Download pdf - 1analiza medicamentului

8/18/2019 1analiza medicamentului

1/27

Marius BojitaRobert Sandulescu

Liviu RomanRadu Oprean

UNIVERSITATEA DE MEDICINASl FARMACIE

JULIU HATIEGANU CLUJ-NAPOCA

Volumul 2. etode instrument le in analiza

si controlul medicamentelor

Editura Intelcredo 2003DEVA


2/27

ISBN 973-8197-15-5

Copyright Intelcredo © 2003

Publicata de Intelcredo S A 2700-DevaEditura tel: 0264/594914 FAX: 0264/594914Serv. comercial tel. 0722-234058

Toale drepturile asupra acestei lucrari apartin autorilor si editurii Intelcredo S.A.Deva.

Nici o parte din acest volum nu poate f i copiata sa u transmisa prin nici un mijloc,electronic sau mecanic, inclusiv fotocopiere, inregistrare audio sau prin orice altsistem de stocare si redare a informatiei, fara permisiunea scrisa din partea autorilorsi editurii Intelcredo Deva.

cT tya?ita in

prin Intelcredo SA Deva si Imprimeria Ardealul Cluj-Napoca

Lucrarea execulatala Imprimeria , ,ARDEALUL" Cluj

B-dul 2 1 Decembrie nr. 146 Cluj-N apocaTel 4 387 ; Fax: 4 3883

Comanda nr. 3077/2003

INTRODUCERE

Lucrarea „Analizas. i controlul m edicamentelor" afost conceputa in dona volume,dintre care primul trateaza problematica generala a analizei si controlului medica-mentelor, aducand in discufie cele mai noi date referitoare la calitatea s.i sigurantamedicam entului. Aceste aspecte includ date specifice privind prelevarea si esantionareaprobelor de inedicamente si pretratamentul lor pana la faza de masurare a semnaluluianalitic. De asemenea, o importanta aparte s-a acordat In volumul 1 stabilitatii medi-camentelor, normelor, cerintelor si performantelor actuate in domcniul analizei sicontro lu lu i inedicarnentelor in con exiun e cu legislatia nafionala, a Comuni ta t i iEuropene, a SUA si Japoniei, a OMS etc.

In prezent nu se poate vorbi de calitatea si siguranja medicam entelor fara o inaltacalitate profesionala a specialistilor din acest domeniu. Calitatea presupune pe de o partemulta stiinja, iar pe de alta parte multa constiinta. l ar stiinta implica o mare cantitate d einformatie, care asigura profesionalismul specialistilor care lucreaza in acest domeniu,iar constiinfa impune responsabilitate, onestitate si o Tnalta moralitate. Aceste conceptesunt formulate sub forma unor criterii dc calitate si acceptanta a calitatii medicamen-telor, de acreditare a laboratoarelor de analizS si control si de atestare a competenteispeciaiistilor.

In elaborarcaacestui al doilea vol um, care poarta s u b t i t l u l , ,Metode instnimentale

de analiza si control" s-a t i n u t seama de programa analitica in vigoare a acestei spe-cialitati si de evolu{ia tehnologica a instrumentelor de masurare, de progresele rapidedin domeniul electronicii s i informaticii in general si information analitice in particular.Aceasta lucrare se bazeaza pe experienta acumulata de autori in cateva dcccnii deactivitate in inva tamantn l farmaceutic romanesc, considerand ca c ine nu cunoasteproblematica g enerala a an alizei (calitative si cantitative), bazele teoretice si practice aleacesteia, nu poate intelege procesele complexe care stau la baza metodelor instrumenlalemoderne. Mul tora dintre speciali^ti le ,,scapa" faptul ca peste 90% din cuantumul eroriifinale a unei analize se datoreaza esantionarii s i pretratainentului probelor in etapele cepremerg m asiiratoarea analitica p ropr iu-z isa . F ar aceste erori sunt in mare masura eroripersonale a le celor care lucreaza, datorandu-se In principal neatenjiei si l u c r u l u i nein-grijit.


3/27

Pentru a veni T n spri j inul Tnfelegerii s i cunoasterii m etodelor de analiza instrumeii-tala, pentru f iecare t ip de metoda se expun p r inc ip i i l e tcoretice, aparatura, principaliiparametri operational si importanfa lor, avantajele si l imitele metodelor tratate, ca siaplicati i le lo r, i n p r imul r and in ana l iza si controlul m cdicamenle lor. De asemenea, suntexpuse si unele date referitoare la selectivilalea, exactitatca, precizia si sensibil i tatea lor,in compara t ie cu alte metode, c u sublinierea necesitatii de a sc asigura Tntotdeauna unraport costuri /beneficii acceptabil , iar in acest context si necesitatea reducerii lucru-lui/probS.

Desi acest volum include o m are cantitate de i n fo rmaj i i , acestea sun t tratate intr-omaniera inteligibila pen t ru a putea f i infelese si asimilate. Pe dc alta par te , aceasta lucrareofera o baza teoretica si practica polivalenta, adaptata cerintelor si exigentelor actualeal e analizei si controlului d e medicaments.

A m b e l e v o l u m e al e lucrarii , ,Analiza si con t ro lu l medicamentelor" s e adreseazain p r i m u l r and sttiden}ilor facultati lor $ i colegiilor de f a rmacie , da r ele sun t ut i le prinproblematica tratata si pentru s tudenti i facultati lor de cl i imie, d e ch imic al imentara etc.ca t s i p e n t r u cloctoranzii d in aceste domeni i , pen t ru cercetatori § i cadre didactice un iver-sitare, inclusiv din domeniile biomedicale.

Aducem calde m u l t u m i r i tuturor celor care ne-au spri j init in elaborarea acesteilucrari , Tntre care Agentia Nat iona la a M edicamentu lu i , sponsor ilo r nos t r i si colegilorapropiaji.

Cluj-Napoca

Decembrie 2002

Autori i

CUPRINS

CUPRINS

1NTRODUCERE 3

A B R E V I E R I 12

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APL1CAT1I IN ANALIZA SICONTROLUL MEDICAMENTELOR 17

1.1. N o t i u n i genera le 171.2. Baze le teoretice a le cromatograf iei 26

1.2.1. Parametri i cromatograf ici 261.2.2. Eficacitatea co loanei c romatograf ic e 441.2.3. S i m e t r i a p icur i lo r si modifi carea form ei lor 501.2.4. Largirea picurilor si dilutia cromatografica 53

1.2.5. Rezolu t ia separar i i c romatograf ice 551.2.6. Detec tia analit i lor separa ji c romatograf ic 621.2.7. Aplicafi i le metodelor c romatograf ice 6 3

1.3. Cromatograf ia de l ichide de ina l ta per form anta 651.3.1. Cromatograf ia HPLC pecoloana 66

1.4. U nele preocupar i ac tua le p r iv ind op t imizarea con t inua a metode lorcromatograf ice de ana l iza 771.4.1. Dezvoltarea fazelor stationare pe baza de carbon poros grafitat 771.4.2. Ut i l i za rea in H P L C a unor faze stationare cu acces restrictiv 791.4.3. Apl ica t i i ale HPLC pe coloane D i s c o v e r y ™ C I S s i RP-Amide C16

in ana l iza si con t ro lu l medicamente lor 851.4.4. Cresterea eficientei s eparar i lo r de m ed icamente u t i l i zand dona

coloane c u sistem d e comutare rapida si gradienti 961.4.5. Separar i c romatograf ice a le molecu le lo r ch i ra le 10 4

1.5. Electrocromatografia capilara (CEC) 1 1 51.5.1. Cupla ju l electrocromatografiei capilare cu spectrometria d e masa 12 2

1.6 . Crom atograf ia cu f lu ide sup ercr i t i ce (SFC) 1 271.7. C r o m a t o g r a f i a de exc ludere sterica 13 9

1.7 .1 . Not iu n i generale. Definite, clasificare, t ipur i de geltiri 1391.7.2. Mecanismul separar i i p e geluri . Paramet r i i m ai impof tan t i 1 46

1.8. Crom atograf ia de scli imb ionic 15 51.8.1. Def in i t i a si structtira schimbatorilor de ioni 15 51.8.2. Proprietati f i z ico-ch imice a le sch im bator i lo r de ioni . . . . . 15 9


4/27

F CUPRINS CUPRINS1.8.3. Deplasarea ech i l ib re lor d e sch imb ionic si f ac tor i i care o

in f luenteaza 16 21.8.4. Fenomenul Donan 16 31.8.5. M o d u l de operare in ioncromatograf ie 165

1.9. Cromatografia planara 1 731.9.1. Cromatografia pe hartie 1731.9.2. Cromatograf ia pe strat subt i re (CSS) :. 1 741.9.3. Evaluarea densitometrica a c romatogramelor CSS 188

1.10. Cromatografia de gaze 19 81 .10 .1 . Definite. Apara tura 1981.10.2. Coloane , faze stationare si mobile 2021.10.3. Condi t i i de operare in C romatograf ia de gaze 20 91.10.4. Detector utilizati in Cromatografia de gaze 213

1.10.4.1. Detectori.il d e con ductibilitate termicS 21 31.10.4.2. Detectorul cu ionizare In flacarS 2151.10.4.3. Detectoul termoionic 21 6

1.10.4.4. Detectorul prin fotometrie de flacara 21 71.10.4.5. Detectorul cu captura de electron 21 8

1.10.5. Aplicatii ale cromatografiei de gaze In controlul medicamentulu i 2211.10.6. C u p l a J L i I G C - M S pentru analiza rapida in r ad ia t i i moleculare

supersonice 226

1.10.7. Cuplaju) LC-GC 23 41.10.8. Cupla ju l HPLC-HRGC 23 7

CAPITOLUL 2 ELECTROFOREZA 2402.1. N o t i u n i introductive 24 02.2. Electroforeza zonala . . . 24 32.3. Factorii care influenteaza electroforeza 245

2.4. Imunoelec t roforeza 25 02.5. Electroforeza p r in i zofocal izare 25 12.6. Electroforez a b id imens iona la 2522.7. Electroforez a capi la ra 25 2

2.7.1. Electroforeza capilara zonala 2562.7.2. Electroforeza cap i la ra mice lara 2572.7.3. Electroforez a capilara pe gel 2582.7.4. Separarea enant iomer i lor p r in C E in cont racurent 2592.7.5. Apl icarea electroforezei capi ia re in ana l iza ?i con t ro lu l

medicamente lor i l ici te : 2642.7.6. Separari CE ch i ra le 27 7

2.7.7. Utilizarea electroforezei, in p reconcentrarea t inor medicamenteprin bio sau imuno afinitate 281

CAPITOLUL 3 NOTIUNI GENERALE REFERITOARE LA METODELEOPTICE SPECTRALE DE ANALIZA 289

CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE ABSORBTIE [N ULTRAVIOLETSI IN VIZIBIL 296

4.1. Oomeniul spectral U V - VIS. Originea absorbtiei 2964.2. Absorbt ia l u in in i i . Tranzi t i i electronice 29 84.3. Producerea cu lor i i . Cromofori. Solvatocromie.Deplasari bato $ i

hipsocrome 30 24.4. Spectrofotometria UV-VIS 3064.5. Legea fundamenta l s a absorbtiei 3084.6. Abater) de la legea Lambert-Beer. Erori datorate ins t rumente lor 310

4.7. Determinari cantitative. Curba de calibrare 3124.8. U tiliza rea spectrelor electronice pentru studii de structural - activitate 31 54.9. Inregistrarea spectrelor 31 84.10 . Determinarea va lor i i p Kadin masur3tor i spectrofotometrice 32 14 . 11 . Exemple d e spectre UV ale unor substan}e inedicam entoase 3244.12. Spectrometria derivatS 327

CAPITOLUL 5 SPECTROMETRIA ATOMICA 333

5 .1 . Spect rometr ia de absorbt ie atomica si de emis ie a tomica in f lacara 33 35.2. Spectrom etria de absorbtie atomica electroterm ala 3385.3. Spectrometria atomica de emisie in plasma 346

5.4. Apl ica t i i ale spectrometriei atomice 35 0

CAPITOLUL 6 SPECTROMETRIA IN NFRAROSU 3536.1 . Reg iun i spectrale I R . M o d u r i de v ibra t ie moleculara . „ 35 36.2. Obtinerea spectrelor IR si interpretarea lor . 356

6.2.1. Etape in Inregistrarea spectrelor IR 3626.2.1.1. Etape la inregistrarea spectrelor in I R - apropiat 365

6.3. Spectrometre c u t r a n s f o r m a r e F o u r i e r 36 66.4. Spect rometr ia de d i fuz ie R a m a n 37 36.5. Intocmirea une i biblioteci de spectre IR de referinfa pentru

medicamente ...382


5/27

415

. .415

8 CUPRINS

CAPiTOLUL 7 SPECTROFLUORIMETRIA 3837.1. N o t i u n i generale 38 37.2. Masurarea intensitali i f luorescentei 38 57.3. Polarizatia de fluorescenta 394

CAPITOLUL 8 SPECTROMETRIA DE FLUORESCENTA CU RAZE X 4008.1. Not iun i in t roduct ive 40 08.2. Spectrul d e fluorescenta X 4028.3. Detectoare d e fluorescenta X 4078.4. Anal izorul c u raze X cu energie dispersive (EDX) 411

CAPITOLUL 9 SPECTRE DE M1CROUNDE9.1 . S tud iu l cantitativ al energiei de rotatie

CAPITOLUL 1 METODE OPTICE NESPECTRALE 42

I O . I . Polar imet r ia 42 0I O . I . I . No t iun i genera le 42 0

l O . l . l . l . Lumina p o l a r iz a t a 420

10.1.2. Stereoizomerie, enantiomeri 422I O . I . 3 . Polar imet ru l 425

10.2. Dispersia rotatorie 42 910.3. Dicroismul circular 43 110.4. Refrac tometr ia 43210.5. Turbidimetria s j nefelornetria 440

CAPITOLUL 1 1 SPECTROMETRIA DE WIASA 4451 1 . 1 . N ot iuni genera le 44 511.2. Apar'atura. Spectrometrul de masa 4461 1 . 3 . Procedee d e f ragmentare a molecule lor 44 81 1 . 4 . Detectoare 45 51 1.5. Per formanfe le spec t rometre lor de masa 4561 1 . 6 . Ti p u r i de analizoare d e masa 45 8

11.6 .1 . A n a l i z o r u l cu camp magnetic 45 811.6.2. Analizorul electromagnetic 45 91 1.6.3. Analizori cu capcane d e i o n i 46 011.6.4. A n a l i z o r u l cu f i l t r u cvadrupol 46 211.6.5. A n a l i z o r u l cu t i m p de zbor 46 4

1 1 . 7 . Unele aplicati i analit ice al e spectrometriei de masa 46 6

C U P R I N S

11 .7 .1 . Cupla ju l gazcromatografie-spectrometrie de masa (GC-MS ) 46 711.7.2. Cupla ju l cromatografie de l ichide-spectrometrie de masa

(UPLC-MS) 46911.7.3. Identificarea unei molecule de ana l i t 47 2

11.7.4. Determinarea formule lor bru te 47 311.7.5. Sta bilirea formu lei moleculare 47411.7.6. Utilizarea spectrometriei de masa in analiza cantitativa 47811.7.7. Delerminarea rapoartelor izotopice 47 911.7.8. Identificarea unu i compus c u ajutorul spectrotecii MS 48111.7.9. Alte ap l ica t i i a le spectrometriei de masa in ana l iza ? i cont ro lu l

medicamente lor ....482

CAPITOLUL 12 SPECTROMETRIA DE REZONANTA MAGNETICANUCLEARA 489

12.1. Producerea sp inu lu i nuclear12.2. Absorbtia de radiatii s.i var ia t ia energie i .

12.3. Grupuri sa u popula t i i de nuclee12.4. Ecuatia La rmor

48949 1

49549 7

12.5. Deplasarea ch imica si relaxarea 49 812.6. Deplasarea c h i m i c a si masu rarea ei 50112.7. Factorii care in f luenteaza deplasarea ch imica 50 212.8. Cupla ju l sp in-spin si structura h iper f ina 50 5

12.8.1. Cupla ju l heteronuclear 50612.8.2. Cuplaje homonucleave 50 9

12.9. U nele aplicati i cantitative ale RMN 51 212.10. Procedee util izate in R M N 5 1 6

12.10.1. Rezonan{a magnetica nucleara cu unde cont inue 51 612.10.2. Rezonanta magnetica nucleara cu i m p u l s u r i 51 6

12.10.3. Rezonanfa magnetica nu cleara cu rezolutie joasa ...,...,_ 51 712.10.4. Unele date imp or tante in ana l iza si cont ro lu l medicamente lor 517

528CAPITOLUL 1 O METODE ELECTROCHIMICE IN ANALIZA SI

CONTROLUL MEDICAMENTELOR

13.1. Notiuni generale 52 813.2. Procese redox in electroanaliza 53 I13.3. Titrarea potentiometrica 536

13.3.1. Montajul in titrarea potentiometrica 53613.3.2. Masurarea diferentei de potenfial 53 7


6/27

10 CUPRINS

13.3.3. Eroti sistematice si aleatoare in titrarea potenfiometricS 54113.3.4. Electrozi indicator si de referinta in titrarea potentiom etrica 545

13.3.4.1. E lectrozi indicator 54513.3.4.2. Electrozi de referinta 55213.3.4.3. Electrozi membrane cationi § i anioni selectivi 55513.3.4.4. Electrozi membrana modificata substante medicaincntoase sensibili569

13.3.5. Senzori microcip de si l iciu 57113.4. VoU amperometria si coulometria 573

13.4.1. Dozarea voltamperom etrica 57313.4.2. Polaro grafia 576

13.4.2.1. Polarografia la curent contiiiuu 57613.4.2.2. Polarografia impulsionala ( cu impulsuri, pulspolarografia) ... 579

13.4.3. Voltamperometria cu redizolvare ano dica (stripping voltainetria) 58 413.4.4. Voltainetria strippin g puls diferenjjala adsorbtiva 58 713.4.5. Electrozi pasta de carbon utilizati in metodele voltamp eroinetrice.. .. 589

13.5. Titrarea couloinetrica 59 6

13.5.1. Coulom etria potentiostatica 59 613.5.2. Cou lom etria galvano statica 597

13.6. Determinarea coulometrica a apei, Karl Fischer 59813.7. Aplicatii ale metodelor electroanalitice in analiza si controlul

medicamentelor .602

CAPITOLUL 4 METODE DE ANALIZA PRIN MARCAREASUBSTANTELOR 608

14.1. Nof iuni introductive 6 0814.2. Tehnici izoto pice de analiz a 609

14.2.1. M arcarea c u un radioizotop 60914.2.2. Tehnica imunoenzimatica 61414.2.3. Anal iza radioimunologica (RIA) 6 1 514.2.4. Analiz a f luoroimunologica ( IFA) 61614.2.5. Anal iza p r in activare neutronica (NAA) 6 1 6

14.2.5.1. Detectia $i dozarea cu un spectrometru NAA 61814.2.5.2. Determinarea prin d i l u t i e izotopica 61914.2.5.3. Tehnica dozim etrica 62 0

4 ISCAPITOLUL I D W IETODE TERWIICE iN ANALIZA §1 CONTROLUL

MEDICAMENTELOR 62215.1. N o t i u n i introductive 62215.2. Analiza termogravimetrica si termogravimetrica derivata 62 315.3. Calorim etria c u scanare diferentiala (DSC) 634

CUPRINS 11

15.4. Anal iza tennomecanica (TMA) 65915.5. Titrare entalpica sail termom etrica 66715.6. Titrarea calorim etrica izoterma 675

CAPITOLUL 1 6 UTILIZAREA CHEMOMETRIEI IN ANALIZA SICONTROLUL MEDICAMENTELOR 677

16.1. Preprocesarea probelor 67 716.1.1 .Normal izarea 677

16.2. Netezirea sau curaf i rea semnalului analitic de zgomotul d e fond 68 016.2.1. Curat i rea medie 68016.2.2. Curati rea medie succesiva (continua, ciclica) 68116.2.3. Curat i rea mediana succesivS 68216.2.4. Curajirea po l inomia la succesiva 68416.2.5. Cura{irea c u f i l trul Fourier 685

16.3. Corectia l iniei de baza 689

16.3.1. Abordarea prin modelare explicita 68916.3.2. Derivarea 69 116.3.3. Diferenfa simpla contin ua (succesiva) 69216.3.4. Diferen^a medie succesiva (continua) 69 316.3.5. Metoda Savitzky-Golay si metodaGorry 69 4

16.4. Tipuri de funcjii de calibrare 69516.4:1. Nive lul un ic de calibrar e 69516.4.2. Calibrareanivel tnu l t ip lu (mul t i - level) 695

16.5. Controlul calitaji i formular i lor farmaceutice 69716.5. . Controlul cali tafi i formular i lor farmaceutice continand

catecolamine 69 716.5.2. Designul statistic experimental aplicat la medicamente 69 7

16.5.3. Aplicarea designului statistic la determinarea nimesulidei si acombinafiei diazepam-otiloniu 698

16.5.4. Determinarea CZE a c lorh idra tu lui de ruf loxacina 69 916.5.5. Utilizareastatisticii variate pentru determinarea altor medicamente . .70116.5.6. Designul Plackett-Burmann 704

DICTIONAR TEHNIC DE SPECIAL1TATE 707

B1BL1OGRAFIE... . . . . .765


7/27

12 ABREVIERI ABREVIERI 13

ABREVIERI

A: AASf = spectrometrie de absorbjie atomica in f lacaraAASe = spectrometrie de absorbtie atomica electrotermalaAc = acetatACP = po larograf ie la curent alternativAdSV = vo l tamctr ie s t r ipping adsorbtivaAES = spectrometrie atomica de emisieA F M = m icroscopie atomica fortataAMD = developare multipla automataA N C O VA = sistem de ana l iza a cqv ar ian jeiAP = alcalin fosfatazaAPC1 = ionizare chim ica la presiune atmosfericaASV = vo ltametrie stripping anodica

B: BGE = electrolit suport sau de fond (background electrolyte)BioFETS = biosenzori - tranzistori cu efect de camp

C: CASM = ana l iza ca lor imet r ica cu microscopie d e scanareCCPE = electrod com pozit carbon-polimer(CC) = suma corectata a patratelor concentratii lorCCD = project compus central (i n designul exper imenta l )CC S A = an aliza strip ping la curent constantCCZE = electroforeza zonaia capilara chiralaCD = ciclodextrine neutreCDs = c ic lodext r ine incarcate negativCE = electroforeza capilaraCIE = captura interna de electroni in fluorescenja cu raze XC1EF = concentrare capilara izoelectrica (Capillary isoelectric focusing)C1T = citratCPE = electrod pasta d e carbon(CR) = suma corectata a patratelor produselor incrucisate a le concentrafii lor (C )

si semnale lor analit ice (R )CR M = material standard de referintaCSV = vo l tametr ie s tr ipping catodicaCUT = test de conformitate a l continutuluiCVD = depunere ch imica d e vapor i

D: D (sau Da) = Dalton, imitate de masiira a masei egala cu 1/12 din masa atomului de"C , uti l izata i n biologie, microbiolo gie etc.

DAD = detector cu diode i n l i n i e (bareta)DCV = vo l tametr ie la curent direct

DEG = dieti lenglicol(DF) = suma totala a patratelor gradelor de l ibertateDMA = ana l iza mecanica d inamicaDME = electrod picurator d e mercurDPP = po larograf ie pulsdiferentialSDPV = voltametrie pulsdiferentiala

E: EAS = spectrometrie elec tronica de absorbfieECHP =electroforeza capi la ra d e inalta per formantaEC1 = injectie electrocineticaEDX = energia dispersive a razelor X

EELS = spectroscopie electron ica, c u pierdere d e energie (a e lec t ronulu i )EF = electroforeza prin izofocalizareEI A = analizfi imunoenzimatica (test imunoenzimologic)ELSD = detector evaporator cu lumina dispersataEO F = f lux electrbosmoticERE = eiectrod de referinta externES = extracfie sinergicaES C = electrod saturat de calomelES H ( N H E ) = electrod saturat de hidrogen (sau normal de hidrogen)

F: FA = analiza frontalaF AB = bombardare cu atomi rapizi (fast atomic bombardm ent)FCD = design fafa centrataf.e.m. = fo rtS electromotrice (electromotoare)FFT = f i l t ru de netezire/curatire Fo ur ier, a semnalului analit ic ( in chemometr ie )F IA = ana l iza cu injecfic in f luxFR = f lavin reductazaFSOT = coloana tubu la ra deschisa di n s i l ice topitaFTIR = spectroscopie in infrarosu cu transformare Four ie r

G: GC = cromatografie in faza gazoasa (gazcromatografie)GCE = electrod de carbon sticlo s (glassy carbon electrode)


8/27

14 ABREVIERI

GC-ICP-MS = cuplaj gazcromatografie-plasma cuplala inductiv-spectrometrie d emasa

GC-MS-MS = cuplaj gazcromatografic - masspectrometrie - masspeetrometrieOFF = glicil-L-fenilalanil-L-fenilanil

GO D = glucozoxidazaH: HIS = ionizare selectiva hipertermala de suprafata

HPCE = electroforeza capilara de inalta performantaHMDE = electrod picatura d e mercur suspendata/stationaraI IPLC = cromatografie de lichide de inalta performantaHPTLC = cromatografie pe strat subtire d e inalta performantaHRGC = gazcromatog rafie de Tnalta rezolujie

I: IDT = analizor cu capcana d e ioni (iontrape detector)IEC = captura interna d e electronIFA = analiza f luor imunologica ( f luor imet r ic immunologic analysis)IM S = spectrometru cu mobilitate de ioniIR = infrarosu (spectroscopie in infrarosu)IRE = electrod de referinta internISE = electrod ion selectiv (EIS)

L: L A M M A = spectrometru (an alizor) de masa cu microsondaLAMPA = m et i lpropi lamidaac idulu i lisergicLC = cromatografie de l ichideLI F = fluorescenta laser - indusaLLE = eluent organic continuuL O M O = orbital molecular eel ma i pu t in ocupat

LSD = dietilamida acidului l isergicL S V = voltametrie c u scanare l iniara

M : MALD1 = desorbtia cu ionizare a matricei asistata de laserM A S M = analiza mecano-termala cu microscopic d e baleiajMCA = analiza multicomponentMCPE = electrod pasta de carbon mo d if icatM E B = microscopic electronica cu baleiajMEKC = cromatografie capilara electrocinetica in mediu micelarM G C E = electrod de carbon sticlos modificat

ABREVIERI 15

MS = spectrometrie de masa( M S ) = m edia totala a patratelor (SS) 10(a ia/(DF) tot 1 |a, in statisticaMTDSC = calorimetria de scanare diferenjiala la temperatura modulata

N: NAA= analiza p r in activare cu neutronN A D H = nicotinamid-adenin dinucleotida, forma redusaNIST = National Institute fo r Standards an d Technology - USANPD = detector t e rmoionicN P L C = l ichid-cromatografie p e faza normalaNP P = polarografie cu puls norm alNPBP = N-propil-p-hidroxibenzoat (standard intern)

O: OES = spectroscopie de emisie opticaOPTLC = cromatografie pe strat subjire suprapresurizata (over pressure TLC)

P: PCA = analiza component principalPCP = fenilciclidina

,. PDMS -pol id imet il s i loxanPEEK = polietercetonaPE T = po lietilentereftalatPLD = depunere puls-laserP L M = microscopic c u lumina polarizataPM D = developare multipla programataPMT = tub fotomultiplicatorPP = fenilfosfatPPD = polarografie impulsionala diferentialaPPN = polarografie impulsionala cu puls norm alPP O = polifenoloxidazaPS A = analiza s tripping potentiometricaPtE = electrod de platinaPTFE = politrifluoretena (teflon)

R: R1A = anal iza rad io imunologica (test rad io imunologic)RGCE = electrod rotitor d e carbon sticlosR M S = substanta de referinta/standardRPLC = l ichid cromatog rafie pe faz5 inversa


9/27

16 ABREVIERI

(RR) = Simla corectata a patratelor semnalelor analiticeR S D = deviajia standard relativa (%)R S M = metodologia raspunsului suprafefei/ariei (pent ru dc terminarea robusteji i)

S: SAM = autoasamblare m onostrat (cu referire la senzori electrochim ici)SCE = cromatografie de excludere d e marlineSCSI = sistem computer m ic c u interfata pentru prelucrarea r ap ida a datelorSDU = imitate de eliberare (livrare) a solventului ( in SPE si si SPME)SEC = concentrafia electrolitului suportSEF = factor rapid dc intensificareS E M - E D X = microscopie c u scanare electronica, cu energie dispersiva a razelor XS F A = analiza in f lux segmentatSFC = cromatografie cu f luide supercriticeSFE = extracfie cu f luide supercriticeS M B s = radiatii supersonice moleculare

SPE = ex tractia in faza solidaS P M E = m icroextractia in faza solida(SS) = suma patratelo r regres iilor (aclica a patratelor reg resiilo r si a mediilor

patratelor reziduale)(SS)| = SS i = eroarea instrumental^(SS) L = SS L = eroarea cle neconordanta(SS) O

= SS O = eroarea generala (SS ( + SSp + SS L)(SS)p = S SP = eroarea procedurala (sail d e metoda)

T: TL C = c romatograf ia pe strat subtireTOF = t imp de zborTOFA = analiza (analizor) cu tim p de zborT X R F = spectrometria d e f luorescenta cu raze X, cu reflexie totals

U : U V = ultravioletUV-V1S = spectrometrie Tn UV si V IS

V: V IS = vizibil

W: WCOT = coloana tubulara deschisa cu perete acoperit

X : X R D = d i f rac t ie c u raze X

1.1. No t iun i genera teCromatografia este un a di n r amur i le mari, vaste al e analizei instrunientale cu

aplicatii largi i n separarca, detecjia si determinarea substan{elor ch imice i n general si inanaliza si controlul medicamentelor in par t icu lar. Tehnic i le cromatografice de analizasunt in primul rand tehnici cle separare dintre cele m ai selective si mai eficiente. i n c l u s i vpentru urrnele de substance. Asociate cu metode de detecjie, tehnicile cromatografice suntcapabile sa sesizeze cantitati infime de substanta, ceea ce le confera o mare sensibilitateprecum § i capacitate sigura de clozare pana la n ivel e cle ppb, ppt, in func t ie d e sensibili-tatea detectorului. Tehnic ile cromatografice de analiza" se numara printre metodeleinstrunientale cele m ai performante de analizS, raspunzancl unor cerinfe majore al esocietatii care se pot formula astfel:

- mai repede (citius), deci cu viteza mai mare;- eficienta m ai inalta (altius), deci m ai buna;- forla m ai mare (fortius) in ceea ce privesle:

- selectivitatea;- sensibililatea;- automatizarea;- min ia tur izarea senzorilor si al tor componente;- tratarea datelor analitice;- scopul aplicatii lor tehnicilor instrunientale cle analiza , inclusiv acelor

cromatografice.


10/27

18 CAPITOL.UL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATM IN ANALIZA 5 1 CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Pentru realizarea acestor objective sunt necesare sisteme de ana l iza complexe, sauchiar de analiza totala, care trebuie sa includa uii n u m a r impor tant de , ,un i la t i " destinateunor etape precizate de analiza, asa cum rezulta di n schema urmatoare (Figura 1.1):

Figura 1.1 Sistem de analiza complexa1 = imitate d e tratare a probei; 2 ~ imitate de injectie a probei; 3 = imitate de pur i f icarea probei; 4 = unitate de separare analitica (coloana); 5 = imitate de reacfic (bio) chimica;6 = unitate de detectie; 7 = un itate de prelucrare a datelor

Cromatografia a C o s t descoperita ( inventata) de botanistul ru s Tswet care T n 1906 aseparat o serie de pigment vegetali cu m sun t dorofilele si xantofi lele , din extracte Tneter de petrol , pe o coloana de carbonat de calciu fin pulverizat . In t roducand un so l -vent in partea superioarS a coloanei, el a constatat c i zona intens colorata di n capu lcoloanei se deplaseaza de sus in jos , iar componenti i se separS In f u n c t i e de v i t e z a lo rde migrare si a f i n i t a t e a lo r fa(a de faza stationara (CaC03), T n zone colorate distin cte,su b fo rma de inele, care co respund diversi lor pigment separati . Tswet a denumi taceste proces de separare ,,cromatografie" , terme n care provine de la grecescul,,chroma" (culoare) si ,,graphein" (a scrie). Pentru detectia pigmen(ilor separati se poateizola fiecare zona de concentra(ie (inel) din care se poate extrage pigmentul separat, sause poate ,,elua" fiecare pigment succesiv prin adaugarea unor solvent p o t r i v i t i , iar e f l u -endi ( f r a c t i u n i l e ) se culeg separat, procedandu-se apoi la detectia l o r .U n rol impor tan t In dezvoltarea cromatografiei 1 - a u avut M a r t i n si Synge (premiul N o b e l- 1962) care au dcscoperit (1941) cromatografia de reparl i t ie , care a s t imula t cerce-t a r i l e In acest domeniu , ceea ce a dus la descoperirea proceselor i n t ime de separare ,la s t ab i l i r ea parametri lor cromatografiei s i la dezvoltarea continue a performantelorde separare, detectie si de dozare ale metodelor cromatografice.

Datorita complexi ta t i i proceselor de separare, a n u m a r u l u i mare de factori carein f luenteaza separarea, a n u m a r u l u i ina redetehnic i s i dedetec tor i e s ted i f ic i la f o r m u l a -rea une i clefinitii general valab ile a cromatografiei. S e poate spunc insa ca toate tehnici lecromatograf ice au ca e lemente comune o .,faza stationara" si o , ,faza mobila", ia r compo-nentii unu i amestec d e analizat sunt antrenati in lungul coloanei de un f lux de faza mobila(gazoasa s au l ichida), cu viteze diferite, ceea ce constituie procesul fundam ental al separarii .Pe de alta partc, la baza tuturor metodelor cromatografice de separare stau patru procesefundamentale: adsorbtia p e suporturi solide, repartitia intre faza stationara si aceea mobi la ,schimbul ionic si excluderea-difuzia. Prin urmare, principiul separarii poate sa fie diferit,da r etapele analizei cromatografice sunt acelcasi s i anume:

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII TN ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAWIENTELOR 19

• pregatirea fazei sta{ionare;• fixarea ini j iala a anali j i lor in capul coloanei, pe faza stationara, dupa

introducerea solutiei de proba;• deplasarea selectiva - caracteristica a ana l i | i lo r, care sunt antrenati de sus in

jos de catre faza mobi la , In cadrul procesului d e elufie (developare).• identificarea anali}ilor separafi , pe m a s u r a ce acestia ies din coloana separa-toare s i tree in detector

• inregistrarea cromatogramelor, calcularea a r i i lo r p icur i lo r s i a altor para-metr i s idozareaanal i t i lorcorespunzator i , concomitentcuevaluareas ta t i s t icaa rezultatelor (regasirilor) etc.

Tinand seama de cele expuse, ca si de numerosii factori care sunt implicati inseparare, in asigurarea selectivitati i si rezolujiei, ca si de caracteristicile detectoriloruti l izafi , respectiv de sensibilitatea lor, de reproductibilitatea proceselor de separare,detec{ie si de dozare, este greu de dat o clasificare atotcuprinzatoare.

Totusi, avand in vedere natura fazelor stationare ^i a celor mobi le se poate da oclasificare acceptabila si rezonabila a metodelor cromatografice, asa cum se observa di nfigura 1.3. In figura 1.2 se prezinta o schema mai explicita si niai intuit iva a acesleiclasificari .

Figura 1.2 Clasificarea intuitiva a tehnicilor cromatografice


11/27

20 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Faza Procesulstationary cromatografic

âdsorbtie "^L

.

K i\ > » * x "

\ excludere s \\iI s

>

I /adsorbtie si

Kr\x

/:/

Solids excludere A\ i \ ;

\

\\\

schimb ionic x.̂Î Îi

i

Ti p u I

anorganic s o l u l f i

organic solids

a n o r g a n i c s o l i d a

organic solida

l i c h i d v o k i l i l

l i c h i d n c v o l a t i l

cromatografie de afiniuue

anorganic solida

organic solida

separiiri polarc

separSri ncpolarc

ion cromatografie

r a ? i n i chelalante

f u z a adsorbiia normals sauinversa

fa / . a l e a i i t a normala sauinversa

ciotnalografie in coniracureni

Figura 1 .3 Clasificarea metodelor crom atografice

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 21

In acest context, trebuie precizat ca alegerea fazelor stationare se face in func t iede masa moleculara a analit i lor, de solubili tatea lor in solventorganic si T n apa, decaracterul lo r nepolar/polar sa u ionic etc., asa cum se poate observa T n f igurile 1.4 si 1.5(dupa E. Merck).

De remarcat ca, exista posibilitatea ut i l izari i unei scheme simplificate de alegerea fazei stationare, pentru un an limit tip de proces cromatografie.Asa de cxemplu , pen t ru cromatografia de adsorbtie se poate u t i l i z a o schema . . t r iun-gh iu la rS" pentru alegerea f a z e i stationare si a celei mobile i n f u n c t i e dc a c t i v i t a t e a f a z e istat ionare adsorbante si de polaritalea a n a l i t i l o r asa cum se, poate observa Tn f i g u r a 1.6;din aceasta f i g u r a se constats ca activitatea f a / . e i stationare este Impartita in c i n c i sec-toare.

Destul de frecvent analistul este p us T n si tuatia d e a alege pen t ru un anumi t tip deana l i t i tehnici c romatograf ice d e adsorbjie sau de reparti t ie. P e n t r u aceasta t rebuie sa s ecunoasca s t ruc ture anali t i lor, respectiv t ipul de grupari functionale, n u m a r u l acestora sipolaritatea lo r.

Pen t ru exemplificare, tn f i g u r a 1.7 se da un ghid de alegere pentru procedcele deadsorbtie si de reparti t ie.

Cu ca t polaritatea compusilor este m ai mare adsorb t ia lo r este m ai accentuata. iarelutia mai dif ici la; de aceea procedeele de adsorbtie sunt ut i l izate mai ales Tn cazulcompusi lor nepolari sau cu polaritate mica, Tn timp ce procedeele de reparti t ie suntutil izate pen t ru separarea compusilor cu polaritate mare. Pe de aha parte t rebuie avut Tnvedere ca dubla legatura C = C nu mareste polaritatea unei molecule T n masura T n careo mares te o g rupare functionala, in s c h i m b ciclul a romat ic mares te polaritatea Intr-omasura mai mare decat trei difcle legaturi izolate Tntr-o catena l iniara.

In functie de procesele care stau la baza separarilor cromatografice exista:

- Cromatografie de adsorbtie, faza stationara f i i n d un suport solid (ex. AÔ-), SiOjetc.) care a re proprietati adsorbante.

- Cromatografie de repartitie, in care faza s tationara este o pelicula d e l i c h i d f ixatape un suport solid (ex. SiCy, faza stationara l ichida nefiind misc ib i l a cu fazamobila.

- Cromatografle de schimb ionic, Tn care faza stafionara este un compus macro-molecular reticulat , care cont ine un n u m a r m are de grupar i func t io na le ac idesa u bazice, capabile s a schimbe protoni s au ioni alcalini c u cat ioni bi s i tr ivalenli(gruparile acide) sau anioni precum OH~, Cl ~ etc. cu an ion i m ai grei si cu sarcinam ai mare (gruparile bazice); schimbatorii de ioni se mai numesc si rasinicationice (sau cationit i) s au anionice (sau anionit i) .

- Cromatografie de excludere sterica sau de excludere - difuzie, Tn care faza stal ionaraeste dc regula un gel, care se comporta ca o si ta moleculara f ixand anumi temolecule s i e l iminanc l altele Tn func t ie de mar im ea , respec t iv masa lo rmoleculara .


12/27

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA $l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

H nepolari

H polari

— I neionici

ionizabili

ionizabili

f a z i S dircctd normala :Liclirospher/Superspher Si, CN ,

DIOL.NH;, AliispherAlf a z f i i n v c r s A : Lichrospher/Superspher

CN, RP-8, RP Select B, RP 18

PA H faza inversa: Lichrospher PAH

fazil invcrsS: Uchrospher/Supersphei-CN, RP 8, RP Select B, RP 18, RP 8e,

RP I8e, Purospher RP 1 8, R P 18e

f a z i inversil - percchi dc ioni:Lichrospher/Superspher RP 8, RPSelect B, RP 18. RP 8e, RP 18ef n / . a in versa cu control de p l l :

Lichrospher/Superspher RP 8, RPSelect B, RP 18, RP 8e, RP 18e

ionizabi l • fazil U i r c c l i i minmila :Aliispher A, A I

ionizabil - fazil invcrsa :Purospher RP 18, RP 18e, Aluspher

RP - Select Bionizabil - faza inversii cu clucnp'

alcalini: Aluspher R - Select B

neionici

ionizabil i

anioni anorg.ac. org.

puternicacid/bazic

cationianorganici

faza invcrsa: Lichrospher RP 8, RP 18, Purospher RP 18cu apa ca eluent, Lichrospher N H: , D10L cu apa/solv.org. eluent

faza invcrsa cu control de p H : Licherosphei/SuperspherRP 18, RP 18e, cu eluent de tampon: Lichrospher N H ? ,D1QL cu eluent/ tampon solv. org

I'azS inversii, pcrcchi dc ioni: Lichrospher/SuperspherRP 8, RP Select B. RP 18, RP8e, RP 18e

cromatografie de schimb ionic: Lichrospher ICCA,Polyspher ICCA

cromatografic dc .schimb ionic: Polyspher 1C A N - 1

3C1Z1

organic

monozaha-ride

mono-, di-zaharide

cromatografie dc cxcluderc ionica: Polyspher OA HY,O A K C

cromatografie d e excludere: Polyspher CHOHf az iS inversa: Lichrospher NH ;

romat. sch-ligand: Polyspher CHCA, CHPB

vcrsa: Lichrospher N H3

Analitichindi

Nota: R P

Chira-Dex, Chira-Dex GAM MA,Spher N T, Celulose triacetat

- fazS inversS

Whelk-01, ChiraSep DNBPG, Chira-

igura 1.4 Alegerea fazei stationare pentru molecule cu mase moleculare < 1000 u.a.m.

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICAT IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 23

n e o n c

I proteine, peptide [

—I acizi nucleic

cromatograf ie de gel permeat ie (GPC,SEC), c u e luent organic, Lichrogel PS

faza i n v e r s a c u s o rben t i c u p o r i m a r i :Lichrospher WP300RP18

fazS i n v e r s a c u s o r b e n t i cu por i m a r i :Lichrospher WP300RP18

cromatograf ic de gel permeat ie (GPC,SEC), cu eluent apos: Fractogel EMDGP C

cromatograf ie de excludere ionica:Fractogel EMD-TM AE, DEAE, DM AE,

SO *~ , -COO", hidroxilapatit

cromatograf ie hidrofobica ( H I C ) : \

Fractogel EMD-Propyl , Phenyl Ifaza inversa cu s o r b e n f i cu por i mar i :Lichrospher WP300 RP18

cromatograf ie de af ini ta te : F ractogelEMD Chelat , TA, Epoxy, Azlacton,Heparine

cromatograf ie de schimb ionic:Fractogel EMD-DMAE ,Hydroxylapat i te

zaharide

cromatograf ie de gel p e rmea t i e (GPC,SEC), cu eluen t apos: Po lysphe r C HN A, BIOGPC, DIOL 500

cromatograf ie de schimb ionic:Fractogel EMD-TMA E

faza d i r e c t s ( n o r m a l s ) : LichrospherNH,

Nota: GPC = gel permeat ion chromatographySEC = size exclusion cromatography

Figura 1.5 Alegerea fazelor stationare pentru molecule cu mase molecularemai mari de 1000 u.a.m.


13/27

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Fazastationary

inalta polar&

activitate

slabs

Faza m o b i l a

nepolari amestec deanali t i

nepolarS

polari

Figura 1.6 Schema triunghiulara de alegere a fazei stajionareadsorbante si fazei mobile

polaritntea gniparilor function fi l

Hie l roca rbur i Do-ivati oxigennti a i5 1 derivati hiilrocarlmrilor

Douoi ' i ti eproton

Coinpu.; iiouici

O O I O

// // I // „ „

"H, / / I i , l iF< H RX RNO , , R O R RC -OR R G - R R C - H i H C - W H R R j N H , ROH Ho AT OH RCftH Neudeoflde M H . - E - C O ,

compu s i i ceim s u p u t i n po la r

ADSORBTIE

— . . . . . . -— jy i i | > a functionsila

•— • J J T ZgrupSr i func t ion al e

_vt_._ 3 gj-unftri functioiuile R E PA RT I T I E

x» 4 grupiiri f imc t iona ta^s.— 5 saj| lna j i nn it e oj'upai-i func l iona le

coinpu.yi i cc i, na j ,, o i al .j

Figura 1.7 Ghid de alegere a procedeelor de adsorbfle $ i repartitie

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 25

In afara de aceste t i p u r i fundamenta le de metode cromatograf ice exista inca u n e l eprocedee cromatograf ice specifice, ca racteristice unor specii chimice, datorita u n o rin terac t iuni foarte selective; dintre acestea se pot m e n t i o n a cateva:

- cromatografia de aflnitate care se bazeaza pe propr ie ta lea unor adsorbant i macro-molecu lar de a manifesta o afinitate specifics pentru anu in i t i analit i . Cromatograf ia

de af in i ta te exploateaza caracteristicile func t iona te al e analif i lor, respectiv in te rac-(iunile specifice dintre moleculeie de analit ?i un l igand fixat pe un suport inertinsolubil (numi t curent, .suport imunoadsorbant"); i n fap t l iganzii ( C L I d i fe r i te masemoleculare) sunt inclu;i I n suportul solid, caruia T i confers specificitate (sau eel pufino m are selectivitate) pent ru anumi te m olecule de analit , fata de care mani fes ta oafinitate, legandu-le p r in covalenta .

- cromatograflachiraia, de adsorbtie sau r epar t i t i e care s e caracterizeaza p r in structurechi ra ia a fazei stationare sau a fazei mobile, ceea ce permite separarea selectiva aanalit i lor chirali , respectiv a enant iomer i lo r.

- cromatografia c u lichide supercri t ice, care ex ploateaza solubil i tatea anali t i lor Tntr-unfluid supercritic (ex. COi) ca atare sa u modi f ica t (ex. cu metanol), care asiguraextragerea analit i lor di n matrice, ce sunt apoi separati cromatografic.

- electrocromatografia capi lara micelaHi care este o tehnica h ibr ida care inibina croma-tografia cu electroforeza.

Desigur ca se poate face o clasif icare a metoclelor cromatograf ice ? i in f unc t ie deprocedeul practic utilizat si anume:

- cromatografla pe coloana, in care faza s ta t ionara este plasata in t r-o coloana(tub) de metal sau de sticla, sau de si l ice topita.

- crom atografia planurS sau de suprafa ta pe har t ie sau pe strat subt i re .

In func t ie de migrarea faze i mobi le se d i s t ing:• crom atografia prin developare in care analiti i raman pe faza stationara sau sunt loca-

l izati pe aceasta (ex. separarea clorof i lelor s i xantof i le lor pe carbonat de ca lc iu) i nfunct ie de directia de migrare; exista developare ascendenta sau descendants,monodimensionala sau b id imens ionala (migrar i in d i rec t i i perpendiculare, deci la

90°), circulars etc.• cromatografia d e elude, in care ana l i t i i sunt e lua t i pana la iesirea lor completa din

coloana, deci din faza stationara, f i ind posibila culegcrea succesiva a f rac j iuni lorde ana l i t i ; in acest caz detectia se face in e f l u e n t i .

Din toate clatele prczentate pana a ic i rezul ta ca intr-adevar n u este p o s i b i l a oclasificare unica , atotcuprinzatoare, general valabila pentru toate tehnicile si procedeelecromatografice de a n a l i z a ; dar este pos ib i la intelegerea c o m p l e x i t a t i i si nesti tafi id o m e n i u l u i analizei cromatografice, de unde si intelegerea ap l icab i l i t a t i i l a rg i in diversed o m e n i i a acestor metode, datorita se lec l iv i ta t i i (uneor i a specif i c i ta t i i ) lo r, ca si da tor i tasensibilitatii si in general a performantelor proceselor de separare, detectie, clozare,pur i f icare-preparare etc.


14/27

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICAT IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDiCAMENTELOR

.2. Bazele teoretice ale cromatografiei

1.2.1. Parametrii crom atografieiPe langa datele prezentate anterior trebuie sa se cunoasca o serie de noj iuni

;oretice general valabile, referitoare la procesele de separare cromatografica, not iuniare se pot transforma (adapta) tuturor metodelor cromatografice. De aceea, in cele cermeaza se fac referiri la cromatograf ia de lichide bazata pe repartitia unor analiti intreoua faze. Se admite ca trebuie sa se analizeze un amestec de analiti (diferiti), care~ebuie sa fie separati (aceasta fiind scopul princip al al cromatografiei); indi feren t deshnica aleasa, metodele au cateva aspecte comune:

- anali}ii d in amestec s e repartizeaza intre faza stationara si faza mobila, care suntnemiscibile (sau foarte p u f i n solubile un a in alta); intre cantitatile de analitirepartizati in cele dona faze exista un echilibru c e depinde de insusjrile fiecaruianalit faja de cele douS faze.

- adaugand continuu faza mobila , ,noua sau proaspata" are loc deplasarea echili-brului de repartitie, antrenand migrarea analitilor de-a-lungul fazei stationare, c uviteze diferite.

- separarea consta in eluarea continua a analitilor care migrand cu viteza caracte-ristica fiecaruia, parasesc succesiv coloana.

Pentru a intelege mecanismul separarii in cromatografia de l ichide (LC) deepartitie se admite ca se analizeaza o proba continand doi analiti A si B; se admite deisemenea ca se utilizeaza o coloana pregatita in prealabil prin fixarea pe particulele d euport inert, a unui film (pelicula) de lichid faza stationara, potrivita (compatibila cuinalitii). Apoi se introduce un volum de proba ( in metodele inalt performante se introducle l a cativa la cateva zeci de U .L d e solutie foarte diluata d e proba); se adauga apoi fazanobila putin cate p u f i n cand se produce developarea, adica migrarea de sus in jos amali|ilor, cu viteze diferite; continuand adaugarea fazei mobile s e produce elutia, adicaixtractia din coloana a fiecarui analit, pana la iesirea din coloana; i n aparatele actuale

le crom atograf ie, ef luentul se cond uce direct la detector in care se face detectia analitilor;eparati. I n figura 1. 8 sunt reprezentate aceste etape ale separarii cromatografice.

Din cele expuse se observa ca procesul de separare se produce treptat, intre faza;tationara si faza mobila existand un echilibru, dcterminat de concentratiile fiecaruimalit in faza stationara si faza mobila, al caror raport reprezinta coeficientul derepartitie sau de distributie:

[A] s _ CAS[A]m CAIH

(1.1)

CAs = concentratia lu i A in faza stationara

C A m = concentratia lui A in faza mobila

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA 1 CONTROLUL MEDICAMENTELOR 27

Bin ± Bs K D B = [B]s CB s[B]

(1.2)

CBs si CBm au acelea? semnificajii ca pentru A

proba faza mobila

1 I I T

(a)

to t 3 t 4detector

B/

(b ) A

to t i

Figura 1.8 Separarea componentilor A(.) si B ..) dintr-un amestec

a) Schema separarii succesive ; b) Seinnalul d e iesire al detectorului pentru cei doicomponent , i n functie de t i m p i i de elutie

Puterea d e separare a unei coloane depinde de mai multi factori, da r i n principaldepinde de vitezele relative de elutie care sunt determinate chiar de coeficienjii derepartitie ai celor do i a n a l i t i intre cele dona faze, stationara s i mobila . Ideal ar fi caacesticoeficienji de repartitie sa fi e independentde concentratia analitilor, ceea ce inseamnaca intotdeauna Cs sa fie proporti ona l cu Cm.


15/27

CAPITOLUL 1 CROWIATOGRAFIA. APLICATII iN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

Prin reprezentarea grafica a concentratiei ana l i t i lor A § i B separati, concentrateire este egala cu aria de sub pic, i n funcf ie de t impul de elutie ( re tent ie) sail v o l u m u l deiujie (retentie) se obtine cromatograma celor doi anal i t i asa cum se poate observa dinisura 1.9.

A

distanta parcursa

Flgura 1.9 Cromatograma amestecului substantelor A si B, respectivprofilele concentrapor picurilor In doua momente alemigrarii lor, adica la timpii ti s i tz

Din f igurile 1.8 si 1. 9 se constata ca substanta B este m ai puternic retinuta pe fazastationara decat substanta A, de aceea B se deplaseaza cu viteza mai mica; des igur caunbele substance parcurg aceeasi distanta d, egala cu lun gimea fazei stationare, dar cuk'iteze diferite.

v A =̂ (1 -3 )

(1.4)

L = lungimea coloanei de faza stationara in cm (sau m m)

Se mai constata de asemenea ca pe masura ce creste distanta dintre cele douapicuri, A si B, deci odata cu apropierea de baza coloanei, se produce o largire a celordoua p icur i , mai v iz ib i la la baza p icur i lor, ceea ce micsoreaza ef ic ienta separar i i lor.Trebuie precizat c a prin alegerca (stabilirea) unor conditii judicioase e st posibil ca accastalargire a p icur i lor sa se produca mai meet (lent) decat separarea, ceea ce inseamna orezolutic mai buna; aceasta implica o l u n g i m e mai potr iv i la (m a i mare ) a co loanei ;puterea de separare a unei coloane cromatografice se poate imbunata t i pr in cont ro lu lunor parametri cum sunt (vezi si rezolutia, f igura 1.26):

- cresterea vitezei de separare a p icur i lor ;- micsorarea vitezei de largire a p icur i lor.

CAPITOLUL 1 CROW IATOGRAFIA. APLICATII iN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR 29

In context se defineste t i m p u l de re tent ie maxim a l unui analit t R , ca f i ind t i m p u lcare s e scurge de la injectia (introducerea) probei de anal i t in coloana si apar i t ia (iesirea)picurilor ana litului la detector.

Pe de alta parte viteza liniara medie de deplasare a ana l i tu lu i in coloana, v m = L/t R ,este egala c u rapor tul d in t re lungimea L a coloanei si t i m p u l d e re tent ie . lar viteza l in ia ra

medie ,,u" a m oleculelor fazei mobile este data de raportul d int re lungimeacoioanei si t impulmort, u = L/t,,,; t impul mort t M este t impul necesar ca o specie neretinuta sau faza mobila(solventul) sa traverseze coloana p ana la iesire; evident ca este vorba de lungimea coloaneide faza stationara numita si lungime utila, si nu de lungimea tubului de sticla, silice sa umetalic in care se af la faza stationara. Trebuie precizat ca volumul total al coloanei V T esteocupat de faza stationara V s si de vo lumul fazei mobile V M , deci:

VT = VS + VM (1.5)

In legatura c u faza stationara trebuie sa se faca unele precizari:1. ea este formata di n particule fine solide, sferice (sau aproape sferice) pe

suprafata carora se produc interactiile cu analiti (ex. In crom atografia deadsorbjie);

2. ea este forma ta din particule f ine solide, care sunt suportul pe care se f ixeazafaza stationara l ichida ca in cromatografia de repartitie;

3. particulele de suport solid pot avea grefate sau adsorbite pe suprafata lorsubstante sau grupar i ch imice cu m sunt C8 , CIS etc , si care participa laprocesele cromatografice;

4. in coloanele capilare utilizate in cromatografia de gaze, faza stationara estefixata in stare omogena. sub forma unui film (p elicula) pe peretii interior aiacestora;

5. par t icule le de faza station ara se caracterizeaza prin ca t iva parametr i in t re carediametrul lor mediu (dp), omogenitatea m a r i m i i lor si suprafata specifics(SSp), dar si p r in diametrul porilor uno ra d in t re particule, asa cum se poate

vedea d in tabelul I . I S uprafa ta specifics a por i lor creste odata cu numaru l lorsi scade odata cu cresterea m a r i m i i lor.

Tabelu l 1 . 1 . Caracter is t ic i al e particulelor de SiO 2 in LC si Ch romosorb In GC

CaracteristiciDiametvul mediu al particulelor, dp in |ini

Diamet ru l med iu al pori lor, nm

Suprafata specifics SSp in m /g

Porozitatea tolala, et

Perrneabil i tatea, K°=dp2/O (cm2)

S i O z T n L C

3- lOj im

6 - l O n m

400- lOOOm2/Q

- suport poros: 0,80- suport ueporos: 0,35-0,40

I 0 "9cm 2

Chromosorb i n GC1 50-180 Jim

(80- 10 0 mesh)

300-4000 n m1 00-500 in 2 /"

-

10' 7 cm 2


16/27

JO CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATH IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR 31

Volumu l dintre particulele (granulele) d e faza stationara, numit si volum inter-;titial sau intergranular, este ocupat de faza mo bila, se noteaza cu VM si se numeste vo lumnort; el a fost definit mai sus. Vo lumul mort este egal cu suma volumului porilor, care;e umple cu faza mobila si se numeste volum in tragranular Vp si volumul n t r ag ranu la r\n (Figura 1.10):

Volum intragranular, Vp

Volum intergranular, V ]

Figura 1 . 1 0 Volumul intra si intergranular

VM = Vp + Vi (1.6)

Volumul coloanei goale (a tubului de sticia sau silice) Vcol, cu lungimea L sidiametral interior d.i. sau (dcol) se poate calcula astfel:

Porozitatea totala a coloanei, respectiv a tu turor granulelor de faza stationara, e tse poate calcula fScand raportul dintre volumul mort si volumul coloanei, deci:

V Met = Vcol

(1.8)

Aceastl porozitate este suma porozitatii intragranulare £ p si a celei intergranulare,

Et = Ei + £p

Vi .£ i — T ~ ; r ia r £ n — .Vcol H Vcol

(1.9)

(1.10)

In cazul pa rticulelo r solide neporoase Vp = 0. e p = 0, iar volumul mort este egal cuVm = Vi volumul in tergranular ; evident ca si porozitatea totala este egala cu volumulintergranular, e l = Vi , f i ind cuprinsa in intervalul 0,35 - 0,45, ceea c e Inseamna ca peste60% din volumul coloanei este ocupat d e gran ule neporoase al e faz ei stationare. In cazulparticulelor poroase e t = 0,85, coloana este ocupata de granule poroase in proportie d epeste 80-90%.

Diferentele dintre ma r imi l e date in tabelul 1.1 pe rmi t cunoasterea permeabilitatiispecifice a coloanei, K°, care caracterizeaza usur inta cu care faza mo bila poate traversacoloanacromatograf ica si sa se evalueze calitatea umpler i i coloanei care are d imensiuneaunei suprafete si care s e poate calcula cu ajutorul relatiei (Kozeny-Carman):

sau

K u = -

(1.11)

(1 .12)

Calitatea umple r i i este caracterizata de permeabilitatea K °, care creste cu patratuldiametrului particulelor dp. In relajia (12) 3> este factorul de rezistenta la curgere,exprimat pr int r-un numar ( fara d imensiuni) care depinde de forma granulelor, deporozitatea lor, d e textura lor si de calitatea umpler i i coloanei si pe exprima' prin relatia:

I S O ^ l - E f ),3 (1.13)

Valoarea numerica a factorului de rezistenfa este egala cu =500 pentru granuleleporoase cu forma regulata, sferica si cu 0=1^00 pentru granulele poroase cu formaneregulata.

De altfel curgerea unui lichid s au fluid - faza mob ila se poate datora gravitatii sa uunei presiuni care s e exercita asupra fazei mob ile cu ajutorul unei pompe T n cromatogra-fia de lichide si cu fluide supercritice, sau de catre un gazsub presume in cromatografiain faza gazoasa.

Pe de alta parte, faza mobila, dar mai ales coloana, adica faza stationara, provoacao rezistenta la curgere; curgere care s e caracterizeaza prin viteza ei liniara meclie, v m ,care se exprima in m/sec, si prin relatia:

v m = L / t m (1.14)

L = lungimea coloanei

t m = t impul necesar fazei mobile pentru a parcurge distan{a L

Viteza liniara medie vm depinde de temperatura, de presiunea impusa fazei mobi lesi de natura coloanei (adica a fazei stationare); ia r la temperatura constants aceasta vitezase exprima pr in rela|ia urmatoare (Darcy):

0A P K

v m = viteza l iniara medie de curgere, in m/ s

(1.15)

\


17/27

32 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATH IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

K° = constanta de permeabilitate a coloanei, expr imata in m f i ind dependents dediametral particuleior dp pentru o coloanS um pluta

L = lungimea coloanei, in m

il = vascozitatea fazei mobi le in pascal-s, Pa-s (IPa-secunda = 10 poises)

AP = pierderea

d e sarcina (greutate)

in pascali

(1 Pa = 10"

5 bar = 9,8 10 "6atm)

Pierderea AP reprezinta diferenta d in t re presiunea impusa fazei mobi le la intrareain coloan a (Pe) si p resiune a observata la iesirea din coloana (Ps):

AP = Pe - Ps (1.16)

Desigur cS pentru a realiza o separare buna a analifilor trebuie sa se stabileasca oviteza l iniara optima d e curgere a fazei mobile, ceea ce implica o alegere judicioasa apresiunii impose Pe; de asemenea trebuie sa se Jina seama ca pierderea AP (de caredepinde calitatea separarii) depinde de vascozitatea fazei mobile si de permeabilitateacoloanei K ° dependents l a randul ei de lun gimea sa, L. Pierderea AP se poate dedu ce din

relatia (1 .15) :

AP = (1.17)K°

Pierderea AP se poate e x p r i m a si in func{ie de diametru part icule ior, dp si defactorul de rezistenja O astfel:

AP =Vm Lr|

di(1.18)

Avand in vedere ca vascozitatea l ichidelor este de cca. 10 0 d e o ri mai mare decataceea a gazelor, p res iuni le necesare in c romatograf ia de l i ch ide (HPLC) t rebuie sa fiede cca. 100 de ori mai m a r i decat in c romatograf ia in faza gazoasa (de ex. vascozitateaapei la 20° este egala cu Pa-s =10"J Pa-s ia r p res iunea he l iu lu i - gaz purtator in GC, esteegala cu t| = 1 ,94-10° Pa-s).

Considerand o coloana HPLC de 20 cm lungim e si c u particulele de 10 tun, pent rua obtine o viteza liniara medie de 10"2 m/s trebuie sa se u t i l izeze o presume de intrare Pede cateva sute de bari, deci de cateva sute de atmosfere. Deoarece l i ch ide le nu suntcompres ib i le (pana la cca 600 bari) viteza fazei mobi le este practic constanta, in schimbin gazcromatografie, gazele f i ind com presibile, viteza fazei mobile nu mai este l in ia rasi nici constanta, ea creste cu lungimea colo anei, deci a distantei parcurse.

Performantele analitice a le coloanelor c romatograf ice sunt determinate de carac-teristicile acestora, respectiv de na tura fazei station are si in acest context s e impun unelelamur i r i p r iv ind factorii sau parametr i i c rom atograf ic i.

CAPITOLUL 1 CROMAT OGRAFIA. APLICATH IN ANALIZA §l CONTROL UL MEDICAMENTELOR 33

Pentru a infelcge fenomenele implicate i n separarea cromatografica este necesarsa se cunoasca structura discret discontinua a t ransferului de masa (d e analifi) princoloana, imaginandu-se ca o coloana este alcatuita d in t r-un num ar foar te m are de ,,ctajeminuscule" numite , ,platouri teoretice", masade analiti transferandu-se de pe u n platou p ealtul, conform unei succesiuni continue d e echilibre de transfer (conceptul este oarecumasemanator distilarii l ichidelor intr-o coloana de distilare). Trebuie sub liniat faptul ca teoriaplatourilor teoretice are neajunsul ca ea considers cromatografia ca o suits discontinua d eoperatiuni, deci de echilibre si ca f iecare echilibru se realizeaza separat si integral, ne t inandu-se seama de fenomenul de difuzie si de curgerea continuS a fazei mobile, care micsoreazaschimburile (transferurile de masa). De aceea a n aparut si alte teorii In aceasta privinta, in t recare teoria cinetica, In care se ia in considerare aspectul dinamic al fazei mobile si inf luentatemperaturii si a presiunii asupra curgerii si implicit asupra separarii cromatografice.

In acest context este necesar sa se discute d i s t r ibuf ia / repar t i fia anal i | i lor in t re douafaze, curgerea fazei mobile (care provoaca separarea anali^ilor) si elutia succesiva aanalitilor s i detectia lor.

Distrlbiitia termodinamM a analit i lor intre faza stationara si cea mobi la candconcentratiile lor nu sunt ma ri, respectiv cand faza stationara nu este saturata in ana l i t i ,se admite ca este regulata si independents de concentra^iile (cantitatile) altor substanteprezente. T n acest caz intre concentratiile unui analit in faza stationara, Cs, si in fazamobila C M , exista o relatie l iniara, exprimata pjin relatia:

Cs = (1 .19)

K p j = este coef icientul de distribute al unei substanteintre substante intre cele douafaze.

Trebuie subliniat ca in cazul cromatografie gaz-lichid (GL) n u se utilizeazacoef icientul d e distributie c i coef icientul de repartitie, in cromatografia de adsor btie seutilizeaza coeficientul de adsorbtie, ia r in cromatografia pe gel este valabila constantade difuzie.

Marimea K D se numeste , ,coeficientul termodinamic de distributie", putandu-seexprima in functie de ,,entalpia libera standard de distribute , AG s/i corespunde diferenteientalpiilor libere, rezultate din transferul unui analit standard c u dilutie in f in i t a di n fazamobila, catre faza stationara:

AG ° = - RT I nKo (1.20)

Coeficientul t e rmod inamic de distributie se poate exprima si prin u t i l izarea,potenjiale or chimice" standard, |i , ale analitului i n fiecare d in cele doua faze:

RT RT (1.21)


18/27

34 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA $l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

De aceea, potent ia lul chimic standard, care ar e d imens iuni le unei energi i /mol ,trebuie sa fi e Tnlocuit cu potent ia lul ch imic (0, care rezulta di n in te racf iuni specifice,io n ice sail m oleculare, la care este supus analitul din partea fazei stationare si a fazeimobi le . Potent ia lul chimic es te mul t in f luenta t de temperatura si de polaritatea compu-silor, dec de activitatea a = fC, f fi ind coeficientul de activitate (totdeauna subunitar;cand f= l , a=C ), iar C este concentrajia:

(j. = (J ° + RT In a

La echilibru cele doua potentiate ch imice sunt egale:

(1.22)

U .s = M m , respectiv: In a s H - RT l n a m (1.23)

i a r

(is - H m = R T I n a m - R T I n a s

rn̂RT a s

Prin urmare:., i 3m as

I n KD = - In — = I n — = I n3s am

(1.24)

(1.25)

(1.26)

In sfarsit, daca se considers ca in solutie diluata coeficientul de activitate alanalit i i lui ar e valor i foarte apropiate si foarte mici:

C CIn KD = I n -^ — iar KD = T T~

Cm Cm(1.27)

Coeficientul termodinamic de distributie KQ este prin urmare o caracteristica aunui analit dat, in conditii bine determinate; i ar in condi t i i identice ana l i t i i care a u na tur idiferite au evident coeficienti de d is t r ibut ie d i fer i t i , ceea ce permite separarea lo rcromatograf ica .

Trebuie Tnsa precizat ca bazele teoretice a le variafiei potenfialului chimic standard,A|_ i sunt mai comp licate, dar scarile de polaritate stabilite m ai mul t emp i r i c sun t utilizatepent ru expr imarea unor interactiuni si anume:

- seria eluotropa (a lu i S nyder), care descrie energia deadsorb(ie E Q a molecule lor fazeimobile p e unitatea de suprafafa de adsorbant, ceea c e exprima forta eluanla a fazeimobile;

- polaritatea (P') a solventilor calculata dupa R ohrschneider plecand de la d atele expe-r imenta le efectuate in cromatografia de gaze;

- parametrii de solubilitate, 5 (a lui Hildebrand) care reprezinta energia necesarapentru a transforma un mo l de solvent di n stare l ichida in stare gazoasa in conditi inormale, se bazeaza pe masuratori entalpice;

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII TN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR 35

A

In procesul cromatograf ic o importanta deosebita o are ,,curgerea separativa afazei mobile" care implica deplasarile separative s i profilul elufiei .

Curgerea fazei mobile per turba echi l ibrele de d is t r ibut ie a ana l i tu lu i in t re celedoua faze, stationara s i mobi la , ceea c e determ ina deplasarea succesiva a e c h i l i b r u l u i T ncoloana, astfel ca pe masura ce au loc aceste deplasari se creeaza echi l ibre noi cu faza

stationara. Deplasarile ana l i f i lor de-a lungul coloanei sunt determinate d e doua procesem ai importante si anume:

« de , ,fenomenul de transport" prin antrenare si prin difuziune Tn faza m obila, care nueste selectiv dar care este guvernat de viteza de curge re a fazei m obile.

« de ,,procesul de reteinle selectM" a analitilor, retentie care se datoreaza afinitatiifiecarui analit fafa dc fazele stationara si mobi la , afinitati care se expr ima l a randuilor prin coeficienjii de distributie (Figura 1.11).

De subliniat ca , , transportul T nfaza mobila" (care se face Tn sensulcurgerii), prin antrenare sau translatieare loc datoritagravitatiei sau datoritapres iuni i impuse u n u i f lu id cu opompa (c a Tn cromatografia de lichidesau cu fluide supercritice) sau prindetenta unui gaz aflat sub presiune (cain crom atografia Tn faza gazoasa).

Curgerea un ui fluid dep inde sieste deci inf luenja ta si de rezistentala curgere datorata vascozitSfii fazeimobile, de permeabilitatea coloaneisi d e pierderea de sarcina. despre care s -a vorbit anterior.

Transportul se face, asa cum s-a mai aratat, s i prin d i fuz iune , Tn cazurile Tn careconcentratiile unei substante Tn diferite puncte ale acestuia, sunt diferite. In astfel decazuri datorita tendinte i de omogenizare a concentra t i i lor se produc o miscare amolecule lor de substanta dinspre zona mai concentrata spre aceea m ai diluata. Aceastamiscare se numeste d i fuziune si se poate evalua prin legea lui Pick, care coreleazadifuziunea, deci m iscareasubstanj;ei, respectiv in tens i ta teaf luxului J cu t raversarea une isuprafete S , cu coeficientul de d i fuz ie D si cu di ferenta de concentra t ie ,,dc" existentaTntre doua puncte a le m ediulu i, Tntre care exista distanta dx :

B

Figura 1.11 Profilul Gaussian al celor doi analitiseparati prin migrarea (deplasarea) lor

dx(1.28)

Coeficientul de d i fuz iune D este o m a r i m e caracteristica a unei substante, f i indlegata de ma r imca ei Tn conditii date de tem peratura, vascozitatea mediu lu i s i t inandseama si de natura ei; D se exp r i ma Tn m /s. Pentru de terminarea exper imenta la acoeficientului de d i fuz iune , in cazul uno r mo lecu l e mic i dizolvate T n apa, se poate u t i l izarelatia:


19/27

36 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

(1.29)

T n care / este coeficientul de frecare, exprimabil prin relafia:

/ = 6pNrq (1.30)

T n care:

r = raza moleculelor considerate de forma sferica

N = numarul lu i Avogadro (notat astfel pentru a-l deosebi de numarul de platouriteoretice N )

/ = vascozitatea mediului

Trebuie subliniat faptul ca deplasarea pr in d i fuziune este mul t mai mica (slaba)decat aceea p r i n curgere, coef icientii de d i fuz iune f i ind d e 1 0 - 103 ori mai mic i i n l ichidedecat Tn gaze. Fenomenele de difuzie sunt mai accentuate si dcci mai importante incromatografia de gaze, datorita vascozitatii mai mici a mediului (fata de cromatograf iade l i ch ide) , in tervenind in t r-o masura importanta i n largirea benzilor (p icur i lor) mai alesT n GC .

Deplasarea unui analit si Tn general a une i substante Tntr-o coloana cromatograf ica,de ex. in cazul cromatografiei de repartitie, poate fi asemuita cu un transfer de masa asubs tanfe i , repetat de un n u m a rfoarte mare de ori, conform unuinuma r tot atat de mare de echilibrecare se st bilesc si se distrug'.Aceste transferuri se fac de pe niste,,niv eluri" sau ,,etaje" extrem de in-guste, pe altele, succesiv, numite, ,platouri teoretice", care sunt infond niste niveluri imaginare intr-ofaza stafionara reala, asa cum sepoate observa din figura 1.12.

Transferul de masa, respec-ti v deplasarea selectiva a u n u ianalit Tn coloana cromatograf ica seface Tn condi t i i experimentale binedeterminate (granulatie, porozi-tate, t ip de faza mobi la , concen-tratie de analit , temperatura etc).Pe baza teoriei platourilor teoreticese poate aprecia c a dupa un anumitparcurs in coloana, profilul con-centratiei ana l i tu lu i i n faza mobi la

analit +faza mobila

-frits

Figura 1.12 Repre zentarea intuitiva a ,,platourilorteoretice intr-o coloana cromatograf ca


este de tip Gaussian, deci poate fi asemuit cu o curba Gauss. Aceasta Tnseamna ca la unmoment dat a l migrar i i cromatografice, substanta este localizata pe un platou (imaginatca o suprafata orizontala extrem d e tngusta) al coloanei si se distribuie simetric Tn j u r u lunei v a lo r i maxime cu ordonata y 0 s i abscisa x 0 .

In f igura 1. 13 este prezentat traseul geometric al unei curbe Gauss si ecuatiei uneiastfel de curbe, fiecare punct f i ind caracterizat prin ordonata lui, y, si prin distanta x Tnraport cu axa de simetrie a ordonatei y p.

y = . y o(x-xo)

2a 2 (1.31)

0,507 -

Figura 1.13 Traseul geom etric al curbei Gauss, reprezentand profilul concentra|ieiunui analit In cursui procesului de separare cromatografica

A§ a cum se observa, curba Gauss este simetrica prezentand un maxim B si douapuncte de inf lexiune E si F. Pentru ordonata maximului curbei se atribuie valoarea

yO=l ,000; punctele de inflexiune E 5 F au ordonatele egale, y E = Y I: = 0,607, iar distan telelor Tn raport cu axa de simetrie (BD) sunt egale cu abaterea tip o, prin urmare largimeapicului Tnlre punctele E si F este cgala cu 2a. Pe de alta parte, semi-Tnaltimea p icu tu i esteegala cu y\/2 = 0,500 ia r l a rg imea p icu lu i pentru aceasta valoare a ordonatei este egalacu 2,34a.

Examinand cu atentie curba se observa ca ea se Inscrie intr-un t r i u n g h i isoscel,AGI, al e carui l a tur i m ai lungi sunt tangente la curba Tn punctele de inf lexiune. D easemenea s-a stabilit tot prin co nventie ca inal t imea t r iunghiu lu i este egala cu ordonatapunctu lu i A , deci y A = 1,200, iar la rgimea sa la baza este egala cu latura G I = 4o.

Este important de observal ca abaterea tip, sau mai bine varianja o 2 are o distantade migrar e egala cu Z si reprezinta dispersia substantei T n coloana, i ar cresterea largimii


20/27

38 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICAJII IN ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

curbei Gauss (deci a p icu lu i ) se poate expr ima prin cresterea var ianje i da , dupS odeplasare egala cu dZ (vezi figura 1.14), deoarece cresterea do 2 este proportionals cudeplasarea dZ; in acest context se poate scrie:

0z (1 .32)

Factorul de proportionalitate se noteaza cu H, el f i ind o caracteristicS datorataanalitului, naturii fazei stationare, naturii fazei mobile, ca si cond itiilor de separarecromatografica cum sunt debitul fazei m obile si temperatura; factorul de prop ortion ali-tate este independent de deplasare; pc baza acestor consideratiuni se poate scrie pentrucresterea varia ntei egalitatea.

do 2 = HdZ (1.33)

In continuarea acestor rationamente se poate considera ca la intrarea in coloana,largirea p r in d i fuziune 0 0 este n u l a (deci Z=0), ea f i ind m axim a dupa parcurg ea de catre•analit a intregii coloane cu lungimea L. Prin extrapolarea inicii deplasari dZ la intreagacoloana m a r i m i l e discutate dz devine L, o^ +dz dev ine OL iar da devine Aa L ; prin

u rmare se poate scrie:

a 2 -O n (1.34)

insS O Q = 0. ceea ce f ace ca ecuajia (1.34) sS devina:

de unde:H = -r k ia

(1.35)

(1.36)

Se poate spune ca deplasarea analitului in coloan a se traduce pr in deplasarea curbeiGauss, care impr ima largimea e i (deci a picului) si este determinata de d i f u z i u n e si demiscarea de translate (F igu ra 1.14).

Factorul de propo rfionalitate H corespunde, cresterii variantei curbei Gauss peunitatea de lungime a migrar i i ; iar confo rm teoriei p la tour i lor teoretice coloana croma-tografica este asemuita unui numar foarte mare de volume elementare, considerandu-seca in fiecare dintre acestea se realizeaza un echilibru perfect de d i s t r i bu t e a ana l i tu lu iintre faza mobi la si aceea stationara. Notiunea de volum elemental' se poate inlocui cunot iunea de ina i t ime, deoarece sectiunea coloanei are o suprafata constants, respectivraportul dintre volum § i aceastS suprafata; in acest f el se ajunge la a considera factorulde proport ional i ta te H ca f i ind inaltimea platoului teoretic pentru coloana utilizata,inai t ime care se expr ima in mm (dar H poate avea si alte dimensiuni; a se vedea maideparte). Cunoscand ina l t imea p la toulu i teoretic si lungimea coloanei se poate calculan umaru l de platouri teoretice pentru o anum ita coloana.

N = (1.37)


translate

difuzie

difuzie

z+dz

Figura 1.14 Deplasarea analitului ?i largimea curbei Gauss (picului)

O mare importanta in analiza cromatografica o are, , ,elufia analitului", respectiv, ,obtinerea picului crom atograflc". Separarea cromatografica implica in mod necesar migra-rea completa a analitului prin toata faza stationara pana la iesirea completa din coloana.Aceasta migrare depinde de afinitatea fazei stafionare fata de analit. de caracteristicilecoloanei (tipul de faza stationara, marim ea particulelor, porozitatea, suprafata specifics etc)si de volumul d e faza mobila adaugat, care curge prin coloana.

Pentru o substanta nerejinuta in coloana, deci nesupusa proceselor cromatogra-fice, este suficient un vo lum de faza mobi la egal cu v o l u m u l moil, V M , pent ru a culegesubstanta la iesirea din coloana; cu alte cuvinte o astfel de substanta se e l imina in frontulfazei mobile.

In realitate substantele de anal iza t aflate in amestec au o anumita afinitate fa{a defaza stationara, determinata de structure lor chimica § i de m a r i m e a mo leculelor lor. D eaceea, cand f rontul fazei a junge la iesirea di n coloana, ana l i j i i sunt cu atat mai pu t indeplasati in coloana cu cat afinitatea lor pentru faza stationara este mai mare. Iar pentrueluarea analiti lor trebuie sa se adauge u n volum de faza stationara cu atat mai mare cu

cat ei sun t mai retinufi in coloana, respectiv p e faza stationara.Pentru un amestec de analiti este posibi l sa se ut i l izeze un detector, plasat cat mai

aproape de iesirea ef luentului din coloana, si sa se inregistreze continuu semnalul analiticcare este propor t ional cu var ia t i i le con centra t i i lor analiti lor separati si e lua t i si careevident traverseaza coloana, obtinandu-se cromatograma corespunzatoare, inregistratade un Tn registrator (recorder) care face par.te din ansamblul componentelor ins t rumen-tu lu i d e analiza cromatografica.

Prin urmare pentru fiecare analit , intensitatea semnalulu i detectorului , t ransmiscatre inregistrator, este proport ionals cu cantitatea de analit di n proba analizata; f i ecaru ianalit i i corespunde in consecinta un pic pe cromatograma, care s e inregistreaza intr-unsistem de coordonate drepte; traseul unei astfel de cromatog rame este dat in figura 1.15,pe care sunt inscrise s i cateva mar im i fundamentale .


21/27

40 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR

to sau VM

dR s au tR sau VR

liniade baza

b d (cm) saut (mi n) sauV (mL)

Figura 1.15 Traseul unei cromatograme si picul componentului separat

d R = distanta de la inceputul procesului cromatografic la maximul picului

b = largimea picului l a baza, egala cu baza tr iunghiului in care se Tnscrie cea m ai mareparte a curbei Gauss

h = inaltimea picului cromatografics = suprafata de sub pic, cuprinsa intre abscisele G si I si curba Gaussto = t impul mor t

VM = volmnul mort ; VR = volumul de retentie; tR = t impul d e reten^ie.

Pentru intclegerea corecta a proceselor cromatograf ice si pentru utilizarea corectasi eficienta a metodelor cromatografice de analiza trebuie sa se cunoasca o serie deparametri sau ma r imi , care definesc si explica procesele crom atografice de separare.

(A ) Mlrimi de retentie, care caracterizeaza retinerea analifi l or in coloana cromato-graf ica, respectiv pe faza stationara, m a r i m i exprimate in t imp , voluin , distanta sifactor de retentie (numit si raport de retentie). Toate aceste m a r i m i sunt legate decoef icientul d e distribute al ana l i tu lu i K D, intre fazele stajionara s i mobila (distanta

de retentie notata cu da s e poate Tnlocui c u t i m p u l de retenlie tR sau cu v o l u m u l deretentie VR cu care este proport ionals) .

- t impul d e retenfie este egal cu timp ul scurs de la intvoducerea probei de analit incoloana si momentul i n care iese maxim ul p iculu i d in coloana (deci concentrajiama x ima) .

De notat cS vi teza de tnregistrare a picului este cons tants , ia r masurarea d i s tan te i d Rpermite sS sc cunoasca t impul de retentie 1R. E l u e n t u I (faza mobila) neretimit decoloana iese mull ma i repede di n aceasta, ia r t impul necesar ca f a za m o b i l a sa a j u n g i lla detector se noteaza cu t0 sau tM si se numeste t imp mort. Acest t imp se datoreazaparcursu lu i o b l i g a t o r i u al f a z e i mobi le prin spa|i i le m t e r s t i f i a l e (d in t re particulele defaza s ta t ionary) ca si volumelor moarte ale d i f e r i t e l o r par t i co mponente a le apara tu-l u i .

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII IN ANALIZA SI CONTROLUL MEDICAMENTELOR 41

De regula eluentul iesit d in coloana este detectat pr int r-un semnal sau pic aldetec torulu i ( p r i m u l pic in figura 1 .15) si Tncepand di n acest m o m e n t scmasoara t i m p u l de retentie al ana l i tu lu i , t i m p care se noteaza cu t R si se n u m e s t e, , t imp d e retentie corectat", el calculanciu-se astfel:

t'r = t R - t M (1.38)

• vo lumul de retentie, se noteaza cu VR ( v o l u m u l de retentie brut) si el reprezintav o l u m u l de faza mobi la necesar pentru a aduce ana l i tu l cu concentraf ia samaxima in detector; v o l u m u l de retentie se poale deduce din t impul de retentietR si in acest caz trebuie sa se f ina seama de v o l u m u l mort de faza mobi la ,respectiv de v o l u m u l mort a l coloanei, care trebuie sa se scada di n v o l u m u l brutde retentie obt inandu-se astfel, v o l u m u l d e retentie corectat (sau redus; v o l u m u lmort se poate nota c u V Q iar cu t im pul mort to) .

V'r = V R - V M (1.39)

raportul de retentie, notat cu RR, se expr ima prin raportul dint re viteza medie dedeplasare a ana l i tu lu i VA s i viteza medie de deplasare a fazei m obi le (sau asubstanfelor neretinute) VM :

VM(1.40)

sa u daca se inlocuiesc VA ?i VM , cu expresiile lor in care se in t roduc l u n g i m e acoloanei L si t i m p u l de retentie tR , respectiv t i m p u l mor t IM , se obtine pent rurapor tul de retentie expresia:

- L ' - L - - L (1.41)tM

L /t R _ tM(1.42)

este posibil de asemenea sa se inlocuiasca raportul tM/tR c u rapor tul volum elorcorespunzatoare VM/VR sau cu

(1.43) M VM

KR — ~; — 7^dA VR

d^ = distanfa parcursa de vo lumul mort de faza mobi la ( V M )

d A = distanta pana la maximul picului analitului A; ambele aceste doua m a r i m ise pot masura pe cromatograma

Rapor lu l de retentie are o valoare subunitara iar valoarea sa maxima poate fi egala cuuni ta tea a tunc i c:ind o s u b s t a n f i nu este r e f i n u t a pe coloana, caz in care substanta sedeplascaza cu aceeasi v i t e z a ca si faza mobi la .


22/27

CAPITOLUL 1 CROMATOG RAFIA. APLICATII N ANALIZA ?l CONTROLUL MEDICAMENTELOR CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATII [N ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAMENTELOR 43

• factorul de retenfie sau d e capacitate, notat cu k' se exprima prin raportul dintrecantitatea de analit care se gaseste i n faza stationara, Qs, si cantitatea de analitcare se gaseste in faza mo bila, QM ; uneori se utilizeaza pentru factorul decapacitate simbolul K, dar este preferat k' care arata ma i bine ca acest raport nuare o valoare constants, decat in conditii bine stabilite:

k' = Q s CsVs KpVsQ M V M

(1.44)

Exprimarea ,,factor de retentie" este de preferat in locul aceleia de ,,factor decapacitate" pentru a se evita confundarea acestuia cu ,,capacitatea coloanei" referi-tor la cantitatea maxima de subslanja care poate fi fixata pe coloana. Trebuiesubliniat ca marimile de retenfie depind de substantele implicate in procesulcromatograf ic sj de coloane, respectiv de faza stationara, de aceea ele se pot exprimaunele prin altele.

Astfel, volumul de retentie VR se poate exprima in funcfie de coeficientul dedistribute KD si fracfia molara a a n a l i t u l u i in faza mobila. Analilul se deplaseazaprin coloana numai atunci cand el se gaseste in faza mobila, de aceea cantitateal u i in faza mobilS se poate exp rima prin fracfia sa molara in aceasta faza, careeste egala cu raportul analitului in faza mobila, QM si cantitatea totala de analitintrodusa in coloana, Q T. Aceasta din urma este egala cu suma QM si Qs, deciQl = QM + Qs , astfel ca raportul de retentie s e poate exprim a astfel:

RR =O M Q M

cum Q s = ia r QM = CM V M , raportul de retentie devine:

RR =

(1.45)

(1.46)

Pe de alta parte Csexpresie:

_ M _ M ~ ~

C M V M + C S V S

, astfel ca raportul de retentie primeste o alt3

VMtR ~ VR ~ C M V M + K D C M + K D V S

de unde se poate deduce v o l u m u l de retentie astfel:

(1.48)

Aceasta este una din r e l a f i i l e fundamenta le al e c romatogra f ie i , pen t ru u n a n u m i tanali t si evident pentru condi(i i experimentale bine definite, i n t r e care in p r i m u l randt impul , t empera tura , p rcs iunea e tc . Relat ia (1.48) leagi v o l u m u l d e r e ten t ie cu coe-f i c i en tu l de d i s t r ibute KD 5 1 cu vo lumele de fazS s t a t ionara $ i mobi la .

- Pentru exprimarea volumului de retemie si a timpuhu de retemic in f u n c f i e defactorul de retentie, k' se pleaca de la expresia volumului Vs in f u n c f i e defactorul de retentie (vezi relafia 1.44):

k ' = ^? d e u n d e V s = ^ (1.49)

Prin inlocuirea V s cu valoarea sa din relatia (1.48) se obtin:

V R = VM + KDVS = VM = VM + k'VMdeci:

Ecuatia (1.50) s e poate scrie sj sub forma urmatoare:VRV M

= 1 -k'

(1.50)

(1.51)

Tinand seama ca acest raport este egal cu raportul de retentie, conform ecuajiei(1 .43), ca si de faptul ca raportul de retentie este egal cu rapor tul t M / t R (conformecuatiei 1 5 1) se deduce o ecuatie referitoare la timp, deci:

D VM M V iR R = TT~ =.T~ =

1V R ' tR 1 + k'

= t M ( l + k ' )

(1.52)

(1.53)

iar daca se inlocuie$te tM cu valoarea sa I M = L / V M se obtine o rela tie care aratSimportanja deosebita a vitezei fazei mobile asupra t impului de retenjie:

L k') (1.54)

- In acest context se potvalor ifica ecuatiile 1.52si 1.53 pentru calculareafactoruluide retentie k' , plecand d e la t impii de retentie masurati pe o cromatograma:

t R - t Mk' =tM

(1.55)

sau daca s e tine seama ca tR - IM = tR (timpul de retentie corectat) se objine:

(1.56) '' = ^tM

Valoarea f ac to ru lu i de capacitate cre?te odata cu t impul t ̂ cu care este proportional.Timpul mor t tM este cons tan t pen t ru o coloana data, pentru o subs tanfa nere t inu ta ,t R = tM ia r k'=0;


23/27

44 CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLiICAJII IN ANALIZA §l CONTROLUL MEDICAMENTELOR

In temeiul celor discutate se poate aprecia ca optimizarea proceselor cromato-grafice in faza lichida necesita cautarea unui compromis intre valorile k' cerute pentruo separarc b una a anal i t i lor s i t impul d e analiza care t rebuie sa fie cat m ai scurt posib il.

1.2.2. Eficacitatea coloanei cromatograficeEficienta coloanei cromatografice care se traduce prin eficacitatea separarii

cromatografice depinde i n pr imul rand de numarul de platouri teoretice, f i ind cu atatmai mare cu cat acest numar este mai mare (este o situatie simi lara si in cazul extractiei,ma i ales in faza solida). Pr in urmare un analist isi poate da seama de eficienta uneicoloane cromatografice, pe care o utilizeaza, prin determinarea numaru lu i de platouriteoretice al coloanei (data de relatia 1.57) care caracterizeaza functionarea coloanei.~ N u maru l de p la touri eoretice depinde de geometria si natura chimica a fazelor stajionarasi mobila, dar s.i de toti ceilalti factor care influenteaza repar t i t ia analitului in fazastationara si mobila.

N = ^ - (1.57)n

De aceea, a§a cum s-a aratat anterior, valoarea inaltimii platoului teoretic (sautalerului teoretic) depinde nu numai de lungimea coloanei ci si de var ianta p iculu i

cromatografic in cauza, OL ; prin urmare:°£ (1.58)

Tnlocuind valoarea l u i H in relatia l u i N se objine:'(1.59)

De re tinu t ca abaterea tip o£ (varianta) a curbei Gauss este implicata in largimeapicului cromatografic, deoarece largimea bazei p iculu i este identica bazei t r iunghiulu iAGI si este egala cu 4o L , asa cum se poate observa din figura 1.13. M a r im e a H nu aredimensiunile unei inal t imi , asa cu m prevede teoria p la tour i lor (conform careia seexprima in mm) . H p utandu-se exprima in func^e de volumul d e reten^ie V R , t impul deretentie t R sau de distanta pana la max imu l picului, d R , conform relajiilor urmatoare:

VR N

tR

Hv (1.60)

(1.61)

d R (1.62)

CAPITOLUL 1 CROMATOGRAFIA. APLICATM IN ANALIZA 51 CONTROLUL MEDICAMENTELOR 45

In aceasta abordare numaru l de p la tour i teoretice devine egal cu:

(1.63)

Ia r daca se exprima a in raport de largimea bazei picului b, stiind ca o = b/4, se

obtine:N

16 dR 16VR 16t R (1.64)

(b):Evident ca din relaj:ia (1.64) se poate dedu ce ecuatia care da largim ea bazei picului

_ 4d R = 4Vg _ 4t RV N (1.65)

Din toate cele expuse rezulta ca numaru l de plato uri teoretice N se poate calculain funct ie de distanta dR a picului (adica din momentul injectarii pana la maximulpicului), de volumul de retentie V R, d e t impul de retenfie t R si de largimea bazei p i c u l u i

b s au chiar 5 = 1/2 h = 2,354a. Pr in urmare se pot face pe cromatograma masurator i d ed R , de b si de largime a p iculu i la semimal t imea acestuia, 8, ceea ce usureaza calculareanumaru lu i de p latouri teoretice astfel:

16 tR 5,54t R (1.66)

Adesea se prefers masurarea largimii 5 a p iculu i la semiinaltimea acestuia (h/2).deoarece aceasta parte a picului este adesea m ai sime trica decat intreg picul (care includelargimea b). Odata cunoscut numaru l de platouri teoretice si lungimea coloanei croma-tografice se poate calcula inal t imea talerului teoretic, H = L/N, pentru respectivacoloana.

Din cele expuse, se poate trage concluzia ca eficacitatea unei coloane cromato-

grafice este cu atat mai mare cu cat n u m a r u l de plato uri eoretice este mai m are, respectivcu cat sunt mai mici baza p iculu i b (sau 5) si abaterea tip OL a colo anei. Cu alte cuvinte,,eficacitatea coloanei exprima insiisirea ei, capadtatea ei de a da picuri c at rnai sinietrke,mai stramte $i cu ba