o ácido 2-4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e o
ácido indolbutírico (AIB) (ROSS, 1992).
A auxina 2,4-D é bastante usada para a indução de calos e tem o efeito de
supressão da morfogênese. As auxinas 2,4-D e ANA são sintéticas e têm efeitos
semelhantes às auxinas de ocorrências naturais, sendo mais estáveis à degradação.
3.5. SUBSÍDIOS PARA O DESENVOLVIMENTO REGIONAL E ME IO
AMBIENTE
Na Amazônia, as categorias socioambientais de ocupação humana são
distinguidas em termos de pressão de uso e do impacto que exercem sobre o ambiente,
relacionados ao modo como ocupam, exploram e concebem sua relação com a natureza.
O comportamento de uma dada categoria socioambiental em relação ao ambiente é
influenciado por características de sua formação social, tais como a orientação de sua
produção econômica, grau de envolvimento como o mercado e a posse de uma cultura
ecológica (LIMA & POZZOBON, 2005).
O desenvolvimento sustentável não é um estado permanente de harmonia, mas
um processo de mudança no qual a exploração dos recursos, a orientação dos
investimentos, os rumos do desenvolvimento tecnológico e a mudança institucional
estão de acordo com as necessidades atuais e futuras. A maioria dos países em
desenvolvimento necessita de sistemas de incentivo mais eficazes para estimular a
produção, sobretudo de culturas alimentares. É necessário que as “relações de troca”
passem a favorecer o pequeno agricultor, promovendo práticas agrícolas sensatas do
ponto de vista ecológico (GUIMARÃES, 1996).
As tecnologias emergentes prometem maior produtividade, mais eficiência e
menos poluição, que beneficiem a natureza em altas proporções, a fim de atender as
necessidades humanas básicas, pois um desenvolvimento agrícola rápido e sólido
representa não só mais alimento, como também conservação dos recursos naturais
(LIMA, 2011).
Os avanços da biotecnologia, ocorridos nos últimos anos, certamente
concorrerão para dinamização desse processo, criando entre todos os agricultores a
expectativa de oferecer mudas de qualidade. Isso para que a fruticultura aumente
sempre sua competitividade, respeitando os preceitos contemporâneos de
sustentabilidade.
Com isso, a disponibilização de mudas por esse sistema pode aumentar a
competitividade do produtor, já que as mudas micropropagadas permitem a obtenção de
plantas uniformes e isentas de doenças, além de possibilitar que o planejamento da
produção seja cumprido durante todo o ano. Isso estabelece uma melhoria no padrão de
rendimento da produção, implicando em uma maior competitividade na comercialização
dos produtos agrícolas, o que colabora ainda com a geração de emprego, renda e fixação
do homem no campo (LIMA, 2011).
A busca de novas tecnologias é o caminho para promover melhoria de vida dos
agricultores. Desse modo, a utilização de ferramentas biotecnológicas para a produção
de mudas de algumas espécies vegetais em larga escala, com alta qualidade sanitária,
fidelidade genética, vigor e uniformidade, tem contribuído para o desenvolvimento da
agricultura em determinados setores, além de reduzir o impacto negativo em relação ao
ambiente, à saúde dos trabalhadores rurais e do consumidor, devido à menor utilização
de agrotóxicos.
4. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biotecnologia Vegetal da
Embrapa Rondônia, em Porto Velho, Rondônia (8º53’20’’ S 63º06’40’’ W), no período
de novembro de 2010 a junho de 2012.
As folhas de A. glabra L. utilizadas para o experimento foram coletadas no
campo experimental da Embrapa-RO, localização de 8º48’50’’ Latitude e 63º50’48”
Longitude. Foram separados quatro exemplares da espécie, e em seguida encaminhadas
para o registro na forma de exsicata para o Herbário Dr. Ary Tupinambá Penna Pinheiro
com número de registro 6847. De acordo com a classificação de Köppen, o clima da
região é do tipo Aw’ caracterizado como tropical chuvoso com média climatológica da
temperatura do ar, durante o mês mais frio, superiores a 18ºC, e um período seco bem
definido durante a estação de inverno, quando ocorre na região um moderado déficit
hídrico, com índices pluviométricos inferiores a 50 milímetros por mês.
4.1. ESTABELECIMENTO IN VITRO
Foram utilizadas folhas jovens de A. glabra L. coletadas nos meses de novembro
a março, quando só se observa crescimento vegetativo, sem a presença de flores ou
frutos. As plantas são cultivadas no campo experimental da Embrapa Rondônia, no
município de Porto Velho-RO. Todas as manipulações foram efetuadas em câmara de
fluxo laminar. Os explantes inoculados foram mantidos em câmara de crescimento, com
luminosidade de 2000 lux e fotoperíodo de 16 horas. O material com reguladores foi
mantido no escuro sob temperatura de 24±2ºC.
4.2. DESINFESTAÇÃO DOS EXPLANTES
As folhas foram coletadas no campo experimental e levadas para o laboratório,
onde foram lavadas com água destilada corrente, com auxílio de esponja estéril,
detergente comercial e sabão antisséptico. Em câmera de fluxo laminar, as folhas foram
imersas em álcool 70% (v/v) por um minuto e logo após foram submersas em solução
de hipoclorito de cálcio nas concentrações 5 e 10% (p/v), em períodos de 15 e 30
minutos, sendo mantidos em constante agitação, seguida de três enxagues com água
destilada ionizada autoclavada. Com auxílio de pinça e de bisturi, foram segmentadas, a
parte das folhas contendo nervuras principais e secundarias, em fragmentos de 1 cm2, e
cultivadas em tubos contendo 10 ml de meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962)
com a metade da concentração de nutrientes e suplementado com 30 g.L-1 de sacarose e
solidificado com 8 g.L-1 ágar. O pH foi ajustado para 5,8±0,1 antes da autoclavagem a
121ºC e 1 atm, durante 20 minutos, sem a presença de reguladores de crescimento.
Após a inoculação, os cultivos foram mantidos no claro, em sala de crescimento, a
25±1ºC, por um período de sete dias.
4.3. INDUÇÃO DE CALOS
Para a indução de calos, as folhas jovens de A. glabra foram desinfestadas,
segmentadas e inoculadas em meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), com 30 g.L-
1 de sacarose e solidificado com 8 g.L-1 de ágar e combinações fatoriais dos reguladores
de crescimento 2,4-D (0, 2, 4, 8 mg.L-1.) e TDZ (0, 2, 4, 8 mg.L-1). Após a inoculação,
as amostras foram mantidas em sala de crescimento no escuro, sob temperatura de
24±2ºC.
Os dados foram
submetidos à análise de
variância, utilizando o
software BioEstat 5.0 e as
médias foram submetidas ao
teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
5. RESULTADOS E
DISCUSSÃO
5.1. DESINFESTAÇÃO DOS EXPLANTES
Na tabela 1 está representada a análise de variância referente aos tratamentos
de desinfestação dos explantes foliares A. glabra. Pode-se observar que os tratamentos
diferiram significativamente entre si e que houve interação entre as concentrações de
hipoclorito de cálcio e os tempos de imersão neste desinfestante. Com o desdobramento
dos fatores observa-se que as concentrações só diferiram entre si no período de imersão
de 15 minutos, e que os tempos de imersão só diferiram entre si na concentração de
10% de hipoclorito de cálcio. Considerando a existência de interação, procedeu-se ao
teste de Tukey, cujos resultados são apresentados posteriormente (Figura 5).
Tabela 1. Análise de variância referente aos tratamentos de desinfestação de explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa-Rondônia, 2012. Causas de variação GL QM F Tratamentos (3) 19,31 91,97** Resíduo 12 0,21 Concentrações 1 22,57 107,45** Tempos 1 18,07 86,02** C x T 1 17,30 82,38** C (dentro de 15’) 1 0,13 0,59ns
C (dentro de 30’) 1 40,50 192,86** T (dentro de 5%) 1 0,00 0,00ns
T (dentro de 10%) 1 36,13 172,05** CV (%) 5,51 * Significativo a 5% de probabilidade; ** significativo a 1% de probabilidade. ns: não significativo.
Aos sete dias de inoculação, o tratamento que mostrou maior eficiência quanto à
desinfestação, além de ser menos agressivo aos tecidos foliares, foi o tratamento que
combinou o período de 30 minutos de imersão com a concentração de hipoclorito de
cálcio a 10%, resultando em 90% de explantes sem presença de micro-organismos
(Figura 5). Já nos outros tratamentos foi observada uma porcentagem maior de
contaminação, chegando a apresentar 100% no tratamento que combinou o período de
15 e 30 minutos com a concentração de 5% de hipoclorito de cálcio.
*As letras diferentes indicam significância, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Figura 5. Efeito das combinações de tempo de imersão e concentração de hipoclorito de cálcio na desinfestação de explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa Rondônia, 2012.
Mateo-Sagasta (1990), afirma que no início da desinfestação dos explantes, é
utilizado etanol 70% durante alguns segundos, com a finalidade de se eliminar bolhas
de ar e parte dos lipídios, aumentando assim o contato do desinfestante com o material
vegetal. Juntamente com etanol, o cloro é o princípio ativo mais utilizado, em geral na
forma de hipoclorito de sódio que é encontrado facilmente na forma de água sanitária. O
hipoclorito de cálcio é encontrado em forma de pó, necessitando dissolver e filtrá-lo. A
dificuldade maior nesta etapa reside na obtenção de tecidos descontaminados sem
conduzi-los à morte, quando isolados. Sendo determinantes os pré-tratamentos
aplicados na planta matriz para o sucesso desta etapa do trabalho (GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1998). Segundo Leifert et al. (1991), a condição fitossanitária da planta
determina a eficiência no processo de desinfestação dos explantes. Por esta razão a
escolha da planta doadora e do material vegetal é importante, ao escolher explantes de
folhas para a realização deste trabalho, se fez necessário o retorno ao estado
meristemático, para que em seguida se promova a rediferenciação. A desdiferenciação e
indução de regeneração de plantas a partir de calos são, muitas vezes, um processo
difícil de ser obtido e pode demandar algum tempo de experimentação, até se obter um
protocolo de micropropagação (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Várias substâncias com ação germicida são utilizadas, entre elas o hipoclorito de
cálcio, cloreto de mercúrio, o ácido clorídrico, o cloreto de benzalcônico, o peróxido de
hidrogênio e, os mais comumente utilizados, o hipoclorito de sódio, também pode ser
utilizado para a desinfestação dos explantes (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Geralmente, um surfactante como Tween 20, ou outro detergente, é adicionado à
solução de hipoclorito para facilitar a sua ação, aumentando o contato da solução com
os tecidos (TORRES et al., 1998). Porém, a adição deste pode, além de diminuir a
contaminação, aumentar a toxicidade do hipoclorito para o tecido vegetal (CORREA,
2010).
Para Hartmann et al. (2002) a desinfestação do material juvenil geralmente não é
difícil, entretanto, também são utilizados explantes de material adulto ou de plantas
crescidas em condição de campo. Esta apresenta dificuldades, pois a percentagem de
contaminação é frequentemente alta, quando comparadas com as de explantes juvenis
ou retiradas de mudas mantidas em casa-de-vegetação. A contaminação pode ser
reduzida por pulverizações com inseticidas e fungicidas, envolvendo os brotos das
plantas em sacos plásticos ou mantendo-os em casa de vegetação. Esta dificuldade em
desinfestar o material vegetal pode ser observada neste trabalho, ao comparar os dados
de concentração de 5% de hipoclorito de cálcio a 15 e 30 minutos atingiram o ponto
maximo de contaminação (100%), enquanto que a concentração de 10% por 15 minutos
atingiu 90% de contaminação, e a imersão de 30 minutos resultou em um melhor
potencial, ao atingir 90% de explantes desinfestados. Por isso é que as concentrações
das soluções desinfestantes e a combinação dos princípios ativos podem variar muito
em função da sensibilidade do tecido a ser desinfestado (GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1998).
Santos et al. (2011), ao testar explantes foliares de insulina vegetal (Cissus
verticillata) com hipoclorito de cálcio a 1,25; 2,5; 5,0 e 10,0% e hipoclorito de sódio a
0,50; 1,0; 1,5 e 2,0%, com tempo de imersão de 30 minutos, observou que o mais
eficiente foi o hipoclorito de cálcio, na concentração de 5,0%, a qual resultou em 95%
de desinfestação. Porém, os resultados diferiram bastante do presente trabalho, no qual
o hipoclorito de cálcio na concentração de 5% com o tempo de 30 minutos obteve uma
contaminação de 100% dos explantes. O cloro, principal componente do hipoclorito,
quando liberado em meio aquoso atua na inibição enzimática via desnaturação proteica
e inativação de ácidos nucleicos, o que de acordo com Pasqual et al. (2002), por inativar
enzimas e agir como oxidante, tem ação bactericida, porém apresenta baixa eficiência
contra esporos.
5.2. INDUÇÃO DE CALOS
Na tabela 2, está apresentada a análise de variância referente ao efeito dos
reguladores de crescimento TDZ e 2,4-D na indução de calos em explantes foliares de
A. glabra. Quanto ao desdobramento do efeito das concentrações de 2,4-D em cada
concentração de TDZ, observa-se que só houve efeito significativo do 2,4-D nas
concentrações de 4 e 8 mg.L-1 de TDZ (Tabela 2).
Tabela 2. Análise de variância referente aos efeitos dos reguladores de crescimento TDZ e 2,4-D na calogênese em explantes foliares de A. glabra. Porto Velho-RO, Embrapa-Rondônia, 2012.
Causas de Variação
GL QM F
Tratamentos (15) (12,25) 72,05 ** Resíduo 48 0,17
TDZ 3 0,42 2,47 ns 2,4-D 3 18,25 107,35**
TDZ X 2,4-D 9 14,19 83,50** 2,4-D (0 TDZ) 3 4,5 0,56 ns 2,4-D (2 TDZ) 3 2 0,25 ns 2,4-D (4 TDZ) 3 43,56 5,45** 2,4-D (8 TDZ) 3 46,72 5,84**
CV(%) 6,48 ns: Não significativo. ** Significativo (P<0,01)
Nos segmentos foliares de A. glabra L. inoculados na ausência de reguladores de
crescimento não foi observada calogênese. O processo de indução de calos teve início
aos 14 dias após a inoculação (Figura 6 B), sendo que os explantes apresentaram
intumescimento, indicando desta forma o início do processo. Na avaliação final aos 28
dias após a inoculação, o 2,4-D apenas apresentou efeito nas concentrações de 4 e 8 mg.
L-1 de TDZ sendo que, nestas concentrações, apenas foi obtido 100% de calos na
ausência de 2,4-D. Considerando que estas duas concentrações de TDZ foram
equivalentes em relação ao efeito calogênico, o tratamento mais simples e econômico, 4
mg.L-1 de TDZ isoladamente, pode ser indicado para a indução de calos nesta espécie.
Na calogênese, os reguladores de crescimento agem sobre a expressão gênica, de
forma sinérgica ou não, fazendo com que, a partir de células de tecidos organizados e
diferenciados, se forme uma massa de células com características meristemáticas cujo
crescimento é, geralmente, muito rápido e irregular. Neste contexto, geralmente os
níveis de citocininas e auxinas promovem um balanço hormonal que pode estimular o
crescimento da planta (SANTOS, 1998).
Para Kerbauy (1998) o comportamento de formação de calos oriundos da parte
aérea é apresentado devido a expressão morfogenética diante do sinergismo auxina e
citocinas. Porém este balanço hormonal não foi significativo neste experimento, já que
o TDZ resultou em 100% de calogênese quando isolado.
Neste contexto, geralmente os níveis de citocininas e auxinas promovem um
balanço hormonal que pode estimular o crescimento da planta. Segundo Ammirato
(1993), o balanço de auxina/citocinina em alta/baixa concentração favorece o
enraizamento e o balanço inverso promove a formação da parte aérea e concentrações
iguais promovem a produção de calos.
Corroborando com este estudo Londe (2005) relata que auxina 2,4-D, testada
em explantes de cajuí (Anacardium nanum), não teve efeito significativo.
Paiva et al. (2012) ao testar o potencial de regeneração em folhas das espécies
A. squamosa, A. bahiensis e A. glabra in vitro, utilizaram a combinação de BAP e
ANA (0,0; 0,5 e 1,0 mg.L-1) observaram que ocorreu a organogênese direta sem
formação de calos.
Os reguladores que se destacam na indução de calos são o 2,4-D e TDZ (LU,
1993), no qual o 2,4-D tem sido amplamente utilizado para a indução de calos (PALÚ,
2004; SANTOS, 2001; NOGUEIRA et al., 2007). Torres et al. (1998), citam que o
regulador vegetal 2,4-D apresenta caráter indutor para o intumescimento e calosidade.
George (1996), em estudos com murici-pequeno (Byrsonima intermedia A.
Juss.) verificou que explantes foliares responderam positivamente a presença de 2,4-D.
As auxinas são capazes de iniciar a divisão celular e controlar os processos de
crescimento e alongação celular. O 2,4-D tem efeito no metabolismo do RNA,
induzindo a transcrição de RNAs mensageiros capazes de decodificar proteínas para o
crescimento e que podem induzir a proliferação celular desordenada. O crescimento de
tecidos vegetais organizados in vitro geralmente não é inibido pela luz. Entretanto,
divisões celulares iniciais do explante e o crescimento de calo podem ser inibidos pela
presença de luz (GEORGE, 1996). A indução e formação de calos pode ter sido
influenciada pela ausência de luz, fato também já proposto por Nascimento et al. (2003),
que trabalharam com indução de calos em carqueja Baccharis trimera (Less) DC. Por
esta razão após a inoculação dos explantes, os mesmos foram mantido em câmara de
crescimento sem luminosidade sob temperatura de 24±2ºC.
Por ser o TDZ mais potente que outras citocininas, as concentrações requeridas
são menores que das demais citocininas para se obter resultados similares de
multiplicação (HUETTEMAN & PREECE, 1993). Sankhla et al. (1996), verificaram
que o TDZ, utilizado em baixas concentrações, 0,1 M, foi altamente eficiente em
promover a multiplicação de brotações de Albizzia julibrissin, sendo necessárias altas
concentrações de benziladenina e zeatina (ZEA) para produzir efeito similar. As
citocininas têm profundo efeito sobre a síntese de proteínas e sobre os tipos de proteínas
feitas pela planta. Em particular, a citocinina estimula a síntese de proteínas específicas
do cloroplasto que são codificadas por genes nucleares.
Cavalcante (2001) cita que ao combinar o TDZ com o 2,4-D não foi observado
a iniciação de calos friáveis e que as concentrações de 2 e 3 µM de TDZ isoladamente
induziram as maiores frequências de indução de calos em explantes foliares de cupuaçu
(Theobroma grandiflorum (Willd ex Spreng) Schum).
Ahroni et al. (1997), testaram as citocininas BAP, CIN, ZEA e o TDZ, e
obtiveram melhores resultados com TDZ. O TDZ geralmente é mencionado como um
potente indutor de calos (MURTHY et al., 1998; HUETTEMAN & PREECE, 1993).
Wilhelm (1999), mencionou que concentrações mais altas dessa citocinina
proporcionaram a produção de calos mais volumosos. Entretanto, Nieuwkerk &
Zimmerman (1986), observaram que altas concentrações de TDZ causaram necrose em
tecidos de macieira, vitrificação e crescimento anormal da folha.
Salman (2002), obteve 100% de calos desenvolvidos a partir de segmentos
foliares em meio suplementado com 2,4-D e BAP. Em seu estudo, a maior taxa de calos
foi obtida mantendo-se a relação auxina/citocinina igual a 0,2 mg.L-1. Resultado
diferente foi encontrado neste trabalho, já que as combinações de reguladores não foram
tão eficazes quanto aos seus efeitos isolados.
Werner et al. (2007), observaram resultados positivos quanto à formação de
calos, quando usadas altas concentrações da auxina 2,4-D (5, 10, 20, 50 e 100 mg L-1).
Esses resultados apontam que concentrações maiores podem ser usadas para a indução
da calogênese. As auxinas são capazes de iniciar a divisão celular e controlar os
processos de crescimento e alongação celular. O 2,4-D tem efeito no metabolismo do
RNA, induzindo a transcrição de RNAs mensageiros capazes de decodificar proteínas
para o crescimento e que podem induzir a proliferação celular desordenada (GEORGE,
1996).
O uso de 2,4-D isoladamente na concentração de 6,4 mg.L-1 induziu calogênese
e rizogênese em explantes foliares de moreira (Chlorophora tinctoria), produzindo
calos de aspecto friável e coloração amarelada, conforme relatou Paiva Neto (1996).
Resultado semelhante foi encontrado no presente trabalho com emprego isolado de 2,4-
D apresentando eficiente indução de calos. Para Nogueira (2003) e Soares (2003), a
concentração de 1 mg.L-1 de 2,4-D é eficiente na indução de calos.
Para o tipo de explante testado de A. glabra L., o TDZ foi o fitorregulador mais
eficiente na desdiferenciação celular. De acordo co os resultados obtidos no presente
trabalho, a concentração de 4 mg.L-1 de TDZ foi eficiente na indução de calos mesmo
em explantes cultivados em meio desprovido de 2,4-D. Não foram encontrados na
literatura resultados similares para espécies pertencentes ao gênero Annona.
A B
C D
Figura 6. Desenvolvimento dos segmentos foliares, quanto à indução de calos. Avaliação em sete dias (A); avaliação em 14 dias (B); explante com 21 dias (C) e com 28 dias de inoculação (D) e calo com mais de 28 dias (E). Foto: Andrina Guimarães Silva Braga.
6. CONCLUSÕES
Com as análises dos resultados pode-se afirmar que:
• Nas condições em que foi realizado este trabalho a desinfestação de 90% dos
explantes foliares de A. glabra é obtida com imersão em álcool 70% (v/v) por
um minuto, seguida de imersão em solução de hipoclorito de cálcio a 10% (p/v)
por 30 minutos.
• Recomenda-se a utilização de TDZ a 4 mg.L-1 para a indução de calos em
explantes foliares de A. glabra.
E
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