265

7. Séquençage des protéines

Protéine inconnue

Structure primaire

séquençage des acides aminés

structure secondaire structure tertiaire structure quaternaire

266

7.1 Stratégie de séquençage d’une protéine

Stratégie de base développée par Frederick Sanger en 1953 (Prix Nobel 1958)

Étapes impliquées dans le séquençage d’une protéine:• Détermination du nombre de chaînes polypeptidiques (sous-unités)

dans la protéine• Coupure des liens disulfures (inter- ou intramoléculaires)• Détermination de la composition des acides aminés de chaque chaîne

polypeptidique• Les chaînes polypeptiques sont souvent trop longues pour être

directement séquencées; elles doivent avant être coupées en des plus petits fragments peptidiques par des réactions spécifiques.

• Détermination de la séquence de chacun des fragments peptidiques par la dégradation d’Edman

• Élucidation de la séquence de chacune des chaînes polypeptidiques par recouvrement des séquences des différents fragments

• Détermination de la structure de la protéine entière, incluant les liens disulfures entre les sous-unités

267

7.2 Analyse des résidus terminaux

Puisque chaque chaîne polypeptidique possède un résidu N-terminal et C-terminal, le nombre de sous-unités distinctes dans une protéine peut être déterminé en identifiant le nombre de chacun des résidus terminaux.

NN

N COO-

O

NH3+

HR

H

R H

O

H

H R

O

H

R H

résidu N-terminal résidu C-terminal

268

7.2.1 Analyse N-terminal

Réaction avec du chlorure dansyl (réagit avec des α-amines):

N(CH3)2

SCl

OO

HN CH C NH CH C NHR1

O R2

OCH CR3

O

N(CH3)2

SO2

H2N CH C NH CH C NHR1

O R2

OCH CR3

O

H3O+

HN CH C OHR1

O

N(CH3)2

SO2

HCl

NH3 CH C OHR2

O

HN CH C NH CH C NHR1

O R2

OCH CR3

O

N(CH3)2

SO2

NH3 CH CR3

OOH

+

chlorure dansyl

polypeptide dansyl

+ ++ + + ...

...

...

...

acide aminé dansyl acides aminés libres

(espèce fluorescente)

269

Dégradation d’Edman (analyse séquentielle):

=

phényl isothiocyanate (PITC)

(séquençage de peptides constitués de 40 à 60 résidus)

270

NCS

NH CH C NH CH C NHR1

O R2

OCH CR3

ONH

C

S

H3O+

H2N CH C NH CH C NHR1

O R2

OCH CR3

O

2. traitement avec H3O+NH3 CH C NH

R2

OCH CR3

O

HN N

OR1

PhS

N S

O

NHPh

R1

+

PITC polypeptide

... ...

dérivé phénylthiohydantoin dérivé thiazolinone

acide trifluoroacétique

...++

répétition du cycle

λmax = 296 nm

1. extraction dans un solvant organique

PITC

271

Séquençage automatisé par dégradation d’Edman

272

Réaction enzymatique (exopeptidase):

L’utilité des aminopeptidases pour l’analyse des résidus N-terminalest limitée puisque ces enzymes agissent spécifiquement sur certains acides aminés et avec des vitesses de réaction différentes.

H2N CH C NH CH C NHR1

O R2

OCH CR3

O...

aminopeptidaseH2N CH C O-

R1

ONH3 CH C NH

R2

OCH CR3

O...+

+

273

7.2.2 Analyse C-terminal

Il n’y pas de processus comparable à la dégradation d’Edman pour l’analyse séquentielle des résidus C-terminal.

Réaction enzymatique (exopeptidase):

Due à la nature sélective des carboxypeptidases, certains résidus sont résistants aux coupures ou sont coupés très lentement.

HN CH C NH CH C NHR3

O R2

OCH CO-

R1

O...

carboxypeptidaseH3N CH C O-

R1

ONH CH C NH

R2

OCH CO-

R3

O... +

+

274

Réaction chimique (ex. hydrazinolyse):

NH CH C NHRn-1

OCH CO-

Rn

OH3N CH C

R1

O

NH2-NH2

NH3 CH C NHRn-1

ONH2H3N CH C O-

Rn

OH3N CH C NH-NH2

R1

O+

+

...

polypeptide

90°C, 20-100 h

++

+... +

acide aminé libre hydrazines aminoacyles

conditions légèrement acide

+

275

7.3 Coupure des liens disulfures

+H3N CH

CH2

COO-

SH

+H3N CH

CH2

COO-

HS

+H3N CH

CH2

COO-

S

+H3N CH

CH2

COO-

S

Cystéine Cystéine Cystine

+

Insuline Les liens disulfuresdoivent être coupésavant le séquençage pour séparer et déplier les sous-unités.

276

Oxydation avec de l’acide performique:

Toutes les cystéines dans une protéine sont oxydées (celles qui sont liées ensemble par des ponts disulfures et celles qui sont en forme de thiol).

L’acide performique réagit aussi avec d’autres résidus; ex. le groupement indole de la Trp est partiellement détruit et les résidus Met sont oxydés.

H C CH2 S S CH2 C H

N H

CO

NH

C O

C O OH

O

HH C CH2 SO3

-NH

C O

-O3S CH2 C H

N H

CO

Cystine

+

Acide cystéique

NH CH C

O

(CH2)2

S

CH3

C O OH

O

HNH CH C

O

(CH2)2

S

CH3

OO

Méthionine

277

Réduction avec du dithiothréitol (DTT) ou du 2-mercaptoéthanol:

H C CH2 S S CH2 C HN H

CO

NH

C O2 HSCH2CH2OH CH2OH

CH2SH

CHOHCH2SH

H C CH2 SHNH

C OS

SHO

HOHS CH2 C H

N H

CO

SCH2CH2OHSCH2CH2OH

Cystine

+ ou

+ ou

Cystéines

278

H C CH2 SH

NH

C O

ICH2COO- H C CH2 SCH2COO-NH

C O

+

Cystéine

Iodoacétate

alkylation

Cystéine protégée

+ HI

Pour empêcher la ré-oxydation de la cystéine formée:

279

7.4 Détermination de la composition d’acides aminés d’une protéine

Le nombre de chaque acide aminé dans une chaîne polypeptidique est un paramètre caractéristique de chaque protéine. Une protéine inconnue peut souvent être identifiée en mesurant le pourcentagerelatif des différents acides aminés et en comparant avec des bases de données.

Premièrement, les liens peptidiques dans une protéine sont hydrolysés par traitement acide, basique ou enzymatique. Les acides aminés libérés sont ensuite séparés et quantifiés.

Traitement acide: polypeptides + 6 M HCl, reflux à 100-120°C pour 24 hres sous vide.

280

Des temps de réaction plus long sont nécessaires pour une hydrolyse complète des résidus Leu, Val et Ile.

Par contre, certains résidus sont dégradés dans ces conditions sévères. Trp est considérablement dégradée. La vitesse de dégradation de certains résidus, tels que Thr, Tyr et Ser peut être mesurée et un facteur de correction peut être inclut pour tenir compte de la perte de ces acides aminés en fonction du temps d’hydrolyse.

De plus, l’hydrolyse acide convertit Asn à Asp et Gln à Glu, respectivement (du NH4

+ est éliminé). Pour déterminer la quantité de ces acides aminés, la teneur totale de Asx (Asn + Asp), Glx (Gln + Glu) et NH4

+ (Asn + Gln) doit être mesurée et comparée.

Puisque des conditions optimales pour l’hydrolyse acide sont difficiles à établir, la réaction est effectuée plusieurs fois dans des conditions différentes et la composition des acides aminés est déduite à partir des différentes expériences d’hydrolyse.

281

Hydrolyse basique: Polypeptides + 6 M NaOH, reflux à 100°C pendant 4 à 8 hres. L’hydrolyse basique est seulement utilisée dans des cas spéciauxpuisqu’elle est plus problématique que l’hydrolyse acide.Dans ces conditions, Arg, Cys, Ser et Thr sont décomposées et d’autres résidus sont dé-aminés et racémisés. Ceci limite l’utilisation de l’hydrolyse basique à la détermination de la teneur en Trp.

Les méthodes enzymatiques sont surtout utilisées pour la détermination de l’Asn, de la Gln et du Trp. Puisque les exopeptidases et endopeptidases exhibent des spécificités élevées, il est essentiel d’utiliser un mélange d’enzymes pour assurer l’hydrolyse de tout les liens peptidiques. Des faibles concentrations d’enzymes doivent être utilisées (~1%) puisqu’elles sont aussi des protéines qui peuvent être dégradées et contaminées le mélange réactionnel.

282

Après hydrolyse, les acides aminés libres sont séparés par chromatographie à échange d’ions ou par HPLC à phase inversée.

Exemple: composition des acides aminés dans un peptide(Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe)

Les acides aminés peuvent être identifiés selon leur temps de rétention et quantifiés selon leur volume d’élution.

HN CH C OHR1

O

N(CH3)2

SO2

CH C OHR1

ON

SCH2CH2OH

dérivés fluorescents

283

7.5 Coupure spécifique des liens peptidiques

7.5.1 Fragmentation enzymatique

Exopeptidases: Coupure d’un acide aminé N- ou C-terminal d’une chaîne peptidique

Endopeptidases: Coupure spécifique de liens peptidiques à l’intérieure d’une chaîne

284

trypsine

Protection de la Lys et de l’Arg contre l’hydrolyse par la trypsine

285

La charge positive sur ce dérivé de la cystéine rend cet acide aminé plus susceptible à l’hydrolyse par la trypsine.

286

Br-

H2O

7.5.2 Fragmentation chimique

Le CNBr coupe les liens peptidiques du côté C-terminal d’un résidu Met.

287

7.6 Détermination de l’ordre des fragments peptidiques

La séquence des fragments peptidiques individuels est déterminé en établissant l’ordre dans lequel ils étaient connectés.

La séquence des acides aminés dans un 1er set de fragments est comparé avec celui d’un 2è set de fragments pour lequel les points de coupure sont différents.

Un recouvrement de quelques résidus est généralement suffisant pour identifier un point de connexion.

288

7.7 Détermination des positions des liens disulfures

Fragmentation de la protéine native => mélange de fragments peptidiques, dont certains sont liés par des ponts disulfures

Le mélange peptidique est analysé par électrophorèse sur gel en 2D en utilisant les mêmes conditions de séparation dans les deuxdirections.

Après séparation dans la 1ère direction, la matrice est exposée à l’acide performique pour couper tout les liens disulfures existants.

Ensuite la séparation est effectuée dans la 2è directions. Les fragments qui ne contiennent pas de liens disulfures sont positionnés sur la diagonale puisque leur vitesse de migration dans le deux directions est identique.

289

L’électrophérogramme des fragments contenant des liens disulfuresmontrera 2 points pour les fragments produits par oxydation qui sont positionnés on dehors de la diagonale.

Les fragments liés par des ponts disulfures peuvent être isolés du gel et identifiés par séquençage. La séquence des acides aminés est ensuite comparer avec celle de la protéine entière, permettant ainsi l’identification de la position des liens disulfures.