Transcript
Page 1: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

1 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

- FARMAKODINAMIK - Jumpa lagi.. hahaha.. Nah berhubung materi ini ada yang penting dan ngga (keluar ujian ato ngga kan dikasih tau tuh..), yang katanya keluar itu yang ada bintang-bintang yak.. tapi materi yang lain dibaca juga, ntar ga sesuai perkiran berbahaya.. keh.. lanjuuut.. Baiklah, sekarang kita belajar mengenai farmakodinamik. Apa seh **bedanya** antara farmakodinamik dan farmakokinetik?? Farmakokinetik mempelajari akan nasib obat di dalam tubuh jadi tubuh ngerjain si obat, nah kalo farmakodinamik mempelajari akan nasib tubuh karena obat jadi obat ngerjain tubuh, hehehe.. Kalo diliat, farmakokinetik mempelajari berapa dosis yang harus diberikan, obatnya berapa banyak? Apa bentuknya? Seberapa sering? Dimasukan ke tubuh mau lewat mana? Ya begitulah.. Kalo farmakodinamik mempelajari akan respon tubuh atau dampaknya dari kerja obat tersebut. Ada yang bikin seneng, ada yang bikin tenang, dan lain-lain. Kedua sub-materi dari farmakologi ini dihubungkan lewat keadaan obat di dalam plasma darah dan resptornya di sel. Ini neh yang jadi jembatan keduanya. Secara ilmiah, **definisi dari farmakodinamik** itu adalah. Ilmu biokimia yang mempelajari kerja obat secara fisiologik dalam tubuh dan mekanisme kerjanya, yang merupakan dasar dari terapi pemberian obat dan pembuatan obat baru. Hal ini dilihat dari interaksi antara obat dengan reseptor yang akan memberikan efek bagi tubuh. Mekanisme dari kerja obat itu tergantung reseptor neh kawandz.. Reseptor akan memodulasi tingkat fungsi kerja dari tubuh dan fungsi fisiologis nya. Jadi rumusnya, obat + reseptor = fungsi (inget materi apa gtu.. hehehe ) Contohnya : hormon, growth factor, neurotransmiter, enzymes (Ach [asetilkolin]

transferase, dihodrofolat reduktase, dan transpor elektron kayak Na/K-ATPase)

Reseptor fisiologis itu memiliki 3 bentuk kerja :

Agonis, kerjanya menyerupai kerja senyawa yang berasaal dari dalam sel individu

Antagonis, obat yang memiliki aktivitas intrinsik sehingga menimbulkan efek yang menghambat kerja agonis

Inverse Agonis (Agonis negatif), obat tersebut menimbulkan efek yang berlawanan dengan efek agonis

Mekanisme ini tergantung dari ikatan antara obat dan reseptor, yaitu ikatan ion, hidrogen, hydrofobik, van der Waals hingga kovalen. (umumnya reversible)

Mekanisme kerja reseptor ini bisa diliat dari pompa Na/K-ATPase yang bisa meningkatkan kadar Ca

2+ dalam sel dan

membuat terjadinya kontraktilitas (kontraksi). Struktur dan hubungan antara reseptor dan molekul obat tergantung pada struktur kimia dari obat tersebut terhadap reseptor (affinitas dan aktivitas intrinsik) serta modifikasi diantara keduanya. Contohnya Rasio Efek terapi/efek racun yang jika makin tinggi makin baik adanya, selektivitas obat dan profil dari farmakokinetiknya. (Kalo di slide contohnya ada senyawa thiazolidinedione yang beda struktur dari Troglitazone, Pioglitazone dan Rosiglitazone [nice to know aja, ga keluar.. hehehe]) **Sifat reseptor** ini tergantung dari hal-hal berikut.

Daerah fungsional, yaitu tempat berikatan dengan ligan (ekstrasel) dan yang tidak berikatan dengan ligan (intrasel)

Reseptor occupancy, ada yang langsung ke target selulernya (protein efektor), pake protein efektor lalu kirim second messenger, atau transducer yang memediasi molekul sinyal seluler

Reseptor – protein efektor/transducer/second messenger – target nya merupakan sebuah sistem efektor atau jalur transduksi sinyal.

Merupakan amplifier dari sinyal biokimia

Page 2: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

2 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Diagram ini menggambarkan interaksi antara reseptor inversagonis (Ri) dan Reseptor agonis nya (Ra) serta keadaan berikatan dengan obat (D-Ri dan D-Ra) **Grafik diatas** memperlihatkan mekanisme kerja obat dan kecenderungan rekasi terjadi. misalnya, untuk full agonis, maka reaksi akan cenderung bergerak ke Ra. Begitu seterusnya.

Reseptor ini ada apa aja seh??? **Jenis reseptor fisiologik** yang ada yaitu

Reseptor enzymes, kalo ada teks book yang bilang resptor sitokin, salah satunya contohnya.

Kanal ion, udah tau lah ya.. gerbang perpindahan ion gtu..

G protein, ini lagi mpe bosen.. hehe

Faktor trankripsi, satu-satu nya reseptor di intrasel yang temenan nya sama sinyal yang berupa lipid.

Ne die gambarnye.. udah ringkasan jadi pahamin ye (cara kerja, ligannya, protein efektornya, second messengernya).. hehhehe

**Keterangan gambarnya**. (Afalin neh guyz..) 1. Enzim

Tirosin Kinase, ligannya: insulin, EGF, PDGF, lymphokins

Sherine/ threonine protein kinase : TGF beta

Guanilil siklase : reseptor ANF, reseptor guanilin

Tirosin fosfatase 2. Ligand-gate ion channel

Reseptor asetilkolin nikotinik

Reseptor GABAA

Reseptor glutamat, aspartat and glysin 3. G protein-coupled receptor

Reseptor amin biogenik

Reseptor eikosanoid

Resptor hormon peptida Untuk protein efektornya ada:

Enzyme : adenyl siklase, PLA2, C, D.

Kanal ion : Ca++

, K+, Na

+

Protein transpor 4. Faktor transkripsi

Reseptor hormon tiroid, steroid, retinoid, dan Vitamin D.

ENZIM (PROTEIN KINASE) Jenisnya udah ada diatas, wat protein ini targetnya bisa enzim lain (kinase lainnya), protein regulator, atau protein struktural. Contohnya yang paling gampang ya insulin (santai aja ne Nice 2 Know) **RESEPTOR SITOKIN (JAK-STAT receptor)** Merupakan reseptor tirosin kinase, yaitu 2 protein tirosin kinase yang terpisah (Janus Kinase, JAK family) JAKs ini akan menfosforilasi protein STATs ato signal transducers and activator of transcription (udah pinter lah ya bhs.inggrisnya.. hehehe). Jadi fungsinya ntu, meregulasi transkripsi dari gen yang spesifik. Ligand nya ada growth hormones, erythropoeitin, interferon, etc dah.

Page 3: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

3 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

KANAL ION Sesuai namanya, reseptor ini mengatur potensial membran dan komposisi ion di dalam sel. Untuk jenis ligannya kaya jenis yang dah disebutin diatas, ada asetilkolin nikotinik (nicotinic cholinergic receptor), Reseptor GABAA, glutamat, aspartat and glysin (merupakan **tranmitter sinapsis**) Contohnya reseptor asetilkolin nicotinik, merupakan pentamer (2α, β, γ, δ chains) dengan berat 43000-50000. Asetil kolin berikatan pada subunit α sehingga Na

+ masuk.

PROTEIN G **Ligannya** yaitu..

Amin biogenik (norepinefrin, ACh, histamin, tiramin, dopamin, dll). Eikosanoid (LT [leukotrine], PG [prostaglandin], TX [thromboxan], dll) Hormon peptida (LH, FSH, ACTH, etc)

**Protein efektornya** yaitu adenyl siklase, PLA2 (PhospoLipase A2) , C, D, Kanal ion (Ca

++, K

+, Na

+), protein transpor.

Protein G ini memiliki 3 sub unit yaitu (α, β, γ) yang akan mencari protein efektor. Lalu protein efektor akan berasosiasi dengan second messenger untuk meneruskan sinyal ke dalam sel. Kompleks protein ini memiliki 7 buah protein transmembran yang memiliki bentuk bermacam-macam. Gugus yang berikatan dengan ligan adalah gugus amina dan yang berikatan dnegan protein G α adalah gugus karboksil. Jadi, ke 7 protein ini sebenarnya berbentuk melingkar dengan faktor

agonis ada di tengah-tengahnya (abstrak seh, gw juga bingung.. pizzz). G alfa yang teraktivasi akan mencari protein efektor targetnya dan bagian ini spesifik untuk setiap protein efektor yang ada. Berikut tabel yang memperlihatkan spesifisitas dari efektor yang ada. (JANGAN PANIK!!! INI NICE TO KNOW AJA.. HEHEHE..)

Waktu untuk interaksi nya berbeda-beda, yang paling lama itu pada saat protein G mencapai protein efektornya. Reseptor yang kemudian akan mengaktifkan efektor lalu sinyal yang ada di dalam sel akan berakumulasi dan menimbulkan efek.

OIA, PROTEIN INI PALING FAMOUS DI KEBANYAKAN SEL. FAKTOR TRANSKRIPSI Reseptor spesial yang ada di dalam sel dan bisa mengakibatkan terjadinya trankripsi karena bisa berikatan dengan DNA. **Ligan nya**, yaitu steroid, tiroid, vitamin D dan retinoid. Bagian yang berada di dekat karboksil akan menjadi kontrol atau regulator dari transkripsi DNA yang kemudian akan berikatan dengan DNA untuk menghambat atau mengaktivasi transkripsi gen. ***SECOND MESENGEEEEEEER***

Page 4: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

4 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Karakteristiknya, konsentrasinya sangat rendah, prosuksinya cepat dan mekanisme nya daur ulang. **Contohnya**, cAMP, cGMP, Inositol triphospate (IP3) dan diacylglycerol (DAG), Ca

++, serta NO

(Signaling nya dan contoh nya apa aja di slide NICE TO KNOW AJA.. )

**REGULASI DARI RESEPTOR** Reseptor yang ada di regulasi oleh fungsi fisiologi dan biokimia agar terciptanya homeostasis di dalam sel melalui proses sintesis dan degradasi. Baik reseptro, transducer maupun efektor itu diregulasi. Pemberian stimulasi yang sama secara berkelanjutan dari agonis akan memberikan efek negatif yaitu desensitisasi (kecanduan hingga faktor regulatornya menurun) Mekanisme feedback inhobition nya ada yang

Homolog desensitisasi (dari reseptor yang terstimulasi)

Heterolog desensitisasi (dari banyak reseptor yang sharing jalur sinyal yang sama) Untuk yang homolog, desensitisasi terjadinya hanya pada molekul reseptor itu saja. Bisa mengalami fosforilasi, proteolisis, hingga penurunan sintesis. Untuk yang heterolog, desensitisasi terjadi dengan adanya penghambatan atau hilangnya satu hingga lebih protein yang ikut berpartisipasi dalam jalannya sinyal dari

reseptor yang lain. Jadi karena dia ikutan ngelanjutin sinyal dari resptor itu, dia juga ikut-ikutan mengalami desensitisasi. Ada lagi yang PARAAAH, hehe... namanya supersensitisasi yaitu pengurangan fungsi secara kronik dari stimulasi reseptor itu. Contohnya pada beta-blocker.

Untuk grafik yang ada di atas, ceritanya begini. Kalo mengalami desensitisasi pasti responnya akan menurun. Kalo homolog, bila dikasih stimulasi agonis yang lain (b) dia akan kembali seperti respon semula. Tapi, kalo yang heterolog karena reseptor yang kena banyak, maka dikasih stimulasi agonis b,c,d juga ga akan balik ke respon semula. Hal ini dikarenakan reseptor yang satu mungkin bisa kembali, tapi kalo reseptor yang lain ngga ya sama juga boong. Lah kerjanya juga bareng-bareng. Hehehe.. Nah terakhir ne.. **PENYAKIT KARENA MALFUNGSI RESEPTOR**

Sindrom feminisasi testis, karena kekurangan reseptor ANDROGEN

Myasthenia gravis, yaitu deplesi autoimun gara-gara reseptor cholinergic nicotinic

Insulin-resistant DM, yaitu deplesi autoimun karena reseptor insulin

Multiple endocrine disorder, karena defisiensi dari Gs (heterogen)

Malignancy, aberasi reseptor yang bersifat onkogen

Page 5: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

5 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Retinitis pigmentosa, precocious puberty, dan malignant hipertiroidisme yaitu mutasi reseptor yang memicu aktivasi dari kompleks protein G

(Hafalin ya temandz, yang sabar ngafalinnya biar apal.. hehehe.. semangaaaadz) Yang paling ujungz... **KERJA OBAT YANG TIDAK DI MEDIASI OLEH RESEPTOR**

(Jadi langsung tancep gas ngasih efek ke tubuh.) Ada macem-macem yaitu.

Kerjanya Berikatan dengan molekul lain atau ion, contohnya antasida (obat maag)

Efek koligatif, contohnya mannitol (obat sembelit)

Yang memiliki struktur analog dengan molekul kimia biologis, contohnya beberapa agen antiviral dan antikanker (jadi salah kenal gitu virus nya.. hhehe)

Desinfektan, detergen, alkohol yang LANGSUNG merusak membran tanpa pamrih.. hehehe

Baiklah, mungkin itu dulu.. sebenarnya ini ada di buku rujukan farmakologi bab yang depan-depan kayak: Farmakologi FKUI (yang hejo), Katzung, Goodman-Gilman, dan laen-laen.. Sory ya kalo mirip banget ma slide, hehehe.. Met belajar guyz.. GBU!!!

- MUTASI GENETIK -

PROLOG

DNA merupakan informasi genetik yang berupa molekul asam nukleat.

Gen merupakan DNA yang diekspresikan menjadi protein

DNA yang tidak diekspresikan berfungsi hanya sebagai pembentuk struktur dan juga fragmen perantara antara satu gen dengan gen lainnya (disebut juga junk DNA). Namun, di dalam organisme prokariot, terutama bakteri, DNA yang terdapat di dalam bakteri hampir semuanya diekspresikan.

Basa nitrogen selalu berpasangan pada rantai DNA double helix dengan komplemennya. Yakni Adenin dengan Timin, serta Citosin dengan Guanin.

Mutasi adalah perubahan pada materi genetik (DNA) yang dapat diturunkan.

Mutasi mengacu pada : 1. Perubahan materi genetik, 2. Proses perubahan materi genetik tersebut.

TIdak semua mutasi itu negatif, contoh : evolusi → tanpa adanya mutasi, evolusi tidak akan terjadi → makhluk hidup tidak dapat beradaptasi dengan membentuk alel.

Mutan → Organisme yang mengalami mutasi → akan membentuk fenotip dan genotip baru.

Mutasi dapat terjadi pada sel apapun dan kapanpun ketika perkembangan dari organisme multiseluler. Mutasi dapat terjadi pada 2 jenis sel:

1. Germinal mutation → terjadi pada sel sperma dan sel telur, akibatnya akan diteruskan ke keturunan selanjutnya

2. Somatic mutation → terjadi pada seluruh sel tubuh kecuali sel sperma dan ovum, dan pada mutasi ini tidak akan diturunkan pada keturunan berikutnya

Mutasi dapat terjadi dalam skala kecil → hanya satu molekul DNA yang berubah (point mutation), hingga terjadi dalam skala besar → hingga satu kromosom yang berubah.

Jenis-jenis mutasi titik (point mutation):

1. Substitusi → satu nukleotida digantikan oleh nukleotida lain, contoh : tautomeri 2. Delesi → hilangnya nukleotida, bisa satu pasang saja atau satu fragmen besar,

misalnya disebabkan oleh radiasi sinar-sinar radioaktif 3. Insersi → masuknya satu atau lebih nukleotida ke dalam sekuens DNA

Delesi dan insersi dari satu atau dua pasang basa pada sebuah gen dapat

menyebabkan perubahan pada pembacaan kodon → pembacaan kodon menjadi bergeser, sehingga dapat terjadi perubahan asam amino yang dikode pada proses translasi. Mutasi semacam ini disebut frameshift mutation.

(perhatikan pada pembacaan kodon ketiga dst pada gen yang wild-type (normal) dan pada gen yang mutant, terjadi perubahan pengkodean asam amino akibat insersi C-G)

Page 6: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

6 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Mutasi yang terjadi pada gen normal sehingga menghasilkan fenotip yang mutan → disebut forward mutation.

Sementara itu, ketika terjadi mutasi kedua yang menyebabkan fenotip kembali menjadi normal (original), maka mutasi tersebut disebut reverse mutation. → biasanya terjadi pada organisme yang mudah mengalami mutasi, ex. bakteri. Reverse mutation dapat terjadi melalui 2 cara :

1. Back mutation → mutasi kedua terjadi pada tempat yang sama dari mutasi yang pertama sehingga fenotip yang dihasilkan kembali normal

2. Suppressor mutation → mutasi kedua terjadi pada lokasi yang berbeda, tapi akibat dari mutasi kedua tersebut meniadakan (menekan = suppress) efek dari mutasi yang pertama.

Mutasi titik yang menyebabkan perubahan pasangan nukleotida pada gen, yang

pada akhirnya mengakibatkan perubahan pada asam amino yang dikode, disebut juga missense mutation.

Sementara itu, apabila mutasi titik yang menyebabkan perubahan pasangan nukleotida pada gen, tetapi pada akhirnya tidak menyebabkan perubahan asam amino yang dikode (hal ini disebabkan karena terdapat asam amino yang dikode oleh beberapa kodon) disebut juga silent mutation.

Jika point mutation yang terjadi menyebabkan terciptanya stop kodon (UAG, UGA, atau UAA), disebut juga nonsense mutation.

Akan tetapi, ada mutasi yang terjadi tetapi tidak menimbulkan efek pada fenotip (jadi kayak mutasinya itu gak ngaruh), oleh karena itu disebut sebagai neutral mutation. Hal ini terjadi misalnya pada mutasi pada DNA yang bukan gen → junk DNA.

Namun, kebanyakan mutasi yang terjadi menyebabkan perubahan fenotip. Dan perubahan fenotip ini adalah akibat dari tidak adanya protein yang terbentuk atau aktivitas protein yang terbentuk itu berkurang akibat terjadinya mutasi.

Alel resesif yang mutan seringkali menyebabkan gangguan metabolisme. Contoh :

ada 5 gangguan/penyakit yang disebabkan oleh mutasi autosomal resesif sehingga tidak dihasilkan enzim yang berperan dalam metabolisme, akibatnya adalah adanya gangguan pada metabolisme phenylalanine-tyrosin, yakni :

Phenylketonuria (tidak adanya enzim phenylalanine hydroxylase) Tyrosinosis (tidak adanya enzim tyrosine transaminase) Tyrosinemia (tidak adanya enzim p-hydroxyphenylpyruvic acid oxidase) Alkaptonuria (tidak adanya enzim homogentisic acid oxidase) Albinism (ada dua kemungkinan penyebab, defek pada enzim tyrosinase atau

gangguan pada perubahan 3,4 dihydroxyphenylalanine menjadi pigmen melanin)

*Untuk lebih mudah memahami, sebaiknya lihat bagan yang ada di slide*

Berdasarkan penyebab terjadinya mutasi, ada 2 jenis mutasi: Mutasi spontan (spontaneous mutation)

Terjadinya tanpa diketahui penyebabnya. Pada eukariot, mutasi ini dapat terjadi dengan perbandingan 1: 10juta hingga 1: 1 milyar. (artinya : dari setiap 10 juta hingga 1 milyar pasang nukleotida yang terdapat di DNA, dapat terjadi mutasi pada 1 pasang nukleotida). Sementara pada DNA yang merupakan gen, mutasinya terjadi dengan perbandingan 1: 10ribu hingga 1:10juta. kesimpulan : pada SELURUH DNA, perbandingan mutasi 1: 10 juta hingga

1: 10 milyar, sementara pada DNA yang merupakan Gen, perbandingan 1: 10ribu hingga 1:10 juta). Jadi kemungkinan mutasi pada DNA yang merupakan Gen lebih tinggi daripada seluruh DNA. Contoh : Orangtuanya normal, tapi tiba-tiba ketika punya anak, anaknya mengidap sickle cell anemia.

Induced mutation Dihasilkan karena tereksposenya organism ke agen fisik dan kimia (physical and chemical agent) → disebut mutagen.

Mutagenic Agent, ada 3: 1. Chemical Agents (note : struktur kimianya bisa dilihat di slide) :

Alkylating agent → mentransfer gugus alkil (CH3-, CH3CH2-, etc) ke basa DNA Contoh : Mustard Gas [Di-(2-chloroethyl) sulfide]

EMS (Ethyl methane sulfonate)

Basa Analog → analog dari suatu basa nitrogen, memiliki struktur yang mirip dengan basa nitrogen normal dan masuk ke dalam DNA selama replikasi. Contoh : 5-Bromouracil (BU) 2-Aminopurin (2-AP)

Deaminating Agent → mendeaminasi (menghilangkan gugus amino) pada basa nitrogen. Contoh : Nitrous Acid (HNO2)

Hydroxylating agent → menghidrolasi gugus amino pada basa nitrogen. Akibatnya, dapat terjadi mutasi transisi (mutasi titik yang menyebabkan nukleotida purin menjadi purin lainnya (A→G, vice versa) atau pirimidin menjadi pirimidin lainnya). Contoh : hydroxylamine.

Acridine dyes → menginterkalasi (masuk) pada celah DNA (groove), sehingga rigiditas dari DNA bertambah → mengubah konformasi DNA yang double helix menjadi abnormal. Contoh : Prolavin, Acridine orange. *keduanya merupakan zat pewarna pakaian.

Page 7: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

7 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

2. Physical Agent

Ionizing radiation = sinar berenergi tinggi → menyebabkan elektron lepas → menyebabkan free radical ion. Sinar tersebut menyebabkan perubahan yang sangat besar pada kromosom. Contoh : X-rays, gamma rays, dan cosmic rays.

Non-ionizing radiation → energinya lebih rendah dibanding ionizing radiation → penetrasinya hanya pada lapisan permukaan pada sel→ tidak menyebabkan ionisasi. Contoh : Sinar UV → menyebabkan pyrimidine hydrate dan pyrimidine dimer.

3. Transposable Genetic Material

(transposons) Elemen dari gen itu sendiri yang dapat berpindah. Berasal dari kata (transposable = dapat berpindah). Pada sel eukariota, jarang ditemukan adanya transposons. Perpindahan akibat insersi dari transposon itu tentu saja akan menyebabkan gen tersebut menjadi tidak fungsional.

Faktor utama mengapa mutasi dapat terjadi : 1. Tingkat keakuratan dari proses replikasi DNA 2. Efisiensi dari mekanisme yang dapat memperbaiki kerusakan DNA (DNA Repair) 3. Tingkat keterpajanan terhadap mutagenic agent Mekanisme dari mutasi : 1. Tautomerisasi pada proses Replikasi DNA

Tautomerisasi adalah proses dimana terjadinya perpindahan atom hidrogen dari satu posisi ke posisi lain pada basa purin atau pirimidin. Hal ini mungkin disebabkan karena adanya sinar yang menyebabkan atom hidrogen “loncat”. Mutasi yang disebabkan karena tautomerisasi :

Mutasi transisi : penggantian purin menjadi purin lainnya (contoh : G menjadi A) atau pirimidin menjadi pirimidin lainnya.

Mutasi transversi : penggantian purin menjadi pirimidin lainnya dan sebaliknya.

Pada pirimidin, perpindahan atom hidrogen terjadi pada atom karbon nomer 3 ke atom karbon nomer 4. Sementara pada purin, perpindahan atom hidrogen terjadi pada atom karbon 1 dan 6. Perpindahan atom karbon ini menyebabkan potensi mereka untuk berikatan dengan basa nitrogen pasangannya berubah. Contoh : Seharusnya dalam keadaan normal, yang terjadi adalah ikatan antara Adenin dan Timin. Namun, karena terjadi tautomerisasi, yang terjadi adalah ikatan antara Adenin dan Citosin. Hal ini disebabkan karena perpindahan atom

hidrogen tersebut merubah konformasi dari Citosin yang dalam keadaan normal adalah amino form, menjadi imino form. Citosin dengan bentuk amino form berpotensi untuk berikatan dengan Guanin, sementara Citosin dengan bentuk imino form berpotensi untuk berikatan dengan Adenin.

* Untuk lebih mudah memahami, sebaiknya lihat gambar yang ada di slide*

2. Kegagalan dalam proses repair DNA. Mekanisme dari DNA repair diklasifikasikan menjadi : 1. Excision (memotong) repair:

Terdiri dari 3 tahap : a. DNA glycosilase enzyme mengenali bagian DNA yang mengalami

mutasi kemudian memotongnya. b. DNA polymerase mengisi nukleotida yang hilang dengan nukleotida

yang sesuai karena dipotong. c. DNA ligase menyambungkan potongan tadi sehingga untaian DNA

menjadi seperti semula Apabila terjadi kegagalan dalam proses repair ini, maka dapat terjadi mutasi yang permanen.

2. Light-dependent repair (photoreactivation)

Page 8: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

8 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Proses repair yang dibantu oleh adanya sinar. Hanya terjadi di prokariota, pada organisme tingkat tinggi seperti manusia jarang atau hampir tidak pernah terjadi. Enzim yang berperan adalah DNA photolyase. Contoh : prokariota sangat sensitive terhadap sinar UV → menyebabkan timin menjadi dimer → DNA photolyase mengenali dan memisahkan timin dimer sehingga molekul timin-timin tersebut dapat berpisah kembali. Enzim ini aktif karena adanya sinar.

Penyakit-penyakit heritable yang disebabkan karena adanya mutasi DNA :

Sickle Cell Anemia Ditemukan pertama kali oleh Pauling et al. (1949). Penyakit ini merupakan pencetus istilah “molecular disease”. Pada penyakit ini terjadi substitusi nukleotida A menjadi C → asam amino glutamat berubah menjadi valin → Hb A (normal) berubah menjadi Hb S (defective, gak normal).

Tay-Sachs disease Mutasi terjadi pada gen HEXA yang mengkode hexosamidase A untuk mengubah ganglioside GM2 into GM3 di dalam sel saraf. Jika tidak ada enzim tersebut, maka GM2 akan terakumulasi, padahal GM2 bersifat toksik pada sel saraf.

Penyakit-penyakit heritable yang disebabkan oleh defek pada proses perbaikan DNA:

Xeroderma Pigmentosum : penderita sangat sensitive terhadap sinar matahari. Disebabkan karena adanya defek pada proses perbaikan DNA akibat sinar UV.

Cockayne syndrome : Defek pada excision dalam DNA repair.

Mutasi adalah penyebab terjadinya polimorfisme. Polimorfisme itu sendiri adalah adanya dua atau lebih dari alternatif fenotip yang normal. Jadi misalnya, dalam golongan darah ABO, kita tau kan kalo golongan darah itu ada banyak. Namun, dari bermacam-macam golongan darah ABO tersebut,, semuanya normal.

Menurut para ahli genetika, disebut genetic polymorphism apabila frekuensi dari adanya 2 atau lebih alel dalam satu lokus lebih dari 1% di dalam populasi. Misalnya golongan darah ABO dan MN. Sementara itu, alel dengan frekuensi kurang dari 1% (misalnya Golongan darah O Bombay) disebut varian yang jarang (rare variant) → bukan disebut polimorfisme.

Polimorfisme merupakan penyebab banyaknya perbedaan yang normal pada populasi manusia seperti warna mata, warna rambut, dan golongan darah.

Meskipun polimorfisme tidak memiliki efek negatif pada kesehatan seseorang, beberapa variasi tersebut mungkin meningkatkan risiko terjadinya suatu penyakit atau kelainan.

Bentuk-bentuk dari polimorfisme: 1. Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

Polimorfisme pada DNA sequence yang berisi variasi dari basa nitrogen. Contoh missense mutation akibat substitusi nukleotida → sickle cell anemia.

2. Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) → disebut juga macrosatellites Suatu tipe dari DNA polimorfisme yang dihasilkan oleh adanya pengaturan besar tandem (perulangan dari fragmen DNA yang pendek, misalnya masing-masing fragmen terdiri dari sekitar 10 untaian nukleotida, kemudian fragmen tersebut diulang-ulang). Contoh: ada orang yang VNTRnya 6, ada yang VNTRnya 5, etc.

3. Microsatellites (Short Tandem Repeat Polymorphism (STRP))

Mirip VNTR, bedanya pada STRP nukleotida yang berulang hanya terdiri dari 2-6 nukleotida tiap fragmen yang berulang, sementara pada VNTR bisa sekitar 10-20 nukleotida tiap fragmen yang diulang. Setiap jumlah fragmen STRP yang berbeda terdapat dalam alel yang berbeda. Misalnya : seorang anak memiliki 2 alel STRP, salah satunya berisi 14 fragmen yang berulang dan alel satunya lagi berisi 10 fragmen yang berulang. *Lihat gambar di slide untuk memudahkan pemahaman* Penurunan dari VNTR dan STRP mengikuti hukum Mendel.

Sekitar 1 dari 1000 DNA dalam genom manusia termasuk polimorfisme genetik→ ada 3 juta SNP yang terdapat di dalam genom manusia. Dapat dilihat dari berbagai macam perbedaan dari produk-produk gen yaitu protein.

Penggunaan Polimorfisme :

Dalam forensik → mengidentifikasi individu

Dalam farmakogenetik → respon tubuh terhadap obat berbeda-beda tiap individu

Page 9: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

9 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Genetic relationship → molecular evolution → untuk melihat kekerabatan, apakah dekat atau tidak. Ex. suku batak ternyata dekat kekerabatannya dengan suku Toraja

Mutasi genetik atau polimorfisme dapat diketahui dengan beberapa cara:

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR – DNA Sequencing

Southern Blot

- GENE REARRANGEMENT -

1. DNA rearrangement = Perubahan struktur & komposisi gen pada khromosom

yang mengakibatkan pengaturan ulang urutan gen dalam genom (berbeda dengan rekombinasi DNA pada saat meiosis yang hanya mengalami pertukaran gen tapi tidak merubah urutan gen pada genom).

2. Rearrangement dapat terjadi pada virus, prokariota & eukariota untuk mengatur & mengontrol perubahan ekspresi gen pada tipe sel tertentu. Penemuan mengenai adanya gen yang mampu berpindah ke lokasi kromosom yang berbeda lalu mengubah ekspresi gen sekitarnya berasal dari ilmuwan yang tak asing bagi kita yaitu Barbara Mcclintock.

3. Rekombinasi DNA pada gene rearrangement melibatkan site-specific recombination yang ada pada sekuens DNA dari segmen (gen) yang mengalami rekombinasi. Interaksi DNA yang terlibat rekombinasi dimediasi oleh protein (enzim) yang mengenal sikuens spesifik pada DNA target.

4. Gene rearrangement pada prokariot

Tujuan : menghasilkan varian protein yang diperlukan untuk beradaptasi pada perubahan lingkungan, seperti resisten terhadap antibiotik dan penghindaran dari intervensi sistem imun host.

Rekombinasi DNA bakteriofag pada genom bakteri

Apabila bakteriofag menginfeksi E.

coli, DNA akan direplikasi untuk menghasilkan virion baru hingga sel lisis, atau terintegrasi ke genom bakteri

membentuk profag. Pada siklus tsb (lisogenik), profag akan ikut direplikasi didistribusikan ke sel baru generasi berikutnya. Pada kondisi tertentu, profag dapat dieksisi & direplikasi kembali membentuk virion baru.

Baik integrasi maupun eksisi DNA akan melibatkan site- specific recombination sequens pada virus dan sel host (bakteri). (gambar dapat dilihat di slide,,gak muat dimasukin di sini hehe).

Rekombinasi (rearrangement) bakteriofag DNA dan genom bakteri

dimediasi oleh protein bakteriofag disebut integrase (int). Protein integrase (enzim ini dikode oleh gen virus) mengenal site- specific recombination sequens pada virus (attP) dan sel host/bakteri (attB). Keduanya dipotong & diintegrasikan seperti gambar di samping.

Mekanisme rekombinasi yang lebih detail : attP (merah) dan attB (biru) Int awalnya mengikat attP, membentuk sebuah kompleks di mana DNA attP dibungkus oleh sekitar beberapa protein Int. Kemudian kompleks Int-attP mengikat attB, dengan menyelaraskan dari situs att fag bakteri yang homolog (1). Baik attP maupun attB akan mengalami pemotongan oleh int pada site tertentu (2). attP dan attB yang sudah terpotong pada urutan yang homolog kemudian mengalami pertukaran dan direkatkan oleh enzim ligase (3). Int protein juga berperan pada

eksisi profag yang prosesnya merupakan kebalikan dari proses integrasi. (materinya agak susah kalo ingin baca lebih lanjut

Page 10: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

10 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

kunjungi http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi? book=cooper&part= A828)

Transposisi gen / DNA Gen yang tidak akif (silent gene) diaktifkan dengan memindahkannya ke situs ekspresi yang akhirnya akan mengubah ekspresi gen sebelumnya. Gen yang mengalami transposisi disebut transposon. Transposisi melibatkan enzim transposase. Salah satu bentuk ekspresi gen yang dirubah oleh gene arrangement transposisi yaitu perubahan antigen permukaan (berupa komposisi protein pilin) oleh Neisseria gonorhoeae (bakteri penyebab kencing nanah) guna menghindar respon dari sIgA memori. Gambarnya ada di bawah tuuuh…

Inversi gen

Segmen DNA dipotong & disambung kembali dengan orientasi berbeda (terbalik) dari sebelumnya. Contohnya pada Campylobacter fetus (bakteri gram positif dan patogen pada sapi peternakan dan manusia). C.fetus mengekspresikan SLP (S-layer protein) di permukaan selnya SLP dapat bereaksi dengan c3b yang berperan dalam opsonisasi. Ternyata C.fetus dapat mengalami rearrangement pada SLP-nya dengan membentuk 6,2 kb invertible element sehingga SLP berubah dan tidak bereaksi dengan c3b -> terhindar dari fagositosis. (gambarnya juga ada di samping tuuh).

5. Gene arrangement pada eukariota

a. Pathological Gene Rearrangement Contohnya : gene arrangement pada gen bcr/abl karena translokasi khromosom 9 dan 22. Simbolnya yaitu t (9;22)(q34;q11). Pada kasus ini gen bcr pada khromosom 22 berekombinasi dengan gen abl pada khromosom 9 menghasilkan rekombinan bcr/abl. Rekombinan ini menimbulkan penyakit

chronic myeloblastic leukemia. Gambar nya tuuh

Page 11: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

11 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

b. Natural gene rearrangement

Terjadi pada reseptor antigen manusia : reseptor sel T (TCR) dan immunoglobulin. Mengapa? Karena bentuk gen Ig dan TCR itu ada dua :

Bentuk germline = gen nonfungsional pada presel T dan presel B. Bentuk rearrangement = gen fungsional pada sel T dan sel B yang telah

matur. Gen fungsional tsb berasal dari rekombinasi segmen gen somatik bentuk germline pada waktu diferensiasi sel T dan sel B.

Kenapa siih si gen Ig dan TCR butuh di “arrangement” supaya fungsional?? Jadi ceritanya gini kan jumlah antigen ada milyaran. Berarti kan butuh milyaran sel T dan B juga agar spesifik untuk tiap antigen. Sayangnya, total DNA genom kita aja cuman ada sekitar 3 milyar itu juga banyak yang non pengkode. Nah. Ternyata memang Tuhan tahu segalanya yaah..Tuhan mensiasatinya dengan melakukan rekombinasi gen – gen limfosit yang unik pada saat perkembangan sistem imun. Mau tahu gimana rekombinasinya?? Makanya jangan ngantuk dulu yaah..baru setengah jalan nhh semangat!!!..langsung ke nomor selanjutnya aja deeh..

6. Gene rearrangement pada TCR

TCR terdiri dari dua rantai polipeptida ( dan ) yang menembus membran plasma

dan terikat oleh ikatan sulfide. Rantai dan tersusun atas variable region dan constant region. Bagian variable berfungsi untuk antigen binding sedangkan constant untuk aktifitas biologis.

Gen yang mengkode dua polipeptida ini adalah rekombinasi antara V, J, C segments (rantai alfa) atau antara V, D, J, dan C segmen (rantai beta). (V= variable, D = diversity, J = joining, C = constant). Gen pengkode rantai alfa :

Gen pengkode rantai beta :

Page 12: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

12 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Bagaimana siiih gen2 ini menghasilkan bermilyar rantai polipeptida yang spesifik?? Mekanisme umumnya ditunjukkan oleh gambar di atas ini. Gambar ini adalah mekanisme umum pembentukan rantai TCR beta. Perbedaannya yang “atas” pake gen D2, J2, C2 sedangkan yang “bawah” pake gen D1, J1, C1. Jadi ngerti kan..tapi…Pertanyaannya kok bisa bermilyar2??pdhal di gambar ini ada dua aja variasinya. Sebentar..kan belum selesai ternyata V, D, J, C itu masing2 punya banyak ekson sehingga variasinya menjadi besar. Ingat prinsipnya hanya 1 ekson saja yang dipakai untuk DNA sel T yang matur . Lebih jelasnya ditunjukkan oleh table berikut.

Domain (exon) TCRa TCRb

Bentuk germline V 50 70 D -- 2 J 50 13 C 1 2

Bentuk rearrangement Kombinasi 2,5 X 103 3,6 X 103 Tambahan N-sequence 2,5 X 105 3,6 X 105

Diversitas TCR ab kombinasi

7. Gene rearrangement pada Ig (Immunoglobulin) Immunoglobulin tersusun atas 2 heavy

chains (H) dan 2 light chains (L dan L) yang terikat oleh ikatan disulfide. Keduanya terdiri atas region variable dan constant. Prinsip rekombinasi spesifik dalam pembentukan gen Ig pertama kali diungkapkan oleh Susumu Tonegawa. Gene rearrangement pada gen Ig dapat membentuk sekitar 10

12 Ig yang spesifik

untuk setiap antigen. Sama seperti TCR, gen yang menentukan kedua chain tsb adalah V,

D, J, dan C. Untuk L dan L dikode oleh region gen V, J, dan C sedangkan H ditambah region gen D.

Sekedar tambahan nihh saya kasih gambar mekanisme rearrangement light chain (1) dan heavy chain (2) :

Page 13: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

13 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Lagi – lagi seperti TCR,,alasan kenapa kombinasinya bentuk bisa banyak karena tiap region gen (V, D, J, C) punya hingga ratusan ekson (lebih hebat dari TCR hehe). Lebih jelasnya diuraikan oleh table di bawah ini.

Domain (exon) Rantai Lk Rantai Ll Rantai H

Bentuk Germline V 300 300 300 D -- -- 50 J 5 -- 8 C 1 5 9

Bentuk Rearrangement Kombinasi 1,5 X 103 1,5 X 103 11 X 104 Tambahan N-sequence 1,5 X 105 1,5 X 105 11 X 106

Diversitas Ig kombinasi

8. Mekanisme rekombinasi VDJ

Bagian ini beda dengan sebelumnya kalo tadi (TCR dan Ig) kan hanya mekanisme rearrangement secara umum untuk pembentukan gen fungsional keduanya sedangkan bagian ini akan menjelaskan bagaimana cara segmen VDJ itu saling “join” an yang nantinya akan membentuk gen fungsional. Pembahasan ini akan kembali ke prinsip awal kita dimana rearrangement melibatkan dua komponen

penting yaitu site specific recombination dan protein (hayo hayo masih ingat gak).Tambah penasaran..ayuuk lanjut bacanya. Ternyata segmen coding dari Ig dan TCR (V, D, J, dan C) diapit oleh dua recombination signal sequence (RSS) yang terletak dihulu & dihilir exon. RSS dikenali dan di eksisi oleh 2 protein kompleks RAG1 & RAG2. Setelah eksisi noncoding sequence antara dua segmen (misal V dan D), maka akan terjadi rekombinasi (rearrangement) antara kedua segmen yang akhirnya menghasilkan gen fungsional (Ig & TCR) yang sangat bervariasi. Gambarnya sebagai berikut.

9. Deteksi gene rearrangement TCR dan Ig

Prinsip deteksi ini dimulai karena ditemukan bahwa rearrangement gen TCR dan Ig merupakan penanda galur dan distribusi klon sel T dan sel B. Penanda galur maksudnya adalah tiap galur TCR dan Ig memiliki pola rearrangement yang khas sedangkan distribusi klon berarti anggota dari satu klon pasti mempunyai gambaran rearrangement yang sama. Cara deteksi rearrangement gen TCR dan Ig :

RFLP (determinasi fragmen restriksi pada blot Southern) Situs restriksi pada intron gen germline akan terinterupsi oleh rekombinasi segmen gen yang berpartisipasi/mengalami rearrangement sehingga komposisi fragmen restriksi akan berubah (berbeda dari bentuk germline). Akibatnya jika dilakukan Hibridisasi dengan DNA pelacak (probe) menyebabkan gambaran hibridisasi pada radioautogram blot Southern akan berubah dan berbeda dari gambaran germline.

Amplifikasi gen dengan PCR Menggunakan primer yang komplementer dengan intron segmen gen pasangannya. Akibatnya, rearrangement akan menyebabkan segmen gen yang berkombinasi tidak teramplifikasi. Oleh karena itu, dengan amplifikasi ini kita bisa tahu segmen ekson mana yang berkombinasi berdasarkan intron yang hilang tsb.

10. Rearrangement gen TCR dan Ig sebagai alat untuk memantau kelainan dan patologi limfoproliferasi

Page 14: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

14 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Leukemia limfositik dan limfoma Sel leukemia dan neoplasma limfoblastik berasal dari satu sel ansestor yang berproliferasi lebih agresif dari pada sel normal, membentuk satu klon dominan dalam sirkulasi atau kelenjar limfa. Oleh karena itu jika dilakukan analisa rearrangement pada limfosit yang diisolasi dari darah tepi atau kelenjar limfe maka akan menunjukkan ekspansi klonsel neoplasia limfositik / limfoblastik

Penyakit-penyakit autoimun Analisa limfosit yang diisolasi dari organ atau jaringan yang mengalami lesi karena reaksi autoimun, menunjukkan adanya proliferasi sel T monoclonal (stau jenis klon yang dominan) atau oligoklonal (beberapa jenis klon yang dominan) yang spesifik. - rhematoid arthritis (reaksi autoimun pd persendian) - autoimun chronic active hepatitis - psoriasis (lesi pada kulit, cth : dermatosis squamosa)

Penyakit-penyakit infeksi virus dan bakteri intraseluler Respon imun thd antigen virus menyebabkan proliferasi sel T spesifik dalam sirkulasi dan jaringan/organ target. Jika dilakukan analisa rearrangement pada limfosit dari sirkulasi/organ memperlihatkan ekspansi monoklonal atau oligoklonal sel T tertentu. Cth : pada penderita hepatitis, sel hati yang terinfeksi akan mengekspresikan antigen hepatitis lalu dikenali oleh sel T CD 8 yang akan merusak sel2 hati yang terinfeksi.

11. Sedikit data tambahan nhh teman2..btw kalo materi ini agak susah usahain jangan menghapal terus baca berulang2 ajah dan perhatikan gambarnya soalnya itu membantu sekali hehe,,sukses sumatif 2 yaaa… Table lokus gen yang mengkode polipeptida TCR dan Ig

Gen Lokus

TCR 14 q 4

7 q 32 – 35

7 p 15

14 q 4

Ig L 2

L 22

H 14 q 9

- DIAGNOSIS MOLEKULER DAN TERAPI GEN - Sebelum memasuki diagnosis molekuler dan terapi gen lebih jauh, teman-teman perlu mengetahui beberapa hal di bawah ini:

Replikasi Transkripsi Translasi Kodon

Sejarah Pada awal tahun 90an, implementasi dari biomol adalah sebagai alat diagnostik, baik untuk penyakit genetik maupun penyakit infeksi. Inilah yang kemudian mengarah ke suatu diagnosis yang dinamakan diagnosis molekular. Saat ini, diagnostik molekuler bisa diterapkan di berbagai kebutuhan medis, termasuk untuk mendeteksi malignansi, penyakit genetik, identity assignment, farmakogenetik, dan penyakit infeksi. Metode dan Spesimen Kelainan yang berhubungan dengan mutasi dapat dideteksi dengan metode:

PCR PCR-RFLP Oligo spesifik probe ARMS Real time PCR for quantitaion

Spesimen yang digunakan dapat berupa: Darah tepi/limfosit cord blood Vili choriales Cairan amnion Circulating Asam nukleat, etc.

Deteksi mutasi terjadi di berbagai level DNA pada penyakit genetik. Mutasi dapat terjadi belakangan setelah proses differensiasi sel. Untuk mendeteksi mutasi gen paternal, kita tidak harus mengambil sel sperma ayah, cukup diambil limfositnya. Untuk mendeteksi ada tidaknya gen yang bermutasi, diambil DNA nya karena gen yang ada di inti sel sama urutannya di semua jaringan. Sedangkan, RNA sudah merupakan hasil ekspresi dari gen. RNA di sel otot berbeda dengan RNA di sel saraf. Meskipun ditemukan adanya mutasi di DNA, tidak semua gen akan digunakan. Misalnya, sel darah merah tidak mensistesis imunoglobulin. Gen imunoglobulin ada, tetapi RNA nya tidak ada. Imunoglobulin diproduksi sel limfosit B. Klo mau lihat RNA nya, lihat sel limfosit B. Kalau sel T? tidak ada juga karena tidak diekspresikan.

Page 15: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

15 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Jadi, deteksi mutasi pada DNA menunjukkan bahwa mutasi itu ada. Tapi apakah akan diekspreskan? Lihat RNAnya! Circulating Asam Nukleat Merupakan asam nukleat DNA maupun RNA yang tidak berada di dalam sel (DNA radikal). Misalnya DNA dari sel kanker. Sel ini pertumbuhannya sangat cepat dan banyak pula yang mengalami kematian. Sel yang lisis akan mengeluarkan materi genetik ke bagian darah yang tidak mengandung sel. Darah terdiri dari sel dan cairan yang berupa plasma ataupun serum. Plasma masih mengandung faktor-faktor koagulasi. Ketika clotting, koagulasi memeras suatu cairan yang disebut serum. Dalam serum inilah terdapat circulating DNA. Beberapa hal yang dapat dideteksi: 1. Ca DNA bisa digunakan untuk mendeteksi:

Apakah ada mutasi onkogen yang memicu terjadinya kanker. Keberadaan asam nukleat virus. Di mana, beberapa jenis kanker terkait

dengan virus. Misalnya, HPV pada kanker serviks dan Absetrat(sp?) virus pada kanker nasofaring.

2. DNA fetus ada yang lolos ke sirkulasi ibu, meskipun jumlahnya sedikit. Untuk menghindari diagnosis prenatal yang melibatkan pengambilan plasenta yang “pake acara tusuk2 segala” dan beresiko, DNA fetal dapat diperoleh pada sirkulasi maternal/ibu untuk mendeteksi kelainan maternal:

Beta thalasemia Akondroplasia Hiperplasia adrenal congenital

Sayangnya, kebanyakan dari DNA di plasma sirkulasi maternal merupakan DNA ibu, sehingga tidak dapat dipastikan bila DNA yang diambil bersasal dari DNA fetal. DNA dari dari bayi, jumlahnya sangat sedikit, sehingga akan terencerkan dikalahkan oleh DNA ibu. Di samping itu, materi genetik fetal setengahnya berasal dari ibu. Meskipun hasilnya positif, bagaimana ketahuan ini memang dari bayi atau malah ibunya. Oleh sebab itu, cairan amnion untuk PND tetap digunakan. Penggunaan circulating DNA ini juga dapat mendeteksi kerusakan jaringan pada emboli paru (kerusakan jaringan paru), infark miokard(kerusakan jaringan otot jantung), stroke (kerusakan jaringan otak), dan transplantasi organ (kerusakan jaringan transplantasi). Caranya, dengan mengambil circulating Asam Nukleat di sirkulasi. Tapi, yang diambil RNA nya, bukan DNA nya. Sebelumnya, kita harus mengetahui RNA spesifik hasil ekspresi gen-gen oleh organ-organ tersebut.

Mt DNA DNA yang mengalami mutasi bisa berasal dari nukleus atau mitokondria. Karakteristik mtDNA:

Diturunkan secara maternal. Saat pembuahan, sitoplasma sel sperma tidak ikut masuk, melainkan hanya materi genetiknya saja. Interaksi hanya terjadi antara membran ovum dan membran sperma. Namun, kemungkinan ada kebocoran cairan sitoplasma ayah yang akan direduksi, termasuk mtDNAnya.

Jika satu pasang kromosom inti berasal satu dari ayah dan satu dari ibu, mt DNA memiliki banyak kopi dalam satu mitokondria, dan tidak sama satu dengan lainnya.

mtDNA tidak memiliki sistem repair seperti DNA inti sel. DNA inti jika mengalami mutasi/tidak normal sel itu akan masuk ke aptosis. Kalo mitosis gagal akan menghadapi sistem imun selnya akan dihancurkan/difagositosis. Kalau sistem imun kewalahan kanker. mtDNA memiliki rate of mutation yang tinggi.

mt DNA menggunakan istilah heteroplasmi dan homoplasmi. Homoplasmi terjadi bila dalam satu sel, mtDNA nya mengalami mutasi semua atau normal semua, sedangkan heteroplasmi berarti dalam 1 sel, mtDNA yang mengalami mutasi bisa ada beberapa, tetapi terdapat pula yang tidak. Dari 1 sel dengan komposisi tertentu, dapat berkembang menjadi sel dengan mtDNA bermutasi yang lebih banyak, dan sel dengan mutasi mtDNA yang justru sedikit.

Pada pembuahan, hasilnya pun bervariasi derajat penyakit yang berbeda. Misalnya sel ovum matang dengan komposisi: 80% mutan dibuahi sel sperma severe disease 50% mutan dibuahi sel sperma mild disease 20% mutan dibuahi sel sperma no disease

Kelainan pada mtDNA ada 2 macam, kelainan sel somatik dan sel germinal. Rate of mutation pada sel somatis dikaitkan dengan usia, proses menua, dan kejadian kanker. Kelainan yang berasal dari ovum/germline akan menimbulkan penyakit neurodegenartive dan myopati (kelainan otot dan saraf). Di Indonesia, sering ditemukan Leber’s Hereditary Optic Neuropathy (LHON). Kelainan ini pernah ditemukan di keluarga-keluarga di suatu desa di Bali. Diduga karena pernikahan antar keluarga dekat. LHON diakhiri dengan kebutaan. Kebutaan tidak terjadi mendadak dan gejala tidak ditemukan sejak lahir, bersifat progressif. MELAS (Myopathy Encelopathy Lactis Acidosis Stroke like episode ini seperti stroke dan terkait dengan metabolisme. Karena DNA bertugas memproduksi energi, melalui produksi molekul ATP. Penderita lama kelamaan akan mengalami kelumpuhan.

Aplikasi Diagnosis Molekuler Diagnosis molekuler dapat diaplikasikan untuk mendeteksi kelainan bawaan. Caranya bermacam-macam:

1. Diagnosis differensial

Page 16: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

16 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Contoh: Kelumpuhan terkait mutasi satu gen di kromosom X yang menyandi

protein distrofin Tidak berkembangnya otot (distrofi otit). Gejala klinisnya lumpuh biasa, tetapi tidak lumpuh total. Namun lumpuh dapat disebabkan oleh banyak hal, sehingg diperlukan deteksi untuk membedakan.

Retardasi mental terkait fragile X-syndrome. Kelainan kromosom X gampang patah. Manifestasinya dapat bergradasi dari ringan hingga severe.

2. Deteksi karir/pembawa sifat dalam keluarga Contoh:

Suatu penyakit Hiperplesia Adrenal Congenital yang disebabkan oleh defisiensi enzim hidroxylase 21. Produksi enzim tersebut berkurang sehingga menyebabkan gangguan berupa kehilangan garam pada awal kelahiran. Dapat dideteksi karier dalam keluarga.

Pada pathway pembentukan, diketahui enzim hydroxylase 21 berperan merubah konformasi kolesterol menjadi kortisol. Kolesterol juga merupakan asal pembentukan testosteron. Enzim yang tidak ada kortisol berkurang pengaturan keseimbangan elektrolit terganggu nenatus kehilangan garam fatal. Bila diketahui sebelumnya bayi akan menderita salt lost, dokter dapat mepersiapkan obat-obatan untuk membypass konversi konversi dari kolestorol kortisol.

Apabila jalur ini terhambat terbentuk jalur lain pada bayi wanita meningkatkan testosteron klitoris rusak ambigous genitalia/kebingungan terhadap jenis kelamin bayi diperlukan pemeriksaan kromosom.

Intermezo: Sehari-hari dokter kita berjuang menghadapi kasus demam berdarah, di mana masalah yang utama sebenarnya bukan penurunan trombosit (tidak bermasalah selama tidak terjadi perdarahan), melainkan bagaimana menyeimbangkan elektrolit di dalam sirkulasi

pasien makanya penggunaan infus sangat penting.

3. Deteksi kelainan genetik yang disebabkan oleh autosomal resesif di

populasi. Syaratnya, frekuensinya tinggi. Contoh: sistic fibrosis di populasi Kaukasia. Penyakit ini disebabkan mutasi gen yang menyandi Transmembrane Conductance Regulator yang

mengatur saluran klorida dari dalam dan keluar sel. Mutasi fungsinya terganggu terbentuk mukosa/lendir yang dibentuk di saluran napas kental menghambat jalan napas gampang terkena infeksi disebut juga sebagai infeksi sekunder karena ada pemicunya.

Di Indonesia Thallasemia frekuensinya sangat tinggi (14-15%). Kemungkinan 1 karier akan bertemu dengan karier lainnya sangat besar. Namun, mutasinya lebih dari 200an (sulit) deteksi di populasi tidak dilakukan, tapi deteksi carier di keluarga. Di populasi dapat dilakukan screening hematologi sel eritrosit yang ukurannya sangat kecil (tetapi dapat pula disebabkan defisiensi besi atau infeksi kronis). Jadi, untuk inherited disease harus dibuat dulu pedigree/riwayat family sebelum pemeriksaan untuk medeteksi apakah kelainan berupa maternal inherited (mtDNA atau X –linked) atau nuclear inherited.

4. Diagnosis prenatal (PND) sebelum kelahiran Tidak semua perlu didiagnosis prenatal, seperti PKU (kelainan metabolisme) karena dapat diobati. PND dapat dilakukan pada penyakit yang muncul gejalanya saat kanak-kanak, gejalanya berat dengan prognosis yang buruk dan tidak ada terapi yang efektif. Contoh:

Thalasemia Thalasemia sintesis hemoglobin berkurang anemia. Meskipun dapat ditransfusi, tetapi membawa masalah karena memasukkan darah orang lain ke resipien komplikasi, seperti penyakit infeksi akibat donor tidak diseleksi. Terkadang donor mendonorkan hepatitis, serta menyebabkan kelebihan besi yang harus dikeluarkan dengan bantuan obat. Jika tidak, akan menumpuk di organ-organ.

Thalasemia beta terkait globulin beta, gejalanya muncul saat 3 bulan. Thalasemia alfa terkait globulin alfa, gejala lansung muncul pada saat kelahiran. Globulin terdiri dari alfa dan beta. Hemoglobin orang dewasa terdiri dari 2 alfa dan 2 beta, serta delta dan gamma (HbA). Bayi yang baru lahir hanya terdiri dari 2 alfa dan 2 gamma (HbF). Perubahan dari gamma ke beta terjadi pada usia 3 bulan, tetapi beta dapat mengalami kerusakan. Kalau alfa hilang tidak terdapat hemoglobin mati sebelum kelahiran.

Page 17: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

17 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Gradasinya bermacam-macam ada 4 gen yang menyandi. Satu

mengalami kerusakan, masih ada 3 tidak masalah. Kalo 3, hilang

parah! kerusakan terjadi saat pembentukan janin. Pada beta, ada 2 gen yang menyandi. Salah satu gen mengalami kerusakan tidak bermasalah, kalau 2 berat. Tiap bulan harus ditransfusi, kalau bagus transfusinya, besi dihilangkan, screening donor dilakukan baik dapat bertahan hidup sampai dewasa. PND harus disertai genetic counseling untuk memberitahukan apa yang dilakukan dan apa yang akan terjadi.

Meskipun bayi meninggal dengan sendirinya dalam kandungan,

tetap perlu PND karena kerusakan bayi dalam kandungan ibu mengalami resiko perdarahan, ecamplasia.

5. Diagnosis presimptomatik. Misalnya kebutaan progressif yang dapat dideteksi sebelum mengalami kebutaan, seperti pada kelainan mtDNA. Syaratnya:

Untuk kelainan genetik yang manifestasinya ketika dewasa dipersiapkan dan gejalanya ditunda kemunculannya.

Mutasinya mutasi beta pada thalasemia bermacam-macam

mutasi di tiap etnik 1-5 macam yang dominan klinisi tinggal menanyakan asal suku pasien.

Koleksi data dikumpulkan 500 di tiap etnik untuk memperoleh peta

jenis mutasi dapat dilihat yang dominan yang mana. Jika tidak ketemu, dilihat mutasi kedua terbanyak. Bila tidak ketemu

mutasinya sama sekali dilakukan sekuensing dilihat semua

urutan nukleotidanya yang mana yang mengalami mutasi 2-3 minggu. Masalahnya, seringkali orang berkonsultasi ketika usia

kehamilan telah lanjut. Sebaiknya sedini mungkin terminasi lebih aman.

PCR Teknik untuk mengamplifikasi/memperbanyak DNA Contoh:

Kelainan dari rantai beta disebut sebagai Sickle cell disease karena eritrositnya seperti bulan sabit. Prevalensinya tinggi di populasi orang timur tengah.

Terjadi akibat mutasi salah satu basa N, dari Adenin menjadi Timin, sehingga triplet GAG yang menyandi glutamin GTG yang menyandi valin.

Bagaimana bisa diketahui seseorang memiliki gen HbS (Sickle) atau HbA (Normal)? Digunakan metode PCR RFLG.

Enzim Mst II akan memotong di A pada GAG HbA akan terpotong. A yang diubah menjadi T pada GTG HbS tidak terpotong. Caranya, dilakukan amplifikasi basa DNA dengan panjang 1,3 kB diinkubasi dengan enzim Mst II HbA akan terpotong menjadi 1,1 dan 0,2, sedangkan HbS tidak akan terpotong (tetap 1,3 kB) dielektroforesis dan dilihat pita-pitanya ditentukan sampel homozigot normal (HbA HbA), heterozigot (HbA HbS), atau homozigot mutan (HbS HbS). Dapat pula dengan manggunakan probe/pelacak. Satu probe untuk normal sekuens, sedangkan yang lain untuk mutan sequence dimasukkan ke dalam tabung tabung satu untuk mutant dan yang lain untuk normal. Kalau positif untuk tabung mutan saja berarti HbS, tabung normal HbA, dan untuk kedua tabung positif berarti heterozigot. Screening Pasca Kelahiran PKU (inborn errors metabolism) Mutasi gen yang mengkode enzim phenylalanine hidroxylase yang mengubah phenylalanine menjadi tirosin penumpukan penilalanin kerusakan sel otak mental retardasi. Dikoreksi dengan newborn screening/screening pas baru lahir dengan mengukur level phenylalanine dalam darah. Dihilangkan phenylalanine dari makanannya. Kita perlu segera mengetahui apakah anak ini menderita. New Born screening, Apakah kadar penilalanine yang di dalam meningkat atau tidak. TREATMENT KELAINAN GENETIK Konvensional (diutamakan)

Restriksi dietari/membatasi makanan Misalnya pada PKU dibatasi konsumsi makanan yang mengandung fenilanin.

Penggantian hormon Congenital Adrenal Hyperplasia diberikan hormon cortison Congenital Hypothyroidism diberikan hormon tiroksin

Penggantian protein Hemophilia A diberikan faktor VIII

Thalasemia diberikan transfusi darah Terapi obat

Hyperchlesterolemia diberikan antikolestelor. Menghindari obat tertentu

Defisiensi enzim G6PD di eritrosit yang disebabkan faktor pencetus (obat-obatan, seperti sulphonamide eritrosit akan lisis.

Page 18: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

18 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Terapi Gen Tujuannya untuk mengkoreksi defect genetik di DNA dan dipastikan harus diekspresikan. Terapi yang sukses baru cystic fibrosis.Caranya dengan memasukkan gen normal ke sel target yang tepat dan mempertahankan ekspresi optimal dari gen yang diperkenalkan memproduksi produk yang defisien pada pasien. Klasifikasi

Germ line: gen disisipkan di sel germinasi karena sifat-sifatnya dilanjutkan ke generasi berikutnya dilarang dalam konsensus internasional karena merupakan satu langkah untuk menciptakan manusia super.

Sel somatik: perubahan hanya pada sel somatis saja boleh dilakukan. Terapi Sel somatis Setelah dikoreksi, gen yang baru diperbanyak melalui kloning gen, kemudian dimasukkan ke sel target melalui dua cara, yaitu:

In vivo: disuntikkan ke pasien. Ex vivo: dimanipulasi di luar, kemudian dimasukkan lagi dengan harapan gen

akan memperbanyak diri di dalam tubuh. Namun, gen dapat hilang dalam 2-3 bulan karena tidak stabil. Untuk mendapatkan 1 gen terapi Memerlukan waktu yang lama untuk penemuan ini 20 -30 tahun. Aspek yang perlu diperhatikan:

Karakter gen Harus dipikirkan bagaimana gen tersebut berekspresi dalam keadaan normal, daerah yang mengontrol ekspresinya, promotornya, faktor yang menswitch on dan off. Jika ditaruh sembarangan tidak ada pengaruhnya harus diperbanyak dengan kloning 1 paket, tidak hanya gen tertentu, tetapi juga daerah yang mengontrol ekspresi gen tersebut.

Target Sel/pemicu atau gen organ harus diidentifikasi sel mana yang tepat dan mudah diakses oleh gen yang telah dibuat.

Vektor/ kendaraan; dibutuhkan trial dan error dengan tujuan untuk mamasukkan gen secara efisien dan aman. Salah satunya dengan liposom, yaitu dengan menggabungkan materi genetik yang digabungkan dengan suatu plasmid (liposom) disuntikkan invitro ke dalam sel materi genetiknya akan bergabung dengan materi genetik sel. Pada kenyataanya? Tidak mudah.

- REKAYASA GENETIKA - Defenisi Rekayasa genetik manipulasi DNA dengan menggunakan teknik DNA rekombinan. Teknik DNA rekombinan: DNA dipotong dipisahkan berdasarkan ukuran disekuensing untuk menentukan komposisi dan urutan nukleotidanya.

Tujuan

1. Isolasi gen tertentu, bagian dari gen atau daerah genomnya. 2. Menghasilkan RNA atau molekul protein yang diinginkan dalam jumlah

banyak. 3. Meningkatkan efisiensi dalam pembuatan enzim dan obat-obatan secara

komersil. 4. Memodifikasi organisme, sehingga dapat mengekspresikan suatu sifat baru

yang sebelumnya tidak dikode oleh gen. 5. Koreksi kelainan genetik di organisme, termasuk manusia.

Peralatan Peralatannya meliputi Polmerase Chain Reaction (PCR) memperbanyak DNA supaya dapat dianalisis, elektroforesis, etc. Teknik Rekayasa Genetik Struktur DNA (lihat tentir Asam Nukleat)

DNA merupakan polimer dari nukleotida yang terdiri dari gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa Nitrogen. Gula deoksiribosa terbentuk karena atom C no.2 pada gula ribosa kehilangan oksigen.

Basa N terdiri dari purin (adenin & guanin) dan pirimidin (cytosin & timin).

Basa N membentuk ikatan hidrogen dengan komplementernya, A x T dan G x C membentuk untai nukleotida yang anti paralel. Untai pertama tersusun oleh nukleotida dari arah 3’ ke 5’, sedangkan pasangannya terususun dari arah 5’ ke 3’. Struktur inilah yang membentuk double helix pada DNA.

Replikasi Semikonservatif (lihat tentir Replikasi-Transkripsi) Secara in vivo, terjadi replikasi dari arah 5’ ke 3’. Terbentuk dua untai yang disebut leading strand dan lagging strand. Lagging strand, untainya direplikasi terputus-putus, membentuk fragmen

yang disebut fragment okazaki.

Page 19: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

19 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

ssBP membant fiksasi untai DNA template yang telah terbuka mencegah kedua untai bersatu kembali.

Oleh karena itu, prinsip replikasi selalu diawali dengan membuka dsDNA ssDNA.

Prinsip ini dapat diterapkan dalam denaturasi DNA secara in vitro. Adonannya: ssDNA sbg template, topoisomerase, DNA polimerase III, etc. DNA terdenaturasi melalui pemanasan, memerlukan suhu yang sangat tinggi,

90-950 C.

Enzim Restriksi Endonuklease

Enzim dapat memotong DNA pada untai tertentu, memotong ikatan fosfodiester kedua untai.

Tempat pemotongannya (restriction site) dinamakan palindrom; prinsipnya seperti cermin, di mana untai 3’ ke 5’ menjadi cermin 5’ ke 3’. Ex: Pada untai 3’ ke 5’ terbentuk urutan G A A T T C, maka cerminnya adalah kebalikan dari urutan basa N tersebut, C T T A A G.

DNA yang kepotong bisa jadi berekor(sticky end) atau berujung rata (blunt end).

Untuk yang ujung rata kodenya CCCGGG yg berpasangan dengan GGGCCC. Kalo ekor, dipotong di urutan nukleotida G AATTC. Yang berekor ini lebih baik

digunakan karena ia membentuk lock and key dengan tempat pemotongan pada vektor, misalnya plasmid bakteri.

Potongan DNA ini disebut fragment restriksi. Bakteri memiliki kromosomal (mencapai Megabp) dan ekstrakromosomal

(kbp) yang disebut plasmid. Plasmid biasa digunakan untuk kloning karena dapat bereplikasi secara mandiri, dan banyak mengandung restriction site.

Bagaimana melakukan kloning DNA ke plasmid? diperlukan enzim ligase. Enzim Ligase

Ligase adalah enzim yang menautkan 2 fragmen DNA dengan menyambung ikatan gula- fosfat yang terpotong endonuklease.

Misalnya, insert (DNA yang akan diklon) memiliki situs potongan untuk Enzim EcoR1, vektor DNA (plasmid) juga harus punya samakan, kemudian dipotong membentuk sticky end. Dengan bantuan ligase, keduanya akan menyambung, dan terbentuk molekul rekombinan.

Suatu plasmid memiliki situs pemotongan untuk enzim Alu I dan Hind III. Dipilih enzim yang memotong sesuai keinginan, jangan sampai motong di sembarang tempat.

Tidak ketemu juga? Direkayasakan dengan PCR, daerah tersebut diamplifikasi, primernya disisipi dengan daerah yang bisa dikenali, sehingga amplifikasi bisa dilakukan dengan enzim yang tadinya tidak bisa digunakan.

Tidak semua mikroorganisme memiliki DNA, ada virus yang materi genetiknya RNA. Dalam kloning, kita akan menggunakan materi genetik yang berupa DNA. Bagaimana dengan virus RNA? Enzim Reverse Transkriptase Digunakan reverse transkiptase. Enzim ini bertolakbelakang dengan dogma sentral: DNA RNA protein.

Dahulu, orang berpikir, enzim tidak bisa balik. Tidak bisa menjadi RNA lagi karena mengalami processing, sehingga gen manusia jika diamplifikasi akan sukar karena memiliki ekson dan intron yang tidak mengkode gen. Klon DNA yang gennya dibatasi oleh intron, jika dimasukkan ke dalam PCR, daerah intronnya yang tidak dibutuhkan akan ikut teramplifikasi.

RNA ternyata dapat diranskripsi balik menjadi DNA. Dengan reverse dari RNA yang hanya mengandung exon (intronnya telah dibuang melalui splicing) diperoleh DNA.

Caranya? Template berupa RNA yang memiliki ekor yang kaya akan polinukleotida A (AAAA) di ujung 3’. DNA primer berisi oligo dT (TTTT) akan berikatan dengan ekor RNA sebagai pasangan poli A, lalu dielongasi dari arah 5’ ke 3’ dengan reverse transkriptase. Terbentulah cDNA, komplementernya.

Setelah selesai, cDNA akan menjadi template untuk replikasi pasangannya terbentuklah cDNA untai ganda diperbanyak dengan PCR, lalu dipotong dengan retriksi endonuklease diklon.

Bagaimana kita mengetahui klon telah berhasil atau tidak? Genome dan Analisis Protein Untuk mengetahui keberhasilan kloning, digunakan jel elektroforesis dengan menggunakan jel agarosa atau poliakrimilamida.

Page 20: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

20 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Diagar, lalu dibuat cetakannya, kemudian diberkukan cetakan sumur diberikan DNA hasil amplifikasi.

DNA bermuatan negatif karena gugus fosfat DNA akan berjalan ke kutub positif.

Hasilnya berupa separasi DNA berdasarkan berat molekulnya. DNA juga akan terpisah sesuai berat molekulnya.

Misalnya 500 kb akan berbeda dengan 300 kb. Yang paling jauh adalah 300 karena lebih kecil, sehingga lebih mudah melewati pori-pori.

Pengecekan dapat menggunakan marker. Jika 300 yang kita amplifikasi, garis visualisasi yang terbentuk pada agar akan berada di sekitar daerah 300 pada marker. Marker adalah DNA yang dipotong-potong pada daerah tertentu yang berfungsi seperti skala dengan ukuran tertentu.

Ex: Hasil elektroforesis DNA Lambda yang dipotong pake EcoRI. DI sini bisa dilihat, ada berbagi macam ukuran dari potongan EcoRI. Setelah dielektroforesis, DNA yg terdiri dari 21.2 kb (paling gede) akan berada paling jauh dari kutub positif dan garisnya kelihatan tebal. Klo yg 3,6 kb paling dekat ke kutub positif. Menunjukkan semakin kecil BM semakin cepat migrasinya ke kutub yg berlawanan. Yg gede, yah harus jalan lambat karena kegedean. Meskipun kesannya the biggest loser, to be honest, big means beautiful! :D

Hibridasi Asam Nukleat dan Pelacak (Probe) Produk yang diinginkan bisa dideteksi atau dilacak denga probe. DNA ketika didenaturasi akan menjadi ssDNA, jika didinginkan akan terjadi

renaturasi menjadi dsDNA. Dua untai asam nukleat dengan urutan basa yang saling berkomplementer,

dapat bergabung satu sama lain. Gabungan ini dapat berupa DNA-DNA, DNA-RNA, dan RNA-RNA. Sifat ini digunakan untuk merancang oligonukleotida yang mengenali fragmen/sekuens DNA tertentu yang ingin dicari dengan pelacak/probe. Supaya bisa dilihat, probenya dilabel dengan radioaktif atau enzim. Teknik mendeteksi asam nukleat tertentu dengan probe RNA atau DNA inilah yang disebut hibridisasi.

Radioaktif maupun enzim memiliki manfaat dan mudarat (kerugian) masing-masing. Radioaktif memiliki sensitifitas yang tinggi, apalagi pada DNA yang berukuran kecil, tetapi dapat berpotensi memancarkan radiasi, seperti neutron yag dapat masuk ke dalam kulit dan mematahkan DNA yang menyandi sel epidermis. Akibatnya, kulit terbuka, sehingga harus dirawat di ruang steril.

Enzim kurang sensitif, tetapi resikonya jauh lebih kecil dibanding radioaktif, sehingga tidak diperlukan peralatan mahal seperti antiradioaktif.

Mekanisme blot: Sampel dilarikan pada elektroforesis jel agarosa blot ke membran hibridisasi dengan pelacak berlabel visualisasi. Terdapat Southern Blot untuk sampel DNA dan Northern blot untuk sampel RNA. Di samping itu, adapula hibridasisi balik tanpa label radioaktif. Hasilnya nanti dianalisis.

Hasil analisis dapat dihasilkan gambar yang menyerupai titik2 hitam yang banyak, digunakan untuk mengetahui dan membedakan strain dari suatu mikroorganisme penyebab infeksi suatu penyakit.

Ex: dalam suatu keluarga yang terkena TB, apakah penularan pada anak disebabkan oleh penularan dari ayah. Atau ketika seseorang menderita suatu penyakit enam bulan lalu. Ingin diketahui apa ia sembuh dan terapinya berhasil. Pada pemeriksaan awal, dicek dan hasilnya dijadikan sebagai database untuk dibandingkan dengan pemeriksaan 6 bulan kemudian. Jika sama, pasien masih terinfeksi bakteri yang sama dan disimpulkan bahwa terapinya belum berhasil.

PCR PCR ibarat seperti pintu. Apakah mutasi ini dapat menyebabkan suatu penyakit itu hanya dapat dilakukan jika sampel diperbanyak hingga jutaan kopi.

Dulu ditaruh dalam wadah berbeda-beda. 30 siklus, berarti 2 pangkat 30. Hasil akhirnya berupa miliaran kopi. Hehe...

Memperbanyak DNA secara in vitro (di luar jaringan) Dibutuhkan primer, yaitu oligonukleotida sintetis yang dirancang untuk

mengenali bagian DNA yang akan diamplifikasi memungkinkan terjadinya polimerasi/ pemanjangan untai DNA. Diperlukan suhu tinggi untuk denaturasi DNA. Dibandingkan dengan probe, primer pada PCR harus memiliki syarat-syarat tertentu, yaitu memiliki panjang antara 21-23bp dan bisa melakukan annealing di suhu tertentu. Walaupun kita sudah mendesign primer dengan bantuan komputer pada kenyataan, ketika pCR akan menghasilkan hasil yang negatif karena primer yang dipake tidak bisa nempel pada dna target.

Digunakan enzim DNA polimerase yang tahan pada suhu 95oC (misal enzim

taq polymerase dari Thermus aquaticus yang berasal dari kawah reaksi enzimatik dilakukan pada suhu ekstrem). Jadi, harus enzim yang tahan akan suhu yang panas karena enzim yang tidak tahan akan mengalami denaturasi.

Proses 1. Denaturasi: pemisahan untai ganda menjadi tunggal, terjadi pada suhu

90-950C

Page 21: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

21 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

2. Annealing/Priming: perlekatan primer pada ssDNA target; pada suhu 50-65

0C

3. Elongasi: reaksi polimerasi/pemanjangan rantai DNA; pada suhu 68-720C

Di sini juga dapat kita lihat betapa menguntungkannya PCR ini karena dengan 6 siklus saja, dapat dihasilkan 64 kopi DNA. 30 siklus milyaran kopi. Sekuensing DNA Dalam rekayasa genetik digunakan metode sekuensing untuk mengetahui urutan nukleotida pada Gen.

Metode sanger; di mana dua utas dsDNA yang tidak diketahui urutan basa N nya, akan didenaturasi membentuk ssDNA. Salah satu untai akan dijadikan template untuk sintesis untai pasangannya. Intinya, dengan mengetahui satu untai DNA, dapat diketahui untai lainnya karena saling berkomplementer.

ssDNA template kemudian ditambahkan banyak dNTP yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan DTTP.

Ditambahkan pula primer untuk memulai sintesis dan enzim DNA polimerase untuk sintesis pasangan ssDNA yang menjadi template.

Adonan ini kemudian diramu dan dibagi ke dalam empat tabung. Dengan demikian, setiap tabung memiliki ssDNA, dNTP yang kaya, serta enzim DNA polimerase yang sama rata.

Yang berbeda, tabung I diberi ddATP yang diberi label dengan warna merah, tabung II dengan dTTP (biru), tabung III dengan dCTP (hijau), serta tabung IV dengan dGTP (kuning). Molekul ddNTP ini berbeda dengan dNTP karena tidak memiliki molekul O pada karbon 3’ dari ribosa, sehingga pemanjangan rantai DNA terhenti bila rantai mengikat ddNTP spesifik di masing-masing tabung tersebut (ddATP, ddGTP, ddCTP, atau ddTTP) atau diterminasi.

Hasilnya, ketika terjadi elongasi primer, dNTP akan berkompetisi dengan ddNTP dalam berikatan dengan basa N pada ssDNA sebagai template.

Ex: Di ssDNA (template), sekuens basa N (setelah basa yang diduduki oleh primer) adalah GATCA. Pada tabung I yang berisi dATP dari dNTP dan ddATP sintesis akan berlangsung hingga mencapai posisi T, di mana dATP akan berkompetisi dengan ddATP untuk berikatan. Bila diduduki oleh dATP, sintesis tetap berlanjut. Bila tidak, ddATP yang mengikat, akan terjadi terminasi, sehingga sintesis berhenti, terbentuk fragmen, dengan ujung yang berwarna merah bila dianalisis.

Hasil akhirnya berupa fragmen-fragmen yang terpotong di daerah tertentu akibat terminasi dengan berat molekul yang berbeda-beda dielektroforesis, sehingga memberi warna yang berbeda. Hasilnya dapat dianalisis secara statistik. Komputer akan membaca urutan-urutan tersebut. Lihat yang mana yang paling atas.

Dulu, orang melakukannya dengan cara diekspos ke suatu film dan dibaca satu per satu. Sekarang, cukup disinari dan akan ditangkap oleh sensor dibaca, lalu disusun menjadi suatu grafik yang ditampilkan oleh layar komputer secara runut. Adakalanya antara basa N yang satu berhimpitan dengan yang lain, sehingga tinggal dibaca sinyal yang paling kuat.

Metode dalam Teknologi Rekombinan Kloning DNA Mekanisme:

1. Mengambil gen atau bagian dari gen yang diinginkan dari 1 organisme (donor).

2. Insersi gen yang diinginkan ke vektor (plasmid, virus, cosmid) 3. Memasukkan vektor yang telah mengandung insert DNA ke sel hospes yang

sesuai (cloning host), baik bakteri, jamur, ataupun sel mamalia. 4. Seleksi sel host yang berisi DNA yang diinginkan. 5. Konfirmasi dengan analisis DNA/protein.

Produknya macam-macam, bisa untuk memproduksi protein, menghasilkan tanaman transgenik bebas hama misalnya, ataupun sumber pembelajaran DNA. Sebagai tambahan, makhluk bernama E. coli ini teryata merupakan sel host dalam kloning yang paling digunakan secara massive untuk amplifikasi rekombinasi DNA. Selain itu, suatu penelitian menghasilkan pisang transgenik hasil klon DNA hepatitis yang dapat menginduksi imunitas terhadap hepatitis yang tadinya diinsersi ke suatu vektor, mis. plasmid. Pisang yang dihasilkan, jika dikonsumsi, dapat berperan sebagai vaksin hepatitis pada manusia. Sejarah Awal tahun 70an, Herbert Boyer, Stanley Cohen, Paul Berg dan co-workers memulai teknologi rekombinasi DNA dengan menyisipkan beberapa bagian DNA asing ke dalam

Page 22: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

22 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

sel host dan mengklon sel host tersebut untuk memproduksi kopi dari DNA yang disisipkan sebanyak mungkin. Saat ini, terdapat berbagai teknik, yaitu dengan menyisipkan DNA dari satu spesies (donor) ke spesies lain (resipien). Sel resipien kemudian akan bereplikasi, lalu memproduksi banyak kopi dari DNA rekombinan yang baru. Organisme yang mengandung fragmen DNA asing yang sengaja dibuat inilah yang disebut sebagai transgenik. Sifat-Sifat Penting Vektor untuk Kloning Gen

Punya oriC (origin of replication) supaya dapat berplikasi memperbanyak DNA. Plasmid adalah materi genetik yang dapat bereplikasi secara mandiri.

Dapat menerima DNA insert, kecil, dan tidak mudah terdegradasi. Mempunyai situs restriksi yang dapat digunakan untuk insersi/penyisipan gen

yang akan diklon. Membawa gen marker, misalnya membawa sifat resistensi antibiotika

digunakan untuk seleksi. Misalnya kita ingin melakukan kloning DNA ke plasmid pada sel bakteri. Bagaimana cara menyeleksi bakteri mana yang mengndung plasmid rekombinan tersebut? Caranya, diinsersi pula gen penyandi resistensi ampicilin dan tetracyclin. Kemudian, mediumnya diberi kedua antiobiotik tersebut. Bakteri yang dapat tumbuh pada media tersebut yang mengandung gen yang disisipkan. Tapi, harus dibuktikan lebih lanjut.

Selain sifat-sifat di atas, khusus untuk kloning yang bertujuan untuk ekspresi protein, sifat tambahannya adalah mempunyai promoter, untuk transkripsi dan ribosome binding sequence untuk translasi sebagai bagian dari ekspresi gen pada prokaryot, sedangkan pada mamalia memiliki fragment Kozak.

Jenis-Jenis Vektor Vektor yang digunakan untuk kloning gen antara lain:

Retrovirus Adenovirus Adeno-associated virus (AAV) Herpes simplex virus Rhinoviruses Human Immunodeficiency Virus (HIV) Plasmid of various types. Ex: plasmid pBR322 dan pUC; maksimal hingga 20

kb. Faga lambda Kosmid (hibrid plasmid dan faga lambda); maksimal sampai 50 kb.

Introduksi klon gen ke sel hospes

Sel hospes: Bakteri, sel mamalia, serangga, tanaman Syaratnya: tumbuh cepat, non-patogen, genomnya sudah dipetakan, dapat menerima vektor plasmid atau faga, mempertahankan gen asing selama multiplikasinya, serta mengekspresi dan mensekresi protein klon dalam jumlah besar. Metode

1. Transformasi DNA diambil langsung dari medium dan direkombinasikan ke genom sel kompeten, yaitu sel bakteri yang bisa mengambil DNA. DNA rekombinan diinsersi ke DNA sirkuler untai ganda pada salah satu untai saja (misalnya di luar), membentuk heteroduplex karena untai di dalam tidak mengalami rekombinasi. Kedua untai mengalami replikasi, sehingga bakteri yang dihasilkan ada yang mengandung gen insersi adapula yang tidak.

2. Transfeksi Prosesnya dilakukan dengan memperkenalkan materi asing pada sel

eukariotik. Transfeksi melibatkan pembukaan pori di membran plasma, sehingga materialnya bisa diambil. Materi genetik seperti supercoiled plasmid DNA dan siRNA, bahkan protein antibodi dapat ditransfeksikan. Metode ini sering diikuti dengan mencampur lipid kationik dengan material tertentu untuk memproduksi liposom yang akan berfusi ke membran plasma dan mendeposito isinya di dalam. Transfeksi sering digunakan untuk transfeksi yang berkaitan degnan sel mamalia, sedangkan pada bakteri dan terkadang, tumbuhan, jenis proses ini disebut transformasi.

Disebut juga transformasi untuk proses yang terjadi di bakteri dan tumbuhan. HeBS (HEPES buffered saline solution) yang mengandung ion fosfat dikombinasikan dengan larutan kalsium klorida yang mengandung DNA. Ketika keduanya digabungkan, presipitat dari kalsium fosfat akan terbentuk dan akan mengikat DNA untuk ditransfeksikan. Suspensi dari presipitat ini kemudian ditambahkan ke dalam sel untuk ditransfeksikan (biasanya berupa kultur yang tumbuh di lapisan tunggal). Lalu, dengan suatu proses yang belum diketahui, sel akan mengambil beberapa presipitat, sehingga kandungan DNA di dalamnya turut masuk. Caranya: elektroporasi, heat shock, lipofectamin dan fugene, serta senjata gen (DNA dipasangkan dengan partikel nano dari solid inert (emas), kemudian ditembakkan ke nukleus sel target.

3. Elektroporasi Untuk host yang punya dinding sel, digunakan enzim untuk mencerna dinding sel, menyisakan protoplasma. DNA asing dimasukkan melalui kanal yang terbuka akibat tegangan listrik yang diekspose ke protoplast. Sel yang udah ditransformasikan lalu dikultur dan dimedia yang menginduksi pembentukan

Page 23: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

23 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

dinding sel dan pertumbuhan menjadi organisme utuh. Sel hewan gampang karena tidak memiliki dinding sel.

4. Biolistik Dibombardir dengan proyektil mikroskopis (terbuat dari substansi inert, seperti emas) dan diselubungi DNA. Ditembakkan pada kecepatan tinggi ke dalam sel atau jaringan. Teknik ini menjanjikan untuk digunakan pada organisme yang masih hidup.

5. Transduksi Melalui infeksi virus dengan afinitas tertentu untuk tipe sel tertentu, sehingga dapat digunakan sebagai vektor jika diisi oleh DNA asing.

6. Mikroinjeksi Tujuannya untuk memperbaiki genetik disorder, supaya sel yang DNA nya mengalami kelainan bisa berubah dan mensubtitusi gen yang fungsional. Contohnya untuk menghasilkan hewan transgenik, DNA diinsersi ke zigot atau embryo awal dengan injeksi menggunakan pipet kecil/halus. Zigot/embrio yang sudah ditransformasikan lalu diimplantasi ke rahim ibu untuk pertumbuhan dan perkembangan.

Seleksi klon yang mengandung insert DNA yang dikehendaki Sel bakteri : Ampicilin Sel mamalia : Geniticin

DNA library berisi koleksi fragment klon terbatas yang berasal dari genom suatu organisme. Tujuannya untuk memiliki semacam database.

Genomic library adalah perpus yang isinya genom komplit, dalam bentuk fragment kecil DNA (oligonukleotida) yang merepresentasikan gen yang telah diketahui.

Bioinformatika cabang ilmu yang mengaplikasikan penggunaan komputer dalam analisa data genetik.

cDNA library adalah perpus yang berisikan cDNA yang direkonstruksi dengan reverse transkriptase dari beberapa mRNA organisme.

Konfirmasi Klon Untuk mengkonfirmasi klon dapat dilakukan:

Pemotongan dengan restriksi endonuklease Southern blot PCR Western blot protein

Langkah-langkahnya, yaitu: pertama, protein dengan komposisi yang berbeda-beda, dielektroforesis pada gel poliakrilamida. Hasilnya berupa

pemisahan molekul protein berdasarkan ukurannya. Lalu, blot protein/gel ke membran nitroselulosa. Adanya protein tertentu akan dikenali dengan antibodi spesifik. Antibodi sekunder berlabel radioaktif atau enzim. Kemudian dilakukan visualisasi.

Analis Ekspresi Protein dengan DNA mikroarray Contoh: Untuk mengetahui perbedaan ekspresi gen pada sel kanker dan sel normal Pada chip, direkatkan sejumlah probe oligonukleotida yang mengenali gen-gen yang akan diteliti. Sementara itu, dilakukan isolasi mRNA dengan enzim reverse transkriptase, dibuat cDNA dibuat pula label yang berbeda untuk sel kanker (merah) dan sel normal (hijau) Campurkan cDNA, hibridisasikan pada chip microarray yang telah disiapkan baca hasilnya. Mutagenesis dengan oligonukleotida sintetik DNA bakteri yang sirkuler dan beruntai ganda, terkadang ketika bereplikasi mengalami mutasi DNA. Misalnya basa G yang berpasangan dengan T (seharusnya yang berpasangan dengan T adalah basa C) ketika bereplikasi, terbentuk 2 DNA sirkuler yang mengandung mutan replikasi semakin sering. Hasilnya, terdapat DNA sirkuler yang mengandung mutan, ada pula yang tidak.

- ONKOGENESIS -

Onkogenesis adalah proses perkembangan sel-sel normal menjadi sel-sel tumor. Selama proses tersebut, terjadi perubahan seluler dan genetik secara permanen pembelahan tidak terkontrol. Tumor atau neoplasma adalah pertumbuhan yang berlebihan (abnormal) secara otonom dari sel atau jaringan. Jenis Tumor Berdasarkan sifat pertumbuhan, tumor dibagi menjadi 2 :

1. Tumor Jinak 2. Tumor Ganas

a. Karsinoma (epitelial) b. Sarkoma (mesenkimal) c. Karsinosarkoma (epitelial dan mesenkimal)

Page 24: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

24 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Tumor Jinak Tumor Ganas

Cara Pertumbuhan Ekspansif

Batas Tumor Jelas

Kecepatan Tumbuh Lambat

Diferensiasi Sel Baik

Inti Sel:

Bentuk

Mitosis

Normal/atipia ringan Sangat Jarang

Pleomorfik, hiperkhromatik, butir inti mencolok Sering

Nekrosis Jarang ditemukan Sering ditemukan

Penyebaran Tidak bermetastasis Umumnya bermetastasis

Teori Multistep Karsinoma Perubahan sel normal menjadi sel tumor ganas memiliki 3 tahap, yaitu :

1. Inisiasi Transformasi genetik oleh karsinogen (inisiator)

2. Promosi Perubahan lebih lanjut karena adanya promotor yang menyebakan proliferasi klonal pada sel-sel yang ditranformasi

3. Persistensi Terjadi bila proliferasi klonal dari sel tumor tidak lagi memerlukan initiator dan promotor sel tumor tumbuh secara otonom.

Mekanisme Genetik Onkogenesis 1. Ekspresi Telomerase

Telomer adalah suatu kompleks nukleuoprotein (untaian DNA khusus) pada ujung 3’ kromosom linear. Telomer terdiri dari sekuens basa (TTAGGG) berulang sepanjang 2-20kb. Pada sel normal, telomer tidak akan direplikasi sehingga menyebabkan pemendekan telomer sebanyak 50 – 200 bp setiap pembelahan. Hilangnya telomer hingga di bawah ambang batas dapat menginduksi senescence. Telomerase adalah suatu RNA-dependent DNA polimerase yang menggunakan komponen RNA nya sendiri sebagai template untuk elongasi ujung 3 pita DNA dengan cara mensintesis ulang basa telomer. Fungsi telomerase : menstabilkan panjang telomer, terlibat dalam proses pembelahan sel (diferensiasi, proliferasi, hambatan apoptosis, tumorigenesis.) , perbaikan DNA. Telomerase terdapat pada > 90 % sel tumor manusia, sel line, germ-line cells, dan stem cells.

2. Tumor Supresor Gen (TSG) TSG merupakan gen penghambat pertumbuhan dan merangsang diferensisasi sel. TSG adalah gen resesif. Inaktivasi TSG disebabkan oleh mutasi yang terjadi pada kedua alel. Mutasi protein inaktif kehilangan daya hambat. Mekanisme kerja TSG:

Gatekeeper Menekan proliferasi sel secara langsung. (Rb, p53)

Caretaker Mengatur integritas genom dengan memperbaiki DNA yang rusak. (BRCA1,2)

3. Onkogen Onkogen adalah gen yang menentukan sifat-sifat neoplastik tumor. Pembagian onkoprotein :

Faktor pertumbuhan (TGF¤,EGF)

Reseptor faktor pertumbuhan (c-erbB2)

Aktivitas terkait cyclic nucleotide

Aktivitas tirosin kinase

Nuclear-binding oncoprotein; pengaturan proliferasi seluler (c-myc,c-H-ras,)

Page 25: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

25 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Onkoprotein:

Abnormalitas ekspresi onkogen tumor (protein yang dibuat dapat berupa ):

Jumlah normal, molekul berbeda (ras mutan)

Jumlah berlebih, molekul normal (erb B1, erb B2, C myc ) 4. Pengatur Apoptosis Gen perangsang apoptosis adalah Bax, sedangkan gen penghambat apoptosis adalah bcl. Karsinogenesis Karsinogenesis adalah proses transformasi sel normal menjadi sel tumor karena adanya perubahan genetik yang permanen. Penyebaran tumor ganas :

1. Invasi (penyebaran lokal) Teradapat fase in situ dan fase invasi

2. Metastasis (penyebaran jauh)

Page 26: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

26 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Karsinogen Agen penyebab kanker :

1. Kimia (Hidrokarbon polisiklik, Metilkloranten, Nitrosamina, Asbestos) 2. Fisik (ultraviolet) 3. Biologik (HPV, EBV, virus hepatitis) 4. Ko karsinogen (hormonal, imunologik)

Pertumbuhan Masa Tumor Dipengaruhi oleh :

1. Kinetik pertumbuhan sel tumor Waktu dari satu sel yang mengalami transformasi membentuk masa tumor.

2. Angiogenesis tumor Pembuluh darah memberikan aliran darah nutrisi untuk sel tumor.

3. Progresi dan heterogenitas tumor Sel tumor mudah mutasi spontan dan kemungkinan klonal subklonal dengan sifat sedikit berbeda.

Grading dan Staging Tumor Ganas Latar belakang : tumor ganas apabila tidak diobati akan meningkat progresif. Tujuan :

1. Perencanaan pengobatan 2. Petunjuk prognosis 3. Pertukaran informasi antar pusat pengobatan kanker

Grading : Menentukan derajat keganasan dan keagresifan. Grading merupakan penilaian histologi yang mencakup jumlah mitosis, ukuran inti, dan derajat kesesuaian dengan jaringan normal. Kelemahan dari grading adalah hubungan gambaran histologi dengan sifat biologik tidak sempurna. Staging : Merupakan penilaian klinik berupa ukuran tumor primer dan luas penyebaran ke kelenjar getah bening (KGB) serta tempat yang jauh (metastatis). Pengobatan Kanker

1. Pembedahan 2. Radiasi 3. Kemoterapi 4. Imunoterapi 5. Targeted Terapi

- PATOGENESIS MOLEKULER INFEKSI -

Pada tahun 1890 Robert Koch mengemukakan sebuah postulat yang disebut dengan Postulat Koch. Isinya yaitu :

1. Mikroba harus ada dalam setiap kasus dari sebuah penyakit infeksi 2. Mikroba harus dapat diisolasi dari host dan dibiakkan di media kultur 3. Penyakit harus bisa di munculkan kembali ketika mikroba yang dikulturkan

tadi dimasukkan ke dalam host yang sesuai yang tidak menderita penyakit 4. Mikroba harus bisa diambil kembali dari host yang terinfeksi hasil eksperimen

Namun, postulat Koch memiliki pengecualian, yaitu :

1. Mikroba tidak selalu bisa dikulturkan di laboratorium. Hanya sekitar 30 % mikroorganisme yang bisa dikulturkan

2. Faktor imunologik dan genetik dari host memainkan peran yang besar 3. Pertimbangan etik mencegah penerapan Postulat Koch pada penyakit dan

pathogen yang terjadi pada manusia 4. Penyakit ada yang tidak muncul dalam waktu yang singkat.

Misalnya AIDS, gejalanya tidak muncul dalam waktu yang sebentar melainkan butuh waktu yang lama

Proses terjadinya infeksi bisa dimulai dari masuknya mikroorganisme ke dalam tubuh host. Setelah itu mikroorganisme tersebut melakukan kolonisasi, adesi atau penempelan, dan invasi. Selanjutnya akan menimbulkan reaksi yaitu sebuah penyakit di tubuh host. Ada sebagian mikroorganisme yang masuk ke tubuh host hanya melakukan kolonisasi, tidak melakukan invasi. Maka dalam hal ini pasien/host tersebut tidak akan sakit. Host hanya akan sakit jika mikroorganisme tersebut melakukan invasi. Adapun jalan masuk mikroorganisme ke dalam tubuh kita melalui beberapa pintu, yaitu :

1. Kulit, merupakan pintu masuk yang paling umum 2. Membran mukosa, memiliki sistem pertahanan yang lemah.

Antara lain : Saluran pernapasan, gastrointestinal atau saluran pencernaan, saluran urin, saluran reproduksi, konjungtiva, membran tipis yang melapisi permukaan bola mata, dan bagian bawah dari kelopak mata

3. Plasenta, ibu hamil dapat menularkannya ke anak yang dikandungnya 4. Rute parenteral, sebenarnya ini bukan pintu masuk. Seharusnya masuknya

mikroorganisme melalui jalan masuk ini bisa dielakkan. Misalnya : suntikan, pemasangan kateter

Kolonisasi Infeksi dari suatu organisme diawali dengan kolonisasi. Pada tahap kolonisasi ini, agen penginfeksi menduduki suatu wilayah infeksi dan mengambil nutrient atau makanan (siderophores). Organisme tersebut bisa mengatasi racun atau toksik yang mereka

Page 27: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

27 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

produksi sendiri. Organisme tersebut juga bisa melakukan perlawanan terhadap sistem pertahanan tubuh host yang dijangkitinya, misalnya dengan mengeluarkan IgA protease (semacam enzim untuk menghancurkan protein atibodi), sehingga antibodi menjadi tidak berperan.

Adesi/Pelekatan Merupakan suatu proses di mana mikroorganisme melekatkan diri ke sel. Faktor-faktor yang mendukung terjadinya adesi yang dilakukan oleh mikroorganisme :

1. Mikroorganisme memiliki struktur yang spesial untuk menempel Misalnya cakram pelekatan (pada Protozoa), pengisap, pengait (pada cacing).

2. Ligan, permukaannya disusun oleh lipoprotein dan glikoprotein (bakteri dan virus). Beberapa ligan yang mendukung adesi yaitu :

- Adhesin (pada bakteri), ditemukan di fimbriae, flagel, dan glikokalises

- Protein perlekatan (pada virus)

Mekanisme perlekatan :

a. b.

c.

faktor-faktor yang mendukung mekanisme perlekatan

Fili dan fimbriae merupakan media perlekatan

Fili terkadang bisa muncul dan bisa dihilangkan, hal ini akan membuat fili bisa terhindar dari fagositosis sistem imun tubuh

Protein Adhesin, misalnya pada Streptococcus pyogenes, adhesins nonfibrillar memediasi perlekatan bakteri dengan fibronektin. Fibronektin yaitu sebuah protein yang ditemukan di banyak permukaan sel host (banyak terdapat di reseptor)

Transduksi sinyal, yaitu sinyal yang mendorong pengaktivan atau menekan kemunculan dari ekspresi beberapa gen. Jadi pada miroorganisme bisa diekspresikan suatu gen yang membuat miroorganisme tersebut bisa melakukan perlawanan terhadap antibodi tubuh host

- Pengikatan adhesin dengan reseptor sel host bisa mengaktifkan atau menekan gen virulen dari sel bakteri

Suatu mikroorganisme bisa kehilangan kemampuan dalam membuat ligan. Hai ini dapat disebabkan oleh:

- Perubahan genetik atau mutasi

- Terkena bahan-bahan kimia atau fisika yang berbahaya karena mikroorganisme tersebut tidak memiliki kemampuan untuk membuat ligan, maka mereka tidak bisa menempel di reseptor sel host sehingga membuat mereka menjadi tidak berbahaya atau avirulen.

3. Beberapa bakteri yang patogen tidak menempel pada sel host secara

langsung, melainkan berinteraksi satu sama lain dengan membentuk jaring lengket yang berasal dari bakteri itu sendiri dan polisakarida yang dinamakan Biofilm, yang bisa menempel di permukaan sel host (misalnya : plak pada gigi). Biofilm ini bisa menyebabkan resistensi mikroorganisme terhadap anti mikroba.

Molekul reseptor yang ada di sel host biasanya berupa glikoprotein yang mengandung molekul gula seperti manosa dan galaktosa. Reseptor ini ada bukan untuk memberikan keuntungan pada agen penginfeksi, melainkan memiliki fungsi khusus dalam hidup sel tersebut.

Patogenitas = kemampuan suatu organisme untuk menyebabkan penyakit

Virulensi = derajat patogenitas

Kalau patogenitas tinggi, maka bisa dikatakan suatu mikroorganisme bersifat virulen

Faktor-faktor virulensi

Page 28: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

28 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Sesuatu yang mempengaruhi yang berhubungan dengan host dan kemampuan patogen untuk memasuki host, menempel pada sel host, mendapatkan akses untuk makanan, dan bisa tidak terlacak atau melawan sistem pertahanan tubuh host.

Faktor-faktor virulensi adalah:

- Enzim Ekstraseluler: 1. Hyaluronidase dan kolagenase yang menghancurkan molekul tertentu untuk

memudahkan bakteri untuk menginvasi jaringan yang lebih dalam 2. Koagulase, memberikan sebuah ‘tempat persembunyian’ untuk bakteri di

dalam selubung 3. Kinase, seperti staphylokinase dan streptokinase yang mencerna selbung

bakteri tadi sehingga bakteri bisa masuk ke dalam pembuluh darah

- Toksin: 1. Eksotoksin, toksin yang disekresikan oleh suatu mikroorganisme

Cytotoxins, membunuh sel host atau mempengaruhi fungsinya Neurotoxins, khususnya menyerang fungsi sel saraf Enterotoxins, menyerang sel-sel pada sluran pencernaan

2. Endotoksin, merupakan bagian dari tubuh mikroorganisme itu sendiri Lipid A, yaitu bagian dari lipid yang terdapat pada membran

lipopolisakarida suatu miroorganisme

- Faktor antifagositik: 1. Kapsul, yang tersusun atas zat-zat kimia yang secara normal ditemukan

dalam tubuh manusia (termasuk polisakarida) sehingga tidak memicu munculnya respon dari sistem imun tubuh sebab bakteri tersebut dikenali sebagai bagian dari tubuh, jadi bakteri tersebut bebas dari incaran fagositosis antibodi. Kapsul bakteri ini mencegah pengikatan yang dilakukan oleh C3.

2. Zat-zat kimiawi antifagosit, mencegah fusi antara lisosom dan vesikel fagosit sehingga memudahkan bakteri untuk bertahan hidup di dalam fagosit. Streptococcus pyogenes memproduksi protein di dinding selnya dan fimbrae (protein M), yang tahan terhadap fagositosis dan dengan demikian meningkatkan virulensinya.

- Faktor Invasi, yaitu mekanisme yang memudahkan bakteri untuk menginvasi sel eukariotik dan masuk ke permukaan mukosa. Beberapa bisa berupa patogen obligat intraseluler, dan sebagian besar ada yang patogen fakultatif intraseluler. Faktor yang memediasi bakteri untuk melakukan invasi belum diketahui saat ini.

- Siderophores Organisme membutuhkan zat besi untuk metabolisme dan pertumbuhan. Pada darah, besi ditemukan di Hemoglobin atau di cairan tubuh lainnya bisa ditemukan di air mata, air ludah, dsb. Besi diikat oleh laktoferin. Siderophores yaitu substansi yang diproduksi oleh banyak bakteri untuk menangkap besi yang dimiliki oleh host.

- Lipopolisakarida Adalah situs untuk menempelnya C3b, modifikasi dari lipopolisakarida mempengaruhi interaksi antara ikatan ini.

- Menghindari Respon Antibodi dari Host Yaitu dengan cara: 1. Mengubah permukaan antigen menjadi sesuatu yang dikenali oleh antibodi

sehingga antibodi tidak lagi mengikat antigen 2. Bersembunyi dari sistem imun dengan cara menutupi dirinya sendiri dengan

protein host misalnya dengan fibronektin.

Page 29: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

29 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Superantigen Biasanya antigen presenting cells (APCs) memproses protein antigen dengan cara memotong mereka menjadi peptida dan memunculkan salah satu hasil peptida tersebut ke dalam kompleks dengan MHC (Major Histocompatibility Complex) II di permukaan APC. Hanya sedikit sel T helper yang memiliki reseptor yang mengenali kompleks ini sehingga hanya sedikit sel T helper yang terstimulasi. Superantigen antara MHC II dari makrofag atau APCs lainnya dan reseptor di sel T saling berinteraksi. Banyak APCs yang akan memiliki ikatan molekul superantigen di permukaannya. Superantigen juga akan berikatan dengan reseptor sel T tanpa memilih-milih dan nantinya akan membentuk pasangan APC-T helper. Biasanya respon antigen yang normal yaitu APC menstimulasi 1 dari 10000 sel T. Namun pada superantigen, APC menstimulasi 1 dari 5 sel T. Hal ini menyebabkan peningkatan yang berkelebihan dari IL-2 yang dilepaskan ke aliran darah yang menimbulkan gejala mual, muntah dan demam. Produksi berlebihan dari sitokin lainnya dapat menimbulkan syok. Misalnya akibat racun Staphylococcal. Patogenenesis Penyakit yang disebabkan oleh Virus

- Memasuki sel host

- Melakukan kontak dan memasuki sel yang sesuai

- Bereplikasi di dalam sel

- Melepaskan diri dari sel host

- Interaksi antara virus dan host memicu respon imun sel host

- Virus bisa dimusnahkan dari tubuh, atau malah memperkuat infeksi, bahkan membunuh sel host

Virus bisa masuk ke dalam sel melalui permukaan tubuh, jarum suntik, transfusi darah, transplantasi organ, atau melalui vektor serangga. Adsorpsi adalah proses penetrasi ke dalam sel host untuk mendapatkan akses untuk mekanisme replikasi sel host. Adsorpsi terjadi karena adanya interaksi spesifik protein dan ligan. Virus yang memiliki envelop menggunakan spike (protein viral yang menonjol dari membrannya), sedangkan virus yang naked (telanjang) ligannya adalah protein kapsid. Banyak penyakit yang gejala klinisnya sama, namun ternyata virus penyebabnya berbeda, atau bisa juga Virus yang menyebabkan penyakitnya sama, namun gejala klinis yang muncul bervariasi. Tahap-tahap patogenesis dalam infeksi virus yaitu :

1. Virus memasuki host dan melakukan replikasi

Melalui port de entry, melakukan replikasi di situs port de entry, dan mengalami periode inkubasi

2. Virus dan tropisme menyebar di dalam host Bermacam-macam mekanisme penyebaran virus yaitu dengan sirkulasi darah, limpa, jaringan saraf, dan antara sel-sel. Penyebaran virus ini menuju ke sel yang sepesifik yang akan mereka infeksi. Faktor yang mempengaruhi tropisme yaitu reseptor yang spesifik dan ekspresi gen virus. Pengikatan virus dengan reseptornya di permukaan sel host yang kemudian menyebabkan penetrasi ke dalam sel dan pegiriman materi genetik virus ke sitoplasma sel. Asam nukleat memasuki sel host dengan cara :

- Masuk secara langsung, namun yang masuk hanya asam nukleat saja. Misalnya poliovirus

- Melakukan fusi antara envelop virus dengan membran sel kemudian virus menjadi tidak terselubung, misalnya pada virus influenza

- Melakukan endositosis dan melepaskan asam nukleat dari kapsid (yang tidak memiliki selubung), misalnya Poxvirus.

3. Sel dan jaringan rusak dan menimbulkan manifestasi klinis Kerusakan dapat bersifat lokal dan sistemik. Beberapa jaringan ada yang lebih tebal dari yang lain misalnya jaringan organ sistem pencernaan. Kerusakan dapat menimbulkan respons imun. Respon imun dapat berupa respon spesifik maupun yang nonspesifik. Disini dilibatkan imunitas humoral dan seluler. Yang dilakukan virus untuk mengatasi sistem imun yaitu:

- Menginfeksi sel sistem imun (ex: pada HIV)

- Menginfeksi sel-sel yang memproduksi non MHC I (ex: pada Herpes virus)

- Memproduksi protein imunomodulator untuk menghambat aktivitas MHC (ex: Adenovirus)

- Mutasi, sehingga antigen berubah (ex: virus influenza dan HIV)

- Merusak protein permukaan sel (ex: herpes virus) 4. Perubahan infeksi dan tipe infeksi 5. Penyebaran virus ke luar sel atau ke lingkungan luar tubuh host

Dua mekanisme pelepasan virus dari sel host yaitu:

- Virus dalam jumlah yang besar meninggalkan sel host dalam waktu yang sama dan menyebabkan sel mati atau lisis.

- Membentuk budding atau blebbing, yaitu bentuk baru dari nukleolapsid yang mendorong membran sel host. Kemudian sel yang menembus membran sel tersebut mengambil membran sel host untuk menjadi selubungnya yang akan menjadi envelop bagi virus tersebut. Proses ini berlangsung lebih lambat dari pada lisis.

Page 30: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

30 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Interaksi antara virus dan host

1. Cytophatic virus, langsung membunuh sel host dengan menyebabkan nekrosis lokal. Dapat memicu apoptosis atau kematian sel yang terprogram

2. Noncytophatic virus, tidak secara langsung menyebabkan sel mati namun menyebabkan infeksi yang parah. Virus yang produktif menghasilkan infeksi yang persisten dengan melepaskan sedikit partikel viral yang baru setiap waktu. Virus yang tidak produktif membuat virus tidak terdeteksi pada periode tertentu (masa laten).

EKSOTOKSIN

1. Tidak semua toksin yang dihasilkan oleh bakteri diperuntukkan kepada sel manusia. Misalnya toksin yang dihasilkan oleh Bacillus thuringiensis digunakan untuk insektisida.

2. Eksotoksin penting bagi bakteri untuk bertahan hidup dan berkembang biak. Eksotoksin dapat membunuh neutrofil dan makrofag, selain itu eksotoksin dapat melepaskan penyimpanan ion dan sumber karbon dari sel manusia. Penamaan dari eksotoksin tidak memiliki dasar sistematis yang jelas. Penamaannya bisa berdasarkan:

- Jenis sel host yang diserang. Misalnya: Cytotoxin, Neurotoxin, Leukotoxin, dan Hepatotoxin.

- Spesies bakteri yang memproduksinya. Misalnya Cholera, Shiga, Diphteria, Tetanus toxin

- Aktivitasnya, misalnya adenylate cyclase dan lechitinase

- Penandaan huruf, misalnya Exotoksin A dari Pseudomonas aeruginosa

- Beberapa toksin memiliki lebih dari satu nama, misalnya E.coli O157:H7: shiga toxin dan verotoxin

- Enterotoxin, protein toksin yang dapat menyebabkan diare dan muntah 3. Lokasi dari gen penghasil toksin berada di kromosom maupun plasmid dan di

phage. 4. Toksin diproduksi dalam bermacam-macam keadaan tergantung kebutuhan. Ada

yang diproduksi secara terus menerus oleh bakteri yang sedang tumbuh, saat sel memasuki fase stationary, atau pada waktu-waktu tertentu. Misalnya toksin diphteria diproduksi besar-besaran ketika bakteri diphteria kekurangan zat besi. Bakteri yang berspora kadang-kadang melepaskan racun selama fase spora, misalnya toksin botulinum dan toksin tetanus.

5. Stuktur eksotoksin berupa A-B toksin. Bagian dari toksin yang berikatan dengan reseptor sel host (B=binding) terpisah dengan bagian yang memediasi aktivitas enzimatik yang bertanggung jawab untuk toksik (A=active).

6. Bagian B berikatan secara spesifik dengan molekul di permukaan sel host yaitu protein dan karbohidrat di permukaan sel host, glikoprotein ataupun glikolipid. Bagian B ini mendeterminasi spesifisitas sel host terhadap toksin. Toksin dari bagian B yang mengikat glikoprotein yang ditemukan hanya di permukaan sel saraf maka toksin yang dihasilkan hanya spesifik untuk sel saraf saja walaupun bagian A dapat membunuh banyak jenis sel host jika ia bisa masuk ke dalam sel.

ENDOTOKSIN

Berupa lipopolisakarida (LPS) yang merupakan komponen dari membran terluar dari bakteri gram negatif. Endotoksin LPS terdiri dari O-Polisakarida dan Lipid A yang bertanggung jawab terhadap banyak aktivitas toksin. Lipid A mengelilingi membran terluar bakteri. Sedangkan LPS melalui situs pengikatannya berinteraksi dengan reseptor CD14 di monosit/makrofag/sel host lainnya misalnya endotelial.

- MEKANISME RESISTENSI TERHADAP ANTIBIOTIK, ANTIVIRAL, ANTIFUNGAL, DAN ANTIMIKROBIAL -

Resistensi antimikrobial yaitu kemampuan dari mikroba (bakteri, virus, parasit, atau

jamur) untuk tubuh di tengah-tengah kehadiran zat-zat kimia (obat-obatan) yang biasanya secara normal bisa membunuh mereka atau membatasi pertumbuhan mereka.

Tahapan dari resistensi yang terjadi pada mikroba tersebut yaitu exposure seleksi ekspansi

Page 31: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

31 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Bisa terjadi saat pemberian suatu antibiotik pada populasi yang sensitif, antibiotik tersebut bisa membunuh populasi mikroba yang tidak resisten, namun mikroba yang resisten tetap hidup dan bahkan mereka berkembangbiak menjadi banyak.

Agen antibacterial:

Red azo dye protosil : pada tahun 1935 dilakukan perlindungan dari tikus untuk melawan infeksi streptococcal sistemik, dilakukan perwatan terhadap pasien yang mengalami infeksi yang sama.

Kumpulan dari mikroorganisme yang menghalangi pertumbuhan mikroorganisme lainnya (antibiotik):

- Alexander Flemming menemukan antibiotik Penisilin yang mencegah pertumbuhan bakteri stapilokokus

- Pada tahun 1940 ditemukan Streptomisin

- Pada tahun 1950 ditemukan Tetrasiklins Agen antibacterial yang baru telah diperkenalkan dan secara terus menerus

diperbarui mengingat kemampuan bakteri untuk mengembangkan resistensinya terhadap antibacterial.

Yang dilakukan dan menjadi target dari agen antibacterial yaitu :

- Menghalangi sintesis dinding sel bakteri

- Menghalangi sintesis asam nukleat bakteri

- Menghalangi sintesis protein

- Antimetabolit Menghalangi sintesis dinding sel, antara lain dengan menggunakan

- Penisilin - Bacitracin

- Cephalosporins - Monobactams/carbapenems

- Vancomycin - Fosfomycin

- Cycloserine - Isoniazid Menghalangi sintesis membrane sel dengan Polymyxins akan menyebabkan

membrane sel bakteri kehilangan permeabilitasnya. Menghalangi sintesis DNA/RNA, dengan cara menghalangi replikasi dan transkripsi,

menghalangi enzim gyrase dengan Quinolones(ciprofloxazin) dan menghalangi RNA polimerasi dengan Rifampin.

Menghalangi sintesis protein. Obat yang bertugas di situs 50s adalah :

- Chloromfenikol

- Eritromisin

- Clyndamycin

- Oxazolidinones Sedangkan obat yang bekerja di situs 30s adalah:

- Aminoglycosides

- Tetracyclins

- Streptomycin

- Amikacin Menghalangi metabolism, dengan menggunakan obat

- Sulfonamides (sulfa drugs)

- Trimethoprin

- Dapsone

- Para-aminosalicyclic acid Mekanisme resistensi

- Resistensi intrinsik (kromosomal) Misalnya Pseudomonas pasti resisten terhadap amphicylin dan penisilin karena memiliki resistensi intrinsic

- Resisten yang dibutuhkan, akibat adanya: 1. Mendapatkan properti untuk mendukung fungsi

Misalnya bisa terjadi akibat perpindahan materi genetik dari satu bakteri ke bakteri lain, bahkan bisa juga terjadi antar spesies bakteri sehingga diperoleh sifat baru yang lebih unggul Selain itu bisa juga karena ada aktivitas enzimatik yang baru, misalnya fosforilasi, asetilasi, dan pompa.

2. Mutasi atau keberadaan suatu protein tertentu Misalnya terjadi perubahan subunit ribosom, permeabilitas dinding sel, dsb.

Jadi mekanismenya adalah : 1. Penginaktivasian obat, misalnya Penisilin. Dinonaktifkan dengan

Penicillinase, sebuah enzim yang membelah molekul obat dan menyebabkannya tidak aktif.

2. Menurunkan permeabilitas membrane, reseptor yang mentranspor obat diubah sehingga obat tidak bisa memasuki sel.

3. Mengaktivasi pompa obat, diilakukan oleh protein membrane khusus yang diaktifkan dan secara terus menerus memompa obat keluar sel

4. Mengubah situs perlekatan obat, situs perlekatan yang menjadi target yaitu di ribosom diubah sehingga obat tidak bisa memberikan efek.

5. Menggunakan jalur metabolik alternatif, obat biasanya memblok jalur metabolik, jadi mikroba tersebut mencegah dengan menggunakan jalur metabolik alternatif sehingga jalur tersebut tidak terblok.

Penghambatan sintesis dinding sel Dapat dilakukan dengan:

- Beta Lactam Antibiotik, merupakan antibiotik yang mengahambat sintesis dinding sel paling utama. Berupa : Penicillins, Chepalosporins, Chapamycins, Charbapenems, Monobactams, beta-Lactamase inhibitor

- Antibiotik lainnya, yaitu : Vancomycin dan Bacitracin

Page 32: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

32 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

- Agen antimikobakterial, yaitu : Isoniazid, Ethambutol, Cycloserine, Ethionamide

A. Penghambatan Sintesis Dinding Sel oleh Antibiotik Beta Lactam 1. Lapisan peptidoglikan adalah komponen utama pembangun dinding sel bakteri.

Struktur dasarnya yaitu rantai sepanjang 10 sampai 65 disakarida yang mengandung molekul sebagai berikut : N-acetylglukosamin dan N-acetylmuramic acid.

2. Penicillin binding proteins (PBPs):

- Enzim spesifik yang membangun lapisan peptidoglikan dari dinding sel dan dapat diikat oleh atibiotik beta-lactam yaitu : transpeptidase, carboxypeptidase, dan endopeptidase.

- Antibiotik Beta-lactam biasanay bertindak sebagai agen antibacterial yang membunuh bakteri. Pertama bakteri yang sedang tumbuh diberikan antibiotik beta-lactam yang akan berikatan dengan PBPs di dalam dinding sel bakteri yang sedang tumbuh tersebut, antibiotic tersebut menghambat sintesis dinding sel namun tidak mendagradasi peptidoglikan, lalu bakteri tersebut mati.

Di bawah ini akan dijelaskan lebih rinci mengenai antibiotik2 yg berperan dalam menghambat sintesis dinding sel bakteri serta macam-macam resistensi yang terjadi terhadap antibiotik tersebut. Mekanisme Resistensi Bakteri terhadap Antibiotik Beta-Lactam 1. Mencegah interaksi antara antibiotik dengan PBPs target, hanya terlihat di bakteri

gram negatif (biasanya spesies Pseudomonas), yaitu dengan cara:

- Perlindungan terhadap membrane terluar yang melapisi lapisan peptidoglikan

- Penetrasi dari antibiotic beta-lactam ke dalam bakteri gram-negatif membutuhkan perpindahan melalui pori membrane terluar, maka bakteri melakukan perubahan protein pori membrane terluar (porin) sehingga merubah ukuran dari saluran porin sehingga menyingkirkan antibiotik yang akan masuk tersebut.

2. Mengurangi pengikatan antibiotik terhadap PBPs. Bisa dilakukan bakteri dengan memodifikasi PBP. Pemodifikasian ini tidak akan menyebabkan kerusakan pada lapisan peptidoglikan melainkan justru membantu sintesis lapisan peptidoglikan bakteri. Pemodifikasian ini bisa terjadi secara alami yaitu dengan mutasi yang terjadi pada gen PBP, misalnya pada Streptococcus Pneumonniae yang resisten terhadap penisilin. Selain mutasi, modifikasi pada PBP bisa terjadi karena kedatangan PBP yang baru, misalnya saja masuknya PBP E.coli ke dalam staphylococcus aureus menyebabkan bakteri ini resisten terhadap oxacillin.

3. Hidrolisis antibiotik oleh beta-lactamase. Yaitu dengan cara penginaktivasian antibiotic beta-lactam. Ada sekitar 200 jenis yang berbeda dari beta-lactamase, misalnya khusus untuk penisilin yaitu penicilinase dan khusus untuk chepalosporins yaitu chepalosporinase. Aktivitas yang luas dari enzim ini bisa menonaktifkan antibiotik beta-lactam. Extended-spectrum beta-lactamase (ESBLs) dikode oleh plasmid yang bisa ditransfer dari satu organisme ke organisme lainnya yang bisa menyebabkan kesulitan dan keterbatasan dalam penggunaan beta-lactam di beberapa rumah sakit.

Mekanisme Resistensi Methicilin 1. Protein beta-lactamase pada staphylocococcal yang memotong struktur cincin beta

lactam hanya resisten terhadap penisilin namun tidak pada penisilin semi sintetis seperti methicilin, oxacilin, atau cloxacilin. Perolehan gen mecA yang mana mengkode Penicilin Binding Protein PBP2a melengkapi resistensi terhadap semua jenis antibiotik beta-lactam, sehingga bahkan yang merupakan penisilin semi sintetis juga bisa resisten terhadap antibiotik tersebut. PBP2a memiliki afinitas yang rendah terhadap antibiotik beta-lactam dan ini menguntungkan untuk pembentukan dinding sel saat PBPs normal dinonaktifkan oleh antibiotik. Gen mecA ditemukan pada elemen genetik yang bergerak yang dinamakan staphylococcal chromosomal cassette mec (SCCmec).

Glikopeptida dan resistensinya terhadap Vancomycin 1. Glikopeptida kompleks yang mengganggu sintesis dinding sel peptidoglikan pada

pertumbuhan bakteri gram positif. Glikopeptida ini berinteraksi dengan D-alanin-D-alanin dari rantai pentapeptida pada dinding sel bakteri yang kemudian mengganggu formasi rantai peptidoglikan. Glikopeptida digunakan untuk mengatur infeksi yang disebabkan oleh resistensi oxacilin staphylococci dan bakteri gram positif lainnya yang resisten terhadap antibiotik beta-lactam. Glikopeptida tidak aktif ketika melawan bakteri gram negatif. Molekul glikopeptida terlalu besar untuk menembus membran terluar dan mencapai situs target di peptidoglikan bakteri gram negatif tersebut.

2. Resistensi intrinsik terhadap vancomycin terjadi ketika terminasi pentapeptida di D-alanin-D-lactate glikopeptida tidak mengikat vancomycin. Misalnya pada bakteri leuconostoc, lactobacillus, pediococcus, dan erysipelothrix. Juga bisa terjadi ketika terminasi pentapeptida di D-alanin-D-serine misalnya pada Enterococcus gellinerum, Enterococcus casselillavus.

3. Resistensi yang diperoleh dari Vancomycin dimediasi oleh plasmid. Misalnya pada bakteri Enterococcus faecium dan Enterococcus faecalis. Hal ini merupakan ancaman yang potensial untuk kegunaan vancomycin dalam perawatan terhadap infeksi bakteri enterococcal. Ini menjadi pemikiran jika gen resisten ini ditransfer ke

Page 33: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

33 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

staphylococci (terbukti melalui eksperimen laboratorium) resisten akan semakin tinggi dan virulensi dari bakteri tersebut juga akan semakin tinggi.

Polipeptida 1. Antibiotik lain yang berperan dalam menghambat sintesis dinding sel bakteri adalah

Bacitracin. Merupakan gabungan dari polipeptida. Bacitracin menghambat dinding sel dengan mengganggu defosforilasi dan daur ulang lipid yang bertanggung jawab untuk memindahkan prekursor peptidoglikan melalui membran sitoplasmik menuju dinding sel. Bacitracin juga menghacurkan membrane sitoplasmik bakteri dan menghambat transkripsi RNA. Resistensinya terjadi ketika kegagalan antibiotik tersebut untuk masuk ke dalam sel bakteri.

2. Selain itu terdapat juga antibiotik Polymixin yang merupakan polipeptida siklik. Masuk ke dalam membrane bakteri dengan berinteraksi dengan lipopolisakarida dan fofolipid di membrane terluar yang mana akan meningkatkan permeabilitas membrane dan akan menyebabkan sel bakteri mati. Sebagian besar antibiotik ini aktif melawan bakteri gram negative selama bakteri tersebut tidak memiliki membrane terluar. Misalnya Polymixin B dan E (Colistin).

Jenis antibiotik lain yang sering digunakan yaitu Isoniazid, Ethionamide, Ethambutol dan Cycloserine. Isoniazid mempengaruhi sintesis dari asam mycolic bakteri dan mengganggu desaturasi dari asam lemak rantai panjang dan mengganggu elongasi asam lemak serta hidroksi lipid. Ethionamide berasal dari Isoniazid dan juga berfungsi untuk menghalangi sintesis asam mycolic. Ethambutol menggangu sintesis arabinogalaktan di dinding sel bakteri. Sedangkan Cycloserine menghambat sintesi D-alanin-D-alanin yang mana merupakan katalis bagi sintesis dinding sel bakteri. B. Penghambatan Sintesis Protein Aminoglikosida Aminoglikosida adalah antibiotik yang menghambat situs 30s protein ribosom. Contoh aminoglikosida yaitu:

- Streptomycin, neomycin, kanamycin, tobramycin

- Amikacin merupakan derivat sintetis dari kanamycin

- Netilmicin merupakan derivat sintesis dari sisomycin Aminoglikosida ini mempunyai kemampuan untuk menembus membrane terluar dari bakteri (pada bakteri gram negatif), menembus dinding sel, dan menembus membrane sitoplasmik. Situs aktif aminoglikosida yaitu di sitoplasma dan nantinya akan berikatan dengan situs 30s protein ribosomal. Aminoglikosida yang masuk ke ribosom akan memberikan dua efek yaitu :

1. Ribosom akan memproduksi protein yang salah sebagai akibat dari kesalahan dalam pembacaan mRNA.

2. Interupsi terhadap sintesis protein dengan menyebabkan pelepasan protein ribosom yang prematur atau belum matang dari mRNA.

Bakterisidal mampu melakukan pengikatan yang ireversibel pada ribosom. Penetrasinya melalui membrane sitoplasmik bakteri yang aerobik dengan membutuhkan energi. Namun bakteri yang anaerobik resisten terhadap aminoglikosida sehingga tidak bisa dimasuki oleh aminoglikosida. Dinding sel bakteri Streptococci dan Enterococci tidak bisa dimasuki oleh aminoglikosida. Pengobatan dengan aminoglikosida ini membutuhkan bantuan antibiotik lain yang bisa menghambat sintesis dinding sel bakteri (misalnya Penisilin, Vancomycin, dan Ampicillin) agar aminoglikosida bisa masuk. Resistensi yang terjadi pada aminoglikosida bisa terjadi dalam tiga langkah:

1. Mutasi yang terjadi pada situs perlekatan ribosom, namun biasanya hal ini jarang terjadi dan hanya terjadi di bakteri genus Enterococcus.

2. Menurunnya jumlah antibiotic yang bisa masuk ke dalam sel, misalnya pada bakteri Pseudomonas dan sering terjadi pada bakteri gram negatif.

3. Modifikasi enzimatik dari antibotik. Modifikasi ini bisa terjadi melalui fosforilasi, adenilasi, dan asetilasi dari gugus amino dan gugus hidroksil antibiotic.

Tetracyclin Tertracyclin ini bersifat broad-spectrum. Tetracyclin mengikat secara reversibel situs 30s subunit ribosom. Antibiotik ini menghalangi pengikatan aminoasil-transfer RNA (tRNA) ke kompleks 30s ribosom-mRNA. Resistensi yang terjadi karena :

1. Penurunan jumlah antibiotik yang bisa masuk ke dalam sel bakteri Bisa terjadi karena mutasi pada gen kromosom yang mengkode porin protein membrane terluar bakteri. Level resistensi yang rendah terhadap tetrasiklin juga terjadi pada antibiotik lain misalnya beta-lactam, quinolone, dan chlorampenicol.

2. Pengeluaran antibiotik dari dalam sel. Banyak variasi dari gen bakteri yang berbeda yang mengontrol pengeluaran antibiotik tetracycline dari dalam sel. Inilah penyebab resistensi yang paling umum. Ternyata bakteri nggak sebodoh yang dikira.

3. Perubahan situs target ribosom. Produksi protein serupa dengan faktor elongasi yang melindungi 30s ribosom, dalam hal ini antibiotik masih dapat berikatan dengan ribosom namun sintesis protein tidak akan terganggu.

4. Modifikasi enzimatik dari antibiotik itu sendiri Oxazolidone

Page 34: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

34 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Antibiotik ini merupakan represntatif dari Linezolid dan bersifat narrow-spectrum. Antibiotik ini menghambat inisiasi dari sintesis protein dengan mengganggu formasi dari kompleks inisiasi di subunit 30s ribosom. Resistensi silang yang biasa terjadi pada penghambat sintesis protein yang lain tidak terjadi di sini. Sehingga antibiotic ini dapat digunakan untuk pengobatan terhadap infeksi bakteri strain Staphylococci, Streptococci, dan Enterococci yang mana resisten terhadap penisilin, vancomycin, dan amiboglikosida. Chloramphenicol Berfungsi untuk menghambat sintesis protein di sel sumsum tulang belakang. Dapat mengikat peptydil transferase yang merupakan komponen dari subnunit 50s ribosom secara reversibel sehingga menghalangi elongasi peptide. Resistensi terhadap antibiotik ini disebabkan karena plasmid bakteri yang mengkode chloramphenicol acetyltransferase mengkatalisis asetilasi grup 3 hidroksil dari chloramphenicol sehingga antibiotic ini tidak bisa berikatan dengan subunit 50s. selain itu resistensi juga bisa terjadi karena mutasi kromosom yang mengubah protein porin membrane terluar sehingga membuat bakteri gram negatif menjadi kurang permeable. Namun resistensi yang disebabkan oleh mutasi ini jarang terjadi. Macrolide Antibiotic ini bersifat bakteriostatik. Struktur dasarnya yaitu cincin macrocyclic lactone yang berikatan dengan dua gula. Antibiotik ini mengikat subunit 50s ribosom secara reversibel dan menghalangi elongasi polipeptida. Resistensi terhadap antibiotic ini bisa disebabkan karena metilasi yang terjadi pada 23s ribosomal RNA sehingga mencegah pengikatan antibiotik. Selain itu bisa disebabkan karena rusaknya cincin lactone yang disebabkan oleh enzim erythromycin esterase. Dan yang terakhir resistensi disebabkan karena efluks atau keluarnya antibiotic dari sel bakteri. Clindamycin Menghalangi elongasi protein dengan melakukan pengikatan dengan subunit 50s ribosom dan kerjanya yaitu menghalangi peptydil transferase dengan mengganggu pengikatan asam amino acyl kompleks tRNA. Resistensiya disebabkan oleh metilasi di 23s ribosomal RNA. C. MENGHAMBAT SINTESIS ASAM NUKLEAT Quinolone Merupakan agen kemoterapetik sintetis. Kerjanya yaitu menghalangi enzim yang dibutuhkan oleh DNA untuk bereplikasi, rekombinasi, dan perbaikan yaitu enzim DNA Gyrase atau Topoisomerase. Resistensi terhadap antibiotic ini di mediasi oleh kromosom dengan dua mekanisme yaitu perubahan subunit alfa dari DNA Gyrase serta

mengurangi pemasukan antibiotic ke dalam sel dengan cara mengubah protein porin di permukaan sel bakteri.

Biofilm Beberapa bakteri ada yang berinteraksi satu sama lainnya dengan membentuk jaringan lengket bakteri dan polisakarida yang dinamakan biofilm, yang mana akan menempel di permukaan sel host, misalnya plak gigi, menempel pada kateter atau alat-alat intravena lainnya. Bakteri yang memiliki biofilm memiliki resistensi terhadap obat-obatan sekitar 100x lebih kuat daripada bakteri biasa. Hal ini disebabkan karena :

- Mikroba tersebut dilindungi oleh lapisan anti penetrasi alami yang tebal di matriks ekstraseluler.

- Bakteri memperlambat pertumbuhannya dan menurunkan aktivitasnya MENGHAMBAT REPLIKASI VIRUS DENGAN AGEN ANTIVIRAL Perkembangan dari kemoterapi antiviral jauh lebih lambat daripada obat-obatan antibacterial. Virus adalah makhluk obligat intraseluler di mana virus tersebut menggunakan enzim dan mesin biosintetik sel host untuk membantunya bereplikasi. Lebih susah untuk menghambat replikasi virus dengan antiviral tanpa meracuni sel host

Page 35: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

35 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

itu sendiri. Obat antiviral sekarang ini lebih mentargetkan kepada sintesis DNA dan RNA virus. Antibiotik terbaru saat ini targetnya adalah :

1. Enzim yang dikode oleh virus 2. Struktur virus yang sangat penting dalam proses replikasinya

Aktivitas dari obat aniviral ini biasanya terbatas hanya untuk famili virus yang spesifik. Misalnya menggunakan anti reverse transcriptase untuk terapi virus HIV. Resistensi terhadap obat antiviral telah menjadi masalah dalam proses pengobatan pasien yang membutuhkan jangka waktu yang panjang, misalnya resistensi terhadap obat antiviral pada orang yang mengidap AIDS. Ketidakhati-hatian dalam menggunakan oseltamivir (Tamiflu) bisa memicu resistensi terhadap obat oleh virus H5N1. Sintesis protein virus sebagai target antiviral bukan merupakan sasaran antivirus yang baik karena tidak memungkin obat untuk melakuan penghambatan selektif terhadap sintesis protein virus karena replikasi virus itu sendiri memanfaatkan ribosom dan mekanisme sintesis sel host. Mekanisme resistenis yang terjadi antara lain disebabkan karena :

1. Inaktivasi protein yang mengaktifkan antivirus dalam sel, misalnya kinase timidin

2. Perubahan target obat, misalnya reverse transcriptase, protease, dan GP41 Analog Nukleosida Dapat melakukan penghambatan atau inhibisi selektif karena :

1. Berikatan lebih baik dengan DNA polymerase virus dibandingkan dengan DNA Polimerase sel host

2. Obat digunakan lebih ekstensif pada sel yang terinfeksi, karena sintesis DNA nya lebih cepat dibandingkan dengan sel yang tidak terinfeksi

a. Acylovir, Valacylovir, Penciclovir dan Famciclovir

Memiliki rantai samping asiklik (buka merupakan gula ribosa atau deoksiribosa) dan bersifat selektif terhadap HSV (virus herpes simpleks) atau VZV (virus varicella zoster), karena kedua virus herpes tersebut menyandi kinase timidin. Kinase timidin virus mengaktivasi obat melalui fosforilasi (inisiasi fosforilasi), enzim-enzim sel penjamu/host melanjutkan proses pembentukan menjadi bentuk difosfat kemudian ke bentuk trifosfat. Pada sel yang tidak terinfeksi obat-obat ini terdapat dalam bentuk tidak aktif karena tidak terjadi inisiasi fosforilasi. Akibat obat ini bentuk trifosfat berkompetisi dengan guanosin trifosfat sehingga menghambat polymerase serta terminasi

perpanjangan rantai DNA virus. Obat-obat ini digunakan 100x lebih banyak oleh DNA polymerase virus dibandingkan oleh DNA polymerase sel.

b. Ganciclovir Obat ini aktif terhadap CMV, CMV ini tidak menyandi kinase timidin, tetapi dapat melakukan fosforilasi GCV oleh suatu protein kinase yang disandi oleh virus ini. Obat ini digunakan 30x lebih banyak oleh DNA Polimerase virus dibandingkan oleh DNA polymerase sel. Obat ini digunakan dalam terapi antitumor dengan terapi gen. Kemoterapi antivirus 1. Nukleosida Analog

- Acylovir (Acycloguanosine)

- Lamivudine (3TC)

- Ribavirin

- Vidarabine (Adenin Arabinosida)

- Zidovudine (Azidothymidine = AZT) 2. Nukleotida Analog, ex : Cidofovir (HPMPC) 3. Non nukleosida Reverse Transcriptase Inhibitor, ex : Nevirapine 4. Protease Inhibitors, ex : Saquinavir, Indinavir, Ritonavir Antivirus Tipe Lain Amantadine dan Rimantadine menghambat uncoating virus, ex : virus influenza dan profilaksis Foscarnet (Phosphonoformic acid, PFA) menghambat DNA polymerase virus dan reverse transcriptase Methisazone menghambat tahap akhir replikasi virus sehingga partikel virus menjadi imatur dan non infeksius (Poxvirus) Oseltamifir (Tamiflu) menghambta neuraminidase virus influenza, menghambat perakitan atau budding Fuzeon menghambat perlekatan GP41 pada reseptor seluler

Page 36: 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

Biologi Molekuler 2010

36 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA!

Setelah perjuangan dan pertumpahan darah (lebay) yang dilakukan para pejuang-pejuang kita, akhirnya tentir ini selesai. Dibawah ini adalah nama-nama para pejuang kita yang rela mengorbankan waktu tidur dan waktu belajarnya buat ngebuat tentir ini:

Afifah Putri H Deriyan Sukma Widjaja Karina Maharani Pramudya Monika Besti Yolanda Randy Satria Nugraha Rusdy Wendy Damar Aprilano

Kalo ada saran atau kritikan langsung bilang aja ke Siepend terdekat. Kalo mau ikutan bantu juga sangat diterima :D. Semoga tentiran kali ini berguna dan 2009 dapet A semua di modul BioMol ini hahahahahaha! Amin.