ZBORNIK PROCEEDINGS

VIII SIMPOZIJ PERADARSKI DANI 2009. s međunarodnim sudjelovanjem

Hrvatska, Poreč, 25.-28. ožujka 2009.

VIII SYMPOSIUM POULTRY DAYS 2009 With International Participation Croatia, Poreč, March 25-28, 2009

ZBORNIK

PROCEEDINGS

Zagreb, 2009.

Izdavač – Publisher CENTAR ZA PERADARSTVO, ZAGREB

POULTRY CENTRE, ZAGREB

Glavna urednica – Editor-in-Chief Mirta Balenović

Lektura hrvatskog jezika – Proofreading the Croatian language

Vesna Arsovski Maša Rimac

Lektura i prijevod engleskog jezika – Proofreading and Translation the English language

Christine Reither Vlatka Kos

Grafička priprema i tisak – Prepress and Print

GRAFO 900 Zagreb

Radovi objavljeni u Zborniku recenzenti su pozitivno ocijenili.

CIP zapis dostupan u računalnom katalogu Nacionalne i sveučilišne knjižnice u Zagrebu pod brojem 634191

ISBN 978-953-96259-7-7

Organizator – Organizer

Hrvatski veterinarski institut Centar za peradarstvo

Heinzelova 55, Zagreb Hrvatska

Croatian veterinary institute Poultry centre Heinzelova 55, Zagreb Croatia

Pokroviteljstvo – Patronage

Svjetska udruga za znanost o peradi Hrvatski ogranak

Zagreb

The World’s Poultry Science Association Croatian Branch Zagreb

Glavni sponzor – General sponsor

KOKA d.d., Varaždin KOKA Inc., Varaždin

Predsjednik Simpozija –President of the Symposium Vladimir Savić

Tajnica Simpozija –Secretary General of the Symposium Radmila Raguž-Đurić

Organizacijski odbor - Organising committee Mirta Balenović, Boris Belko, Branko Bobetić, Vlasta Brlek,

Miroslav Cvetić, Jakov Čorić, Danijela Horvatek, Zlatko Janječić, Luka Jurinović, Zvezdan Kičeec, Fani Krstulović, Krešimir Kuterovac,

Irena Lukač Novak, Darko Majnarić, Radmila Raguž-Đurić, Mirjana Runjak, Ljubica Sremić-Njari

Znanstveni odbor - Scientific committee Tajana Amšel Zelenika, Željko Cvetnić, Anamaria Ekert Kabalin,

Lidija Kozačinski, Milivoj Mikec, Suzana Milinković-Tur, Stjepan Mužic, Stjepan Pepeljnjak, Tomislav Petrak, Estella Prukner-Radovčić,

Vladimir Savić, Marijana Sokolović, Borka Šimpraga, Marina Tišljar, Olga Zorman-Rojs, Đurđica Žutinić

7

SADRŽAJ Uvodna predavanja / Introductory lectures

UNOS I ŠIRENJE VISOKOPATOGENE INFLUENCE (H5N1) DIVLJIM PTICAMA U HRVATSKOJ TIJEKOM 2005. I 2006. (INTRODUCTION AND SPREAD OF HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA VIRUS (H5N1) WITH WILD BIRDS IN CROATIA DURING 2005 AND 2006) Vladimir Savić, Ankica Labrović, Tajana Amšel Zelenika, Mirta Balenović, Sanja Šeparović, Luka Jurinović 13

UVOĐENJE SUSTAVA KVALITETE I AKREDITACIJA U HVI – PODRUŽNICA CENTAR ZA PERADARSTVO (INTRODUCTION OF QUALITY SYSTEMS AND ACCREDITATION IN CROATIAN VETERINARY INSTITUTE - BRANCH POULTRY CENTRE) Tajana Amšel Zelenika, Vladimir Savić, Milivoj Mikec, Borka Šimpraga, Marina Tišljar, Radmila Raguž-Đurić, Mirta Balenović ......................................................................................................................... 21 Usmena izlaganja / Lectures

OBRAZOVANJE KAO UVJET RAZVITKA HRVATSKE PERADARSKE PROIZVODNJE (EDUCATION AS A CONDITION OF DEVELOPMENT CROATIAN POULTRY PRODUCTION) Đurđica Žutinić, Radmila Raguž-Đurić ........................................................................................................... 26

DOBROBIT PURANA U INTENZIVNOJ PROIZVODNJI (WELFARE OF TURKEYS IN INTENSIVE PRODUCTION) Mario Ostović, Željko Pavičić, Alenka Tofant, Tomislav Balenović, Anamaria Ekert Kabalin, Sven Menčik . 31

POGAČA ULJANE REPICE U TOVU HIBRIDNIH PURANA (RAPESEED OIL CAKE IN FATTENING OF HYBRID TURKEYS) Stjepan Mužic, Zlatko Janječić, Jasna Pintar, Dalibor Bedeković, Vlasta Herak-Perković ............................ 35

PROCJENA SADRŽAJA KAROTENOIDA PREMA INTENZITETU BOJE ZRNA KUKURUZA (ESTIMATION OF CAROTENOID CONTENT FROM COLOUR ANALYSIS OF CORN GRAINS) Kristina Kljak, Darko Grbeša, Danijel Karolyi ................................................................................................. 39

UTJECAJ MIKROKLIME NA KONCENTRACIJU PRAŠINE I MIKROORGANIZAMA U ZRAKU PERADNJAKA ZA NESILICE KONZUMNIH JAJA (INFLUENCE OF MICROCLIMATE ON DUST AND ON CONCENTRATION OF MICROORGANISMS IN THE AIR OF POULTRY HOUSES FOR LAYING HENS) Kristina Matković, Marija Vučemilo, Bara Vinković ......................................................................................... 45

COMPARISON OF DIFFERENT CELL CULTURES FOR THE ISOLATION OF H5N1 HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA VIRUS (HPAI) (USPOREDBA RAZLIČITIH KULTURA STANICA ZA IZOLACIJU VISOKOPATOGENOG VIRUSA INFLUENCE H5N1) Brigita Slavec, Peter Hostnik, Uroš Krapež, Jožko Račnik, Alenka Dovč, Renata Lindtner-Knific, Marko Zadravec, Dušan Benčina, Olga Zorman-Rojs .............................................................................................. 48

8

A MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF AVIAN PARAMYXOVIRUS TYPE 1 (NEWCASTLE DISEASE) VIRUSES ISOLATED FROM PIGEONS IN SLOVENIA (MOLEKULARNA EPIDEMIOLOGIJA PTIČJEG PARAMIKSOVIRUSA TIPA 1 (NEWCASTLESKA BOLEST) VIRUSA IZOLIRANIH IZ GOLUBOVA U SLOVENIJI) Uroš Krapež, Adela Fratnik Steyer, Brigita Slavec, Darja Barlič-Maganja, Alenka Dovč, Jožko Račnik, Olga Zorman-Rojs .......................................................................................................................................... 56

MULTIPLICATION OF HVT FC-126 (HERPESVIRUS TURKEY) MAREK'S DISEASE VIRUS IN CELLS OF NONAVIAN ORIGIN (UMNAŽANJE HVT FC-126 (HERPESVIRUS PURANA) U STANICAMA NEAVIJARNOG PODRIJETLA) Bratko Filipič, Željko Gottstein, Srećko Sladoljev, Avrelija Cencič, Srečko Koren, Hrvoje Mazija ................. 64

DEMONSTRATION OF WEST NILE VIRUS ANTIBODIES IN WILD BIRDS IN SLOVENIA (PRIKAZ PROTUTIJELA WEST NILE VIRUSA U DIVLJIH PTICA U SLOVENIJI) Jožko Račnik, Olga Zorman-Rojs, Tomi Trilar, Mateja Jelovšek, Darja Duh, Alenka Dovč, Tatjana Avšič Županc ............................................................................................................................................................ 69

NEURAMINIDASE OF MYCOPLASMA SYNOVIAE DESIALYLATES GLYCOPROTEINS OF CHICKENS, BUT THEY CAN RAISE ANTIBODIES WHICH INHIBIT ITS NEURAMINIDASE ENZYMATIC ACTIVITY (NEURAMINIDAZA VRSTE MYCOPLASMA SYNOVIAE DESIJALIZIRA GLIKOPROTEINE KOKOŠI, ALI ONE MOGU TVORITI PROTUTIJELA KOJA PRIJEČE NJENU NEURAMINIDAZNU ENZIMSKU AKTIVNOST) Rebeka Lucijana Berčič, Ivanka Cizelj, Daliborka Dušanić, Mojca Narat, Olga Zorman-Rojs, Peter Dovc, Dušan Benčina ............................................................................................................................................... 72

PRISUTNOST CAMPYLOBACTER SPP. U OBRISCIMA S TRUPOVA PERADI U KLAONICAMA I NA MJESTU PRODAJE (THE PREVALENCE OF CAMPYLOBACTER SPP. IN POULTRY CARCASSES SWABS IN SLAUGHTERHOUSES AND ON THE MARKET) Slavica Jakšić, Sunčica Uhitil, Kornelija Granić, Damir Krčar ........................................................................ 79

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HPLC METHODS FOR THE DETERMINATION OF ANTIBIOTIC RESIDUES IN POULTRY MEAT AND EGG YOLK ACCORDING TO 2002/657/EC-AN OVERVIEW (RAZVOJ I VALIDACIJA HPLC METODA ZA ODREĐIVANJE REZIDUA ANTIBIOTIKA U MESU PERADI I ŽUMANJKU JAJETA PREMA 2002/657/EC) Victoria F. Samanidou .................................................................................................................................... 82

DIJAGNOSTIKA KLAMIDIOZE U PTICA (DIAGNOSTIC CHLAMYDIOSIS IN BIRDS) Ivan Križek, Estela Prukner-Radovčić ............................................................................................................ 88

HEALTH STATUS OF BREADING PHEASANTS IN SLOVENIA (ZDRAVSTVENI STATUS FAZANA U UZGOJU U SLOVENIJI) Marko Zadravec, Brigita Slavec, Jožko Račnik, Aleksandra Vergles Rataj, Alenka Dovč, Cvetka Marhold, Olga Zorman-Rojs .......................................................................................................................................... 98 Posteri / Poster presentations

PAD NESIVOSTI U LAKIH HIBRIDA KOKOŠI UZROKOVAN AVIJARNIM ENCEFALOMIJELITISOM (EGG PRODUCTION DROP IN LAYING HENS CAUSED BY AVIAN ENCEPHALOMYELITIS) Dino Krstulović, Marina Biđin, Vladimir Savić, Zdenko Biđin .......................................................................... 104

9

KARAKTERIZACIJA PARAMIKSOVIRUSA TIPA 1 (PMV-1) IZDVOJENOG IZ GOLUBA U HRVATSKOJ U 2008. (CHARACTERISATION OF PARAMYXOVIRUS TYPE 1 (PMV-1) ISOLATED FROM PIGEON IN CROATIA IN 2008) Luka Jurinović, Vladimir Savić, Mirta Balenović, Duje Lisičić, Tajana Amšel Zelenika .................................. 110

DOSADAŠNJI REZULTATI ISTRAŽIVANJA SINDROMA ENTERITISA I UGINUĆA PURIĆA U HRVATSKOJ (POULT ENTERITIS AND MORTALITY SYNDROME (PEMS) IN CROATIA – SURVEY RESULTS) Zdenko Biđin, Ivana Lojkić, Marina Biđin, Marina Tišljar, Milivoj Mikec, Darko Majnarić, Željko Stanišić ...... 114

LONGITUDINALNA STUDIJA VRLO VIRULENTNIH VIRUSA ZARAZNE BOLESTI BURZE U HRVATSKOJ OD 1996. DO 2008. (LONGITUDINAL STUDY OF VERY VIRULENT INFECTIOUS BURSAL DISEASE VIRUSES IN CROATIA DURING THE PERIOD 1996 - 2008) Vladimir Savić, Mirta Balenović ...................................................................................................................... 119

EVALUATION OF RNA ISOLATION METHODS FOR THE DETECTION OF INFLUENZA A VIRUSES IN DIFFERENT ENVIRONMENTAL SAMPLES BY REAL-TIME RT-PCR (VREDNOVANJE METODA IZOLACIJE RNK ZA DETEKCIJU VIRUSA INFLUENCE IZ RAZLIČITIH UZORAKA OKOLIŠA METODOM REAL-TIME RT-PCR) Adela Fratnik Steyer, Olga Zorman-Rojs, Brigita Slavec, Uroš Krapež, Barbara Muščet, Aleš Lapanje, Alexis Zrimec, Darja Barlič-Maganja .............................................................................................................. 124

HUMORALNI I STANIČNI IMUNOSNI ODZIV TOVNIH PILIĆA IMUNIZIRANIH ŽIVIM ILI INAKTIVIRANIM CJEPIVOM PROTIV NEWCASTLESKE BOLESTI (HUMORAL AND CELL-MEDIATED IMMUNE RESPONSE IN FATTENING CHICKENS IMMUNISED WITH LIVE OR INACTIVATED VACCINE AGAINST NEWCASTLE DISEASE) Mirta Balenović, Vladimir Savić, Maja Popović, Anamaria Ekert Kabalin, Tajana Amšel Zelenika, Luka Jurinović, Ivica Valpotić .................................................................................................................................. 129

IMUNOGENOST ŽIVIH CJEPIVA U PILIĆA TEŠKE HIBRIDNE LINIJE ROSS (IMMUNOGENICITY OF LIVE VACCINES IN ROSS 308 CHICKENS) Vesna Weigand, Vlasta Herak-Perković, Neda Ergotić .................................................................................. 136

UČINAK CIJEPLJENJA PROTIV MAREKOVE BOLESTI NA ANTIOKSIDATIVNI SUSTAV PLUĆA PILIĆA (EFFECT OF VACCINATION AGAINST MAREK’S DISEASE ON LUNG ANTIOXIDATIVE SYSTEM IN CHICKENS) Jasna Aladrović, Suzana Milinković-Tur, Blanka Beer Ljubić, Željko Gottstein, Hrvoje Mazija ..................... 142

PRIMJENJIVOST POSTUPAKA IZRAVNE I POSREDNE IMUNOFLUORESCENCIJE PRI DIJAGNOSTICIRANJU KLAMIDIOZE U PTICA (APPLICABILITY OF DIRECT AND INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE METHODS IN DIAGNOSTICS OF AVIAN CHLAMYDIOSIS) Ksenija Vlahović, Maja Popović, Branka Šeol, Gordana G. Gračner, Iva Popović, Alenka Dovč .................. 150

DELETIONS IN GENES ENCODING CYSTEINE PROTEASES OF MYCOPLASMA SYNOVIAE AND MYCOPLASMA GALLISEPTICUM (DELECIJE U GENIMA KOJI KODIRAJU CISTEINSKE PROTEAZE U MYCOPLASMA SYNOVIAE I MYCOPLASMA GALLISEPTICUM) Ivanka Cizelj, Rebeka Lucijana Berčič, Daliborka Dušanić, Mojca Narat, Peter Dovč, Dušan Benčina ........ 156

INTERPLAY BETWEEN MYCOPLASMA SYNOVIAE AND CHICKEN CELLS DURING INFECTION (MEĐUSOBNI UTJECAJ MYCOPLASMA SYNOVIAE I PILEĆIH STANICA TIJEKOM INFEKCIJE) Daliborka Dušanić, Miha Lavrič, Rebeka Lucijana Berčič, Ivanka Cizelj, Calvin L. Keeler, Dušan Benčina, Mojca Narat ..................................................................................................................................................... 158

10

MIKOPLAZMOZE PURANA I KOKOŠI TEŠKIH HIBRIDA TIJEKOM 2007. I 2008. GODINE U REPUBLICI HRVATSKOJ (MYCOPLASMOSIS IN TURKEYS AND HEAVY HYBRID HENS IN THE REPUBLIC OF CROATIA IN THE PERIOD 2007-2008) Tajana Amšel Zelenika, Vladimir Savić, Mirta Balenović, Luka Jurinović ...................................................... 161

SALMONELE U JAJIMA I IZMETU PERADI TIJEKOM 2007. I 2008. GODINE (SALMONELLA IN EGGS AND FAECES OF POULTRY DURING THE YEARS 2007 AND 2008) Fani Krstulović, Borka Šimpraga, Marijana Sokolović, Radmila Raguž-Đurić ............................................... 167

ZNAČAJ NALAZA BAKTERIJA IZ RODA SALMONELLA I DRUGIH POTENCIJALNO PATOGENIH BAKTERIJA U HRANI ZA ŽIVOTINJE (SIGNIFICANCE OF ISOLATION OF SALMONELLA SPP. AND OTHER POTENTIALLY PATHOGENIC BACTERIA FROM ANIMAL FEED) Marijana Sokolović, Borka Šimpraga, Fani Krstulović .................................................................................... 172

OSJETLJIVOST SOJEVA BAKTERIJE E. COLI IZDVOJENIH IZ TOVNIH PURANA NA ANTIBIOTIKE (ANTIBIOTIC SENSITIVITY OF E. COLI STRAINS FROM COMMERCIAL TURKEY FLOCKS) Borka Šimpraga, Marijana Sokolović, Fani Krstulović .................................................................................... 178

POJAVNOST CAMPYLOBACTER SPP. U FECESU, BRISEVIMA S PILEĆIH TRUPOVA I OTPADNE VODE NA LINIJI KLANJA (INCIDENCE OF CAMPYLOBACTER SPP. IN FECES, MEAT SURFACE AND WASTEWATER SWABS ALONG THE SLAUGHTER LINE) Tihomir Zglavnik, Marijana Sokolović ............................................................................................................. 184

ISTRAŽIVANJE OSJETLJIVOSTI BAKTERIJA RODA CAMPYLOBACTER SPP. NA ANTIMIKROBNE TVARI DIFUZIJSKIM POSTUPKOM (ANTIMICROBIAL RESISTANCE OF CAMPYLOBACTER SPP. ISOLATED FROM CHICKENS AS DETERMINED BY DISK DIFFUSION METHOD) Estella Prukner-Radovčić, Danijela Horvatek, Katja Krivičić .......................................................................... 191

NALAZ OSTATAKA ANTIMIKROBNIH TVARI U HRANI ZA ŽIVOTINJE I SIROVINAMA ZA NJIHOVU PRIPREMU UPORABOM SCREENING TESTA (FINDINGS OF RESIDUES IN FEED AND RAW MATERIAL FOR FEED PREPARATION USING SCREENING TEST) Vesna Jaki, Darko Majnarić, Manuela Zadravec ............................................................................................ 196

UČINAK PROBIOTIKA NA PROIZVODNE REZULTATE BROJLERSKIH PILIĆA (EFFECT OF PROBIOTICS ON PRODUCTION RESULTS OF BROILER CHICKS) Aida Kavazović, Abdulah Gagić, Emina Rešidbegović, Fahira Alibegović-Zečić, Teufik Goletić, Ćazim Crnkić, Aida Kustura, Almira Softić ................................................................................................................. 199

ZDRAVLJE CRIJEVA U PERADI (HEALTH OF THE BOWEL OF POULTRY) Milivoj Mikec, Zdenko Biđin, Mirta Balenović .................................................................................................. 206

UTJECAJ PRIMJENE RAZLIČITIH NAČINA DEZINFEKCIJE RASPLODNIH JAJA NA REZULTATE INKUBACIJE (DIFFERENT HATCHING EGGS DISINFECTION INFLUENCE ON HATCHABILITY) Aida Kustura, Abdulah Gagić, Emina Rešidbegović, Teufik Goletić, Aida Kavazović .................................... 213

MORFOMETRIJSKE KARAKTERISTIKE ERITROCITA PTICA – PRELIMINARNA STUDIJA (MORPHOMETRIC CHARACTERISTICS OF AVIAN ERYTHROCYTES – PRELIMINARY STUDY) Nina Poljičak-Milas, Matko Kardum, Terezija Silvija Marenjak, Ika Kardum-Skelin, Suzana Milinković-Tur . 217

11

KONCENTRACIJE SERUMSKIH BJELANČEVINA I AKTIVNOST AMINOTRANSFERAZA U JETRI I BUBREZIMA PAČIĆA TIJEKOM GLADOVANJA (CONCENTRATIONS OF SERUM PROTEINS AND HEPATIC AND RENAL AMINOTRANSFERASE ACTIVITIES IN FASTING DUCKLINGS) Suzana Milinković-Tur, Nina Poljičak-Milas, Jasna Aladrović, Blanka Beer Ljubić, Nikolina Novak, Ivona Žura Žaja ......................................................................................................................................................... 227

ULOGA HRVATSKOG STOČARSKOG CENTRA U PERADARSKOJ PROIZVODNJI U REPUBLICI HRVATSKOJ (THE ROLE OF THE CROATIAN LIVESTOCK CENTER IN POULTRY PRODUCTION IN THE REPUBLIC OF CROATIA) Gordana Duvnjak, Maja Dražić, Dalibor Bedeković ........................................................................................ 235

IMUNOGENOST TERENSKOG SOJA VIRUSA NEWCASTLESKE BOLESTI NB ZG-2000. PRIMIJENJENOG NA SPF PILIĆIMA (IMMUNOGENICITY OF FIELD STRAIN OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS ND ZG-2000 APPLIED TO SPF CHICKENS) Marina Biđin, Hrvoje Mazija ............................................................................................................................ 241

Okrugli stol / Round table ................................................................................................................... 247 Nacionalni program kontrole salmoneloze u jatima konzumnih nesilice i odraslih rasplodnih jata vrste gallus gallus u Republici Hrvatskoj (National program of salmonella control in poultry species gallus gallus in the Republic of Croatia)

RESULTS OF SALMONELLA CONTROL IN POULTRY IN THE NETHERLANDS (REZULTATI KONTROLE SALMONELOZE U PERADI U NIZOZEMSKOJ) Tjep de Vries ................................................................................................................................................... 248

ASPECTS OF VACCINATIONS IN SALMONELLA CONTROL IN POULTRY (ASPEKTI CIJEPLJENJA U KONTROLI SALMONELOZE U PERADI) Tjep de Vries ................................................................................................................................................... 249

NACIONALNI PROGRAMI KONTROLE SALMONELOZE U PERADI VRSTE GALLUS GALLUS U REPUBLICI HRVATSKOJ (NATIONAL PROGRAM OF SALMONELLA CONTROL IN POULTRY SPECIES GALLUS GALLUS IN THE REPUBLIC OF CROATIA) Ivana Lohman ................................................................................................................................................. 251

NUTRITIONAL APPROACHES TO CONTROLLING SALMONELLA (PREHRAMBENI PRISTUPI KONTROLI SALMONELE) Zöe Stevenson ................................................................................................................................................ 252 Top 5 paraziti u intenzivnom peradarstvu (Top 5 parasites in intensive poultry farming)

JESMO LI USTUKNULI PRED PARAZITIMA KOJI UGROŽAVAJU PROFITABLNOST PROIZVODNJE U NESILICA? (DO WE RECEDE IN FRONT OF PARASITES THAT ENDANGER THE PROFITABILITY OF LAYING HENS PRODUCTION?) Albert Marinculić ............................................................................................................................................. 253

12

Slobodne teme / Free Communications

UPRAVLJAČKI LIMS KAO NEIZOSTAVNI ALAT PRI PRAĆENJU DOSLJEDNOSTI DOBAVLJAČA, UJEDNAČENOSTI PROIZVODA, TE STRATIFIKACIJI FINALNOG PROIZVODA PREMA RAZNIM LEGISLATIVNIM I NORMATIVNIM OKRUŽENJIMA U SVRHU KONTROLE RIZIKA I PREVENCIJE INCIDENATA (MANAGEMENT LIMS: AN INDISPENSABLE TOOL FOR MONITORING SUPPLIER CONSISTENCY, PRODUCT UNIFORMITY AND STRATIFICATION OF THE FINAL PRODUCT IN VARIOUS LEGISLATIVE AND NORMATIVE ENVIRONMENTS FOR THE PURPOSE OF RISK MANAGEMENT AND PREVENTION OF FOOD RELATED INCIDENTS) Sandra Zavadlav, Tomislav Petrak, Marijan Katalenić, Vedran Poljak, Damir Kropf ..................................... 254

MOGUĆNOST KORIŠTENJA USITNJENOG KUKURUZNOG OKLASKA ZA STELJU U PERADARSKOJ PROIZVODNJI (REPLACEMENT OPTION OF WOOD WASTE BEDDING WITH MASTICATED CORN COB BEDDING) Ivan Hunjadi, Stjepan Vukušić, Marijan Hren ................................................................................................. 255

DALMATINSKA TUKA - ARHAIČNA FORMA PERADI (DALMATIAN TURKEY – AN ARCHAIC FORM OF POULTRY) Anamaria Ekert Kabalin, Šandor Horvath, Velimir Sušić, Tomislav Balenović, Ivo Karadjole, Mirta Balenović, Drago Marguš, Davorin Marković, Ana Grgas, Željko Pavičić, Igor Štoković, Sven Menčik, Mario Ostović .................................................................................................................................................. 257

THE "TELEVET SYSTEM”® AN INNOVATIVE AND POWERFUL INSTRUMENT FOR THE POULTRY WELFARE SELF-CONTROL Luciano Giovannetti ........................................................................................................................................ 261 Komercijalna predavanja / Commercial lectures

THE BENEFITS OF ELLAGITANNINS AND ENCAPSULATED CALCIUMBUTYRATE IN POULTRY NUTRITION (KORISTI OD ELAGITANINA I KAPSULA KALCIJ BUTIRATA U PREHRANI PERADI) Martina Novak - TANIN SEVNICA d.d. ........................................................................................................... 263

PERADARSKI DANI 2009. 13

UNOS I ŠIRENJE VISOKOPATOGENE INFLUENCE (H5N1) DIVLJIM PTICAMA U HRVATSKOJ TIJEKOM 2005. I 2006.

Vladimir Savić1, Ankica Labrović2, Tajana Amšel Zelenika1, Mirta Balenović1, Sanja Šeparović2, Luka Jurinović1

1 Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska 2 Uprava za veterinarstvo, Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja Republike Hrvatske, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

U razdoblju od listopada 2005. do ožujka 2006. godine u Hrvatskoj je izdvojeno ukupno 17 izolata virusa visokopatogene influence ptica podtipa H5N1. Svi izolati potječu iz divljih ptica: crvenokljunih labudova (Cygnus olor), riječnih galebova (Larus ridibundus) i jedne divlje patke (Anas platyrhynchos) sa šest lokacija: 1) ribnjak „Grudnjak“ - Zdenci, 2) „Ribnjak 1905“ - Našice, 3) Slatina na otoku Čiovo, 4) močvara Pantana kraj Trogira, 5) Zagreb i 6) Draž u Baranji. Filogenetski je analizirano sedam izolata koji su grupirani u tri skupine, što nedvojbeno ukazuje na najmanje tri neovisna unosa ovog virusa u Hrvatsku tijekom relativno kratkog razdoblja. Na svim lokacijama, osim na Pantani i obližnjem Čiovu, nađen je isključivo jedan tip virusa koji je najsličniji izolatima iz uginulih divljih ptica na jezeru Qinghai u Kini i izolatima iz divljih ptica i peradi u azijskom dijelu Rusije. Na Pantani su, osim tog tipa virusa, nađena i preostala dva tipa virusa H5N1 izdvojena u Hrvatskoj. Raznovrsnost tipova virusa H5N1 na Pantani može se povezati s vrlo hladnom zimom i zaleđenim vodenim površinama početkom 2006. u kontinentalnom dijelu Hrvatske i zemljama u regiji te migriranjem ptica prema toplijim područjima. Nije utvrđena uska povezanost tipova virusa H5N1 izdvojenih u Hrvatskoj i vrsta divljih ptica iz kojih su virusi izdvojeni, što ukazuje na širenje tog virusa među različitim vrstama divljih ptica. Ovo je prvi nalaz virusa influence ptica u Hrvatskoj i prvo izdvajanje virusa visokopatogene influence ptica podtipa H5N1 u naizgled zdravih riječnih galebova.

Ključne riječi: influenca ptica, H5N1, divlje ptice, Hrvatska

Uvod

Virusi influence ptica (IP) pripadaju rodu Influenzavirus A obitelji Orthomyxoviridae i imaju negativno orijentiranu, segmentiranu RNA. Virusi influence A se dijele u podtipove temeljem posjedovanja jednog od 16 različitih hemagluti-ninskih antigena (H1 do H16) i jednog od devet neurami-nidaznih antigena (N1 do N9). Iz ptica su naizgled izdvojeni virusi svih mogućih kombinacija, a genetski rezervoar za kruženje virusa IP u prirodi su prvenstveno vodene ptice (Capua i Alexander, 2004.; Fouchier i sur., 2005.). Virusi influence A su, s obzirom na bolest koju uzrokuju u domaće peradi, podijeljeni na viruse niske i visoke patogenosti. Viru-si visoke patogenosti uzrokuju visokopatogenu influencu ptica (VPIP), koja može rezultirati uginućem i do 100%. Takvi virusi su do sada bili ograničeni isključivo na podtipove H5 i H7, iako VPIP ne uzrokuju svi virusi iz te dvije skupine. Svi ostali virusi uzrokuju niskopatogenu influencu ptica (NPIP), daleko blažu bolest koja se očituje

prvenstveno blagim dišnim simptomima i slabijom proiz-vodnjom jaja. Ponekad infekcija drugim mikroorganizmima može pogoršati simptome i učiniti NPIP daleko ozbiljnijom bolesti (Capua i Alexander, 2004.). Patogenost virusa IP za ptice ovisi ponajprije o višestrukoj zastupljenosti bazičnih aminokiselina na mjestu cijepanja bjelančevine hemagluti-nina u procesu infekcije stanice domaćina (Stienke-Grober i sur., 1992.; Rott, 1992.). Brojne ptičje vrste mogu biti zaražene virusima influence A (Alexander, 2000.; Hinshaw i sur., 1981.), no sve do pojave i širenja azijske VPIP podtipa H5N1 visokopatogeni virusi rijetko su bili izdvajani iz slobodnoživućih ptica, s iznim-kom pojave VPIP u čigri (A/tern/S.Africa/61). Sporadični izolati virusa VPIP iz slobodnoživućih ptica obično su bili izdvajani iz lešina u neposrednoj blizini peradi oboljele od VPIP ili iz uginulih ptica koje se moglo geografski i kro-nološki povezati s pojavama VPIP u peradi (Alexander i Capua, 2008.). Međutim, masovna pojava VPIP u migrator-nih vodenih ptica 2005. godine na jezeru Qinghai u Kini

Dr. sc. Vladimir Savić, dr.vet.med., Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; Tel: ++ 385 (0) 1 2441-392, 2441-394; Fax: ++ 385 (0) 1 2441-396; E-mail: [email protected]

UNOS I ŠIRENJE VISOKOPATOGENE INFLUENCE (H5N1) DIVLJIM PTICAMA U HRVATSKOJ TIJEKOM 2005. I 2006. 14

uzrokovana podtipom H5N1 (Chen i sur., 2005.; Liu i sur., 2005.) i činjenice koje su upućivale na širenje ovog virusa migratornim pticama na velike udaljenosti (Normile, 2006.) imale su za posljedicu paniku globalnih razmjera, prven-stveno zbog sposobnosti azijskog virusa H5N1 da izazove zarazu u ljudi i drugih sisavaca sa smrtnim ishodom (Claas i sur., 1998.; Subbarao i sur., 1998., Kuiken i sur., 2004.). Štoviše, tom virusu je pripisan i pandemijski potencijal (Hien et al., 2004.). Azijski virus H5N1 utvrđen je u listopadu 2005. u domaće peradi u Rumunjskoj i Turskoj te u slobodnoživućih ptica u Hrvatskoj, a kasnije i slobodnoživućih ptica i peradi u broj-nim drugim europskim zemljama (Anon., 2009.). Prelimi-narna analiza je ukazivala na veću sličnost izolata iz Hrvatske s izolatima iz migratornih ptica na jezeru Qinghai iz svibnja 2005. nego sa spomenutim izolatima iz peradi u Rumunjskoj i Turskoj (Savić, 2005.). Virus H5N1 je zatim dokazan u više navrata na nekoliko lokacija u Hrvatskoj sve do ožujka 2006. (Savić, 2006.). Cilj ovog rada je prikazati podatke o potvrđenim slučajevima infekcije virusom H5N1 u Hrvatskoj i epidemiološki ih usporediti koristeći moleku-larnu analizu reprezentativnih virusnih izolata. Materijal i metode Uzorci Od rujna 2005. do lipnja 2006. prikupljeni su uzorci od ukupno 6142 divlje ptice i 844 domaće peradi te od 11 uginulih mačaka i jednog uginulog psa. Većina uzoraka divljih ptica je prikupljena u okviru pasivnog monitoringa temeljem dojava o uginulim i bolesnim pticama na cijelom području Republike Hrvatske. Preostali uzorci divljih ptica i domaće peradi su ciljano prikupljani u okviru dodatnog monitoringa na područjima na kojima je prethodno doka-zan virus influence ptica podtipa H5N1. U većini slučajeva virološki su pretraživani organi (mozak, dušnik, pluća, jetra, slezena, bubrezi i crijeva), a rjeđe obrisci kloake i ždrijela. Od ulovljenih divljih ptica koje su nakon uzimanja uzoraka puštane i od žive domaće peradi pretraživani su isključivo obrisci, obično ždrijela i kloake, a u pojedinim slučajevima samo obrisci kloake. Virološke pretrage Izdvajanje virusa u kokošjim embrijima i serotipizacija su učinjeni sukladno standardnoj proceduri (Anon., 2004.). Test inhibicije neuraminidaze je učinjen za izolate virusa influence, za koje molekularnim postupcima nije dokazana nazočnost gena za N1 (postupak inhibicije neuraminidaze dostupan na zahtjev). Za određivanje H i N podtipa virusa influence ptica korišten je panel seruma za svih 16 H podtipova i svih 9 N podtipova influence A (IZSVe, Padova, Italija) dok je za potvrdu paramiksovirusa tipa 1 korišten serum za virus newcasdtleske bolesti (VLA, Weybridge, Velika Britanija). Molekularne metode Ukupna RNA je izdvojena iz infektivnih alantoisnih tekućina pomoću komercijalnog kompleta High pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Applied Science, Njemačka) i

prema uputama proizvođača. Komplementarna DNA (cDNA) je sintetizirana korištenjem nasumičnih heksamera i komercijalnog kompleta GeneAmp® Gold RNA PCR Core Kit (Applied Biosystems, SAD) i prema uputama proizvođača. Lančana reakcija polimerazom (PCR – engl. polymerase chain reaction) za cjeloviti HA gen za odabrane izolate virusa influence A podtipa H5 je učinjena korištenjem istog kompleta kao i za reverznu transkripciju i univerzalnih klica Bm-HA-1 i Bm-NS-890R prema po-stupku Hofmanna i suradnika (Hoffman i sur., 2001.). Dobiveni PCR proizvod je odvojen elektroforezom u 2%-tnom gelu agaroze s dodatkom etidijevog bromida (0,5 mg/l) i vizualiziran pomoću ultraljubičastog svjetla. Dio gela sa specifičnim PCR proizvodom je izrezan i pročišćen komercijalnim kompletom Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, SAD). Pročišćeni proizvodi su sek-vencirani u oba smjera na uređaju 3730XL DNA (Applied Biosystems, SAD) i pomoću kompleta BigDye v3.1 (Applied Biosystems, SAD). Pomoću dobivenih sekvenci dizajnirane su nove početnice za tzv. šetanje početnicama (engl. primer walking), koje su zatim korištene za dobi-vanje narednih manjih PCR proizvoda iz početne cDNA. Za dobivanje tih proizvoda su korišteni opisani komplet i postupak s tom razlikom da je vrijeme produljivanja PCR proizvoda skraćeno sa 7 na 3 minute. Tako dobiveni PCR proizvodi su također vizualizirani, pročišćeni i sekvencira-ni opisanim postupkom. Na taj način je svaka nukleotidna pozicija HA gena istraživanih izolata analizirana najmanje 2 puta. Nakon što su iz dobivenih sekvenci uklonjeni dijelovi koji odgovaraju korištenim klicama, preostali dio nukleotidnih sekvenci za svaki istraživani izolat je objedinjen pomoću računalnog programa ALIGN Plus 2.0. Za filogenetsku analizu je korišten računalni program Clustal W 1.83, a filogenetsko stablo je prikazano pomoću računalnog programa TreeView 1.6.0. Dobivene nukleotidne sekvence su također prevedene u aminokiselinski slijed pomoću ra-čunalnog programa ALIGN Plus 2.0 da bi se odredila pato-genost istraživanih izolata temeljem zastupljenosti bazičnih aminokiselina na mjestu cijepanja HA bjelančevine. Potvrda gena N1 u svih izolata virusa influence je učinjena klasičnim PCR postupkom s početnicama CU-N1F i CU-N1R (Payungporn i sur., 2004.) i kompletom GeneAmp® Gold RNA PCR Core Kit (Applied Biosystems, SAD) ili modificiranim (dostupno na zahtjev) PCR postupkom u stvarnom vremenu (engl. Real Time PCR) prema Payung-porn i sur. (2006.) na uređaju LightCycler 1.5 (Roche Applied Science Njemačka) i pomoću kompleta Light- Cycler RNA Master HybProbe (Roche Applied Science, Njemačka). Rezultati

Tijekom istraživanog razdoblja izdvojeno je 17 izolata vi-rusa influence ptica podtipa H5N1 na ukupno šest lokacija u Hrvatskoj. Pojedinosti o lokaciji, vremenu izdvajanja, vrstama iz koje je virus izdvojen, njihovom zdravstvenom stanju i tipu monitoringa u okviru kojeg je dokazana zaraza prikazani su na Tablici 1.


Tablica 1. Izolati virusa influence ptica podtipa H5N1 izdvojeni u Hrvatskoj tijekom 2005. i 2006. godine

Lokacija Dan uzimanja uzorka Vrsta ptice Uzorak Zdravstveno

stanje4 Monitoring Oznaka

19.10.2005. Crvenokljuni labudovi (Cygnus olor) Organi 6 ptica2 Uginuli sa

simptomima Pasivni 139/055

Crvenokljuni labud (Cygnus olor) Organi Nađena lešina Aktivni 616/05-1

29.10.2005. Crvenokljuni labud (Cygnus olor) Organi Nađena lešina Aktivni 616/05-2

Ribnjak „Grudnjak“ - Zdenci (45°37'N 18°03'E)

19.11.2005. Crvenokljuni labud (Cygnus olor)

Organi i brisevi ždrijela i kloake2

Uginuo sa simptomima Aktivni 1089/05

21.10.2005. Crvenokljuni labud (Cygnus olor) Bris kloake3 Nađena lešina Pasivni 168/05

24.10.2005. Crvenokljuni labudovi (Cygnus olor) Brisevi kloaka 4 ptice2 Nađene lešine Aktivni 181/05

„Ribnjak 1905“ – Našice (45°32'N 18°08'E)

28.10.2005. Crvenokljuni labud (Cygnus olor) Organi Nađena lešina Aktivni 613/05

Slatina - Čiovo (43°30'N 16°16'E)

15.2.2006. Crvenokljuni labud (Cygnus olor) Organi Nađena lešina Pasivni 229/065

21.2.2006. Crvenokljuni labud (Cygnus olor) Organi Nađena lešina Aktivni 315/065

Riječni galebovi (Larus ridibundus)

Brisevi kloaka 5 ptica2 Zdravi Aktivni 680/06-1-5







28.2.-3.3.2006.



Močvara Pantana – Trogir1 (43°31'N 16°16'E)

3.3.2006. Divlja patka (Anas platyrhynchos)

Organi Nađena lešina Aktivni 676/065

Draž (45°50'N 18°47'E)


Zagreb (45°46'N 15°53'E)


1Uzorci u močvari Pantana su uzimani u okviru aktivnog monitoringa nakon pozitivnog nalaza u crvenokljunog labuda u obližnjoj Slatini. 2Pojedinačni uzorci su obrađeni kao jedan skupni uzorak. 3Uzet i i bris ždrijela, ali je dao negativan rezultat. 4Uginuo sa simptomima: zamijećena bolesna jedinka koja je pretražena nakon uginuća; Nađena lešina: pretražena je uginula jedinka za koju nije poznato zdravstveno stanje prije uginuća; Zdrav: pretražena je jedinka koja u trenutku uzimanja uzorka nije pokazivala znakove bolesti. 5Izolati virusa visokopatogene influence koji su podvrgnuti filogenetskoj analizi.


Table 1. Isolates of highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1 from Croatia during 2005 and 2006.

Location Date of sampling Bird species Sample Health status4 Monitoring Designation

19.10.2005. Mute swans (Cygnus olor)

Organs of 6 birds2 Died with symptoms Passive 139/055

Mute swan (Cygnus olor)

Organs Carcass Active 616/05-1 29.10.2005.

Mute swan (Cygnus olor)

Organs Carcass Active 616/05-2

Fishpond „Grudnjak“ - Zdenci (45°37'N 18°03'E)

19.11.2005. Mute swan (Cygnus olor)

Organs and pharingeal and cloacal swabs2

Dead with symptoms Active 1089/05


Cloacal swab3 Carcass Passive 168/05

24.10.2005. Mute swans (Cygnus olor)

Cloacal swabs of 4 birds2 Carcasses Active 181/05

Fishpond „Ribnjak 1905“ – Našice (45°32'N 18°08'E)


Organs Carcass Active 613/05

Slatina - Čiovo (43°30'N 16°16'E)


Organs Carcass Passive 229/065


Organs Carcass Active 315/065

Black headed gulls (Larus ridibundus)

Cloacal swabs of 5 birds 2 Healthy Active 680/06-1-5







28.2.-3.3.2006.



Pantana marsh– Trogir1

(43°31'N 16°16'E)

3.3.2006. Mallard (Anas platyrhynchos) Organs Carcass Active 676/065

Draž (45°50'N 18°47'E)



Zagreb (45°46'N 15°53'E)



1The samples from the Pantana marsh were taken within active monitoring after positive finding in mute swan in nearby Slatina 2Individual samples were processed as a pool. 3Pharingeal swab was also taken, but gave negative result. 4Died with symptoms: sick bird was noted and tested after it died; Carcass: dead bird tested without known health history; Healthy: tested bird did not show any disease symptoms at the moment of sampling. 5Isolates of highly pathogenic avian influenza virus that were phylogenetically analyzed.


Osim virusa influence podtipa H5N1 tijekom navedenog razdoblja iz divlje patke (Anas platyrhinchos) je izdvojen virus podtipa H5N3 sa slijedom aminokiselina na mjestu cijepanja HA bjelančevine tipičnim za niskopatogene

viruse (PQRETR*GLF) te virus influence podtipa H10N7, dok je iz labuda izdvojen paramiksovirus tipa 1 (PMV-1). Rezultati filogenetske analize odabranih izolata sa svih šest lo-kacija i izdvojenih iz sve tri vrste ptica prikazani su na Slici 1.

Slika 1. Filogenetsko stablo virusa visokopatogene influence podtipa H5N1 na temelju analize HA gena. Izolati iz Hrvatske su

označeni podebljanim slovima, a u zagradi su napisane oznake izolata iz tablice 1. Za sekvence izolata iz drugih zemalja pristupni broj u genskoj banci je napisan u zagradama uz oznaku svakog izolata. Početna sekvenca za filogenetsku analizu je A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) s pristupnim brojem u genskoj banci AF144305 (izolat nije prikazan na slici). Duljina vodoravnih grana je proporcionalna genetskoj udaljenosti između pojedinih izolata virusa. Pojedinačne skupine izolata iz Europe, s Bliskog istoka i iz Azije (EMA – Europe, Middle East, Asia prema Salzberg i sur, 2007.) su naznačene na desnoj strani slike

Figure 1. Phylogenetic tree for highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1 based on the HA gene analysis. Isolates from Croatia are in bold and designations from the table 1 are given in parentheses. GeneBank accession numbers for isolates from other countries are given in parentheses for each isolate. The tree is rooted with A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) with accession number AF144305 (the isolate is not shown in the figure). Lenght of the horisontal lines is propotional to the genetic distance among individual isolates. Groups of isolates from Europe, Middle East and Asia (EMA groups according to Salzberg et. Al, 2007) are indicated on the right hand side of the figure


U slijedu aminokiselina na mjestu cijepanja HA bje-lančevine u svih analiziranih izolata virusa influence pod-tipa H5N1 izdvojenih u Hrvatskoj tijekom 2005. i 2006. nađene su višestruko zastupljene bazične aminokiseline: PQGERRRKKR*GLF.

Razmatranje

Azijski virus visokopatogene influence ptica podtipa H5N1 najvjerojatnije je nastao u domaće peradi u Kini još 1996. (Xu i sur., 1999.), gdje je očito dugo cirkulirao u tamošnje peradi sa sporadičnim širenjem u susjedni Hong Kong (Sims i sur., 2003., Sims i sur, 2005.). Situacija se dramatično promijenila kada je od 12. prosinca 2003. do 27. siječnja 2004. osam zemalja jugoistočne Azije prijavilo zaražavanje peradi ovim virusom (Capua i Alexander, 2004.). Opsežno širenje infekcije među domaćom peradi rezultiralo je 2005. prelijevanjem virusa u populaciju divljih ptica i njegovim širenjem uslijed sezonskih migracija divljih ptica (Alexander i Capua, 2008.). Iako su u početku vođene rasprave o tome da li su divlje ptice mogle prenijeti virus u azijski dio Rusije i dalje u Europu ili je virus unešen ilegalnom trgovinom peradi i proizvodima od peradi, brojni su dokazi da divlje ptice mogu prenijeti visokopatogeni virus podtipa H5N1 na velike udaljenosti (Kilpatrick, 2006.; Normile, 2006.). Izdvajanje virusa iz uginulih labudova u Hrvatskoj u listopadu 2005. ukazivalo je na značaj te ptičje vrste i divljih ptica općenito za širenje virusa H5N1 u mnogim zemljama Europe, Kavkaza i Bliskog istoka tijekom prve polovice 2006. godine (Alexander i Capua, 2008.). Velika sličnost virusa izdvojenog u listopadu 2005. iz uginulih labudova s ribnjaka „Grudnjak“ u Zdencima s izolatima iz migratornih divljih ptica u svibnju 2005. na jezeru Qinghai u Kini, posebice s izolatom iz velikog crnoglavog galeba (Larus ichthyaetus), bila je među prvim pokazateljima uloge divljih ptica u širenju visokopatogenog virusa H5N1 na velike uda-ljenosti (Savić, 2005.; Savić, 2006.; Salzberg i sur, 2007.). Virus visokopatogene influence ptica podtipa H5N1 potvr-đen je u Hrvatskoj, osim na ribnjaku „Grudnjak“, i u uginulim labudovima na „Ribnjaku 1905“ u Našicama u listopadu 2005., na Čiovu i obližnjoj močvari Pantana u veljači 2006. te u okolici Draža u Baranji i u Zagrebu u ožujku 2006. Ovaj virus je u Hrvatskoj potvrđen i u naizgled zdravih riječnih galebova (Larus ridibundus) na Pantani krajem veljače i početkom ožujka 2006. i u uginule divlje patke (Anas platyrhynchos) s iste lokacije početkom ožujka 2006. Očekivano, svi analizirani izolati pripadaju tzv. soju Qinghai, odnosno skupini izolata numerički označenoj 2.2 (WHO, 2008). Zanimljivo je da je većina filogenetski ana-liziranih izolata u ovom istraživanju vrlo slična prvom izo-latu virusa H5N1 u Hrvatskoj, tj. izolatu s ribnjaka „Grud-njak“. Među njima su izolati iz labuda iz okolice Draža i iz Zagreba te izolat iz riječnog galeba s Pantane. Iz ovih re-zultata se može zaključiti da je ovaj tip bio dominantan tijekom epizootije u 2005. i 2006. u Hrvatskoj. Nadalje, pet od ukupno šest izolata virusa H5N1 izdvojenih iz uginulih migratornih divljih ptica na jezeru Qinghai u Kini tijekom ponovnog izbijanja ove zaraze u svibnju 2006. pokazivalo je

na globalnoj razini najveću filogenetsku srodnost upravo s virusom iz labuda s ribnjaka Grudnjak. Šesti izolat s jezera Qinghai bio je, međutim, najsrodniji virusu izdvojenom 2005. iz patke u Novosibirsku u Rusiji (Wang i sur., 2008). Ovakav nalaz nedvojbeno potvrđuje ulogu divljih ptica u održavanju virusa H5N1 u prirodi, unatoč činjenici da je u pojedinim zemljama, u koje je ovaj virus unešen divljim pticama, nedvojbeno nastupio i prijenos među peradi i po-vratno s peradi na divlje ptice (Alexander i Capua, 2008.). Izolati iz Hrvatske filogenetski grupirani oko izolata s ribnjaka „Grudnjak“ pripadaju podskupini EMA 2 (EMA: Europe - Middle East - Africa) prema nomenklaturi Salzberga i sur. (2007.), a preostala tri analizirana izolata pripadaju podskupini EMA 1 (Slika 1). No, dok su naši izo-lati iz podskupine EMA 2 filogenetski vrlo bliski ukazujući na usku epizootiološku poveznost, hrvatski izolati iz pod-skupine EMA 1 su razvrstani u dvije različite grane. S obzirom na relativno kratko razdoblje unutar kojeg je došlo do pojave virusa H5N1 u Hrvatskoj, takva filogenetska raz-ličitost nedvojbeno ukazuje na to da je u Hrvatsku u raz-doblju od listopada 2005. do ožujka 2006. virus visoko-patogene influence podtipa H5N1 neovisno unešen divljim pticama barem u tri navrata. Dominantni tip virusa u Hrvatskoj, koji je predstavljen izolatom s ribnjaka „Grudnjak“, nađen je u sve četiri regije u kojima se virus H5N1 pojavio (Slavonija, Baranja, Dal-macija i Zagreb), a bio je i jedini nađeni tip virusa u Sla-voniji, Baranji i Zagrebu. Nasuprot tome, u okolici Trogira su nađena sva tri tipa virusa koja su dokazana u Hrvatskoj. Na toj lokaciji je najprije dokazan virus u uginulom labudu nađenom na obali u mjestu Slatina na otoku Čiovo 15. veljače 2006. godine. Lešina labuda je najvjerojatnije nošena morskom strujom i valovima doplutala do Slatine iz obližnje močvare Pantana koju tvori ušće istoimene rječice u more. Pomnim pregledanjem močvare tjedan dana kasnije nađena je još jedna lešina labuda iz koje je izdvojen virus H5N1, koji je bio gotovo identičan virusu izdvojenom iz labuda nađenog na obali Čiova, pa se očito radilo o epizootiološki povezanim jedinkama. Oba izolata su, međutim, značajno različita od virusa H5N1 izdvojenih s ostalih lokacija u Hrvatskoj. Dodatnim prikupljanjem uzoraka od živih ulov-ljenih divljih ptica na Pantani krajem veljače i početkom ožujka 2006. godine dokazana je i infekcija naizgled zdravih riječnih galebova koji su nakon uzimanja uzoraka prsteno-vani i odmah pušteni. Analizirani izolat iz riječnih galebova bio je, međutim, različit od virusa izdvojenih iz labudova s iste lokacije i pripadao je dominantnom tipu virusa H5N1 u Hrvatskoj pokazujući najveću srodnost s izolatom iz labuda u Zagrebu. Na istoj lokaciji početkom ožujka 2006. je pronađena i lešina divlje patke iz koje je također izdvojen virus H5N1, no filogenetski je bio različit od svih ostalih izolata virusa H5N1 iz Hrvatske pokazujući najveću srod-nost s određenim izolatima iz zapadne Europe. Nalaz sva tri različita tipa virusa na maloj lokaciji, u močvari Pantana, može se povezati s vrlo hladnom zimom i zaleđenim vo-denim površinama u to vrijeme u kontinentalnom dijelu Hrvatske i istočne Europe općenito te s povlačenjem migratornih ptica prema toplijim područjima. Tezu o širenju


virusa H5N1 divljim pticama iz crnomorskog bazena u ostale dijelove Europe zbog vrlo hladne zime u istočnoj Europi početkom 2006. i posljedičnoj disperziji divljih ptica prema manje hladnim područjima iznijeli su Kilpatric i sur. (2006.) i Alexander i Capua (2008.). U Hrvatskoj su tijekom 2005. i 2006. dokazana tri tipa virusa H5N1 u tri različite vrste divljih ptica, međutim nije nađena povezanost između tipova virusa i vrsta divljih ptica. Tako su izolati iz labudova u okolici Trogira bili filogenetski različiti od izolata iz labudova s drugih lokacija u Hrvatskoj. Izolat iz riječnih galebova u okolici Trogira je, nasuprot tome, vrlo sličan izolatima iz labudova s drugih lokacija u Hrvatskoj. Shodno rečenom, može se zaključiti da je u Hrvatskoj došlo do širenja virusa između različitih vrsta divljih ptica. Dokaz virusa visokopatogene influence podtipa H5N1 u riječnih galebova nije čest, a isto tako nije uobi-čajeno ni izdvajaje tog virusa iz zdravih ptica. Većina izolata virusa H5N1 iz divljih ptica bila je iz uginulih ili teško bolesnih jedinki, uzimajući u obzir i dokumentirana izdva-janja virusa H5N1 iz riječnih galebova (Ellis i sur., 2004.), tako da je ovo prvi nalaz tog virusa u naizgled zdravih riječnih galebova. Moguće je da su galebovi ulovljeni u fazi inkubacije kada su izlučivali virus, ali još nisu pokazivali simptome bolesti. Da li su galebovi kasnije oboljeli, nije poznato budući da su pušteni odmah nakon uzimanja uzo-raka. Istraživanja ukazuju da se evolucijom virusa H5N1 od 1997. do 2005. godine povećavala njegova patogenost za pokusno zaražene galebove od inaparentne infekcije do fa-talne bolesti (Perkins i Swayne, 2002.; Perkins i Swayne, 2003.; Brown i sur., 2008.; Brown i sur., 2008. a), pa se može pretpostaviti da su galebovi ulovljeni na Pantani bili u fazi inkubacije. Pouzdan odgovor na ovo pitanje mogao bi se utvrditi nakog pokusnog zaražavanja rječnih galebova odgovarajućim izolatom virusa H5N1. Zahvala Genska analiza izdvojenih izolata je financirana sredstvima projekta „Genska karakterizacija virusa influence ptica i newcastleske bolesti u Hrvatskoj“ (broj 048-0481153-1136) Ministarstva znanosti, obrazovanja i športa Republike Hrvat-ske (voditelj dr. sc. Vladimir Savić). Sve aktivnosti vezane za uzimanje i dostavu uzoraka i njihovo laboratorijsko pre-traživanje na virus influence ptica, kao i aktivnosti vezane za hvatanje i uzorkovanje divljih ptica te provedbu epidemio-loških istraživanja na terenu financiralo je Ministarstvo po-ljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja Republike Hrvatske.

Literatura

Alexander, D. J. (2000.): A review of avian influenza in different bird species. Vet. Microbiol., 74, 3-13.

Alexander, D. J., I. Capua (2008.): Avian influenza in poultry. WPSJ, 64, 513-532.

Anonimus (2004.): Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 5th edn. Office Internationale des Epi-zooties, Paris, France.

Anonimus (2009.): Update on highly pathogenic avian influenza in animals (type H5 and H7). http://www.oie.int/wahis/reports/ /en_imm_0000005448_20050724_183940.pdf, 29 siječnja 2009.

Brown, J. D., D. E. Stallknecht, J. R. Beck, D. L. Suarez, D. E. Swayne (2008. a): Susceptibility of North American Ducks and Gulls to H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Viruses. Emerging Infectious Diseases, 12 (11), 1663-1670.

Brown, J. D., D. E. Stallknecht, D. E. Swayne (2008.): Experimental infections of herring gulls (Larus argentatus) with H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses by intranasal inoculation of virus and ingestion of virusinfected chicken meat. Avian Pathology, 37 (4), 393-397.

Capua, I., D. Alexander (2004.): Avian influenza: recent developments. Avian Pathology 33, 393-404.

Chen, H., G. J. Smith, S. Y. Zhang, K. Qin, J. Wang, K. S. Li, R. G. Webster, J. S. Peiris, Y. Guan (2005.). Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl. Nature 436, 191-192.

Claas, E. C., A. D. Osterhaus, R. van Beek, J. C. De Jong, G. F. Rimmelzwaan, D. A. Senne, S. Krauss, K. F. Shortridge, R. G. Webster (1998.). Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet 351, 472-477.

Cox (1998.). Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness. Science 279, 393-396.

Ellis, T. M., R. B. Bousfield, L. A. Bissett, K. C. Dyrting, G. S. M. Luk, S. T. Tsim, K. Sturm-Ramirez, R. G. Webster, Y. Guan, J. S. M Peiris (2004.): Investigation of outbreaks of highly pathogenic H5N1 avian influenza in waterfowl and wild birds in Hong Kong in late 2002. Avian Pathology, 33 (5) 492-505.

Fouchier R. A. M., V. Munster, A. Wallensten, T. M. Bestebroer, S. Herfst (2005.): Characterization of a novel Influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from Black-Headed Gulls. J. Virol, 79, 2814-2822.

Hien, T. T., M. de Jong, J. Farrar (2004.): Avian influenza–a challenge to global health care structures. N Engl J Med 351, 2363–2365.

Hinshaw, V. S., R. G. Webster, R. J. Rodriguez (1981.): Influenza A viruses: combinations of hemagglutinin and neuraminidase subtypes isolated from animals and other sources. Arch Virol., 67, 191-201.

Hoffmann, E., J. Stech, Y. Guan, R. G. Webster, D. R. Perez (2001.): Universal primer for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch. Virol. 146, 2275–2289.

Kilpatrick, A. M., A. A. Chmura, D. W. Gibbons, R. C. Fleischer, P. P. Marra, P. Daszak (2006.): Predicting the global spread of H5N1 avian influenza. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 19;103(51):19368-19373.

Kuiken, T., G. Rimmelzwaan, D. Riel, G. Amerongen, M. Baars, R. Fouchier, A. Osterhaus (2004.): Avian H5N1 influenza in cats. Science. 2004;306: 241.

Liu, J., H. Xiao, F. Lei, Q. Zhu, K. Qin, X. W. Zhang, X. L. Zhang, D. Zhao, G. Wang, G. Y. Feng, J. Ma, W. Liu, J. Wang, G. F. Gao (2005.). Highly pathogenic H5N1 influenza virus infection in migratory birds. Science 309, 1206.

Normile, D. (2006.). Avian influenza. Evidence points to migratory birds in H5N1 spread. Science 311, 1225.

Perkins, L. E. L., D. E. Swayne (2003.): Comparative susceptibility of selected avian and mammalian species to Hong Kong-origin H5N1 high-pathogenicity avian influenza virus. Avian Diseases, 47, 956-967.

Payungporn, S., S. Chutinimitkul, A. Chaisingh, S. Damrong-wantanapokin, C. Buranathai, A. Amonsin, A. Theam-


boonlers, Y. Poovorawan, (2006): Single step multiplex real-time RT-PCR for H5N1 influenza A virus detection Journal of Virological Methods 131, 143–147.

Payungporn, S., P. Phakdeewirot, S. Chutinimitkul, A. Theam-boonlers, J. Keawcharoen, K. Oraveerakul, A. Amonsin, Y. Poovorawan, (2004.): Single-step multiplex reverse trans-cription-polymerase chain reaction (RTPCR) for influenza A virus subtype H5N1 detection. Viral Immunol. 17, 588–593.

Rott, R. (1992.): The pathogenic determinant of influenza virus. Veterinary Microbiology, 33, 303 - 310.

Salzberg, S. L., C. Kingsford, G. Cattoli, D. J. Spiro, D. J. Janies, M. Mehrez Aly, I. H. Brown, E. Couacy-Hymann, G. M. De Mia, D. H. Dung, A. Guercio, T. Joannis, A. S. M. Ali, A. Osmani, I. Padalino, M. D. Saad, V. Savić, N. A. Sengamalay, S. Yingst, J. Zaborsky, O. Zorman-Rojs, E. Ghedin, I. Capua (2007.): Genome Analysis Linking Recent European and African Influenza H5N1 Viruses. Emerging Infectious Diseases 13: 713-718.

Savić, V. (2005.): Virus ptičje gripe H5N1 u Hrvatskoj. Veterinarska stanica, 2005, 36, 129-130.

Savić, V. (2006.): Influenca ptica – globalna prijetnja. Infektološki glasnik, 26, 7-12.

Sims, L. D., T. M. Ellis, K. K. Liu, K. Dyrting, H. Wong, M. Peiris, Y. Guan, K. F. Shortridge (2003.). Avian influenza in Hong Kong. U: Proceedings of the Fifth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, April 14-17 2002. Avian Diseases, 47, 832-838.

Sims, L. D., J. Domenech, C. Benigno, S. Kahn, A. Kamata, J. Lubroth, V. Martin, P. Roeder (2005.): Origin and evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza in Asia. Veterinary Record ,157:159.

Stieneke-Grober, A., M. Vey, H. Angliker, E. Shaw, G. Thomas, C. Roberts, H. D. Klenk, W. Garten (1992.): Influenza virus hemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin-like endoprotease. EMBO Journal, 11, 2407-2414.

Xu, X., E. K. Subbarao, N. J. Cox, Y. Guo (1999.): Genetic characterization of the pathogenic influenza A/Goose/Guang-dong/1/96 (H5N1) virus: similarity of its hemagglutinin gene to those of H5N1 viruses from the 1997 outbreaks in Hong Kong. Virology, 261, 15-9.

Subbarao, K., A. Klimov, J. Katz, H. Regnery, W. Lim, H. Hall, M. Perdue, D. Swayne, C. J. Bender, M. Huang, T. Hemphill, M. Rowe, M. Shaw, X. Xu, K. Fukuda, N. Cox (1998.): Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness. Science 279, 393-396.

World Health Organization/World Organisation for Animal Health/Food and Agriculture Organization H5N1 Evolution Working Group (2008.): Toward a unified nomenclature system for highly pathogenic avian influenza virus (H5N1). Sažetak. Emergimg Infectious Diseases [serial on the Internet]. 2008 Jul, 29. siječnja 2009. http://www.cdc.gov/EID/content/ /14/7/e1.htm

INTRODUCTION AND SPREAD OF HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA VIRUS (H5N1) WITH WILD BIRDS IN CROATIA DURING 2005 AND 2006

Summary Seventeen isolates of highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1 were isolated in Croatia during the period from October 2005 to March 2006. All of the viral isolates were found in wild birds: Mute Swans (Cygnus olor), Black-headed Gulls (Larus ridibundus) and a Mallard (Anas platyrhynchos) from six locations: 1) “Grudnjak” fishponds - Zdenci, 2) “Ribnjak 1905” fishponds - Našice, 3) Slatina on the island of Čiovo, 4) Pantana marsh near Trogir, 5) Zagreb and 6) Draž in Baranja. Phylogenetic analysis of seven representative isolates has shown that they cluster in three groups which undoubtedly points to at least three independent introductions of the virus in Croatia during a relatively short period of time. At all locations, except Pantana and nearby Čiovo, only one type of the virus was found with the highest similarity to the isolates from dead wild birds at Qinghai Lake in China and isolates from wild birds and poultry in the Asian part of Russia. Beside this type of the virus, the remaining two types of H5N1 viruses isolated in Croatia were also found on Pantana. The diversity of H5N1viruses found in Pantana can be associated with very cold weather and frozen water surfaces in early 2006 in the continental part of Croatia as well as countries in the region and the movements of birds towards warmer areas. There was no correlation of the type of the H5N1 virus and the species of bird from which it was isolated indicating spread of the virus among different species of wild birds. This is the first record of avian influenza viruses in Croatia, and the first isolation of highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1 from apparently healthy Black-headed Gulls. Key words: avian influenza, H5N1, wild birds, Croatia


UVOĐENJE SUSTAVA KVALITETE I AKREDITACIJA U HVI – PODRUŽNICA CENTAR ZA PERADARSTVO

Tajana Amšel Zelenika, Vladimir Savić, Milivoj Mikec, Borka Šimpraga, Marina Tišljar, Radmila Raguž-Đurić, Mirta Balenović

Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

U radu su opisane ativnosti koje je podružnica Centar za peradarstvo poduzela kako bi ispunila zahtjeve norme HRN EN ISO / IEC 17025 „Opći zahtjevi za osposobljenost ispitnih i umjernih laboratorija.“ s ciljem stjecanje ovlasnice i statusa akreditiranih laboratorija. Ključne riječi: sustav kvalitete, Centar za peradarstvo, laboratorij, akreditacija Uvod Centar za peradarstvo je osnovan 1961. godine u okviru Ve-terinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, a 1993. postaje podružnica Hrvatskog veterinarskog instituta (HVI). Od tada pa sve do danas radi na unapređenju peradarstva Hrvatske, planiranju intenzivne peradarske proizvodnje, napose mesa i jaja, čvrstom povezivanju s proizvođačima mesa i jaja peradi i očuvanju zdravlja ljudi kroz zdravstveni nadzor svih di-jelova proizvodnje. Pristupanje Republike Hrvatske europ-skim i gospodarskim integracijama zahtijeva promjene i približavanje hrvatskog zakonodavstva zakonodavstvu unu-tarnjeg tržišta Europske unije. Tako je i otvaranjem po-glavlja Sigurnost hrane, veterinarstvo i fitosanitarni nadzor pokrenuto prilagođavanje našeg zakonodavstva zakonodav-stvu Europske unije, što je i pred Centar za peradarstvo kao podružnicu HVI-a stavilo nove zahtjeve i izazove. Kako bi i prije ulaska u EU osigurali konkurentnost, ali i dobili odo-brenje za obavljanje dijagnostike bolesti koje propisuje Naredba o mjerama za zaštitu životinja od nametničkih bolesti i njihovom financiranju i pravilnici koji su iz nje proizašli, HVI – Centar za peradarstvo mora imati za to osposobljene i akreditirane laboratorije. Uspostava i održa-vanje povjerenja kupaca u sigurnost i kvalitetu usluga naša je primarna zadaća, a da bismo u tome uspjeli, moramo primjenjivati suvremene metode za dokazivanje sukladnosti naših usluga sa zahtjevima za sigurnost, zdravlje i zaštitu okoliša te zahtjevima za kvalitetu koj su pred nas po-stavljeni. Kupci su zainteresirani za pouzdanost rada usta-

nova koje im nude usluge ispitivanja i potvrđivanja. HVI je pokrenuo postupak za stjecanje dokaza o svojoj stručnoj i tehničkoj osposobljenosti za obavljanje dijagnostičkog ispi-tivanja, te stjecanje ovlasnice prema normi HRN EN ISO / IEC 17025.

Ispunjavanje zahtjeva norme HRN EN ISO / IEC 17025 za potrebe akreditacije

Akreditaciju provodi Hrvatska akreditacijska agencija (HAA), a njome vrednuje određenu instituciju i potvrđuje da je stručno i tehnički osposobljena za rad, te joj za to izdaje ovlasnicu. U Centru za peradarstvo, kao i u cijelom HVI-u, pripreme za pokretanje postupka akreditacije laboratorija započele su u srpnju 2005. godine. Bio je to opsežan posao čiji je cilj bio proizvesti mnoštvo dokumenata kojima se potvrđuje suklad-nost rada i djelovanja laboratorija Centra za peradarstvo sa zahtjevima norme HRN EN ISO / IEC 17025 „Opći zahtjevi za osposobljenost ispitnih i umjernih laboratorija“. Akredita-cija se temelji na ocjeni stručne i tehničke osposobljenosti tijela za ocjenu sukladnosti prema europski i svjetski prihva-ćenim kriterijima. Ispitni laboratoriji moraju izgraditi sustav upravljanja kvalitetom i udovoljiti tehničkim zahtjevima norme HRN EN ISO / IEC 17025. Sustav upravljanja kvali-tetom obuhvaća organizacijski ustroj, postupke i procese, a tehnički zahtjevi odnose se na osoblje, smještaj laboratorija, okolišne uvjete i ispitne metode. Da bi akreditacija bila uspješno provedena, a laboratoriji Centra za peradarstvo

Dr. sc. Tajana Amšel Zelenika, Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Heinzelova 55, Zagreb, Republika Hrvatska; tel: ++385 (0) 1 2441 394; fax: ++385 (0) 1 2441 396; e-mail. [email protected]

UVOĐENJE SUSTAVA KVALITETE I AKREDITACIJA U HVI – PODRUŽNICA CENTAR ZA PERADARSTVO 22

dobili status akreditiranog labora-torija, bila je potrebna predanost svih zaposlenika i velika finan-cijska ulaganja. Djelatnosti Centra za peradarstvo su brojne, a najvažnije su: labora-torijska i terenska dijagnostika zaraznih, nametničkih i drugih bo-lesti peradi; ispitivanje zdravstve-ne ispravnosti stočne hrane te si-rovina i aditiva koje služe za njezinu proizvodnju; znanstvena, razvojna i primijenjena istraživa-nja u području veterinarstva i pe-radarstva, te prenošenje znanstve-nih dostignuća u praksu; istraži-vanje pojava i uzroka širenja za-raznih, nametničkih i drugih bo-lesti peradi i načina njihova suzbi-janja; istraživanje, razvijanje i uvođenje u upotrebu novih laboratorijskih i kliničkih metoda za dijagnostiku, analitiku, preventivu i terapiju peradi; skupljanje, obrada i interpre-tacija podataka o zdravlju i proizvodnosti peradi te informi-ranje državnih tijela, proizvođača, udruženja i komora. Centar za peradarstvo u svom sastavu ima sljedeće labora-torije/jedinice:

- Laboratorij za analitiku stočne hrane (C-1) - Laboratorij za bakteriologiju (C-2) - Laboratorij za patologiju (C-3) - Laboratorij za virusologiju i serologiju (C-4) - Opća jedinica (C-5)

Za provođenje sustava kvalitete i dobru labo-ratorijsku praksu nužno je osigurati opremu i metode te referencijske materijale, provesti vali-daciju metoda i optimizaciju mjernog postupka, utvrditi mjernu nesigurnost, osigurati sljedivost i kompetentnost procjene mjernih podataka, sudje-lovati u međulaboratorijskom ispitivanju te osi-gurati zaštitu okoliša i sigurnost na radu. Uz opis organizacije Centra za peradarstvo definirane su odgovornosti i odnosi između upravljanja susta-vom kvalitete i tehničkim poslovima. Svi zaposlenici Centra za peradarstvo dužni su ob-našati svoj posao stručno i profesionalno. Kupce kao korisnike usluga naših labotratorija prije svega zanima brzina izvođenja i točnost pretrage. Da bi neka dijagnostička metoda bila akreditirana, laboratorij mora ispunjavati čitav niz uvjeta propisanih normom HRN EN ISO / IEC 17025.

Uvjeti koje laboratorij mora ispuniti da bi bio akreditiran su: 1. Osoblje: uz odgovarajuću stručnu spremu

osoblje mora trajno raditi na edukaciji i usavršavanju znanja te biti podvrgnuto ispitivanju vještina i sposobnosti.

U Centru za peradarstvo zaposleno je 24 djelatni-ka (Slika 2).

Tablica 1. Prikaz djelatnika prema stručnoj spremi Table 1. View employees by qualification

Stručna sprema Broj djelatnika Visoka stručna sprema - doktor znanosti 7 Visoka stručna sprema - magistar znanosti 1 Visoka stručna sprema - magistar specijalist 1 Visoka stručna sprema 2 Srednja stručna sprema 12 Niža stručna sprema 1

Slika 1. Organizacija HVI – podružnica Centar za peradarstvo

Predstojnik podružnice

Voditelj kvalitete podružnice

C-1 C-2 C-3 C-4 C-5

Laboratorij za analitiku

stočne hrane

Laboratorij za

bakteriologiju

Laboratorij za

patologiju

Laboratorij za virusologiju i

serologiju Opća

jedinica

Slika 2. Djelatnici Centra za peradarstvo Figure 2. Staff of the Poultry Center


Centar za peradarstvo posebno brine o edukaciji svojih djelatnika i trajnom nadzoru njihova rada. Tijekom 2008. godine 16 djelatnika Centra za peradarstvo bilo je na ukupno 36 znanstvenih ili stručnh usavršavanja. Naši stručnjaci objavili su tijekom 2008. godine 24 znanstvena i stručna rada (Tablica 2), čime dokazuju da prate literaturu i usavr-šavaju svoje znanje, koje kasnije primjenjuju u svom radu. Tablica 2. Broj radova objavljenih u 2008. godini. Table 2. Number of papers published in 2008 year.

Rad Broj radova Doktorska disertacija 2 Knjige 1 Radovi u časopisima 13 Radovi u zbornicima 8 Ukupno 23

2. Uvjeti smještaja i okoliša – uvjeti u laboratoriju moraju omogućiti nesmetan rad i provedbu ispitivanja uz zaštitu od nepoželjnih utjecaja

Da bi se osigurali ovi uvjeti, u Centru za peradarstvo napravljen je čitav niz građevinskih zahvata. Uređen je prijemni ured koji je u potpunosti opremljen za zaprimanje uzoraka (Slika 3).

Slika 3. Prijemni ured Figure 3. The reception office

U cilju osiguravanja kvalitete rada Centra za peradarstvo tijekom 2007. i 2008. godine adaptirano je spremište, u pot-punosti je izgrađena i u upotrebu stavljena garderoba i uređen je sanitarni čvor. U Laboratoriju za virusologiju i serologiju izvršena je rekonstrukcija prostora u kojem se obavlja molekularna dijagnostika i u potpunosti je uređen prostor (Virusologija 4) za manipulaciju organima potencijalno zaraženim virusom i za izolaciju RNA (Slika 4). Uređen je i prostor za pripremu hranjivih podloga i ured voditelja kvalitete. Klimatizirani su laboratorij za bakte-riologiju i prostor vagaone u Laboratoriju za analitiku stočne hrane.

Slika 4. Virusologija 4 Figure 4. Virology 4 Laboratoriji Centra za peradarstvo opskrbljeni su najsuvre-menijom opremom koja se redovito servisira i umjerava da bi se omogućilo nesmetano provođenje ispitivanja (Slika 5).

Slika 5. Oprema laboratorija za molekularnu dijagno-stiku - Virusologija 3

Figure 5. Laboratory equipment for molecular diagnostics - Virology 3

Slika 6. Protupožarni ormar Figure 6. Fire cabinet


Tijekom 2007. i 2008. godine za potrebe akreditaranja me-toda nabavili smo sigurnosni (protupožarni) ormar za čuva-nje zapaljivih kemikalija (Slika 6), laminar za rad s visoko-patogenim mikroorganizmima, centrifugu, centrifugu s hlađenjem, termostatiranu komoru, spektrofotometar, dva CO2 inkubatora, vodenu kupelj, referentni termometar, elektronsku multikanalnu pipetu, pH metar, dva hladnjaka i četiri računala. Jedna od najvažnijih investicija bila je nabava servera i umrežavanje svih računala u Centru za peradarstvo. U tijeku je postavljanje računalnog programa „Vet Lab“ koji će omogućiti brzi upis pristiglih uzoraka, metoda pretraživanja i rezultata, čime će biti skraćeno potrebno vrijeme za ispu-njavanje obrazaca potrebnih za zaprimanje uzoraka te omo-gućeno brzo i točno prosljeđivanje uzoraka u laboratorij.

3. Metode ispitivanja, validacija i osiguravanje kvalitete rezultata ispitivanja, međulaboratorijska testiranja

Posebna pozornost posvećuje se odabiru dijagnostičkih me-toda, pri čemu se prvenstvo daje standardnim metodama koje su sukladne najnovijim izdanjima međunarodnih normi (ISO, AOAC, OIE). Također se, da bi se dokazalo da me-toda koja se koristi dosljedno daje ono što se i očekuje s odgovarajućom točnošću te da je prikladna za namjenu za koju se koristi, provodi se validacija. U postupku validacije mikrobioloških metoda obuhvaćaju se sljedeći parametri: a) točnost - je postotak pravilno identificiranih uzoraka b) ponovljivost (repetibilnost) - je preciznost u izvođenju

iste metode na identičnom testnom materijalu, u istim uvjetima (isti analitičar, ista oprema, isti laboratorij, ista vrsta i broj (lot) podloge, kratko vremensko razdoblje)

c) obnovljivost (reproducibilnost) - je preciznost u izvo-đenju iste metode na identičnom ili jednakom testnom materijalu u različitim uvjetima (različiti analitičari, lotovi podloga, različito vrijeme, jednaki, ali ne i nužno isti materijali).

Glavna prednost akreditacije je dokaz pouzdanosti rezultata ispitivanja i međunarodno priznavaje ispitnih rezultata. Zato svi laboratoriji Centra za peradarstvo tijekom godine sudje-luju u međulaboratorijskim testiranjima. Laboratorijska ispitivanja prikazana prema laborato-rijima tijekom 2008. godine Laboratorij za analitiku stočne hrane 1. siječanj 2008.: Central Institute for Supervising and

Testing in Agriculture (ÚKZÚZ), Czech Republic – Basic Parameters (vlaga, protein, masti, pepeo, vlakna, šećer, škrob, Ca, P, K, Mg, Na, Mn, Zn, Fe, Cu)

2. svibanj 2008.: Central Institute for Supervising and Testing in Agriculture (ÚKZÚZ), Czech Republic – Basic Parameters (vlaga, protein, masti, pepeo, vlakna, šećer, škrob, Ca, P, K, Mg, Na, Mn, Zn, Fe, Cu)

3. listopad 2008.: Central Institute for Supervising and Testing in Agriculture (ÚKZÚZ), Czech Republic –

Basic Parameters (vlaga, protein, masti, pepeo, vlakna, šećer, škrob, Ca, P, K, Mg, Na, Mn, Zn, Fe, Cu)

4. siječanj 2008.: Veterinary Laboratories Agency, UK - izdvajanje i identifikacija salmonela – ISO 6579 metoda

5. travanj 2008.: Veterinary Laboratories Agency, UK - izdvajanje i identifikacija salmonela – ISO 6579 metoda

6. listopad 2008.: Veterinary Laboratories Agency, UK - izdvajanje i identifikacija salmonela – ISO 6579 metoda.

Laboratorij za bakteriologiju

1. QAU, Veterinary Laboratories Agency, SUTTON, UK 2. veljača 2008., izdvajanje i identifikacija Salmonella spp 3. svibanj 2008., izdvajanje i identifikacija Salmonella spp 4. studeni 2008., izdvajanje i identifikacija Salmonella spp

Laboratorij za patologiju 1. Međulaboratorijsko testiranje u suradnji sa Zavodom za

opću patologiju i patološku morfologiju Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu – 10 uzoraka pato-histoloških preparata i 10 uzoraka lešina različitih vrsta ptica (makroskopska patološkomorfološka pretraga)

Laboratorij za virusologiju i serologiju

1. ožujak 2008.: Veterinary Laboratories Agency, UK - 2008 EU AI PCR Proficiency testing

2. veljača 2008.: Veterinary Laboratories Agency, UK - Antigen and Antiserum Ring Trial 2008.

Laboratorij za virusologiju i serologiju je tijekom 2008. godine u sklopu projekta "Emergency assistance for early detection and prevention of avian influenza in the Eastern Europe and Caucasus region" TCP/RER/3004 Project orga-niziro Avian Influenza Interlaboratory Comparison Testing. Rezultati svih međulaboratorijskih testiranja bili su zadovo-ljavajući, što je dokaz da su primijenjene metode i rezultati koji su njima dobiveni međunarodno prihvaćeni. Time se povećava povjerenje kupaca i zaposlenika u laboratorij te se smanjuje potreba za dodatnim ispitivanjem.

Zaključak

Akreditacija je postupak za dokazivanje stručne i tehničke osposobljenosti za rad pojedinog laboratorija. Da bi se uspješno dobio status akreditiranog laboratorija, potrebna je predanost svih zaposlenika i velika financijska ulaganja. No, prednost koju laboratorij stječe dobivanjem ovlasnice očituje se prvenstveno u priznavanju rezultata ispitivanja u svim akreditiranim laboratorijima u Hrvatskoj, ali i izvan njenih granica. Djelatnicima Centra za peradarstvo uvijek je na prvom mjestu kupac. Značaj akreditacije za naše kupce očituje se u činjenici da su svi čimbenici koji utječu na točnost pretrage kontrolirani, da je osoblje stalno educirano i


da su rezultati analiza točni, vjerodostojni i izdani u najkraćem roku. Prednost akreditiranih laboratorija trebala bi se očitovati i mogućnošću obavljanja dijagnostike i na hrvatskom i na globalnom tržištu.

Literatura

HRN EN ISO / IEC 17025:2007 (2007.): Opći zahtjevi za osposobljenost ispitnih i umjernih laboratorija. Državni zavod za norme, Zagreb

INTRODUCTION OF THE QUALITY SYSTEM AND ACCREDITATION IN CROATIAN VETERINARY INSTITUTE – BRANCH POULTRY CENTRE

Summary

This paper includes descriptions of the activities which the Centre for Poultry took in order to fulfill the requirements for the standard HRN EN ISO / IEC 17025 „General conditions for the qualification of laboratories for testing and measuring” with the aim to obtain the certificate and the status of an accreditated laboratory. Key words: quality system, Poultry Centre, laboratory, accreditation


OBRAZOVANJE KAO UVJET RAZVITKA HRVATSKE PERADARSKE PROIZVODNJE

Đurđica Žutinić1, Radmila Raguž-Đurić2

1Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska 2Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Pretpostavlja se da je za uspješan napredak hrvatske peradarske proizvodnje, osobito obiteljskih peradarskih gospodarstava neophodan takozvani kapital znanja. Odnosno, oblikovanje novih evolutivnih sposobnosti peradarskih proizvođača utemeljenih na znanju i poznavanju tehnologije, organizacije i poslovanja, a dovoljno fleksibilnih za brze prilagodbe i usvajanje promjena. Tragom te pretpostavke u radu se istražuje je li u sadašnjem sustavu poljoprivrednog/veterinarskog obrazovanja dostatno razvijen podsustav cjeloživotnog obrazovanja za potrebe peradarskih proizvođača. Analiza je pokazala da je potrebno osmisliti i organizirati heterogene specijalističke programe za permanentno stručno usavršavanje i osposobljavanje djelatnika u peradarskoj proizvodnji. Ključne riječi: cjeloživotno obrazovanje, obrazovni sustav, peradarski proizvođači Uvod “The illiterate of the 21st century will not be those who cannot read and write, but those who cannot learn, unlearn, and relearn..” Alvin Tofler

(Nepismeni u 21 stoljeću neće biti oni koji ne znaju čitati i pisati, već oni koji ne žele učiti, koji zaboravljaju naučeno i koji ne žele ponovno učiti.) Danas u svijetu postoji opća suglasnost da između obra-zovanja i gospodarskog rasta postoji tijesna međuzavisnost, odnosno da obrazovanje postaje odlučujući činitelj gospo-darskog i socijalnog razvitka. Veza između stope tehničkog napretka i kvalitetne ljudske intervencije sve je očitija kao i potreba da oni koji aktivno sudjeluju u gospodarstvu budu osposobljeni inovirati i služiti se novim tehnologijama (Delors, 1998.). Drugim riječima, odlučujući činitelji proiz-vodnje premještaju se u sferu „ljudskog faktora“ u kojem znanje biva glavni resurs (Schultz, 1985.). Stoga je ulaganje u naobrazbu (ili ulaganje u ljude) i znanost prepoznato kao najprofitabilnije ulaganje. Suvremeni pristup obrazovanju polazi od koncepta „cjelo-životnog učenja” i „društva koje uči”. Sam koncept je pri-hvaćen na konferenciji OECD-a (Directorate for Education, Labour, Employment and Social Affair) 1996. godine te postaje temelj europske obrazovne politike. Cjeloživotno (ili

doživotno) učenje podrazumijeva proces ili aktivnosti usva-janja različitih znanja, stjecanja vještina, kvalifikacija i kom-petencija tijekom cijelog života za osobne, društvene i profesionalne potrebe. Ono uključuje sve vrste učenja: for-malno učenje, neformalno učenje i informalno učenje. For-malno učenje ili obrazovanje odvija se u obrazovnim ustano-vama (škole, fakulteti) i njime se stječu priznate diplome i kvalifikacije. Neformalno učenje provodi se nezavisno od službenog obrazovnog sustava, a može biti organizirano na radnom mjestu ili kroz aktivnosti različitih strukovnih druš-tva ili udruženja, nevladinih organizacija i sl. Informalno učenje, za razliku od formalnog i neformalnog, ne mora nužno biti svjesno i namjerno učenje (pr. razmjena znanja u obitelji i među prijateljima, pretraživanje interneta, svako-dnevno nenamjerno učenje). Osnovna načela i ciljevi cjeloživotnog obrazovanja sadržani su u europskom Akcijskom planu za provedbu strategije cjeloživotnog obrazovanja, koji je sastavni dio Lisabonske deklaracije.1 On se sastoji od 6 ključnih točaka (Commission Staff Working Paper, 2000.): 1. pristup osnovnim vještinama - cilj je osigurati stjecanje

„novih” vještina (informatička pismenost, strani jezici, vještine za sudjelovanje u javnom životu);

2. više ulaganje u ljudske potencijale – potrebno je osi-gurati poticaje za dodatno obrazovanje, financiranje tečajeva i dr. na nacionalnoj razini, razni poduzeća i institucija;

Prof. dr. sc. Đurđica Žutinić, Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zavod za ekonomiku poljoprivrede i agrarnu sociologiju, Svetošimunska 25, 10 000 Zagreb, Hrvatska, Tel: 385 (1) 239-3742. Fax: 385 (1) 239-3745. E-mail: [email protected]

OBRAZOVANJE KAO UVJET RAZVITKA HRVATSKE PERADARSKE PROIZVODNJE 27

3. inovacije u poučavanju i učenju - usmjerenost na ko-risnika i njegove potrebe, povezivanje raznih područja/ /sadržaja obrazovanja u jedinstvene programe, kreiranje heterogenijih obrazovnih programa;

4. vrednovanje znanja - certificiranja i vrednovanja obra-zovnih programa koji dokazuju posjedovanje određenih kvalifikacija;

5. savjetovanje i vođenje - osigurati informaciju ljudima kako i gdje se dodatno obrazovati i usavršavati kako bi im se pružila veća mogućnost za pronalaženje zaposle-nja, ostvarivanje dodatnih kvalifikacija, mijenjanje posla i sl. Treba izgraditi svijest o potrebi dodatnog i per-manentnog obrazovanja i ukazati na sve mogućnosti primjene u praksi i načine na koji će im ta znanja pomoći na tržištu,

6. približiti obrazovanje korisnicima – osigurati dostupnost obrazovanja u lokalnim okvirima. Suvremene tehnolo-gije omogućavaju da se učenje odvija i u udaljenim i rijetko naseljenim područjima, a učenje preko interneta omogućava fleksibilnost i učenje bez obzira na to gdje se netko fizički nalazi u danom trenutku.

Iako se u Hrvatskoj posljednjih godina afirmira i promovira cjeloživotno obrazovanje kroz sektorske strategije2 i različite projekte/programe, stručne analize pokazuju da je radna snaga u nas nedovoljno kvalificirana ili neodgovarajuće kvalificirana za potrebe suvremenog tržišnog gospodarstva (Bejaković, 2006.). To se naročito odnosi na sektor poljo-privrede u kojem je razina školske naobrazbe poljoprivredne radne snage nepovoljna, samim time i prepreka uspješnom i racionalnom korištenju razvojnih poljoprivrednih potencijala

te postizanju njezine međunarodne konkurentnosti (Žutinić, 2003.).3 U ovom radu, na temelju dostupnih podataka i informacija, analiziramo je li u sadašnjem sustavu poljoprivrednog/ve-terinarskog obrazovanja dostatno razvijen podsustav cjelo-životnog obrazovanja za potrebe peradarskih proizvođača, osobito kad je riječ o malim i srednjim obiteljskim pera-darskim gospodarstvima. Cilj je ovog priloga aktualizirati potrebu širih znanstvenih istraživanja i stručnih rasprava o permanentnom stručnom usavršavanju peradarskih proiz-vođača.

Analiza stanja

Obrazovna struktura peradarskih proizvođača Zasebno statističko praćenje stanja formalne naobrazbe pe-radarskih proizvođača u nas ne postoji. Kako bismo dobili donekle uvid u tu obrazovnu strukturu poslužili smo se nala-zima empirijskog istraživanja Raguž-Đurić iz 2004. godine.4 Prema tom istraživanju 17,5% peradara imalo je nepotpunu (7 razreda) ili završenu osnovnu školu, 68,0% završilo je srednju školu, a razmjerno mali postotak imalo je završenu višu školu i fakultet (14,5%). Iako je obrazovna struktura peradarskih proizvođača u ovom uzorku znatno povoljnija u usporedbi s obrazovnom strukturom poljoprivrednog stanov-ništva (Tablica 1), ubrzani prodor novih tehnologijskih po-stignuća i sve zahtjevnije tržište (kakvoća proizvoda i pro-izvodne orijentacije sa što manjim posljedicama na prirodni okoliš) traže proizvođače s višim stupnjem znanja i vještina te nameću potrebu za stalnim usavršavanjem.

Tablica 1. Usporedna analiza formalne naobrazbe poljoprivrednog stanovništva i peradarskih proizvođača (u %) Table 1. Comparative analyses of formal education of farmers and poultry producers (in %)

Poljoprivredno stanovništvo Farm population

Peradarski proizvođači Poultry producers Škola

School 2001. 2004.

Bez školske spreme i 1-7 razreda osnovne škole No schooling and 1-7 class of elementary school 38,3 3,1

Osnovna škola Elementary school 39,0 14,4

Srednja škola Secondary school 21,7 68,0

Viša škola Non-university college 0,6 5,2

Fakultet i više University studies 0,3 9,3

Nepoznato Unknown 0,1 -

Ukupno Total

100,0 N= 206.036

100,0 N= 97

Izvor: Popis stanovništva 2001. godine, DZS RH; Raguž-Đurić, 2004. Source: Population census 2001, Central Bureau of Statistics of the Republic of Croatia; Raguž-Đurić, 2004


Institucionalno (formalno) obrazovanje

U sustavu formalnog srednjoškolskog i visokog obrazo-vanja, programi izobrazbe budućih stručnjaka i proizvođača iz područja peradarstva su dio veterinarskih i poljopri-vrednih kurikuluma. Programi izobrazbe za „niža” stručna zanimanja (veterinarski tehničar, poljoprivredni tehničar) nude se u osamnaest stručnih škola (Tablica 2), ali s relativno oskudnim sadržajima iz područja peradarstva. Stručni preddiplomski studij zootehnike, u trajanju od tri godine, nudi Visoko gospodarsko učilište u Križevcima. Na Učilištu je 2004. godine utemeljen i program permanentnoga obrazovanja za poljoprivrednike u obliku dvomjesečnih spe-cijalističkih seminara. Ovi su specijalistički tečajevi, barem zasada, organizirani iz područja svinjogojstva, govedarstva i pčelarstva (Svržnjak i sur., 2006.). Izobrazbu visokokvalificiranih stručnjaka iz područja pera-darstva nude tri visoka učilišta. Na Veterinarskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu provodi se Sveučilišni studij veteri-narske medicine (dodiplomska nastava) u trajanju šest godina i poslijediplomski (doktorski) studij u trajanju od tri godine. U provedbi dodiplomske nastave s temama iz po-dručja peradarstva sudjeluju stručnjaci i znanstvenici šest zavoda, a studentima je ponuđeno 16 obveznih ili izbornih kolegija/modula. Također, u okviru jedinstvenog Sveučiliš-nog doktorskog studija veterinarske medicine, postoji mo-gućnost znanstvenog usavršavanja odabirom uže profiliranih kolegija/modula. Sveučilišni poljoprivredni studiji raznih specijalnosti nude se na Agronomskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu i Poljoprivrednom fakultetu u Osijeku. Studiji su organizirani kao preddiplomski, diplomski i doktorski studiji (shema 3+2+3). Među poljoprivrednim studijima na Agro-nomskom fakultetu postoje uže profilirani studiji za potrebe budućih peradarskih proizvođača i stručnjaka kao što je Preddiplomski studij animalne znanosti i Diplomski studiji hranidbe i hrane životinja i Diplomski studij proizvodnje i prerade mesa. Poljoprivredni fakultet u Osijeku nudi Pred-diplomski studij i Diplomski studij zootehnike. Također, na istom su Fakultetu utemeljeni Sveučilišni stručni studiji zootehnike i Agrarnog poduzetništva u trajanju tri godine.

Obrazovanje odraslih - neformalno obrazovanje

Za potrebe obrazovanja odraslog stanovništva u Hrvatskoj djeluju 132 ustanove (pučka otvorena učilišta, centri za kulturu, centri za obrazovanje u poduzećima, privatne i državne škole i dr.), većinom locirane u gradskim središtima (Markovina, 2007.). Unatoč brojnosti tih ustanova, prema pokazateljima EUROSTAT-a, u Hrvatskoj je 2007. godine svega 2,7%. odraslog stanovništva (starosti od 25 do 64 godina) bilo uključeno u neke od obrazovnih programa. Ti rezultati su znatno niži u odnosu na države Europske Unije (EU-27) gdje je taj postotak iznosio 9,5%. Na primjer, u susjednoj Sloveniji taj je postotak iznosio 14,8%. Jedno od glavnih ograničenja za razvoj poljoprivrede jest vrlo skrom-na ponuda obrazovnih certificiranih programa za dodatno stručno usavršavanje, osobito iz područja stočarske pro-

izvodnje (pa time i peradarstva), menadžmenta, marketinga, organizacije poslovanja i dr.5 U kontinuitetu cjeloživotnog učenja od osobite važnosti su neformalno i informalno obrazovanje. Iako ne postoje orga-nizirani tečajevi/seminari za dodatno obrazovanje i usavrša-vanje peradarskih proizvođača, ono se ipak djelom provodi kroz sustav stručne pomoći koju nude ovlaštene upravne i stručne službe (veterinarska služba, Hrvatski stočarski centar i dr.), potom gospodarska udruženja (Croatiastočar; Hrvat-ska veterinarska komora) i strukovne udruge (Udruga za znanost o peradi i Svjetska udruga veterinara peradara – Hrvatski ogranak). Posljednjih godina pojedine podružnice Hrvatskog zavoda za poljoprivrednu savjetodavnu službu organiziraju cikluse zimskih predavanja za poljoprivrednike, ali s gotovo zanemarivim sadržajima iz područja peradar-stva. Kao oblik neformalnog obrazovanja peradarskih proiz-vođača valja spomenuti i znanstveno-stručni skup „Pera-darski dani” koje od 1994. godine kontinuirano organizira Centar za peradarstvo Hrvatskog veterinarskog instituta u Zagrebu (Raguž-Đurić, 2005.). Kroz znanstvene i stručne radove i komercijalna predstavljanja prenose se najnovije znanstvene i stručne spoznaje, poglavito iz područja zaštite zdravlja peradi, hranidbe preradi, prerade mesa peradi i jaja, okoliša te dobrobiti životinja.

Neka promišljanja o smjeru djelovanja

U perspektivi europskih integracija i postizanja međuna-rodne konkurentnosti, hrvatskoj poljoprivredi, pa tako i peradarstvu kao njenoj važnoj grani, predstoji stvaranje primjerenih programa cjeloživotnog obrazovanja i sustava prijenosa znanja i vještina za sustizanje tehnološki napred-nijih zemalja. Naša je analiza pokazala da u sadašnjem obra-zovnom sustavu ne postoji dostatno razvijen podsustav cje-loživotnog obrazovanja i stručnog usavršavanja peradarskih proizvođača. Stručnom usavršavanju peradarskih proizvođa-ča treba pridati podjednaku pozornost kao i profesionalnom (formalnom) obrazovanju veterinarskih i poljoprivrednih tehničara, inženjera poljoprivrede, doktora veterine i znan-stvenika. Njegovo postizanje nalaže razvoj polifunkcional-nog permanentnog stručnog obrazovanja prilagođenog kraj-njim korisnicima - peradarskim proizvođačima. Ključne su promjene i u vrsti znanja. Uz poznavanje i vladanje naj-novijim tehnološkim i tehničkim znanjima, peradarskim proizvođačima potrebna su i ekonomska znanja jer su važna za donošenje racionalnih odluka i primjerenih strategija poslovanja te za učinkovito korištenje proizvodnih resursa (upravljanje gospodarstvom); potom znanja iz marketinga (kako plasirati proizvod koji će kakvoćom i cijenom biti prihvatljiv na sve zahtjevnijem tržištu, kako stvoriti pre-poznatljiv hrvatski proizvod i sl.). Također, potrebna su i znanja koja omogućuju sudjelovanje u primjerenom obliku interesnog gospodarskog povezivanja, osobito proizvodno manjih obiteljskih peradarskih gospodarstava. Nužna su zna-nja iz sigurnosti i kvalitete hrane i ekološka znanja koja su jamstvo poštivanja načela održivog razvitka, zaštite životne sredine i sprječavanja devastacije resursa.


Tablica 2. Popis škola koje nude programe izobrazbe iz peradarstva Table 2. Vocational secondary schools with poultry educational programmes

Škole Schools

Program iz poljoprivrede (peradarstva) Agricultural curriculum

(poultry subject)

Program iz veterine Veterinary curriculum

Srednja škola Bedekovčina Poljoprivredni tehničar Agricultural technician

Srednja škola Petrinja Veterinarski tehničar Veterinary technician

Tehnološko-kemijska škola Karlovac Veterinarski tehničar Veterinary technician

Poljoprivredna i veterinarska škola Arboretum, Opeka Veterinarski tehničar Veterinary technician

Srednja gospodarska škola Križevci Poljoprivredni tehničar Agricultural technician

Veterinarski tehničar Veterinary technician

Srednja škola Bartola Kašića, Grubišno Polje Stočar Livestock breeder Poljoprivredni gospodarstvenik Agricultural manager

Srednja škola Pitomača Poljoprivredni gospodarstvenik Agricultural manager

Poljoprivredno-prehrambena škola Požega Poljoprivredni tehničar Agricultural technician

Srednja škola Matije Antuna Reljkovića, Slavonski Brod Poljoprivredni tehničar Agricultural technician


Poljoprivredna, prehrambena i veterinarska škola Stanka Ožanića, Zadar

Poljoprivredni tehničar Agricultural technician


Poljoprivredna i veterinarska škola Osijek Poljoprivredni tehničar Agricultural technician


Srednja škola Dalj Poljoprivredni tehničar Agricultural technician


Zdravstvena i veterinarska škola dr. Andrije Štampara, Vinkovci


Poljoprivredo-šumarska škola Vinkovci Poljoprivredni tehničar Agricultural technician

Srednja škola “Braća Radić”, Kaštel Štafilić - Nehaj Poljoprivredni tehničar Agricultural technician


Gospodarska škola Čakovec Poljoprivredni tehničar Agricultural technician

Veterinarska škola Zagreb Veterinarski tehničar Veterinary technician

Poljoprivredna škola Zagreb Poljoprivredni tehničar Agricultural technician

Izvor: MZOS RH Source: Ministry of Science, Education and Sports of the Republic of Croatia


Za osmišljavanje i organizaciju permanentnoga stručnog usavršavanja za potrebe obiteljskih peradarskih gospodar-stava neophodno bi bilo sljedeće: - empirijski ustanoviti koja znanja trebaju peradarski pro-

izvođači – kako bi stručni obrazovni programi bili skro-jeni prema njihovim potrebama;

- interdisciplinarnost – polivalentni timovi stručnjaka za kreiranje heterogenih

- specijalističkih programa; - verificiranje programa za dodatno usavršavanje – certifi-

cirani programi; - edukacijski pristup u prenošenju znanja i inovacija –

kompetentni predavači s poznavanjem metoda učenja i prijenosa znanja odraslim osobama;

- umrežavanje obrazovnih ustanova (škole, ustanove za obrazovanje odraslih, visoka učilišta, fakulteti, znanstve-no-istraživački instituti), upravnih i stručnih službi, go-spodarskih i strukovnih udruženja koja su u funkciji raz-voja peradarstva – zbog kontinuiranog protoka informa-cija/znanja za osuvremenjivanje programa i nastave;

- percepcija - izgraditi svijest o potrebi dodatnog kontinui-ranog obrazovanja i stručnog osposobljavanja.

Literatura

Bejaković, P. (2006.): Uloga obrazovnog sustava u postizanju za-pošljivosti i konkurentnosti radne snage u Hrvatskoj. Druš-tvena istraživanja 15, 3, 401 - 425.

Commission Staff Working Paper. A Memorandum on Life- long Learning, Bruxelles, 2000., http://www.bologna-berlin2003.de/pdf/MemorandumEng.pdf (10.02.2009.)

Delors, J. (1998.): Učenje: blago u nama, Izvješće UNESCO-u Međunarodnog povjerenstva za razvoj obrazovanja za 21. stoljeće. Zagreb. Educa 40, 304.

Markovina, J. (2007.): Cjeloživotno obrazovanje u poljoprivredi. Rukopis. Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu.

Radinović, S., Đ. Žutinić (2006.): Može li Hrvatska imati konkurentnu obiteljsku poljoprivredu - Prilog istraživanju agrarne strukture. Društvena istraživanja 1 - 2 (87-88), 175-197.

Raguž-Đurić, R. (2004.): Tržište kao uvjet razvitka peradarske proizvodnje u Republici Hrvatskoj. Magistarski rad. Agro-nomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu.

Raguž-Đurić, R., V. Wittner, M. Balenović (2005.): Povijesna obilježja Peradarskih dana. VI. simpozij „Peradarski dani 2005.” s međunarodnim sudjelovanjem. Poreč, 11. - 14. 05. 2005. Zbornik radova, 225 - 229.

Svržnjak, K., D. Kamenjak, S. Kantar (2006.): Obrazovanje poljoprivrednika kroz specijalističke seminare. Poljoprivreda 12, 2, 64 - 69.

Schultz, T. W. (1985.): Ulaganje u ljude. Cekade. Zagreb. Žutinić, Đ. (2003.): Obrazovanje u funkciji ruralnog razvoja.

Međunarodni skup „Održivi razvoj ruralnih područja u Hrvatskoj i uloga sveučilišta”. Mali Lošinj, 03. - 05. 09. 2003. Zbornik radova, 10 - 17.

Bilješke 1 Lisabonska deklaracija/strategija usvojena je 2000. godine s ciljem stvaranja konkurentnog gospodarstva temeljenog na znanju, sposobnosti i smanjivanju nezaposlenost u EU. U strategiji su identificirana 4 prioritetna područja: Jačanje unutarnjeg tržišta; Istraživanje i razvoj, obrazovanje, ino-vacije i poduzetništvo; Zaposlenost i socijalna kohezija (promicanje zapošljavanja i cjeloživotno obrazovanje); i Zaštita okoliša i održivi razvoj. 2 Godine 2004. Ministarstvo znanosti, obrazovanja i športa RH donijelo je „Strategiju i akcijski plan obrazovanja odraslih“. U njoj su determinirani i operacionalizirani ciljevi razvitka obrazovanja odraslih kako bi Hrvatska mogla lakše pristupiti modernim društvima znanja. 3 Nizak stupanj profesionalizacije rada u poljoprivredi imat će znatne reperkusije na proces prilagodbe hrvatske poljo-privrede zahtjevima eurointegracija i podizanju njene kon-kurentnosti u domaćem i inozemnom okružju (Radinović i Žutinić, 2006.). 4 Istraživanje je provedeno na uzorku od 104 peradarskih gospodarstava koja se bave tovom pilića i proizvodnjom konzumnih jaja. 5 U pučkim otvorenim učilištima (POU) uglavnom se nude programi izobrazbe iz vinarstva, proizvodnje začinskog i ljekovitog bilja, uzgoja gljiva, pčelarstva, kozarstva i voćar-stva, a nedavno je u POU Samobor pokrenuti program obra-zovanja menadžera u marketingu za voditelje poljopri-vrednih zadruga.

EDUCATION AS A CONDITION OF DEVELOPMENT CROATIAN POULTRY PRODUCTION

Summary

The author’s starting point was a presumption that for a successful progress of Croatian poultry production, particularly that of family farms, so called knowledge capital is needed, shaping of new evaluative abilities of poultry producers founded upon knowledge and skills in technology, organization and running business, but them being enough flexible for quick accommodation and adoption of changes. Following this presumption the paper investigates whether the current system of agricultural/veterinary education is sufficiently developed subsystem for lifelong learning of poultry producers. Analysis has shown the need for designing and organizing heterogeneous educational programmes for permanent professional training of poultry producers. Keywords: lifelong learning, knowledge system, poultry producers


DOBROBIT PURANA U INTENZIVNOJ PROIZVODNJI

Mario Ostović1, Željko Pavičić1, Alenka Tofant1, Tomislav Balenović2, Anamaria Ekert Kabalin2, Sven Menčik2

1Zavod za animalnu higijenu, okoliš i etologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska 2Zavod za stočarstvo, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Osnovni cilj intenzivnog uzgoja je visoka proizvodnost. Međutim, takvim uzgojem stvoreni su uvjeti u kojima nije moguće zadovoljenje optimalnih bioloških potreba purana, važnih u kontekstu njihove dobrobiti. Genetska selekcija na ubrzanom prirastu, odnosno većoj tjelesnoj masi rezultirala je zdravstvenim problemima, posebice lokomotornog i kardiovaskularnog sustava. Osim toga, održavana visoka gustoća naseljenosti životinja po jedinici smještajnog prostora u farmskom uzgoju uzrokom je lošije kvalitete zraka u peradnjacima, moguće pojave kanibalizma, kao i smanjene mogućnosti kontrole zdravstvenog stanja jedinki. Ostale probleme po dobrobit predstavljaju i postupci izlova, prijevoza i klanja purana. U svrhu sprečavanja pojave kanibalizma purani se uzgajaju pri smanjenom intenzitetu osvjetljenja i/ili im se skraćuju kljunovi, što su postupci koji su već sami po sebi problem dobrobiti. Narušena dobrobit rasplodnih jedinki očituje se i provedbom programa restriktivne hranidbe, a u svrhu kontrole tjelesne mase. Zbog navedenih razloga smanjenja dobrobiti purana pri intenzivnoj proizvodnji nameće se potreba modifikacije određenih postupaka proizvodnje i obogaćenja njihova okoliša. Ključne riječi: purani, dobrobit, intenzivna proizvodnja Uvod Puran je udomaćen u Meksiku početkom nove ere, a potječe od sjevernoameričkog divljeg purana (Meleagris gallopavo), a nekoliko vrsta i varijateta i danas nastanjuju sjevernoame-rički kontinent (Pavičić i Ostović, 2007.). Purani u divljini pokazuju složeno, prilagodbeno i inteligentno ponašanje. Mladi purani velik dio vremena kljucajući traže hranu u poljima i šumama. Purani su organizirani u malim skupi-nama sa stabilnom društvenom hijerarhijom, pamte jedinke unutar vlastitog jata i razlikuju ih od susjednih. U pre-napučenim nastambama u intenzivnoj proizvodnji za purane ne postoji mogućnost istraživanja okoliša, traženja hrane, sjedenja na prečkama, odnosno oblikovanja prirođenog po-našanja (Anonymous, 2008.). Naime, s obzirom na inten-zivnost proizvodnje, pojedini smještajni uvjeti ne omogu-ćavaju životinjama zadovoljenje njihovih osnovnih potreba, posebice etoloških, zbog čega se dovodi u pitanje i njihova dobrobit. Povijesno gledajući, održivost proizvodnje defini-rana je profitom, no u novije vrijeme društveno prihvaćanje stočarske proizvodnje usko je vezano za kvalitetu i sigurnost proizvoda, brigu za okoliš te dobrobit životinja (Hartung,

2000.; Jago i sur., 2000.). Pitanje dobrobiti sve je više tema rasprave i u kontekstu suvremene proizvodnje purana, ali s različitim pristupom u pojedinim zemljama (Buddiger i Algers, 2004.). Dobrobit životinje je stanje u kojem se ona pokušava nositi sa svojim okolišem (Broom, 1996.; Broom i Fraser, 2007.) i odnosi se izričito na jedinku (Halverson, 1991.), a uključuje njezino fizičko i mentalno zdravlje. Polazne točke u cilju osiguranja dobrobiti životinja su temeljne slobode životinja: sloboda od gladi i žeđi, sloboda od neudobnosti, sloboda od boli, ozljeda i bolesti, sloboda izražavanja vrsti specifičnog vladanja te sloboda od straha i stresa (FAWC, 1993.; Ostović i sur., 2008.). Naime, „Pet sloboda“ nastoji poboljšati neod-govarajuće postupke u proizvodnji, zbog čega se nameće i potreba modifikacije određenih postupaka u intenzivnoj proizvodnji purana, kao i obogaćenja njihova okoliša. Skraćivanje kljunova Skraćivanje kljunova postalo je upitni postupak u peradar-skoj proizvodnji (Cunningham, 1992.; Hughes i Gentle, 1995.; Schwean, 2002.). On se rutinski provodi da bi se smanjila šteta od agresije i kanibalizma, koji, naime, mogu

Mario Ostović, dr. vet. med., Zavod za animalnu higijenu, okoliš i etologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: ++385 (0) 1 2390 294, fax: ++385 (0) 1 2441 390, e-mail: [email protected]

DOBROBIT PURANA U INTENZIVNOJ PROIZVODNJI 32

rezultirati značajnim ozljedama i smrtnošću u jatima. Iako ima svojih prednosti, taj pstupak u jedinki izaziva akutnu, kao i kroničnu bol, povezanu s tvorbom neuroma u pre-ostalom dijelu kljuna, stoga predstavlja visoko značajan pro-blem dobrobiti. Skraćivanje kljunova u određenih proizvod-nih kategorija je postupak koji bi zbog navedenoga u budućnosti trebalo ukinuti, a nepoželjno vladanje izbjeći od-govarajućim uređenjem nastambe i poštivanjem temeljnjih tehnoloških načela proizvodnje (Martrenchar, 1999.; Ano-nymous, 2006.; Wallace, 2007.). Problem visoke gustoće naseljenosti u nastambama za purane Visoka gustoća naseljenosti životinja po jedinici smještajnog prostora jedan je od glavnih problema njihove dobrobiti, a iz njega proizlaze i drugi problemi, primjerice lošija kvaliteta zraka i stelje u peradnjacima (Martrenchar, 1999.; Ano-nymous, 2006.). Kvaliteta zraka složena je varijabla zračnih komponenti kao što su mikroorganizmi, prašina, štetni plinovi te neugodni mirisi. Loša kvaliteta zraka, osim što utječe na zdravlje i dobrobit peradi, predstavlja i rizik za zagađenje neposrednog vanjskog okoliša (Vučemilo i sur., 2007.). Dok su radnici izloženi lošijoj kvaliteti zraka kraće razdoblje, purani kontinuirano borave u takvom okolišu. Zračna onečišćenja, posebice visoka koncentracija amonijaka u zraku perad-njaka, povezana su s brojnim zdravstvenim problemima kao što su respiratorne bolesti, keratokonjunktivitis i povećana prijemljivost za određene virusne i bakterijske infekcije (Anonymous, 2008.). Stelja ima velik učinak na mikroklimatske uvjete u perad-njacima te, posljedično, na zdravlje peradi i njihove proiz-vodne rezultate (Senčić i sur., 2004.). Ukoliko je upravljanje proizvodnjom neodgovarajuće i purani moraju boraviti u vlažnoj, visoko onečišćenoj stelji, mogu im se razviti žuljevi na prsima te ulceracije na prstima i skočnim zglobovima. Istraživanja su pokazala da i do 98% purana u komer-cijalnim uvjetima boluje od lezija na prstima koje mogu biti putovi za bakterijske infekcije (Ekstrand i Algers, 1997.), te da 67 % boluje od žuljeva na prsima (Kamyab, 2001., Ano-nymous, 2006.). Visoka gustoća naseljenosti u peradnjaku uzrok je i ne-dostatka odgovarajuće njege. Budući da su nastambe za industrijsku proizvodnju visoko automatizirane, pojedinac može voditi brigu o velikom broju životinja, pri čemu bo-lesne ili ozlijeđene jedinke bez sumnje prolaze neopaženo (Anonymous, 2008.). Osvijetljenost Osjetilo vida je pticama vrlo važno, pa se režim osvjetljenja koristi kao sredstvo upravljanja proizvodnjom (Manser, 1996.). Naime, smanjeni intenzitet osvjetljenja unutar na-stambi provodi se u svrhu smanjenja agresivnog vladanja i kanibalizma. Međutim, znanstvena su istraživanja pokazala da purani izbjegavaju vrlo nizak intenzitet osvijetljenosti, oko 2 luksa, i preferiraju svjetlije uvjete, posebice tijekom

prvih nekoliko tjedana života. Niske razine osvjetljenja - od 2 do 5 lx - mogu biti uzrokom oštećenja vida. Nadalje, pri smanjenom intenzitetu osvjetljenja osoblju je teže obavljati kontrolne preglede, čime se bolesne ili ozlijeđene jedinke, koje je potrebno izdvojiti ili eutanazirati, mogu previdjeti (Anonymous, 2007.; 2008.). Selekcija na ubrzani rast i veću tjelesnu masu Genetska selekcija i suvremena hranidba rezultirali su ubrza-nim prirastom, no to je, međutim, i jedan od najznačajnijih problema dobrobiti. Prirast divljih purana iznosi od 51 g pri valjenju do 3,5 kg sa 4 mjeseca starosti. Istovremeno su-vremeni selekcionirani purani postižu i do 3 puta veću tje-lesnu masu. Ubrzani rast i veća tjelesna masa mogu narušiti njihovo zdravlje vodeći bolnim ozljedama nogu, oštećenju mišića, kardiovaskularnim problemima i povećanoj prijem-ljivosti na bolesti (Nestor i sur., 1996.; Anonymous, 2008.). Takve jedinke više vremena provode ležeći, a ponekad nisu sposobne otići do hranilica i pojilica. Iako su problemi nogu vrlo ozbiljan problem dobrobiti, ekonomske postavke proiz-vodnje često potiskuju pitanje dobrobiti purana (Schwean, 2002.; Anonymous, 2008.). Daljnja istraživanja trebalo bi usmjeriti na smanjenje zdravstvenih problema i stresa ve-zanog uz proizvodnju, te na mogućnost povećane fizičke aktivnosti purana koja bi poboljšala čvrstoću kostiju, a bez negativnog učinka na profitabilnost proizvodnje (Rath, 2004.). Rasplodni purani Rasplodne i nerasplodne jedinke imaju istu genetsku predis-poziciju za ubrzani prirast, odnosno skeletne poremetnje i kardiovaskularne bolesti. U cilju smanjenja zdravstvenih problema i povećanja reproduktivnih sposobnosti rasplodne se jedinke hrane restriktivno. Međutim, restrikcija hrane u peradi uzrokuje opću neishranjenost, specifičnu hranidbenu deficijenciju i frustraciju (Savory i Maros, 1993.; Ano-nymous 2006.; 2008.). Rasplodne jedinke imaju duži pro-izvodni vijek od nerasplodnih jedinki, stoga su u njih i skeletni problemi mnogo češći. Na kraju rasplodnog perioda najmanje 75% roditeljskog jata boluje od poremetnji u hodu ili laminitisa (Hocking, 1992.; Schwean, 2002.). Izlov, prijevoz, omamljivanje i klanje purana Postupci prije klanja koji uključuju izlov, ukrcavanje i pri-jevoz vrlo su stresni za jedinke i predstavljaju područje u kojem dobrobit može biti narušena (Schwean, 2002.). Naime, istraživanja su pokazala da tijekom navedenih po-stupaka dolazi do pojave modrica, unutarnjih krvarenja, prijeloma krila, amputiranih prstiju, ozljeda nogu, iščašenja i ruptura tetiva zglobova. Samim time umanjena je i klaonička vrijednost mesa. Da bi se to izbjeglo, pojedini proizvođači za ukrcavanje purana koriste, primjerice, auto-matizirane tekuće trake, čime pridonose i poboljšanju nji-hove dobrobiti (Anonymous, 2008.). Nakon dolaska u klaonicu purani se vješaju o lire. To vješanje je za purane bolno, posebice što ih velik broj boluje


od skeletnih deformiteta (Anonymous, 2006.). Uz to, purani su selekcionirani prema većim tjelesnim razmjerima, a veličina lira u pojedinim klaonicama ostala je ista u odnosu na veću tjelesnu masu (Stevenson, 1997.). Najčešće rabljena metoda omamljivanja purana su kupke za omamljivanje (električno omamljivanje). Naime, ptice se omamljuju električnim šokom da bi bile u stanju bez svijesti tijekom klanja. Međutim, purani prilikom prolaza kroz kupku mogu osjetiti električne šokove prije nego što budu omamljeni, jer njihova krila koja vise niže od glava mogu dotaknuti vodu prije glava. Nadalje, događa se da sve jedinke zbog propusta u proizvodnji nisu odgovarajuće omamljene ili iskrvarene. Inovacije u postupcima klanja purana sve više privlače pozornost. Tako, primjerice, pojedini proizvođači u SAD-u i Europi umjesto kupkama za omamljivanje purane sve češće omamljuju plinom; takve bi postupke trebalo preporučiti u svrhu poboljšanja njihove dobrobiti (Anonymous, 2008.).

Zaključak

Intenzivan uzgoj, vođen principom profita, temelji se na pro-izvodnji velikog broja životinja na ograničenom prostoru. Time se javljaju mnogi problemi po dobrobit životinja i u intenzivnoj proizvodnji purana. Naime, u takvom okolišu ne postoji mogućnost zadovoljenja optimalnih bioloških po-treba purana, što se posljedično odražava na njihovu do-brobit, odnosno na ekonomičnost cjelokupne proizvodnje. Stoga se nameće potreba modifikacije pojedinih postupaka u intenzivnoj proizvodnji komercijalnih hibrida.

Literatura

Anonymous, A COK Report: Animal Suffering in the Turkey Industry, http://www.worldproutassembly.org/archives/2006/ /02/animal_sufferin.html, (23. 02. 2006.).

Anonymous (2007): Welfare standards for turkeys. RSPCA. Anonymous, An HSUS Report: The Welfare of Animals in the

Turkey Industry, http://www.hsus.org/farm/resources/research/ /welfare/welfare_turkeys.html, (12. 02. 2008).

Broom, D. M. (1996.): Animal welfare defined in terms of attempts to cope with the environment. Acta Agriculturae Scandinavica Section A. Animal Science. Suppl 27, 22-28.

Broom, D. M., A. F. Fraser (2007.): Domestic Animal Behaviour and Welfare. 4th Edition. CAB International, Cambridge University Press, UK.

Buddiger, N., G. Albers (2004.): Future Trends in Turkey Breeding. Hybrid Turkeys. A division of Nutreco Canada Inc., Kitchener, Ontario, Kanada

Cunningham, D. L. (1992.): Beak trimming effects on performance, behavior and welfare of chickens. A review. Journal of Applied Poultry Research 1, 129-134.

Ekstrand, C., B. Algers (1997.): Rearing conditions and foot-pad dermatitis in Swedish turkey poults. Acta Veterinaria Scandinavica 38, (2), 167-74.

Farm Animal Welfare Council (1993.): Second report on priorities for research and development in farm animal welfare. FAWC, Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Tolworth

Halverson, M. (1991.): Farm animal welfare: Crisis or opportunity for agriculture? Paper P91-1.

Hartung, J. (2000.): Some aspects of animal welfare in livestock production. Deutsche Tierarztliche Wochenschrift 107, 12, 503-506.

Hocking, P. M. (1992.): Musculo-skeletal disease in heavy breeding birds. In: Whitehead CC (ed.), Bone Biology and Skeletal Disorders in Poultry. Poultry Science Symposium Number Twenty-three (Oxfordshire, U.K.: Carfax Publishing Co., 297-309).

Hughes, B. O., M. J. Gentle (1995.): Beak trimming of poultry: its implications for welfare. World's Poultry Science Journal 51, 51-61.

Jago, J., A. Fisher, P. Le Neindre (2000.): Animal welfare and product quality. Biological resource management: connecting science and policy, 163-171.

Kamyab, A. (2001.): Enlarged sternal bursa and focal ulcerative dermatitis in male turkeys. World’s Poultry Science Journal 57, 5-12.

Manser, C. E. (1996.): Effects of lighting on the welfare of domestic poultry: a review. Animal Welfare 5, 341-360.

Martrenchar, A. (1999.): Animal welfare and intensive production of turkey broilers. World's Poultry Science Journal 55, 2, 143-152.

Nestor, K. E., Y. M. Saif, J. Zhu, D. O. Noble (1996.): Influence of growth selection in turkeys on resistance to Pasteurella multocida. Poultry Science 75, 1161-3.

Ostović, M., Ž. Pavičić, B. Buković Šošić (2008.): Dobrobit peradi u Hrvatskoj i Europskoj uniji. Zbornik radova. 3. simpozij Udruge za znanost o peradi “Ususret novoj eri peradarstva”, 05. 12. 2008, Zagreb, 58 -67.

Pavičić, Ž., M. Ostović (2007.): Uzgoj purana. Hrvat. vet. vjesn. 30, 185-194.

Rath, N. C (2004.): Minimizing leg problems through management. World Poultry Turkey Special 6, 14-16.

Savory, C. J., K. Maros (1993.): Influence of Degree of Food Restriction, Age and Time of Day on Behaviour of Broiler Breeder Chickens. Behavioural Processes 29, 180.

Schwean, K. (2002.): The Welfare of Poultry: Review of recent Literature. In Welfare Issues Resource Centre ( J. Gardner, H. Gonyou, K. Schwean, J. Watts, L. Whittington), 45-62.

Senčić, Đ., Z. Antunović, Marcela Šperanda (2004.): Ekološka važnost stelje u peradarskoj proizvodnji. Stočarstvo 58, 71-78.

Stevenson, P. (1997.): The Welfare of Turkeys at Slaughter. Compassion in World Farming Trust. Hampshire, UK.

Vučemilo, M., B. Vinković, K. Matković, R. Brezak (2007.): Kvaliteta zraka i dobrobit peradi. Stočarstvo 61, 267-275.

Wallace, J., “Animal Welfare Essay”, Beak Trimming in Chickens: a welfare cost or benefit?, http://vip.vetsci.usyd.edu.au/ /contentUpload/content_2862/JessicaWallace.pdf, (18. 09. 2007).


WELFARE OF TURKEYS IN INTENSIVE PRODUCTION

Summary

Within the conditions of intensive rearing, of which the main goal is high productivity, certain turkeys' needs, important in the welfare context, cannot be satisfied. Genetic selection for rapid growth and higher body weight has resulted in many health problems, for instance problems of the locomotory system, and has also made natural mating in turkeys impossible. Besides, a high stocking density per housing space unit in farm rearing causes poor air quality, cannibalism as well as lower possibility of animal inspection. Furthermore, routine procedures like catching, transportation and slaughtering represent major welfare problems for turkeys. With the aim to prevent cannibalism, turkeys are raised at low light intensity or/and beak trimming is conducted, which also raises questions about animal welfare. Poor welfare of breeding birds is also manifested in restrictive feeding programs, with the purpose of forced molting and controlling of their body weight. The above mentioned reasons of poor welfare in intensive turkey production prove the need of modification of certain production practices as well as of environmental enrichment. Key words: turkeys, welfare, intensive production


POGAČA ULJANE REPICE U TOVU HIBRIDNIH PURANA

Stjepan Mužic1, Zlatko Janječić1, Jasna Pintar1, Dalibor Bedeković1, Vlasta Herak-Perković2

1 Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska 2 Veterina d.o.o., Kalinovica, Hrvatska

Sažetak

Upotreba pogače uljane repice već godinama predstavlja veliki izazov istraživačima i nutricionistima glede njenih udjela u krmnim smjesama za različite kategorije peradi. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi utjecaj 0, 5 i 10% pogače uljane repice (domaćeg kultivara „Bristol“) u krmnim smjesama na proizvodna svojstva 120 Nicholas muških purana podijeljenih u 12 skupina do dobi od 9 tjedana. Završne tjelesne mase iznosile su 6598,72 g, 6701,25 g i 6510,53 g gledano po tretmanima. Udio pogače uljane repice od 5% doveo je do značajno (p<0,05) većih tjelesnih masa purana u odnosu na 10%, dok razlike između 0 i 5% te 0 i 10% nisu bile (p>0,05) signifikantne. Konverzija krmne smjese na kraju istraživanja (redoslijedom po tretmanima) iznosila je 2,52, 2,33 i 2,26, dok je mortalitet purana bio 2,5, 0 i 5%. Iz svega navedenoga vidljivo je da se pogača uljane repice može preporučiti u udjelu od 5% u krmnim smjesama za tov hibridnih purana. Ključne riječi: pogača uljane repice, tov, hibridni purani Uvod U Europskoj uniji, zbog klimatskih prilika, najvažniju ulogu u proizvodnji biogoriva zauzima uljana repica. Nakon hladnog prešanja sjemena uljane repice i ekstrakcije ulja dobiva se pogača uljane repice koja već godinama pred-stavlja vrlo velik znanstveni izazov u smislu ekonomske isplativosti u hranidbi domaćih životinja. Pogača uljane re-pice predstavlja dobar izvor sirovih bjelančevina, no ogra-ničavajući faktori u hranidbi peradi su visok sadržaj sirovih vlakana (Chibowska i sur., 2000.), te antinutritivnih čim-benika glukozinolata, eruka kiselina, tanina i fitata (Smu-likowska i sur., 1998.). U produljenom tovu purana utjecaj glukozinolata je veći bez obzira na to što je sadržaj istih u 00-uljanim repicama danas nizak (Zobač i sur., 2000.). Moderno hladno prešanje zrna uljane repice smanjuje sa-držaj nekih antinutritivnih faktora, dok visoke temperature mogu negativno djelovati na probavljivost bjelančevina (Slominski, 1997.). Primanjem u punopravno članstvo Europske unije Hrvatska će preuzeti i određene obaveze glede korištenja biodizela, te će jedna od zadaća stočarske proizvodnje biti da kroz hranidbu životinja zbrine velike količine pogače uljane repice. Stoga je cilj ovog istraživanja bio utvrditi utjecaj 0, 5 i 10% pogače uljane repice u krmnim smjesama na proizvodna svojstva hibridnih purana do dobi od 9 tjedana.

Materijal i metode rada U istraživanju je korišteno 120 jednodnevnih muških Nicho-las purana koji su smješteni u pokusni objekt Zavoda za hra-nidbu domaćih životinja Agronomskog fakulteta u Zagrebu u kojem su uzgajani do dobi od 9 tjedana. Purani su slučaj-nim odabirom podijeljeni u 12 boksova sa po 10 purana u svakom. Uvjeti držanja bili su u skladu s tehnološkim nor-mativima za tov hibridnih purana (Uremović i sur., 2002.). Purani su hranjeni "ad libitum" prvih sedam dana iz podnih hranilica, a zatim do kraja istraživanja iz okruglih visećih hranilica. Napajanje purana u prvih je sedam dana provođe-no iz okruglih plastičnih pojilica, a nakon toga iz automat-skih okruglih visećih pojilica koje su redovito prane i de-zinficirane. U istraživanju je korištena pogača uljane repice dobivene iz sjemena uljane repice domaćeg kultivara „Bri-stol“. Kontrolna skupina purana hranjena je krmnom smje-som koja nije sadržavala pogaču uljane repice (T-0), dok je udio iste u dvjema pokusnim skupinama iznosio 5 i 10% (T-5 i T-10). Svaki je hranidbeni tretman imao četiri ponav-ljanja. Purani su prva četiri tjedna hranjeni krmnom smje-som predstarter (Pu-0), a zatim do kraja istraživanja krmnom smjesom starter (Pu-1). Krmne smjese korištene u istraži-vanju izrađene su u TSH „Kušić-promet“ prema receptura-ma sačinjenim u Zavodu za hranidbu domaćih životinja, u čijem su laboratoriju izvršene i kemijske analize, a rezultati su prikazani na Tablici 1.

Prof. dr. sc. Stjepan Mužic, Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zavod za hranidbu domaćih životinja, Svetošimunska 25, 10 000 Zagreb, Republika Hrvatska; tel: ++385 (0) 1 239 3822; fax: ++385 (0) 1 239 3932; e-mail: [email protected]

POGAČA ULJANE REPICE U TOVU HIBRIDNIH PURANA 36

Tablica 1. Kemijski sastav pogače uljane repice i krmnih smjesa za hranidbu hibridnih purana

Kemijski sastav, g/kg Pogača uljane repice

T-0 Pu-0

T-5 Pu-0

T-10 Pu-0

T-0 Pu-1

T-5 Pu-1

T-10 Pu-1

Vlaga 72,27 113,24 105,22 109,67 112,91 112,49 115,68 Pepeo 71,12 75,18 75,73 74,66 69,14 72,26 69,47 Sir. bjelančevine 299,84 282,59 278,35 273,32 273,47 284,47 268,51 Sirova mast 79,72 32,35 35,06 36,29 36,61 39,96 40,57 Sirova vlaknina 112,40 33,61 40,25 40,13 38,92 53,34 50,29 Ca 11,97 15,20 15,38 14,82 14,06 13,71 12,91 P 10,57 9,83 9,44 10,13 8,33 9,03 8,94 Na 0,38 2,09 2,08 2,08 1,59 1,44 1,50 Škrob 4,58 278,50 270,12 259,40 299,82 251,90 292,10 Table 1. Chemical composition of rape oil-cake and feed mix for hybrid turkeys

Chemical composition, g/kg

Rape seed oil-cake

T-0 Pu-0

T-5 Pu-0

T-10 Pu-0

T-0 Pu-1

T-5 Pu-1

T-10 Pu-1

Moisture 72,27 113,24 105,22 109,67 112,91 112,49 115,68 Ash 71,12 75,18 75,73 74,66 69,14 72,26 69,47 Protein 299,84 282,59 278,35 273,32 273,47 284,47 268,51 Fat 79,72 32,35 35,06 36,29 36,61 39,96 40,57 Fibre 112,40 33,61 40,25 40,13 38,92 53,34 50,29 Ca 11,97 15,20 15,38 14,82 14,06 13,71 12,91 P 10,57 9,83 9,44 10,13 8,33 9,03 8,94 Na 0,38 2,09 2,08 2,08 1,59 1,44 1,50 Starch 4,58 278,50 270,12 259,40 299,82 251,90 292,10 Kontrolno vaganje purana izvršeno je na početku istra-živanja, u dobi od četiri tjedna te na kraju istraživanja. Tijekom istraživanja praćena je konzumacija i konverzija krmne smjese te mortalitet purana. Svi dobiveni podaci tijekom istraživanja obrađeni su statističkim programom Microsoft Excel.

Rezultati i rasprava

Na Tablici 2 prikazane su prosječne tjelesne mase purana i konverzija krmnih smjesa tijekom istraživanja.

Kako je vidljivo iz Tablice 2, prosječne tjelesne mase jednodnevnih purana bile su ujednačene i nisu se (p>0,05) razlikovale. U dobi purana od četiri tjedna značajno (p<0,05) manje tjelesne mase imali su purani iz skupine T-10 koja je hranjena krmnom smjesom s 10% pogače uljane repice od purana iz skupina T-0 i T-5. Prosječne tjelesne mase purana iz skupina T-0 i T-5 nisu se (p>0,05) razlikovale na kraju istraživanja. Značajno (p<0,05) manje tjelesne mase ostvarili su purani iz skupine T-10 u odnosu na purane iz skupine T-5, dok između skupina T-0 i T-10 razlika nije bila (p>0,05) značajna.

Tablica 2. Prosječne tjelesne mase purana tijekom istraživanja, g

Dob 1. dan 4. tjedan 9. tjedan Tretman T-0 T-5 T-10 T-0 T-5 T-10 T-0 T-5 T-10

x 59,57a 59,76a 60,23a 1257,88a 1272,50a 1188,68b 6598,72a 6701,25a 6510,53b,a

sx 0,66 0,59 0,70 14,95 11,29 12,85 71,15 58,08 66,33 s 4,87 4,37 5,07 94,56 71,43 112,90 444,33 367,33 408,88 cv 8,17 7,31 8,42 7,52 5,61 9,50 6,73 5,48 6,28

Vrijednosti označene istim slovima nisu signifikantno različite (p>0,05)


Table 2. Average body weights of turkeys during the investigation

Age 1. day 4. week 9. week Treatment T-0 T-5 T-10 T-0 T-5 T-10 T-0 T-5 T-10

x 59,57a 59,76a 60,23a 1257,88a 1272,50a 1188,68b 6598,72a 6701,25a 6510,53b,a

sx 0,66 0,59 0,70 14,95 11,29 12,85 71,15 58,08 66,33 s 4,87 4,37 5,07 94,56 71,43 112,90 444,33 367,33 408,88 cv 8,17 7,31 8,42 7,52 5,61 9,50 6,73 5,48 6,28

Means with the same letter are not significantly different (p>0,05) Na Tablici 3 prikazane su vrijednosti konverzije krmnih smjesa tijekom istraživanja. Tablica 3. Konverzija krmnih smjesa tijekom istraživanja, kg/kg

Krmna smjesa Pu-0 Pu-1 Tretman T-0 T-5 T-10 T-0 T-5 T-10

1,76 1,78 1,92 2,52 2,33 2,26 Table 3. Feed conversion during the investigation, kg/kg

Food mixture Pu-0 Pu-1 Treatment T-0 T-5 T-10 T-0 T-5 T-10

1,76 1,78 1,92 2,52 2,33 2,26 Tablica 4. Mortalitet purana, %

Dob 4. tjedan 9. tjedan Tretman T-0 T-5 T-10 T-0 T-5 T-10

0 0 0 2,5 0 5 Table 4. Mortality of turkeys, %

Age 4. week 9. week Treatment T-0 T-5 T-10 T-0 T-5 T-10

0 0 0 2,5 0 5

Purani iz pokusne skupine T-10 ostvarili su u prva četiri tjedna najlošiju konverziju krmne smjese Pu-0, koja je za 8,33% bila veća u odnosu na skupinu T-0 i 7,29% u odnosu na purane iz skupine T-5. Konverzija krmne smjese Pu-1 bila je najlošija kod skupine T-0; razlika u odnosu na skupinu T-10 iznosila je 10,32%, a razlika u konverzijama krmne smjese između skupina T-5 i T-10 iznosila je 3%. Mortalitet purana tijekom istraživanja prikazan je na Tablici 4. U prva četiri tjedna istraživanja ni kod jedne skupine purana nije bilo uginuća. Kako je vidljivo iz Tablice 4, kod skupine T-5 taj je trend nastavljen i do kraja istraživanja. Kod skupine T-0 u posljednjih je pet tjedana istraživanja uginuo jedan puran, a kod skupine T-10 2 purana.

Zaključak

Na temelju istraživanja utjecaja različitih razina pogače uljane repice u hranidbi hibridnih purana na njihove pro-izvodne rezultate možemo zaključiti da se pogača uljane repice dobivene iz sjemena uljane repice domaćeg kultivara „Bristol“ može preporučiti u udjelu od 5% u krmnim smje-sama za tov hibridnih purana.

Literatura

Chibowska, M., S. Smulikowska, B. Pastuszewska (2000.): Meta-bolisable energy value of rapeseed meal and its fractions for broiler chickens as affected by oil and fibre content. Journal of Animal and Feed Sciences, 9:371-378.


Slominski, B. A. (1997.): Developments in the breeding of low fibre rapeseed/canola. Journal of Animal and Feed Sciences, 6:303-317.

Smulikowska, S., B. Pastuszewska, A. Ochtabinska, A. Mieczkowska (1998.): Composition and nutritional value for chickens and rats of seeds, cake and solvent meal from low-glucosinolate yellow-seeded spring rape and dark-seeded winter rape. Journal pf Animal and Feed Sciences, 7:415-428.

Uremović, Z., M. Uremović, V. Pavić, B. Mioč, S. Mužic, Z. Janječić (2002.): Stočarstvo. Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Zobač, P., I. Kumprecht, V. Prokop, J. Cmolik, W. Schwartz (2000.): Use of rapeseed meal and phospholipids in feed mixtures for turkey production. Czech Journal of Animal Science, 45:119-126.

RAPESEED OIL CAKE IN FATTENING OF HYBRID TURKEYS

Summary

For many years the use of rapeseed oil cake has presented a big challenge for researchers and nutritionists concerning its inclusion in feed mixtures for different categories of poultry. The main goal of this research was to establish the influence of 0 % (T-0), 5 % (T-5) and 10 % (T-10) portion of rapeseed oil cake of domestic cultivar Bristol in feed mixtures on the production of 120 Nicholas male turkeys divided in 12 groups until the age of 9 weeks. The final body weights were 6598.72, 6701.25 and 6510.53 g. The portion of 5 % of rapeseed oil cake resulted with significantly (p<0.05) higher body weights of turkeys in relation to 10 %, but the differences between portions of 0 and 5 %, and 0 and 10% didn’t differ significantly (p>0.05). The feed conversion ratio was 2.52, 2.33 and 2.26 kg/kg, and mortality of turkeys were 2.5, 0 and 5 % respectively. Taking into consideration above mentioned, it can be recommended to use the 5 % portion of rapeseed oil cake in feed mixture for hybrid turkeys. Key words: rapeseed oil cake, fattening, hybrid turkeys


PROCJENA SADRŽAJA KAROTENOIDA PREMA INTENZITETU BOJE ZRNA KUKURUZA

Kristina Kljak1, Darko Grbeša1, Danijel Karolyi2

1Zavod za hranidbu domaćih životinja, Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska 2Zavod za opće stočarstvo, Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Boja žutanjaka jaja, kože ili mesa peradi važan je čimbenik percepcije kakvoće proizvoda za potrošače. Boja kože ili žutanjka povezana je s nakupljanjem pigmenata karotenoida, koji su važni za metabolizam rasta i plodnost peradi. Žuti kukuruz je jedina žitarica sa značajnom količinom karotenoida te je, kao najzastupljenije krmivo u hrani peradi u RH , za perad važan izvor pigmenta. Karotenoidi u kukuruzu su gotovo isključivo smješteni u endospermu zrna te određuju njegovu boju. Kemijsko određivanje sadržaja karotenoida je skupo i dugotrajno, a zbog toga u praksi i često neprimjenjivo. Cilj ovoga istraživanja bio je odrediti parametre boje endosperma kukuruza prema CIE Lab sustavu i njihovu povezanost sa sadržajem karotenoida u zrnu. U istraživanju je analizirano 18 Bc hibrida kukuruza. Karotenoidi iz zrna su ekstrahirani heksanom, a sadržaj je kvantificiran spektrofotometrijski pomoću apsorpcijskog koeficijenta β-karotena u heksanu. Boja endosperma je mjerena instrumentalno kolorimetrijskim uređajem (Chroma meter CR-410, Minolta, Japan). Prosječni sadržaj karotenoida u zrnu iznosio je 33,16 μg β-karotena/g (raspon od 22,13 do 47,47 μg/g). Srednje vrijednosti parametara boje L*, a* i b* redom su iznosile 84,11 (od 78,81 do 87,29), 0,17 (od -1,30 do 2,62) i 34,83 (od 29,87 do 40,07). Od parametara boje endosperma jedino je parametar žutoće b* bio vrlo visoko signifikantno (P<0,001) pozitivno povezan (r=0,79) sa sadržajem karotenoida u zrnu. Na temelju dobivenih rezultata može se zaključiti da intenzitet žutoće zrna kukuruza određen CIE Lab parametrom b* dobro procjenjuje sadržaj ukupnih karotenoida u njemu (sadržaj ukupnih karotenoida (μg/g)=-22,33+1,577xb*, p<0,001, R2=0,63).

Ključne riječi: zrno kukuruza, karotenoidi, boja

Uvod

Kukuruz je najvažniji izvor energije i žuto-narančastih pig-menata karotenoida, od kojih su neki provitamini vitamina A, drugi bojila žutanjaka jaja, kože ili mesa peradi (Kopsell i Kopsell, 2006., Perez-Vendrell i sur., 2001., Breithaupt, 2007.), a svi su antioksidanti. Karotenoidi pridonose visokoj antioksidativnoj moći zrna kukuruza, najvišom među žita-ricama, koja iznosi 181 µmol ekvivalenata vitamina C/g uzorka (Adom i Liu, 2002.). Karotenoidi u kukuruzu su gotovo isključivo (95-97%) smješteni u endospermu zrna, najviše u rožnatom (74-86%) (Blessin i sur., 1963.), te određuju njegovu boju. Kemijsko određivanje sadržaja karo-tenoida je skupo, dugotrajno i složeno, te zahtijeva kemi-čara, pa je u praksi neprimjereno jer industrija zahtijeva velik broj analiza određenih na jednostavan i pouzdan način u kratkom vremenu. Cilj ovoga rada je utvrditi u kojoj mjeri jednostavno mjerenje parametara boje pomoću kolorimetra može procijeniti sadržaj ukupnih karotenoida u uzorku zrna kukuruza.

Materijal i metode

U istraživanju je određen sadržaj ukupnih karotenoida i boja zrna 18 Bc hibrida kukuruza. Hibridi kukuruza roda 2008 uzgajani su pri istim agroekološkim uvjetima na testnom polju 'Bc Instituta d.o.o' u Rugvici. Svaki hibrid je zasijan na jednoj pokusnoj parceli, a nasumično je uzeto pet klipova hibrida iz središnjih redova pokusne parcele koji su spojeni u skupni uzorak. Zrno hibrida je samljeveno i homogenizi-rano na mlinu Cyclotec (Tecator, Švedska) sa veličinom čestica do 0,75 mm. Samljeveni uzorci su čuvani na +4 ˚C, zaštićeni od svjetla. Karotenoidi su ekstrahirani heksanom. 0,5 g samljevenog i homogeniziranog uzorka hidratizirano je 30 minuta sa 2 mL ultračiste vode. Dodano je 4 mL acetona, te je smjesa ultra-sonificirana 5 minuta (Sonorex TK52, Bandelin, Njemačka). Nakon ultrasonifikacije dodano je 2 mL heksana, te je smje-sa vorteksirana 30 sekundi (37600 Mixer, Barnstead Ther-molyne, UK). Nakon centrifugiranja (Centric 322A, Teht-

Kristina Kljak, dipl. ing. kemije, Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zavod za hranidbu domaćih životinja, Svetošimunska cesta 25, 10000 Zagreb, Republika Hrvatska, tel:++385 (0) 1 2393-945, fax:++385 (0) 1 2393-932, e-mail: [email protected]

PROCJENA SADRŽAJA KAROTENOIDA PREMA INTENZITETU BOJE ZRNA KUKURUZA 40

nica, Slovenija; 4000 rpm, 5 minuta) odvojen je heksanski sloj. Postupak je ponovljen do obezbojenja heksanskog slo-ja. Odvojeni heksanski slojevi su sakupljeni tako da im ukupni volumen bude 10 mL. Apsorbancija heksanskog eks-trakta je mjerena u rasponu 400-480 nm UV/Vis spektro-fotometrom Helios γ (Thermo Electron Corporation, UK), a za kvantifikaciju je uzeta apsorbancija u piku. Sadržaj ukup-nih karotenoida uzorka hibrida izražen je kao μg β-karote-na/g uzorka koristeći apsorpcijski koeficijent β-karotena u heksanu ( = 2550) (Olson, 1996.). Svaki hibrid analiziran je u triplikatu, a analiza je izvedena u najkraćem mogućem vremenu od mljevenja uzorka. Boja u samljevenim uzorcima određena je prema CIELab sustavu (CIE, 1976) mjerenjem kolorimetrom Chroma meter CR-410 (Minolta, Japan). Prema CIELab skali parametar L* je mjera svjetline (0=crno do 100=bijelo), a* je mjera crvenosti (+a=crveno do –a=zeleno), dok je b* mjera žutosti (+b=žuto do –b=plavo). Uzorci su mjereni u triplikatu. Rezultati analiza su prikazani kao srednja vrijednost i stan-dardna devijacija. Povezanost sadržaja ukupnih karotenoida i parametara boje L*,a* i b* analizirana je izračunom koe-ficijenta korelacije (r) po Pearsonu te regresijskom anali-zom. Korišten je računalni paket SAS 9.1. (SAS, 2003.).

Rezultati i diskusija

Sadržaj ukupnih karotenoida određen je u zrnu 18 Bc hi-brida kukuruza, a rezultati istraživanja su prikazani na Tab-lici 1. Hibridi se razlikuju prema sadržaju ukupnih karoteno-ida, što se slaže sa rezultatima Egesela i sur. (2003.), Huls-hofa i sur. (2003.), te Kurilicha i Juvika (1999.). Najveće razlike u sadržaju ukupnih karotenoida su između Bc 394 i Bc 678 te iznose 22,13 i 47,47 μg β-karotena/g uzorka. Tako visoke razlike u sadržaju karotenoida uzrokovane su vje-rojatno genotipom (hibridom) koji, prema Kurilichu i Juviku (1999.), objašnjava 88-97% varijacija, dok preostale vari-jacije uzrokuju vremenske prilike i lokacija. Vrijednosti parametara boje zrna 18 Bc hibrida kukuruza prikazani su na Tablici 1. Vrijednosti svjetline (L*) 18 Bc hibrida iznosile su od 78,81 (Bc 282) do 87,29 (Bc 778). Dobiveni rezultati se slažu s rezultatima Lozano-Alejo i sur. (2007.). Nije pronađena signifikantna korelacija između sa-držaja ukupnih karotenoida i svjetline zrna hibrida kukuruza (grafički prikaz Slika 1). Raspon dobivenih vrijednosti crvenosti (a*) je iznosio od -1,3 (Bc 778) do 2,62 (Bc 282). Veće vrijednosti crvenosti daju hibridi crvenog perikarpa. Osim navedenog Bc 282 to su još hibridi Bc 354 i Pajdaš. Nije pronađena signifi-kantna korelacija između sadržaja ukupnih karotenoida i crvenosti zrna hibrida kukuruza (grafički prikaz Slika 2).

Tablica 1. Srednje vrijednosti i standardne devijacije sadržaja ukupnih karotenoida izražene kao μg β-karotena/g uzorka i

parametara boje L*, a* i b* zrna 18 Bc hibrida kukuruza

Hibrid Sadržaj karotenoida (μg/g)a L* a* b*

Bc 244 34,57 ± 0,28 83,76 ± 0,39 -0,22 ± 0,07 39,30 ± 0,24 Bc 282 24,48 ± 0,16 78,81 ± 0,35 2,62 ± 0,07 33,68 ± 0,45 Bc 288 b 24,25 ± 0,49 86,72 ± 0,08 -1,29 ± 0,05 32,24 ± 0,21 Bc 304 28,75 ± 0,47 83,96 ± 0,10 0,09 ± 0,05 33,37 ± 0,68 Bc 354 27,77 ± 0,71 80,90 ± 0,26 2,30 ± 0,03 30,63 ± 0,32 Bc 394 22,13 ± 0,38 85,45 ± 0,14 -0,10 ± 0,05 31,91 ± 0,36 Bc 408 b 13,31 ± 0,47 85,58 ± 0,16 0,46 ± 0,10 29,89 ± 0,28 Bc 418 b 31,84 ±0,82 83,36 ± 0,66 0,51 ± 0,13 33,06 ± 0,28 Bc 462 31,27 ± 0,63 83,91± 0,25 -1,16 ± 0,08 37,86 ± 0,51 Bc 462 b 36,04 ± 0,58 83,33 ± 0,27 0,81± 0,05 39,02 ± 0,65 Bc 4982 35,18 ± 0,22 85,97 ± 0,19 -1,19 ± 0,03 33,46 ± 0,66 Bc 566 28,92 ± 0,69 84,82 ± 0,09 0,27 ± 0,04 30,98 ±0,11 Bc 572 41,70 ± 0,37 83,08 ± 0,37 1,12 ± 0,11 39,94 ± 0,65 Bc 5982 37,66 ± 0,35 85,43 ± 0,31 -1,08 ± 0,11 36,29 ± 0,68 Bc 666 39,14 ± 0,89 85,46 ± 0,17 -1,08 ± 0,13 34,49 ± 0,41 Bc 678 47,47 ± 2,18 85,44 ± 0,56 -0,29 ± 0,11 40,07 ± 0,57 Bc 778 24,63 ± 0,21 87,29 ± 0,36 -1,30 ± 0,08 32,21 ± 0,54 Pajdaš 27,45 ± 0,28 80,75 ± 0,25 2,54 ± 0,14 38,56 ± 0,18 a Dobivene vrijednosti pri 100% suhe tvari.


Table 1. Average values and standard deviations of total carotenoid content expressed as μg of β-carotene equivalents/g of sample and colour parameters L*, a* and b* of 18 corn hybrids

Hybrid Carotenoid content

(μg/g)a L* a* b*

Bc 244 34,57 ± 0,28 83,76 ± 0,39 -0,22 ± 0,07 39,30 ± 0,24

Bc 282 24,48 ± 0,16 78,81 ± 0,35 2,62 ± 0,07 33,68 ± 0,45

Bc 288 b 24,25 ± 0,49 86,72 ± 0,08 -1,29 ± 0,05 32,24 ± 0,21

Bc 304 28,75 ± 0,47 83,96 ± 0,10 0,09 ± 0,05 33,37 ± 0,68

Bc 354 27,77 ± 0,71 80,90 ± 0,26 2,30 ± 0,03 30,63 ± 0,32

Bc 394 22,13 ± 0,38 85,45 ± 0,14 -0,10 ± 0,05 31,91 ± 0,36

Bc 408 b 13,31 ± 0,47 85,58 ± 0,16 0,46 ± 0,10 29,89 ± 0,28

Bc 418 b 31,84 ±0,82 83,36 ± 0,66 0,51 ± 0,13 33,06 ± 0,28

Bc 462 31,27 ± 0,63 83,91± 0,25 -1,16 ± 0,08 37,86 ± 0,51

Bc 462 b 36,04 ± 0,58 83,33 ± 0,27 0,81± 0,05 39,02 ± 0,65

Bc 4982 35,18 ± 0,22 85,97 ± 0,19 -1,19 ± 0,03 33,46 ± 0,66

Bc 566 28,92 ± 0,69 84,82 ± 0,09 0,27 ± 0,04 30,98 ±0,11

Bc 572 41,70 ± 0,37 83,08 ± 0,37 1,12 ± 0,11 39,94 ± 0,65

Bc 5982 37,66 ± 0,35 85,43 ± 0,31 -1,08 ± 0,11 36,29 ± 0,68

Bc 666 39,14 ± 0,89 85,46 ± 0,17 -1,08 ± 0,13 34,49 ± 0,41

Bc 678 47,47 ± 2,18 85,44 ± 0,56 -0,29 ± 0,11 40,07 ± 0,57

Bc 778 24,63 ± 0,21 87,29 ± 0,36 -1,30 ± 0,08 32,21 ± 0,54

Pajdaš 27,45 ± 0,28 80,75 ± 0,25 2,54 ± 0,14 38,56 ± 0,18

aValues at dry basis.

r = -0,19, p = 0,4384R2 = 0,0533

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

svjetlina (L*)

sad

ržaj

uku

pnih

kar

oten

oida

/ μg

/g

0

Slika 1. Ovisnost sadržaja ukupnih karotenoida izraženih kao μg β-karotena/g uzorka i svjetline (L*) za 18 analiziranih Bc hibrida


r = -0.19, p = 0.4384R2 = 0.0533

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

brightness (L*)

tota

l car

oten

oid

cont

ent /

μg/

g

0

Figure 1. Relationship between total carotenoid content (μg β-carotene/g) and brightness (L*) for 18 analyzed corn hybrids

r = 0,04, p = 0,8780R2 = 0,0116

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50

crvenost (a*)

sadr

žaj u

kupn

ih k

arot

enoi

da / μg

/g

Slika 2. Ovisnost sadržaja ukupnih karotenoida izraženih kao μg β-karotena/g uzorka i crvenosti (a*) za 18 analiziranih Bc hibrida

r = 0.04, p= 0.8780R2 = 0.0116

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50

redness (a*)

tota

l car

oten

oid

cont

ent /

μg/

g

Figure 2. Relationship between total carotenoid content (μg β-carotene/g) and redness (a*) for 18 analyzed corn hybrids


Vrijednosti intenziteta žutosti razlikuju se za 18 Bc hibrida, a raspon dobivenih vrijednosti analiziranih hibrida iznosio je od 29,87 (Bc 408 b) do 40,07 (Bc 678). Vrijednosti žutine signifikantno (P<0,001) i pozitivno koreliraju sa sadržajem ukupnih karotenoida (r=0,79). Naime, žuti lutein i zeaksan-tin najviše određuju boju jer su najzastupljeniji (78,16%) karotenoidi u zrnu kukuruza (Brenna i Berardo, 2004.). Pozitivna korelacija se slaže s istraživanjem Lozano-Aleje i sur. (2007.). Na temelju dobivene pozitivne korelacije može se zaključiti da se prema intezitetu žutoće određenom prema CIELab može procijeniti sadržaj ukupnih karotenoida u zrnu hibrida kukuruza. Ovisnost sadržaja ukupnih karotenoida o žutosti može se opisati regresijskim pravcem: sadržaj ukupnih karotenoida (μg/g) = -22,33 + 1,577xb* (p<0,001, R2=0,63), a regresijski pravac je prikazan Slikom 3.

Zaključak

Žuta boja zrna kukuruza povezana je sa sadržajem karote-noida – pigmenata koje perad koristi za pigmentaciju ali i očuvanje zdravlja. Intenzitet žutine zrna kukuruza, određen prema CIELab sustavu, uporabom kolorimetra može dobro procijeniti sadržaj ukupnih karotenoida. Primjenom ovog mjerenja u praksi na jednostavan i jeftin način može se odrediti koji je hibrid kukuruza prikladniji kao izvor karotenoidnih pigmenata za perad.

Literatura

Adom K. K., R. H. Liu (2002.): Antioxidant activity of grains. J. Agric. Food Chem. 50, 6182-6187.

Blessin, C. W., J. D. Brecher, R. J. Dimler (1963.): Carotenoids of corn and sorghum V. Distribution of xanthophylls and

sadržaj ukupnih karotenoida = -22,327 + 1,5766xb*

R2 = 0,6302

20

25

30

35

40

45

50

25 27 29 31 33 35 37 39 41

žutina (b*)

sadr

žaj u

kupn

ih k

arot

enoi

da / μg

/g

000

0

Slika 3. Ovisnost sadržaja ukupnih karotenoida izraženih kao μg β-karotena/g uzorka i žutine (b*) za 18 analiziranih Bc hibrida

total carotenoid content = -22,327 + 1,5766xb*

R2 = 0.6302

20

25

30

35

40

45

50

25 27 29 31 33 35 37 39 41

yellowness (b*)

tota

l car

oten

oid

cont

ent /

μg/

g

000

0

Figure 3. Relationship between total carotenoid content (μg β-carotene/g) and yellowness (b*) for 18 analyzed corn hybrids


carotenes in hand-dissected and dry-milled fractions of yellow-dent corn. Cereal Chem. 40, 582-586.

Breithaupt D. E. (2007.): Modern application of xanthophylls in animal feeding – a review. Trends Food Sci. Tech. 18, 501-506.

Brenna, O. V., N. Berardo (2004.): Application of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy (NIRS) to the evaluation of carotenoids in content in maize. J. Agric. Food Chem. 52, 5577-5582.

CIE (1976.): Supplement No.2 to CIE Publication No. 15 (E-1.3.1) 1978, 1971/(TC-1- 3). Recommendations on uniform color spaces-color difference equations, Psychrometric Color Terms. Commission Internationale de I ´Eclairage, Pariz

Egesel C. O., J. C. Wong, R. J. Lambert, T. R. Rocheford (2003.): Combining ability of maize inbreds for carotenoids and tocopherols. Crop. Sci. 43, 818-823.

Hulshof P. J. M., T. Kosmeijer-Schuil, C. E. West, P. C. H. Hollman (2007.): Quick screening of maize kernels for provitamin A content. J.Food Comp. Anal. 20, 655-661.

Kopsell D. A., D. E. Kopsell (2006.): Accumulation and bioavailability of dietary carotenoids in vegetable crops. Trends Plant. Sci. 11, 499-507.

Kurilich A. C., J. J. Juvik (1999.): Quantification of carotenoid and tocopherol antioxidants in Zea Mays. J. Agric. Food Chem. 47 1948-1955.

Lozano-Alejo N., G. Yazquez Carrillo, K. Pixley, N. Palacios-Rojas (2007.): Physical properties and carotenoid content of maize kernels and its nixtamalized snacks. Innovat. Food Sci. Emerg. Tech. 8, 385-389.

Olson J.A. (1996.): Biochemistry of vitamin A and carotenoids. 221-250. U: Vitamin A deficiency: health, survival and vision. Oxford University Press, New York, USA

Perez-Vendrell A. M., J. M. Hernandez, L. Llaurado, J. Schierle, J. Brufau (2001.): Influence of source and ratio of xanthopyll pigments on broiler chicken pigmentation and performance. Poult. Sci. 80, 320-326.

SAS (2003.): OnlineDoc® Software Release 9.1. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA.

ESTIMATION OF CAROTENOID CONTENT FROM COLOUR ANALYSIS OF CORN GRAINS

Summary

The colour of egg yolk and poultry skin or flesh is a very important factor influencing the consumers’ quality perception. Carotenoid pigments which are associated with poultry growth metabolism and fertility are deposited in skin or egg yolk. Yellow corn is the only cereal with substantial carotenoid content. Also, yellow corn is the most important nutrient in poultry nutrition in Croatia and therefore an important source of pigments for poultry pigmentation. Carotenoids are located in the grain endosperm and they are responsible for the yellow colour of the grains. Chemical determination of carotenoids is often expensive and time-consuming and therefore inapplicable in practice. The aim of this research was to determine the relationship between the colour shade, according to the CIELab system, and the total carotenoid content in grains of 18 corn hybrids. Corn grain carotenoids were extracted with hexane and quantified using the extinction coefficient of β-carotene in hexane. The corn grain colour was measured with Chroma Meter Cr-410 (Minolta, Japan). The average carotenoid content was 33.16μg β-carotene/g (range from 22.13 to 47.47μg/g). Average values of colour parameters L*, a* and b* were 84.11 (78.81-87.29), 0.17 (-1.30-2.62) and 34.83 (29.87-40.07), respectively. Only yellowness (b*) correlated significantly (P<0.001) positive (r=0.79) with the carotenoid content in corn grains. According to the given data, the intensity of yellowness of corn grain determined as CIELab parameter b* could estimates its carotenoid content (carotenoid content (μg/g) =-22.33+1.577xb*, p<0.001, R2=0.63). Key words: corn grain, carotenoids, colour


UTJECAJ MIKROKLIME NA KONCENTRACIJU PRAŠINE I MIKROORGANIZAMA U ZRAKU PERADNJAKA ZA NESILICE KONZUMNIH JAJA

Kristina Matković1, Marija Vučemilo1, Bara Vinković2

1 Zavod za animalnu higijenu, okoliš i etologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska 2 Odjel za ekologiju, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

U radu se opisuje utjecaj mikroklimatskih uvjeta na sadržaj bakterija i gljivica te prašine u zraku nastambe za smještaj nesilica konzumnih jaja. Nastali kao neminovan nusprodukt proizvodnje, a potencijalno opasni po zdravlje ljudi i životinja, te zagađenje neposrednog okoliša, bioaerosoli su predmet brojnih istraživanja s ciljem postavljanja graničnih vrijednosti kvalitete zraka. U provedenom istraživanju srednje vrijednosti ukupnog broja bakterija u zraku kretale su se u granicama od 1,29 x 104 CFU/m3 do 9,21 x 104 CFU/m3, a broj gljivica u zraku kretao se od 7,28 x 103 do 9,34 x 104 CFU/m3. Koncentracija prašine kretala se od 0,68 mg/m3 , koliko je izmjereno u svibnju, do 3,42 mg/m3 , koliko je izmjereno u prosincu. Mikroklimatski pokazatelji bili su uglavnom unutar raspona predviđenih tehnologijom. Zabilježene vrijednosti ukazuju na potrebu daljnjih istraživanja ove problematike koja će pomoći kod postavljanja standarda o kvaliteti zraka u nastambama za životinje. Ključne riječi: nesilice, mikroklima, bakterije u zraku, gljivice u zraku, prašina

Uvod Proizvodnja konzumnih jaja predstavlja intenzivnu sto-čarsku aktivnost tijekom koje se nesilice drže uglavnom u kavezima i u precizno kontroliranim uvjetima. U zraku nastambi stvaraju se znatne količine bioaerosola. Njega sa-činjavaju prašina, bakterije, gljivice, endotoksini i plinovi (Hartung i Wathes, 2001.; Hartung, 2007.). Sadržaj i broj-nost bioaerosola ovisi o građevinsko-tehničkim značajkama nastambi, naseljenosti životinjama, načinu držanja, tempe-raturno-vlažnim odnosima i aktivnostima oko hranjenja, sakupljanja jaja te drugih poslova. Kvaliteta stajskog zraka u nastambama ne utječe samo na zdravlje životinja i ljudi koji s njima rade već se o njoj raspravlja i u kontekstu rizika za kvalitetu neposrednog okoliša. U tu svrhu u radu se opisuje nastamba nesilica konzumnih jaja u kojoj se analiziraju osnovni pokazatelji mikroklime, brojnost bakterija i gljivica u zraku te koncentracija prašine. Dobivene vrijednosti poslužit će u izradi referentnog, u praksi prihvatljivog pokazatelja kvalitete stajskog zraka i mogućeg zagađenja okoliša ovom vrstom kontaminata.

Materijal i metode Istraživanje je provedeno na farmi kavezno držanih nesilica konzumnih jaja u središnjem dijelu Hrvatske. Pretraživana nastamba dužine je 92 m, širine 14 m i visine, do sljemena krova 3 m. Građena je klasičnim građevinskim elementima. Temelji i pod su od betona, zidovi od šuplje opeke, a strop od drvenih ploča (iverica). Krovna konstrukcija pokrivena je valovitim salonit pločama. Nastamba nema prozore. Na podužnom zidu u središnjem dijelu nastambe nalazi se otvor za izgnojavanje. Prozračivanje je mehaničko, a provodi se uz pomoć 35 ventilatora, 18 ventilatora sa 700 i 17 s 1100 okretaja. Ventilatori su smješteni bočno. U nastambi ima ukupno 200 rasvjetnih tijela jakosti 40W, poredanih si-metrično. U nastambu je useljeno 22.000 pilenki hibrida Shaver u dobi od 18 tjedana. Smještene su u konvencionalne kaveze, ve-ličine 90 x 45 x 45 cm. Kavezi su povezani u pet troetažnih baterija, odnosno po 550 kaveza u jednoj bateriji ili ukupno 2750 kaveza. U svaki kavez useljeno je između 7 i 10 nesilica. Žičana podnica kaveza prema prolazu položena je

Dr. sc. Kristina Matković, dr.vet.med., Zavod za animalnu higijenu, okoliš i etologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu; Heinzelova 55; 10000 Zagreb; Hrvatska; tel: ++ 385 1 2390 291; E-mail: [email protected]

UTJECAJ MIKROKLIME NA KONCENTRACIJU PRAŠINE I MIKROORGANIZAMA U ZRAKU PERADNJAKA ZA NESILICE KONZUMNIH JAJA 46

pod kutom od 2% i završava žljebastim oblikom. Jaja se sakupljaju ručno, dva puta dnevno, na kartonske podloške. Dnevni obrok, usklađen s potrebama hibrida Shaver, daje se u četiri navrata. Voda za napajanje potječe iz vlastitog bunara. Izgnojavanje je riješeno tako da se gnoj ispod donje etaže skuplja u kanalu, a gnoj iz druge i treće etaže baterija na ploče postavljene ispod kaveza. Pomoću strugača gnoj se potiskuje do poprečnog kanala iz kojeg se tjedno, pomoću mehaničke trake, ubacuje u traktor i potom odvozi na obližnju poljoprivrednu površinu. U ovom istraživanju određivani su brojnost bakterija i glji-vica te sadržaj prašine u zraku nastambe, potom temperatura zraka, relativna vlaga zraka i brzina strujanja zraka kao sa-stavnice mikroklimatskog kompleksa. Označeni pokazatelji određivani su od siječnja do lipnja, dva puta mjesečno. Mjerenja su obavljana duž dva središnja prolaza između baterija, u razini druge etaže kaveza. Uzorkovanje zraka za utvrđivanje broja bakterija i gljivica obavljeno je pomoću uređaja MERCK MAS-100 (MERCK KgaA, Darmstadt, Njemačka). Za određivanje ukupnog bro-ja bakterija korištene su zdjelice s hranjivim agarom (Co-lumbia agar, Biolife), a za gljivice su poslužile pripremljene zdjelice Sabouraud maltoza agara (Biolife). Petrijeve zdje-lice s hranjivim agarom stavljane su u termostat s tempe-raturom podešenom na 37 ºC/72 h, a zdjelice s materijalom uzorkovanim na Sabouraudov agar na temperaturu od 22 ºC/5 dana. Izrasle kolonije bakterija i gljivica izbrojane su optičkim mehaničkim brojačem (Colony Counter). Potom su dobivene vrijednosti korigirane matematičkom jednadž-bom iz tablice priložene uz uređaj MERCK MAS-100 (Anonim., 1998.). Korekciju je potrebno učiniti jer se kod većeg broja mikroorganizama u uzorkovanom zraku može dogoditi da više njih udari u jedno mjesto na postavljenoj Petrijevoj zdjelici. Uzorkovanje zraka za utvrđivanje koncentracije prašine obavljano je uređajem SKC pump (SKC Ltd., Blandford Forum, UK). Tijekom četiri sata rada pumpe i podešeni protok zraka od 3,5 l/min skupljala se prašina na odgova-rajuće filtere (Whatman International Ltd., Maidstone, UK). Filteri su izvagani prije i poslije uzorkovanja u laboratoriju pri temperaturi zraka od 22 °C i relativnoj vlazi zraka od 45 % (± 5%). Temperatura zraka (tz ºC), relativna vlaga zraka (rv%) i brzina strujanja zraka (m/s) u nastambi mjerene su uređajem TESTO 400 (Testo Inc., Lenzkirch, Njemačka) s pripada-jućom sondom. Dobiveni rezultati obrađeni su statističkim programom Statistica 7.


Izmjerene vrijednosti temperature stajskog zraka bile su unutar optimalnih raspona, osim u zimskim mjesecima kada su bile značajno niže; vrijednosti relativne vlage kretale su se između 56,8 % i 68,6 %, a srednje vrijednosti brzine

strujanja zraka od 0,03 m/s u zimu do 0,19 m/s izmjereno u ljeto. Srednje vrijednosti ukupnog broja bakterija u zraku kretale su se u granicama od 1,29 x 104 CFU/m3 do 9,21 x 104 CFU/m3, a broj gljivica u zraku kretao se od 7,28 x 103 do 9,34 x 104 CFU/m3, izmjereno tijekom istraživanja. Koncentracija prašine kretala se od 0,68 mg/m3 izmjereno u svibnju do 3,42 mg/m3 izmjereno u prosincu. Bakterije su sastavni dio krutih i tekućih bioaerosola (Lange i sur., 1997.; Wathes, 1995.). Najčešće su zastupljeni sa-profiti, ali se ponekad mogu naći i patogene bakterije. Izvor predstavljaju same životinje, hrana, stelja i fekalije, dok njihovu količinu u zraku uvjetuju hranjenje, manipulacije u nastambama, čišćenje i postojeći mikroklimatski uvjeti. Broj patogenih bakterija uvelike će ovisiti o zdravstvenom stanju prisutnih životinja. Zbog fizikalnih utjecaja procesa sedi-mentacije, agregacije, dehidracije te prozračivanja, koji utječu na preživljavanje mikroorganizama, teško je točno utvrditi njihovu brojnost (Cox, 1989.; Wathes i sur., 1998.). U zraku se, kao posljedica djelovanja tih stresora, uz žive, nađu i mrtve bakterije, ali i endotoksini - njihove biološki aktivne sastavnice (Seedorf i sur., 1998.). Stoga su i u literaturi opisani široki rasponi broja mikro-organizama. U nastambama za perad broj bakterija kreće se od 104 CFU/m3 pa čak do 108 CFU/m3, a ukupan broj gljivica od 102 CFU/m3 do 109 CFU/m3 (Wathes, 1994.; Eduard, 1997.; Müller i sur., 2004.; Venter i sur., 2004.; Matković i sur., 2006.). Koncentracija prašine u nastam-bama za nesilice kreće se također u širokom rasponu vrijednosti, točnije između 0,75 i 8,78 mg/m3 (TAKAI i sur., 1998.). Ta količina izravno ovisi o načinu držanja. U nastambama s držanjem na dubokoj stelji javljaju se veće količine prašine i veći broj mikroorganizama u odnosu na kavezno držanje nesilica. Utvrđeni broj mikroorganizama ovisit će i o načinu uzor-kovanja, pri čemu je važno spomenuti i činjenicu da se dosadašnjim metodama, pa tako i u ovom istraživanju, do-biveni broj odnosi na žive bakterije. Broj održivih bakterija pak ovisi o mikroklimi jer je poznato da na preživljavanje bakterija najviše utječe relativna vlaga te da većina njih kod relativne vlage 55-75% može kratko vrijeme opstati u oko-lišu a da ne propadne (Bickert, 2001.). Utvrđeni broj mikroorganizama i prašine u zraku pretra-živane nastambe se kroz cijelo razdoblje proizvodnje kretao na donjim granicama raspona za kavezno smještene nesilice, opisanima u literaturi (Eduard, 1997.; Seedorf i sur., 1998.; Saleh i sur., 2003.; Saleh, 2006.). Veća koncentracija mikroorganizama i prašine u zimskim mjesecima uzročno je povezana s mikroklimatskim uvjeti-ma, posebice brzinom strujanja zraka, koja je tada dosegnula najniže zabilježene vrijednosti (0,03 m/s). Time se svakako može potvrditi teza kako je brzina strujanja zraka, odnosno prozračivanje, kao stvarni proces razrjeđenja zraka, najvaž-nija za smanjenje prisutnog broja mikroorganizama u zraku nastambi (Müller, 1987.). Dodatna potvrda su najniže izmje-rene koncentracije mikroorganizama i prašine u ljetnim mje-secima, kada je ventilacija pojačano radila.

UTJECAJ MIKROKLIME NA KONCENTRACIJU PRAŠINE I MIKROORGANIZAMA U ZRAKU PERADNJAKA ZA NESILICE KONZUMNIH JAJA 47

Zaključci

Na ukupan broj mikroorganizama izravno utječu tempera-tura zraka, relativna vlaga i brzina strujanja zraka, što je dokazano Wilcoxon testom ekvivalentnih parova na razini statističke značajnosti P<0,05. Utvrđene vrijednosti koncen-tracije mikroorganizama i prašine ukazuju na potrebu dalj-njih istraživanja ove problematike, koja će pomoći kod postavljanja standarda o kvaliteti zraka u nastambama za životinje.

Potvrda

Rad je izrađen u sklopu projekta Ministarstva znanosti, obra-zovanja i športa pod naslovom «Utjecaj okoliša na zdravlje životinja i sigurnost namirnica animalnog podrijetla» (053-0531854-1867) voditeljice prof. dr. sc. Marije Vučemilo .

Literatura

Anonimno (1998.): MERCK MAS-100 System. Microbiological Air Sampler, Operator,s manual. MERCK KgaA. Darmstadt, Germany

Bickert, W. (2001.): Ventilation and animal health. Agricultural Engineering Department. Michigan State University News-letter, July/August

Cox, C. S. (1989.): Airborne bacteria and viruses. Science Progress, Oxford. 73, 469-500.

Eduard, W. (1997.): Exposure to non-infectious microorganisms and endotoxins in agriculture. Ann. Agric. Environ. Med. 4, 179-186.

Lange, J. L., P. S. Thorne, G. J. Kullman (1997.): Determinants of culturable bioaerosol concentraions in dairy barns. Ann. Agric. Environ. Med. 4, 187-194.

Matković, K., M. Vučemilo, B. Vinković, B. Šeol, Ž. Pavičić, A. Tofant, S. Matković (2006.): Effect of microclimate on bacterial count and airborne emission from dairy barns on the environment. Ann. Agric. Environ. Med. 13, 349-354.

Müller, W. (1987.): Dust and microbial emissions from animal production; Origin, quantity and quality of microbial emis-sions in animal houses. In: Strauch, D. (ed.): Animal pro-

duction and environmental health, Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, Tokio. 47-74.

Müller, W., U. Schütze, J. Schulz, B. A. Zucker (2004.): Sampling and differentiation of airborne molds in animal houses. Proceedings of the In-between congress of the ISAH, 11-13 October. Saint-Malo, France. pp. 201-202.

Saleh, M., J. Seedorf, J. Hartung (2003.): Total count of bacteria in the air of three different laying hen housing systems. Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 110, 394-397.

Saleh, M. (2006.): Untersuchungen zur luftqualität in ver-schiedenen Systemen der geflügelhaltung mit besonderer Berücksichtigung von staub und luftkeimen. Disertation. Hannover.

Seedorf, J., J. Hartung, M. Schröder, K. H. Linkert, V. R. Phillips, M. R. Holden, R. W. Sneath, J. L. Short, R. P. White, S. Pedersen, H. Takai, J. O. Johnsen, J. H. M. Metz, P. W. G. Groot Koerkamp, G. H. Uenk, C. M. Wathes (1998.): Concentrations and emissions of airborne endotoxins and microorganisms in livestock buildings in Nothern Europe. J. agric. Engng. Res. 70, 97-109.

Venter, P., F. R. Lues, H. Theron (2004.): Quantification of bioaerosols on automated chicken egg production plants. Poult. Sci. 83, 1226-1231.

Wathes, C. M. (1994.): Air and surface hygiene. In: Wathes, C. M., D. R. Charles, (eds.) Livestock housing. CAB International. Wallingford. pp. 123-148.

Wathes, C. M. (1995.): Bioaerosols in animal houses. In: Cox, C. S., C. M. Wathes (eds) Bioaerosol handbook. Lewis Publisher, New York. pp. 547 - 577.

Wathes, C. M., V. R. Phillips, M. R. Holden, R. W. Sneath, J. L. Short, R. P. White, J. Hartung, J. Seedorf, M. Schröder, K. H. Linkert, S. Pedersen, H. Takai, J. O. Johnsen, P. W. G. Groot Koerkamp, G. H. Uenk, J. H. M. Metz, T. Hinz, V. Caspary, S. Linke (1998.): Emissions of aerial pollutants in livestock buildings in Nothern Europe; Overview of a multinational project. J. agric. Engng. Res. 70, 3-9.

Takai H., S. Pedersen, J. O. Johnsen, J. H. M. Metz, P. W. G. Groot Koerkamp, G. H. Uenk, V. R. Phillips, M. R. Holden, R. W. Sneath, J. L. Short (1998.): Concentrations and emissions of airborne dust in livestock buildings in Northern Europe. J. Agric. Engng. Res. 70, 59-77.

INFLUENCE OF MICROCLIMATE ON DUST AND ON CONCENTRATION OF MICROORGANISMS IN THE AIR OF POULTRY HOUSES FOR LAYING HENS

Summary

This paper describes the influence of the microclimate on content of bacteria, fungi and dust in the air of laying hen housing systems. Due to the fact that bioaerosols are an obliged by-product of poultry production, a potential danger for the health of people and animals, as well as causing pollution of the nearby environment, they have been subject of numerous researches. The aim of these researches is to set up limiting values of air quality in animal housing systems. In the entire research the total number of airborne bacteria ranged from 1.29 x 104 CFU/m3 to 9.21 x 104 CFU/m3, and the number of airborne fungi ranged from 7.28 x 103 to 9.34 x 104 CFU/m3. Dust concentration ranged from 0.68 mg/m3 measured in May to 3.42 mg/m3 measured in December. Microclimate factors were, mostly, inside the ranges anticipated by technology. Measured values signify the need for further researches on this problem, which will help in establishing standards for air quality in animal housing systems. Key words: laying hens, microclimate, airborne bacteria, airborne fungi, dust


COMPARISON OF DIFFERENT CELL CULTURES FOR THE ISOLATION OF H5N1 HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA VIRUS (HPAI)

Brigita Slavec1, Peter Hostnik2, Uroš Krapež1, Jožko Račnik1, Alenka Dovč1, Renata Lindtner-Knific1, Marko Zadravec1, Dušan Benčina3, Olga Zorman-Rojs1

1 Institute of Poultry Health and Protection, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia 2 Institute for Microbiology and Parasitology, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia 3 Chair for Genetics, Animal Biotechnology, Immunology, Animal Production and Horse Breeding, Department of Animal Science, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Domžale, Slovenia

Summary

Avian influenza (AI) represents one of the greatest concerns for animal and public health that has emerged in recent years. Ongoing outbreaks of H5N1 AI in migratory waterfowl, domestic poultry and also in mammals – including humans – present a continuing threat in the fields of animal and human health. Despite of the well developed molecular diagnostic of avian influenza infection, isolation of the virus is essential for further studies. Traditionally, embryonated chicken eggs have been used to propagate influenza viruses, and they are still preferably used in many laboratories. However, there are some problems associated with the use of eggs, such as obtaining a sufficient number of reliable high quality eggs and the possibility of the selection of variants containing antigenic and structural changes in the hemagglutinin molecule after growth of the virus in the eggs. For searching an adequate alternative for growing the virus, many studies were done on isolation of the avian influenza virus on Madin-Darby canine kidney (MDCK) and on African green monkey kidney (Vero) cells, but only a few studies are done on other cell culture types. In the present study we investigated the ability of HPAI isolate H5N1 of avian origin to adopt and grow on different cell cultures of avian and mammalian origin. We also analysed potential molecular changes on main antigenic determinates such as hemagglutinin gene. In the experiment chicken embryo cells (CEC) and three cell lines of mammalian origin, baby hamster kidney (BHK), swine kidney (PK) and rabbit kidney (RK) cells were used. The growth of the virus was estimated by determination of genome copies by real time RT-PCR and determination of cythopatic effect (CPE). The results confirmed that passages on embryonated eggs lead to mutation in hemagglutinin gene, whereas no mutations were observed after passages on cell cultures. PK and BHK cells were very sensitive for the infection with the HPAI H5N1, even more than CEC, but the RK cells were insensible. Key words: avian influenza virus; H5N1; CEC, BHK, PK, RK cell lines; hemagglutinin gene Introduction

Avian influenza (AI) represents one of the greatest concerns for animal and public health that has emerged in recent years. Ongoing outbreaks of HPAI H5N1 in migratory waterfowl, domestic poultry and also in mammals – in-cluding humans – present a continuing threat for animal and human health (Webster et al., 2006; Capua and Alexander, 2006). During the third wave of HPAI virus subtype H5N1, in autumn 2005, the disease spread westwards and was re-

ported for the first time in Europe where wild birds events were initially observed in the Russian Federation followed by Turkey and Romania. In winter 2005/2006, the H5N1 was detected in Western Europe and in Africa (EMPRES, 2006). In Slovenia the first case was reported in the middle of February 2006, almost three months after the outbreak in Croatia and at the same time as in Italy. During the outbreak of HPAI in Slovenia, viruses of subtype H5N1 were detected in 48 birds. From the middle of February to the end of March 2006 all H5N1 positive birds (forty-four mute swans, two grey herons, one pintail and one mallard) were

Brigita Slavec, PhD, Institute of Poultry Health and Protection, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Cesta v Mestni log 47, Ljubljana, Slovenia; E-mail: [email protected]


49

found in the same geographical region near the River Drava in the northeastern part of Slovenia (Slavec et al. 2008). The virus identified in Slovenia showed close relationship with H5N1 viruses from other European countries from the same period which had its origin in either Russia or Qinghai Province in China (Salzberg et al. 2007). Comparison of nucleotide sequences of hemagglutinin gene obtained for H5N1 isolates from different bird species indicated that two different HPAI H5N1 viruses were introduced in Slovenia in 2006, despite relatively short duration of HPAI outbreak (Slavec et al. 2008). Early detection and aggressive control measures allowed Japan, South Korea, and Malaysia to eradicate the H5N1 virus soon after its introduction into poultry flocks. Howe-ver, in other countries in Asia, delayed detection and response caused the virus to become entrenched across a wide region (Webster et al. 2006). Well developed molecular methods support rapid detection of influenza viruses. Sequencing of the hemagglutinin gene proteolytic cleavage site of the H5 and H7 subtype AI viruses is critical for quickly pathotype prediction. This is one of the criteria of the World Organization of Animal Health (Office Internationale des Epizooties- OIE) for reporting an AI virus as highly pathogenic notifiable AI virus (Spackman et al. 2008). Despite of well developed molecular diagnostic of avian influenza infection, isolation of the virus is essential for further studies, such as pathobiology, antigenic and antiviral sensitivity and also for genome sequencing. Commonly used and most promising methods for isolation and propagation of the AI viruses are specific pathogen-free (SPF) chicken eggs (Swayne et al., 1998). Although em-bryonated eggs can support the growth of a broad range of influenza viruses, many field isolates do not grow in eggs (Monto et al. 1981; Clavijo et al., 2002; Lee et al., 2008). Long-term planning the embryonated eggs need, the risk of lack of eggs in event of an epidemia or pandemia, together with the hemagglutinin variation observed in virus cultivated in eggs (Schild et al. 1983; Robertson et al., 1987), lead to a significant demand for a tissue culture based laboratory host (Ferrari et al. 2003). The aim of our study was firstly to determinate the ability of HPAI isolate H5N1 of avian origin to adopt and grow on different cells cultures of avian and mammalian origin as an alternative method for virus isolation and propagation in our laboratory, and secondly to find out potential molecular changes on hemagglutinin, main antigenic determinate, after serial passages of the virus on the cell lines.

Material and Methods

Virus The virus HPAI H5N1 used in the study was obtained during the outbreak in Slovenia as the last isolate (A/swan /Slovenia/Slo/649/2006). The cloacal swab was taken from a dead mute swan within the program of AIV passive moni-

toring of wild birds, regulated by the Veterinary Adminis-tration of the Republic of Slovenia. The swab was stored in transport medium (MEM, Gibco) containing antibiotics. For initial RNA extraction and virus isolation, the aliquot of original material was used. The virus was isolated using specific antibody free (SPF) embryonated eggs (Lohmann, Germany) as previously described (Anon., 2006a). The presence of H5N1 virus was confirmed by RT-PCR assays targeting fragments of M, NP, N1 and H5 gene including sequence encoding HA0 cleavage site. Virus H5N1 was titrated in SPF eggs, and ELD50 was calculated (Swayne et al., 1998). Ten-fold serial dilutions were done and 100µl of each dilution was inoculated into five 10 days old SPF embryonated eggs. The virus titer was determined using the Reed and Muench method (Villegas, 1998). Allantoic fluid containing 106.4ELD50/mL was stored for further use. All experiments using HPAI H5N1 were conducted in biosafety level 3 (BSL 3).

Cell culture and viral infection Four different cell lines were used. CEC (CRL-2112) cells were maintained in medium for cell culture Optimem (Gibco/Invitrogen, 3175 Staley, UK). BHK21 (CRL-13001) cells, PK15 (CCL-33) cells and RK13 cell line (CCL-37) were maintained in Minimal essential medium (Gibco/In-vitrogen, 3175 Staley, UK) and were incubated at 37 °C in 5% CO2. Prior using, the cell cultures were mycoplasma tested (Hoechst fluorochrome dye 33258, Germany) and were found negative. For the experiment the cells were seeded (approximately 2 x 105 cells/ml) in a 25cm2 cell culture flask in 9ml of appropriate cell medium. For virus infection three days old cultures were used. The cells were maintained at 35,5 °C in a standard incubator for egg hatching. The virus with titre 106.4ELD50/ ml was 10-fold serially diluted in MEM medium containing antibiotics. One millilitre of dilutions 1:10, 1:100 and 1:1000 were used for primary CEC cell infection. On the fourth day of incubation the cells were observed for the cytopathic effect (CPE). Aliquots of supernatants were harvested for RNA extraction; supernatant obtained with 1:100 viral dilution was used for further virus passage on CEC, BHK, PK and RK cells and titrated directly in cell medium. One ml of supernatant was inoculated in 9ml of cell medium to obtain dilution of 1:10. After sensitive shaking, 1ml was taken out and put in a new flask with the same cell type culture (final dilution 1:100). For negative control, separate non-infected cell cultures were used. On the fourth day of the incubation the cells were observed on CPE and supernatants were harvested for RNA extraction and for the following passage. Additional two passages were done with diluted supernatants (obtained with dilution 1:100) prepared as previously described.

RNA extraction and real-time RT-PCR (RRT-PCR) Total viral RNA used in this study was extracted from 250µl of cloacal swab, allantoic fluid or cell supernatant using


50

Trizol® reagent (Invitrogen, USA) according to the manu-facturer’s instruction. One-tube RRT-PCR was preformed using the Qiagen QuantiFast Probe RT-PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany) in a 25µl reaction mixture containing probe specific for the influenza type A matrix gene (Spackman et al., 2002). The RT-PCR program consisted of 10min at 50 °C for reverse transcription, 5min at 95 °C for PCR initial activation step. A two-step PCR consisted of 40 cycles of 95 °C for 10s and 60 °C for 30s where the fluorescence data were acquired. For relative quantification, the samples obtained after incubation were run together with the starting sample obtained immediately after dilution in cell medium. The results were given in Ct values. Ct value indicated threshold cycle which reflects cycle number at which the fluorescence generated within a reaction crosses the threshold (positive-negative cut-off value). It is inversely correlated to the logarithm of the initial copy number of RNA. To calculate the expression fold value of the virus growth, ΔCt was used. ΔCt means the difference between the Ct value of a sample obtained after incubation and the Ct for the sample obtained before incubation, in case that in both occasion RNA was extracted from the equal volume of the sample. ΔCt was used to calculatethe expression fold value by the equation: expression fold value = 2-ΔΔCt.

Sequencing and analysis of nucleotide and amino acid changes in hemagglutinin of H5N1 The complete hemagglutinin open reading frame was re-verse transcribed and amplified according to Hoffman et al. (2001) with some modification. For obtaining full length of the gene combination two sets of primers were used for getting overlapping gene fragments. For amplification of 5-end of the gene from nt1 to nt819 forward primer Bm-HA-1: TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG G (Hoffman et al., 2001) and reverse primer H5-Kha-3: TAC CAA CCG TCT ACC ATK CCY TG (Anon., 2006b) were used. For amplification of the 3-end of the gene from nt794 to 1778 combination of forward primer H5-Kha1: CCT CCA GAR TAT GCM TAY AAA ATT GTC (Anon., 2006b) and reverse primer Bm-NS-890R: ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT (Hoffman et al., 2001) was used. The amplicon was generated with the OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germany) in a 25µl reaction. The program profile consisted of 30min at 50 °C for reverse transcription, 15 min at 94 °C for reverse transcriptase inactivation and PCR initial activation step followed with 33 cycles of 1min at 94 °C, 1min at 50 °C and 2 min at 72 °C , with a final extension of 7 min at 72 °C. Amplicons were visualised by gel electrophoresis on a 1,5% bromide stained agarose gel. The size of the amplicons generated with Bm-HA1/ H5-Kha-3 primers were approximately 900 bp and amplicons generated with H5-Kha-1/ Bm-NS-890R were approximately 1000 bp. Amplicons were excised from the gel and the RT-PCR products were purified with Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega Corp., Madison WI, USA) following the manufacturer’s instructions. Purified RT-PCR products were sequenced by the dideoxy-mediated chain-

termination method, using ABI Prism BigDye terminator v.1.1. cycle sequencing kit (PE Applied Biosystem, USA) as described by the manufacturer. For sequencing, all four primers were used. The sequencing product was purified with Ethanol/EDTA precipitation in accordance with the instructions of the manufacturer (PE Biosystem, USA). The sequences were analyzed with an automated nucleic acid analyzer (ABI Prism 310 PE Applied Biosystem, USA). Sequence data were assembled and edited using Chromas v.1.45 (http://www.technelysium.com.au/chromas14x.html) and MEGA v. 4.0 (Tamura et al., 2007). Analyses of nucleo-tide and predicted amino acid sequences were conducted using MEGA v. 4.0 (Tamura et al., 2007), NCBI Blast program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) and ClustalW v. 1.8 software (Thompson et al., 1994). Obtained full length hemagglutinin and one partial sequence were aligned with sequences of the Slovene virus isolates analysed in a previous study (Slavec et al., 2008) and have been deposited in the GenBank database under accession numbers: CY017043, AM911100, AM911095, AM911090, AM911085.

Results

H5N1 virus growth in different cell lines In our study, besides cells of avian origin, three cell types (PK, BHK and RK) of mammalian origin were used. In the experiment three passages of the virus A/swan /Slo-venia/649/2006 with 106.4ELD50/mL were done on each cell type. The growth of the virus was estimated by CPE and Ct values (Table 1) which indicated the amount of the viral RNA in the sample. The results demonstrated that the virus grew well on CEC in the first and second passage, with CPE from 50 to 100% in both dilutions. In the third passage no virus growth was observed. ΔCt values indicated that the virus replicated better in dilution 10-2 comapared to 10-1. The difference between dilutions was from 6-fold in the first passage to 32-fold in the second passage. In third passage no growth was observed (Figure 1). PK cells were very susceptible for H5N1 in all three passages. Slightly lower CPE was observed in the first passage, but 100 % CPE was observed in the second and third passage. Similar to the CEC line, the replication of the virus was most intensive in 10-2 dilution (Figure 1). There were obvious differences found between dilutions: about 2210-fold in the first passage, about 22,5-fold in the second passage and about 6,6-fold in the third passage. BHK cells were also very susceptible for the virus. A very high percentage of CPE was observed in the first and in the third passage, but interestingly almost no CPE was observed in second passage. The difference between dilutions was about 18-fold in the first passage and about 10,5-fold in third passage. In the second passage, where almost no CPE was observed, about 2-fold better growth was observed in 10-1dilution. RK cells were not susceptible for infection with H5N1. The differences found in the Ct values were very likely a result of imprecise pipetting (Table 1).


51

Table 1. Replication of HPAI H5N1 in different cells measured by Ct value and cytopathic effect

Figure 1. The estimation of H5N1 growth in different cell lines by CPE and ΔCt value. ΔCt is the difference between the Ct

value of a sample obtained after incubation and the Ct of the sample obtained before incubation from the same flask. The values of the ΔCt above the x-axis are actually negative and those under the x-axis are positive. The -1 in the graph legend represents dilution 1:10 and the -2 represents dilution 1:100

The comparison of all three susceptible cell lines, CEC, PK and BHK, revealed that the PK cells were the most susceptible for infection with H5N1. The growth of the virus in this cell line was evidently higher in the first passage than in CEC and BHK. In the third passage, the growth of the virus in PK cells was 2,6-fold lower compared to BHK cells, but evidently better than in CEC cells (Figure 1).

Characterisation of HA sequences after passage in cell lines Complete hemagglutinin gene sequence for the last Slove-nian H5N1 virus isolate (A/swan/649/2006) and partial

sequence (976 nt) from RNA extracted directly from the cloacal swab were obtained. The sequences had 100% homology. For study of potential mutations which can arise after passage on embryonated chicken eggs and cells lines, additional sequencing of the hemagglutinin gene was preformed (Figure 2). Complete sequences were obtained after the first passage of the virus on the eggs and for all isolates obtained after passages on CEC, PK, and BHK cells. Because of a too small quantity of the virus RNA isolated from the supernatant obtained after incubation in the RK cells, we were not able to amplify RT-PCR amplificons for sequencing the hemagglutinin gene.


52

Comparison of the nucleotide sequence of the virus A/swan/Slo/649/2006 isolate (last isolate), with sequence of the first Slovenian isolate A/swan/Slo/740/2006 showed two substitutions, one of them was non-synonymous. The virus A/swan/Slo/649/2006 had Isoleucine at position 472 whereas the other previously analysed isolates had Leucine (Figure 2). After the first passage on eggs isolate A/swan/Slo/649/2006 obtained another mutation which leads to substitution of Isoleucine at position 437, whereas the other isolates have Valine. After three serial virus passage on the cell cultures, no mutations were observed.

Discussion and conclusions The aim of our study was to determine the ability of HPAI isolate H5N1 of avian origin to adopt and grow on different cell cultures of avian and mammalian origin, and to find out potential molecular changes on hemagglutinin gene as one of the main antigenic determinates. The success of binding and growing of influenza virus is mainly determined by two factors, namely the receptor binding affinity of the virus and the receptor density on the host cell surface (Asaoka et al., 2006). Influenza viruses enter cells by binding to sialyl sugar chain receptors on the cell membranes. The sialic acids (SAs) are typically found at the outermost ends of N-glycans, O-glycans and glyco-sphingolipids. They are subjected to a wide variety of modifications. One of the diversity in sialic acid presentation is generated by different α-linkages from the 2-carbon to underlying sugar chain. The most common sialylterminals are to SA2-3Gal and SA2-6Gal. Human influenza viruses isolated on MDCK cell bind the SA2-6Gal linkeage, but equine and avian viruses bind predominantly SA2-3Gal, whereas the swine viruses bind both SA2-6Gal and SA2-3Gal linkages (Suzuki, 2005). The different recognition of SA2-3Gal or SA2-6Gal by influenza viruses of different species was attributed to changes in the amino acid sequence of the hemagglutinin (Nicholls et al., 2008). Besides, the virus can bind to SA2-3Gal or SA2-6Gal, the receptor binding interaction are far more complex than previously recognized (Nicholls et al., 2008; Thanh et al., 2008). The H5N1 viruses isolated from humans and poultry display the receptor-binding properties which are typical for avian but not for human viruses (Matrosovich et al., 1999). However, some isolates from human showed a hetero-geneous mixture of hemagglutinins that were able to bind

both receptors SA2-3Gal and SA2-6Gal, but had decreased affinity (Nicholls et al., 2008). Traditionally, embryonated chicken eggs have been used to propagate influenza viruses, and they are still preferably used in many laboratories. However, several problems could arise associated with the use of eggs; HPAI viruses may cause embryo mortality in less than 24 hours which must be taken in consideration in differentiation of traumatic mor-tality due to the inoculation procedure (Kaleta and Hönicke, 2005; Kaleta et al. 2005). Allantoic fluid obtained from such eggs usually contains insufficiently virus particles for further

studies. Another problem represents changing of the hemag-glutinin gene after the passage on chicken embryonated eggs (Schild et al., 1983). Robertson et al. (1987) observed that some egg-adapted influenza viruses contained at least one amino acid substitution in their hemagglutinin in comp-arison with its parental sequence. The results of our study confirmed that observation also in case of HPAI H5N1. The hemagglutinin sequence of the isolate A/swan/Slo/649/2006 was identical to its parental sequence obtained directly from cloacal swab whereas it changed after the first passage on eggs. The mutation was non synonymous and led to substitution of amino acid in HA2 protein of hemagglutinin. Such substitutions on the major antigen could have dramatic effects on antigenicity and may lead to inappropriate seroepidemiological studies and vaccine design (Robertson et al., 1987). To find a comparable alternative for isolation and pro-pagation of influenza viruses, many studies were done on Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells (Tobita et al. 1957; Oh et al., 2008; Asaoka et al., 2006; Tree et al., 2001) and on African green monkey kidney (Vero) cells (Go-vorkova et al. 1996; Youil et al., 2004). Limited studies were done on other cell culture types such as on chicken embryo cells (CEC), chicken fibroblast (DF-1), quail fibroblast (QT-6), baby hamster kidney cells (BHK-21), porcine kidney cells PK-15 and newborn swine kidney cells (NSK), newborn pig trachea (NPTr), St. Jude porcine lung cells (SJPL) (Smith et al., 2008; Lee et al., 2008; Govorkova et al., 1999; Ferrari et al., 2003; Seo et al., 2001). In our study we used four different cell lines: CEC and three cell lines of mammalian origin, BHK, PK and RK cells. We were able to propagate virus isolate in CEC, BHK and PK cell lines, but not in RK cells. The results of comparison of all three susceptible cell lines revealed that the PK cells are

Figure 2. Comparison of the deduced H5N1 hemagglutinin amino acid sequences (from amino acid 401 to 480, numbering from

initial methionine residue)


53

the most susceptible to H5N1. Successful propagation of H5N1 on pig cells (SJPL cell line) was reported previously by Seo et al. (2001). According to Ferrari et al. (2003) pig cells such as NSK and NPTr could also be successfully used for propagation of different human A and B type of influenza viruses, as well as some swine, fowl and equine strains. Our results also revealed the importance of the amount of viral particles in inoculums e.g. concentration of virus. Better results were obtained when we used higher dilution for the propagation of the virus. Obviously this is more important in the case of more pathogenic AI and less important when low or non pathogenic viruses are involved. Namely, Seo et al (2001) reported that for sufficient replication of non pathogenic avian influenza viruses on MDCK cells, higher doses were needed. Govorkova et al. (1999) reported about amino acid substitutions in the hemaglutinin which arise after the virus passage on BHK cells. In our study no mutations were observed on the H5N1 hemagglutinin obtained after three passages on BHK cells. Substitutions were observed in human isolates and were the consequence of selective pressures on viruses which have predominant binding affinity on SA2-6Gal receptors. BHK cells express predominantly SA2-3Gal and could lack the SA2-6Gal receptors (Govorkova et al., 1999). On the contrary, RK cells may not express the SA2-3Gal, which does not support the growth of the H5N1 virus. In a previous study, comparison of the hemagglutinin gene sequences of rhw Slovenian H5N1 isolates was done (Slavec et al., 2008). Comparison of the hemagglutinin gene sequences of four later isolates from different bird species with the first isolate A/swan/Slovenia/760/2006 showed 16 mutations. However, only three of them were non-syno-nymous. The virus obtained from a pintail has Glycine at position 239, while other isolates carry Serine. The isolate from the mallard has two amino acid substitutions. Interestingly, the first substitution at position 5, where Methionine replaces Valine, is located in the signal peptide coding region. However, more evident is the mutation at position 341, where Arginine is replaced by Glycine, and so reducing the number of basic amino acids in the HA0 cleavage site. An identical cleavage site PQGEGRRKKR*GLF has isolate from the Sudan (e.g. A/chicken/Sudan/1784-7/2006). The phylogenetic analysis of HA gene sequences clustered our isolates in clade EMA 1. However, the isolate from the mallard is more closely related to the Sudan isolates, while the others are closely related to Italian isolates (data not shown). Additional comparison of the last isolate A/swan/Slo/649/2006 with the first isolate A/swan/Slovenia/760/2006 showed one more substitution of Isoleucine at position 472. Although eggs remain a practical host for the isolation of influenza viruses, cell cultures such as CEC, PK and BHK seemed to be a good alternative for the propagation of the largest quantity of the virus for research and diagnostic purposes. One of the most important advantages is the

stability of the virus propagated on the cell lines. For primary virus isolation on cell lines from cloacal and tracheal swabs, additional validations have to be done.

Acknowledgments

We thank Dr. Nataša Toplak from OMEGA d.o.o., Ljubljana, for helpful suggestions of Real-time RT-PCR. We also thank our veterinary technician Darja Krelj from the Institute of Poultry Health and Protection, Veterinary Faculty, for excellent technical support. The study was carried out on the behalf of VARS and research project (J49683-0406). The project was founded by the Ministry of Education, Science and Technology.

References

Anon. (2006a): Commison decision of 4 August 2006 approving a Diagnostic Manual for avian influenza as provided for in Council Directive 2005/94/EC (notified under document number C (2006) 3477; 2006/437/EC).

Anon. (2006b): Draft- Commison decision of 15 May 2006 approving a Diagnostic Manual establishing diagnostic procedures, sampling methods and criteria for evaluation of the laboratory tests for the conformation of avian influenza for avian influenza (notified under document number C (2006) SANCO/10212/2006).

Asaoka, N., Y.Tanaka, T. Sakai, Y. Fujii, R. Ohuchi, M. Ohuchi (2006): Low growth ability of recent influenza clinical isolates in MDCK cells is due to their low receptor binding affinities. Microbes Infect. 8, 511-519.

Capua, I., D.J. Alexander, (2006): The challenge of avian influenza to the veterinary community. Avian Path. 35(3), 189-205.

Clavijo, A., D.B. Tresnan, R. Jolie, E.-M. Zhou (2002): Comparison of embryonated chicken eggs with MDCK cell culture for isolation of swine influenza virus. Can. J. Vet. Res. 66, 117-121.

EMPRES Watch: Evolution of Highly Pathogenic Avian Influenza type H5N1 in Europe: review of disease ecology, trends and prospects of spread in autumn-winter 2006. http://www.fao.org/eims/secretariat/empres/eims_search/simple_s_result.asp?infotype=38

(1st October 2008 i.e. date of assessing the document) Ferrari, M., A. Scalvini, M.N. Losio, A. Corradi, M. Soncini, E.

Bignotti, E. Milanesi, P. Ajmone-Marsan, S. Barlati, D. Bellotti, M. Tonelli (2003): Establishment and characterization of two new pig cell lines for use in virological diagnostic laboratories. J. Vir. Met. 107, 205-212.

Govorkova, E.A., M.N. Matrosovich, A.B.Tuzikov, N.V. Bovin, C. gerdil, B. Fanget, and R.G. Webster (1999): Selection of receptor-binding variants of human influenza A and B viruses in baby hamster kidney cells. Virology 262, 31-38.

Govorkova, E.A., G. Murti, B. Meigner, C. de Taisne, R.G. Webster (1996): African green monkey kidney (Vero) cells provide an alternative host cell system for influenza A and B viruses. J. Virol. 70, 5519-5524

Hoffman, E., J. Stech, Y. Guan, R.G. Webster, and D.R. Perez (2001): Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch.Virol. 146, 2275-2289


54

Kaleta, E.F., G. Hergarten, A.Yilmaz (2005): Avian influenza A viruses in birds- an ecological, ornithological and virological view. Dtsch.Tierärztl. Wschr. 112, 448-456.

Kaleta, E.F., A. Hönecke (2005): A retrospective description of a highly pathogenic avian influenza A virus (H7N1/ Carduelis/Germany/72) in a free-living siskin (Carduelis spinus Linnaeus, 1758) and its accidental transmission to yellow canaries (Serinus canaria Linnaeus, 1758). Dtsch.Tierärztl. Wschr. 112, 17-19.

Lee, C.W., K. Jung, S.J. Jadhao, D.L. Suarez (2008): Evaluation of chicken-origin (DF-1) and quail-origin (QT-6) fibroblast cell lines for replication of avian influenza viruses. J. Virol. Met. 153, 22-28.

Matrosovich, M., N. Zhou, Y. Kawaoka and R.Webster (1999) : The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chicken, and wild aquatic birds have distinguishable properties. J. Virol. 73(2), 1146-1155.

Monto, A.S., H.F. Maassab, and E.R. Bryan (1981): Relative efficacy of embryonated eggs and cell culture for isolation of contemporary influenza viruses. J. Clin. Microbiol. 13(1), 233-235.

Nicholls, J.M., R.W.Y. Chan, R.J. Rusell, G.M. Air and J.S.M. Peiris (2008): Evolving complexities of influenza virus and its receptors. Trends Microbiol. 16(4), 149-157.

Oh, D.Y., I.G. Barr, J.A. Mosse, and K.L. Laurie (2008): MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J. Clin. Microbiol 46(7), 2189-2194

Robertson, J.S., J.S. Bootman, R. Newman, J.S. Oxford, R.S. Daniels, R.G. Webster and C.C. Schild (1987): Structural changes in the haemagglutinin which accompany egg adaption of an influenza A (H1N1) virus. Virology 160, 31-37.

Schild, G.C., J.S. Oxford, J.C. De Jong, R.G. Webster (1983): Evidence for host-cell selection of influenza virus antigenic variants. Nature 303, 706-709.

Seo, S.H., O. Goloubeva, R. Webby, and R.G. Webster (2001): Characterization of a porcine lung epithelial cell line suitable for virus studies. J. Virol. 75(19), 9517-9525.

Slavec, B., J. Račnik, O. Zorman-Rojs, U. Krapež, A. Dovč, M. Zadravec, R. Lindtner-Knific, E. Starick (2008): Molecular analysis of H5N1 highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) isolates from Slovenia in 2006. In: 8th conference of the European wildlife disease association, 2 - 5 October, 2008, Rovinj, Croatia. Book of abstracts. Rovinj: EWDA pp. 88.

Smith, K.A., C.J. Colvin, P.S.D. Weber, S.J. Spatz P.M. Coussens (2008): High titer growth of human and avian influenza viruses in an immortalized chick embryo cell line without the need for exogenous proteases. Vaccine 26, 3778-3782.

Spackman, E., A.D. Senne, T.J. Myers, L.L. Bulaga, L.P. Garber, M.L. Perdue, K. Lohman, L.T. Daum, and D.L. Suarez (2002): Development of Real-Time reverse Transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40(9), 3256- 3260.

Spackman, E., D.L. Suarez, D.A. Senne (2008): Avian influenza diagnostic and surveillance methods. In Swayne, D.E. (Ed.), Avian Influenza, 1st ed. Blackwell Publishing, Iowa, pp 299- 308.

Suzuki, Y. (2005): Sialobiology of influenza molecular mechanism of host range variation of influenza viruses. Biol. Pharm. Bull., 28(3), 399-408.

Swayne, D.E., D.A. Senne, C.W. Beard (1998): Influenza. In: Swayne, D.E., J.R. Glisson, M.W. Jackwood et al. (eds.). A laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens 4th ed., American Association of Avian Pathologists, pp. 150-155.

Tamura, K., J. Dudley, M. Nei and S. Kumar (2007): MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, 1596-1599.

Thanh, T.T., H.R. van Doorn, M.D. de Jong (2008): Human H5N1 influenza: Current insight into pathogenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40, 2671-2674.

Thompson, J.D., D.G. Higgins, T.J. Gibson (1994): CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680.

Tobita, K., A. Sugiura, C. Enomoto, and M. Furuyama (1975): Plaque assay and primary isolation of influenza A viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. 162, 9-14.

Tree, J.A., C. Richardson, A.R. Fooks, J.C. Clegg, D. Looby (2001): Comparison of large-scale mammalian cell culture system with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains. Vaccine, 19, 3444-3450.

Villegas, P. (1998): Titration of biological suspension. In: Swayne, D.E. (Ed.), A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens. American Association of Avian Pathologist. Kennett Squere, Pannsylvania, pp. 248- 254.

Webster, R.G., M. Peiris, H. Chen, and Y. Guan (2006): H5N1 outbreaks and enzootic influenza. Emerging Infectious Disease 12(1), 3-8.

Youil, R., Q. Su, T.J. Toner, C. Szymkowiak, W.-S. Kwan, B. Rubin, L. Petrukhin, I. Kiseleva, A.R. Shaw, D. DiStefano (2004): Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods 120, 23-31

USPOREDBA RAZLIČITIH KULTURA STANICA ZA IZOLACIJU VISOKOPATOGENOG VIRUSA INFLUENCE H5N1

Sažetak

Influenca ptica predstavlja jedan od najvećih problema javnog zdravstva i zdravlja životinja tijekom proteklih nekoliko godina. Kontinuirane pojave influence ptica podtipa H5N1 kod ptica selica, močvarica, domaće peradi kao i u sisavaca, uključujući ljude, predstavljaju stalnu prijetnju za ljudsko i životinjsko zdravlje. Usprkos dobro razvijenoj molekularnoj dijagnostici influence ptica, izdvajanje virusa je ključno za daljnja istraživanja. Uobičajeno, korištena su kokošji embriji za umnažanje virusa influence i još uvijek se koriste u mnogim laboratorijima. No postoje problemi vezani za korištenje jaja, poput dobivanja dovoljnog broja pouzdanih visokokvalitetnih jaja i mogućnosti odabira varijanti sastojeći se od antigenskih


55

i strukturalnih promjena u molekuli hemaglutinina nakon rasta virusa na jajima. Za traženje adekvatne alternative za uzgoj virusa, mnoga su istraživanja provedena o izdvajanju virusa influence ptica na stanicama Madin-Darby psećeg bubrega (engl. MDCK) i bubrega afričkog zelenog majmuna (Vero), ali su provedena ograničena istraživanja i na drugim tipovima staničnih kultura. U ovom smo istraživanju ispitivali sposobnost visokopatogenog virusa influence (engl. highly pathogenic avian influenza, HPAI) izolata H5N1 ptičjeg podrijetla da se adaptira i uzgoji na različitim kulturama stanica ptičjeg podrijetla i podrijetla sisavaca. Analizirali smo također potencijalne molekularne promjene na glavnim antigenskim determinatama poput gena hemaglutinina. U pokusnim stanicama kokošjeg embrija (engl. chicken embryo cells, CEC) i tri stanične linije podrijetla sisavaca korištene su stanice bubrega malog hrčka (engl. baby hamster kidney, BHK), svinjskog bubrega (engl. swine kidney, PK) i zečjeg bubrega (rabbit kidney, RK). Razvoj virusa je procijenjen determiniranjem kopija genoma pomoću metode Real-Time RT-PCR i determiniranjem citopatskog efekta. Rezultati su potvrdili da u kokošjim embrijima dolazi do mutacije u genu hemaglutinin, u međuvremenu nisu primijećene mutacije nakon izdvajanja na staničnim kulturama. PK i BHK stanice su vrlo osjetljive na infekciju sa HPAI H5N1, čak i više nego CEC, ali su stanice RK bile neosjetljive. Ključne riječi: virus ptičje gripe; H5N1; CEC, BHK, PK, RK stanične linije; gen hemaglutinina


A MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF AVIAN PARAMYXOVIRUS TYPE 1 (NEWCASTLE DISEASE) VIRUSES ISOLATED FROM PIGEONS IN SLOVENIA

Uroš Krapež1, Adela Fratnik Steyer2, Brigita Slavec1, Darja Barlič-Maganja3, Alenka Dovč1, Jožko Račnik1, Olga Zorman-Rojs1

1 Institute for Poultry Health, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia 2 Department for Virology, Institute for Microbiology and Parasitology, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana,

Slovenia 3 College of Health Care Izola, University of Primorska, Izola, Slovenia

Summary

Twelve isolates of the avian paramyxovirus type 1 (Newcastle disease) viruses isolated from pigeons in Slovenia between the years 2000 and 2008 were genetically analysed. A part of the fusion protein gene, which included the region encoding the fusion protein cleavage site, was amplified and sequenced. Phylogenetic analysis obtained from fusion gene alignments showed that Slovenian strains belong to two separate groups, 4bi and 4bii, of sublineage 4b of lineage 4. The sequence of F2/F1 cleavage site of all Slovenian isolates was typical for the pathogenic APMV-1 viruses. The motif 112RRQKRF117 was present in the viruses from lineage 4bii, whereas viruses from lineage 4bi displayed the 112GRQKRF117 motif. Key words: avian paramyxovirus type 1, NDV, F gene sequences, phylogenetic analysis, pigeon Introduction

The avian paramyxovirus type 1 (APMV-1) of pigeons (PPMV-1) is an antigenic variant of the Newcastle disease virus (NDV) of chickens that is responsible for an autonomous Newcastle disease (ND)-like infectious disease of pigeons. The APMV-1, including PPMV-1, is a member of the genus Avulavirus (Mayo, 2002) within the viral family Paramyxoviridae (Lamb et al., 2000). Based on the severity of the disease, NDV isolates can be grouped into four pathotypes; viscerotropic or neurotropic velogenic strains which cause severe disease resulting in high mortality (up to 100%), mesogenic strains that cause respiratory and nervous signs with moderate mortality, and lentogenic strains that cause only mild respiratory disease and asymptomatic strains. The infection is highly contagious and, in spite of control measures and vaccination, often manifests itself in epizootics (Alexander, 2000). PPMV-1 strains caused outbreaks among racing and show pigeons in Europe in 1981 and re-emerged in 1985 causing a panzootic that continues today (Biancifiori and Fioroni, 1983; Alexander et al., 1985a,b; Wilson 1986; Kaleta 1992; Ujvari et al., 2003; Aldous et al., 2004). Besides pigeons,

doves and chickens, PPMV-1 viruses have also been isolated from kestrels, falcons, cockatoos, budgerigars, pheasants, swans and a robin (Alexander et al., 1985a; Lister et al., 1986; Werner et al., 1999; Aldous et al., 2004; Monne et al., 2006). Most PPMV-1 strains have reduced virulence (mesogenic) for chickens (Alexander and Parsons 1986; Kissi, 1988; Werner et al., 1999; Meulemans et al., 2002), but in most cases PPMV-1 isolates have increased their virulence for chickens after passage, and therefore represent a threat to poultry production (Alexander and Parsons 1986; King, 1996; Kommers et al., 2001). Molecular characterisation of APMV-1 strains concerned mainly the F and M genes. The most studied molecular pattern was the F cleavage site which is considered as a major determinant of strain pathogenicity for poultry (Collins et al., 1993; Peeters et al., 1999; Seal et al., 1995). Most of the PPMV-1 strains were classified into a subgroup VIb within the genotype VI of NDV by phylogenetic analysis of the F cleavage site (Ballagi-Pordany et al., 1996; Lomniczi et al., 1998; Ujavari et al., 2003). Eight NDV genotypes, that have been recently re-classified into six broadly distinct lineages (1 to 6), were described for

dr. Uroš Krapež, Institute for Poultry Health, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia; tel.: +386 1 4779 247; fax. +386 1 4779 339; e-mail address: [email protected]

A MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF AVIAN PARAMYXOVIRUS TYPE 1 (NEWCASTLE DISEASE) VIRUSES ISOLATED FROM PIGEONS IN SLOVENIA 57

epizootic NDV strains world-wide (Lomniczi et al., 1998; Herczeg et al., 1999; Yang et al., 1999; Yu et al., 2001; Czegledi et al., 2002; Mase et al., 2002; Wehmann et al., 2003a, b; Aldous et al., 2004). PPMV-1 viruses associated with the ongoing panzootic in pigeons have been placed into the sublineage 4b of lineage 4 (Aldous et al., 2004). For a better understanding of the epidemiology, in the present study we determined and analysed the phylogenetic relationship and evolution of PPMV-1, the partial sequences of F gene of twelve NDV strains obtained from free living and domestic pigeons between the years 2000 and 2008 in Slovenia.

Materials and methods

Virus strains Isolations of all twelve strains were performed at the Institute for Poultry Health, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, by inoculation of different tissue suspensions, obtained from dead domestic and free-living pigeons, into the allantoic cavity of 9 to 10-day-old embryonated specific-pathogen-free (SPF) chicken eggs as described by Alexander (Alexander, 1988). Isolates were identified as APMV-1 through a haemagglutination inhibition test by using a APMV-1 specific antiserum (Alexander, 1988), provided by VLA, Weybridge, UK. The pathogenicity was evaluated for three strains by the intracerebral pathogenicity index (ICPI) performed on one-day-old SPF chickens (Alexander, 1988). The determined ICPI values for isolates SLO 442/00, SLO 758/00 and SLO 349/01 were 1.1, 0.9 and 1.1, respectively. Infective allantoic fluids were stored at -70 ºC.

RNA extraction, reverse transcription, polymerase chain reaction and nucleotide sequencing RNA was extracted from infectious allantoic fluids by QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN, USA), according to

the manufacturer’s instructions. A region of approximately 454-bp of the F gene, including the F protein cleavage site, was amplified by the oligonucleotide primer pair: F-OPU: 5'-TTG AYG GCA GRC CTC TTG C-3' and F-OPL: 5'-TGC ATC TTC CCA ACT GCC ACT-3' (Li and Zhang, 2004), with two modifications of the F-OPU primer in bold. A single tube RT-PCR system (OneStep RT-PCR Kit, QIAGEN, USA) was used for the genomic RNA amplification. The RT-PCR was performed by uninterrupted thermal cycling with the following program: 30 min at 50 ºC for reverse transcription and reverse transcriptase inactivation at 95 ºC for 15min was followed by 40 cycles of denaturation at 94 ºC for 30 sec, annealing at 52 ºC for 1min, extension at 72 ºC for 1 min, and final extension at 72 ºC for 10 min. The reaction’s products were analysed by electrophoresis on a 1,8% agarose gel stained with ethidium bromide. The DNA fragments were excised from gel and purified with a Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega Corp, USA). Direct double-stranded nucleotide sequencing was completed by using the ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, USA) and oligonucleotide primers used for RT-PCR. Reactions were analysed with an ABI3730xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA).

Sequence analysis The MEGA 3.1 software (Kumar et al., 2004) was used for editing nucleotide sequences and deducing amino acid sequences. Nucleotide and deduced amino acid sequences were aligned with ClustalW software (Thompson, 1994). Phylogenetic analyses were constructed with MEGA 3.1 software using the neighbor-joining method with the Kimura-2 parameter substitution model and 1000 bootstrap replicates to assign confidence level to branches.

Table 1. Slovenian pigeon PMV-1 isolates

Virus isolate Host Year of isolation ICPI SLO 94/00 pigeon (domestic) 2000 n.d SLO 442/00 pigeon (domestic) 2000 1,1 SLO 758/00 pigeon (domestic) 2000 0.9 SLO 349/01 pigeon (domestic) 2001 1,1 SLO 304/03 pigeon (domestic) 2003 n.d SLO 308/03 pigeon (domestic) 2003 n.d SLO 17/04 pigeon (domestic) 2004 n.d SLO 263/04 pigeon (domestic) 2004 n.d SLO 872/04 pigeon (domestic) 2004 n.d SLO 218/05 pigeon (free-living) 2005 n.d SLO 75/06 pigeon (free-living) 2006 n.d SLO 912/08 pigeon (free-living) 2008 n.d


Table 2. Virus isolates used for pairwise comparisons

Virus isolate Host Geographical origin Year of isolation Accession number PUKPI88284 pigeon UK 1988 AY175767 PIEPI96302 pigeon UK 1996 AY175757 PUKPI89124 pigeon UK 1989 AY175768 GB 1168/84 pigeon UK 1984 AF109885 IT 227/82 pigeon Italy 1982 AJ880277 HU 655/89 pigeon Hungary 1989 AY150120 IT 132/89 pigeon Italy 1989 AY150121 HU 1114/90 pigeon Hungary 1990 AY252120 IT 150/95 pigeon Italy 1995 AY150145 IT 152/96 pigeon Italy 1996 AY150147 907/00 pigeon Italy 2000 AF520966 IT 146/94 pigeon Italy 1994 AY150142 4400/00 pigeon Italy 2000 AF520970 PDKPI95103 pigeon UK 1995 AY175755 PDEPI94102 pigeon Germany 1995 AY135749 PUKPI84125 pigeon UK 1984 AY175766 99106 pigeon France 1999 AJ306305 Italy/1166/00 pigeon Italy 2000 AY288996 PUKPI99064 pigeon UK 1999 AY175770 PUKPI99130 pigeon UK 1999 AY175772 PSAPI98201 pigeon Saudi Arabia 1998 AY175760 PAEPI96210 pigeon UK 1996 AY175751 PDEPI94216 pigeon UK 1995 AY175753 PDEPI99063 pigeon UK 1999 AY175754 PZAPI99091 pigeon UK 1999 AY175774 ITPI99129 pigeon UK 1999 AY175737 EFRPI99117 pigeon UK 1999 AY175702 BITPI87079 pigeon Italy 1987 AY135747 BHKPI89165 pigeon UK 1989 AY175672 PTRPI95107 pigeon UK 1995 AY175763 BBGPI95039 pigeon Bulgaria 1998 AY135742 BAEPI99109 pigeon UK 1999 AY175668 Results Phylogenetic analysis of partial F protein genes indicated that the Slovenian PPMV-1 isolates do not cluster together, but instead are split between the two groups 4bi and 4bii. Seven Slovenian isolates (SLO 349/01, SLO 17/04, SLO 263/04, SLO 872/04, SLO 218/05, SLO 75/06 and SLO 912/08) were placed in the lineage 4bii. Five other isolates (SLO 94/00, SLO 442/00, SLO 758/00, SLO 304/03 and SLO 308/03) were clustered together with PPMV-1 isolates from lineage 4bi (Fig. 2). Identity at the nucleotide level

between Slovenian isolates was 91,1% to 100%. Nucleotide identities between isolates from lineage 4bi were 96,1% to 100%. Identities between isolates from lineage 4bii were 97,4% to 99,7%. There was at least 94,5% identity at nucleotide level between Slovenian isolates from lineage 4bi and Slovenian isolates from lineage 4bii. Slovenian isolates from lineage 4bi shared 93% to 99% nucleotide sequence identities with other international lineage 4bi viruses. Isolates from lineage 4bii shared the same identities with lineage 4bii viruses.


Most of the observed nucleotide changes were silent mutations as only one amino acid change was observed between Slovenian isolates from lineage 4bii and two amino acid changes were observed between isolates from lineage 4bi (Fig. 1). The sequence of F2/F1 cleavage site of all Slovenian isolates was typical for pathogenic APMV-1 viruses. The motif 112RRQKRF117 was present in the viruses from lineage 4bii, whereas viruses from lineage 4bi displayed the 112GRQKRF117 (Fig. 1). Slovenian isolates from lineage 4bii shared the same amino acid (isolevcin) at the position 50 as other isolates from the same lineage. These isolates shared the same 112RRQKRF117

sequence at the F2/F1 cleavage site, except strain PDEPI94216 which displayed 112RRKKRF117 sequence (Fig. 1). Amino acid changes occurred at position 124 (serin to glicin for strains SLO 872/04 and 218/05), position 125 (valin to

isolevcin for strains SLO 442/00, SLO 758/00, SLO 304/03 and SLO 308/03) and position 54 (glutamin to isolevcin for strain SLO 94/00) (Fig. 1). Five Slovenian isolates of lineage 4bi clustered together with European isolates obtained between 1992 and 2000 and form a group together with isolates from Italy and Hungary isolated between 1989 and 2000 (Fig. 2). Isolate SLO 94/00 shared the highest nucleotide identity (99%) with the Hungarian strain isolated in 1989, whereas the other four Slovenian isolates shared 96% identity with the same Hungarian isolate. These four isolates form a distinct branch on the phylogenetic tree (Fig. 2). Seven Slovenian isolates that belong to the lineage 4bii were grouped together with isolates from France, UK and Italy, obtained between 1999 and 2000 (Fig 2). Nucleotide identities between these strains were 98% to 99%.

Figure 1. Amino acid sequence alignment of partial PPMV-1 fusion protein sequences. The fusion protein cleavage site

sequence from position 110 to 119 is underlined


Figure 2. Phylogenetic tree of a region at the 3’ end of the fusion protein gene of PPMV-1 viruses. Slovenian virus isolates are

framed


Discussion Newcastle disease is a highly lethal disease of poultry caused by APMV-1 (Alexander, 2000). Considerable gene-tic heterogeneity (eight APMV-1 genotypes) was detected within APMV-1, which appears to be influenced by host, time and geographical origin (Lomniczi et al., 1998; Herczeg et al., 1999; Yang et al., 1999; Yu et al., 2001; Czegledi et al., 2002; Mase et al., 2002; Wehmann et al., 2003a, b). APMV-1 isolates were reclassified into six broadly distinct groups (lineages 1 to 6). Lineages 3 and 4 were further subdivided into four sublineages (a to d) and lineage 5 into five lineages (a to e) (Aldous et al., 2003). Twelve Slovenian strains isolated from domestic and free-living pigeons between 2000 and 2008 were classified, together with other PPMV-1 viruses associated with the ongoing panzootic in pigeons, into sublineage 4b of lineage 4. Slovenian isolates do not cluster together, but instead are split between two separated groups 4bi and 4bii of lineage 4b (Fig. 1), that were proposed by Aldous (Aldous et al., 2004). Group 4bi is composed of isolates of Asian and European origins obtained between 1983 and 2002, whereas group 4bii includes isolates from Europe, North America and Asia isolated between 1984 and 2002. Group 4 bii is the predominant strain in the latter period of this ongoing panzootic, with the number of type 4bi isolations diminishing from late 1980s onwards (Aldous et al., 2004). Despite of this, strains from group 4bi are still circulating in the pigeon population. Isolates originating from Italy in 2000 were from group 4bi and 4bii (Terregino et al., 2003) and isolates obtained from South Africa from 2002 to 2006 were also from both groups (Abolnik et al., 2008). Isolates from both groups were circulating in Slovenia between 2000 and 2003, but only isolates from lineage 4bii have been isolated from domestic and free-living pigeons since 2004 (Fig. 2). This is in agreement with previous studies where it has been concluded that at any time there are numerous genetically distinct ND virus pools circulating in a host population (Alexander, 2000). Detection of only PPMV-1 from group 4bii in a small geographic region of Slovenia in the last four years and the fact that in previous years both lineages were circulating in pigeon population is in accord with the report published by Aldous (Aldous et al., 2004), that the group 4bii is the predominant strain in the latter period of this ongoing panzootic. The Slovenian lineage 4bi strains formed a single clade together with viruses isolated in Italy and Hungary from 1989 to 2000 (Fig. 2). This clade was first described by Ujavari (Ujavari et al., 2003). These isolates were clustered into lineage VIb/I, sublineage EU/ea, that includes isolates from the early phase of the epizootic in Europe, together with some from Egypt, Malta and Japan. Signs of diversification of this sublineage became apparent by the end of 1980s with at least two clades evolving, such as the one comprising isolates mainly from Hungary, Italy and Slovenia (Ujavari et al., 2003).

Isolate SLO 94/00 shared the highest nucleotide identity (99%) with the Hungarian strain isolated in 1989, whereas the other four Slovenian isolates shared 96% identity with the same Hungarian isolate. These four isolates form a distinct branch on the phylogenetic tree (Fig. 2). Based on this we can speculate, that two different strains from lineage 4bi were circulating in Slovenia in 2000. Relatively longer branch length suggests that strains SLO 442/00, SLO 758/00, SLO 304/03 and SLO 308/03 may have been circulating in Slovenia for an extended period. This is in agreement with the findings of Ujavari (Ujavari et al., 2003), that in some places (Hungary, Italy, Slovenia and Japan) the spread of more diverged viruses could be detected in the second half of 1980s and that they are still persisting in those regions. Nucleotide sequence identities between Slovenian isolates from group 4bii were from 97,4% to 99,7%. This isolates cluster together with European viruses isolated between 1999 and 2000 (Fig. 2). Slovenian group 4bii viruses were isolated from domestic and free-living pigeons. The finding that recently isolated strains from free-living pigeons (SLO 218/05, SLO 75/06 and SLO 912/08) are highly related to strains obtained from domestic pigeons suggests that the same strains were circulating between two populations. The presence of NDV in the population of free-living pigeons of the city Ljubljana was first detected in 2000 (Krapež et al., 2001; Dovč et al., 2004). High hemagglutination titers were found in 88,4% of examined pigeons, however, all attempts to isolate the virus from cloacal swabs of these pigeons failed (Krapež et al., 2001). Compulsory vaccination against NDV-1 only for birds taking part in races or shows in Slovenia could contribute to spread a virus between two populations. On the basis of predicted amino acid sequences surrounding the fusion protein cleavage site, all Slovenian PPMV-1 isolates have amino acid sequences associated with virulence. Slovenian isolates from lineage 4bi had sequence 112GRQKRF117 (Fig. 1). This sequence was first described as the characteristic for PPMV-1 viruses (Collins et al., 1994), but further investigations showed that this sequence occur-red only in the strains from the earlier period of the panzootic (Meulemans et al., 2002; Ujvari et al., 2003). Results from further studies (Terregino et al., 2003; Aldous et al., 2004) as well as our results demonstrate that strains with cleavage site motif typical for earlier isolates were still circulating in pigeon populations between 2000 and 2003. The other seven Slovenian isolates have sequence 112RRQKRF117 at fusion protein cleavage site (Fig. 1). This sequence found in the majority of the recently isolated PPMV-1 viruses (Meulemans et al., 2002; Aldous et al., 2004) is identical to that associated with highly virulent ND viruses (Collins et al., 1993). However, this prerequisite for high virulence did not always correlate with the pathogenicity of PPMV-1 strains for chickens (Kommers et al., 2001; Kommers et al., 2002), although it has been demonstrated that virulence of the majority of PPMV-1 viruses for chickens is greatly


increased, following three to four passages through this host (Alexander and Parsons, 1986; Collins et al., 1996). We can conclude that isolates from groups 4bi and 4bii were circulating in Slovenia between 2000 and 2008. Isolates from both groups could have been introduced in Slovenia on different occasions. Four isolates form a distinct branch on the phylogenetic tree. Their relatively longer branch length suggests that strains SLO 442/00, SLO 758/00, SLO 304/03 and SLO 308/03 may have been circulating in Slovenia for an extended period. All Slovenian PPMV-1 isolates have amino acid sequences associated with virulence at the fusion protein cleavage site and have to be considered a potential threat for poultry.

References

Abolnik C., G.H. Gerdes, J. Kitching, S. Swanepoel, M. Romito, S.P. Bisschop (2008): Characterization of pigeon paramyxoviruses (Newcastle disease virus) isolated in South Africa from 2001 to 2006. Onderstepoort J. Vet. Res. 75 (2), 147-152.

Alexander D.J., G.W. Wilson, P.H. Russell, S.A. Lister, G. Parsons (1985a): Newcastle disease outbreaks in fowl in Great Britain during 1984. Vet. Rec. 117 (17), 429-434.

Alexander, D.J., P.H. Russell, G. Parsons, E.M. Elzein, A. Ballouh, K. Cernik, B. Engstrom, M. Fevereiro, H.J. Fleury, M. Guittet, E.F. Kaleta, U. Kihm, J. Kosters, B. Lomniczi, J. Meister, G. Meulemans, K. Nerome, M. Petek, S. Pokomunski, B. Polten, M. Prip, R. Richter, E. Saghy, Y. Samberg, L. Spanoghe, B. Tumova (1985b): Antigenic and biological characterisation of avian paramyxovirus type I isolates from pigeons--an international collaborative study. Avian Pathol. 14 (3), 365-376.

Alexander, D.J. and G. Parsons (1986): Pathogenicity for chickens of avian paramyxovirus type 1 isolates obtained from pigeons in Great Britain during 1983-85. Avian. Pathol. 15 (3), 487-493.

Alexander, D.J. (1988): Newcastle disease diagnosis. In Newcastle disease (pp. 147-160). Kluwer. Norwell.

Alexander, D.J. (2000): Newcastle disease and other avian paramyxoviruses. Rev. Sci. Tech. 19 (2), 443-462.

Aldous, E.W., M.S. Collins, A. McGoldrick, D.J. Alexander (2001): Rapid pathotyping of Newcastle disease virus (NDV) using fluorogenic probes in a PCR assay. Vet. Microbiol. 80 (3), 201-212.

Aldous E.W., J.K. Mynn, J. Banks, D.J. Alexander (2003): A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1 (Newcastle disease virus) isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene. Avian Pathol. 32 (3), 239-256.

Aldous, E.W., C.M. Fuller, J.K. Mynn, D.J. Alexander (2004): A molecular epidemiological investigation of isolates of the variant avian paramyxovirus type 1 virus (PPMV-1) responsible for the 1978 to present panzootic in pigeons. Avian Pathol. 33 (2), 258-269.

Biancifiori, F., A. Fioroni (1983): An occurrence of Newcastle disease in pigeons: virological and serological studies on the isolates. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 6 (3), 247-252.

Ballagi-Pordány, A., E. Wehmann, J. Herczeg, S. Belák, B. Lomniczi (1996): Identification and grouping of Newcastle

disease virus strains by restriction site analysis of a region from the F gene. Arch. Virol. 141 (2), 243-261.

Collins, M.S., J.B. Bashiruddin, D.J. Alexander (1993): Deduced amino acid sequences at the fusion protein cleavage site of Newcastle disease viruses showing variation in antigenicity and pathogenicity. Arch. Virol. 128 (3-4), 363-370.

Czeglédi A., J. Herczeg, G. Hadjiev, L. Doumanova, E. Wehmann, B. Lomniczi (1996): The occurrence of five major Newcastle disease virus genotypes (II, IV, V, VI and VIIb) in Bulgaria between 1959 and 1995. Epidemiol. Infect. 129 (3), 679-688.

Dovč A, O. Zorman-Rojs, A. Vergles Rataj, V. Bole-Hribovšek, U. Krapež, M. Dobeic (2004): Health status of free-living pigeons (Columba livia domestica) in the city of Ljubljana. Acta Vet.. Hung. 52 (2), 219-226.

Herczeg J., E. Wehmann, R.R. Bragg, P.M. Travassos Dias, G. Hadjiev, O. Werner, B. Lomniczi (1999): Two novel genetic groups (VIIb and VIII) responsible for recent Newcastle disease outbreaks in Southern Africa, one (VIIb) of which reached Southern Europe. Arch. Virol. 144 (11), 2087-2099.

Kaleta, E.F. (1992): Comparative pathogenicity tests of eight pigeon paramyxovirus 1 variant isolates in pigeons, turkeys and chickens. Dtsch Tierarztl Wochenschr. 99(12), 475-478.

King, D. J. (1996): Avian paramyxovirus type 1 from pigeons: isolate characterization and pathogenicity after chicken or embryo passage of selected isolates. Avian Dis. 40 (3), 707-714.

Kissi, B. (1988): Studies on the virulence of pigeon paramyxovirus-1 (PMV-1). Changes in the virulence of pigeon PMV-1 strains isolated in Hungary upon passage in chickens, embryonated hen's eggs and pigeons. Acta. Vet. Hung. 36 (3-4), 283-292.

Kommers, G. D., D. J. King, B. S. Seal, C. C. Brown (2001): Virulence of pigeon-origin Newcastle disease virus isolates for domestic chickens. Avian. Dis. 45 (4), 906-92.

Kommers G.D., D.J. King, B.S. Seal, K.P. Carmichael, C.C. Brown (2002): Pathogenesis of six pigeon-origin isolates of Newcastle disease virus for domestic chickens. Vet. Pathol. 39 (3), 353-362.

Krapež U., A. Dovč, O. Zorman-Rojs, D. Barlič-Maganja, I. Mrzel (2001): Zaražanje paramiksovirusima u golubova. Zbornik Savjetovanje peradarski dani, Poreč. Hrvatski vete-rinarski inštitut, Centar za peradarstvo, Zagreb, pp. 103-104.

Kumar S., K. Tamura, M. Nei (2004): MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Brief Bioinform. 5 (2), 150-163.

Lamb, R. A., P. L. Collins, D. Kolakofsky, J. A. Melero, Y. Nagai, M. B. A. Oldstone, C. R. Pringle, B. K. Rima (2000): Paramyxoviridae. In: Virus taxonomy. Seventh report of the international committee of taxonomy on viruses. Academic press, pp. 549-561.

Li Y. P., Zhang M. F. (2004): Rapid pathotyping of Newcastle disease virus from allantoic fluid and organs of experimentally infected chickens using two novel probes. Arch. Virol. 149, 1231-1243.

Lister, S. A., D. J. Alexander, R. A. Hogg (1986): Evidence for the presence of avian paramyxovirus type 1 in feral pigeons in England and Wales. Vet. Rec. Apr 118 (17), 476-479.

Lomniczi B., E. Wehmann, J. Herczeg, A. Ballagi-Pordány, E. F. Kaleta, O. Werner, G. Meulemans, P. H. Jorgensen, A. P. Manté, A. L. Gielkens, I. Capua, J. Damoser (1998): Newcastle disease outbreaks in recent years in western


Europe were caused by an old (VI) and a novel genotype (VII). Arch. Virol. 143 (1), 49-64.

Mase M., K. Imai, Y. Sanada, N. Sanada, N. Yuasa, T. Imada, K. Tsukamoto, S. Yamaguchi (2002): Phylogenetic analysis of Newcastle disease virus genotypes isolated in Japan. J. Clin. Microbiol. 40 (10), 3826-3830.

Mayo, M. A. (2002): Virus taxonomy - Houston 2002. Arch. Virol. 147 (5), 1071-1076.

Meulemans, G., T. P. van den Berg, M. Decaesstecker, M. Boschmans (2002): Evolution of pigeon Newcastle disease virus strains. Avian. Pathol. 31 (5), 515-519.

Monne, I., M. S. Beato, I. Capua, M. L. Mandola (2006): Pigeon paramyxovirus isolated from a robin in Italy. Vet. Rec. 158 (11), 384.

Peeters B., O. S. de Leeuw, G. Koch, A. L. Gielkens (1999): Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73 (6), 5001-5009

Seal B. S., D. J. King, J. D. Bennett (1995): Characterization of Newcastle disease virus isolates by reverse transcription PCR coupled to direct nucleotide sequencing and development of sequence database for pathotype prediction and molecular epidemiological analysis. J. Clin. Microbiol. 33 (10), 2624-2630.

Terregino C., G. Cattoli, B. Grossele, E. Bertoli, E. Tisato, I. Capua (2003): Characterization of Newcastle disease virus isolates obtained from Eurasian collared doves (Streptopelia decaocto) in Italy. Avian Pathol. 32 (1), 63-68.

Thompson J. D., D. G. Higgins, T. . Gibson (1994): CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22 (22), 4673-4680.

Ujavari, D., E. Wehmann, E.F. Kaleta, O. Werner, V. Savić, E. Nagy, G. Czifra, B. Lomniczi (2003): Phylogenetic analysis reveals extensive evolution of avian paramyxovirus type 1 strains of pigeons (Columba livia) and suggests multiple species transmission. Virus Res. 96 (1-2), 63-73.

Werner, O., A. Römer-Oberdörfer, B. Köllner, R. J. Manvell, D.J. Alexander (1999): Characterization of avian paramyxovirus type 1 strains isolated in Germany during 1992 to 1996. Avian. Pathol. 28 (1), 79-88.

Wehmann, E., A. Czeglédi, O. Werner, E. F. Kaleta, B. Lomniczi (2003a): Occurrence of genotypes IV, V, VI and VIIa in Newcastle disease outbreaks in Germany between 1939 and 1995. Avian Pathol. 32 (2), 157-163.

Wehmann E., D. Ujvári, H. Mazija, M. Velhner, I. Ciglar-Grozdanić, V. Savić, G. Jermolenko, Z. Cac, E. Prukner-Radovcić, B. Lomniczi (2003b): Genetic analysis of Newcastle disease virus strains isolated in Bosnia-Herzegovina, Croatia, Slovenia and Yugoslavia, reveals the presence of only a single genotype, V, between 1979 and 2002. Vet. Microbiol. 94 (4), 269-281.

Wilson, G. W. (1986): Newcastle disease and paramyxovirus 1 of pigeons in the European community. World’s Poult. Sci. 42, 143-153.

Yang C. Y., H. K. Shieh, Y. L. Lin, P. C. Chang (1999): Newcastle disease virus isolated from recent outbreaks in Taiwan phylogenetically related to viruses (genotype VII) from recent outbreaks in western Europe. Avian Dis. 43 (1), 125-130.

Yu L., Z. Wang, Y. Jiang, L. Chang, J. Kwang (2001): Characterization of newly emerging Newcastle disease virus isolates from the People's Republic of China and Taiwan. J. Clin. Microbiol. 39 (10), 3512-3519.

MOLEKULARNA EPIDEMIOLOGIJA PTIČJEG PARAMIKSOVIRUSA TIPA 1 (NEWCASTLESKA BOLEST) VIRUSA IZOLIRANIH IZ GOLUBOVA U SLOVENIJI

Sažetak

Genetski je analizirano dvanaest izolata ptičjeg paramiksovirusa tipa 1 (Newcastleska bolest) izoliranih iz golubova u Sloveniji od 2000. do 2008. godine. Dio fuzijskog proteinskog gena, koji je uključen regiju koja kodira mjesto rascijepa fuzijskog proteina amplificirano je i poredano. Filogenetska analiza dobivena iz poredaka fuzijskih gena pokazala je da slovenski sojevi pripadaju dvjema grupama, 4bi i 4bii, od podlinije 4b i linije 4. Sekvenca rascijepa F2/F1 svih slovenskih izolata bila je tipična za patogene APMV-1 viruse. Motiv 112RRQKRF117 bio je prisutan u virusima iz linije 4bii, pri čemu su virusi iz linije 4bi prikazali 112GRQKRF117. Ključne rijeci: ptičji paramiksovirus tipa 1, NDV, F genske sekvence, filogenetska analiza, golub


MULTIPLICATION OF HVT FC-126 (HERPESVIRUS TURKEY) MAREK'S DISEASE VIRUS IN CELLS OF NONAVIAN ORIGIN

Bratko Filipič1*, Željko Gottstein2, Srećko Sladoljev3, Avrelija Cencič4,5, Srečko Koren1, Hrvoje Mazija2**

1 Institute of Microbiology and Immunology, Medical Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenija 2 Department of Avian Diseases, Veterinary Faculty, University of Zagreb, Zagreb, Croatia 3 Institute of Immunology, Zagreb, Croatia 4 Faculty of Agriculture, University of Maribor, Maribor, Slovenija 5 Faculty of Medicine, University of Maribor, Maribor, Slovenija

Summary

Marek’s disease virus (MDV) is an oncogenic, lymphotropic herpesvirus, productively and cytolitically infecting B-, T- and gamma delta T-lymphocytes and latently T-helper lymphocytes. It also infects macrophages. MDV causes important economic crashes in poultry due to its severity. Among MDV the vaccine strain HVT FC-126 was isolated and used in prevention. Multiplication of this virus takes place not only in chicken or quail fibroblasts, but also in intestinal epithelium cells, like: CIEB (calf intestinal epithelial cells), Human amniotic cells (WISH) and Human macrophage cell line. HVT FC-126 can be adapted to them because of their cultivation in the presence of SR-2.0552P (serum replacement based on the porcine ocular fluid) instead of the FCS (fetal calf serum). The presented experiments were aimed to cultivate and use for the multiplication of HVT FC-126 in the PLA (Adult pig kidney) and GL-4 (Gerbille kidney) cell lines. Two different HVT FC-126 vaccine strains were used: MARIKAL SPF (Veterina d.o.o., Croatia) and Lyomarex (Merial, USA). They were adapted to the PLA and GL-4 cell lines. After the adaptation they were titrated on PLA (TCID50 24.233) and GL-4 (TCID50 24.963). On both cell lines they show similar CPE (cytophatic effect). The difference between them was detected using real-time PCR, which was also positive by agarose gel analysis for the virus in Lyomarex, but not in the MARIKAL SPF. It can be concluded that both cell lines are sensitive for HVT FC-126 and the virus can be multiplied in quite high titers, although much lower than in CIEB cells (TCID50 27.928). Key words: Marek’s disease virus, HVT FC-126, adult pig kidney cell line, Gerbille kidney cell line Introduction

Marek's disease (MD), a lymphoproliferative disease of chickens, is of great concern for the poultry industry. In the absence of control measures, MD is capable of causing devastating losses in commercial poultry flocks. MD is caused by an alpha-herpesvirus (Marek's disease virus or MDV), first isolated in 1968 (Churchill, 1968). The unique features of the MDV differentiates it from other alpha-herpesviruses. It is strictly cell associated, establishes latency in lymphocytes, includes an oncogene (meq) in its genome, and it is able to induce lymphomas (Buckmaster et

al., 1988). However, its molecular structure and genomic organization are very similar to the herpes simplex virus (HSV), hence its classification within the alpha-herpesviridae family. MDV includes three serotypes that have major differences not only in the genome but also in the biological features. Serotype 1 MDV includes all the oncogenic strains and their attenuated forms; serotype 2 are non-oncogenic viruses isolated in chickens, and serotype 3 are non-oncogenic viruses isolated in turkeys, generally known as herpesvirus of turkeys (HVT). Because of their close relationship, the three serotypes have been placed in the taxonomic genus Mardivirus. It has been proposed that

* Bratko Filipič, Assist. professor, Institute of Microbiology and Immunology, Medical Faculty, University of Ljubljana, Zaloška 4, 1105 Ljubljana, Slovenija. Tel.: 003861 5437463, Fax: 003861 5437401, e-mail: [email protected] ** Hrvoje Mazija, Professor, Department of Avian Diseases, Veterinary Faculty, University of Zagreb, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Croatia, Tel.: 003851 2390 281, Fax: 003851 2390 280, e-mail: [email protected]

MULTIPLICATION OF HVT FC-126 (HERPESVIRUS TURKEY) MAREK'S DISEASE VIRUS IN CELLS OF NONAVIAN ORIGIN 65

the three different MDV serotypes represent three distinct, individual species that have undergone parallel evolution and that only serotype 1 should retain the name MDV (Witter and Schatt, 2003). Among the MDV vaccine strains, HVT FC 126 was isolated and used in prevention. Multiplication of this virus takes place not only in chicken or quail fibroblasts, but also in intestinal epithelial cells, like CIEB (calf intestinal epithelial cells), WISH (Human Amniotic cells) and human macrophage cell line. HVT FC 126 can be adapted to them because of its cultivation in the presence of SR-2.0552P (serum replacement based on the porcine ocular fluid) instead of the FCS (fetal calf serum) (Filipič et al., 2002; Filipič et al., 2007). It was also found that the MDV virus, as well as the HVT virus can be adapted to the VERO (vervet monkey kidney) cells (Jaikumar et al., 2001). The presented experiments were aimed to introduce PLA and GL-4 cell lines for the multiplication of the HVT FC 126 virus.

Material and methods

Cells PLA and GL-4 cells were cultivated in the Eagle’s medium supplemented with 8% of SR-2.0552 P (serum replacement based on the porcine ocular fluid).

Viruses Two HVT FC-126 vaccine strains where used e.g. MARIKAL SPF (Veterina d.o.o. Croatia) and Lyomarex (Merial, USA).

Adaptation of HVT FC 126 on the PLA and GL-4 cells Both HVT FC 126 viruses were adapted for the growth (multiplication) in the PLA and GL-4 cells as it was described (Filipič et al., 2007).

Determination of the TCID50 The TCID50 (tissue culture infective dose) of both HVT FC-126 on the PLA and GL-4 was determined according to Reed and Muench (1938). Cells were cultivated in the 96-well micortiter plates in the Eagle's medium supplemented with 8% SR-2.0552P at 37oC for 18 hours. On the next day, the medium was replaced with the medium containing 2% SR-2.0552P and 100μl of virus suspension, that was serially diluted from 1:2 to 1:1024, and further incubated for 72

hours. Afterwards, microscopically ratio of infected/non-infected cells was determined.

DNA isolation DNA samples were isolated from the cell control and/or inoculated cell cultures using the commercial kit Dneasy® Tissue Kit (Qiagen, USA). Isolated DNA samples were stored at -20°C until analysis.

Real-time PCR Real-time PCR analyses were performed using primers previously described by Islam et al. (2004) specifically designed for SORF1 region of HVT FC 126. Specific products were detected using SYBR green Brilliant® SYBR® Green QPCR Master Mix (Stratagene, USA) kit on Mx3005P (Stratagene, USA) and results (amplification and dissociation curve) were analyzed with MxPro (Stratagene, USA) software (Gottstein et al., 2007). After amplification, 15µl of PCR product was analyzed by electrophoresis on 1.5% agarose gel to confirm the real-time PCR results.

Results and conclusions

During the experiments, two different HVT FC 126 vaccine viruses (MARIKAL SPF and Lyomarex) were used. They were successfully adapted to the PLA and GL-4 cells. Similarly as in case of CIEB cells, two to three adaptation cycles were needed to get the full CPE. After the adaptation, the TCID50 was determined. Both of them showed similar value for TCID50 (Table 1), even much lower than obtained on CIEB cells (TCID50 27.928). On both kidney cell lines (PLA and GL-4) they show the CPE, which is: big plaques at PLA and small plaques on GL-4. There was no visible difference in the form of plaques after five days of incubation (Figure 1. and 2.). The main difference between viruses contained in MARIKAL SPF and Lyomarex vaccines could be seen after the real-time PCR analysis: amplification and dissociation curve (Figure 3. and 4.). It was found that HVT FC-126 contained in Lyomarex vaccine can be detected in the culture (PLA), but not the one in MARIKAL SPF. Regardless of the fact that both of them were HVT FC 126, by the use of the same primers it turned out that they could be HVT FC-126 of different genome patterns. It is probable that the specific region, SORF1, used for primer design could be different in few base pairs which are important for primer annealing among these vaccine strains, what could cause no amplification of MARIKAL SPF vaccine strain.

Table 1. TCID50 of HVT FC-126 on the cells of nonavian origin Tablica 1. Umnažanje HVT FC-126 na stanicama neavijarnog podrijetlaTCID50

CELLS OF NONAVIAN ORIGINE HVT FC-126 VACCINE

PLA (Adult pig kidney cell line) GL-4 (Gerbille kidney cell line) CIEB (Calf intestinal epithelial cell line) MARIKAL SPF 24.233 24.963 27.928 Lyomarex 24.300 24.720 Not tested


Figure 1. PLA cells – noninfected control (20X magnification). Cells were fixed with the of 3% solution of glutaraldehyde containing 1% of glucose and stained with the 0.1% of Crystal violet in 20% of ethanol

Slika 1. PLA stanice – nezaražena kontrola (20X uvećanje). Stanice su fiksirane u 3% otopini glutaraldehida koja je sadržavala 1% glukoze, a poslije obojene s 0,1% kristal violetom u 20% etanolu

Figure 2. HVT FC-126 infected PLA cells. Visible CPE (20X magnification). Cell fixation and staining method is the same as in Figure 1 Slika 2. PLA stanice zaražene s HVT FC-126. Vidljiv CPE (20X uvećanje). Fiksacija i bojenje stanica isto kao što je opisano na Slici 1


Figure 3. Amplification curves of SORF1 region of vaccine strain HVT FC-126 (Lyomarex , Merial, USA and Marikal SPF, Veterina d.o.o., Croatia) after 5 days of incubation

Slika 3. Amplifikacijska krivulja dobivena umnažanjem SORF1 regije cjepnog soja FC-126 herpesvirusa purana (Lyomarex, Merial, USA i Marikal SPF, Veterina d.o.o, Hrvatska) nakon 5 dana inkubacije na stanicama

Figure 4. Dissociation curve of specific product after amplification of SORF1 region of vaccine strain HVT FC-126 (Lyomarex,

Merial, USA and Marikal SPF , Veterina d.o.o., Croatia) after 5 days of incubation Slika 4. Krivulja taljenja specifičnog produkta nakon umnažanja SORF1 regije cjepnog soja FC-126 herpesvirusa purana

(Lyomarex, Merial, USA i Marikal SPF, Veterina d.o.o, Hrvatska) nakon 5 dana inkubacije na stanicama


Further experiments by additional multiplication of HVT FC-126 on PLA and GL-4 cell lines and comparison to the virus growth on the VERO cells will show if they can be used as suitable for the vaccine production. In this respect efficacy and safety analyses should be performed (Gereligs et al., 2008).

References

Churchill, A. E. (1968): Herpes-type virus isolated in cell culture from tumors of chickens with Marek's disease. I. Studies in cell culture. J. Natl. Cancer Inst. 41, 939–950.

Buckmaster, A. E., S. D. Scott, M. J. Sanderson, M. E. G. Boursnell, L. J .N. Ross, M. M. Binns (1988): Gene sequence and mapping data from Marek's disease virus and herpesvirus of turkeys: implications for herpesvirus classification. J. Gen. Virol. 69, 2033–2042.

Filipič, B., L.. Gradišnik, T. Botić, I. Ciglar Grozdanić, Ž. Gottstein, S. Sladoljev, A. Cencič, S. Koren, H. Mazija (2007): Uzgoj cjepnog virusa Marekove bolesti HVT FC 126 na staničnoj kulturi neavijarnog podrijetla. Zbornik radova Peradarski dani 2007 (Ed. M. Balenović), pp. 84-91.

Filipič B., S. Sladoljev, M. Shehata, S. Toth, J. Schwarzmeier, S. Koren (2002): Novel serum replacement based on bovine

ocular fluid: A useful tool for cultivation of different animal cells in vitro. ALTEX. 19 (1), 15-20.

Geerligs, H., S. Quanz, B. Suurland, I. E. M. Spijkers, J. Rodenberg, F. G. Davelaar, B. Jongsma M. Kumar (2008): Efficacy and safety of cell associated vaccines against Marek's disease virus grown in a continuous cell line from chickens. Vaccine 26, 5595-5600.

Gottstein, Ž., I. Ciglar Grozdanić, Ž. Cvetić, H. Mazija, (2007): Detection of HVT FC 126 in lung tissue of chickens vaccinated by means of nebulization against Marek’ s disease. 15th World Veterinary Poultry Congress Abstract Book, Bejing, China, 442.

Islam, A., B. Harrision, B. F. Cheetham, T. J. Mahony, P. L. Young, S. W. Walkden-Brown (2004): Differential amplification and quantitation of Marek’s Disease viruses using real-time polymerase chain reaction. J. of Virol.Meth. 119, 103-113.

Jaikumar, D., K. M. Read, G. A. Tannock (2001): Adaptation of Marek's disease virus to the Vero continuous cell line. Vet. Microbiol. 79, 75-82

Reed, L. J., H. Muench (1938): A simple method of estimating 50% endpoints. Am. J. Hyg. 27, 393-399.

Witter, R, A. Schatt (2003): Marek’s disease. In: Diseases of poultry, 11th Edition (Ed. Y. M. Saif). Iowa State University Press, Ames, IO, pp. 407-465.

UMNAŽANJE HVT FC-126 (HERPESVIRUS PURANA) U STANICAMA NEAVIJARNOG PODRIJETLA

Sažetak

Virus Marekove bolesti (VMB) je onkogeni, limfotropni herpesvirus, koji zaražava B, T i gamadelta te latentno T-pomoćničke limfocite. Virus Marekove bolesti uzrokuje značajne ekonomske gubitke u peradi zbog svoje patogenosti. Jedan od cjepnih sojeva VMB soj HVT FC 126 korišten je u suzbijanju bolesti. Umnažanje VMB moguće je ne samo na fibroblastima pilića ili prepelice, nego također i epitelnim stanicama poput epitelnih stanica tankog crijeva teleta (calf intestinal epithelial cells, CIEB ), humanih amnionskih stanica (WISH), te staničnih linija humanih makrofaga. Soj HVT FC-126 moguće je prilagoditi za umnažanje na spomenutim stanicama zbog dodanog nadomjestka seruma temeljenog na očnoj tekućini svinja (serum replacement based on the porcine ocular fluid, SR-2.055) umjesto fetalnog telećeg seruma. Opisanim pokusom dokazana je mogućnost umnažanja i uzgoja HVT FC-126 na stanicama bubrega odrasle svinje (adult pig kidney, PLA) i staničnim linijskim kulturama bubrega gerbila (Gerbille kidney, GL-4). Korištena su dva različita cjepna soja virusa HVT FC-126 sadržana u cjepivima MARIKAL SPF (Veterina d.o.o., Zagreb) i Lyomarex (Merial, SAD). Ovi su virusi prilagođeni na PLA i GL-4 linije stanica. Nakon prilagodbe, ovi su virusi titrirani su na PLA (TCID50 24,233) i GL-4 (TCID50 24,963). Na obje vrste stanica tvorili su slični citopatski učinak. Razlika među njima dokazana je primjenom probe Real Time PCR, koja je također bila pozitivna analizom u agaroznom gelu za virus u cjepivu Lyomarex, ali ne i u MARIKAL SPF. Moguće je zaključiti da su obje stanične kulture osjetljive na HVT FC-126 i da se u njima virus umnaža u prilično visokom titru no ipak u nižem negoli na CIEB stanicama (TCID50 27,928). Ključne riječi: Virus Marekove bolesti, HVT FC-126, stanična kultura bubrega odrasle svinje, stanična linija bubrega

gerbila


DEMONSTRATION OF WEST NILE VIRUS ANTIBODIES IN WILD BIRDS IN SLOVENIA

Jožko Račnik1, Olga Zorman-Rojs1, Tomi Trilar2, Mateja Jelovšek3, Darja Duh3, Alenka Dovč1, Tatjana Avšič Županc3

1Institute for Poultry Health, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Slovenia 2Slovenian Museum of Natural History, Ljubljana, Slovenia 3Institute of Microbiology and Immunology, Medical Faculty, University of Ljubljana, Slovenia

Summary

Blood samples were taken from wild living birds during a four years period (2001, 2004, 2005, and 2006). Although most of the sampled birds were song birds, other species were included in the study, too (great crested grebes, little grebes, domestic pigeons, wrynecks and kingfishers). The indirect immunofluorescence test (IFF) was used for the detection of WNV specific antibodies in the bird serum. Altogether, 519 sera of 32 different species of songbirds were examined. Among wild living birds in Slovenia a 6,4% overall prevalence of antibodies against WNV was demonstrated, whereas 4,6% song birds had specific antibodies against WNV. Passerine birds with positive sera were: the blackcap, the house sparrow, the European goldfinch, the lesser whitethroat, the common whitethroat, the garden warbler and the robin. In other bird species, specific antibodies against WNV were found in 12,4% domestic pigeons. However, the rest of the birds tested negatively. Key words: West Nile Virus, wild birds, surveillance, serology, indirect immunofluorescence test (IIF) Introduction

Wild birds can transmit many pathogenic agents and the West Nile Virus (WNV) is one of the most important among them (Hubalek, 2004). The WNV transmission is related to the mosquito carrier, wild birds, especially songbirds, however, are an important natural host for WNV (Hubalek, 2000). Infection with WNV is a threat to the public and equine health. In Europe that disease had been reported in human and horses in numerous countries (Romania, Italy, France) (Jourdain, 2005). In our research we investigated the presence of specific antibodies against the West Nile Virus (WNV) in wild bird’s sera in Slovenia.


Blood samples were taken from 737 wild living birds in years 2001, 2004, 2005 and 2006. Most of them were songbirds, but other species were included, too (23 great crested grebes, 4 little grebes, 186 domestic pigeons, 4 wrynecks and 1 kingfisher). More than 500 wild living birds were captured into mist nets during their autumn stopover in Slovenia. A total of 187 birds was caught at the

ornithological station Vrhnika (x = 91582; y = 445909) in autumn 2004 (13th to 18th of September) and 337 birds were caught at the ornithological station Cerkniško jezero (x = 70012; y = 454067) in autumn 2005 and 2006 (23rd to 26th of September), respectively. The birds were clinically examined and ringed. 23 great crested grebes and four little grebes were caught at the Cerkniško jezero in summer 2006. Domestic pigeons were caught on different locations in the city of Ljubljana, capital of Slovenia, in years 2001 and 2006. After blood collection the birds were re-released again. The blood was stored in tubes, centrifuged and sera were stored at -20 ºC prior the testing. The bird sera were serologically investigated on presence of specific antibodies against West Nile Virus. For the detection of specific IgG antibodies against WN, indirect imunoflorescence test (IIF) was used. The commercial goat anti-wild bird fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated antibodies (Benthyl Laboratories, Inc., Montgomery) were used in the test.

Results and discussion

Wild living birds were investigated for the presence of specific antibodies against WNV. Serological testing was

Jožko Račnik, DVM, PhD; Institute of Poultry Health, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Cesta v Mestni Log 47, Sl - 1115 Ljubljana, Slovenia; tel: +38614779247; fax: +38614779339; E-mail: [email protected]

DEMONSTRATION OF WEST NILE VIRUS ANTIBODIES IN WILD BIRDS IN SLOVENIA 70

performed. A total of 737 birds were examined, among which songbirds (Passeriformes) prevailed (519 birds). 218 sera from birds from the orders of grebes (Podicipedi-formes), pigeons (Columbiformes), woodpeckers and rela-tives (Piciformes), and kingfishers and relatives (Coracii-formes) were also tested. The positive birds were found among passerines and domestic pigeons. The prevalence of antibodies against WNV among wild birds was of 6,4%. The seropositive birds were songbirds (4,6%) and domestic pigeons (12,4%). Among the positive birds were: the blackcap, the house sparrow, the European goldfinch, the lesser whitethroat, the common whitethroat, the garden warbler and the robin. The rest of the birds were negative. These results are presented in table 1. The results of our study prove that WNV is circulating in wild birds captured

throughout Slovenia. Considering these presented results and worldwide reports of increased WNV activity, further systematic research is needed to illuminate the epidemiology and ecology of WNV in Slovenia.

Acknowledgement

We would like to thank Marko Zadravec and Cvetka Marhold from the Institute for Poultry Health, Veterinary faculty in Ljubljana as well as Miša Korva from the Institute of Microbiology and Immunology, Medical faculty, Uni-versity of Ljubljana. Further we would like to thank the Notranjski Regijski Park and especially Leon Kebe for his support during the fieldwork.

Table 1. Wild birds sampled and tested in years 2001, 2004, 2005 and 2006

Positive / Total wild birds sampled and tested Wild birds sampled

2001 2004 2005 2006 Wild passerine birds Barred Warbler (Sylvia nisoria) - - 0/1 - Black Redstart (Phoenicurus ochruros) - - - 0/1 Blackbird (Turdus merula) - 0/2 0/3 0/2 Blackcap (Sylvia atricapilla) - 1/75 0/74 3/60 Bluethroat (Luscinia svecica) - 0/1 - 0/1 Chaffinch (Fringilla coelebs) - - - 0/1 Coal Tit (Parus ater) - - 0/2 - Common Redstart (Phoenicurus phoenicurus) - 0/1 0/1 0/1 Common Whitethroat (Sylvia communis) - 0/3 2/4 - European Goldfinch (Carduelis carduelis) - - 2/13 2/12 Garden Warbler (Sylvia borin) - 1/27 1/18 6/25 Grasshopper Warbler (Locustella naevia) - 0/2 0/1 - Great Tit (Parus major) - 0/1 0/3 - Greenfinch (Carduelis chloris) - - 0/9 - House Sparrow (Passer domesticus) - 0/1 1/1 - Icterine Warbler (Hippolais icterina) - - - 0/1 Lesser Whitethroat (Sylvia curruca) - 1/4 2/2 1/3 Marsh Warbler (Acrocephalus palustris) - 0/1 - - Meadow Pipit (Anthus pratensis) - - 0/1 - Pied Flycatcher (Ficedula hypoleuca) - 0/2 - - Red-backed Shrike (Lanius collurio) - 0/1 - 0/2 Reed Bunting (Embrezia schoeniclus) - - 0/5 0/16 Reed Warbler (Acrocephalus scirpaceus) - 0/11 0/7 0/2 Robin (Erithacus rubecula) - 0/25 0/9 1/36 Rufous Nightingale (Luscinia megarhynchos) - - 0/1 - Sedge Warbler (Acrocephalus schoenobaenus) - 0/10 0/1 0/3 Siskin (Carduelis spinus) - 0/14 - -

DEMONSTRATION OF WEST NILE VIRUS ANTIBODIES IN WILD BIRDS IN SLOVENIA 71

Positive / Total wild birds sampled and tested Wild birds sampled

2001 2004 2005 2006 Song Thrush (Turdus philomelos) - - 0/1 0/4 Tree Pipit (Anthus trivialis) - - 0/1 0/1 Whinchat (Saxicola rubetra) - - 0/1 - Willow Warbler (Phylloscopus trochilus) - 0/1 - - Yellowhammer (Embrezia citrinella) - - 0/7 - Other wild birds Great Crested Grebe (Podiceps cristatus) - - - 0/23 Little Grebe (Tachybaptus ruficollis) - - - 0/4 Domestic Pigeon (Columba livia) 12/100 - - 11/86 Wryneck (Jynx torquilla) - 0/4 - - Kingfisher (Alcedo atthis) - 0/1 - - TOTAL 37 species 12/100 3/187 8/166 24/284 Scientific and English bird names are used according to JANČAR et al. (1999). Literature

Hubalek Z. (2000). European experience with the West Nile virus ecology and epidemiology: could it be relevant for the New world? Viral Immunol 13: 415-26.

Hubalek, Z. (2004). An annotated checklist of pathogenic mi-croorganisms associated with migratory birds. J Wild Dis. 40: 639 - 659.

Jourdain E., Gauthier, Clerc, M., Bicout D. J., Zeller, H., Murri, S., Kayser, Y., Sabatier, P. (2005). A study on free ranging

wild birds to better understand their role in the circulation of West Nile virus in Camarique, Southern France. In: Procee-dings of 8th European AAV conference and 6th ECAMS scientific meeting, Arles. France: European Association of avian veterinarians and European college of avian medicine and surgery, 60-5.

Jančar, T., Bračko, F., Grošelj, P., Mihelič, T., Tome, D., Trilar, T., Vrezec, A. (1999). Slovene Nomenclature of Birds of the Western Palearctic. Acrocephalus. 20 (94-96): 97 - 162.

PRIKAZ PROTUTIJELA WEST NILE VIRUSA U DIVLJIH PTICA U SLOVENIJI

Sažetak

Uzorci krvi uzeti su od divljih ptica tijekom četiri godine (2001., 2004., 2005., i 2006.). Većina uzorkovanih ptica bile su ptice pjevice, ali i ostale ptice su također bile uključene u istraživanje (ćubasti gnjurci, mali gnjurci, domaći golubovi, vijoglavi i vodomari). Korišten je test indirektne imunoflorescencije (IF) na prisutnost specifičnih protutijela u serumima za virus zapadnog Nila (engl. West Nile virus, WNV). Ukupno je ispitano 519 seruma od 32 različitih vrsta ptica pjevica. Prisutnost protutujela za WNV iznosio je ukupno 6,4% u ptica u Sloveniji. Ukupno 4,6% ptica pjevica imalo je specifična protutijela za WNV. Vrapčarke s pozitivnim serumom bile su: crnoglava grmuša, vrabac, češljugari, grmuša čevrljinka, grmuša pjenica, siva grmuša i crvendać. U ostalih ptičjih vrsta, specifična protutijela za WNV pronađena su u 12,4% golubova. Ostatak pretraženih ptica bio je negativan. Ključne riječi: Virus Zapadnog Nila, divlje ptice, nadzor, serologija, test indirektne imunoflorescencije (IF)


NEURAMINIDASE OF MYCOPLASMA SYNOVIAE DESIALYLATES GLYCOPROTEINS OF CHICKENS, BUT THEY CAN RAISE ANTIBODIES WHICH INHIBIT ITS NEURAMINIDASE ENZYMATIC ACTIVITY

Rebeka Lucijana Berčič1, Ivanka Cizelj1, Daliborka Dušanić1, Mojca Narat1, Olga Zorman-Rojs2, Peter Dovc1, Dušan Benčina1

1 Department of Animal Science, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Domžale, Slovenia 2 Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia

Summary

Mycoplasma synoviae (M. synoviae) is a major poultry pathogen causing disease in poultry flocks all over the world. M. synoviae synthesises sialidase (neuraminidase) NanH. Its invasive and pathogenic strains have stronger neuraminidase enzymatic activity (NEAC) than nonpathogenic strains. We sequenced the nanH gene of 20 M. synoviae strains, including those without NEAC. In the strains lacking NEAC, a deletion causing frameshift and premature termination of translation was found in the nanH gene. In ULB 9122 cultures that lost NEAC, a deletion in a polyA region (6A→5A) causing frameshift generated shorter NanH protein. Although functionally balanced activity of the haemagglutinin VlhA and neuraminidase might be important for the M. synoviae populations in vivo, coordinated expression of haemagglutination (HA) and NEAC was not observed in vitro. We developed NEAC–inhibition (NI) assays to examine sera of chickens infected with M. synoviae for antibodies which inhibit enzymatic activity of its neuraminidase. All sera contained antibodies to the N-terminal part of the VlhA haemagglutinin (termed MSPB), whereas only 25% of the examined sera were positive in the NI assay. More positive sera were found in NI assays in which the infection causing M. synoviae strain was used. Some of the M. synoviae strains cleaved sialic acid from glycoproteins of chicken sera, tracheal mucus, immunoglobulin G (IgG), transferrin and some other serum glycoproteins with (Sia α 2-6) gal linkage. Notably, desialylation of Sia (α 2-3) gal was observed in three glycoproteins from the tracheas suggesting the mechanism enabling M. synoviae colonisation and long persistence in the tracheas. This study provides several new informations contributing to a better understanding of the interactions between M. synoviae and its host.

Key words: Mycoplasma synoviae, neuraminidase activity, mutations, desialylation, antibody response Introduction

Mycoplasma synoviae infects a number of avian species and causes disease and significant economic losses in chickens and turkeys. In subclinical infections, M. synoviae colonises the upper respiratory tract causing infections that can be lifelong. More invasive M. synoviae strains can cause systemic infections and lesions in numerous organs, including the joints (Kleven, 2003; Hinz et al., 2003; Senties-Cue et al., 2005). Recent studies suggested that M. synoviae strains with higher invasiveness and potential to cause clinical disease proved to have more neuraminidase activity in vitro (May et al., 2007; Berčič et al., 2008b). We recently reported that

some M. synoviae cultures lacked detectable neuraminidase enzymatic activity (NEAC), although the reason for the absence of NEAC was not investigated (Berčič et al., 2008b). All examined M. synoviae strains synthesised VlhA, whereas the synthesis of the neuraminidase NanH is less documented and there is no data concerning the synthesis of GapA (Noormohammadi et al., 1997, 1998; Benčina et al., 2001; Berčič et al., 2008a). M. synoviae binds to erythrocytes and other chicken cells via receptors containing sialic acid (Aldridge, 1972; Razin, 1985). Previous treatment of chicken cells with neura-minidase destroys the receptors for the binding of M. synoviae. However, M. synoviae cells which are already

Dušan Benčina, PhD, Department of Animal Science, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Groblje 3, 1230 Domžale, Slovenia; Tel: +38617217809; Fax : +38617241005; E-mail: [email protected]

NEURAMINIDASE OF MYCOPLASMA SYNOVIAE DESIALYLATES GLYCOPROTEINS OF CHICKENS, BUT THEY CAN RAISE ANTIBODIES WHICH INHIBIT ITS NEURAMINIDASE ENZYMATIC ACTIVITY 73

attached to chicken embryonic cells can not be released with the neuraminidase treatment (Aldridge, 1972). Theoretically, due to presumably antagonistic effects of the M. synoviae VlhA and neuraminidase, their activities are expected to be coordinated or balanced. Nevertheless, there were no data about the expression of the haemagglutination (HA) phenotype in relation to NEAC. During the evolution, Mycoplasma species have become highly adapted to their hosts, most frequently to the mucosa of the respiratory and urogenital tract and joints (Razin et al., 1998). Such sites contain glycoproteins rich in sialic acid, for instance respiratory mucus, oviduct, serum and egg white, which can inhibit M. synoviae binding to host cells. Among major M. synoviae immunogenic proteins, the VlhA haemagglutinin is the most immunogenic for chickens (Noormohammadi et al. 1997; 1998; Berčič et al., 2008a). On the other hand, it was not clear whether chickens infected with M. synoviae can raise antibodies to its neuraminidase NanH.

In this study we investigated whether mutations can abolish neuraminidase activity of M. synoviae. We also investigated the relationships between NEAC and HA, NEAC and synthesis of GapA as an adherent population. In addition, we investigated whether M. synoviae is capable to cleave sialic acid residues from chicken glycoproteins and whether chickens can raise antibodies to its neuraminidase.


Mycoplasma species, their strains and growth media Reference strains of M. synoviae also used in previous studies are shown in Table 1. Most of them have already been examined for NEAC in our previous investigation (Berčič et al., 2008b). Other Mycoplasma species with determined NEAC were M. gallisepticum RLOW, M. anseris 1219 and M. corogypsi BV1 (Berčič et al., 2008b). In addition, the M. canis field isolate (Lara) with very strong NEAC was also used in this study (see May and Brown, 2008). The M. synoviae strains were cultured in modified Frey’s media (Benčina et al., 2001).

Table 1. Neuraminidase activity, haemagglutination phenotype and nanH gene sequences of M. synoviae strains

Strain Clone or culture NEACa HA titreb mAb 50 to

MSPB mAb 3E10 to

MSPA nanH gene – GenBank

access number Reference

WVU1853 5G6 strong 2x104 +c +c EU245026 Berčič et al. 2008b WVU1853AA C2 strong 102 - - same as U245026 Berčič et al. 2008b F10-2AS C1 strong 104 + + same as EU245026 Benčina et al. 2001 K1968 Z2 strong 104 + + EU532615 Benčina et al. 2001 B27/00 C2 strong ND -d -d EU245031 Ramirez et al. 2006 K4436B C5 strong 5x103 + - EU245028 Benčina et al. 2001 PAA2 C1 strong 104 - - same as EU245028 Benčina et al. 2001 K2581 C2 strong 5x103 + - EU245025 Benčina et al. 2001 K3344 T2 strong 104 + - same as EU245025 Benčina et al. 2001 K2426D K4 strong 4x104 - - EU14500 Benčina et al. 2001 K3009/37 KA1 strong <103 - - EU245030 Benčina et al. 2001 ULB02/P4 AA3 strong 1,2x104 - - EU245029 Lavrič et al. 2007 ULB02/T6 AA2 moderate <102 - - same as EU245029 Berčič et al. 2008a ULB07/P5 C5 moderate <102 - - EU532616 this study ULB9122 C1 moderate <102 - - EU245027* Benčina et al. 2005 ULB9122 C2 in C3 negative <102 - - EU245027 Benčina et al. 2005 AAY K 1/3/7 negative 104 - + same as EU532617 Narat et al. 1998 ULB925 KF negative 4x104 - + EU532617 Benčina et al. 1999 ULB925 KF9 negative 4x104 - + same as EU532617 Benčina et al. 1999 ULB925 KF6 negative <102 - - same as EU532617 Benčina et al. 1999 a NEAC evaluated as described (Berčič et al., 2008b) b reciprocial dilution (of pellet) which gave complete haemagglutination of 0,5% chicken erytrocytes (Narat et al., 1998) c more than 50% of colonies (in clones >90%) reacted with an appropriate monoclonal antibody (mAb) d less than 50% of colonies (in clones <10%) reacted with an appropiate mAb e identical to the Genbank deposited sequences f identical to the Genbank deposited sequences except mutation described in section 3.2


Determination of HA and HI titres, NEAC and reactivities with monoclonal antibodies (mAbs) Samples were assayed for HA titres and NEAC as described elsewhere (Rhoades, 1985; Narat et al., 1998; Berčič et al., 2008b). Reactivities of M. synoviae strains with monoclonal antibodies were determined by the indirect immuno-peroxidase assay (IIPA) and immunoblotting (Benčina et al., 1999; 2001; Noormohammadi et al., 2000). Haemagglu-tination-inhibition (HI) titres of chicken sera with the M. synoviae HA antigen were determined by the micromethod (Benčina et al., 1991).

Cloning of the nanH gene and production of recombinant protein A DNA fragment of the nanH gene (615 bp) was amplified. The PCR product was purified, digested and ligated into the digested vector. For the expression of recombinant products, ligated plasmid was used to transform Escherichia coli. Production of recombinant protein rNanH was induced. E. coli cells were then lysed under denaturing conditions and a recombinant protein was extracted.

Polymerase Chain Reaction (PCR) and nanH sequencing PCR primers were designed using Primer3 Software (Rozen and Skaletsky, 2000). Purified nucleic acid of different M. synoviae strains was used for polymerase chain reaction. The PCR products were analysed on agarose gel and sent for sequencing to Macrogen DNA Sequencing Service. Sequence analyses were performed by EMBL-EBI Tool ClustalW2, BCM Search Louncher and NCBI BLAST Tools.

Desialylation of chicken glycoproteins DIG glycan differentiation kit (Roche) was used to determine sialylation of glycoproteins, as well as their desialylation with the M. synoviae neuraminidase. Samples with determined patterns of sialylation were used in assays with M. Synoviae cells, both with strong NEAC or lacking NEAC. For the positive control of desialylation, neura-minidase of Clostridium perfringens was used, whereas for the negative control only PBS was added to the samples.

Detection of antibodies to rMSPB and rNanH Sera collected from blood of chickens which were naturally or experimentally infected with M. synoviae were assayed for specific antibodies by the rapid serum agglutination, HI test, indirect immunoperoxidase assay and immunoblotting (Benčina and Bradbury, 1991; Narat et al., 1998). Direct comparison of levels of antibodies to the recombinant MSPB (rMSPB) or to the recombinant NanH (rNanH) was determined by dot-immunobinding assay (DIBA), perfor-med as described elsewhere (Benčina et al., 2001; 2005).

NEAC-inhibition (NI) test NI test was developed to investigate whether chickens can raise antibodies which inhibit NEAC, i.e. are capable to

reduce or even block the function of neuraminidase. In all cases, sera were assayed with the type strain WVU 1853 cells which have strong NEAC (May et al., 2007; Berčič et al., 2008b and this study). Besides WVU 1853, also other M. synoviae strains, usually, those that caused an infection, were used in the NI-assay. In addition, two sera which completely blocked NEAC were assayed in the NI-assay with M. gallisepticum (R-low), M. corogypsi, M. canis and M. anseris (Berčič et al., 2008b).

Results

Polymorphic nanH sequences in M. synoviae strains Sequencing of the nanH gene of 20 M. synoviae strains showed its extensive diversification which started at nt 40 and finished at nt 2758. Their predicted NanH amino acid sequences were aligned with NanH sequences determined for M. synoviae strains, as described by Vasconcelos et al. (2005) and May and Brown (2008). This alignment showed 11 types of NanH sequences. With reference to the NanH consensus amino acid sequence, neuraminidase proteins contained 57 polymorphic residues. The most diversified NanH sequence was found in K 2581 and K 3344. On the other hand, the ULB 9122 strain showed only a few polymorphic NanH residues. Relatively conserved NanH sequence was found in strains WVU 1853, ULB 02/P4 and ULB 07/P5.

Mutations in the nanH sequence which destroy NEAC Our previous study showed that certain M. synoviae strains like the strain ULB 925 and its clones lacked NEAC (Berčič et al., 2008b). Further examinations showed that its parental strain AAY-4 and all 15 cultures deriving from it, also lacked detectable NEAC. AAY-4 and three clones of ULB 925 (KF, KF9 and KF6) had the identical nanH sequence with a distinct point mutation. In the codon for K (lysine), one adenine was lost (change AAA→AAG), which introduced a premature stop codon (TAA) in the NanH neuraminidase (see Fig. 1A). Theoretically, the truncated NanH would lack elements that are crucial for the neuraminidase function. Two cultures of ULB 9122 lost NEAC (cultures C2 and C3) and they had identical frameshift mutation in a polyA sequence of nanH (Fig. 1B). A deletion of one adenine (6A→5A) caused frameshift which also introduced a premature stop codon TAA. Therefore, their predicted NanH polypeptide would lack 105 amino acids and this could be responsible for the absence of NEAC in these two cultures.

NEAC is independent of HA phenotype and GapA synthesis In this study, all cultures of the examined type strain WVU 1853 had high levels of NEAC. On the other hand, their HA titers varied from 4 x 104 to less than 102. In contrast to WVU 1853, AAY-4 and ULB 925 cultures were without detectable NEAC, probably due to the mutation in the nanH gene. However, those M. synoviae cultures had high HA


titres or eventually lost the HA-positive phenotype, like the ULB 925 strain’s clone KF6. Changes in HA titres were associated with recombinations of the vlhA gene which generated diversification of the VlhA haemagglutinin sequence (see GenBank acc. numbers AF 488710, AF 488711 and AF 488712 for ULB 925 clones KF, KF9 and KF6, respectively). All in all, there was no association of NEAC with the HA phenotype or with epitopes on MSPB and MSPA. This was also observed in ULB 9122 cultures which were HA- negative, but some of them lost NEAC, probably due to mutation in the nanH gene. Specific antibodies detected a relatively abundant synthesis of about 36-kDa GapA protein in all 15 M. synoviae strains examined. Notably, ULB 925 (clone KF) lacking NEAC, showed an amount of GapA similar to WVU 1853 which had high NEAC. This suggested that the absence of NEAC associated with the truncation or even absence of NanH, did not affect the amount of GapA.

M. synoviae can desialylate chicken glycoproteins M. synoviae cleaves sialic acid from synthetic substrates, but its ability to desialylate chicken glycoprotein was not known. Initial analysis showed that WVU 1853 with high NEAC cleaved a considerable amount of sialic acid (α2-6 gal linkage) from a fetuin used as a reference glycoprotein. Further incubation with WVU 1853 caused complete removal of sialic acid from a fetuin. On the other hand, M. synoviae ULB 925 (clone KF) without NEAC did not cause a visible change in quantity or pattern of sialylation on fetuin. An overnight incubation of cells of WVU 1853 with serum samples caused an apparent change in the pattern and degree of sialylation of glycoproteins. Significantly reduced sialy-lation was observed for IgG, as well as for a major glycoprotein of about 95 kDa. Longer incubation with WVU 1853 caused the complete desialylation of chicken serum glycoproteins that can be compared with that by neura-minidase of Cl. perfringens. In contrast to WVU 1853, strain ULB 925 (KF) without NEAC, did not cause a notable change in the pattern or degree of sialylation of serum glycoproteins. Samples from chicken tracheas contained sialylated glyco-proteins, too. Again, ULB 925 (KF) did not cause any change in the level or pattern of sialylation of tracheal glycoproteins while WVU 1853 reduced the level of sialic acid on glycoproteins. Desialylation of glycoproteins from the upper trachea with WVU 1853 was reproducible and was also shown for tracheal samples obtained from other chickens. WVU 1853 was also capable to cleave sialic acid from a sample of a chicken embrio allantoic fluid.

Chicken raised antibodies which inhibit NEAC of M. synoviae Except for Newcastle disease and influenza A viruses, there is almost no data about the antibody response against

neuraminidase of avian pathogens. We examined sera of 103 chickens that were experimentally or naturally infected with M. synoviae. All of them raised specific antibodies, inclu-ding antibodies to MSPB and to rMSPB (Benčina et al., 2001). In contrast to rMSPB, only about 30% of those chickens raised serum antibodies that reacted with a recombinant rNanH. At dilutions of sera 1:100 their reactions were stronger with rMSPB than with rNanH. In addition, we investigated whether chickens can produce antibodies that inhibit NEAC. Using the M. synoviae WVU 1853 strain in the NI assay, 26 sera of 103 examined sera gave the reaction indicating the presence of antibodies that inhibit NEAC. In cases when M. synoviae strains that caused infection were used in the NI assay, the percentage of positive sera was higher in comparison with the NI assay using WVU 1853. Only two sera completely blocked NEAC and there was no staining of samples within 10 days. The first serum was from an adult chicken infected naturally with the ULB 08/T3 strain. The second serum was taken from a six-weeks-old chicken, two weeks after the experimental infection with F 102AS. This serum blocked NEAC of strains F 10 2AS and WVU 1853, but was without HI antibodies. It also inhibited NEAC of M. gallisepticum RLOW, but not NEAC of M. anseris, M. corogypsi and M. canis. In immunoblotting and DIBA, this serum apparently reacted with rNanH what confirms that antibodies were specific for M. synoviae neuraminidase.

Discussion

Neuraminidase enzymes are pathogenic factors in many pathogenic bacteria and viruses. This also seems to be accurate for two major poultry pathogens, M. synoviae and M. gallisepticum, because their more invasive and/or pathogenic strains have stronger NEAC than their apathogenic strains (May et al., 2007; Berčič et al., 2008b). Analyses of the nanH gene sequences of M. synoviae strains so far identified 11 types of this gene and 90 polymorphic nt (May and Brown, 2008; this study). Up to now, 57 polymorphic aminoacids (aa) were found in the NanH neuraminidase in M. synoviae, but there is no obvious relationship between the extent of polymorphism(s) and the level of NEAC. We identified point mutations causing frameshift, premature termination of translation and consequently, the absence of NEAC in strains AAY4 (ULB 925) and ULB 9122 cultures. In both cases a deletion of a single adenine caused frameshift and introduced TAA stop codon, however, this occurred in different regions of the nanH gene. Such mutations in homopolymeric tracts are relatively frequent in Mycoplasma species and are thought to be the result of slipped-strand mispairing during the chromosomal replication or other processes requiring DNA synthesis (Citti et al., 2005). However, despite an extensive diversification of the nanH gene, closely related M. synoviae strains have identical nanH sequences, although they were recovered from poultry with a time gap of five years or


more. Except the horizontally transferred paralog in M. gallisepticum, the nanH of M. synoviae shares only a low percentage of identity with neuraminidase genes sequences stored in data bases. At present, the nearest homolog of the M. synoviae (and M. gallisepticum) nanH is that of Pasteurella multocida. In some pathogenic microorganisms, like influenza A virus, balanced activities of haemagglutinin and neuraminidase is important in interactions with their hosts (Mitnaul et al., 2000). This study shows, that at least in vitro, M. synoviae NEAC is independent of the HA phenotype, which changes due to the vlhA gene recombinations (Noormohammadi et al., 2000). Synthesis of the GapA proteins was constant and relatively high, also in cultures without detectable NEAC, i.e. ULB 925/KF. This suggests that the expression of the nanH gene does not depend on the neighbour genes gapA and vlhA. It seems that M. synoviae populations synthesise NanH in infected chickens. Indeed, approximately 25% of such chickens had serum antibodies which inhibited NEAC of M. synoviae. Such antibodies might have a protective role, because the M. synoviae neuraminidase is able to desialylate chicken glycoproteins. To detect antibodies which inhibit the function of NanH it was necessary to develop a new test based on NEAC inhibition by antibodies. Our NI-assay is similar to the recently developed NI-assay by Sylte et al. (2007), who investigated if influenza A neuraminidase antibodies provide protection for chickens. They used a fluorogenic substrate MUAN which detects lower quantities of NEAC in M. synoviae than the chromogenic substrate BIN used by us (May et al., 2007; Berčič et al., 2008b). Therefore, a NI-assay using MUAN can probably detect a lower quantity of specific antibodies than an NI-assay using BIN. However, we prefer to use BIN because it is much more stable than MUAN. Nevertheless, NI-assays used by us or by Sylte et al. (2007) are faster and much simpler than a standard NA inhibition method developed long ago, but still used in a recent investigation about influenza A neuraminidase antibodies in mice and humans (Webster and Campbell, 1972; Sandbulte et al., 2007). The presence and distribution of receptors containing sialic acid is crucial in infections with influenza A virus of humans or birds (Thompson et al., 2006; Gambaryan et al., 2006). This aspect of infection is less clear for other respiratory pathogens, including Mycoplasma species which otherwise preferentially colonizs mucosal surfaces of the respiratory and urogenital tract and eventually joints, like M. synoviae (Razin et al., 1998; Kleven, 2003). Besides sialic acid containing receptors, other sialylated substances, like glycoproteins present in respiratory mucus can play important roles in respiratory infections, too. In samples of chicken respiratory mucus we observed sialylated glycoproteins. The extent and pattern of sialylation differed among samples obtained from different chickens of the same flock and in some samples proteins of comparable Mw. Our study demonstrated that M. synoviae WVU 1853 is capable to cleave sialic acid from tracheal mucus glycoproteins, whereas M. synoviae ULB 925 (KF) lacking NEAC due to

mutation in the nanH gene is not. The incapability of ULB 925 to desialylate tracheal mucus glycoproteins might be responsible for its poor capability to colonise the upper respiratory tract of chickens in two experiments carried out in the early 1990’s (our unpublished work). In the same experiments, M. synoviae F 10 2AS (its cultures have strong NEAC) readily colonised the upper respiratory tract of all inoculated chickens. WVU 1852 readily cleaved from a reference fetuin sialic acid. Moreover, it seems that this strain is also capable of proteolytic cleavage of fetuin, whereas neither desialylation nor proteolysis occurred with ULB 925. Following infection of chickens with WVU 1853, it can be isolated from the bloodstream for almost two months (Kerr and Olson, 1970). During such stage of the infection, M. synoviae comes into contact not only with blood cells, but also with blood proteins and many of them could be sialylated. In our study, sialic acid was detected on serum glycoproteins. Notably, certain sera did not contain detec-table level(s) of sialic acid. In other sera sialic acid was readily detected on a number of glycoproteins including IgG and transferrin. Sialylation of chicken IgG was reported before and it was on the CH2 part of the IgG (Suzuki and Lee, 2004). The capability of M. synoviae to desialylate chicken glycoproteins enables its better defense and survival and likely, a supply of a nutrient (sialic acid) which M. synoviae can utilise using enzymes involved in the canonical sialic acid degeneration pathway (Vasconcelos et al., 2005; May and Brown, 2008).

Conclusions

In the cultures of two M. synoviae strains which lost NEAC we found mutations in their nanH gene sequences. Deletions of a single adenine occurred at different positions, but in both strains they caused frameshifts and premature termination of translation. NEAC did not depend on the HA phenotype. M. synoviae WVU 1853 with strong NEAC cleaved sialic acid from glycoproteins of chicken serum or tracheal mucus, whereas its strain ULB 925/KF lacking NEAC did not desialylate those glycoproteins. About one fourth of chickens infected with M. synoviae had serum antibodies which inhibited its NEAC, what indicates that M. synoviae synthesises neuraminidase NanH in vivo.

Acknowledgements

This research was supported by the grant P4-0220 from the Slovenian Research Agency (ARRS). We thank Dr J. M. Bradbury for the Mycoplasma cultures. Technical help of S. Salmič is acknowledged.

References

Aldrige, K. (1972): Growth and Cytopathology of Mycoplasma synoviae in Chicken Embryo Cell Cultures. Infect. Immun. 12, 198–204.


Benčina, D., J. M. Bradbury (1991): Indirect immunoperoxidase assay for the detection of antibody in chicken Mycoplasma infection. Avian Pathol. 20, 113–124.

Benčina, D., M. Narat, P. Dovc, M. Drobnič-Valič, F. Habe, S. H. Kleven (1999): The characterization of Mycoplasma synoviae EF-Tu protein and proteins involved in hemadherence and their N-terminal amino acid sequences. FEMS Microbiol. Lett. 173, 85–94.

Benčina, D., M. Drobnič-Valič, S. Horvat, M. Narat, S. H. Kleven, P. Dovč (2001): Molecular basis of the length variation in the N-terminal part of Mycoplasma synoviae hemagglutinin. FEMS Microbiol. Lett. 203, 115–123.

Benčina, D., M. Narat, A. Bidovec, O. Zorman-Rojs (2005): Transfer of maternal immunoglobulins and antibodies to Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae to the allantoic and amniotic fluid of chicken embryos. Avian Pathol. 34, 463–472.

Berčič, R. L., B. Slavec, M. Lavric, M. Narat, A. Bidovec, P. Dovc, D. Bencina (2008a): Identification of major immunogenic proteins of Mycoplasma synoviae isolates. Vet. Microbiol. 127, 147-154.

Berčič, R. L., B. Slavec, M. Lavric, M. Narat, O. Zorman-Rojs, P. Dovc, D. Bencina (2008b): A survey of avian Mycoplasma species for neuraminidase enzymatic activity. Vet. Microbiol. 130, 391-397.

Citti, C., G. F. Browning, R. Rosengarten (2005): Phenotypic Diversity and Cell Invasion in Host Subversion by Pathogenic Mycoplasmas. In: Mycoplasmas. Molecular biology, pathogenicity and startegies for control (Blanchard, A., G.Browning, ed). Horizon Bioscience. Norfolk, 439–483.

Gambaryan, A., A. Tuzikov, G. Pazynina, N. Bovin, A. Balish, A. Klimov (2006): Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. Virology. 344, 432–438.

Gaskell, A., S. Crennell, G. Taylor, (1995): The tree domains of a bacterial sialidase: a β-propeller, an immunoglobuline module and a galactose-binding jelly-roll. Structure. 3, 1197 – 1205.

Hinz, K. H., C. Blome, M. Ryll (2003): Virulence of Mycoplasma synoviae strains in experimentally infected broiler chickens. Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 116, 59-66.

Jeffery N., G. F. Browning, A. H. Noormohammadi (2007): Organization of the Mycoplasma synoviae WVU 1853T vlhA gene locus. Avian Pathol. 35, 53–57.

Kerr, K. M., N. O. Olson (1970): Pathology of chickens inoculated experimentally or contact-infected with Mycoplasma synoviae. Avian Dis. 14, 291–320.

King, J. S., K. R. Hippe, J. M. Gould, D. Bae, S. Peterson, R. T. Cline, C. Fasching, E. N. Janoff, J. N. Weiser (2004): Phase variable desialylation of host proteins that bind to Streptococcus pneumoniae in vivo and protect the airway. Mol. Microbiol. 54, 159–171.

King, S. J., K. R. Hippe, J. N. Weiser (2006): Deglycosilation of human glycoconjugates by the sequential activities of exoglycosidase expressed by Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 59, 961–974.

Kleven, S. H., 2003. Mycoplasma synoviae infection. In: Diseases of Poultry. 11th (Saif, Y. M., H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne, eds.). Iowa State University Press. Ames, 756-766.

Lauerman, L. H., R. A. Reynolds-Vaughn (1991): Immunoglobulin G Fc receptors of Mycoplasma synoviae. Avian Dis. 35, 135–138.

Lockaby, S. B., F. J. Hoerr, L. H. Laureman, S. H. Kleven (1998): Pathogenicity of Mycoplasma synoviae in broiler chickens. Vet. Pathol. 35, 178–190.

May, M., S. H. Kleven, D. R. Brown, (2007): Sialidase activity in Mycoplasma synoviae. Avian Dis. 51, 829-833.

May, M., D. R.Brown (2008): Genetic variation in sialidase and linkage to N-acetylneuraminate catabolism in Mycoplasma synoviae. Microb. Pathog. 45, 38-44.

Mitnaul, L. J., M. N. Matrosovich, M. R.Castrucci, A. B.Tuzikov, N. V.Bovin, D. Kobasa, Y. Kawaoka (2000): Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient replication of Influenza A Virus. J. Virol. 74, 6015–6020.

Narat, M., D. Benčina, S. H. Kleven, F. Habe, (1998): Hemagglutination-positive phenotype of Mycoplasma synoviae induces experimental infectious synovitis in chickens with a higher frequency than the hemagglutination-negative phenotype. Infect. Immun. 66, 6004–6009.

Noormohammadi, A. H., P. H. Markham, K. G. Whithear, I. D. Walker, V. A. Gurevich, D. H. Ley, G. F. Browning (1997): Mycoplasma synoviae has two distinct phase-variable major membrane antigens, one of which is a putative hemagglutinin. Infect. Immun. 65, 2542–2547.

Noormohammadi, A. H., P. F.Markham, M. F.Duffy, K. G.Whithear, G. F. Browning (1998): Multigene families encoding the major hemagglutinins in phylogenetically distinct mycoplasmas. Infect. Immun., 66, 7, 3470-3475.

Noormohammadi, A. H., P. F.Markham, A. Kanci, K. G.Whithear, G. F. Browning (2000): A novel mechanism for control of antigenic variation in the haemagglutinin gene family of Mycoplasma synoviae. Mol. Microbiol. 35, 911–923.

Ramirez, A. S., C. J.Naylor, P. P.Hammond, J. M. Bradbury (2006): Development and evaluation of a diagnostic PCR for Mycoplasma synoviae using primers located in the intergenic spacer region and the 23S rRNA gene. Vet. Microbiol. 118, 76–82.

Razin, S.(1985): Mycoplasma adherence. In: The Mycoplasmas IV. Mycoplasma pathogenicity (Razin, S., M. F. Barile, eds.). Academic Press, 161-202.

Razin, S., D. Yogev, Y. Naot, (1998: Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 1094–1156.

Rhoades, K. R. (1985): Selection and comparison of Mycoplasma synoviae hemagglutinating and nonhemagglutinating variants. Avian Dis. 29, 1170–1176.

Rozen, S., H. J. Skaletsky (2000): Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology (Krawetz, S., S.Misener, eds). Humana Press. Totowa, 365-386.

Sandbulte, M. R., G. S. Jimenez, A. C. M. Boon, L. R. Smith, J. J. Treanor, R. J. Webby (2007): Cross-reactive neuraminidase antibodies afford partial protection against H5N1 in mice and are present in unexposed humans. PLoS Med. 4, 265–272.

Senties-Cue, G., H. L.Shivaprasad, R. P.Chin (2005): Systemic Mycoplasma synoviae infection in broiler chickens. Avian Pathol. 34, 137–142.

Soong, G., A. Muir, M. I. Gomez, J. Waks, B. Reddy, P. Planet, P. K.Singh, Y. Kanetko, M. C. Wolfgang, Y. Hsiao, L. Tong, A. Prince (2006): Bacterial neuraminidase facilitates mucosal


infection by participating in biofilm production. J. Clin. Invest. 116, 2297–2305.

Sylte, M. J., B. Hubby, D. L. Suarez (2007): Influenza neura-minidase antibodies provide partial protection for chickens against high pathogenic avian influenza infection. Vaccine. 25, 3763–3772.

Suzuki, N., Y. C. Lee (2004): Site-specific N-glycosilation of chicken serum IgG. Glycobiology. 14, 275–292.

Thompson, C. I., W. S. Barclay, M. C. Zambon, R. J. Pickles (2006): Infection of Human Airway Epithelium by Human and Avian Strains of Influenza A Virus. J. Virol. 80, 8060–8068.

Vasconcelos, A. T., H. B.Ferreira, C. V.Bizzaro, S. L.Bonatto, M. O.Carvalho (2005): Swine and poultry pathogens: the complete genome sequence of two strains of Mycoplasma hyopneumoniae and a strain of Mycoplasma synoviae. J. Bacteriol. 187, 5568–5577.

Webster, R. G., C. H. Campbell (1972): An inhibition test for identifying the neuraminidase antigen on influenza viruses. In: Avian Diseases A quarterly (oct.-dec.) (Grumbles, L. C., ed.). The American Association for Avian Pathologists. Texas, 1057–1066.

NEURAMINIDAZA VRSTE MYCOPLASMA SYNOVIAE DESIJALIZIRA GLIKOPROTEINE KOKOŠI, ALI ONE MOGU TVORITI PROTUTIJELA KOJA PRIJEČE NJENU NEURAMINIDAZNU ENZIMSKU AKTIVNOST

Sažetak

Mycoplasma synoviae je značajan patogen koji uzrokuje bolest u jatima peradi u cijelom svijetu. M. synoviae sintetizira sijalidazu (neuraminidazu) NanH. Invazivni i patogeni sojevi imaju snažniju neuraminidaznu enzimsku aktivnost (NEA) nego nepatogeni sojevi. Odredili smo slijed nukleotida za gen nanH od 20 sojeva M. synoviae, uključujući one bez NEAC. U sojevima bez NEAC, pronađena je delecija koja uzrokuje pomak u čitanju kodona i prerani prekid translacije u nanH gene. U kulturama ULB 9122 koje su izgubile NEAC, delecija u regiji polyA (6A→5A) koja uzrokuje pomak u čitanju kodona generirala je kraći NanH protein. Dok funkcionalno balansirana aktivnost hemaglutinina VlhA i neuraminidaze može biti važna za populacije M. synoviae in vivo, koordinirana ekspresija hemaglutinacije (HA) i NEAC nije primjećena in vitro. Razvili smo NEAC – inhibicijski (NI) test za ispitivanje seruma pilića inficiranih s M. synoviae za antitijela koja inhibiraju neuraminidaznu enzimsku aktivnost. Dok su u svim serumima nađena antitijela za N-terminalni dio VlhA hemaglutinina (MSPB), samo 25% ispitanih seruma bilo je pozitivno u NI testu. Više je pozitivnih seruma pronađeno u NI uzorcima u kojima je korišten soj M. synoviae koji je uzrokovao infekciju. Neki od sojeva M. synoviae cijepali su sijalinsku kiselinu iz glikoproteina kokošjeg seruma, sluzi dušnka, imunoglobulina G (IgG), transferina i nekih drugih serumskih glikoproteina s (Sia α 2-6) gal vezom. Posebice je desijalilacija Sia (α 2-3)gal primjećena u tri glikoproteina iz dušnika što upućuje na mehanizam koji omogućuje koloniziranje M. synoviae i dugu postojanost u dušniku. Ovo istraživanje pruža nekoliko novih informacija koje doprinose boljem razumijevanju interakcija između M. synoviae i domaćina. Ključne riječi: Mycoplasma synoviae, neuraminidazna aktivnost, mutacije, desijalilacija, imuni odziv


PRISUTNOST CAMPYLOBACTER SPP. U OBRISCIMA S TRUPOVA PERADI U KLAONICAMA I NA MJESTU PRODAJE

Slavica Jakšić1, Sunčica Uhitil1, Kornelija Granić1, Damir Krčar2

1ZIN-LAB, Veterinarska stanica grada Zagreba, Zagreb, Hrvatska 2 Veterinarska stanica Prelog, Prelog, Hrvatska

Sažetak

Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi prisutnost bakterije Campylobacter spp. na trupovima peradi u klaonicama neposredno nakon hlađenja u odnosu na trupove peradi na mjestu prodaje. Tijekom svibnja i lipnja 2008. godine prikupili smo i ispitali ukupno 105 uzoraka obrisaka s trupova peradi u 5 klaonica u Međimurju i 135 uzoraka obrisaka s 5 prodajnih mjesta u Zagrebu kod istih proizvođača. Campylobacter spp. izoliran je iz 2 obriska s trupova peradi iz klaonica (1,9%) i u 12 obrisaka s mjesta prodaje (88,8%). Najčešće izolirani soj bio je C. coli (6,66%), a potom C. jejuni (2,22%). Istraživanje pokazuje višu stopu kontaminacije Campylobacter spp. na trupovima peradi u prodaji. Na taj se način značajno povećava rizik od alimentarne infekcije ljudi. Ključne riječi: Campylobacter spp., obrisci, trupovi peradi Uvod Kampilobakterioza je bakterijska bolest uzrokovana bakte-rijom Campylobacter spp. Prvi izolat je dobiven iz uzorka stolice pacijenta s dijarejom u Belgiji 1972. godine i od tada je postao poznat kao vodeći uzročnik patogenog gastro-enteritisa u ljudi (Altekruse i sur., 1999.). Kampilobakte-rioza je jedna od najčešćih alimentarnih infekcija čiji se simptomi kreću od blage do vrlo ozbiljne dijareje, često s krvavim stolicama, grčevima, abdominalnim bolovima, mučninom, povraćanjem i temperaturom. Simptomi se javljaju unutar 2 do 5 dana od infekcije. Bolest traje tjedan dana i obično prođe bez specifičnog liječenja. Rijetko neke osobe mogu razviti reaktivni artritis i komplikacije koje se odražavaju na nervni sustav, što je poznato kao Guillain-Barréov sindrom (Nachamkin i sur., 1998.). Infektivna doza je mala, već od 500 cfu/g i ovisi o dobi i fizičkom statusu pacijenta. Češće obolijevaju djeca i muškarci i to češće ljeti nego zimi (Mead, 1999., Kothary i Buba, 2001.). Bakterije roda Campylobacter treći su po redu uzročnik alimentarnih infekcija s letalnim ishodom, nakon bakterija roda Sal-monella i Listeria. U industrijski razvijenim zemljama po-java alimentarnih infekcija izazvanih bakterijom Campylo-bacter spp. posljednjih godina se značajno povećava (Keller i sur., 2007.). Ona je najčešća dijarejalna bolest u SAD-u, pri čemu godišnje oboli preko 2 milijuna ljudi ili 1% popu-

lacije, a procjenjuje se da 100 osoba godišnje umre zbog te infekcije. Životinje, posebice ptice, najčešći su prenosioci infekta na ljude premda same ne obolijevaju. Campylobacter spp. najbolje raste na tjelesnoj temperaturi ptica koje predstav-ljaju nosioce. Bakterija iz probavnog trakta peradi konta-minira površinu trupa, a potom i meso, tijekom postupka evisceracije u klaonicama. Ludi obolijevaju nakon konzu-macije nedovoljno termički obrađene i kontaminirane hrane (Naglić, 2005.). Campylobacter spp. je Gram negativni mikroorganizam spi-ralnog oblika, 0,2-0,5 μm širok i 0,5-5,0 μm dug, pokretan, mikroareofilan. Za rast su mu potrebni uvjeti uz malu koncentraciju kisika i 3-5% ugljičnog dioksida (Smibert, 1984.). Najčešće izolirani sojevi su C. jejuni, C. coli, C. lari i C. hyonitestinalis (Richardson i sur., 2005.).

Materijal i metode

Obrisci su dijelom uzeti s trupova peradi u klaonicama nakon hlađenja. Temperatura trupova bila je 5 ºC. Ostali obrisci uzeti su s trupova peradi na mjestu prodaje i njihova temperatura iznosila je 8 ºC i 10 ºC. Obrisci su dobiveni temeljitim brisanjem kože preko cijelog trupa. Svaki obrisak je stavljen u posudu s puferiranom pepton-skom vodom (1.07228. Merck) za obogaćenje te inkubiran pri 37 ºC kroz 24 sata.

Dr. sc. Sunčica Uhitil, dr. vet. med., ZIN-LAB, Veterinarska stanica grada Zagreba, Heinzelova 68, 10000 Zagreb, Hrvatska; ++385 (1) 6040-143.

PRISUTNOST CAMPYLOBACTER SPP. U OBRISCIMA S TRUPOVA PERADI U KLAONICAMA I NA MJESTU PRODAJE 80

Potom je 1 ml tako pripremljenog uzorka dodan u 9 ml Boltonovog hranjivog bujona (1.00068. Merck) u koji je dodan selektivni dodatak (1.00070. Merck) i lizirana konjska krv. Uzorci su potom inkubirani pri 41 ºC kroz 24 sata. Nakon inkubacije uzorci su razmazani ezom na kromogenu podlogu Campy Food ID Agar (43 471 bioMérieux) i inkubirani pri 41 ºC i mikroaerobnim uvjetima kroz 24-48 sati. Mikroareobni uvjeti postignuti su u posudi dodatkom medija koji to omogućava (96 125, bioMérieux).

Identifikacija

Sumnjive kolonije na Campy Food ID Agaru su male, tamnocrvene do narančasto-crvene boje metalnog sjaja, po Gramu se boje negativno i formiraju karakterističan oblik „galebovih krila“. Bojenje je puno bolje karbol fuksinom. Oksidaza test je pozitivan. Identifikacija je provedena dodatkom tipičnih kolonija u 1% otopinu natrijeva hipurata (8.20648. Merck) i inkubacijom pri 37 ºC kroz 2 sata. Potom je dodana otopina ninhidrina (1.05752. Merck) i uzorak je inkubiran još 1-2 sata pri 37 ºC. Pojava plave boje upućuje na prisutnost C. jejuni, dok odsutnost boje znači da se radi o C. coli. Identifikaciju smo proveli i API testom Campy 20 800 (bioMérieux). Metoda koju smo koristili za izolaciju Campylobacter spp. je akreditirana metoda HRN EN ISO 10272-1:2006.

Rezultati

Ukupno je pretraženo 105 uzoraka obrisaka s trupova peradi u 5 klaonica neposredno nakon hlađenja. Campylobacter spp. izoliran je u 2 obriska i oba su bila C. coli (1,9%). Potom je pregledano 135 obrisaka s trupova peradi prikup-ljenih na prodajnim mjestima; proizvođači su bili isti oni od kojih su prethodno uzeti uzorci na klaonicama. U 12 obri-saka je dokazana prisutnost Campylobacter spp. (8,88%), od čega su 3 izolata bila C. jejuni (2,2%), a 9 izolata C. coli (6,66%).

Rasprava i zaključak

U radu je odabrana metoda analize obriska trupova jer je dokazano da koža peradi predstavlja jedan od glavnih izvora ovog patogena (Musgrove i sur., 1997.). Ukoliko je koža kontaminirana, vjerojatnost da je i meso kontaminirano je 35 puta veća u odnosu na kožu koja nije kontaminirana (Jeffrey i sur., 2001.). Koža peradi pogoduje preživljavanju C. jejuni, pa neki autori navode da se taj soj češće nalazi na trupovima peradi u klaonicama (McCrea i sur., 2008.), premda postu-pak hlađenja znatno smanjuje kontaminaciju mikroorga-nizmom C. jejuni (Alter i sur., 2004.). Drugi autori tvrde suprotno - da se u klaonicama češće nalazi C. coli (72,4%) (Meeyam i sur., 2004.). Naši rezultati odgovaraju nalazu McCrea i sur. i pokazuju da je na mjestu prodaje češće zastupljen C. coli (6,6%) nego C. jejuni (2,2%), koji je izo-liran u klaonici.

Neki autori, suprotno našem nalazu, izvještavaju o znatno višoj kontaminaciji kože trupova. Na primjer, u Belgiji je Campylobacter spp. izoliran iz čak 78% obrisaka s kože peradi u klaonicama. Sličan je nalaz dobiven i u SAD-u - 79%. (Berrang i sur., 2001.; McCrea i sur., 2008.). U Indiji je C. jejuni izoliran iz 40% obrisaka s mesa peradi (Suresh Varma i sur., 2000.), dok je u Japanu taj broj iznosio 38% (Mizuno i sur., 2001.). Kako smo ranije naveli, Campylobacter spp. je jedan od vodećih patogena, uzročnika alimentarnih infekcija, a C. jejuni je najzastupljeniji soj (Saenz i sur., 2000.; Chatto-padhyay i sur., 2001.). Infektivna doza za čovjeka je niska i može biti već 5 x 102 CFU (Robinson, 1981.). Stoga je opravdan rizik od alimentarne infekcije hranom koja je već kontaminirana ovim patogenom. Takvu tvrdnju potkreplju-jemo pozitivnim nalazom u gotovo 10% uzoraka peradi s mjesta prodaje. Važna je i činjenica da je broj pozitivnih nalaza na tržištu čak nekoliko puta veći nego na mjestu klanja i hlađenja. To upućuje na zaključak da postoje pro-pusti u lancu proizvodnje pilećeg mesa te na potrebu defini-ranja kritičnih kontrolnih točaka u lancu prehrane, od klao-nice do mjesta prodaje i njihove kontrole, kako bi se izbjegla kontaminacija te vrste hrane i posljedično zaštitilo zdravlje ljudi.

Literatura

Altekruse, S. F., N. J. Stern, P. I. Fields, D. L. Swrdlow (1999.): Campylobacter jejuni – An Emerging Foodborne Pathogen, Emerging Infectous Diseases, 5:28-35.

Alter, T., F. Gaull, A. Froeb, K. Fehlgaber (2005.): Distribution of Campylobacter jejuni strains at different stages of a turkey slaughter line. Food Microb., 22:345-351.

Berrang, M. E., R. J. Buhr, J. A. Cason, J. A. Dickens (2001.): Broiler carcass contamination with Campylobacter from faces during defeathereing. J. Food Prot. 64:2063-2066.

Chattopadhyay, U., M. Rashid, S. Sur, D. Pal (2001.): The occurence of campylobacteriosis in domestic animals and their handlers in and around Calcutta. J. Med. Microbiol. 50:933-934.

Jeffrey, J. S., K. H. Tonooka, J. Lozano (2001.): Prevalence of Campylobacter spp. from Skin, Crop and Intestine of Commercial Broiler Chicken Carcasses at Processing, Poultry Sci. 80:1390-1392.

Keller, J., B. Wieland, M. Wittwer, R. Stephen, V. Perreten (2007.): Distribution and Genetic Variability Among Campylobacter spp. Isolates from Different Animal Species and Humans in Switzerland. In: Zoonoses and Public Health. 54:2-7.

Kothary, M. H., U. S. Buba (2001.): Infective dose of foodborne pathogens in volunteers. A review. J. Food Safety. 21:49-73.

Mead, P. S. (1999.): Food-related illness and death in the United States. Emerg. Infect. Dis., 5:607-625.

Meeyam, T., P. Padungtod, J. B. Kaneene (2004.): Molecular Chararacterization of Campylobacter Isolated from Chickens and Humans in Northern Thailand.Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 3:670-675.

McCrea, B. A., K. H. Tonooka, C. Van Worth, E. R. Atwill, J. S. Schrader (2008.): Detection of Campylobacter jejuni from the skin of broiler chicken, squab, quail, and guinea fowl carcasses. Foodborne Pathog. Dis. 53:5-7.

PRISUTNOST CAMPYLOBACTER SPP. U OBRISCIMA S TRUPOVA PERADI U KLAONICAMA I NA MJESTU PRODAJE 81

Mizuno A., M. Hanako, K. Shigeru (2001.): The Detection of Campylobacter in Poultry Slaughterhouses. Hiroshima J. Vet. Med. 16:74-77.

Musgrove, M. T., J. A. Cason, D. L. Fletcher, N. J. Stern, N. A. Cox, J. Bailey (1997.): Effect of Cloacal Plugging on Microbial Recovery from Partially Processed Broilers. Poul. Sci. 76:530-533.

Nachamkin, I., B. M. Allos, T. Ho (1998.): Campylobacter species and Guillain-Barré syndrome. Clin. Microbiol. Rev. 11:555-567.

Naglić, T., D. Hajsig, J. Madić, LJ. Pinter (2005.): Veterinary mikrobiology, 1th ed. Zrinski d.d., Čakovec, 103-108.

Richardson, L., N. Cox, R. Buhr, J. Bailey, J. Wilson, D. Cosby (2005.): Natural Presence of Campylobacter spp. in the

Internal Organs and Late-Life Broiler Breeder Hens. Poultry Sci. Ass. Meeting Abstr. 84:24.

Robinson, D. A. (1981.): Infective dose of Campylobacter jejuni in milk. Br. Med. J. 282:1584.

Saenz, Y., M. Zarazaga, M. Lantero, M. Gastanares, F. Bacuero, C. Torres (2000.): Antibiothic resistance in Campylobacter strains isolated from animals, foods, and human in Spain in 1887-1998. Antimicrob. Agents Chemother. 44:267-271.

Smibert, R. M. (1984.): Genus Campylobacter, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Williams & Wilkins, 8th ed., 1:111.

Suresh Varma K., N. Jagedeesh, H. K. Mukhopadhyay, N. Dorairajan (2000.): Incidence of Campylobacter jejuni in poultry and their carcasses. J. Food Sci. Techn. 37:639-541.

THE PREVALENCE OF CAMPYLOBACTER SPP. IN POULTRY CARCASS SWABS IN SLAUGHTERHOUSES AND ON THE MARKET

Summary

The aim of this study was to determine the probability of Campylobacter spp. detection and its prevalence in poultry carcasses in slaughterhouses after cooling, in relation to market shops, by skin swabbing method. During May and June 2008, we sampled and examined a total of 105 poultry carcass swabs from five slaughterhosuses in Međimurje County and 135 poultry carcass swabs from five market places in Zagreb, all the same products. Campylobacter spp. were determined in only two swab samples collected at poultry slaughterhouses (1.9%). Furhtermore, the same pathogens were determined in 12 swab samples collected at the five market places (88.8%). The most frequently isolated Campylobacter was Campylobacter coli (6.66%), followed by Campylobacter jejuni (2.22%). The research showed higher contamination of Campylobacter spp. in poultry carcasses designated for consumption. Therefore, the foodborne risk is of major importance for foodborne Campylobacter infections in human and all gastroenterological infections. Key words: Campylobacter spp., swabs, poultry carcasses


DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HPLC METHODS FOR THE DETERMINATION OF ANTIBIOTIC RESIDUES IN POULTRY MEAT AND EGG YOLK ACCORDING TO 2002/657/EC-AN OVERVIEW

Victoria F. Samanidou

Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, Greece

Summary

In order to reassure food quality and protect human health the European Union regulates the use of veterinary medicines through council regulations. The Council Regulation No. 2377/90 has established maximum residue limits (MRLs) of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. The European Union has also issued the Decision 2002/657/EC, which defines the performance criteria of analytical methods and the interpretation of results for analytical methods in the official control of residues in products of animal origin. Tetracyclines and quinolones are some of the most frequently used veterinary drugs in animal husbandry. Chicken meat and eggs are probably the most widely consumed foodstuff of animal origin. In this paper two analytical methods are presented for the HPLC determination of quinolones and tetracyclines residues in poultry meat and eggs. Key words: HPLC, antibiotic residues, quinolones, tetracyclines, poultry meat, egg yolk, validation, 2002/657/EC Introduction The widespread use of antibiotics in human as well as in veterinary medicine has led to a significant increase in antibacterial resistance and has therefore important consequences for the public health. In order to reassure food quality and protect human health the European Union regulates the use of veterinary medicines through council regulations. The Council Directive 96/23/EC describes the procedure for the establishment of Maximum Residue Level (MRL) values for veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin and regulates the residue monitoring of pharmacologically active compounds in those products. This directive classifies all residues into two groups: Group A, which comprises prohibited substances, and Group B which includes all registered veterinary drugs in conformity with Annexes I and III of 2377/90/EC and other residues. The Council Regulation No. 2377/90 has established maximum residue limits (MRLs) of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. (Samanidou et al, 2005a, Samanidou et al, 2005b, Samanidou et al, 2007).

Recently the European Union has issued the Decision 2002/657/EC, which defines the performance criteria of analytical methods and the interpretation of results for analytical methods in the official control of residues in products of animal origin. Currently applied methods for the analysis of official samples of the substances in group B of Annex I of the Council Directive 96/23/EC have to comply with the Decision 2002/657/EC by 1st of September 2007. Chicken meat and eggs are probably the most widely consumed foodstuff of animal origin. Tetracyclines and fluoroquinolones are, according to statistical data of the EU, some of the most frequently used veterinary drugs in animal husbandry. Tetracyclines TCs are classified in group B1 (veterinary medicines and contaminants, with an MRL) of Annex I of the Directive 96/23/EC. MRL values set for the presence of tetracycline, oxytetracycline and chlorotetra-cycline, the TCs approved from the EU to be used for therapeutic purposes in poultry, in chicken tissues and eggs are 100 and 200μg/kg respectively. The MRLs for fluoroquinolones according to the same regulation in chicken muscle are 200μg/kg for danofloxacin, 300µg/kg for difloxacin, 100µg/kg for enrofloxacin and 200µg/kg for flumequine. Another provision according to

Assistant Professor Victoria F. Samanidou, PhD; Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, GR-54 124 Thessaloniki, Greece; E-mail: [email protected]


83

this directive is that the use of quinolones is prohibited in animals whose eggs are produced for human consumption. Therefore analytical methods as sensitive as possible are required in order to check food samples before their disposal to the markets for human consumption. Confirmatory methods are required to classify compliant and non-compliant samples to reassure human health (Samanidou et al, 2005c, Christodoulou et al, 2007, Nikolaidou et al, 2008). Herein two different methods are discussed for the deter-mination of ten quinolones (enoxacin, ofloxacin, norfloxa-

cin, ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid and flumequine) in chicken muscle (chicken breast muscle, pectoralis major) and egg yolk. An HPLC method with diode-array detection, at 355nm, is described for the determination of seven tetra-cyclines in chicken muscle and egg yolk: minocycline, tetracycline, oxytetracycline, methacycline, demeclocycline, chlortetracycline, and doxycycline. Chemical structures of examined quinolones and tetra-cyclines are shown in Figure 1. and Figure 2., respectively:

O

OH

NN N

O

C2H5

F

HN

N

O

OH

O

F

N

CH3

OCH3

O

NN

C2H5

F

HN

OH

O

Enoxacin Ofloxacin Norfloxacin

O

OH

NN N

O

F

HN

O

OH

F

N

N

CH3

O

OH

NN

O

F

N

H3CH2C

Ciprofloxacin Danofloxacin Enrofloxacin

O

OH

NN N

O

F

HN

F

O

OH

O

CH2CH3

O

O

N

O

OH

O

N

C2H5

H3C

Sarafloxacin Oxolinic acid Nalidixic acid

O

OH

O

F

N

CH 3 Flumequine Figure 1. Chemical structure of examined quinolones


84

OH O OH OOH

CONHR7

OH

R1 R2 R3

R4 R5 R6

12

34567

8

109

11 12

Compound Chemical name R1 R2 R3 R4

TC Tetracycline

2-naphthacenecarboxamide, 4-(dimethylamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a-pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-monohydrochloride

H CH3 OH H

OTC Oxytetracycline 5-hydroxy-tetracycline H CH3 OH OH CTC Chlortetracycline 7-chloro-tetracycline Cl CH3 OH H DC Doxycycline 6-deoxy-5-hydroxy-tetracycline H CH3 H OH

MNC Minocycline 7-dimethylamino-6-demethyl-6-deoxy-tetracycline N(CH3)2 H H H MTC Methacycline 6-methylene-5-hydroxy-tetracycline H = CH2 OH DMC Demeclocycline 6-demethyl-7chloro-tetracycline Cl H OH H

R5 = N(CH3)2, R6, R7= H Figure 2. Chemical structures of examined tetracyclines

Experiment


For quinolones, HPLC separation was performed at 25°C using an ODS-3 PerfectSil®Target (250mm x 4mm) 5μm analytical column (MZ-Analysentechnik, Germany). The mobile phase consisted of a mixture of 0.1% v/v trifluoro-acetic acid (TFA)–ACN–CH3OH, delivered by a gradient program, different for each method. In both cases caffeine was used as internal standard at the concentration of 7.5ng/μL. Column effluent was monitored using a photo-diode array detector, set at 275 and 255nm. The analytes were initially extracted from chicken muscle and egg yolk and purified by a solid phase extraction using LiChrolut RP-18 cartridges. Tetracyclines were extracted from chicken muscle with 15% TFA and 0.4M oxalate buffer (pH 4) and from egg yolk with 40% TFA and 0.4M oxalate buffer (pH 4). LiChrolut and Nexus SPE cartridges were used for further purification of chicken tissue and egg yolk extracts, respectively with 0.01M C2H2O4/CH3CN/CH3OH (40:30:30 v/v/v) as elution solvent. The separation was achieved on a Kromasil ODS-3, 5μm, 250 x 4mm, analytical column. The mobile phase, a

mixture of 0.01M oxalic acid and CH3CN, was delivered by using a gradient program. Both procedures were validated according to the Decision 2002/657/EC, determining selectivity, stability, decision limit, detection capability, accuracy, and precision.

Results and Discussion

Recoveries of quinolones varied between 96.6 and 102.8% for chicken muscle and 96.4–102.8% for egg yolk. The developed methods were validated according to the criteria of the Commission Decision 2002/657/EC. The LODs for chicken muscle varied between 5.0 and 12.0μg/kg and for egg yolk it was 8.0 μg/kg for all examined analytes. Typical chromatograms for quinolones in chicken meat and eggs, respectively, are presented in Figures 3. and 4. For tetracyclines, RSD values were lower than 11%. Overall recoveries ranged from 92–110.1% and 89–106% for chicken tissues and eggs, respectively. The decision limits CCa in chicken tissues ranged from 102.98 to 109.11 μg/kg, while detection capability CCb ranged from 113.45 to 118.18μg/kg. Respective values in eggs were 206.53–214.60μg/kg for CCa and 216.21–228.97μg/kg for CCb. Typical chromatograms of tetracyclines in chicken meat and eggs, respectively, are presented in Figures 5. and 6.

A B C D


85

Figure 3. Chromatogram of chicken muscle spiked with a mixture of the ten quinolones at the concentration of 5ng/μL and IS,

monitored at 275nm Peaks: 1. IS (7.63 min), 2. ENO (20.23 min), 3. OFL (21.31 min), 4. NOR (22.15 min), 5. CIP (23.45 min), 6. DAN 7.(25.43

min), 7. ENR (26.50 min), 8. SAR 10.(27.72 mn), 9. OXO (29.36 min), 10. NAL (32.04 min), 11. FLU (32.58 min)

Figure 4. Chromatogram of egg yolk spiked with a mixture of the ten quinolones at the concentration of 5ng/μL and IS,

monitored at 275nm Peaks: 1. IS (8.91 min), 2. ENO (13.03 min), 3. OFL (13.34 min), 4. NOR (13.57 min), 5. CIP (14.24 min), 6. DAN (14.85 min),

7. ENR (15.23 min), 8. SAR (17.52 min), 9. OXO (20.19 min), 10. NAL (25.04 min), 11. FLU (26.63 min)


86

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

-7.5

-5.0

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5mAU

355nm,4nm (1.00)

1.19

61.

325

1.50

4

1.86

7

2.95

9

4.91

0

5.60

7

6.62

2

7.91

8

8.36

4

8.90

2

9.85

2

Figure 5. High performance liquid chromatogram of spiked chicken tissue at 100μg/kg after SPE, using the conditions

described in text Peaks: 1. MNC (2.959 min), 2. OTC (4.910 min), 3. TC (5.607 min), 4. DMC (6.622 min), 5. CTC (7.918 min), 6. MTC (8.364

min), 7. DC (8.902 min), and colchicine IS (9.852 min)

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

mAU355nm,4nm (1.00)

1.15

01.

280

1.41

9 1.67

51.

833

3.04

5

4.31

8

4.96

3

5.71

4

5.99

7

6.69

56.

948

8.15

2 8.63

2

9.21

0

10.4

73

Figure 6. High performance liquid chromatogram of spiked egg yolk at 100μg/kg after SPE, using the conditions described in

text Peaks: 1. MNC (3.045 min), 2. OTC (4.318 min), 3. TC (4.963 min), 4. DMC (5.714 min), 5. CTC (6.695 min), 6. MTC (8.632

min), 7. DC (9.210 min), and colchicine IS (10.473 min)


87

Conclusions

Both methods for the determination of antibiotics in chicken meat and eggs were validated according to the European Decision 2002/657/EC, and the results of the validation process demonstrate that they are simple and suitable for any surveillance programme for veterinary drug residue in the European Union.

References

96/23/EC: Council Directive of 29 April 1996 on measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products and repealing Directives 85/358/EEC and 86/469/EEC and Decisions 89/187/EEC and 91/664/EEC. Off. J. Eur. Commun. 1996, L125, 10–32.

90/2377//EC: Council Regulation (EEC) of 26 June 1990 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin, Brussels, Belgium. Off. J. Eur. Commun. 1990, L224, 1–124.

2002/657/EC: Commission Decision of 12 August 2002 imple-menting Council Directive 96/23/EC concerning the perfor-mance of analytical methods and the interpretation of results. Off. J. Eur. Commun. 2002, L221, 8–36.

Christodoulou, Ε. A., Samanidou, V.F, Papadoyannis, I.N. (2007). Validation of an HPLC-UV method according to the European

Union Decision 2002/657/EC for the simultaneous deter-mination of ten quinolones in chicken muscle and egg yolk. J. Chromatogr. B. 859(2) 246-255.

Nikolaidou, K.I., Samanidou, V.F., Papadoyannis, I.N. (2008). Development and validation of an HPLC method for the determination of seven tetracycline antibiotics residues in chicken muscle and egg yolk according to 2002/657/EC. Liquid Chromatogr. & Rel. Technol. 31(14): 2141–2158.

Samanidou V. F., Christodoulou E. A., Papadoyannis I. N. (2005a). Recent Advances in Analytical Techniques used for the Determination of Fluoroquinolones in Pharmaceuticals and Samples of Biological Origin - a Review Article. Current Pharmaceutical Analysis, 1 (2), 155-193.

Samanidou V. F., Christodoulou E. A., Papadoyannis I. N. (2005b). Advances in Chromatographic Analyses of Fluoroquinolones in Pharmaceuticals and Biological Samples - A Review Article. Current Pharmaceutical Analysis, 1 (3) 283-308.

Samanidou V. F., Christodoulou E. A., Papadoyannis I. N. (2005c). Determination of fluoroquinolones in edible animal tissues samples, by High Performance Liquid Chromatography, after Solid Phase Extraction. J. Sep. Sci. 28(6) 555-565 (2005).

Samanidou V. F., Nikolaidou K. I., Papadoyannis I. N. (2007). Advances in Chromatographic Analysis of Tetracyclines in Foodstuffs of Animal Origin –A Review.

Separation and Purification Reviews. Volume 36 Issue 1, 1-69.

RAZVOJ I VALIDACIJA HPLC METODA ZA ODREĐIVANJE REZIDUA ANTIBIOTIKA U MESU PERADI I ŽUMANJKU JAJETA PREMA 2002/657/EC

Sažetak

Kako bi se utvrdila kvaliteta hrane i zaštitilo ljudsko zdravlje, Europska Unija regulira korištenje veterinarskih lijekova uredbom Vijeća. Uredba br. 2377/90 utvrđuje maksimalni rezidualni limit veterinarskih proizvoda u hrani životinjskog podrijetla. Europska Unija je također donijela odluku 2002/657/EC, koja definira izvršne kriterije analitičkih metoda u službenoj kontroli rezidua u proizvodima životinjskog podrijetla. Tetraciklini i kinoloni su neki od najčešće korištenih veterinarskih lijekova u stočarstvu. Piletina i jaja su vjerojatno najrasprostranjenije i najviše konzumirane namirnice životinjskog podrijetla. U ovom istraživanju su prezentirane dvije analitičke metode za određivanje HPLC rezidua kinolona i tetraciklina u mesu peradi i jajima. Ključne riječi: HPLC, rezidui antibiotika, kinoloni, tetraciklini, meso peradi, žumanjak, validacija, 2002/657/EC


DIJAGNOSTIKA KLAMIDIOZE U PTICA

Ivan Križek1, Estella Prukner-Radovčić2

1PHOENIX Farmacija d.d., Osijek, Hrvatska 2Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zavod za bolesti peradi s klinikom, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Klamidioza je zoonoza uzrokovana intracelularnom bakterijom Chlamydophila psittaci (Cp. psittaci), koja predstavlja značajan problem u veterinarskoj i humanoj medicini diljem svijeta. Obolijevaju brojne vrste divljih ptica i peradi, a dijagnostika je, za razliku od dijagnostike mnogih drugih bakterijskih bolesti, vrlo složena i opasna po laboratorijsko osoblje. U Republici Hrvatskoj se preventiva i suzbijanje bolesti obavlja prema zakonskoj odredbi. Prikupljeno je 1068 uzoraka od različitih vrsta ptica i peradi iz različitih županija Republike Hrvatske. Da bismo dokazali infekciju ptica klamidijama, uzorci (izmet, obrisak konjunktive, ždrijela i kloake, organi uginulih ptica) su pretraženi različitim dijagnostičkim postupcima. Korištene su metode ELISA, Clearview test i PCR. Od ukupno 1068 pretraženih 178 uzoraka (16,67%) je bilo pozitivno na bakteriju Cp. psittaci. Prema županijama najveći broj zabilježenih pozitivnih uzoraka potječe iz Požeško-slavonske županije (50%). Prema mjestu uzorkovanja najveći broj pozitivnih nalaza (17,21%) je potjecao od uzgajivača. Dijagnostička metoda PCR za dokazivanje prisutnosti Cp. psittaci pokazala su se kao specifična, osjetljiva i primjenjiva u dijagnostici klamidioze u ptica. Ne samo broj pozitivnih ptica na klamidiozu već i podaci o oboljelim ljudima od psitakoze u razdoblju od 1997. do 2007. godine pokazuju da ta infekcija nije samo problem veterinarske službe već je i javno zdravstveni problem, te je nužna uspostava boljeg praćenja epidemiološke situacije u Republici Hrvatskoj na državnom nivou u zajedništvu veterinarskog i javnog zdravstva. Ključne riječi: Chlamydophila psittaci, klamidioza, ptice, perad, dijagnostika

Uvod

Klamidioza (klamidofiloza, ornitoza, papagajska groznica) je kontagiozna zarazna bolest različitih vrsta ptica uzroko-vana bakterijom Chlamydophila psittaci (Cp. psittaci). Ta bakterija nazivala se sve do 1999. godine Chlamydia psittaci (Everett i sur., 1999.), pa se i dalje preporuča bolest u ptica zvati klamidiozom. Bolest predstavlja značajan problem u veterinarskoj, ali i humanoj medicini diljem svijeta. Iako se bakterija može iz-dvojiti iz različitih vrsta životinja, najčešće obolijevaju ka-vezne i divlje ptice te domaća perad. Bolest u ljudi uzrokuje bakterija Cp. psittaci porijeklom od ptica, te ju smatramo opasnom zoonozom. Očituje se sindromom koji isprva sliči gripi, pa sve do ozbiljnih sistemskih bolesti s pneumonijom i encefalitisom (Andersen i Vanrompay, 2000.). Čovjek se zarazi pri čestom i bliskom kontaktu sa zaraženim pticama, osobito papigama, golubovima i puranima, koje izlučuju uzročnika najčešće izmetom i dišnim eksudatom. Rizične

skupine su laboratorijsko osoblje, veterinari, trgovci i uzga-jatelji ptica, držaoci ptica kućnih ljubimaca te radnici na farmama i klaonicama peradi. Smatra se da je prvi zabilje-ženi slučaj bolesti uzrokovane bakterijom Cp. psittaci opisao Juergensen 1874. godine kao nepoznatu bolest u ljudi koji su bili u doticaju s pticama (Ritchie, 2007.). Zbog raširenosti u cijelome svijetu svjetska zdravstvena organizacija (WHO) tu bolest je 1982. godine odredila kao bolest od posebnog zna-čaja. Europski parlament i Vijeće uvrstili su 2003. godine klamidiozu na listu B opasnih zoonoza koje se moraju pratiti ovisno o epidemiološkoj situaciji u pojedinoj zemlji (Ano-nymous, 2003.). Uzročnik bolesti je obligatna intracelularna (unutarstanična) gram-negativna bakterija koja ima karakterističan bifazičan životni ciklus (Moulder, 1985.; Vanrompay i sur., 1995.; Entricann i sur., 2004.). Poznato je devet serovarova bak-terije Cp. Psittaci, od kojih se sedam smatra endemičnim za ptice. Pojava klamidioze do sada je zabilježena u više od 467 vrsta ptica iz 30 redova (Kaleta i Taday, 2003.).

Prof. dr. sc. Estella Prukner-Radovčić, dr. vet. med.; Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zavod za bolesti peradi s klinikom, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: ++385 1 23 90 135; fax: ++385 1 23 90 280; E-mail: [email protected]

DIJAGNOSTIKA KLAMIDIOZE U PTICA 89

Klinički oblik bolesti u ptica javlja se u akutnom, inaparent-nom i subkliničkom obliku, te kao kronična bolest ili često asimptomatska infekcija, što predstavlja dodatnu opasnost (Andersen i sur., 1997.; Sudler i sur., 2004.). U ptica i peradi klinička slika je nespecifična i očituje se znakovima sličnim za većinu drugih bolesti: proljev, gubitak tjelesne težine, nakostriješenost perja, letargija, konjunktivitis, sinusitis i povišena temperatura. Kod golubova bolest postaje klinički vidljiva uz istovremene koinfekcije, a znakovi su uglavnom ograničeni na gornji dišni sustav te smanjenu letačku spo-sobnost (Prukner-Radovčić i sur., 2005.). Klinički znakovi kod kokoši uključuju sljepoću, gubitak težine i umjereni pomor (Prukner-Radovčić i sur., 2006.). Laboratorijske dijagnostičke pretrage kojima se dokazuje prisutnost bakterije Cp. psittaci u ptica i ljudi zahtjevne su, te iako se radi o opasnoj zoonozi, još uvijek ne postoji jedin-stvena metoda. Osnovni preduvjet za uspješnu dijagnostiku klamidioze je pravilan odabir materijala za pretragu, način uzorkovanja, skladištenje te transport uzoraka do dijagno-stičkog laboratorija. Izlučivanje uzročnika iz oboljelog orga-nizma nije stalno. Zbog toga negativan nalaz pravilno uzetih uzoraka za dijagnostiku ne znači da ptica nije zaražena klamidofilom (Andersen i Vanrompay, 2003.). U Republici Hrvatskoj bolest se suzbija prema Naredbi o mjerama za za-štitu životinja od zaraznih i nametničkih bolesti i njihovom financiranju te Naputku koji se odnosi na klamidiozu. Uobi-čajene serološke metode (reakcija vezanja komplementa, inhibicija hemaglutinacije, imunodifuzija u gelu, ELISA) nisu potpuno pouzdane, jer ne dokazuju protutijela svih raz-reda i podrazreda što mogu nastati u reakciji s uzročnikom. Osim toga, veterinaru na terenu predstavljaju problem zbog otežanog uzorkovanja. Izdvajanje klamidofila na staničnim kulturama ili kokošjim zametcima te dokazivanje direktnom imunoflorescencijom dugotrajni su postupci i opasni po zdravlje laboratorijskog osoblja, pa nisu prikladni u rutinskoj dijagnostici. Uz to, tim postupcima nije moguće dokazati klamidofile koje su u transportu uginule. Ostale metode koje uključuju različita citološka i histokemijska bojanja smatraju se relativno jednostavnim za izvođenje, ali su im osjetljivost i specifičnost često nedovoljne za objektivno prosuđivanje. S obzirom na nedovoljnu obučenost veterinara da pojedinim vrstama ptica (osobito divljima i kućnim ljubimcima) ne-škodljivo izvade krv te zbog nedovoljne pouzdanosti sero-loškog postupka, od 2007. godine na inicijativu Zavoda za bolesti peradi s klinikom Veterinarskog fakulteta u Zagrebu promijenjen je tekst Naredbe. Od tada se klamidioza dijag-nosticira iz obrisaka ili fecesa živih te organa uginulih ptica, bilo imunoenzimskom metodom (ELISA) za dokaz antige-na, lančanom reakcijom polimerazom (PCR- polymerase chain reaction) ili RealTime PCR reakcijom. Takve po-stupke dijagnostike klamidioze opisuje i Međunarodni ured za epizootije (Office International des Epizoties - OIE) (Anonymous, 2004.). Cilj ovog rada je opisati učestalost na-laza te vjerodostojne dijagnostičke metode identifikacije bakterija iz porodice Chlamydophila.

Materijali i metode

Na prisutnost bakterije Cp. psittaci pretraženo je ukupno 1068 uzoraka (izmet, obrisak konjunktiva, ždrijela i kloake, te organi uginulih ptica) porijeklom od različitih vrsta ptica i peradi, koji su zaprimljeni u ovlašteni laboratorij za dijag-nostiku klamidioze na Zavodu za bolesti peradi s klinikom Veterinarskog fakulteta u Zagrebu i to iz svih županija Re-publike Hrvatske radi pretrage, bilo zbog redovite kontrole na klamidiozu ili sumnje na bolest. Pretraženo je 256 uzo-raka porijeklom od golubova, 238 porijeklom od papiga, 85 od ptica pjevica, 8 od peradi, 6 od ptica vodarica, a najveći broj uzoraka (475) potjecao je od nepoznatih vrsta ptica koje su najčešće slali uzgajivači. Uzorci su pretraženi različitim dijagnostičkim postupcima, ovisno o vrsti uzorka i porijeklu ptica.

Imunoenzimska proba (ELISA) Prikupljenih 763 uzorka pretraženo je komercijalno dostup-nim ELISA testom IDEIATM PCE Chlamydia Test (DAKO, Hamburg, Njemačka ili OXOID, UK) koji nije vrsno spe-cifičan. Prema naputku proizvođača dokazuju se lipopoli-saharidi vanjske membrane (LPS) uzročnika. Optička gu-stoća nakon imunološke reakcije vezanja antigena iz uzorka i specifičnih monoklonskih protutijela adsorbiranih na mi-krotitarske ploče (dobivene s kitom za ELISA) očitana je pri 490 nm kroz jednu do dvije minute u uređaju Labsystems iEMS Reader MF uz uporabu filtera broj pet, a izračun je prilagođen porijeklu uzorka prema naputcima Gemermana (1997.).

Clearview Chlamydia MF test Pticama (ukupno 19) uzeti su tzv. trojni obrisci (konjunk-tiva, ždrijelo, kloaka) i pretraženi brzim imuno testom Clearview Chlamydia MF test (UNIPATH LIMITED, ENGLAND) prema preporuci proizvođača, a u skladu s na-vodima iz literature (Vanrompay i sur., 1994.). Tim testom izravno se otkriva prisutnost antigena pomoću rodno speci-fičnih antiklamidijskih monoklonskih protutijela . S obzirom da je test nedovoljno specifičan i osjetljiv, postupak je pri-mijenjen najčešće u ambulanti Zavoda zbog svoje jedno-stavnosti i brzine kod ptica s vidljivim znakovima bolesti, gdje se očekivala znatna količina antigena.

PCR proba Ukupna DNA od bakterije Cp. psittaci izravno je izdvajana iz uzoraka korištenjem DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen, USA) prema naputku proizvođača, koji koristi kolonice za koje se veže DNA. U konvencionalnoj PCR reakciji umnoženi su odsječci veličine 264 parova baza dijela 5´-netranslatirajuće regije ompA gena uz odabir specifičnih početnica za bakteriju Cp. psittaci (Hewinson i sur., 1997.). Sve početnice u istraživanju sintetizirao je isti proizvođač (Invitrogen). Lančana reakcija polimerazom bila je izvedena uz 35 ponavljanih ciklusa. Dobiveni PCR pro-izvodi provjereni su elektroforezom u dva postotnom aga-roznom gelu. Za određivanje veličine dobivenih odsječaka DNA korišteno je 5 µl markera za DNA veličine 100 parova baza (Promega, SAD). Elektroforeza se odvijala pri naponu


100 V, 135-137 mA, 13-14 W tijekom 45 minuta. Nakon toga je gel osvijetljen transiluminatorom i snimljen digi-talnom kamerom. Specifičnost produkata određena je uspo-ređivanjem veličine proizvoda PCR i dijelova DNA koji sadrži standardni marker.

Rezultati

Od sveukupno pretraženih 1068 uzoraka 178 (16,67%) bilo je pozitivno. Najveći broj uzoraka (261) zaprimljen je iz Splitsko–dalmatinske županije, zatim iz Zagrebačke župa-nije i Grada Zagreba (165), Brodsko–posavske županije (87), Osječko-baranjske (85), Šibensko-kninske (82) te osta-lih županija. Od ukupnog broja pristiglih uzoraka iz trgovina

je uzorkovano 380 uzoraka od kojih su 63 (16,58%) bila pozitivna. Od uzgajivača ukupno je zaprimljen 581 uzorak od kojih je 100 (17,21%) bilo pozitivno, dok je od privatnika zaprimljeno 80 uzoraka od kojih je 12 (15%) bilo pozitivno. Iz zooloških vrtova zaprimljeno je 27 uzoraka od kojih su tri (11,11%) bila pozitivna. U Šibensko-kninskoj i Brodsko-po-savskoj županiji utvrđen je najveći udio pozitivnih uzoraka (32,9% i 32,2%). Također, Grad Zagreb i Zagrebačka županija (17%) te Splitsko-dalmatinska županija (14,9%) imale su veći broj pozitivnih uzoraka u odnosu na Osječko- -baranjsku, Primorsko-goransku i Istarsku županiju. Broj pretraženih i pozitivnih uzoraka na prisutnost bakterije Cp. psittaci, kao i njihovo porijeklo prema mjestu uzorkovanja i Županiji prikazano je na Tablici 1.

Tablica 1. Rezultati pretraga uzoraka porijeklom od ptica na klamidiozu (n=1068)

Županija Mjesto uzorkovanja Ukupno pretraženo Pozitivni uzorci % pozitivnih Trgovine 106 22 20,8 Uzgajivači 32 1 3,1 Privatnici 25 5 2,0

Zagrebačka i Grad Zagreb

ZOO vrt 2 0 0 Ukupno 165 28 17,0

Trgovine - - - Uzgajivači 1 0 0 Dubrovačko – Neretvanska Privatnici 1 0 0

Ukupno 2 0 0 Trgovine 165 28 17,0 Uzgajivači 69 6 8,7 Privatnici 17 2 11,8

Splitsko – Dalmatinska

ZOO vrt 10 3 30,0 Ukupno 261 39 14,9

Trgovine 32 7 21,9 Uzgajivači 49 20 40,8 Šibensko – Kninska Privatnici 1 0 0

Ukupno 82 27 32,9 Trgovine 4 0 0 Uzgajivači 13 2 15,4 Zadarska Privatnici 4 0 0

Ukupno 21 2 9,5 Trgovine 1 0 0 Uzgajivači 83 3 3,6 Osječko – Baranjska Privatnici 1 0 0

Ukupno 85 3 3,5 Trgovine 0 0 0 Uzgajivači 7 0 0 Vukovarsko – Srijemska Privatnici 4 0 0

Ukupno 11 0 0


Županija Mjesto uzorkovanja Ukupno pretraženo Pozitivni uzorci % pozitivnih Trgovine 0 0 0 Uzgajivači 19 9 47,4 Virovitičko – Podravska Privatnici - - -

Ukupno 19 9 47,4 Trgovine - - - Uzgajivači 25 12 48 ,0 Požeško – Slavonska Privatnici 1 1 100,0

Ukupno 26 13 50,0 Trgovine 8 1 12,5 Uzgajivači 74 25 33,8 Brodsko – Posavska Privatnici 5 2 40,0

Ukupno 87 28 32,2 Trgovine 20 0 0 Uzgajivači - - - Privatnici 5 0 0

Međimurska

ZOO vrt 1 0 0 Ukupno 26 0 0

Trgovine 1 0 0 Uzgajivači 35 2 5,7 Varaždinska Privatnici 1 1 100,0

Ukupno 37 3 8,1 Trgovine 2 0 0 Uzgajivači 17 7 41,18 Bjelovarsko – Bilogorska Privatnici 1 0 0

Ukupno 20 7 35,0 Trgovine 1 0 0 Uzgajivači 36 4 11,1 Sisačko – Moslavačka Privatnici - - -

Ukupno 37 4 10,8 Trgovine 9 3 33,3 Uzgajivači 18 5 27,8 Karlovačka Privatnici - - -

Ukupno 27 8 29,6 Trgovine 23 2 8,7 Uzgajivači 23 1 4,3 Koprivničko – Križevačka Privatnici 4 0 0

Ukupno 50 3 6,0 Trgovine - - - Uzgajivači 4 0 0 Krapinsko – Zagorska Privatnici 1 0 0

Ukupno 5 0 0


Županija Mjesto uzorkovanja Ukupno pretraženo Pozitivni uzorci % pozitivnih Trgovine 5 0 0 Uzgajivači 51 2 3,9 Primorsko – Goranska Privatnici 7 1 14,3

Ukupno 63 3 4,8 Trgovine 3 0 0 Uzgajivači 25 1 4,0 Istarska Privatnici 2 0 0

Ukupno 30 1 3,3 Ličko - Senjska ZOO vrt 14 0 0 Ukupno 14 0 0

Trgovine 380 63 16,58 Uzgajivači 581 100 17,21 Privatnici 80 12 15,00 ZOO vrt 27 3 11,11

Ukupno Sve Županije

Sveukupno 1068 178 16,67 Table 1. The results of the examination of the samples originating from the birds with chlamydiosis (n=1068)

County Sampling place Totally examined Positive samples % of positive

Shops 106 22 20,8 Breeding Facilities 32 1 3,1 Private Owners 25 5 2,0

Zagreb County And The City Of Zagreb

Zoological Gardens 2 0 0 Total 165 28 17,0

Shops - - - Breeding Facilities 1 0 0 Dubrovnik-Neretva County

Private Owners 1 0 0 Total 2 0 0

Shops 165 28 17,0 Breeding Facilities 69 6 8,7 Private Owners 17 2 11,8

Split-Dalmatia County

Zoological Gardens 10 3 30,0 Total 261 39 14,9

Shops 32 7 21,9 Breeding Facilities 49 20 40,8 Šibenik-Knin County

Private Owners 1 0 0 Total 82 27 32,9

Shops 4 0 0 Breeding Facilities 13 2 15,4 Zadar County

Private Owners 4 0 0 Total 21 2 9,5


County Sampling place Totally examined Positive samples % of positive

Shops 1 0 0 Breeding Facilities 83 3 3,6 Osijek-Baranja County Private Owners 1 0 0

Total 85 3 3,5 Shops 0 0 0 Breeding Facilities 7 0 0 Vukovar-Srijem County Private Owners 4 0 0

Total 11 0 0 Shops 0 0 0 Breeding Facilities 19 9 47,4 Virovitica-Podravina County Private Owners - - -

Total 19 9 47,4 Shops - - - Breeding Facilities 25 12 48 ,0 Požega-Slavonia County Private Owners 1 1 100,0

Total 26 13 50,0 Shops 8 1 12,5 Breeding Facilities 74 25 33,8 Brod-Posavina County Private Owners 5 2 40,0

Total 87 28 32,2 Shops 20 0 0 Breeding Facilities - - - Private Owners 5 0 0

Međimurje County

Zoological Gardens 1 0 0 Total 26 0 0

Shops 1 0 0 Breeding Facilities 35 2 5,7 Varaždin County Private Owners 1 1 100,0

Total 37 3 8,1 Shops 2 0 0 Breeding Facilities 17 7 41,18 Bjelovar – Bilogora County Private Owners 1 0 0

Total 20 7 35,0 Shops 1 0 0 Breeding Facilities 36 4 11,1 Sisak - Moslavina County Private Owners - - -

Total 37 4 10,8 Shops 9 3 33,3 Breeding Facilities 18 5 27,8 Karlovac County Private Owners - - -

Total 27 8 29,6


County Sampling place Totally examined Positive samples % of positive Shops 23 2 8,7 Breeding Facilities 23 1 4,3 Koprivnica – Križevci County Private Owners 4 0 0

Total 50 3 6,0 Shops - - - Breeding Facilities 4 0 0 Krapina – Zagorje County Private Owners 1 0 0

Total 5 0 0 Shops 5 0 0 Breeding Facilities 51 2 3,9 Primorje – Gorski Kotar

County Private Owners 7 1 14,3

Total 63 3 4,8 Shops 3 0 0 Breeding Facilities 25 1 4,0 Istra County Private Owners 2 0 0

Total 30 1 3,3 Lika – Senj County Zoological Gardens 14 0 0 Total 14 0 0

Shops 380 63 16,58 Breeding Facilities 581 100 17,21 Private Owners 80 12 15,00 Zoological Gardens 27 3 11,11

Total All Counties

Subtotal 1068 178 16,67 Pristigli uzorci porijeklom od ptica pretraživani su na prisutnost klamidofila različitim dijagnostičkim postupcima. Pomoću ELISA postupka utvrđeno je da je ukupno 121 uzorak (15%) bio pozitivan, dok je metodom PCR pre-

traženo 333 uzoraka od kojih je 97 (29%) pozitivno. Clearview Chlamydia MF testom pretraženo je 19 uzoraka od kojih su tri (6%) pozitivna (Tablica 2).

Tablica 2. Rezultati pretraga ptica na klamidiozu različitim dijagnostičkim postupcima

ELISA PCR CLEARVIEW Vrsta ptice Br. pretr.

uzor. Br. pozi.

uzor. % pozi. uzor.

Broj pretr. uzor.

Broj pozi. uzor.

% pozi.uzor.

Broj pretr. uzor.

Broj pozi.uzo.

% pozi. uzo.

Ukupno pretraženo

Golub 168 39 23 98 36 37 9 2 22 256

Papige 179 22 12 54 17 31 9 1 11 238 Ptice pjevice (kanarinac/zeba) 66 9 14 22 7 32 1 0 0 85

Perad (kokoš/puran) 6 5 83 6 1 17 0 0 0 8

Vodarice (labud/čaplja) 6 3 50 3 0 0 0 0 0 6

Nepoznate vrste ptica 338 43 30 150 36 24 0 0 0 478

UKUPNO 763 121 15 333 97 29 19 3 6 1068


Table 2. The results of the birds’ examination for chlamidophylosis by means of different diagnostic procedures

ELISA PCR CLEARVIEW

Bird Species No. of exam. samp.

No. of posit.

sam.

% of posit. samp.

No. of exam. samp.

No. of posit. samp.

% of posit. samp.

No. of exam. samp.

No. of posit. samp.

% of posit. samp.

Total of examined samples

Pigeon 168 39 23 98 36 37 9 2 22 256 Parrots 179 22 12 54 17 31 9 1 11 238 Song birds (canary / finch 66 9 14 22 7 32 1 0 0 85

Poultry (hen / turkey) 6 5 83 6 1 17 0 0 0 8

Water birds (swan / egret) 6 3 50 3 0 0 0 0 0 6

Unknown bird species 338 43 30 150 36 24 0 0 0 478

TOTAL 763 121 15 333 97 29 19 3 6 1068 Diskusija i zaključci Klamidioza ptica uzrokovana bakterijom Chlamydophila psittaci (Cp. psittaci), iako je opasna zoonoza poznata u cijelom svijetu, još uvijek nije dovoljno istražena, osobito zbog vrlo zahtjevnog postupka dijagnosticiranja. Prosječan pozitivan nalaz u 16,67% ptica pretraženih tijekom godine dana u Republici Hrvatskoj ukazuje na proširenost klami-dioze te na potencijalnu opasnost zaražavanja ljudi koji do-laze u kontakt s pticama. Dosadašnja istraživanja su pokazala veliku proširenost bakterije Cp. psittaci u svijetu, no prisutnost kod pojedinih vrsta divljih ptica i peradi nije podjednaka te je najviše zabilježena u ptica reda Psittaci-formes, a najmanje u reda Galliformes (Pavlak i sur., 2000.; Kaleta i Taday, 2003.; Prukner-Radovčić i sur., 2005.; Pospishil, 2006.). Tijekom prikupljanja uzoraka također je bilo očevidno da ih je najviše pristiglo porijeklom od golubova (256) i papiga (236), a najmanje od domaće peradi (8). Najčešće su uzorci stizali iz Splitsko–dalmatinske županije. Razlog navedenom je ne samo moguće najveći broj ptica kućnih ljubimaca koji se drži u tim krajevima Hrvatske, već i nedavno zabilježeno oboljenje ljudi u Splitu od kojih je jedan slučaj završio smrtnim ishodom. To je bio poticaj ostalim držaocima ptica za povećanu kontrolu na klamidiozu. Najveći broj prikupljenih uzoraka iz Splitsko-dalmatinske županije, te grada Zagreba sa Zagrebačkom županijom je iz trgovina kućnih ljubimaca. Naime, u nave-denim županijama, nema toliko uzgajivača kao u drugim dijelovima Republike Hrvatske. U drugim županijama je vrlo visok postotak zaraženih ptica koji se prema mjestu uzorkovanja odnosi na uzgajivače. Najveći zabilježeni broj pozitivnih uzoraka je iz Požeško-slavonske županije (50%), Virovitičko-podravske županije (47,4%), Šibensko-kninske (32,9%) te Brodsko-posavske županije (32,2%). Prema mjestu uzorkovanja ukupno u svim županijama najveći postotak pozitivnih uzoraka je porijeklom od uzgajivača

17,21%, zatim iz trgovina 16,58%, privatnika 15%, te iz zooloških vrtova 11,11%. Pozitivan nalaz iz zooloških vrtova odnosi se u većem broju slučajeva na uvezene ptice koje su bile u karanteni. Zakonska regulativa je najprihvatljivije rješenje u preventivi kao i u epidemiološkom praćenju klamidioze, jer je svijest o njezinoj kontroli još uvijek na niskom nivou. Visok postotak pozitivnih uzoraka na Cp. psittaci potvrđuje nedovoljnu educiranost uzgajivača i trgovaca ukrasnih ptica i peradi, te prisutnost „sivog“ tržišta u prodaji ukrasnih ptica u kojem nije prisutna stalna kontrola zdravstvenog statusa životinja, osobito onih neregularno unesenih iz drugih zemalja. Pro-blem je i u neregistriranim matičnim jatima, uzgajivačni-cama i prodajnim mjestima ukrasnih i sobnih ptica te go-lubova pri nadležnim veterinarskim uredima nad kojima se ne provodi zdravstvena kontrola. Iako su klamidofile gram-negativne bakterije, one zbog svog intracelularnog rasta ne rastu na uobičajenim hranjivim pod-logama te je njihova dijagnostika osobito zahtjevna. Zbog toga mnogi slučajevi oboljenja od klamidioze, kako ljudi tako i životinja, bivaju neotkriveni što pridonosi nepriklad-noj procijeni zdravstvenog rizika (Andersen i Vanrompay, 2003.; Haag-Wackernagel i Moch, 2004.). Prema naputku međunarodnog ureda za epizootije (Office International des Epizoties - OIE) za dijagnostiku Cp. psittaci preporučene su dijagnostičke metode ELISA, imunoflorescencija, PCR te izolacija uzročnika. Pojedini komercijalni kitovi za ELISA probu detektiraju klamidijski LPS antigen čiji je nedostatak što dijeli neke epitope s drugim gram-negativnim bakteri-jama pa mogu križno reagirati rezultirajući lažno pozitivnim nalazima (Bevan i Davies, 1987.). Izdvajanje bakterije Cp. psittaci bilo je poznato kao zlatni standard u dijagnostici klamidioze. Danas se izdvaja iz staničnih kultura, kokošjih zametaka i laboratorijskih životinja (bijeli miševi), no uglav-nom u znanstveno istraživačke svrhe, prije svega zbog opa-snosti od zaraze laboratorijskog osoblja te dugotrajnosti


postupka. Izolacija uzročnika je moguća jedino ukoliko ima živih bakterija u uzorku, što je u terenskoj praksi i uvjetima podložno mnogim pogreškama, kao što je pogrešno ruko-vanje uzorkom, kontaminacija i pogreške pri transportu koje dovode do lažno negativnih rezultata. U prilikama kada je potrebna brza točna dijagnoza preporučuju se pouzdane metode kao što je PCR. U izuzetnim slučajevima, kada nije moguće uzorak poslati u sofisticirani i dobro opremljeni laboratorij, ukoliko ima dovoljno prisutnog antigena moguće je klamidofile dijagnosticirati i dokazom inkluzija, bilo imu-noflorescencijom ili nekim od standardnih boljenja cito-loških preparata kao što je bojenja s akridin narančastim, metilen modrim te postupcima bojenja opisanim kao: Casta-neda, Giemsa, Gimenez, Macchiavello i Stamp (Vanrompay i sur., 1993.). Za potrebe ovog rada najčešće je korištena ELISA metoda čiji su se pozitivni rezultati smatrali relevantnim uz kliničku sliku klamidioze. Pretraženo je ukupno 763 uzorka od kojih je 15% bilo pozitivnih. Kada je bilo sumnji u nalaz po-stupkom ELISA, uzorci su dodatno pretraženi PCR postupkom. Nalaz u uzorcima (333) pretraženih PCR-om (ukupno 29% pozitivnih) smatran je vjerodostojnim zbog specifičnosti pretrage, pa se nakon dobivenog nalaza nisu dodatno pretraživali. Metoda dokazivanja prisutnosti klami-dofila s Clearview Chlamydia MF testom (test brze imuno reakcije) primjenjivana je na oboljelim pticama pri ambu-lanti za ptice Zavoda za bolesti peradi s klinikom s vid-ljivom kliničkom slikom klamidioze (ukupno 19 pretraženih ptica od kojih su 3% ili 6% bile pozitivne). Bolest prouzročena bakterijom Cp. psittaci bilježi se i kod ljudi (psitakoza) gotovo svake godine u Hrvatskoj s uče-stalošću oboljelih od jedan do 13 (2007. godine). U raz-doblju od 1997. pa do 2007. godine zabilježeno je ukupno 55 slučajeva (Aleraj, 2008., osobno priopćenje). Prije otkrivanja antimikrobnih sredstava od psitakoze je umiralo 15 do 20% oboljelih (NASPHV, 2008.), no danas je to vrlo rijedak slučaj, jer u terapiji atipičnih pneumonija primjenom širokog spektra antibiotika pacijent ipak bude izliječen. Na-žalost, nije uvijek utvrđena točna etiologija bolesti, već se vrlo često antimikrobna sredstva koriste samo u pretpostavci oboljenja od psitakoze. U istraživanjima u Republici Hrvat-skoj 1992. godine kod 805 bolesnika etiološki agens je dokazan u 238 bolesnika, od kojih je 156 imalo atipičnu pneumoniju. Od uzročnika atipične pneumonije u 10% slučajeva je utvrđena Cp. psittaci (Mlinarić-Galinović i sur., 1995.). Zbog dokazano česte prisutnosti klamidiozu bi trebalo pri-marno isključiti kod bilo koje ptice koja ima kliničke zna-kove vezane uz dišni ili probavni sustav. Na taj način ćemo uvelike moći predvidjeti mogućnost prijenosa na ljude i utvrditi stupanj opasnosti za čovjeka. Rezultati pojavnosti psitakoze u ljudi i klamidioze ptica dokazuje važnost pravovremene i sigurne dijagnostike ove bolesti kao važnog preduvjeta zaštite zdravlja ljudi, osobito uzgajivača i držaoca ptica kućnih ljubimaca, te radnika u intenzivnoj peradarskoj proizvodnji. Rastući trend povećanja ekološke proizvodnje peradi zahtijevat će povećanu kontrolu

nad divljim pticama kao potencijalnim prenosiocima razli-čitih vrsta klamidofila.

Zahvala

Prikazani rezultati proizašli su iz znanstvenog projekta “No-ve mogućnosti suzbijanja bakterijskih bolesti peradi i drugih ptica”, provedenog uz potporu Ministarstva znanosti, obra-zovanja i športa Republike Hrvatske.

Literatura

Andersen, A. A., D. Vanrompay (2000.): Avian chlamydiosis. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 19, 396–404.

Andersen, A. A., D. Vanrompay (2003.): Avian Chlamydiosis (Psittacosis, Ornithosis). U: Disease of Poultry. 11th ed. (Saif, Y. M., H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougland, D. E. Swayne, ur.). Iowa State University Press. Ames Iowa. str. 863-879.

Andersen, A. A., J. E. Grimes, P. B. Wyrick (1997): Chlamydiosis (Psittacosis, Ornithosis). U: Disease of Poultry. 10th ed. (Ur.: B. W. Calnec, H. J. Barnes, C. W. Beard, L. R. McDougald, Y. M. Saif. Mosby-Wolfe). 333-349.

Anonymous (2003.): EU DIRECTIVE 2003/99/EC. Anonymous (2004.): OIE (Office International des Epizooties) :

Avian Chlamydiosis. Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. 5th Edition, Part 2, Section 2.7, Chapter 2.7.4., Pariz, Francuska

Bevan, B. J., M. Davies (1987.): ELISA kit for Chlamydia psittaci detection. Vet. Rec. 120, 24.

Entrican, G., S. Wattegedera, M. Rocchi, D. C. Fleming, R. W. Kelly, G. Wathne, V. Magdalenic, S. E. M. Howie (2004.): Induction of inflammtory host immune response by organisms belonging to genera Chlamydia/Chlamydiphila. Vet. Immunol. Immunop. 100, 179-186.

Everett, K. D. E., R. M. Bush, A. A. Andersen (1999.): Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 415–440.

Haag-Wackernagel, D., H. Moch (2004.): Health hazards posed by feral pigeons. J. Infection 48, 307-313.

Hewinson, R. G., P. C. Griffiths, B. J. Bevan, S. E. S. Kirwan, M. E. Field, M. J. Woodward, M. Dawson (1997.): Detection of Chlamydia psittaci DNA in avian clinical samples by polymerase chain reaction. Vet. Microbiol. 54, 155-166.

Kaleta, E. F., E. M. Taday (2003.): Avian host range of Chlamydophila spp. based on isolation, antigen detection and serology. Avian Pathol. 32, 435–462.

Mlinarić-Galinović, G., B. Turković, A. Hodalin, J. Božikov (1995.): Most frequent clinical pictures caused by respiratory viruses, Mycoplama pneumoniae, Coxiella burnettii and Chlamydia psittaci. Acta medicorum 21, 23-30.

Moulder, J. W. (1985.): Comparative Biology of Intracellular Parasitism. Microbiol. Rev. 49, 298-337.

NASPHV (National Association of State Public Health Veterinarians) (2008.): Compendium of measures to control Chlamydophila psittaci infection among humans (psittacosis) and pet birds (avian chlamydiosis). Dostupno na http://www.nasphv.org


Pospischil, A. (2006.): From disease to etiology-historic aspects of Chlamydia related disease in animals and humans. Proceedings of the Fourth Annual Workshop of COST Action 855 Animal Chlamydioses and Zoonotic Implications, 3-5 rujan. Edinburgh, Scotland, Velika Britanija, 38-39.

Pavlak, M., K. Vlahović, J. Gregurić, Ž. Župančić, J. Jerčić, J. Božikov (2000.): An epidemiologic study of Chlamydia sp. in feral pigeons (Columba livia domestica). Z. Jadgdwiss. 46, 84-95.

Prukner–Radovčić, E., D. Horvatek, Ž. Gottstein, I. Ciglar Groz-danić, H. Mazija (2005.): Epidemiological investigation of Chlamydophilla psittaci in pigeon and other free–living bird in Croatia. Vet. Res. Comm. 29 (Suppl.1.), 17-21.

Prukner-Radovčić, E., D. Horvatek, Ž. Mišković, H. Mazija (2006.): Chlamydophilosis in laying hens: a case report. U: Diagnosis, Pahogenesis and Control of Animal Chlamydioses (Longbottom, D., M. Rocchi, ur.). Moredun Research Institute, Edinburgh, Midlothian, Škotska, Velika Britanija, 82-83.

Ritchie, B. W. (2007): Management of common infectious diseases in companion birds. 9th European AAV conference, 27-31. ožujak. Zürich, Švicarska, 30-54.

Sudler, C., L. E. Hoelzle, I. Schiller, R. K. Hoop (2004): Molecular characterisation of chlamydial isolates from birds. Vet. Microbiol. 98, 235-241.

Vanrompay D., A. A. Andersen, R. Ducatelle, F. Haesbrouck (1993. b): Serotyping of European Isolates of Chlamydia psittaci from Poultry and Other Birds. J. Clin. Microbiol. 31, 134-137.

Vanrompay, D., A. Van Nerom, R. Ducatelle, F. Haesebrouck (1994.): Evaluation of five immunoassays for detection of Chlamydia psittaci in cloacal and conjuncival speciemens from turkeys. J. Clin. Microbiol. 32, 1470-1474.

Vanrompay, D., R. Ducatelle, F. Haesebrouck (1995.): Chlamydia psittaci infection: a review with emphasis on avian chlamydiosis. Vet. Microbiol. 45, 93-119.

DIAGNOSTIC CHLAMYDIOSIS IN BIRDS

Summary

Chlamydiosis is a zoonosis caused by intracellular bacteria Chlamydophila psittaci (Cp. psittaci), which represents a significant problem in veterinary and humane medicine all over the world. Numerous wild and domesticated bird species fall ill, and the diagnostics, compared to many other bacterial illnesses, is very complex and dangerous for laboratory personnel. In the Republic of Croatia, prevention and the illness control is carried out according to the law provisions. 1068 samples have been collected from various species of wild and domesticated fowl in various counties of the Republic of Croatia. In order to confirm the infection of birds by Chlamydia, samples (droppings, the swap of conjunctiva, pharynx and cloaca, the organs of perished birds) were examined by means of different diagnostic procedures. The methods applied were ELISA, Clearview test and PCR. Of the totally 1068 examined samples, 178 (16.67%) were positive for the bacteria Cp. Psittaci. According to the counties, the largest number of recorded positive samples derives from Požega-Slavonia County (50%). According to a place of sampling, the largest number of positive findings (17.21%) originated from breeders. Diagnostic method of PCR for evidencing the presence of Cp. psittaci has been shown as specific, sensitive and applicable in the diagnostics of chlamydiosis in birds. Not only the number of the birds positive for chlamydiosis but also the data on the people fallen ill with psittacosis during the period from 1997 through 2007 showed that this infection is not only a problem of veterinary service, but also a public health service problem so that establishing better monitoring of epidemiologic situation in the Republic of Croatia is necessary at the level of the State in cooperation with veterinary and public health service. Key words: Chlamydophila psittaci, chlamydiosis, birds, poultry, diagnostics


HEALTH STATUS OF BREEDING PHEASANTS IN SLOVENIA

Marko Zadravec1, Brigita Slavec1, Jožko Račnik1, Aleksandra Vergles Rataj2, Alenka Dovč1, Cvetka Marhold1 Olga Zorman-Rojs1

1 Institute of Poultry Health and Protection, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia 2 Institute for Microbiology and Parasitology, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia

Summary

Among game birds, pheasants are the most important breeding animals in Slovenia. There is a lack of knowledge concerning the health status of pheasants, since they can act as a reservoir of many important avian and zoonotic diseases. In Slovenia there are four major breeding farms with a population of approximately 10.000 birds per location. Three of these farms are located in the southeastern part of Slovenia which shows a very high density of intensive poultry population. In our study a total of 100 adult pheasants from four farms were included. Twenty-five pheasants were randomly caught and sampled from each farm. For serological investigations, blood samples were taken and examined on the presence of specific antibodies to: Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Salmonella Enteritidis, Marble Spleen Disease Virus, Avian Influenza Virus and Newcastle Disease Virus (Paramyxovirus-1). Molecular methods were used for detection of Mycoplasma spp., Chlamidophyla spp. and Marble Spleen Disease Virus in cloacal and pharyngeal swabs. Blood smears and fecal samples were randomly collected for parasitological examinations. Key words: pheasants, health status, serology, molecular methods, parasitology Introduction Among game birds, pheasants are the most important breeding animals in Slovenia. Three pheasantries are located in the southeastern part and one in the northwestern part of Slovenia. There are two major breeding farms with their own hatchery and rearing facilities that provide pheasants also for abroad. The other two farms are specialised in rearing pheasants from seven weeks to adults which are mostly released for hunting purposes. All pheasants over seven weeks of age are kept in semi-wild conditions in larger enclosures. The approximate number of pheasants on all farms is estimated around 15.000 in the non-breeding season and at the end of the year. At the peak of the breeding season, their number is estimated around 55.000 to 65.000 (MKGP-VURS, 2006). Breeding pheasants can serve as a reservoir and vectors for many specific pathogens important for animal and human diseases. In order to achieve some data on their health status and to predict the risk of their introduction into the natural environment, we performed serological, molecular and parasitological investigations. The serological monitoring

included the detection of antibodies against: Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma synoviae (MS), Salmonella Enteritidis, Marble Spleen Disease Virus (MSDV), Avian Influenza Virus (AIV) and Newcastle Disease Virus (NDV) (Paramyxovirus-1). Molecular methods were used for the detection of Mycoplasma spp., Chlamidophyla spp. and MSDV in cloacal and pharyngeal swabs. For parasitological examinations, blood smears and fecal samples were randomly collected.

Material and methods

Samples A total of 100 adult pheasants were sampled. One hundred blood samples, cloacal and pharyngeal swabs were taken, 25 from each of the four farms. From each animal approximately 2.5 ml of blood samples were collected from the wing vein (vena ulnaris cutanea). The sera were stored at -20 °C until testing. Cloacal and pharyngeal swabs were stored at -70 °C until isolation of DNA was performed. Seventy-five blood smears and random fecal samples (7 or 8 samples per farm) were obtained from 3 farms.

Marko Zadravec, DVM, Institute of Poultry Health and Protection, Veterinary Faculty, University of Ljubljana, Cesta v Mestni Log 47, 1000 Ljubljana, Slovenia; E-mail: [email protected]

HEALTH STATUS OF BREEDING PHEASANTS IN SLOVENIA 99

Serological methods For the detection of antibodies against Salmonella Enteriti-dis, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Flock-chek® IDEXX Laboratories Inc.) was performed according to the manufacturer’s instructions. Commercially available MG and MS antigens (Nobilis® Intervet) were used for the detection of specific antibodies against MG MS by rapid plate agglutination test (RPA). The test was conducted according to the standard procedure (OIE, 2004). Antibodies against MSDV were detected by the agar gel immunodiffusion test (AGID) (Swayne et al, 1998). For the detection of antibodies against AIV, ELISA (Flock-chek® AI Multi-Screen Ab Test Kit, IDEXX, Laboratories Inc.) was performed according to the manufacturer’s instructions. Specific antibodies against NDV were measured by the standard hemagglutination inhibition (HI) test, using 4 hemagglutinating units (4 HAU) of La Sota antigen and 1% chicken erythrocytes. The test was performed in micro plates (Swayne et al, 1998).

Molecular methods Cloacal and pharyngeal swabs were placed in 2,0ml of PBS and rigorously vortexed before DNA extraction. Total DNA used in this study was extracted from 400µl of cloacal and pharyngeal swabs using the QiaAmp DNA Mini-kit (Qia-gen, GmbH), according to the manufacturer’s instructions.

MSDV For PCR detection of MSDV hexon gene, the primers HEV1F and HEV2R (Hess, 2000) were used. The PCR assay was performed with Qiagen HotStarTaq® Plus DNA Polymerase (Qiagen, GmbH) in a 25μl reaction. The pro-gram profile consisted of 5min at 95 ºC for initial denatu-ration, followed by 35 cycles of 1min at 94 ºC, 30s at 50 ºC, 1min 30s at 72 ºC, with a final extension of 10min at 72 ºC.

Mycoplasma spp. For the detection of Mycoplasma’s 16S rDNA, universal 16S rDNA primers, described by Johansson et al. (1998) with some modifications, were used. The forward primer U4 and the reverse primer U8-RSP were used directly for amplification of 3S and of 16S rRNA gene. The PCR assay was performed with Qiagen HotStarTaq® Plus DNA Polymerase (Qiagen, GmbH) in a 25μl reaction. The program profile consisted of 5min at 95 ºC for initial denaturation, followed by 33 cycles of 15s at 96 ºC and 2min at 68 ºC, with a final extension of 5min at 72 ºC. The reaction products were analysed by electrophoresis on a 1.8% ethidium bromide stained agarose gel. DNA fragments were excised from the gel and the PCR products were purified with the Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega Corp., Madison WI, USA) following the manufacturer’s instructions. Purified PCR products were

sequenced by the dideoxy-mediated chain-termination method using ABI Prism BigDye terminator v.1.1. cycle sequencing kit (PE Applied Biosystem, USA) as described by the manufacturer. For sequencing the U4 or U8-RSP, a primer was used. The sequencing product was purified with Ethanol/EDTA precipitation in accordance with instructions of the manufacturer (PE Biosystem, USA). Sequences were analysed with an automated nucleic acid analyser (ABI Prism 310 PE Applied Biosystem, USA). Sequence data were assembled and edited using Chromas v.1.45 (http://www.technelysium.com.au/chromas14x.html) and MEGA v.4.0 (Tamura et al, 2007). Analyses of nucleotide sequences were conducted using NCBI Blast program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Chlamidophyla spp. For the detection of Chlamidophyla spp., universal primers and probe for 23S rDNA, as described by Borel et al. (2008), were used. Real time PCR (RT-PCR) was conducted in 96-well microtiter plates on an ABI 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA). The forward primer Ch23S, the reverse primer Ch23S and the specific probe Ch23S-p were used in 25μl reactions The assay was performed with QuantiFast probe PCR kit (Qiagen, GmbH). The temperature-time profile was 3min at 95 ºC for initial denaturation, followed by 40 cycles of 5s at 95 ºC and 30s at 60 ºC where the fluorescence data were acquired.

Parasitological methods Sedimentation and flotation of fecal samples were per-formed. Samples were examined with light microscope under 100× or 400× magnification. Blood smears were air-dried and stained with Giemsa. They were examined and blood parasites were determined with light microscope under oil immersion (1000× magnifi-cation).

Results

Serology The results of the serological investigations are shown in Table 1. Eleven of twenty-five (44%) pheasants on farm 1, 17 of 25 (68%) on farm 2, 12 of 25 (48%) on farm 3, and 8 of 25 (32%) pheasants on farm 4 had antibodies against MG detected by RPA. Fourteen of twenty-five (56%) pheasants on farm1, 18 of 25 (72%) on farm 2, 10 of 25 (40%) on farm 3, and 4 of 25 (16%) pheasants on farm 4 had detectable antibodies against MS by RPA test. All tested animals were negative for the presence of antibodies against Salmonella Enteritidis, MSDV and AIV. Six of twenty-five pheasants (24%) on farm 1 had antibodies against NDV (titers ranged from 1:8 to 1:32). All animals from farms 2, 3 and 4 were tested negative for the presence of antibodies against this virus.


Table 1. Results of serological investigations in pheasants

Method Positive birds/Total birds tested (%) Infectious agent

Farm 1 Farm 2 Farm 3 Farm 4

Mycoplasma gallisepticum RPA1 11/25 (44%) 17/25 (68%) 12/25 (48%) 8/25 (32%)

Mycoplasma synoviae RPA1 14/25 (56%) 18/25 (72%) 10/25 (40%) 4/25 (16%)

Salmonella Enteritidis blocking ELISA 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%)

Marble Spleen Disease Virus AGID2 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%)

Avian Influenza Virus ELISA 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%)

Newcastle Disease Virus HI3 6/25 (24%) 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%)

1 rapid plate agglutination test 2 agar gel immunodiffusion test 3 inhibition hemagglutination test Molecular methods The results of the investigations of cloacal and pharyngeal swabs with molecular methods are shown in Table 2. Table 2. Results of investigations by molecular methods

Method Positive birds/Total birds tested (%) Infectious agent


Mycoplasma spp. PCR 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%)

Chlamidophyla spp. Real-time PCR 1/25 (4%) 8/25 (32%) 0/25 (0%) 0/25 (0%)

Marble Spleen Disease Virus PCR 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%) 0/25 (0%) All samples tested for Mycoplasma spp. from pharyngeal swabs and MSDV from cloacal swabs by PCR methods were negative. In total, 9% of all pheasants were positive on the presence of Chlamidophyla spp. in cloacal swabs. One of twenty-five (4%) pheasants was positive on farm 1, and 8 of 25 (32%) pheasants were positive on farm 2. All the animals tested on farm 3 and 4 were Chlamidophyla spp. negative.

Parasitology

The results of the parasitological investigations are shown in Table 3. Table 3. Results of parasitological examinations

Positive birds/Total birds tested (%) Infectious agent


Eimeria spp. ND 0/8 (0%) 4/8 (50%) 3/7 (43%)

Capillaria sp. ND 0/8 (0%) 3/8 (38%) 2/7 (29%)

Syngamus sp. ND 0/8 (0%) 2/8 (25%) 4/7 (58%)

Ascaridia sp. ND 0/8 (0%) 0/8 (0%) 1/7 (14%)

Haemosporidia ND 0/25 (0%) 2/25 (8%) 1/25 (4%) *ND – not done


All fecal samples tested on farm 2 were negative on the presence of endoparasites. On farm 3, four of eight (50%) fecal samples contained Eimeria spp., 3 of 8 (38%) were positive on Capillaria sp. and 2 of 8 (25%) contained Syngamus sp. On farm 4, three of seven (43%) fecal samples were positive on Eimeria spp., 2 of 7 (29%) on Capillaria sp., 4 of 7 (58%) on Syngamus sp. and 1 of 7 (14%) was positive on the presence of Ascaridia sp. Haemosporidia were confirmed in 2 of 25 (8%) pheasant’s blood smears on farm 3 and in 1 of 25 (4%) pheasants tested on farm 4. All 25 pheasants tested on farm 2 were free of blood parasites. On farm 1 parasitological investigation were not performed.

Discussion and conclusions

Since now, very little has been known about the health status of breeding pheasants in Slovenia. In 2003, a work on the characterisation of Mycoplasma gallisepticum strains invol-ved in the respiratory disease in pheasants was published by Benčina et al. (2003). Račnik et al. (2005) included pheasants in a research of the health status of backyard flocks in Slovenia in 2004 and in an epidemiological study of AI and West Nile fever in birds in Slovenia from 2003 until 2006 (Račnik, 2008). While some of the biggest pheasant farms, which release pheasants in nature for hunting purposes, are located in the southeastern part of Slovenia with a very high density of intensive poultry population, the health status of ringed-necked pheasants in view of prevalence of infectious diseases was estimated. Pheasants are highly susceptible to infection with NDV (Kaleta and Baldauf, 1988, Aldous and Alexander, 2006). Recent outbreaks took place in Italy (Capua et al., 1994), Denmark (Jorgensen et al., 1999) and Great Britain (Alexander et al., 1997, Aldous et al., 2007). Clinical signs are considerably variable from asymptomatic birds to high mortality with rapid onset (Kaleta and Baldauf, 1988). In our study, we detected low antibody titers against NDV on only one farm. All samples from the other three farms were negative. Very low prevalence and low antibody titers are probably due to fact, that only breeding flocks have to be vaccinated, however, samples were collected before they were designated as breeding animals and therefore before vaccination. Pheasants are demonstrated to be susceptible to infection with AIV of 15 hemagglutinin subtypes. Moreover, they can shed the virus up to 45 days post infection and can so serve as a long–term source of AIV (Humberd et al, 2006, Humberd et al, 2007). We did not find any serological positive reactor in the tested pheasants. MG is one of the most common infectious agents of the upper respiratory tract in pheasants. It is a common cause of infectious sinusitis in the late summer and autumn. Clinical signs include conjunctivitis with epiphora, sinusitis and dyspnea. Several other Mycoplasma spp. organisms can be present in pheasants, but they do not seem to be pathogenic (Welchman, 2008). An outbreak of MG in Slovenia is

described by Benčina et al. (2003). Clinical signs of conjunctivitis, swollen infraorbital sinuses, nasal exudates and tracheal rales were observed in a flock of 80 backyard pheasants. Within two weeks almost all animals were affected and the mortality reached almost 20% (Benčina et al., 2003). A similar outbreak appeared in a backyard game bird operation in California, USA (Cookson and Shiva-prasad, 1994). Our serological investigation on MG and MS revealed that almost 50% of the tested pheasants had specific antibodies against MG and MS. Although 84% of tracheal swabs were tested positive on ribosomal 16S RNA gene by PCR, further examinations with sequencing PCR products were negative to Mycoplasma spp. Anyway, the results of this study confirmed that MG and MS are widely distributed in the Slovenian pheasants’ population. Among the diseases with a possible impact on the public health we focused on salmonellosis and chlamydiosis. Many of Salmonella enterica serovars were isolated from phea-sants, including serovar Enteritidis (Myoujin et al, 2003, Hosie and Grant, 1990). Most of Salmonella’s pathogenic activity is limited to its first few days of life, but cases of outbreaks in older pheasant chicks occur, too (Welchman 2008, Myoujin et al., 2003, Wieliczko et al., 2003). In our study all animal tested for antibodies against Salmonella enterica serovar Enteritidis were negative. A study of prevalence of Chlamydophila psittaci in phea-sants was performed in the Slovak Republic in 2002. A total of 275 pheasants, without clinical signs of chlamydiosis, were tested and seropositivity oscillated between 31.5 - 40.4% (Travnicek et al., 2002). In 1997 Dovč (1998) tested 39 pheasants from two flocks in Slovenia. Indirect immuno-fluorescence assay was performed. Specific antibodies against Chlamydophila psittaci were found in 11 pheasants (28,2%). In our study, 9% of the tested pheasants were positive with RT-PCR. So far, the prevalence of Chlamy-dophila psittaci in our pheasantries is low, but further monitoring is needed since pheasants in Slovenia have been serologically positive in 1997 and evidence of the infectious agent was also confirmed in the present study. MSD is one of the most important viral diseases of phea-sants. The virus is widely distributed all over the world (Wieliczko et al., 2003, Fitzgerald and Reed, 1989, Fitzgerald et al., 1995). In Slovenia in 2004, 70% of clinically healthy pheasants were serologically positive (Račnik et al., 2005). In a recent study all results were negative, although the birds were tested by both indirect and direct diagnostic methods. Endoparasites are a common finding in breeding pheasants and preventive treatment with licensed antiparasitic drugs should be performed regularly (Welchman, 2008). In our study, parasitological examinations were performed only on three farms. One farm was completely negative on the presence of endoparasites. On farms 3 and 4, infestation with Eimeria spp., Capillaria sp. and Syngamus sp. were confirmed. Furthermore, Ascaridia sp. was found on farm 4.


Some animals on farm 4 exhibited dyspnea, most likely in connection with Syngamus sp. infection. Haemosporidia was confirmed in three blood smears. Plasmodium juxtanucleare is found to infect a variety of wild and captive birds mainly belonging to the Phasanidae (Omori et al., 2007, Murata et al., 2008). Haemosporidia found in our study morphologically strongly resembles protozoa of fam. Plasmodiidae. If so, Plasmodium sp. would be confirmed for the first time in Slovenia in non-migratory birds. Further molecular examinations have to be done for confirmation of Plasmodium sp. and its possible circulation in the population of birds in Slovenia. We can conclude that the general health status of pheasants is quite good. There was no evidence of notifiable diseases such as AI and ND, or of specific infectious agents such as MSD. All birds were negative to SE, and the incidence of Chlamydophila psittaci is not alarming for the public health. The serological confirmation of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae should lead to precaution and indicated that monitoring should be established. The control of endoparasites should be based on preventive programs of treatment with licensed antiendoparasitic drugs as recommended by the manufacturers.

Acknowledgement

The authors wish to thank Darja Krelj, Marko Bogataj and Boštjan Flajnik for their technical assistance. The help from Petra Bandelj and Maja Čonč during the sampling proce-dures is highly appreciated.

References

Aldous, E.W., Alexander, D.J., (2008): Newcastle Disease in Pheasants (Phasianus colchicus): A Review. Vet. J. 175, 181 – 185.

Aldous, E.W., Manvell, R.J., Cox, W.J., Ceeraz, V., Harwood, D.G., Shell, W., Alexander, D.J., Brown, I.H. (2007): Outbreak of Newcastle Disease in Pheasants (Phasianus colchicus) in South-East England in July 2005. Vet. Rec. 160, 482 – 484.

Alexander, D.J., Manvell, R.J., Frost, K.M., Pollitt, W.J., Welchman, D., Perry, K. (1997): Newcastle Disease Outbreak in Pheasants in Great Britain in May 1996. Vet. Rec. 140, 20 – 22.

Benčina, D., Mrzel, I., Zorman Rojs, O., Bidovec, A., Dovč, A. (2003): Characterisation of Mycoplasma gallisepticum Stains Involved in Respiratory Disease in Pheasants and Peafowl. Vet. Rec. 152, 230 – 234.

Borel, N., Kempf, E., Hotzel, H., Schubert, E., Torgerson, P., Slickers, P., Ehricht, R., Tasara, T., Pospischil, A., Sachse, K. (2008): Direct Identification of Chlamydiae from Clinical Samples Using a DNA Microarray Assay – A Validation Study. Molecular and Cellular Probes. 22, 55 – 64.

Capua, I., Manvell, R.J., Antonucci, D., Scaramozzino, P. (1994): Isolation of the Pigeon PMV 1 Variant of Newcastle Disease Virus from Imported Pheasants (Phasianus colchicus). Zentralblatt fur Veterinarmedizin B. 41, 243 – 249.

Cookson, K. C., Shivaprasad, H. L. (1994): Mycoplasma gallisep-ticum Infection in Chukar Partridges, Pheasants and Peafowl. Avian Dis. 38, 914 – 921.

Dovč, A. (1998): Klamidioza (Chlamydia psittaci) pri domačih in divjih pernatih živalih v Sloveniji. Doktorska disertacija.

Fitzgerald, S.D., Reed, W.M. (1989): A Review of Marble Spleen Disease of Ringed-Necked Pheasants. J. Wild. Dis. 25(4), 455 – 461.

Fitzgerald, S.D., Reed, W.M., Furukawa, A.M., Zimels, E., Fung, L. (1995): Effect of T-Lymphocyte Depletion on the Patogenesis of Marble Spleen Disease Virus Infection in Ringed-Necked Pheasants. Avian Dis. 39, 68 - 73

Hess, M., (2000): Detection and Differentiation of Avian Adenoviruses: a Review. Avian Pathol. 29, 195 – 206.

Hosie, B.D., Grant, D.A. (1990): Salmonella enteritidis Infection in Pheasant Chicks and Poults. Vet. Rec. 126, 39 – 40.

Humberd, J., Guan, Y., Webster, R.G. (2006): Comparison of the Replication of Influenza A Viruses in Chinese Ringed-Necked Pheasants and Chukar Partridges. J. Virol. 80(5), 2152 – 2161.

Humberd, J., Boyd, K., Webster, R.G. (2007): Emergence of Influenza A Virus Variants after Prolonged Shedding prom Pheasants. J. Virol. 81(8), 4044 – 4051.

Johansson, K.E., Heldtander, M.U.K., Pettersson, B.(1998): Characterization of Mycoplasmas by PCR and Sequence Analysis with Universal 16S rDNA Primers. Meth. Molec. Biol. 104, 145 – 165.

Jorgensen, P.H., Handgerg, K.J., Ahrens, P., Hansen, H.C., Manvell, R.J., Alexander, D.J. (1999): An outbreak of Newcastle Disease in Free-living Pheasants (Phasianus colchicus). J Vet. Med. Series B 46, 381 – 387.

Kaleta, E.F., Baldauf, C. (1988): Newcastle Disease in Free-living and Pet Birds. In: Alexander, D.J. (Ed.), Newcastle Disease. Kluwer Academic Publishers, Boston. 197 – 246.

Murata, K., Nii, R., Sasaki, E., Ishikawa, S., Sato, Y., Sawabe, K., Tsuda, Y., Matsumoto, R., Suda, A., Ueda, M. (2008): Plasmodium (Bennettinia) juxtanucleare Infection in a Captive White Eared-Pheasant (Crossoptilon crossoptilon) at a Japanese Zoo. J. Vet. Med. Sci. 70(2), 203 – 205.

MKGP-VURS. (2006) Predlogi programov cepljenja perutnine in ptic proti aviarni influence v Republiki Sloveniji in ocena dejavnikov tveganja, http://www2.vf.uni-lj.si/veterina/predmeti/IPSUV/Sodna/Program%20cepljenja%20ptic%20proti%20AI.pdf, (January 22th 2009).

Myoujin, Y., Yona, R., Umiji, S., Tanimoto, T., Otsuki, K., Murase, T. (2003): Salmonella enterica subsp. Enterica Serovar Agona Infections in Commercial Pheasant Flocks. Avian Pathol. 32(4), 355 – 359.

OIE. (2004): OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees). 5th edition. Office International Des Epizooties. Paris

Omori, S., Sato, Y., Isobe, T., Yukawa, M., Murata, K. (2007): Complete Nucleotide Sequences of the Mitochondrial Genomes of Two Avian Malaria Protozoa, Plasmodium gallinaceum and Plasmodium juxtanucleare. Parasitol. Res. 100, 661 – 664.

Račnik., J. (2008): Epidemiološka študija aviarne influence in bolezni zahodnega Nila (West Nile) pri pticah v Sloveniji. Doktorska dizertacija.

Račnik, J., Krapež, U., Dovč, A., Volk, M., Emeršič, I., Zorman Rojs, O., (2005): Health Status of Backyard Flocks in Slovenia


– some Preliminary Data. Peradarski dani VI. Poreč. Zbornik radova, 119 – 122.

Swayne, D.E., Glisson, J.R., Jackwood, M.W., Pearson, J.E., Reed, W.M. (1998): A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avia Pathogens, 4th edition, Rose Printing, Tallahassee, Florida.

Tamura, K.J., Dudley, M.N., Kumar, S. (2007): MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, 1596 – 1599.

Travnicek, M., Cislakova, L., Deptula, W., Stosik, M., Bhide, M.R. (2002): Wild Pigeons and Pheasants – a Source of Chlamydophila psittaci for Humans and Animals. Ann. Agric. Eviron. Med. 9(2), 253 – 255.

Welchman, D. (2008): Diseases in Young Pheasants. In Practice. 30, 144 – 149.

Wieliczko, A., Tomanek, B., Kuczkowski, M. (2003): Prevalence of Infectious Diseases in Ringed-Necked Pheasant Flocks in Poland. Pol. J. Vet. Sci. 6(3), 177 – 182.

ZDRAVSTVENI STATUS FAZANA U UZGOJU U SLOVENIJI

Sažetak

Fazani za lov su najvažnije uzgojne životinje u Sloveniji. Nedostatna su saznanja o zdravstvenom stanju, jer djeluju kao rezervoar mnogih važnih ptičjih bolesti i zoonoza. U našoj zemlji postoje četiri velike farme za uzgoj s populacijom od otprilike 10 000 ptica po lokaciji. Tri farme su locirane u jugoistočnom dijelu Slovenije s visokom gustoćom intenzivne populacije peradi. U našem istraživanju uključeno je ukupno 100 odraslih fazana sa četiri farme. Dvadeset i pet fazana sa svake farme su nasumično uhvaćeni i uzorkovani. Za serološka istraživanja uzeti, su uzorci krvi te ispitivani na prisutnost specifičnih protutijela protiv Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Salmonella Enteritidis, virusa mramoraste slezene, virusa influence ptica i virusa Newcastle bolesti (Paramyxovirus tip 1). Korištene su molekularne metode za detekciju Mycoplasma spp., Chlamidophyla spp. i virusa bolesti mramoraste slezene u obriscima kloake i ždrijela. Razmaz krvi i uzorci stolice su nasumično prikupljeni za parazitološka ispitivanja. Ključne riječi: fazani, zdravstveno stanje, serologija, molekularne metode, parazitologija


PAD NESIVOSTI U LAKIH HIBRIDA KOKOŠI UZROKOVAN AVIJARNIM ENCEFALOMIJELITISOM

Dino Krstulović1, Marina Biđin2, Vladimir Savić3, Zdenko Biđin2

1 VETERINA d.o.o., Kalinovica, Rakov Potok, Hrvatska 2 Zavod za bolesti peradi s klinikom, Veterinarski fakultet, Hrvatska 3 Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Hrvatska

Sažetak

Epizootiološko istraživanje avijarnog encefalomijelitisa provedeno je na dvije farme (A i B) konzumnih nesilica različite dobi s neobjašnjenim padom nesivosti. U farmi A mlađe je jato (A1) bilo u dobi 32 tjedna, a starije jato (A2) u dobi 48 tjedana, te su oba necijepljena. Jato nesilica farme B bilo je cijepljeno protiv AE u dobi 100 dana. Serumi su pretraženi imunoenzimnom probom (ELISA). Titar u A1 jatu iznosio je 7296, u jatu A2 5357, dok je u cijepljenom jatu (B) bio 4975. Serološke pretrage necijepljenih jata potvrđuju prirodnu infekciju kokoši virusom AE, čime se objašnjava i pad nesivosti za 18,2% (jato A1), odnosno 18,6% (jato A2). Ključne riječi: avijarni encefalomijelitis, nesilice jaja za konzum, imunoenzimna proba, pad nesivosti, cijepljenje Uvod Avijarni encefalomijelitis (AE) je pikornavirusna zaraza koja izaziva veliki pomor pilića, a u odraslih neimunih ne-silica dovodi do značajnog pada nesivosti i umanjene leži-vosti oplođenih jaja (Butterfield, 1975.; Tannock i Shafren., 1994.; Marvil i sur., 1999.). Bolest ima veliki gospodarski značaj, a nespecifične preventivne mjere najčešće ne mogu spriječiti unos i širenje virusa u nezaraženo, osjetljivo jato. Zato je temelj sprečavanja zaraze specifična imunoprofi-laksa u cilju onemogućavanja zaraze osjetljivog jata i verti-kalnog širenja terenskog virusa, proizvodnje majčinih protu-tijela za zaštitu potomstva u prvim tjednima nakon leženja i sprečavanja pada nesivosti u nesilica. Za suzbijanje AE proizvedena su živa i inaktivirana cjepiva. Uzgoj virusa u dijagnostičke svrhe uspijeva samo u oplođe-nim SPF kokošjim jajima (Sumner i sur., 1957.), a postojeći sustavi tkivnih kultura ne daju najbolje rezultate (Burke i sur. 1965.). Zbog toga je dijagnostika, kao i nadzor uspjeha cijepljenja, pretežno temeljena na serološkim postupcima. Za dokaz specifičnih protutijela do sada je najčešće ko-rištena serumneutralizacija (SN), proba primljivosti zametka (PPZ), a rjeđe reakcija vezanja komplementa (RVK), di-rektna ili indirektna imunofluorescencija (DIF ili IIF) i imu-

nodifuzija u gelu (IDG) (Chuc-Ho-Dinh, 1982.). Međutim, u praksi se potvrdila prikladnost samo SN i PPZ, ali uz određene nedostatke (potreba za SPF kokošjim zamecima i predugo vrijeme neizvjesnosti), zbog čega se imunoenzimna proba (ELISA, engl. Enzyme linked immunosorbent assay) pokazala postupkom izbora. U našim je prilikama uobičajeno cijepljenje protiv AE ras-plodnih kokoši u vrijeme spolne nedozrelosti, ali dobne rezistencije. Ipak, navedeno se cijepljenje, unatoč čestim i različito velikim ''neobjašnjenim'' padovima nesivosti bez drugih kliničkih simptoma ili uginuća, ne provodi redovito u lakih hibrida kokoši. Svrha ovog rada je istražiti moguću proširenost virusa AE u konzumnih nesilica u našim proizvodnim pogonima i razlike u titru specifičnih protutijela jata cijepljenog protiv AE i onog necijepljenog.

Materijali i metode

Pokusne ptice Epizootiološka istraživanja su provedena u dvije komerci-jalne farme konzumnih nesilica hibridne linije Issa brown. U farmi A s 10 tipskih objekata ukupno je bila smještena 151.000 nesilica (94.000 dobi od 32 tjedna i 57.000 dobi od

Marina Biđin, dr. vet. med.; Zavod za bolesti peradi Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu; Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: 01 2390-281; fax: 01 2390-280; e-mail: [email protected]

PAD NESIVOSTI U LAKIH HIBRIDA KOKOŠI UZROKOVAN AVIJARNIM ENCEFALOMIJELITISOM 105

48 tjedana). Iz farme B istraživanjem su obuhvaćena dva objekta, sa po 16.000 nesilica dobi od 63 tjedna. Nesilice su hranjene i držane u tzv. svjetlosnom režimu prema uputama proizvođača hibridne linije. Cijepljenje Kokoši iz obje farme su cijepljene protiv Marekove bolesti i zaraznog bronhitisa neposredno poslije leženja, protiv za-razne bolesti burze u dobi od 22 dana, boginja u dobi od 8 tjedana, newcastleske bolesti u dobi od 21 dana i od 12 tjedana, a potom inaktiviranim trovaljanim cjepivom (protiv newcastleske bolesti, zaraznog bronhitisa i sindroma pada nesivosti) u dobi od 18 tjedana. Razlika u specifičnoj imunoprofilaksi nesilica farme A i B bila je jedino u tome što su kokoši farme B bile cijepljene protiv AE u dobi od 100 dana, dok su jata farme A ostala necijepljena. Kontrola zdravlja Zdravlje nesilica iz oba jata redovito je nadzirano klinički i razudbom dnevnog uginuća, dok je uspjeh proizvodnje pro-suđivan ostvarenom nesivošću (dnevnom ili tjednom). Nesi-lice farme B klinički nisu pokazivale nikakve osobitosti, dok se u jatu nesilica farme A pojavio pad nesivosti (u mlađem jatu u dobi od 26 tjedana, a u starijem u dobi od 42 tjedna). Serološke pretrage Krv za serološke pretrage uzeta je od ukupno 139 nasu-mično odabranih nesilica farme A (90 nesilica mlađeg i 49

starijeg jata) i od 16 nesilica farme B. Kokošima je vađena krv punkcijom krilne vene (v. cutanea ulnaris) u dobi od 32 tjedna (A1 - mlađe jato farme A) i 48 tjedana (A2 - starije jato farme A), te u dobi od 63 tjedna (nesilice farme B). Krvni serum je do pretraživanja pohranjen na -32 °C. Imunoenzimna proba je učinjena komercijalnim kitom FlockCheck (''IDEXX corp.'', Portland, USA). Postignuti re-zultati su obrađeni kompjutorskim programom istog proiz-vođača (FlockCheck Flock Manager Software).

Rezultati

Rezultat pretrage krvnih seruma dobiven korištenjem ELISA-e prikazujemo slikom (Slika 1). Iz Slike 1 je vidljivo da je titar ELISA protutijela za virus AE u mlađem necijepljenom jatu (A1) u vrijeme pretrage u 32. tjednu života najviši i ima srednju vrijednost (ST) 7296, dok je titar starijeg jata srednje vrijednosti od 5357 i približno jednak titru protutijela cijepljenog jata (B) ST od 4975. Histogrami 1, 2 i 3 prema razrednim vrijednostima pri-kazuju uočljive razlike između ELISA titreva necijepljenih i cijepljenih kokoši. Serumi jata A1 imaju najveći broj titarskog razreda 7, 8 i 9, dok su svega 2 seruma bila negativna. U jatu A2 svi su pretraženi serumi bili pozitivni, ali je titarski razredni raspon bio širi i uglavnom se kretao od 4 do 7. U tom je jatu dokazan i najviši titar od 12.347 (titarski razred 10). Cijepljeno (B) jato ima četiri seruma razreda 7, dva su negativna, a najviši je titar dokazan za jedan serum u razredu 9 u vrijednosti od 10.841.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

A1 A2 B

A1A2B

A1 – mlađe necijepljeno jato A2 – starije necijepljeno jato B – cijepljeno jato

Slika 1. Titar ELISA protutijela za virus AE u necijepljenih i cijepljenih lakih hibrida kokoši


Vrijednosti prikazane na histogramu: Broj uzoraka: 90 Srednja vrijednost: 7296 Standardna devijacija: 2839 Koeficijent varijabilnosti: 38,9 Geometrijska sredina: 6130 Razrjeđenje: 1:500

Histogram 1. Razredne vrijednosti ELISA titra protutijela za virus AE u serumu nesilica jata A1


Histogram 2. Razredne vrijednosti ELISA titra protutijela za virus AE u serumu nesilica jata A


Histogram 3. Razredne vrijednosti ELISA titra protutijela za virus AE u serumu nesilica jata B


Koeficijent varijabilnosti (CV%) je najniži u jatu A1 i iznosi 38,9%, što ukazuje na podjednaku specifičnu reakciju pre-traženih nesilica. U jatu A2 koeficijent varijacije je 44,5%, dok je u cijepljenom jatu najizraženiji i iznosi 58,1 %. Krivulje nesivosti mlađeg i starijeg jata (Slika 2 i Slika 3) prikazuju podjednak gubitak jaja u oba jata, što je u mlađem

jatu iznosilo 18,2%, a u starijem 18,6%. Pad nesivosti je u jatu A1 započeo u 26. tjednu, a ponovni porast u 31. tjednu ži-vota, dok je u jatu A2 pad nesivosti zabilježen u 42. tjednu, a već je u 44. tjednu života započeo oporavak i povrat nesivosti.

Slika 2. Nesivost lakih hibrida kokoši prirodno zaraženih virusom AE (mlađe jato)

Slika 3. Nesivost lakih hibrida kokoši prirodno zaraženih virusom AE (starije jato)


Rasprava Avijarni encefalomijelitis je virusna bolest prvi put utvrđena 1930. godine u SAD-u. Ubrzo se proširila po cijelom svijetu i postala važan gospodarski problem intenzivne peradarske proizvodnje. U Hrvatskoj je opisana 1967. godine (Herceg i sur., 1967.), kada je izazvala veliki pomor tovnih pilića. Zaraza je najčešće dokazana u kokoši, premda mogu oboljeti i fazani, purani i prepelice. Uzročnik AE, virus iz porodice Picornaviridae, je vrlo otporan u vanjskom okolišu, što značajno pridonosi širenju i perzistiranju zaraze (Westbury i Sinkovic, 1978.; Tannock i Shafren , 1994.). Avijarni encefalomijelitis je bolest većinom opisana u teških hibrida kokoši, odnosno njihovih potomaka (tovnih pilića), u kojih izaziva veliki pomor (Calnek, 1960.). U odraslih ne-silica teških i lakih hibrida AE može uzrokovati prolazan i različito dug pad nesivosti i manju leživost bez drugih kliničkih simptoma (Taylor i sur., 1955.; Sumner i sur., 1957.; Hamsley, 1964.; Calnek i sur., 1997.). Zbog toga je uobičajeno cijepljenje rasplodnih nesilica, čime su zaštićeni njihovi potomci u prvim danima života. Ipak, često se previđa mogućnost zaraze neimunih nesilica jaja za konzum, u kojih nastaje prolazan, ali za proizvodnju značajan pad nesivosti. Iz tog smo razloga u ograničenom epizootiološkom istraživanju pretražili serume konzumnih nesilica u kojih nije bio objašnjen uzrok smanjene proiz-vodnje. Istraživanjem su obuhvaćena dva jata - jedno nepo-sredno nakon tzv. špice nesivosti, a drugo u posljednjoj tre-ćini proizvodnje. U mlađem je jatu smanjena nesivost trajala tijekom šest tjedana, dok je u starijem jatu trajala četiri tjedna. Gubitak jaja je u oba slučaja bio gotovo jednak (u mlađem jatu prosječno za 18,2%, a u starijem za 18,6%). Opisani je pad nesivosti i njegovo približno trajanje bio jed-nak navodima ranije opisanih slučajeva (Hamsley, 1964; Halpin, 1967.). Prisutnost monogene infekcije virusom AE nedvojbeno je potvrđena dokazom visokog ELISA titra specifičnih protu-tijela u necijepljenih, odnosno prirodno zaraženih kokoši. Dokazani je titar protutijela u osnovi nalikovao titru speci-fičnih protutijela u kontrolnog, cijepljenog jata nesilica jaja za konzum. Veća varijabilnost pojedinačnih titreva cijeplje-nog jata može se objasniti vremenom proteklim od cijeplje-nja (100. dan života) do serološke pretrage. Necijepljena jata su pretražena u vrijeme povratka nesivosti na tehnološki normativ, pa je i titar protutijela ujednačeniji. On pokazuje da su sve zaražene nesilice podjednako reagirale na infekciju virusom AE, dok prolazno umanjena nesivost potvrđuje patogenezu bolesti prema kojoj je primarno oštećen živčani sustav, premda se uzročnik bolesti umnožava u probavnom sustavu (Luginbuhl i Helmboldt, 1978.). Prolazni pad nesi-vosti bio bi, dakle, rezultat stresa uzrokovanog viremijom i posljedičnom imunosnom reakcijom. Pad nesivosti će biti slabiji što su uvjeti okoliša povoljniji, a broj uvjetno pato-genih mikroorganizama manji. Način prodora terenskog virusa u neimuna jata nesilica obu-hvaćena našim epizootiološkim istraživanjem nismo mogli sa sigurnošću utvrditi. Budući da se radi o pogonima koji

imaju kombiniranu proizvodnju (rasplodna jata, uzgoj i ko-mercijalne nesilice, ali i tov pilića), lako je moguće da je virus AE unesen onečišćenim prijevoznim sredstvima za dovoz hrane u objekte ili drugom opremom. Druga je mo-gućnost da su virus unijele slobodnoživuće ptice, primjerice fazani, što često u hladnijem razdoblju godine (kasna jesen i zima) rado borave u blizini farmi, gdje pronalaze hranu. Potonja se pretpostavka čini vrlo moguća uzme li se u obzir da se pad nesivosti u oba jata pojavio približno u isto vri-jeme tijekom ranog proljeća. Osim toga, to je još uvijek vrijeme kada se zbog razmjerno nižih vanjskih temperatura okoliš farme ne može dostatno sanitarno obraditi, pa se ne-što otporniji virus, kao što je virus AE, lako može hori-zontalno unijeti u peradnjake.

Zaključak

Provedeno ograničeno epizootiološko istraživanje AE u konzumnih nesilica omogućuje nam sljedeće zaključke: 1. Avijarni encefalomijelitis u odraslih neimunih kokoši,

bez obzira na hibridnu liniju, izaziva prolazni pad nesi-vosti. U opisanom je slučaju trajao četiri do šest tjedana.

2. Prolazno i različito dugo umanjena nesivost posljedica je stresa izazvanog viremijom i imunosnom reakcijom, a ne oštećenjem spolnih organa.

3. Uputno je redovito cijepiti ne samo rasplodne već i kon-zumne nesilice.

Literatura

Burke, C. N., H. Krauss, R. E. Luginbuhl (1965.): The multiplication of avian encephalomyelitis virus in chicken embryo tissue. Avian Dis. 9, 104-108.

Butterfield, W. K. (1975.): Avian encephalomyelitis. The virus and immune response. Am. J. Vet. Res. 36, 557-559.

Calnek, B. W. (1993.): Avian encephalomyelitis. U: Virus infections of Birds. Ur.: J. B. McFerran i M. S. McNulty. Elsevier Publ. B. V., Amsterdam, London, New York, Tokio. Vol. IV, 469- 478.

Calnek, B. W., P. J. Taylor, M. Sevoian (1960.): Studies on avian encephalomyelitis. IV. Epizootiology. Avian Dis. 4, 325-347.

Calnek, B. W., R. E. Luginbuhl, C. F. Helmboldt (1997.): Avian encephalomyelitis. U: Diseases of Poultry. 10th ed. Ur. B. W. Calnek, H. J. Barnes, C. W. Berad, L. R. McDougald, Y. M. Saif, MosbyWolfe, 571-581.

Chuc-Ho-Dinh (1982.): Zur Serodiagnostik der Aviaren Encephalomyelitis. Mh. Vet. Med. 37, 118.

Hamsley, L. A. (1964.): The incidence of infectious avian encephalomyelitis (epidemic tremor) in broiler breeding flocks and its economic effect. Veterinarian 2, 193-201.

Halpin, F. B. (1967.): Depression of egg yield associates with infection by the virus of infectious avian encephalomyelitis. Report of six outbreak. Veterinarian 4, 161-167.

Herceg, M. M. Kralj, H. Mazija, S. Cvetnić, B. Mažuran, Ž. Ma-rušić (1967.): Avijarni encefalomijelitis (epidemički tremor). I. Osvrt na epizootiološke probleme i prvu pojavu zaraze u Hrvatskoj. Vet. Arhiv 37, 230-242.

Luginbuhl, R. E., C. F. Helmboldt (1978.): Epidemic tremor. U: Diseases of Poultry. Ur.: M. S. Hofstad. Iowa State University, Press Ames, USA


Marvil, P., N. J. Knowles, A. P. Mockett, P. Britton, T. D. Brown, D. Cavanagh (1999.): Avian encephalomyelitis virus is a picornavirus and is most closely related to hepatitis A virus. J. Gen. Virol. 80, 653-662.

Shafren, D. R., G. A. Tannock (1991.): Pathogenesis of avian encephalomyelitis viruses. J. Gen. Virol. 72, 2713-2719.

Sumner, F. W., E. L. Jungherr, R. E. Luginbuhl (1957.): Studies of avian encephalomyelitis. I. Egg adaptation of the virus. Am. J. Vet. Res. 1, 717-723.

Tannock, G. A. D. R. Shafren (1994.): Avian encephalomyelitis: a review. Avian Pathol. 23, 603-620.

Taylor, L., D. C. Lowry, L. G. Raggi (1955.): Effects of an outbreak of avian encephalomyelitis (epidemic tremor) in a breeding flock. Poultry Sci. 34, 1036-1045.

Westbury, H. A., B. Sinkovic (1978.): The pathogenesis of infectious avian encephalomyelitis. I. The effect of the age of the chicken and the route of administration of the virus. Aust. Vet. J. 54, 68-71.

EGG PRODUCTION DROP IN LAYING HENS CAUSED BY AVIAN ENCEPHALOMYELITIS

Summary

Epizootic research on avian encephalomyelitis was carried out in two farms (A and B) with commercial laying hens of different ages where inexplicable drop of egg production occured. The younger flock (A1) was 32 weeks old and the older (A2) 43 weeks old. The 100-day-old flock from farm B was vaccinated against avian encephalomyelitis. The serum was tested with ELISA. Titer in flock A1 was 7296, in flock A2 titer was 5357. The vaccinated flock B had titer 4975. Serological examination in nonvaccinated flocks proved natural infection of laying hens by AE virus what also confirms the egg drop of 18,2% (flock A1) and 18,6% (flock A2) respectively. Key words: avian encephalomyelitis, laying hens, ELISA, egg drop, vaccination


KARAKTERIZACIJA PARAMIKSOVIRUSA TIPA 1 (PMV-1) IZDVOJENOG IZ GOLUBA U HRVATSKOJ U 2008.

Luka Jurinović1, Vladimir Savić1, Mirta Balenović1, Duje Lisičić2, Tajana Amšel Zelenika1

1 Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska 2 Zavod za animalnu fiziologiju, Biološki odsjek, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

U radu je istražen izolat golubljeg paramiksovirusa tipa 1 (PPMV-1) izdvojen u Hrvatskoj 2008. godine. Izolat je pokazao najveću sličnost sa slovenskim izolatom PG-349 iz goluba iz 2001. i to s 99% podudarnosti na analiziranom dijelu gena F. Na mjestu cijepanja bjelančevine F, izdvojeni virus ima aminokiselinski slijed 112RRQ*KRF117 po čemu je različit od ranijih istraživanih izolata PPMV-1 iz Hrvatske. Može se zaključiti da su na području Hrvatske tijekom posljednjeg desetljeća cirkulirala najmanje dva tipa PPMV-1. Pojava PPMV-1 među divljim golubovima zahtijeva provođenje sustavnog monitoringa ciljanih skupina divljih ptica kako bi se pravodobno mogle spriječiti, ili barem umanjiti, potencijalne velike gospodarske štete koje bi nastale širenjem infekcije na domaću perad. Ključne riječi: PPMV-1, golub, Hrvatska Uvod Ptičji paramiksovirus tipa 1 (APMV-1) je uzročnik new-casleske bolesti (NB), jedne od gospodarski najznačajnijih bolesti peradi (Alexander, 1997.). Virus NB (VNB) pripada rodu Avulavirus (Mayo, 2002.), porodici Paramyxoviridae, redu Mononegavirales (Lamb i sur., 2000.). Virus NB u peradi, uključujući kokoši, pure, guske, patke, ali i golubove, uzrokuje čitav niz simptoma, od blagih pa sve do ozbiljnih. Jako virulentni sojevi uzrokuju dišne, pro-bavne i živčane simptome (Ujvari i sur., 2003.). Glavni rezervoari VNB su primarno vodene divlje ptice, a noviji i sekundarni rezervoar su kokoši, odnosno domaća perad (Ujvari, 2006.). Epizootija NB među uzgojnim golubovima pojavila se u Italiji 1981. i proširila se Europom intenzitetom koji je odgovarao panzootiji NB među kokošima. Zanim-ljivo je da su prijašnji nalazi NB u golubova bili sporadični i da su se većinom povezivali s panzootijom NB u kokošima 1971. godine. Nisu pokazivali znakove širenja među golu-bovima, a ništa nije upućivalo ni na prelazak s golubova na perad (Ujvari i sur., 2003.). Virusi izolirani iz uginulih golubova bili su atipični i različiti od „klasičnih“ VNB. Izolati iz Velike Britanije nisu se mogli razlikovati od onih koji su zarazili uzgojne golubove u kontinentalnom dijelu Europe, a i svojstvo vezivanja monoklonskih protutijela bilo

je različito od postojećih izolata NB. Veliki napredak u istraživanju PPMV-1 postignut je razvijanjem mišjeg mono-klonskog protutijela 161/167 koja se specifično veže na njih (Aldous i sur., 2004.).

Materijali i metode

Uzorak Uginuli gradski golub, Columba livia f. domestica, dostav-ljen je u Centar za peradarstvo 29. svibnja 2008. te mu je dodijeljena oznaka HR-61/08.

Virološke pretrage Izdvajanje virusa u kokošjim embrijima i serotipizacija iz-dvojenog virusa je učinjena sukladno standardnoj proceduri (Anon., 2004). Korišteni su poliklonski serumi za APMV-1, APMV-2 i APMV-3 i monoklonska protutijela U85, 7D4 i 161/617 (VLA, Weybridge).

Molekularne metode Ukupna RNA je izdvojena iz infektivne alantoisne tekućine pomoću komercijalnog kompleta High pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Applied Science, Njemačka) i prema upu-tama proizvođača. Komplementarna DNA (cDNA) je sinte-

Luka Jurinović, dipl. ing. biol., Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: ++385 (0) 1 2441 392; fax: ++385 (0) 1 2441 396; e-mail: [email protected]

KARAKTERIZACIJA PARAMIKSOVIRUSA TIPA 1 (PMV-1) IZDVOJENOG IZ GOLUBA U HRVATSKOJ U 2008. 111

tizirana korištenjem nasumičnih heksamera i komercijalnog kompleta GeneAmp® Gold RNA PCR Core Kit (Applied Biosystems, SAD) i prema uputama proizvođača. Lančana reakcija polimerazom (PCR – engl., polymerase chain reaction) za gen F je učinjena pomoću istog kompleta kao i za reverznu transkripciju, a prema postupku koji su opisali Lomniczi i sur. (1998) s vanjskim klicama K1 i K2 i unutarnjim klicama MV1 i B2. Dobiveni PCR proizvod od 557 parova baza je odvojen elektroforezom u 2%-tnom gelu agaroze s dodatkom etidijevog bromida (0,5 mg/l) i vizuali-ziran pomoću ultraljubičastog svjetla. Dio gela sa specifič-nim PCR proizvodom je izrezan i pročišćen komercijalnim kompletom Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, SAD). Pročišćeni proizvodi su sekvencirani u oba smjera s klicama MV1 i B2 na uređaju 3730XL DNA (Applied Biosystems, SAD) te pomoću kompleta BigDye v3.1 (Applied Biosystems, SAD). Nakon što su iz dobivenih sekvenci uklonjeni dijelovi koji odgovaraju korištenim klicama, preostali dio nukleotidnih

sekvenci je objedinjen pomoću računalnog programa ALIGN Plus 2.0. Za filogenetsku analizu je korišten raču-nalni program TreePuzzle 5.0, a filogenetsko stablo je pri-kazano pomoću računalnog programa TreeView 1.6.0. Ko-načna nukleotidna sekvenca je također prevedena u amino-kiselinski slijed pomoću računalnog programa ALIGN Plus 2.0 kako bi se odredila zastupljenost bazičnih aminokiselina na mjestu cijepanja F bjelančevine. U Tablici 1 navedeni su izolati korišteni u filogenetskoj analizi izolata HR-61/08.

Rezultati

Infektivna alantoisna tekućina prikupljena iz kokošjih em-brija prethodno inokuliranih suspenzijom organa uginulog goluba označenog HR-61/08 pokazala je titar 28 s poli-klonskim antiserumom specifičnim za APMV-1 i 211 s monoklonskim protutijelom 161/617, koja prepoznaje PPMV-1. Alantoisna tekućina je s poliklonskim antiseru-mima specifičnim za APMV-2 i APMV-3, monoklonskim

Tablica 1. Izolati korišteni za filogenetsku analizu Table 1. Virus isolates used in phylogenetic analysis

Oznaka izolata Isolate designation

Zemlja porijekla Country of origin

Domaćin Host

Godina izolacije Year of isolation

Pristupni broj u genskoj banci Accession number

pG-758 Slovenija / Slovenia golub / pigeon 2000 DQ007542 pG-442 Slovenija / Slovenia golub / pigeon 2000 DQ007543 HU-655/89 Mađarska / Hungary golub / pigeon 1989 AY150120 pG-94 Slovenija / Slovenia golub / pigeon 2000 DQ007544 4400/00 Italija / Italy golub / pigeon 2000 AF520970 IT-150/95 Italija / Italy golub / pigeon 1995 AY150145 GB 1168/84 Velika Britanija golub / pigeon 1984 AF109885 pG-349 Slovenija / Slovenia golub / pigeon 2001 DQ007545 1166/00 Italija / Italy golub / pigeon 2000 AY288996 YU(Vo)-595/01 Srbija / Serbia golub / pigeon 2001 AY150164 PDEPI94216 Velika Britanija / UK golub / pigeon 1995 AY175753 PSAPI98390 Saudijska Arabija / Saudi Arabia golub / pigeon 1998 AY 471786 HR-111/01 Hrvatska / Croatia golub / pigeon 2001 AY150162 HR-155/01 Hrvatska / Croatia golub / pigeon 2001 AY150163 HR-3/02 Hrvatska / Croatia grlica / turtle dove 2002 AY150165 HR-65/95 Hrvatska / Croatia golub / pigeon 1995 AY150144 BBGPI95039 Bugarska / Bulgaria golub / pigeon 1998 AY135742 PDEPI94102 Njemačka / Germany golub / pigeon 1995 AY135749 BAEPI99109 Velika Britanija / UK golub / pigeon 1999 AY175668 C-301/90 Slovenija / Slovenia golub / pigeon 1990 DQ007546 BHKPI89165 Velika Britanija / UK golub / pigeon 1989 AY175672 PZAPI99091 Velika Britanija / UK golub / pigeon 1999 AY175774 La Sota SAD / USA kokoš / chicken 1946 EF534702


protutijelom U85, specifičnim za klasične VNB, i mono-klonskim protutijelom 7D4, specifičnim za soj F i soj La Sota, pokazala titar 20. Ovakav nalaz nedvojbeno ukazuje da je izolat HR-61/08 PPMV-1.

Filogenetska analiza izolata HR-61/08 te odabranih izolata prikazana je Slikom 1. Na mjestu cijepanja bjelančevine F nađen je slijed aminokiselina 112RRQ*KRF117 .

Slika 1. Filogenetsko stablo izolata ptičjeg paramiksovirusa tipa 1 na temelju analize dijela F gena od 192 nukleotida. Početna sekvenca za analizu je soj La Sota. Virusi izolirani u Hrvatskoj napisani su podebljanim slovima, dok je izolat analiziran u ovom istraživanju podcrtan

Figure 1. Phylogenetic tree of avian paramyxoviruses type 1 based on the analysis of the F gene region comprising 192 nucleotides. The tree is rooted with La Sota strain. Isolates from Croatia are in bold whereas isolate from this study is underlined


Razmatranje i zaključci

Izolat HR-61/08 je golublja varijanta VNB, odnosno PPMV-1. Na temelju molekularne analize, najsličniji je slovenskom izolatu PG-349 iz 2001. godine i to s 99% podudarnosti na analiziranom dijelu gena F. Skupina izolata najsličnija izolatu HR-61/08 dijeli isti slijed aminokiselina oko mjesta cijepanja F bjelančevine; 112RRQ*KRF117. Ostali izolati PPMV-1 s područja Hrvatske grupirani su u drugoj skupini i imaju slijed aminokiselina oko mjesta cijepanja F bjelan-čevine 112KRQ*KRF117 (Savić i sur., 2003.). Temeljem ovih rezultata može se pretpostaviti da su u populaciji divljih go-lubova tijekom posljednjeg desetljeća na području Hrvatske cirkulirala najmanje dva tipa PPMV-1. Rizična skupina za infekciju virusom PPMV-1, osim divljih golubova i srodnih vrsta iz porodice Columbidae, su prven-stveno uzgojni golubovi, pogotovo necijepljene jedinke, ali i domaća perad. Izolat HR-61/08 ima višestruko zastupljene bazične aminokiseline na mjestu cijepanja bjelančevine F (112RRQ*KRF117) karakteristične za velogene sojeve VNB (Meulemans i sur., 2002.). Unatoč tome, većina izolata s takvom sekvencom na mjestu cijepanja bjelančevine F ima indeks intracerebralne patogenosti (ICPI) manji od 0,7 što upućuje na lentogene sojeve (Meulemans i sur., 2002.). Problem može nastati ako virus prijeđe s golubova na do-maću perad i višestrukim pasažama se prilagodi „novom“ domaćinu čime mu se može povećati patogenost. Stoga pojava i cirkuliranje PPMV-1 u populaciji divljih golubova zahtijeva provođenje sustavnog monitoringa ciljanih skupina divljih ptica kako bi se pravodobno mogle spriječiti ili barem umanjiti potencijalne velike gospodarske štete koje bi mogle nastati širenjem infekcije na domaću perad.

Zahvala

Istraživanje je financirano od strane Ministarstva znanosti, obrazovanja i športa Republike Hrvatske; znanstveni projekt „Genska karakterizacija virusa influence ptica i new-castleske bolesti u Hrvatskoj“ br. 048-0481153-1136.

Literatura

Aldous, E. W., C. M. Fuller, J. K. Mynn, D. J. Alexander (2004.): A molecular epidemiological investigation of isolates of the variant avian paramyxovirus type 1 virus (PPMV-1) responsible for the 1978 to present panzootic in pigeons. Avian Pathol. 33(2), 258 - 269.

Alexander, D. J., (1997.): Newcastle disease and other avian paramyxoviridaeinfections. U: Calnek, B. W., H. J. Barnes, C. W. Beard, W. M. Reid, H. W. Yoder Jr., (Ur.), Diseases of Poultry, 10th ed., Iowa State University Press, Ames, Iowa, str. 541 - 570.

Anonimus (2004.): Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 5th edn., Office Internationale des Epizooties, Paris, France.

Lamb, R. A., P. L. Collins, D. Kolakofsky, J. A. Melero, Y. Nagai, M. B. A. Oldstone, C. R. Pringle, B. K. Rima (2000.): Paramyxoviridae. U: Virus taxonomy. Seventh report of the international committee of taxonomy on viruses. Academic press, str. 549 - 561.

Lomniczi B., E. Wehmann, J. Herczeg, A. Ballagi-Pordány, E. F. Kaleta, O. Werner, G. Meulemans, P. H. Jorgensen, A. P. Manté, A. L. Gielkens, I. Capua, J. Damoser (1998.): Newcastle disease outbreaks in recent years in Western Europe were caused by an old (VI) and a novel genotype (VII). Archives of Virology 143, 49 - 64.

Mayo, M. A. (2002.): Virus taxonomy - Houston 2002. Arch. Virol. 147(5), 1071 - 1076.

Meulemans, G., T. P. van den Berg, M. Decaesstecker, M. Boschmans (2002.): Evolution of pigeon Newcastle disease virus strains. Avian Pathol. 31(5), 515 - 519.

Savić, V., M. Tišljar, B. Šimpraga, T. Amšel Zelenika, I. Lukač Novak, M. Balenović, F. Krstulović (2003.): Epizootiološko stanje u hrvatskom peradarstvu tijekom 2001. i 2002., Stočarstvo 57, 217 - 222.

Ujvari, D., E. Wehmann, E. F. Kaleta, O. Werner, V. Savić, E. Nagy, G. Czifra, B. Lomniczi (2003.): Phylogenetic analysis reveals extensive evolution of avian paramyxovirus type 1 strains of pigeons (Columba livia) and suggests multiple species transmission. Virus Res. 96(1 - 2), 63 - 73.

Ujvari, D.(2006.): Complete nucleotide sequence of IT-227/82, an avian paramyxovirus type-1 strain of pigeon (Columba livia). Virus Genes 32, 49-57.

CHARACTERISATION OF PARAMYXOVIRUS TYPE 1 (PMV-1) ISOLATED FROM PIGEON IN CROATIA IN 2008

Summary

Pigeon paramyxovirus type 1 (PPMV-1) isolated in Croatia in 2008 was analyzed. It has shown highest similarity to the Slovene isolate PG-349 from pigeon in 2001 with 99% homology of the analyzed region of the F gene. The sequence of the F protein cleavage site had a motif 112RRQ*KRF117 which is different from other analyzed PPMV-1 isolates from Croatia. This indicates that at least two types of PPMV-1 were circulating in Croatia during the last decade. Present study shows the need of systematic monitoring of target wild birds species in order to prevent, or at least minimize, potential major economic losses due to spread of the virus to domestic poultry. Key words: PPMV-1, pigeon, Croatia


DOSADAŠNJI REZULTATI ISTRAŽIVANJA SINDROMA ENTERITISA I UGINUĆA PURIĆA U HRVATSKOJ

Zdenko Biđin1, Ivana Lojkić2, Marina Biđin1, Marina Tišljar3, Milivoj Mikec3, Darko Majnarić4, Željko Stanišić5

1 Zavod za bolesti peradi, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska 2 Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska 3 Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska 4 Veterinarski zavod Križevci, Križevci, Hrvatska 5 "Puris", Pazin, Hrvatska

Sažetak

U radu su opisani jednogodišnji (2007. – 2008.) rezultati istraživanja etiologije i pro-širenosti sindroma enteritisa i uginuća purića (PEMS) u intenzivno uzgajanih teških bijelih purana u Hrvatskoj. Po prvi su puta dokazani ptičji astrovirusi (TastV-1;TastV-2) i ptičji nefritis virus (ANV) te puranski reovirus (ARV). Na temelju prvih rezultata nužno je odrediti virulenciju i druga svojstva izdvojenih enterovirusa da bi se odredio stupanj ugroženosti i moguća pojavnost sindroma u budućnosti. Prvi nalazi TastV-1;TastV-2, ANV i ARV nameću potrebu sustavne kontrole pojavnosti tih virusa i njihove uloge u etiologiji i epizootiologiji PEMS-a, a na temelju stvarnih nalaza i virulencije tih virusa mogle su se predložiti specifične preventivne mjere. Ključne riječi: PEMS, astrovirus, ptičji nefritis virus, reovirus, koronavirus, virus hemoragičnog enteritisa purana Uvod Crijevnim se virozama u nas do nedavna nije pridavala oso-bita pažnja, iako je u svijetu tzv. sindrom zarazne kržljavosti tovnih purana bio prepoznat krajem 1980-ih. Zbog lošeg prijetvora hrane, povećana uginuća, slabije kakvoće mesa peradi i većeg klaoničkog konfiskata gospodarski su gubici postali vrlo značajni. Slično se dogodilo i s tzv. sindromom enteritisa i uginuća purića (engl. poult enetric mortality syndrome; PEMS), čija se etiologija i proširenost počela istraživati tek sredinom 2005. godine (McLoughlin i sur., 2007.; Barnes i Guy, 2003.; Lojkić i sur., 2007.). PEMS se obično opisuje kao akutna zarazna crijevna bolest koja se očituje proljevom, dehidracijom, gubitkom tjelesne mase, prestankom uzimanja hrane, slabim rastom i velikim uginućem. Barnes i Guy (2003.) dijele PEMS na dva kli-nička oblika, na tzv. "blaži" (excess mortality), koji u purića u dobi od 7 do 28 dana uzrokuje pomor koji u tri uzastopna dana ne prelazi 1% i na "teži" oblik (spiking mortality), koji će u purića iste dobi uzrokovati pomor veći od 9% (Barnes i Guy, 2003.).

Etiologija PEMS-a nije konačno riješena. U početku se kao vjerojatni etiološki uzrok spominjao puranski koronavirus (Lin i sur., 1996.). Kasnije je iz izmeta purića s PEMS-om izdvojen "mali okrugli virus" (Yu i sur., 2000.), dok su Koci i sur. (2000.) izdvojili astrovirus (TAstV) iz timusa i crijeva bolesnih purića, a Simmons i sur. (2000.) reovirus. Još prije je dokazano da puranski rotavirus (soj Tu-2) u purića uzro-kuje bljedoću crijeva i proširenost cekuma ispunjenih pjenu-šavim ili nepjenušavim sadržajem (Yason i sur., 1987.). U ovom su radu opisani rezultati jednogodišnjeg istraživanja (2007. – 2008.) proši-renosti enteroviroza u intenzivno uzgajanih purana različite dobi.

Materijal i metode Purani Istraživanjem proširenosti enteropatogenih virusa obuhva-ćeni su veliki bijeli purani linije Nicholas različite dobi. U razdoblju od 2007. do 2008. ukupno su pretražena 24 jata purana (22 jata tovnih purana dobi u rasponu od 1 do 14 tjedana i 2 jata rasplodnih purana u dobi od 25 i 39 tjedana). Svi su purani držani i hranjeni u uvjetima intenzivne proizvodnje prema preporuci dobavljača hibridne linije.

Prof. dr. sc. Zdenko Biđin, Zavod za bolesti peradi, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Heinzelova 55; 10000 Zagreb; Hrvatska; E-mail: [email protected]

DOSADAŠNJI REZULTATI ISTRAŽIVANJA SINDROMA ENTERITISA I UGINUĆA PURIĆA U HRVATSKOJ 115

Uzorci tkiva Za dokaz virusnog antigena mogućih uzročnika virusnog enteritisa uzorkovani su slezena, timus i crijeva sa sadrža-jem, te su pretraženi na virus hemoragičnog enteritisa purana (HEV), puranski astrovirus 1 i 2 (TAstV-1; TAstV-2), ko-košji astrovirus (CAstV), virus zaraznog nefritisa (ANV), puranski reovirus (ARV) i puranski koronavirus (TCV). Organi su uzorkovani od 5-10 uginulih purana po jatu, a jedno jato je predstavljalo jedan uzorak.

Izdvajanje virusnih nukleinskih kiselina, RT-PCR i PCR Ukupnu DNK izdvojili smo iz ∼50 mg slezena, a ukupnu RNK iz iste količine tkiva timusa koristeći TRI Reagent (Sigma, Njemačka) prema uputama proizvođača. Virusnu RNK izdvojili smo iz 200 µL suspenzije crijevnog sadržaja pomoću QIAmp viral RNA nini kita (Qiagen, Njemačka) prema uputama proizvođača. Prije ekstrakcije pomiješali smo jedan dio crijevnog sadržaja s pet dijelova sterilnog PBS (140 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 8,0 mM Na2HPO4 i 1,5 mM KH2PO4) i centrifugirali 10 min pri 3000 x g. Reverznu transkripciju (RT) smo izveli u reakcijskoj smjesi 20 µL s 2 µl RNK, 20 U RNaseH-M-MLV reverzne trans-kriptaze (SuperScript III, Invitrogen, SAD), 5 pmola „random hexamer” početnice, 0,5 mM dNTP-a, 10 mM dithiothreitola i 2 µL 5X koncentriranog „first strand“ pufera (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl i 3 mM MgCl2). Smjesu smo inkubirali 50 minuta pri 42 °C i 10 min pri 72 °C. Približno 50 ng DNK (ili 1 µl cDNK) inkubirali smo s 0,25 µM specifične početnice i 12,5 µl 2X koncentriranog Go Taq Green Master Mix-a (1,25 U Taq polimeraze, 0,4 pmola dNTP-a, 3 mM MgCl2 (Promega, SAD) u krajnjem volumenu od 25 µL u uređaju GenAmp PCR System 2400 (Applied Biosystems, SAD). Uvjeti reakcije su prilagođeni za svaku pretragu (naziv, ciljni gen, veličina proizvoda PCR kao i refe-rence pojedinih početnica prikazani su na Tablici 1). Proizvodi reakcije PCR su analizirani na 1 ili 2%-tnom gelu agaroze obojeni etidij-bromidom.


Nastanak crijevne bolesti je složen jer može uključiti razli-čite, napose crijevne viruse koji zajedno s bakterijama te drugim zaraznim i nezaraznim uzročnicima mogu otežati pojavu i tijek same bolesti. Zbog široka raspona mogućih etioloških uzroka crijevne bolesti, želučano-crijevni trakt je organski sustav najizloženiji djelovanju štetnih tvari i uzročnika. Crijevne se viroze obično povezuju s djelova-njem rotavirusa (McNulty, 2003.), adenovirusa (Barnes i Guy, 2003.), koronavirusa (Guy, 2003.), enetrovirusa (Pierson i Fitzgerald, 2003.), astrovirusa (Rosenberger i Schultz-Cherry, 2003.) i reovirusa (Rosenberger, 2003.). Iako se za monogene zaraze nekim od spomenutih virusa uglavnom poznaju klinički simptomi, svojstvo i tijek bolesti, u miješanim zara-zama, bilo s više srodnih virusa iz iste porodice ili s drugim enterovirusima, klinička slika i tijek bolesti mogu biti jako zbunjujući. U te otežavajuće čimbenike uvijek valja ubrojiti i bakterijsku floru, napose salmonele, kampilobakter, klostridije, jedinstvene entero-patogene sojeve Escherichia coli te neke protozoarne bole-sti (kokcidioza, krip-tosporidioza, histomonoza) (Yegani i Korver, 2008.). Uz to, PEMS ošteti i staničnu i humoralnu imunost (Qureshi i sur., 1997.) te smanji fagocitičko djelo-vanje makrofaga i citokinski sastav u sekretu abdomenskih makrofaga (Heggen i sur., 2000.; 2000.a). Narušena vrlo osjetljiva ravnoteža između zdravlja probav-nog trakta i mikrobijelne crijevne flore (virusi, bakterije, gljivice, paraziti) lako može oštetiti proizvodnost komerci-jalno uzgajanih purana, ali i druge vrste domaće peradi. Svakako tu valja razmišljati i o promjeni crijevne flore, do koje će sigurno doći zbog nedavne zabrane primjene anti-biotika u zemljama EU i u Sjevernoj Americi, gdje su se koristili kao poticatelji rasta u hrani za perad. Tada će višeuzročnost crijevnih viroza naći još više pomagača u određivanju težine i kliničkog očitovanja crijevne bolesti uz sinergetsko djelovanje različitih patogenih i uvjetovano patogenih crijevnih bakterija te drugih uzročnika. Enterovirusi kao promarni okidači, ako već i nisu primarni uzrok kliničke crijevne bolesti, lako će oštetiti resorptivnu

površinu crijevne sluznice i kompromitirati imu-nosni sustav u okolnostima slabije opskrbe orga-nizma ptice potrebnim hranivima. Na Tablici 2 su prikazani rezultati jednogo-dišnjeg (2007. – 2008.) sustavnog istraživanja etiologije sindroma enteritisa i uginuća purića u intenzivnom uzgoju u nas. U uvjetima gubitka tjelesne tekućine i elektrolita zbog proljeva te smanjene resorpcije zbog ošte-ćene sluznice i resorptivnog epitela crijevnih re-sica moguće je da i komensalne bakterije posta-nu patogene. Osim toga, u takvim će okolnosti-ma tzv. mikrobijelni pritisak" omogućiti i pro-mjenu virulencije poznatih virusnih sojeva. Zato ne čudi da je nedavno izdvojen reovirus s izra-ženim patogenim djelovanjem na središnji živ-čani sustav (Yegani i Korver, 2008.; Rosen-berger, 2003.; van der Zande i Kuhn, 2007.).

Tablica 1. Početnice korištene za dokaz nekih enterovirusa u pojavi PEMS-aTable 1. PCR primes used for detection some of enteroviruses in PEMS

occurence

Početnica Primer

Ciljni gen Target gene

Veličina proizvoda PCR Size of PCR product

Referenca Reference

HEV Hekson 1646 bp Hess i sur., 1999. TAstV-1 Polimeraza 251 bp Day i sur., 2007. TAstV-2 Kapsidni ORF2 849 bp Koci i sur., 2000. CAstV Polimeraza 362 bp Day i sur., 2007.

ANV Polimeraza 255 bp vlastita sekvenca (neobjavljeno)

ARV Sigma 2 626 bp Sellers i sur., 2004. TCV Nukleokapsida 598 bp Sellers i sur., 2004.

LONGITUDINALNA STUDIJA VRLO VIRULENTNIH VIRUSA ZARAZNE BOLESTI BURZE U HRVATSKOJ OD 1996. DO 2008. 116

Tablica 2. Rezulati PCR pretraga na enteroviruse u purana Table 2. Results of PCR examination for enteroviruses in turkeys

Jato / Flock Dob / Age∗ HEV TAstV-1 TAstV-2 CAstV ANV ARV TCV 1 11 + − + − − − − 2 11 + − + − − − − 3 11 − − + − − − − 4 11 + − + − + − − 5 11 − − + − − − − 6 1 − − + − − − − 7 39∗∗ + − − − − − − 8 25∗∗ − − − − − − − 9 5 + − − − − − −

10 5 − − − − − − − 11 5 − + − − − − − 12 5 − − − − − − − 13 5 + − − − − − − 14 5 − − − − − − − 15 2 − − − − − − − 16 11 − − − − − − − 17 8 − − − − − − − 18 14 − − − − + − − 19 3 − + + − + + − 20 2 − − − − − − − 21 2 + − + − − − − 22 11 − − − − − − − 23 5 + − − − − − − 24 5 − − − − − − −

Kazalo: ∗ − dob u tjednima (engl. age in weeks); ∗∗ − roditelji (engl. parents) Hemoragični enteritis purana kao imunosupresivna bolest također će pridonijeti višeuzročnoj etiologiji crijevnih bole-sti općenito, pri čemu će pojačati i djelovanje drugih uzročnika (Pierson i Fitzgerald, 2003.). Prema dosadašnjim nalazima, ta se crijevna viroza nalazi u svih dobnih kategorija purana u nas, pretežno kao inaparentna bolest koja prelazi u klinički očitovanu u sinergetskom djelovanju s drugim enterovirusima i jakim stresom (Lojkić i sur., 2007.). Nefiritis virus (ANV) može u purića uzrokovati proljev i intersiticijski nefritis. Taj je astrovirus po prvi puta dokazan u naših jata purana. U kliničkoj pojavi enteroviroze ANV je, zajedno s druga dva astrovirusa (TAstV-1 i TAstV-2), uzrokovao u prvih 5 tjedana života pomor tovnih purana od 11,45% uz očitovane znakove PEMS-a i jaku kolisepsu (rezultati nisu prikazani). Uzme li se u obzir da smo pre-tragama organa purića s klinički očitovanim proljevom iz-dvojili tri različita astrovirusa, očita je njihova zastupljenost u PEMS-u. U istom jatu tovnih purana u kojem su dokazani

ptičji astrovirusi (TAstV-1 i TAstV-2 te ANV) dokazan je i puranski reovirus. Nalaz puranskog reovirusa je prvi takav nalaz u nas, pa nužno traži daljnja istraživanja radi odre-đivanja njegove uloge u PEMS-u, što bi bilo u skladu s nalazima i mišljenjem drugih istraživača (Simmons i sur., 2000.; Heggen i sur., 2002.). Tim bi istraživanjem svakako trebalo obuhvatiti i jednodnevna rasplodna roditeljska jata purana zbog određivanja izvora spomenutih enterovirusa i kritičnih mjesta njegova zadržavanja u peradi i okolišu u kojem se ona nalazi.

Zaključci

Već poslije jednogodišnjeg razdoblja sustavnog istraživanja rezultati ukazuju na pro-širenost određenih vrsta entero-virusa u okviru tzv. sindroma eneritisa i uginuća purana iz intenzivnih uzgoja, čime opravdavaju poduzete napore i uložena sredstva. Na taj su način po prvi put u nas dokazana

DOSADAŠNJI REZULTATI ISTRAŽIVANJA SINDROMA ENTERITISA I UGINUĆA PURIĆA U HRVATSKOJ 117

zaražavanja specifičnim puranskim astrovirusnim (TAstV-1 i TAstV-2 te ANV) i puranskim reovirusom koja mogu dijelom objasniti pojavu često opisanog enteritisa nepoznate etiologije. Posebno je zanimljiva etiologija PEMS-a u nas. Dok u nekim zemljama prevladava puranski koronavirus, u Hrvatskoj je, barem za sada, najčešći uzrok pojave tog sindroma astrovirus. Težina očitovane crijevne bolesti ovisi o broju uzročnika u njenom nastanku bez obzira na to radi li se o dugim enterovirusima ili bakterijama. Napredovanjem dijagnostičkih postupaka, napose na molekulskoj osnovi, istraživanja enteroviroza će dati i više uvida u etiologiju enteritisa, osobito značajnih u ranom razdobljuživota inten-zivno uzgajane peradi. Sigurno je potvrđeno da se oštećenje crijevne sluznice i narušavanje vrlo osjetljive ravnoteže iz-među domaćina i crijevne mikroflore vrlo nepovoljno odra-žava na kasniji rast i razvoj ptice, a time i na ostvarenje proizvodnih svojstava. Poznavanjem etiologije općenito sin-droma enteritisa moći će se razviti i prikladne preventivne mjere. Zato istraživanja proširenosti pojedinih enterovirusa treba, ne samo zbog epizootioloških potreba već i zbog gospodarskih gubitaka, nastaviti.

Acknowledgments

This research was supported by grant nos. 053-0531836-1856 and from the Ministry of Science, Education and Sports, Republic of Croatia.

Literatura

Ali, A., i D. L. Reynolds, (2003.): Turky torovirus infection. U: Diseases of Poultry. 11th ed. Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly. L. R. McDougald, D. E. Swayne, eds. Blackwell, Ames, IA, 332-337.

Barnes, H. J. i J. S. Guy (2003.): Poult enteritis mortality syndrome. U: Diseases of Poultry. 11th ed. Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly. L. R. McDougald, D. E. Swayne, eds. Blackwell, Ames, IA, 1171-1180.

Day, J. M., E. Spackman, M. Pantin-Jackwood (2007.): A multiplex RT-PCR test for the differential identification of turkey astrovirus type 1, turkey astrovirus type 2, chicken astrovirus, avian nephritis virus, and avian rotavirus. Avian Dis. 51, 681-684.

Guy, J. S. (2003.): Turkey coronavirus enteritis. U: Diseases of Poultry. 11th ed. Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly. L. R. McDougald, D. E. Swayne, eds. Blackwell, Ames, IA, 300-307.

Heggen, C. L., M. A. Qureshi, F. W. Edens, H. J. Barnes (2000.): Alternations in macroohage-produced cytokines and nitrite associated with poult enteritis and mortality syndrome. Avian Dis. 44, 59-65.

Heggen, C. L., M. A. Qureshi, F. W. Edens, H. J. Barnes, G. B. Havenstein (2000. a): Alterations in the lymphocytic and mononuclear phagocytic systems of turkey poulty. Avian Dis. 42, 711-720.

Heggen, C. L., M. A. Qureshi, F. W. Edens, B. Sherry, P. S. Wackenell, P. H. O′Connel, K. A. Schat (2002.): Isolation of a reovirus from poult enteritis and mortality syndome and its pathogenicity in turkey poults. Avian Dis. 46, 32-47.

Hess, M., R. Raue, H. M. Hafez (1999.): PCR for specific detection of haemorrhagic enteritis virus of turkeys, an avian adeno-virus. J. Virol. Meth. 81, 199-203.

Imada, T. i H. Kawamura (2003.): Avian nephritis. U: Diseases of Poultry. 11th ed. Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly. L. R. McDougald, D. E. Swayne, eds. Blackwell, Ames, IA, 379-383.

Koci, M. D., B. S. Seal, S. Schultz-Cherry (2000.): Molecular cha-racterization of an avian astrovirus. J. Virol. 74, 6173-6177.

Koci, M. D., B. S. Seal, S. Schultz-Cherry (2000. a): Development of an RT-PCR diagnostic test for avian astrovirus. J. Virol. Meth. 90, 79-83.

Lin, T. L., C. C. Wu, R. E. Porter, H. L. Thacker, T. A. Bryan, C. L. Woodruff, T. A. Hooper (1996.): Turkey poult enteritis caused by turkey coronavirus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 209, 372.

Lojkić, Ivana, Z. Biđin, Tajana Amšel Zelenika, M. Mikec, Ž. Stanišić (2007.): Miješane viroze u etiologiji crijevnih bolesti purana. Peradarski dani 2007. Zbornik radova. Poreč 07. – 10. svibnja 2007., 164-167.

McLoughlin, M. F., D. A. McLoone, T. J. Conner (1987.): Runting and stunting syndrome in turkeys. Vet. Rec. 121, 583-586.

McNulty, M. S. (2003.): Rotavirus infections. U: Diseases of Poultry. 11th ed. Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly. L. R. McDougald, D. E. Swayne, eds. Blackwell, Ames, IA, 308-320.

Pierson, F. W., S. D. Fitzgerald (2003.): Hemorrhagic enteritis and related infections. U: Diseases of Poultry. 11th ed. Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly. L. R. McDougald, D. E. Swayne, eds. Blackwell, Ames, IA, 237-247.

Qureshi, M. A., F. W. Edens, G. B. Havenstein (1997.): Immune system dysfunction during exposure to poult enteritis and mortality syndrome agents. Poultry Sci. 76, 564.569.

Reynolds, D. L. i S. L. Schultz-Cherry (2003.): Astrovirus infections. U: Diseases of Poultry. 11th ed. Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly. L. R. McDougald, D. E. Swayne, eds. Blackwell, Ames, IA, 320-326.

Sellers, H. S., M. D. Koci, E. Linnemann, L. A Kelley, S. Schultz-Cherry (2004.): Development of a multiplex reverse transcription polymerase chain reaction diagnostic test specific for turkey astrovirus and coronavirus. Avian Dis. 48, 531-539.

Simmons, V. M., M. D. Koci, D. R. Kapczynski, S. Schultz-Cherry (2000.): Initial characterization od an avian reovirus isolated from turkey poulty with poult enteritis and mortality syndrome. Poultry Sci. 79 (Suppl. 1) 120.

Yason, C. V., B. A. Summers, K. A. Schat (1987.): Pathogenesis of rotavirus infection in various age groups of chickens and turkeys: pathology. Am. J. Vet. Res. 48, 927-938.

Yegani, M., D. R. Korver (2008.): Factors affecting intestinal health in poultry. Poultry Sci. 87, 2052-2063.

Yu, M., Q. Zhang, Y. M. Saif (2000.): Characterization of a small round virus associated with poult enteritis and mortality syndrome. Avian Dis. 44, 600-610.

Zande, Saskia, van der, Eva-Maria Kuhn (2007.): Central nervous system signs in chickens caused by a new avian reovirus strain: A pathogenicity study. Vet. Microbiol. 120, 42-49.

Zhang, Y., M. Liu, O. Shuidong, Q. L. Hu, D. C. Guo, H. Y. Chen, Z. Han (2006.): Detection and identification of avian, duck, and goose reoviruses by RT-PCR: goose and duck reoviruses are part of the same genogroup in the genus Ortho-reovirus. Arch. Virol. 151, 1525-1538.


POULT ENTERITIS AND MORTALITY SYNDROME (PEMS) IN CROATIA – SURVEY RESULTS

Summary

In the present study we report the results of our investigation of etiology and spread of the poult enteritis and mortality syndrome (PEMS) in the line of white Nicholas turkeys collected from commercial production flocks in Croatia during a one-year period (2007–2008). For the first time we detected avian astroviruses (TastV-1; TastV-2), avian nephritis virus (ANV) and turkey reovirus (ARV). Our first results lead us to determine the virulence and other properties of the isolated enteroviruses and to predict the emersion of PEMS in the future. For that reason we emphasize the importance of suggesting preventive measures for the control of PEMS in Croatia. Key words: PEMS, astrovirus, avian nephritis virus, reovirus, coronavirus, turkey hemorrhagic enteritis virus


LONGITUDINALNA STUDIJA VRLO VIRULENTNIH VIRUSA ZARAZNE BOLESTI BURZE U HRVATSKOJ OD 1996. DO 2008.

Vladimir Savić, Mirta Balenović


Sažetak

Filogenetski je analizirano 16 izolata vrlo virulentnog virusa zarazne bolesti burze (ZBB) iz sjeverozapadne Hrvatske i Dalmacije prikupljenih u razdoblju od 1996. do 2008. Svi izolati su u varijabilnom području VP2 posjedovali aminokiseline tipične za vrlo virulentne viruse na pozicijama 256 (izoleucin), 294 (izoleucin) i 299 (serin). Značajana genska raznolikost izolata iz 1996. ukazuje na mogući višestruki unos ovog virusa u našu zemlju, ali isto i na njegovu cirkulaciju u naše peradi kroz duže razdoblje prije nego li je 1995. vrlo virulentna ZBB zapažena i prepoznata u našoj zemlji. Nasuprot tome, velika sličnost pojedinih izolata u istoj regiji u Hrvatskoj, ali izdvojenih u razmaku od gotovo jednog desetljeća, ukazuje na ukorijenjenost ovog virusa u pojedinim područjima naše zemlje. Ključne riječi: filogenetska analiza, zarazna bolest burze, Republika Hrvatska Uvod Zarazna bolest burze je vrlo kontagiozna imunosupresivna bolest pilića uzrokovana virusom ZBB (VZBB) (Van den Berg, 2000.). Klinička infekcija se najjače očituje u pilića zaraženih u dobi od 3 do 6 tjedana, dok u mlađih pilića obično dolazi do subkliničke infekcije s posljedičnom imu-nosupresijom. Bolest primarno zahvaća limfoidno tkivo, po-sebice Fabricijevu burzu (Sharma i sur., 2000.). Virus ZBB pripada porodici Birnaviridae, ima dvostruki lanac RNK koji se sastoji od dva odsječka: A i B (Garriga i sur., 2006.). Odsječak A (3,3 kilobaza) kodira virusni pro-tein (VP) 5 te poliprotein (p VP2-VP4-VP3) koji se autokatalitički cijepa u VP2, VP4 i VP3. Odsječak B (2,9 kilobaza) kodira VP1. Postoje dva serotipa VZBB. Serotip I je patogen, dok je serotip II apatogen za piliće. Virusi sero-tipa I se prema patotipu dijele na klasične, antigenske vari-jante, atenuirane i vrlo virulentne. Vrlo virulentni VZBB (vvVZBB) su najprije zapaženi u Europi krajem 1980-ih, a zatim su se proširili gotovo posvuda u svijetu (Van den Berg, 2000., Müller i sur., 2003.). Vrlo virulentni VZBB se antigenski gotovo ne razlikuju od klasičnih virusa VZBB, ali su daleko virulentniji i uzrokuju visoku smrtnost u zara-

ženim jatima (Brown i sur., 1994.; Etarradossi i sur., 1998.; Van den Berg, 2000., Müller i sur., 2003.). Vrlo virulentna ZBB je u Hrvatskoj prvi put zapažena 1995. u sjeverozapadnom dijelu zemlje, a izdvojeni virus je uzro-kovao uginuće 50% pokusno zaraženih pilića lakih hibrida slobodnih od specifičnih protutijela (Savić i sur., 1997.). Virus se ubrzo proširio po uzgojima peradi u cijeloj zemlji uzrokujući značajne probleme u peradarskoj proizvodnji uz uginuće tovnih pilića do 20% i pilića lakih hibrida i do 60% (Savić, 1999.). Cilj ovog rada je istražiti vvVZBB izdvojene u Hrvatskoj na genskoj razini i analizirati dobivene rezultate prema vremenu izdvajanja i geografskom podrijetlu virusa.

Materijal i metode

Uzorci Tijekom razdoblja od 1996. do 2008. prikupljeno je i ana-lizirano 16 izolata vvVZBB iz sjeverozapadne Hrvatske i Dalmacije. Oznake virusa, godine izdvajanja i regije iz kojih potječu izdvojeni virusi analizirani u ovom radu prikazani su u Tablici 1. U istoj Tablici su prikazane i oznake, godine izdvajanja, zemlje podrijetla i pristupni brojevi u Genskoj banci za izolate iz drugih zemalja čije su nukleotidne sekvence korištene u ovom istraživanju.

Dr. sc. Vladimir Savić, Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Heinzelova 55, 10 000 Zagreb, Hrvatska; tel: ++385 (0) 1 2441 392; fax: ++385 (0) 1 2441 396; e-mail: [email protected]


Tablica 1. Oznake izolata, godine izdvajanja, zemlje/regije podrijetla izolata i pristupni brojevi u Genskoj banci za vrlo virulentne viruse zarazne bolesti burze. Virusni izolati koji su analizirani u ovom istraživanju označeni su podebljanim slovima

Table 1. Isolate designations, years of isolation, countries/regions of isolate origin and GeneBank accession number for very virulent infectious bursal disease viruses. Viral isolates which are analysed in this study are in bold letters

Oznaka izolata Isolate designation

Godina izdvajanja Year of isolation

Regija / zemlja Region / country

Pristupni broj Accession number

AB-06-703/96 1996. Dalmacija - Dalmatia / Croatia - AB-06-785/96 1996. Dalmacija - Dalmatia / Croatia - AB-885/96 1996. Dalmacija - Dalmatia / Croatia - AB-1048/96 1996. Dalmacija - Dalmatia / Croatia - AB-1082/96 1996. Dalmacija - Dalmatia / Croatia - AB-1223/96 1996. Dalmacija - Dalmatia / Croatia - BP-2000 2000. Sjeverozapadna Hrvatska - Northwest Croatia - HR/1/2000 2000. Sjeverozapadna Hrvatska - Northwest Croatia - HR/1/2002 2002. Sjeverozapadna Hrvatska - Northwest Croatia - AB-06-2089/02 2002. Dalmacija - Dalmatia / Croatia - AB-06-2259/02 2002. Dalmacija - Dalmatia / Croatia - AK-120/02 2002. Dalmacija - Dalmatia / Croatia - AK-14-12/05 2005. Dalmacija - Dalmatia / Croatia - HR/1/2005 2005. Sjeverozapadna Hrvatska - Northwest Croatia - HR/82/2008 2008. Sjeverozapadna Hrvatska - Northwest Croatia - HR/97/2008 2008. Sjeverozapadna Hrvatska - Northwest Croatia - 849VB 1987. Belgija - Belgium X95883 K357/88 1988. Njemačka - Germany AF159216 UK661 1989. Velika Britanija - Great Britain X92760 Slo1-95 1995. Slovenija - Slovenia EU025720 Slo2-96 1996. Slovenija - Slovenia EU025723 Slo4-96 1996. Slovenija - Slovenia EU025722 MOH96 1996. Mađarska - Hungary AF548659 AL10 1997. Francuska - France AY907000 Cro-Po/00 2000. Sjeverozapadna Hrvatska - Northwest Croatia EU184687 Cro-Ig/02 2002. Sjeverozapadna Hrvatska - Northwest Croatia EU184685 Slo5-04 2004. Slovenija - Slovenia EU025724 Slo7-04 2004. Slovenija - Slovenia EU025728 Slo12-06 2006. Slovenija - Slovenia EU025727 Slo13-06 2006. Slovenija - Slovenia EU025732 Slo14-06 2006. Slovenija - Slovenia EU025733 35.592 nepoznata - unknown Mađarska - Hungary AF548660

Molekularne metode

Ukupna RNA je izdvojena iz nadtaloga homogeniziranih burzi pomoću reagensa TRIzol® (Invitrogen™ Life Techno-logies, SAD) i prema uputama proizvođača. Komplemen-tarna DNA (cDNA) je sintetizirana korištenjem nasumičnih heksamera i komercijalnog kompleta GeneAmp® Gold RNA

PCR Core Kit (Applied Biosystems, SAD) i prema uputama proizvođača. Lančana reakcija polimerazom (PCR – engl. polymerase chain reaction) za varijabilno područje gena VP2 od 552 para baza učinjena je prema postupku Katarie i sur. (1998.) pomoću nizvodne klice 5'-CGCTATAGGGCTTGACCCAAAAA-3' i uzvodne klice 5'-CTCACCCCAGCGACCGTAACGACG-3'. Dobiveni PCR


proizvod je odvojen elektroforezom u 2%-tnom gelu aga-roze s dodatkom etidijevog bromida (0,5 mg/l) i vizualiziran pomoću ultraljubičastog svjetla. Dio gela sa specifičnim PCR proizvodom je izrezan i pročišćen komercijalnim kompletom Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, SAD). Pročišćeni proizvodi su sekvencirani u oba smjera na uređaju 3730XL DNA (Applied Biosystems, SAD) i pomoću kompleta BigDye v3.1 (Applied Bio-systems, SAD). Za sekvenciranje su korištene klice P2.3 (nizvodna) i RP5.3 (uzvodna), (Lin i sur., 1993.). Na ovaj način je svaki od 474 nukleotida varijabilnog područja gena VP2 istraživanih izolata od 703. do 1176. pozicije prema Baylissu i sur. (1990.) analiziran najmanje 2 puta. Nakon što su iz dobivenih sekvenci uklonjeni dijelovi koji odgovaraju klicama korištenim za sekvenciranje, preostali

dio nukleotidnih sekvenci za svaki istraživani izolat je obje-dinjen pomoću računalnog programa ALIGN Plus 2.0. Za filogenetsku analizu je korišten računalni program Clustal W 1.83, a filogenetsko stablo je prikazano pomoću računalnog programa TreeView 1.6.0. Dobivene nukleotidne sekvence su također prevedene u aminokiselinski slijed pomoću računalnog programa ALIGN Plus 2.0 kako bi se odredio patotip istraživanih izolata.

Rezultati

Rezultati filogenetske analize su prikazani Slikom 1. Pre-vođenjem nukleotidnog u aminokiselinski slijed u svim istraživanim izolatima na pozicijama 256 i 294 nađen je izoleucin, dok je na poziciji 299 nađen serin.

Slika 1. Filogenetsko stablo vrlo virulentnihvirusa zarazne bolesti burze na temelju analizevarijabilnog područja gena VP2. Izolati izHrvatske su označeni podebljanim slovima, doksu izolati analizirani u ovom istraživanjupodcrtani. Izolati iz Dalmacije su označeniasteriskom. Početna sekvenca za filogenetskuanalizu je 52/70, soj klasičnog virusa zaraznebolesti burze, s pristupnim brojem u genskojbanci D00869, (izolat nije prikazan na slici).Duljina vodoravnih grana je proporcionalnagenskoj udaljenosti između pojedinih izolatavirusa Figure 1. Phylogenetic tree for very virulentinfectious bursal disease viruses based on thevariable region of the VP2 gene. Isolates fromCroatia are in bold whereas isolates from thisstudy are underlined. Isolates from Dalmatiaare marked with asterisk. The tree is rootedwith 52/70, a classical infectious bursal diseasevirus, with the GeneBank accession numberD00869 (the isolate is not shown in the figure).Length of the horizontal lines is proportional tothe genetic distance among individual isolates


Rasprava

U svih 16 istraživanih izolata u varijabilnom području VP2 na pozicijama 256 (izoleucin), 294 (izoleucin) i 299 (serin) nađene su aminokiseline koje izolate određuju kao vvVZBB (Brown i sur., 1996.; Etarradossi i sur., 1998.; Yamaguchi i sur., 1997.; Zierenberg i sur., 2000.) što odgovara kliničkoj slici i visokom uginuću uslijed pojava ZBB tijekom kojih su prikupljeni uzorci za istraživanje. Filogenetski je obrađeno ukupno 18 izolata iz Hrvatske izdvojenih tijekom razdoblja od 12 godina, od čega je 10 izolata iz Dalmacije i 6 izolata iz sjeverozapadne Hrvatske, koji su analizirani u okviru ovog istraživanja, te 2 izolata vvVZBB iz istraživanja Lojkić i sur. (2008.), također iz sjeverozapadne Hrvatske. Svi analizirani izolati iz Hrvatske do 2000. potječu iz Dalmacije, dok su kasniji analizirani izolati podrijetlom iz Dalmacije i iz sjeverozapadne Hrvat-ske. Analizom je zapažena genska raznolikost izolata vvVZZB što se također odnosi i na međusobnu raznolikost 6 izolata iz 1996. S obzirom da je vrlo virulentna ZBB prvi put zapažena 1995. u sjeverozapadnom dijelu zemlje, po-stavlja se pitanje raznolikosti vvVZBB koji su izdvojeni naredne godine u Dalmaciji. Ovu činjenicu moguće je tumačiti višestrukim unosom ovog virusa u našu zemlju u relativno kratkom razdoblju, ali isto tako i cirkuliranjem ovog virusa u naše peradi kroz duže razdoblje prije nego li je vrlo virulentna ZBB zapažena i prepoznata u našoj zemlji. Ovakvoj situaciji mogle su pogodovati i ratne okolnosti u našoj zemlji od 1991. do 1995. kada je bilo značajno ote-žano sustavno praćenje zdravlja peradi, poglavito na okupi-ranim područjima i u ekstenzivno držane peradi. Slično na-šoj pretpostavci, novija istraživanja upućuju da su vvZBBV zapravo nastali u zapadnoj Africi odakle su se proširili u zapadnu Europu i brojne zemlje svijeta (Owoade i sur., 2004.). Pretpostavka se temelji na iznimno velikoj razno-likosti dobivenih sekvenci gena koji kodira za VP2 u izolatima iz Nigerije koja je veća od raznolikosti vvVZBB izdvojenih u ostalim dijelovima svijeta. Velika sličnost pojedinih izolata iz iste regije u Hrvatskoj, ali izdvojenih u razmaku od gotovo jednog desetljeća, uka-zuje na ukorijenjenost ovog virusa u pojedinim područjima naše zemlje. Ovo se najbolje vidi na primjeru izolata AB-1082/96 i AK-14-12/05 koji su identični u istraživanom dijelu gena VP2, izdvojeni su u istoj županiji, ali s vre-menskim razmakom od 9 godina. Slična pojava zapažena je u filogenetskom stablu i s izolatima iz Slovenije gdje je primjerice izolat Slo14-06 iz 2006. vrlo sličan izolatu Slo1-95 iz 1995., ali se značajnije razlikuje od drugih izolata izdvojenih iste godine. Istraživanje većeg broja izolata vvVZBB iz naše zemlje mo-že dati uvid u podrijetlo i putove širenja ovog virusa što će doprinijeti otkrivanju izvora zaražavanja i suzbijanju ove bolesti.

Zahvala

Autori izražavaju svoju zahvalnost Anti Bubiću dr.vet. med. i mr.sc. Aniti Kokić na pomoći u prikupljanju uzoraka za ovo istraživanje.

Literatura

Bayliss, C. D., U. Spies, K. Shaw, R. W. Peters, A. Papegeorgiou, H. Müller, M. E. G. Boursnell (1990.): A comparison of the sequences of segment A of four infectious bursal disease virus strains and identification of a variable region in VP2. J. Gen. Virol. 71, 1303 - 1312.

Brown, M. D., P. Green, M. A. Skinner (1994.): VP2 sequences of recent European ‘‘very virulent’’ isolates of infectious bursal disease virus are closely related to each other but are distinct from those of ‘‘classical’’ strains. J. Gen. Virol. 75, 675 – 680.

Brown, M. D., M. A. Skinner (1996.): Coding sequences of both genome segments of a European 'very virulent' infectious bursal disease virus. Virus. Res. 40, 1 - 15.

Eterradossi, N., C. Arnauld, D. Toquin, G. Rivallan (1998.): Critical amino acid changes in VP2 variable domain are associated with typical and atypical antigenicity in very virulent infectious bursal disease viruses. Arch. Virol. 143, 1627 – 1636.

Garriga, D., J. Querol-Audi, F. Abaitua, I. Saugar, J. Pous, N. Verdaguer, J. R. Caston, J. F. Rodriguez (2006.): The 2.6-angstrom structure of infectious bursal disease virus-derived t = 1 particles reveals new stabilizing elements of the virus capsid. J Virol. 80, 6895 – 6905.

Kataria, R. S., A. K. Tiwari, S. K. Bandyopadhyay, J. M. Kataria, G. Butchaiah (1998.): Detection of infectious bursal disease virus of poultry in clinical samples by RT-PCR. Biochem. Mol. Biol. Inter. 45, 315 – 322.

Lojkić, I., Z. Biđin, B. Pokrić (2008.): Sequence analysis of both genome segments of three Croatian infectious bursal disease field viruses. Avian Dis. 52, 513 - 519.

Müller, H., M. R. Islam, R. Raue (2003.): Research on infectious bursal disease - the past, the present and the future. Vet. Microbiol. 97, 153 – 165.

Owoade, A. A., M. N. Mulders, J. Kohnen, W. Ammerlaan, C. P. Muller (2004.): High sequence diversity in infectious bursal disease virus serotype 1 in poultry and turkey suggests West-African origin of very virulent strains. Arch. Virol. 10, 653 - 672.

Savić, V. (1999.): Epizootiološke značajke intenzivne peradarske proizvodnje Hrvatske proteklih 35 godina. Stočarstvo 53, 449 - 459.

Savić, V., Z. Biđin, S. Čajavec, Marija Stančić, Đ. Gjurčević, Gordana Savić (1997.): Epidemic of infectious bursal disease in Croatia during the period 1995-1996: Field and experimental observations. Vet. Arhiv, 67 243 - 251.

Sharma, J. M., I. J. Kim, S. Rautenschlein, H. Y. Yeh (2000.): Infectious bursal disease virus of chickens: pathogenesis and immunosuppression. Dev. Comp. Immunol. 24, 223 – 235.

Van den Berg, T. P. (2000.): Acute infectious bursal disease in poultry: a review. Avian Pathol. 29, 175 – 194.

Yamaguchi, T., M. Ogawa, M. Miyoshi, Y. Inoshima, H. Fukushi, K. Hirai (1997.): Sequence and phylogenetic analyses of highly virulent infectious bursal disease virus. Arch. Virol. 142, 1441 - 1458.

Zierenberg, K., H. Nieper, T. P. van den Berg, C. D. Ezeokoli, M. Voss, H. Müller (2000.): The VP2 variable region of two German and 11 African isolates of infectious bursal disease viruses (IBDV): Comparison of the amino acid sequences with very virulent, "classical" virulent, and attenuated tissue culture-adapted strains. Arch. Virol. 145, 113 -125.


LONGITUDINAL STUDY OF VERY VIRULENT INFECTIOUS BURSAL DISEASE VIRUSES IN CROATIA DURING THE PERIOD 1996 - 2008

Summary

Sixteen isolates of very virulent infectious bursal disease (vvIBD) virus from the Northwest Croatia and Dalmatia collected during the period 1996 - 2008 were phylogenetically analyzed. All isolates had amino acids in the VP2 variabe region typical for very virulent viruses at the positions 256 (isoleucine), 294 (isoleucine) and 299 (serine). Significant genetic diversity of isolates from 1996 indicates possible multiple introduction of the virus into Croatia, but also its circulation in Croatian poultry during the longer period before 1995 when vvIBD was for the first time noted and recognized in Croatia. In contrast, high similarity of certain isolates from the same region, but isolated in time span of almost a decade, indicates enzootic character of the virus in certain areas of the country. Key words: phylogenetical analysis, infectious bursal disease, Republic of Croatia


EVALUATION OF RNA ISOLATION METHODS FOR THE DETECTION OF INFLUENZA A VIRUSES IN DIFFERENT ENVIRONMENTAL SAMPLES BY REAL-TIME RT-PCR

Adela Fratnik Steyer1, Olga Zorman-Rojs1, Brigita Slavec1, Uroš Krapež1, Barbara Muščet2, Aleš Lapanje2, Alexis Zrimec2, Darja Barlič-Maganja1,3

1University of Ljubljana, Veterinary Faculty, Ljubljana, Slovenia 2 Institute of Physical Biology, Grosuplje, Slovenia 3 University of Primorska, College of Health Care Izola, Izola, Slovenia

Summary

So far, only little data about the resistance of the influenza A virus in the environment exist. It is well known that the avian influenza virus (AIV) can survive in faeces and it can also be transmitted by contaminated equipment and personnel. Particularly weakly described is the significance of shores where waterfowls, which could be infected with AIV, gather. The purpose of our work was to develop an efficient molecular method for AIV detection which enables us to trace the virus in complex environmental samples. For reliable identification of AIV an efficient method for virus RNA isolation from such samples is very significant. For this reason, less and more complex environmental materials were selected (mineral sand, shore sand and litter with faeces). The inactivated AIV H5N2 strain was spiked into each matrix. Different RNA isolation methods were tested and their efficiency was determined by an implemented real-time RT-PCR method. For more complex matrixes the best results were obtained with Trizol Plus RNA Purification Kit (Invitrogen), where contaminants were efficiently removed by silica columns. In less complex matrix which was represented by a mineral sand from a Swiss glacier, the best recovery gave a new SmartHelixTM nucleic acid extraction method developed by IFB d.o.o. The findings from this research may give some guidelines for the use of appropriate molecular methods in the study of distribution of these viruses in the environment. The use of efficient molecular methods could also be helpful in the development of strategies to minimize the spread of AIV. Key words: avian influenza virus, nucleic acid extraction method, environmental samples, real-time RT-PCR Introduction Various species of aquatic or wetland birds (particularly ducks, geese, swans, gulls and shorebirds) are considered to be the natural reservoir of all subtypes of avian influenza A viruses (AIV) (Munster et al., 2007). In birds, AIVs multiply in the respiratory and lower intestinal tracts and are excreted in high concentrations in their faeces. These viruses have lipid envelopes that influence their resistance to chemical and physical factors including: moisture, temperature, pH, light and aeration (Spencer et al., 2007). Moist and low temperatures favour survival of the virus. It was reported that AIV survived for 105 days in liquid manure during winter months (Swayne and Halvorson, 2003). In the natural environment AIVs were isolated from water samples taken

from lakes in Canada when wild ducks were present, and also from faecal samples along the shores. In AI outbreaks in poultry, safely disposing of manure and other potentially contaminated wastes is very important. The practice of spreading virus-contaminated manure on land results in environmental contamination that could contribute to spreading of the disease (Spencer et al., 2007). Alexander (2003) suggested that the greatest potential for spread of the virus from farm to farm was by humans and their equipment, presumably contaminated with manure. The purpose of our work was to identify the most appropriate nucleic acid extraction method for real-time RT-PCR-based AIV detection which enables us to trace the virus in complex environmental samples.

Adela Fratnik Steyer, PhD student, University of Ljubljana, Veterinary Faculty, Gerbičeva 60, SI-1115 Ljubljana, Slovenia; tel.:+386 1 4779 846; fax: +386 1 4779 352; E-mail: [email protected]

EVALUATION OF RNA ISOLATION METHODS FOR THE DETECTION OF INFLUENZA A VIRUSES IN DIFFERENT ENVIRONMENTAL SAMPLES BY REAL-TIME RT-PCR 125


Virus and environmental samples for spiking experiments In this study an inactivated AIV isolate A/ost/Denmark/ /72420/96 (H5N2) (VLA, Weybridge, UK) was used as a surrogate virus of the highly pathogenic AI H5N1 subtype. The H5N2 10-fold serial dilutions isolated by two methods were tested and 100-fold and non-diluted virus suspensions were chosen for spiking experiments. Three less and more complex environmental materials (mineral sand, shore sand and litter with faeces) were tested as matrixes. Mineral sand from a Swiss glacier represents the less complex environmental sample. Preliminary results obtained by this material direct further study. The matrix with intermediate complexity was the sand collected from different parts of the Kamniška Bistrica shore. The more complex material was litter with faeces taken from a typical broiler poultry farm.

RNA extraction for viral recovery An amount of 1g of each matrix was inoculated with 100μl of viral suspension or phosphate-buffer saline (PBS) for negative control. The inoculated litter with faeces was resuspended in 4ml of sterile MEM (minimal essential media), vortexed and centrifuged at 1600 x g for ten minutes. Only 100μl of faeces supernatant was taken for RNA isolation. Total RNA or nucleic acids (NA) were extracted from inoculated environmental samples using Trizol based methods (Invitrogen) or SmartHelix isolation kit (IFB d.o.o), respectively, according to the manufacturer’s instructions. In the first part of the study on mineral sand the benefit of RNAlater (Ambion) preventing the RNA degradation and the influence of DNA load in the samples were evaluated. The second part was focused on viral RNA recovery to define the most adequate specific NA extraction method for more complex samples. All extracted RNAs were resuspen-

ded or eluted in 50μl DEPC treated water (Invitrogen) and stored at -70 °C.

Amplification and detection of AIV by real time RT-PCR Primers and slightly modified FAM-labeled MGB probe (5’FAM-ACC GTG CCC AGT GAG –MGB-3’) (Ward et al., 2004) which specifically detect all AIV subtypes (data not shown) were used in the study. For matrix protein gene amplification Superscript III one-step qRT-PCR commercial kit (Invitrogen) was used under the following reaction con-ditions: reverse transcription at 50 °C for 15min, denatu-ration at 95 °C for 2min, followed by 50 PCR cycles (95 °C for 15s, 54 °C for 30s, 60 °C for 30s). Real-time PCR re-actions were performed in 25μl reaction mixtures containing 2 x Reaction mix with ROX as a passive reference dye. The 400nM primer and 100nM probe concentrations were used. The real-time assays were run on an ABI PRISM 7000 amplifying detection system (Applied Biosystems).

Results

In the first part of the study the suitability of three NA extraction methods: Tri Reagent® (Ambion), RNA PowerSoilTM Total RNA isolation kit (Mo Bio Laboratories, Inc.) and SmartHelixTM (IFB d.o.o.) were evaluated for AIV RNA isolation from spiked glacier mineral sand (Table 1.). Preliminary results show that the SmartHelixTM method has a great potential for efficient RNA recovery from such kind of environmental samples in spite of the fact that it was developed for co-extraction of DNA and RNA. To eliminate the possibility of real-time RT-PCR inhibition by co-extracted DNA, SmartHelix isolated NA was treated with DNase (Fermentas) (Table 1.). The results suggested that RNAlater dramatically affects the final yield of RNA extracted from environmental samples. The experiment with mineral sand was repeated with Trizol reagent (Invitrogen) and SmartHelixTM nucleic acid extraction methods in order to check the reliability of the results (Table 2.).

Table 1. Influence of the RNA extraction method on AIV detection in environmental sample

Samples

RNA extraction method

Mineral sand + H5N2

Mineral sand + H5N2 + RNAlater

Mineral sand Mineral sand + RNAlater

Working solution H5N2

Working solution H5N2 + RNAlater

TRI Reagent* neg neg neg neg 38,5 (0) 39,8 (1,57)

RNA PowerSoil* neg neg neg neg neg neg

SmartHelix* 39,3 (1,88) neg neg neg 29,8 (0,84) neg

SmartHelix treated with DNase* 38,8 (1,23) neg neg neg 30,6 (0,31) neg

Note. * Results after the amplification as mean Ct values (with CV [%]).


Table 2. Amplification data used to determine the most appropriate nucleic acid extraction method for AI virus detection in mineral sand

RNA extraction method Trizol reagent SmartHelixTM

Sample Glacier mineral sand spiked with 100-fold diluted H5N2 suspension

RNA dilutions non-diluted RNA 10-fold diluted RNA non-diluted RNA 10-fold diluted RNA

Signal ratio (positive/total No. of reactions) 0/8 0/8 6/8 7/8

Mean Ct values neg neg 38,29 38,38

SD of Ct values –* – 1,3 1,33

CV of Ct values (%) – – 3,4 3,47

Sample 100-fold diluted H5N2 working suspension – positive control

Mean Ct values 27,64 31,67 27,94 32,01

SD of Ct values 0,16 0,045 0,095 0,14

CV of Ct values (%) 0,58 0,14 0,34 0,44

Note. * Standard deviation (SD) and coefficient of variation (CV) could not be calculated due to negative real-time RT-PCR results. The second part of the study was focused on the efficiency of the AIV RNA isolation from shore sand and litter with faeces. Two NA extraction methods were tested and the isolated RNA was analyzed by real-time RT-PCR. From results obtained with 10-fold serially diluted RNA we

could conclude that the most appropriate RNA extraction method was Trizol Plus RNA Purification Kit (Invitrogen) (Tables 3. and 4.). The advantage of this method is an additional purification with silica based columns.

Table 3. Amplification data used to determine the most appropriate nucleic acid extraction method for AI virus detection in

shore sand

RNA extraction method Trizol Plus RNA Purification Kit SmartHelixTM

Sample Shore sand spiked with

Working H5N2 suspension non-diluted H5N2 susp. 100-fold H5N2 susp. non-diluted H5N2 susp. 100-fold H5N2 susp.

RNA dilutions non-

diluted RNA

10-fold diluted RNA

100-fold diluted RNA

non-diluted RNA

10-fold diluted RNA


non-diluted RNA

10-fold diluted RNA


non-diluted RNA

10-fold diluted RNA


Signal ratio (positive/total No. of reactions)

0/8 8/8 8/8 0/8 8/8 5/8 0/8 4/8 8/8 0/8 0/8 8/8

Mean Ct values neg 32,3 31,57 neg 36,87 38,57 neg 29,74 29,19 neg neg 37,04

SD of Ct values –* 1,24 0,42 – 0,6 1,32 – 0,09 1,04 – – 0,67

CV of Ct values (%) – 3,82 1,32 – 1,63 3,41 – 0,31 3,58 – – 1,8

Sample Working H5N2 suspension – positive control

Mean Ct values 17,95 21,48 24,98 28,25 32,24 35,93 17,51 21,13 24,68 28,21 31,92 35,7

SD of Ct values 0,01 0,005 0,01 0,14 0,1 0,28 0,09 0,075 0,09 0,15 0,14 0,34

CV of Ct values (%) 0,056 0,023 0,04 0,47 0,31 0,79 0,51 0,36 0,36 0,52 0,42 0,94

Note. * Standard deviation (SD) and coefficient of variation (CV) could not be calculated due to negative real-time RT-PCR results.


Table 4. Amplification data used to determine the most appropriate nucleic acid extraction method for AI virus detection in litter with faeces

RNA extraction method Trizol Plus RNA Purification Kit SmartHelixTM

Sample Litter with feces spiked with Working H5N2 suspension

non-diluted H5N2 susp.

100-fold H5N2 susp.

non-diluted H5N2 susp.

100-fold H5N2 susp.

RNA dilutions non-diluted RNA

10-fold diluted RNA


non-diluted RNA

10-fold diluted RNA


non-diluted RNA

10-fold diluted RNA


non-diluted RNA

10-fold diluted RNA


Signal ratio (positive/total No. of reactions)

8/8 7/8 8/8 8/8 7/8 0/8 0/8 4/8 8/8 0/8 0/8 0/8

Mean Ct values 26,33 29,75 33,09 35,29 38,78 neg neg 33,4 33,96 neg neg neg SD of Ct values 0,26 0,32 0,4 0,39 0,84 – – 0,52 1,25 – – –* CV of Ct values (%) 1,0 1,06 1,21 1,12 2,16 – – 1,55 3,67 – – – Mean Ct values 25,58 29,62 32,9 34,88 38,77 neg 26,11 29,91 32,15 34,15 36,99 neg SD of Ct values 0,04 0,14 0,12 0,1 0,86 – 0,13 0,05 0,11 0,11 0,26 – CV of Ct values (%) 0,16 0,46 0,36 0,29 2,22 – 0,48 0,17 0,33 0,32 0,7 –

Note. * Standard deviation (SD) and coefficient of variation (CV) could not be calculated due to negative real-time RT-PCR results

Discussion and conclusions According to the obtained results the following conclusions were accepted: a) In less complex matrix represented by mineral sand from

a Swiss glacier the best recovery of RNA gave the new SmartHelixTM nucleic acid extraction method developed by IFB d.o.o. Showing negative results in all tested samples, RNA PowerSoilTM Total RNA isolation kit was not included in further experiments. In the repeated experiments the reliability and the repeatability of the SmartHelixTM extraction method was confirmed.

b) As SmartHelixTM was developed for extraction of total NA from various samples, the DNase treatment was included following the extraction. As shown further amplification it had no influence on real-time RT-PCR efficiency. In addition, RNAlater seemed to have an inhibitory effect on RNA extraction or amplification. Thus, it was excluded from the following experiments.

c) For more complex matrixes the best results were obtained with Trizol Plus RNA Purification Kit, where contaminants were efficiently removed by silica columns. Comparing to Trizol Plus RNA Purification Kit, the SmartHelix extraction was less efficient for RNA isolation from more complex environmental samples.

In complex environmental samples PCR inhibitors are present and they are often co-extracted with NA. Thus, Trizol Reagent was replaced with Trizol Plus RNA Purification Kit as it had an additional purification step included in the extraction procedure. Although the SmartHelix kit can be widely used for DNA and RNA

extraction, it also has some disadvantages, e.g. possible co-extraction of PCR inhibitory substances from complex samples, usage of phenol in extraction procedures known as PCR inhibitor etc. (Cankar et al., 2006) Unexpectedly, AIV was very efficiently detected in the most complex sample (litter with faeces). This achievement can be explained by the different approach for sample preparation before the extraction rather than by the extraction method efficiency itself. The findings from our research may give some guidelines for the usefulness of molecular methods in studies of distribution of these viruses in the environment. The use of efficient molecular methods for AI virus detection in various environmental samples could be helpful in the development of strategies to minimize the spread of AI viruses.

Acknowledgement

This work was supported by the Slovenian Research Agency and the Slovenian Ministry of Defense and is part of the project 450/07/V TP MIR 07/33.

References

Alexander, D.J. (2003): Newcastle disease. In: Diseases of Poultry. 11th ed. Y.M. Saif, H.J. Barnes, J.R. Glisson, A.M. Fadly, L.R. McDougald, D.E. Swayne, eds. Iowa State University Press, Ames 64-87.

Cankar, K., D. Štebih, T. Dreo, J. Žel, K. Gruden (2006): Critical points of DNA quantification by real-time PCR-effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnol 6, 37.


Munster, V.J., C. Baas, P. Lexmond, J. Waldenstrom, A. Wallen-sten, T. Fransson, G. Rimmelzwaan, W. Beyer, M. Schutten, B. Olsen, A. Osterhaus, R. Fouchier (2007): Spatial, temporal and species variation in prevalence of influenza A viruses in wild migratory birds. PLoS Pathogens 3, 0630-0638.

Spencer, J.L., J. Guan, B.W. Brooks (2007): Survival of avian influenza and other poultry viruses in the environment and during composting of carcasses – a review. 15th World veterinary poultry congress abstract book 14-19.

Swayne, D.E. and D.A. Halvorson (2003): Influenza. In: Diseases of Poultry. 11th ed. Y.M. Saif, H.J. Barnes, J.R. Glisson, A.M. Fadly, L.R. McDougald, D.E. Swayne, eds. Iowa State University Press, Ames 135-160.

Ward, C.L., M.H. Demplsey, C.J.A. Ring, R.E. Kempson, L. Zhang, D. Gor, B.W. Snowden, M. Tisdale (2004): Design and performance testing of quantitative real time PCR assay for influenza A and B viral load measurement. J Clin Virol. 29, 179-188.

VREDNOVANJE METODA IZOLACIJE RNK ZA DETEKCIJU VIRUSA INFLUENCE IZ RAZLIČITIH UZORAKA OKOLIŠA METODOM REAL-TIME RT-PCR

Sažetak

Do danas su poznati malobrojni podaci o rezistentnosti virusa influence A u okolišu. Dobro je poznato da virus influence ptica može preživjeti u izmetu i može biti prenesen putem kontaminirane opreme i osoblja. Posebice je nedovoljno opisan značaj obala na kojima se okupljaju ptice vodarice, koje mogu biti inficirane virusom influence ptica. Svrha našeg rada bila je razvoj efikasne molekularne metode za detekciju virusa influence ptica koja omogućava praćenje virusa u kompleksnim uzorcima iz okoliša. Za pouzdanu identifikaciju virusa influence ptica, vrlo je značajna učinkovita metoda za izolaciju virusne RNK iz takvih uzoraka. Iz tog razloga odabrani su manje i više složeni materijali iz okoliša (mineralni pijesak, pijesak s obale i smeće s izmetom). Soj inaktiviranog virusa influence ptica tipa H5N2 stavljen je u svaku matricu. Različite metode izolacije RNK su testirane i njihova efikasnost utvrđena putem implementirane metode Real-Time RT-PCR. Za složenije matrice, najbolji su rezultati dobiveni s Trizol Plus RNA Purifikacijskim kompletom (Invitrogen), pri čemu su onečiščenja učinkovito uklonjena pomoću silicijskih kolumni. U manje složenoj matrici koju je predstavljao mineralni pijesak iz švicarskog glečera, najbolji oporavak pokazala je nova metoda SmartHelixTM za ekstrakciju nukleinske kiseline koju je razvila tvrtka IFB d.o.o. Nalazi ovog istraživanja mogli bi dati smjernice za korištenje prikladnih molekularnih metoda u studiji distribucije tih virusa u okolišu. Korištenje efikasnih molekularnih metoda bilo bi korisno i za razvoj strategija za smanjenje proširenosti virusa influence ptica. Ključne riječi: virus ptičje gripe, metoda ekstrakcije nukleinske kiseline, uzorci iz okoliša, real-time RT-PCR


HUMORALNI I STANIČNI IMUNOSNI ODZIV TOVNIH PILIĆA IMUNIZIRANIH ŽIVIM ILI INAKTIVIRANIM CJEPIVOM PROTIV NEWCASTLESKE BOLESTI

Mirta Balenović1, Vladimir Savić1, Maja Popović2, Anamaria Ekert Kabalin3, Tajana Amšel Zelenika1, Luka Jurinović1, Ivica Valpotić2

1 Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska 2 Zavod za biologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska 3 Zavod za stočarstvo, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Jedan od značajnih preduvjeta uspješne intenzivne peradarske proizvodnje je zdrava i imunokompetentna perad. Zbog toga postoji veliki interes za razumijevanje uloge i odnosa između humoralne i stanične imunosti, odnosno uloge protutijela i imunosnih stanica s ciljem postizanja što boljeg imunosnog odziva. Današnja saznanja o djelovanju cjepnog virusa newcastleske bolesti (NB) na humoralni i stanični imunosni odziv u peradi, posebice poslije primjene različitih tipova cjepiva na poticanje imunosnog odziva su nedostatna. Razvojem imunoloških metoda omogućeno je praćenje kinetike imunosnih stanica kroz vremensko razdoblje na poticaj imunogenom. U istraživanju smo se usredotočili na dinamiku tvorbe protutijela, limfocita, pomoćničkih i citotoksičnih T limfocita u tovnih pilića cijepljenih liofiliziranim živim cjepivom soja La Sota virusa ili inaktiviranim cjepivom protiv NB izrađenim od istog soja. Kinetika ukupnih limfocita, pomoćničkih i citotoksičnih T limfocita kao i protutijela značajno se mijenja u pokusnim skupinama, što dokazuje aktivaciju staničnog i humoralnog imunosnog odziva s obzirom na svojstvo umnažanja imunogena u domaćinu. Tako je cjepivo sa živim sojem La Sota virusa protiv NB potaknulo bržu i snažniju imunoreaktivnost koja uključuje humoralnu i staničnu imunost. Također, inaktivirano cjepivo virusa NB je potaknulo stanični i humoralni imunosni odziv, ali nešto manju imunoreaktivnost od cjepiva sa živim sojem La Sota virusa NB. Ključne riječi: newcastleska bolest, cjepivo, tovni pilići, imunosni odziv Uvod Newcastleska bolest (NB) je, od svih virusnih zaraznih bolesti peradi, zasigurno najznačajnije obilježila proteklih 40 godina peradarske proizvodnje u Republici Hrvatskoj. Ci-jepljenje peradi protiv NB, u intenzivnoj proizvodnji kao i u ekstenzivnom držanju, ubraja se u redovite postupke kojima se provodi specifična imunoprofilaksa. Unatoč sustavnom cijepljenju protiv NB, ta bolest predstavlja značajnu pre-preku u peradarskoj proizvodnji u mnogim zemljama. Kao i većina zemalja, Hrvatska je donijela niz mjera koje se odnose na kontrolu i eradikaciju NB. Intenzivna peradarska proizvodnja uvelike ovisi o uspješnoj kontroli zaraznih bo-lesti. Pritom je cijepljenje najučinkovitiji i najjeftiniji način suzbijanja zaraznih bolesti te je uvelike pridonijela nadzoru,

osobito protiv bolesti virusne etiologije (Savić, 1999.; Savić i sur., 2001.; Savić, 2003.). Ptice reagiraju na cjepivo hu-moralnim i staničnim imunosnim odzivom. Uspješnost ci-jepljenja u jatima prati se dokazivanjem porasta titra pro-tutijela tijekom nekoliko dana nakon cijepljenja. Premda je stanični imunosni odziv veoma značajan u poticaju imuno-sne zaštite potaknute cijepljenjem, postupak provjere stanič-ne imunosti je zahtjevan i nije uobičajen za perad. Nekoliko istraživanja ukazuje da određivanje brzine izlučivanja IFN-γ od T limfocita nakon in vitro poticaja može biti dobar po-kazatelj stanične imunosti nakon infekcije ili cijepljenja (Lambrecht i sur., 2004.). Humoralni imunosni odziv temelji se na djelovanju slobod-nih ili humoralnih protutijela (lat. humor, tjelesni sok, teku-ćina) koja se nalaze u krvi i drugim tjelesnim tekućinama i

Dr. sc. Mirta Balenović, Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; Tel: 2441-392, 2441-394; E-mail: [email protected]

HUMORALNI I STANIČNI IMUNOSNI ODZIV TOVNIH PILIĆA IMUNIZIRANIH ŽIVIM ILI INAKTIVIRANIM CJEPIVOM PROTIV NEWCASTLESKE BOLESTI 130

izlučevinama. Tvore ih plazma-stanice koje nastaju od B limfocita. Svaki B limfocit specifičan je samo za određeni antigen, odnosno antigensku determinantu, a prepoznaje ga pomoću površinskih imunoglobulina koji služe kao receptori antigena (Naglić i Hajsig, 1993.; Zekarias i sur., 2002.). U staničnoj imunosti T limfociti imaju vrlo važnu ulogu. Dokazani su u različitim limfoidnim tkivima uključujući timus, slezenu i limfoidna tkiva povezana uz sluznicu kao što su cekumske tonzile te crijevno i bronhijalno limfoidno tkivo (Lillehoj, 1991.). Limfociti koji migriraju iz timusa i naseljavaju sekundarne limfoidne organe klasificirani su kao T limfociti. T limfociti ni u ptica, kao ni u sisavaca, nemaju karakteristična obilježja, očituju se površinskim receptorima i reagiraju s mitogenima te površinskim antigenima (Sharma i Tizard, 1984.). Različita funkcija limfocitnih populacija očituje se u drukčijoj građi njihovih površinskih molekula. Neke molekule izražene su na svim stanicama pojedine populacije, a nisu izražene na stanicama druge populacije. Budući da je mikroskopski teško ili nemoguće razlikovati limfocite, koriste se specifični biljezi za prepoznavanje, pro-učavanje funkcije ili međusobno razdvajanje pojedinih po-pulacija limfocita (Andreis i sur., 1998.). Razvoj i imunosno dozrijevanje T limfocita određuje se dokazivanjem pojedinih glikoproteina antigenskih svojstava na njihovoj površini koja služe kao “biološki biljezi”. Antigenski biljezi ozna-čavaju se kao CD (engl. cluster of differentiation, razlikovna skupina), a otkrivaju se pomoću monoklonskih protutijela (Saalmûller i sur., 1997.; Glick, 2000.). Ovisno o staničnoj populaciji, diferencijaciji stanica unutar iste stanične popu-lacije i njihovoj funkcionalnoj zrelosti, moguće je razlikovati leukocitne biljege koji tvore heterogenu skupinu molekula, a obuhvaćaju specifične receptore, adhezijske molekule i dr. Iako je njihov broj u sisavaca velik, nijedan od njih nije strogo specifičan za određenu staničnu populaciju ili za po-jedinu stanicu unutar nje. Međutim, zna se da je CD45 biljeg svih leukocita, CD14 biljeg monocitne populacije, CD3, CD4 i CD8 su biljezi T limfocita, CD19, i CD5 biljezi su B limfocita te CD16 i CD56 biljezi su NK stanica (Saalmûller i sur., 1997.). Posebnu ulogu u aktivaciji limfocita ima molekula CD45 koja se nalazi na površini T i B limfocita i svih leukocita (prvotni naziv: površinski leukocitni zajed-nički antigen) te pomaže aktivaciju tih stanica nakon vezanja antigena (Andreis i sur., 1998.). Monoklonsko protutijelo za kokošji CD45

+ iskazuje sve leukocite, ali ne i eritrocite te se koristi za istraživanja zajedničkih leukocitnih antigena u imunologiji ptica (Horiuchi i sur., 2004.). Pomoćnički T limfociti (engl. helper T cells, HTC) imaju regulacijsku ulo-gu i uključeni su u staničnu i humoralnu imunosnu reakciju (Naglić i Hajsig, 1993.). U sisavaca i ptica stečena imunost prema patogenima ovisi o odzivu T limfocita, osobito o odzivu pomoćničkih T limfocita CD4

+ (Vandaveer i sur., 2001.). Oni gotovo uvijek izražavaju na površini molekulu (koreceptor) CD4

+ (Sharma, 2003.). Citotoksični T limfociti (engl. cytotoxic T cells, CTL) imaju izvršnu ulogu u sta-ničnoj imunosnoj reakciji (Naglić i Hajsig, 1993.). Ti limfociti najčešće izražavaju površinske molekule CD8

+

(Sharma, 2003.). Balenović i sur. (2007.) navode u svom istraživanju da je relativna zastupljenost (%) limfocita u ukupnoj populaciji leukocita heterogenog uzorka pune ven-ske krvi kokoši, dobivena primjenom protočne citometrije, iznosila oko 60%. Relativna zastupljenost pojedinih subpo-pulacija T limfocita u ukupnom homogenom uzorku limfo-cita dobivena je na osnovi pozitivnih prisutnosti CD4

+ i CD8

+, odnosno dvostruke prisutnosti CD4+CD8

+ biljega na površini limfocita. Tako relativni udio pomoćničkih T limfo-cita u ukupnoj populaciji limfocita periferne krvi peradi iz-nosi 27,8%, citotoksičnih T limfocita 11,6 %, a CD4

+ CD8+ T

limfocita 3,4%. Cilj ovog istraživanja bio je usporediti razvoj humoralnog i staničnog imunosnog odziva u tovnih pilića cijepljenih dva-ma komercijalnim cjepivima protiv newcastleske bolesti. U istraživanju su korištene imunološke i serološke metode za dokazivanje tvorbe protutijela i porast ukupnih limfocita te pomoćničkih i citotoksičnih T limfocita koji sudjeluju u imunosnom odzivu domaćina na imunogen.

Materijali i metode

Cjepiva i pripravci za primjenu korišteni u istraživanju U istraživanju su se koristila dva komercijalna cjepiva protiv newcastleske bolesti: (1) PESTIKAL® LA SOTA SPF (Veterina d.o.o., Hrvatska) - liofilizirano živo cjepivo, soj La Sota, koje sadržava lentogeni živi virus newcastleske bolesti, umnožen u embrioniranim kokošjim SPF jajima. Jedna doza cjepiva sadržava najmanje 106.0 EID50 virusa newcastleske bolesti. Pomoćne tvari su polivinilpirolidon, peptoni, mono-natrijev glutamat, kalijev dihidrogen-fosfat. (2) PESTIKAL®

(Veterina d.o.o., Hrvatska) - inaktivirano cjepivo u uljnom adjuvansu koje sadrži virus newcastleske bolesti, umnožen u embrioniranim kokošjim jajima. Virus je inaktiviran formal-dehidom, disociran neionskim deterdžentom i suspendiran, uz dodatak emulgatora, u mineralnom ulju u obliku više-struke emulzije tipa voda/ulje/voda. Neutralna emulzija kori-stila se za skupinu tovnih pilića koji nisu dobiti inaktivirano cjepivo, a sadržava sve sastojke kao i inaktivirano cjepivo, osim virusnog antigena, dok je fiziološka otopina korištena kao placebo umjesto živog cjepiva protiv newcastleske bolesti.

Biološko istraživanje Istraživanje je provedeno na 45 tovnih pilića podrijetlom iz komercijalnog matičnog jata (Koka d.d., Varaždin). Jedno-dnevni pilići su bili zajedno smješteni do 14. dana, odnosno do dana cijepljenja. Nakon cijepljenja pilići su razdvojeni po skupinama, u svakoj skupini nalazilo se po 15 životinja, u odvojenim objektima na podnoj dubokoj stelji u skladu s tehnološkim uvjetima intenzivnog uzgoja. Pilići su dobivali kontroliranu hranu namijenjenu za tov pilića: od 1. do 21. dana starter, od 21. do 35. dana finišer I i od 35. do 42. dana finišer II. Tijekom pokusa, pilićima su hrana i voda bile dostupne po volji (ad libitum). Cijepljenje je provedeno u


dobi od 14 dana. Kontrolna skupina (K) tretirana je okulo-nazalno fiziološkom otopinom s po 100 μL i neutralnom emulzijom s po 500 μL i/m. Prva pokusna skupina (P1) cijepljena je okulonazalno, liofiliziranim živim cjepivom PESTIKAL® LA SOTA SPF resuspendiranom u 100 μL destilirane vode po cjepnoj dozi i neutralnom emulzijom u volumenu od 500 po piletu μL i/m. Druga pokusna skupina (P2) cijepljena je okulonazalno, inaktiviranim cjepivom PESTIKAL u volumenu od 500 μL i/m po piletu i fizio-loškom otopinom u volumenu od 100 μL po piletu. Krv je uzorkovana punkcijom iz srca uz dodatak citrata kao antikoagulansa 21. i 28. dan nakon cijepljenja.

Serologija Inhibicija hemaglutinacija za virus NB izvedena je beta postupkom u plastičnim mikrotitracijskim pločama s „V“ dnom. Upotrijebljene su 4 hemaglutinacijske jedinice odgo-varajućeg antigena (La Sota antigen, Centar za peradarstvo, 2006.) i 1 %-tni eritrociti pijetla. Mješavina serijskih raz-rjeđenja i antigena je inkubirana tijekom 60 minuta pri sobnoj temperaturi prije negoli su dodani eritrociti pijetla. Titri inhibirajućih protutijela prikazani su kao negativni logaritam baze 2 najvećeg razrjeđenja seruma pri kojem je još uvijek bila nazočna inhibicija hemaglutinacija. Serumi s titrima manjim od 4 log2 smatrani su neimunim uzorcima za virus NB.

Protočna citometrija U uzorcima pune krvi pilića (100 μL) određen je broj leukocita u aparatu za protočnu citometriju (COULTER® EPICS® XL™, Beckamn Coulter, SAD). Uzorci krvi (100 μL) bili su razrijeđeni u 1x PBS radnoj otopini do broja leukocita od 5,0 – 9,7 x 109/L. Potom je u 100 µL razrijeđene krvi dodano 50 µL monoklonskih protutijela (mPt) protiv kokošjih CD antigena obilježenih fluorescent-nim bojama (Anti-kokošji CD45 antigen FITC, Anti-kokošji

CD4 antigen BIOT i Anti-kokošji CD8 antigen R-PE; Southern Biotechnology Associates, Inc., SAD) te je inku-birana tijekom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Po inku-baciji uzorci su isprani s 1 mL 1x PBS-a te centrifugirani tijekom 5 minuta na 2000 okretaja/min. Supernatant je na-kon centrifugiranja odbačen i na talog je dodano 0,5 mL lizirajućeg pufera (amonij klorid, NH4Cl, pH 7,3) te je suspenzija inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi 10 minuta. Potom su uzorci isprani s 1 mL 1x PBS-a cen-trifugiranjem tijekom 5 minuta na 2000 okretaja/min. Po odlijevanju supernatanta na talog dodan je 1 mL 1x PBS pufera te je takav uzorak analiziran protočnim citometrom Coulter EPICS-XL. Svi uzorci su pripremljeni u triplikatu, a za svaki triplikat analizirano je po 10 000 stanica. Udio ukupnih limfocita s obzirom na prisutnost CD45 biljega, izračunat je iz ukupno analiziranih 10 000 stanica u uzorku periferne krvi. Udio prisutnih CD4 T limfocita i CD8 T limfocita izračunat je iz ukupnog broja limfocita.

Statistika Prikupljeni podaci obrađeni su primjenom statističkog raču-nalnog referentnog programa Statistica 7.1 (StatSoft, Inc., 2006). Osnovna obrada podataka obrađena je postupcima deskriptivne statistike. Za utvrđivanje značajnosti razlika iz-među kontrolne skupine i pokusnih skupina tovnih pilića, koje su tretirane liofiliziranim živim sojem La Sota i inaktiviranim cjepivom virusa NB, korišten je One-way ANOVA test.

Rezultati

U Tablici 1 prikazani su rezultati staničnog imunosnog od-ziva u tovnih pilića nakon cijepljenja, odnosno zastupljenost limfocita s obzirom na prisutnost CD45, CD4 i CD8 biljega na njihovoj površini. U Tablici 2 prikazani su rezultati hum-oralnog imunosnog odziva, odnosno titar IHA protutijela nakon cijepljenja.

Tablica 1. Zastupljenost limfocita s obzirom na prisutnost CD45, CD4 i CD8 biljega na površini u kontrolnoj skupini, pokusnoj

skupini cijepljenja liofiliziranim živim sojem La Sota virusa NB (P1) i pokusnoj skupini cijepljenja inaktiviranim cjepivom virusa protiv NB (P2) tijekom istraživačkog razdoblja

Relativna zastupljenost (%) u krvi Monoklonsko protutijelo

Dan nakon cijepljenja Kontrolna skupina Pokusna skupina (P1) Pokusna skupina (P2)

21. dan 62,20 89,37a,b 82,70a CD45+

28. dan 62,31 92,84a,b 84,30a

21. dan 30,62 44,85a,b 43,58a CD4+

28. dan 30,59 46,09a,b 44,31a

21. dan 12,36 25,13a,b 19,34a CD8+

28. dan 12,41 27,38a,b 20,27a

a statistički značajno veća vrijednost (p<0,01) u odnosu na vrijednost utvrđenu u kontrolnoj skupini b statistički značajno veća vrijednost (p<0,01) u odnosu na vrijednost utvrđenu u pokusnoj skupini 2


Table 1. Representation of lymphocytes with respect to the presence of CD45, CD4 and CD8 mark on the surface in the control group, experiment group vaccination freeze-dried live strain La Sota NDV (P1) and experiment group vaccination inactivated virus vaccine against ND (P2) during the research period

Percentage (%) in blood Monoclonal antibody Day after immunization

Control group Experiment group (P1) Experiment group (P2)

21 days 62,20 89,37a,b 82,70a CD45+

28 days 62,31 92,84a,b 84,30a

21 days 30,62 44,85a,b 43,58a CD4+

28 days 30,59 46,09a,b 44,31a

21 days 12,36 25,13a,b 19,34a CD8+

28 days 12,41 27,38a,b 20,27a

a statistically significant higher value (p<0,01) compared to the value defined in the control group

b statistically significant higher value (p<0,01) compared to the value defined in the experiment group (P2) Tablica 2. Srednje vrijednosti titra IHA protutijela i po-

stotni udio pozitivnih uzoraka za cjepni virus NB po skupinama i kontrolnoj skupini tijekom istra-živačkog razdoblja

IHA titar* ± SD** (%)*** Dan nakon

cijepljenja Kontrolna skupina

Pokusna skupina (P1)

Pokusna skupina (P2)

21. dan 4,87 ± 1,99

(73,33) 1,80 ± 0,96

(6,67)

28. dan

1,80 ± 0,83 (0) 5,60 ± 1,12

(100) 2,07 ± 1,89

(20)

* srednja vrijednost IHA titra (log2) ** standardna devijacija *** postotak uzoraka s IHA titrom 4 log2 i više Table 2. Mean values of hemagglutination inhibition (HI)

antibody titres and the percent of positive samples for ND virus by groups during the research period

HI antibody titer* ± SD** (%)*** Day after

immunization Control group

Experiment group (P1)

Experiment group (P2)

21. dan 4,87 ± 1,99

(73,33) 1,80 ± 0,96

(6,67)

28. dan

1,80 ± 0,83 (0) 5,60 ± 1,12

(100) 2,07 ± 1,89

(20) * Mean titer HI (log2) ** Standard deviation *** percentage of samples with HI titre 4 log2 and more

U Tablici 1 vidljivo je da u relativnoj zastupljenosti (%) limfocita, s obzirom na prisutnost CD45, CD4 i CD8 biljega u punoj krvi tovnih pilića u kontrolnoj skupini, nije bilo statistički značajne razlike kroz cijelo istraživačko razdoblje. Promatrajući dvije pokusne skupine, u obje skupine zabilje-žena je statistički značajno veća vrijednost (p<0,01) limfo-cita (CD45

+) u odnosu na utvrđenu vrijednost u kontrolnoj skupini. Pokusna skupina (P1) tovnih pilića koji su tretirani liofiliziranim živim cjepivom soja La Sota virusa protiv NB imala je statistički značajno veću vrijednost (p<0,01) u od-nosu na utvrđenu vrijednost u pokusnoj skupini (P2) koja je tretirana inaktiviranim cjepivom virusa NB. Prosječne vrijednosti CD4

+ T limfocita u pokusnoj skupini (P1) tovnih pilića, kao i u pokusnoj skupini (P2) tovnih pilića, bile su statistički značajno veće (p<0,01) od utvrđene vrijednosti u kontrolnoj skupini. Pokusna skupina (P1) tovnih pilića imala je statistički značajno veću vrijednost CD4

+ T limfocita (p<0,01) u odnosu na vrijednost utvrđenu u pokusnoj sku-pini (P2). Promatrajući relativnu zastupljenost CD8

+ T limfo-cita, vidljivo je da se ona kretala, kroz cijelo istraživačko razdoblje i po skupinama, kao i kod CD4

+ T limfocita. Iz rezultata seroloških pretraga (Tablica 2) vidljivo je da je titar IHA protutijela u 3. tjednu nakon cijepljenja iznosio 4,87 log2 u pokusnoj skupini (P1) te 1,80 log2 u pokusnoj skupini (P2). Također, možemo uočiti da je titar IHA protu-tijela u istom vremenskom razmaku u pokusnoj skupini (P2) bio jednak kao i u kontrolnoj skupini. U 4. tjednu nakon cijepljenja, titar IHA protutijela u pokusnoj skupini (P1) iznosio je 5,60 log2, dok je u pokusnoj skupini (P2) iznosio 2,07 log2. Na kraju istraživačkog razdoblja (28. dan), u sku-pini tovnih pilića koji su tretirani liofiliziranim živim cjepi-vom soja La Sota virusa protiv NB, postignut je 100 %-tni IHA titar s 4 log2 i više. Pokusna skupina koja je tretirana inaktiviranim cjepivom virusa NB imala je tek 20 %-tni IHA titar s 4 log2 i više. Kinetika ukupnih limfocita, pomoćničkih i citotoksičnih T limfocita kao i protutijela, značajno se mijenja u pokusnim skupinama, što dokazuje aktivaciju staničnog i humoralnog


imunosnog odziva s obzirom na svojstvo umnažanja imuno-gena u domaćinu. Tako je cjepivo sa živim sojem La Sota virusa protiv NB potaknulo bržu i snažniju imunoreaktivnost koja uključuje humoralnu i staničnu imunost. Također, inak-tivirano cjepivo virusa NB potaknulo je stanični i humoralni imunosni odgovor, ali i nešto manju imunoreaktivnost od cjepiva sa živim sojem La Sota virusa NB.

Rasprava

Unatoč širokoj primjeni različitih vrsta cjepiva, NB i dalje predstavlja veliku opasnost za peradarsku proizvodnju. Usporedna učinkovitost komercijalnih cjepiva protiv NB budi veliki izazov. Tako smo u našem istraživanju uspoređi-vali razvoj humoralne i stanične imunosti potaknut dvama komercijalnim cjepivima protiv NB. U razvojnim procesima cjepiva protiv zaraznih bolesti peradi, vrlo je važno razum-jeti imunosne mehanizme domaćina na pojedine vrste cje-piva. Budući da postoje mnoge spoznaje koje nam mogu razjasniti ulogu i razvoj stanične imunosti u nastanku otpornosti prema bolestima peradi, istraživanja imunosnog sustava presudno su za planiranje imunosne kontrole. In vitro metode stanične reakcije temeljene na antigen-speci-fičnoj limfoproliferaciji, funkciji specifičnih efektornih sta-nica te izlučivanju citokina, mogu se koristiti u kvantifikaciji i kvalifikaciji imunosnih reakcija domaćina radi boljeg ra-zumijevanja imunosnog odziva (Lillehoj, 1991.). U prijaš-njim istraživanjima humoralne i stanične imunosti, poglavito su se pratile serološke reakcije i stanične promjene vezane uz infekcije i imunizaciju peradi, ali u novijim istraživa-njima sve se više daje naglasak na istraživanje funkcije T limfocita, odnosno brzinu stanične imunosne reakcije (Withanage i sur., 2005.). Prema Reynolds i Maraqa (2000.a i 2000.b), malo ima saznanja o svojstvu i ulozi cjepnog virusa protiv NB na stanični imunosni odgovor u kokoši, posebice kod različitih vrsta cjepiva na poticanje imunosnog odziva. Također, Russell i sur., (1997.) navode da ima malo saznanja u pogledu prirode i uloge o virus-specifičnom sta-ničnom imunosnom odgovoru na virus NB u peradi, po-glavito o sposobnosti različitih vrsta cjepiva na poticanje staničnog imunosnog odziva. Balenović i sur. (2008.) navode da kinetika limfocita u ukupnoj populaciji leukocita periferne krvi tijekom istraživačkog razdoblja predstavlja doprinos u vrednovanju njihovog imunosnog statusa s obzi-rom na vrstu cjepiva. U istraživanju, u obje pokusne sku-pine, zabilježili su statistički značajan porast (p<0,01) pri čemu je taj porast bio intenzivniji i brži u skupini koja je imunizirana živim cjepivom. Autori su zaključiti da je liofilizirano živo cjepivo pokazalo bolju učinkovitost i brže postizanje imunosti od inaktiviranog cjepiva. Timms i Akexander (1977.) navode da stupanj jačine stanične imu-nosti, koja je uključena u imunosni odziv tovnih pilića cijepljenih cjepivima protiv NB, ovisi o soju virusa i vrsti cjepiva. U svom su istraživanju određivali početni stanični imunosni odziv nakon cijepljenja protiv NB živim cjepivima Hitchner B1 i Scrubs te inaktiviranim cjepivima A.G.68 i Northampton ´72. Prema njihovim rezultatima istraživanja, najveći stupanj zastupljenosti ukupnih limfocita, kao i po-

moćničkih te citotoksičnih T limfocita, postignut je u četvrtom tjednu nakon cijepljenja. Primarni imunosni odziv postiže višu i jaču reakciju sa živim cjepivom od inakti-viranog, a razlog tome je umnažanje virusa u domaćinu. Također, Lambrecht i sur. (2004.) navode kako cjepiva koja sadrže žive antigene daju bolji i brži odziv na početku staničnog imunosnog odziva od cjepiva s inaktiviranim antigenom. Razlike u poticaju staničnog imunosnog odziva potaknutog živim i inaktiviranim cjepivima mogu rezultirati različitom kinetikom. Drugim riječima, imunosti odziv po-taknut inaktiviranim cjepivom može se sporije razvijati. Rezultati dobiveni u našem istraživanju, s obzirom na jačinu i intenzitet imunosnog odziva na pojedine vrste cjepiva protiv NB i s obzirom na način primjene, podudaraju se s rezultatima ostalih autora (Sladić i sur., 1988.; Zorman Rojs i sur., 1994.; Čajavec i sur., 1995.; Biđin i sur., 1996.; Čajavec i sur., 1997.; Roy i sur., 2003.; Čajavec i Pokrić, 2004.; Ergotić i sur., 2005.)

Zaključak

S obzirom na vrstu cjepiva, imunosna reakcija se značajno razlikuje s obzirom na svojstvo umnožavanja imunogena. Živa cjepiva će potaknuti snažnu imunološku reakciju uklju-čujući humoranle i stanične mehanizme jer se umnožava-njem virusa povećava količina imunogena. Kod inaktivira-nih cjepiva, s obzirom da se ne umnožava u domaćinu, potrebna je mnogo veća količina antigena u odnosu na živo cjepivo. Razlog intenzivnije tvorbe protutijela i limfocita u skupini tovnih pilića koji su bili stimulirani cjepivom sa živim sojem virusa možemo pronaći u načinu primjene, odnosno unosu cjepiva kao i svojstvu imunogena.

Zahvala

Istraživanje je financiralo Ministarstvo znanosti, obrazova-nja i športa Republike Hrvatske; znanstveni projekt „Genska karakterizacija virusa influence ptica i newcastleske bolesti u Hrvatskoj“ br. 048-0481153-1136.

Literatura

Andreis, I., F. Čulo, M. Marušić, M. Taradi (1998.): Imunologija (peto, potpuno promijenjeno izdanje), Medicinska naklada, Zagreb.

Balenović, Mirta, Maja Popović, V. Savić, Anamaria Ekert Kabalin, I. Valpotić (2008.): Flow cytometric analysis of peripheral blood leukocytes in fattening chickens immunized with live or inactivated vaccines against Newcastle disease. 1st Mediterranean Summit of WPSA, Advences and Challenges in Poultry Scienc. Porto Carras, Chalkidiki, Grecce, 7. - 10. 5. 2008., Book of proceedings, 564. - 566.

Biđin, Z., S. Čajavec, M. Mikec, V. Savić, Biserka Pokrić (1996.): Humoral immune response of chickens possessing maternal antibodies and vaccinated under stress conditions with a bivalent live infectious bronchitis and Newcastle disease vaccine. Periodicum biol. 98, 379. - 385.

Čajavec, S., A. Cizelj, Z. Biđin, Biserka Pokrić (1995.): Simultaneous application of the live and killed Newcastle


disease virus for vaccination of day-pld chicken with low level of maternal antibodies. Vet. arhiv, 65, 25. - 31.

Čajavec, S., Gordana Savić, A. Cizelj, Z. Biđin, Biserka Pokrić (1997.): The primary chicken vaccination against Newcastle disease with antigenic virus subunits prepared in a water-in-oil-in-water emulsion. Periodicum biol. 99, 39 - 44.

Čajavec, S., Biserka Pokrić (2004.): Immunoprotection of poultry against Newcastle disease by subunit vaccines. Praxis vet. 52, 37. - 47.

Ergotić, Nada, S. Čajavec, A. Cizelj, K. Terzić, V. Savić, M. Mikec, Mirta Balenović, M. Cvetić, Sanja Leskovec (2005.): Immune response in commercial layers after vaccination with different formulations of Trivalent inactivated vaccine against newcastle disease, egg drop syndrome and infectious bronchitis. Praxis vet. 53, 163. - 172.

Glick, B. (2000.): Immunophysiology. In: Sturkie′s Avian Physiology 5th Ed. (G.C. Whittow, Ed.), Academic Press, London, pp. 657 - 667.

Horiuchi H., K. Tanaka, A. Shigeta, K. Yoshida, K. Kushima, H. Ohta, S. Furusawa, H. Matsuda (2004.): A monoclonal antibody against chicken thrombocytes reacts with the cells of thromocyte lineage. J. Vet. Med. Sci. 66, 243. - 250.

Lambrecht, B., M. Gonze, G. Meulemans, T. P. van den Berg (2004.): Assessment of the cell-mediated immune response in chickens by detection of chicken interferon-γ in response to mitogen and recall Newcastle disease viral antigen stimulation. Avian Pathol. 33, 343 .- 350.

Lillehoj, H. S. (1991.): Lymphocytes involved in cell-mediated immune responses and methods to assess cell-mediated immunity. Poultry Sci. 70, 1154 - 1164.

Naglić, T., D. Hajsig (1993.): Veterinarska imunologija. (S. Babić, ur.), Školska knjiga, Zagreb.

Reynolds, D. L., A. D. Maraqa (2000.a): Protective immunity against Newcastle disease: The role of antibodies specific to Newcastle disease virus polypeptides. Avian Dis. 44, 138-144.

Reynolds, D. L., A. D. Maraqa (2000.b): Protective immunity against Newcastle disease: The role of cell-mediated immunity. Avian Dis. 44, 145. - 154.

Roy P., A. T. Venugopalan, A. S. Dhillon (2003.): Efficacy of two commercial Newcastle disease virus lentogenic vaccines against virulent asiatic-type Newcastle diease viruses. J. Appl. Poult. Res. 12, 169 - 173.

Russell, P. H., P. N. Dwivedi, T. F. Davison (1997.): The effects of cyclosporin A and cyclophosphamide on the populations of B and T cells and virus in the Harderian gland of chickens vaccinated with the Hitchner B1 strain of Newcastle disease virus. Vet. Immunol. Immunopathol. 60, 171. - 185.

Saalmûller, A., M. J. Redehasse, H. J. Buhring, S. Jonjić, U. H. Koszinowski (1997.): Stimultaneous expression od CD4 and CD8 antigens by a substantial proportion of resting porcine T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 17, 1297. - 1301.

Savić, V. (1999.): Epizootiološke značajke intenzivne peradarske proizvodnje Hrvatske proteklih 35 godina. Zbornik radova, Peradarski dani '99., Poreč, Hrvatska, 18.-20. 5. 1999., 10-14.

Savić, V., Karmen Bosilj, S. Čajavec, Gordana Savić, Tajana Amšel Zelenika, Mirta Balenović, Neda Ergotić, Z. Biđin, Ankica Nemanič (2001.): Usporedba imunogenosti vakcine Gumpeskal+IB+EDS i inaktivirane vakcine protiv zarazne bolesti burze, newsastleske bolesti i bolesti zaraznog bronhitisa s povećanom količinom antigena. Zbornik radova IV. simpozij "Peradarski dani 2001.", 16. - 19. 5. 2001., Poreč, Hrvatska, 130. - 135.

Savić, V. (2003.): Genetic characterisation of Newcastle disease virus strains isolated in Croatia and neighbouring countries. Doktorska disertacija, Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet, Biološki odsjek, Zagreb.

Sharma, J. M. (2003.): The avian immune system. In: Diseases of poultry. (Y.M. Saif, Ed.) 11th Edition, Iowa State Press, 5. - 14.

Sharma, J. M., I. Tizard (1984.): Avian cellular immune mechanism – a review. Avian Pathol. 13, 357. - 376.

Sladić, D., S. Čajavec, Ana Selec, H. Mazija, Z. Biđin (1988.): Immune response (HI titer) and production rezults in meat-type chichens after the use of Newcastle Disease vaccine (PESTICAL®) by spraying method. Praxis vet. 36, 149 - 154.

Timms, L., D. J. Alexander (1977.): Cell-mediated immune of chickens to Newcastle disease vaccines. Avian Pathol. 6, 51-59.

Vandaveer, S. S., G. F. Erf, J. M. Durdik (2001.): Avian T helper one/two immune response balance can be shifted toward inflammation by antigen delivery to scavenger receptors. Poultry Sci. 80, 172. - 181.

Zekarias B., A. A. Ter Huurne, W. J. Landman, J. M. Rebel, J. M. Pol, E. Gruys (2002.): Imunological basis of differences in disease resistance in the chicken. Vet. Res. 33, 109. - 125.

Zorman Rojs. Olga, D. Viduč, S. Čajavec, I. Mrzel, D. Sladić, Neda Ergotić (1994.): Comparison of two immunoprophylactic programs for broiler chickens against Newcastle Disease with the use of the B1 strain under field conditions. Praxis vet. 42, 135. - 141.

Withanage, G. S. K., P. Wigley, P. Kaiser, P. Mastroeni, H. Brooks, C. Powers, R. Beal, P. Barrow, D. Maskell, I. Mcconnell (2005.): Cytokine and chemokine responses associated with clearance of a primary Salmonella enterica serovar Typhimurium infection in the chicken and in protective immunity to rechallenge. Infect. Immunol. 73, 5173. - 5182.

HUMORAL AND CELL-MEDIATED IMMUNE RESPONSE IN FATTENING CHICKENS IMMUNISED WITH LIVE OR INACTIVATED VACCINE AGAINST NEWCASTLE DISEASE

Abstract

One of the most significant prerequisites for successful intensive poultry production is healthy and immunocompetent poultry. Therefore, there is a growing interest in understanding the role of cellular immunity, respectively the role of immune cells and molecules involved in cellular immunity, with the aim of achieving a better immune response. The current knowledge of the vaccine against Newcastle disease virus (NDV) in relation to the humoral cellular immune response in poultry, and especially of various vaccine types stimulating the immune response, is insufficient. By developing


immunological and molecular methods, it is possible to monitor the kinetics of immune cells and molecules through a time period to the stimulation with immunogens. In our research we focused on the lymphocytes’ dynamics, helper cells, cytotoxic T-lymphocytes and antibodies in the blood of fattening chickens immunised against NDV with the lyophilised live vaccine of the La Sota strain or with the inactivated oil emulsion vaccines produced from the same strain. Kinetics of lymphocytes, helper cells, cytotoxic T-lymphocytes and antibodies significantly changed in the trial groups, as evidenced by activation of cellular and humoral immune responses due to the inherent duplication of imunogens in the host. Thus, vaccination with the live strain La Sota against NDV led to faster and stronger immune response that includes the humoral and cellular immunity. The inactivated vaccine NDV also enhanced cellular and humoral immune response, however, a slightly lower immune response than vaccines with the live strain La Sota NDV. Key words: Newcastle disease, vaccine, fattening chickens, immune response


IMUNOGENOST ŽIVIH CJEPIVA U PILIĆA TEŠKE HIBRIDNE LINIJE ROSS

Vesna Weigand1, Vlasta Herak-Perković2, Neda Ergotić3

1 Valipile d.o.o., Sesvetski Kraljevec, Hrvatska 2 Banski vinogradi 26a, Zagreb, Hrvatska 3 Medvedgradska 28, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Ispitivanje imunogenosti dvaju živih cjepiva protiv virusa newcastleske bolesti (VNB) i virusa zarazne bolesti burze (VZBB) provedeno je na 180 pilića teške hibridne linije ROSS 308, izvaljenih u valionici Valipile. Istodobno je praćen i tjedni prirast tjelesne mase. Visoki titri protutijela za VZBB u jednodnevnih pilića (ELISA-titar 7212) uvjetovali su cjepljenju živim cijepivom u dobi od 18 dana, tj. kasnije nego što je uobičajeno. Životinje skupine 1 cijepljene su cjepivom PESTIKAL LA SOTA SPF izravno u voljku. Doza cjepiva iznosila je 0,1 mL. Pilići skupine 2 cijepljenji su cjepivom GUMBOKAL IM SPF izravno u voljku, a doza je iznosila 0,1 mL. Skupina 3 služila je kao necjepljena kontrola. Titri polučeni cijepljenjem pilića u dobi od 18 dana živim cjepivom osiguravaju zadovoljavajuću zaštitu protiv NB i ZBB tijekom 8 tjedana trajanja pokusa. Dinamika prirasta bila je ujednačena, a postignuti rezultati zadovoljavajući unatoč stresu uzrokovanom tjednim vađenjem krvi. Ključne riječi: živa cjepiva, pilići, Ross 308 Uvod

Zarazna bolest burze (ZBB), poznata i kao Gumborska bolest, akutna je vrlo zarazna virusna bolest mladih pilića karakterizirana znatnim oštećenjima Fabricijeve burze i imunosupresijom (Baxendale, 2006.). Suzbiti i spriječiti pojavu ZBB moguće je jedino pravodobnim cijepljenjem i primjenom nespecifičnih mjera zaštite od bolesti. New-castleska bolest (NB) je smrtonosna virusna zaraza većine ptičjih vrsta. Sprečavanje bolesti cijepljenjem propisano je zakonom. Za specifičnu zaštitu peradi protiv te dvije gospodarski važne bolesti koriste se vrlo efikasna živa ili inaktivirana cjepiva (Ergotić i sur. 2007.). U ovom radu opisano je ispitivanje imunogenosti dvaju živih cjepiva protiv VNB i VZBB. Korišteni su pilići teške hibridne linije ROSS 308, izvaljeni u valionici Valipile (Sesvetski Kraljevec). Vrijeme cijepljenja ovisilo je o titru maternalnih protutijela za VZBB određenih 1. dana života. Istodobno s ispitivanjem imunogenosti vakcina praćen je i tjedni prirast tjelesne mase.

Materijali i metode Brojleri Korišteno je 180 pilića oba spola teške hibridne linije ROSS 308.

Krmne smjese Krmiva su proizvedena prema vlastitoj recepturi u tvornici stočne hrane Valipile d.o.o. Tijekom pokusa korištene su: početna krmna smjesa PPT-I (brojler starter 21%); smjesa za rast pilića PPT-II (brojler grover 18%) te završna smjesa za tov PPT-III (brojler finišer 16%). Napravljena je kemijska i mikrobiološka analiza krmnih smjesa u Hrvat-skom veterinarskom institutu, Odjelu za veterinarsko javno zdravstvo, Laboratoriju za analitičku kemiju i Laboratoriju za mikrobiologiju hrane za životinje. Rezultati kemijske analize prikazani su u Tablici 1. U mikrobiološkom pogle-du uzorci su udovoljavali propisima Pravilnika o kakvoći stočne hrane, NN 26/98.

Vesna Weigand, dr.vet.med., Valipile d.o.o. Proizvodnja i prodaja jednodnevne peradi i stočne hrane, Ive Politea 62, 10361 Sesvetski Kraljevec, Hrvatska; tel: ++385 (0) 1 2048 901, fax: ++385 (0) 1 2048 902, e-mail: [email protected]

IMUNOGENOST ŽIVIH CJEPIVA U PILIĆA TEŠKE HIBRIDNE LINIJE ROSS 137

Tablica 1. Kemijski sastav krmnih smjesa za hranidbu pilića

Kemijski sastav PPT-I PPT-II PPT-III Vlaga, % 11,25 11,41 11,76 Sirove bjelančevine, % 21,74 19,34 16,84 Sirova vlakna, % 4,37 3,96 2,80 Pepeo, % 5,65 5,68 5,43 Kiselinski stupanj 8,95 9,56 10,17 Peroksidni broj <1 <1 <1 Table 1. Chemical composition of feed mix for chicken

Chemical composition PPT-I PPT-II PPT-III

Moisture % 11,25 11,41 11,76

Crude protein, % 21,74 19,34 16,84

Crude fibre, % 4,37 3,96 2,80

Ash, % 5,65 5,68 5,43

Acide degree 8,95 9,56 10,17

Peroxide number <1 <1 <1 Način držanja i hranjenja U pokusnom peradnjaku životinje su držane kavezno. Uvjeti smještaja bili su u skladu s preporukama Zakona o zaštiti životinja NN 135/06 i Euroguide on the accomodation and care of animals used for experimental and other scientific purposes (EC ETS 123, Appendix A; FELASA 2007.). Tijekom prvih 10 dana pokusa životinje su hranjene početnom krmnom smjesom PPT-I (brojler starter 21%); u daljnjem tijeku pokusa dobivale su smjesu za rast pilića PPT-II (brojler grover 18%) do kraja četvrtog tjedna, te završnu smjesu za tov PPT-III (brojler finišer 16%) do kraja pokusa. Za vrijeme trajanja pokusa pilići su hranu i vodu dobivali ad libitum.

Cjepiva PESTIKAL LA SOTA SPF je liofilizirano cjepivo koje sadržava atenuirani živi virus newcastleske bolesti soj La Sota. Jedna cjepna doza sadržavala je 106,6 EID50 vakci-nalnog virusa. GUMBOKAL IM SPF je liofiizirano cjepivo koje sadržava atenuirani živi virus zarazne bolesti burze soj VMG 91. Jedna cjepna doza sadržavala je 103,9 TCID50 cijepnog virusa.

Plan cijepljenja Jednodnevnim pilićima vađena je krv te određen ELISA titar za VZBB, prema čemu je određeno vrijeme cijep-ljenja. Pilići su nasumično podijeljeni u 3 skupine. Skupina 1 cijepljena je u dobi od 18 dana cjepivom PESTIKAL LA SOTA SPF izravno u voljku. Doza vakcine iznosila je 0,1 mL. Skupina 2 cijepljena je u dobi od 18 dana cjepivom

GUMBOKAL IM SPF izravno u voljku. Doza vakcine iznosila je 0,1 mL. Skupina 3 služila je kao nevakcinirana kontrola. Svakodnevni nadzor nad zdravstvenim stanjem životinja i provođenjem pokusa obavljao je doktor vete-rinarske medicine.

Vađenje krvi Krv za serološke pretrage uzimana je 1. i 14. dana, na dan cijepljenja (18. dana) te u tjednim razmacima do 35. dana nakon cijepljenja. Pilići su bili označeni krilnim marki-cama (60 pilića po skupini). Razina specifičnih protutijela u serumima pilića praćena je individualno, a određena je IHA-testom za VNB, te ELISA testom za VZBB (FlockCheck, IDEXX,SAD).

Test inhibicije hemaglutinacije Za dokaz specifičnih hemiinhibicijskih protutijela virusa newcastleske bolesti upotrijebili smo beta-postupak inhibi-cije hemaglutinacije dvostuko serijski razrijeđenih seruma, uzevši 4 HA jedinice standardnog liofiliziranog antigena i 1%-tnu suspenziju eritrocita pijetla. Kao kontrolu upo-trijebili smo liofilizirane pozitivne i negativne serume za virus newcastleske bolesti. Reakciju smo očitali nakon 60 minuta pri sobnoj temperaturi. Titrom smo označili reci-pročnu vrijednost najvećeg razrjeđenja seruma koje je potpuno inhibiralo hemaglutinaciju.

Mjerenje tjelesne mase Tjelesna masa mjerena je u tjednim razmacima (po 20 pili-ća) tijekom čitavog pokusa koji je trajao 57 dana.



Tablica 2. Prosječne tjelesne mase pilića (20 komada) tijekom istraživanja

Dob pilića (dani) 1 8 15 22 29 36 43 50 57 Prosječna tjelesna masa (g) 45 126 305 606 1010 1378 1888 2421 2661 Table 2. Average body weights of chickens (20 pieces) during the trial

Age of chickens (days) 1 8 15 22 29 36 43 50 57 Average body weights (g) 45 126 305 606 1010 1378 1888 2421 2661

0500

10001500200025003000

1 8 15 22 29 36 43 50 57

Dob pilića (dani)

Pros

ječn

a tje

lesn

a m

asa

(g)

Slika 1. Prosječne tjelesne mase pilića tijekom istraživanja

0500

10001500200025003000

1 8 15 22 29 36 43 50 57

Age of chickens (days)

Ave

rage

bod

y w

eigh

ts

(g)

Picture 1. Average body weights of chickens during the trial Tablica 3. IHA-titar (2n) protutijela za VNB u krvnim serumima pilića cijepljenih u dobi od 18 dana živim cjepivom protiv

newcastleske bolesti (PESTIKAL LA SOTA SPF, Veterina)

Dob pilića (dani) 1 14 18 25 32 39 46 53 Dani nakon vakcinacije 0 7 14 21 28 35 Pokusna skupina 1 (60 pilića) 2,7 2,3 4,0 6,0 6,24 5,0 Kontrola (60 pilića) 7,7 4,3 2,7 1,9 1 1,1 1 1 Table 3. HI-titre (2n) of anti NDV in sera of chickens, vaccinated at the age of 18 days with live vaccine against Newcastle

disease (PESTIKAL LA SOTA SPF, Veterina)

Age of chickens (days) 1 14 18 25 32 39 46 53 Days after vaccination 0 7 14 21 28 35 Group 1 (60 chickens) 2,7 2,3 4,0 6,0 6,24 5,0 Control group (60 chickens) 7,7 4,3 2,7 1,9 1 1,1 1 1


VNB

02468

10

-18 -4 0 7 14 21 28 35

vrijeme (dani)

HI-t

itar

Pokusna skupina 1Kontrola

Slika 2. IHA-titar (2n) protutijela za VNB u krvnim serumima pilića cijepljenih u dobi od 18 dana živim cjepivom protiv

newcastleske bolesti (PESTIKAL LA SOTA SPF, Veterina)

NDV

02468

10

-18 -4 0 7 14 21 28 35time (days)

HI-t

itre group 1

control

Picture 2. HI-titre (2n) of anti NDV in sera of chickens, vaccinated at the age of 18 days with live vaccine against Newcastle

disease (PESTIKAL LA SOTA SPF, Veterina) Tablica 4. ELISA titar protutijela za VZBB u krvnim serumima pilića cijepljenih u dobi od 18 dana živim cjepivom protiv

zarazne bolesti burze (GUMBOKAL IM SPF, Veterina)

Dob pilića (dani) 1 14 18 25 32 39 46 53

Dani nakon vakcinacije 0 7 14 21 28 35

Pokusna skupina 2 (60 pilića) 339 86 1741 2920 3958 4988

Kontrola (60 pilića) 7212 533 339 95 59 50 63 42 Table 4. ELISA of anti IBDV in sera of chickens, vaccinated at the age of 18 days with live vaccine against Infectious bursal

disease (GUMBOKAL IM SPF, Veterina)

Age of chickens (days) 1 14 18 25 32 39 46 53

Days after vaccination 0 7 14 21 28 35

Group 2 (60 chickens) 339 86 1741 2920 3958 4988

Control group (60 chickens) 7212 533 339 95 59 50 63 42


VZBB

0

2000

4000

6000

8000

-18 -14 0 7 14 21 28 35

vrijeme (dani)

ELIS

A ti

tar

Pokusna skupina 2Kontrola

Slika 3. ELISA titar protutijela za VZBB u krvnim serumima pilića cijepljenih u dobi od 18 dana živim cijepivom protiv

zarazne bolesti burze (GUMBOKAL IM SPF, Veterina).

IBDV

0

2000

4000

6000

8000

-18 -14 0 7 14 21 28 35

time (days)

ELIS

A ti

tre

group 2control

Picture 3. ELISA of anti IBDV in sera of chickens, vaccinated at the age of 18 days with live vaccine against Infectious bursal

disease (GUMBOKAL IM SPF, Veterina). Prosječne tjelesne mase pilića prikazane su u Tablici 2 i na Slici 1. Početna težina pilića oba spola iznosila je 45 g, što je 17% manje od standarda koji navodi proizvođač roditeljskih jata. Dinamika prirasta bila je ujednačena. Na kraju pokusa prosječna tjelesna masa pilića iznosila je 2661 g. Postignuti su zadovoljavajući rezultati glede prirasta unatoč stresu uzrokovanom tjednim vađenjem krvi. Razina specifičnih protutijela u pilića cijepljenih u dobi od 18 dana protiv newcastleske bolesti dana je u Tablici 3. i Slici 2. IHA-titar specifičnih protutijela za VNB 1. dana života pilića iznosio je 27,7; na dan cijepljenja 22,7; dok je najviša vrijednost postignuta 28. dana nakon cijepljenja (26,2). Razina spe-cifičnih protutijela u pilića cijepljenih u dobi od 18 dana protiv zarazne bolesti burze prikazana je u Tablici 4 i na Slici 3 ELISA-titar specifičnih protutijela za VZBB 1. dan života pilića iznosio je 7212, na dan cijepljenja 339, a najviša je vrijednost postignuta 35. dana nakon cijepljenja (4988). Serološka analiza praćenih specifičnih maternalnih protutijela prvoga dana života pilića upućuje na visoke titre roditeljskih jata. Poznato je da piliće treba cijepiti u vrijeme kada titar maternalnih protutijela nije toliko visok da bi inaktivirao vakcinalni virus. U tovnih pilića poluživot ma-ternalnih protutijela je 3,5-4 dana (Biđin, 2008.). Stoga su polučeni visoki titri protutijela za VZBB u jednodnevnih pilića uvjetovali cijepljenju živim cjepivom kasnije nego što

je uobičajeno da pasivna zaštita ne bi interferirala s aktiv-nom imunizacijom. Titri polučeni cijepljenjem pilića u dobi od 18 dana živim cjepivom osiguravaju zadovoljavajuću zaštitu protiv NB i ZBB tijekom tova.

Zaključci

1. Titri polučeni cijepljenjem pilića u dobi od 18 dana živim cjepivima (PESTIKAL LA SOTA SPF i GUMBOKAL IM SPF, Veterina) osiguravaju zadovoljavajuću zaštitu protiv NB i ZBB tijekom tova. 2. Postignuti su zadovoljavajući rezultati glede prirasta tjelesne mase unatoč stresu uzrokovanom tjednim vađenjem krvi.

Literatura

Baxendale, W. (2006.): Birnaviridae. Pages319-323. In: Poultry Diseases. 5th ed. Saunders Elsevier., Edimburg, London, NY, Oxford, Philadelphia, St Lous, Sidney, Toronto

Biđin, Z. (2008.): Bolesti peradi. 1. izd. Veterinarski fakultet Sveučiišta u Zagrebu, Zagreb

Ergotić, N., S. Čajavec, B. Opić, V. Herak-Perković, B. Pokrić (2007.): Usporedba učinka split cjepiva protiv newcastleske bolesti i živog cjepiva protiv zarazne bolesti burze u Ma- pilića. Zbornik „Peradarski dani 2007.)


IMMUNOGENICITY OF LIVE VACCINES IN ROSS 308 CHICKENS

Summary

The investigation of immunogenicity od two live vaccines against Newcastle disease virus (NDV) and infectious bursal disease virus (IBDV) in ROSS 308 havy hybride chickens was performed. The trial involved 180 broiler chickens of both sexes hatched in Valipile, Croatia. The high level of Ma+ against infestious bursal desease virus (IBDV) in 1-day-old chickens (average ELISA-titer 7212) determined the time of vaccination. The animals were randomly allocated into three groups and at the age of 18 day vaccinated. The chickens in group 1 were vaccinated with 0,1 ml of live vaccine against NDV (PESTIKAL LA SOTA SPF, Veterina 106,6 EID50 per dose), the chicken in group 2 were vaccinated with 0,1 ml of live vaccine against IBDV (GUMBOKAL IM SPF, Veterina; 103,9 TCID50 per dose) and the chickens in control group remain unvaccinated. The live vaccines were applicated directly into the crop. During the 8 weeks of invetigation, the animals' health status and the body weight gain, measured weekly, were satisfactory. A solid post vaccinal humoral immunitiy was achived. Key words: live vaccine, chicken, ROSS 308


UČINAK CIJEPLJENJA PROTIV MAREKOVE BOLESTI NA ANTIOKSIDATIVNI SUSTAV PLUĆA PILIĆA

Jasna Aladrović1, Suzana Milinković-Tur1, Blanka Beer Ljubić1, Željko Gottstein2, Hrvoje Mazija2

1 Zavod za fiziologiju i radiobiologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska 2 Zavod za bolesti peradi s klinikom, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Marekova bolest izaziva velike gubitke prilikom uzgoja, te je uspješna profilaksa od presudnog značenja za proizvodnju. Cilj rada bio je istražiti antioksidativni odgovor plućnog tkiva pilića u tovu nakon cijepljenja primjenom cjepiva HVT soj FC-126 (Lyomarex, Merial, SAD). U istraživanju je korišteno 300 muških pilića lake pasmine podijeljenih u četiri skupine. Prva skupina cijepljena je postupkom nebulizacije (HVTN), druga subkutano (HVTSC), treća postupkom nebulizacije s fiziološkom otopinom (FON) dok je četvrta skupina bila kontrola. Uzorci pluća nakon žrtvovanja uzeti su prije cijepljenja te 1., 3., 5., 7., 10., 14. i 21. dan nakon cijepljenja. U homogenatima tkiva određene su aktivnosti ukupne superoksid dismutaze (SOD), glutation peroksidaze (GSH-Px) i katalaze te koncentracija lipidskih peroksida (LPO). Aktivnost ukupne SOD u plućnom tkivu 1. dan nakon cijepljenja u skupini HVTN bila je značajno veća nego u HVTSC i kontrolnoj skupini, a 3. dan nakon cijepljenja postupkom nebulizacije aktivnost tog enzima bila je značajno veća negoli u FON i netretiranoj kontroli. Desetoga dana nakon cijepljenja aktivnost ukupne SOD bila je značajno viša u HVTSC skupini u usporedbi sa skupinom koja je cijepljena nebulizacijom i kontrolnom skupinom. Dva tjedna nakon cijepljenja značajno viša aktivnost ukupne SOD zabilježena je u HVTN skupini u odnosu na ostale skupine. Aktivnost GSH-Px u plućima pilića 3. dan nakon cijepljenja postupkom nebulizacije bila je značajno viša nego u ostalim istraživanim skupinama. Aktivnost navedenog enzima 14. dan nakon subkutane aplikacije cjepiva bila je značajno viša u usporedbi s cjepivom u netretiranim skupinama. Dva i tri tjedna nakon cijepljenja aktivnost GSH-Px bila je značajno viša u HVTN skupini negoli u FON i kontrolnih pilića. Aktivnost katalaze 3. dan nakon cijepljenja u HVTN skupini bila je značajno viša nego u kontrolnoj skupini. Također, cijepljenje postupkom nebulizacije je uzrokovalo više aktivnosti katalaze u odnosu na subkutanu aplikaciju, te na aktivnost u kontrolnoj skupini 5. dan nakon cijepljenja. Istovremeno je aktivnost katalaze bila viša i u HVTSC skupini u odnosu na kontrolnu skupinu. Intenzitet oksidacijskih procesa (LPO) 3. i 5. dana nakon cijepljenja bio je veći u plućima HVTN skupine u odnosu na kontrolnu. Koncentracija LPO u plućima HVTSC skupine pilića 7. dan nakon cijepljenja bila je značajno niža u odnosu na kontrolne vrijednosti, dok su 14. dan nakon cijepljenja zabilježene suprotne vrijednosti. Postupak unošenja cjepiva protiv Marekove bolesti postupkom nebulizacije rezultirao je intenzivnijom antioksidativnom obranom pluća pilića u prvim danima nakon cijepljenja, no oponašanje prirodnog načina ulaska virusa u dišni sustav izazvalo je i intenzivnije oksidativne procese u tom tkivu. Ključne riječi: Marekova bolest, cijepljenje, nebulizacija, pluća, antioksidativni sustav Uvod Marekova bolest je herpesvirusna limfoproliferativna za-razna bolest peradi koja je karakterizirana infiltracijom upal-nih stanica i stvaranjem limfoma u unutrašnjim organima, šarenici, mišićima, koži kao i drugim tkivima (Witter i Schat, 2003.). Budući da bolest izaziva velike gospodarske

štete, svi se pilići, bilo da se radi o tovnim pilićima, nesi-licama ili roditeljskim jatima, moraju cijepiti protiv te bo-lesti. Cjepivo se priprema od herpesvirusa purana HVT koji sprečava pojavu limfoma i imunosupresiju (Kingham i sur., 2001.). Primarno mjesto ulaska virusa Marekove bolesti su pluća jer virus u organizam ulazi inhalacijom kontaminirane prašine, dijelova kože i perja (Calnek, 2001.).

Doc. dr. sc. Jasna Aladrović; Zavod za fiziologiju i radiobiologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu; Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: ++385 (0) 1 2390-173, fax: ++385 (0) 1 2441 390, e-mail: [email protected]

UČINAK CIJEPLJENJA PROTIV MAREKOVE BOLESTI NA ANTIOKSIDATIVNI SUSTAV PLUĆA PILIĆA 143

Pluća predstavljaju jedinstveno tkivo za razvoj oksidacijskih oštećenja biomolekula u usporedbi s drugim tkivima u orga-nizmu jer su neposredno izložena većoj koncentraciji kisika. Zbog direktnoga kontakta sa zrakom kao i različitih zaga-đenja i antigena iz okoliša koji dovode do stvaranja reaktiv-nih kisikovih i dušikovih spojeva (ROS i RNS) plućne stanice su izložene jačem oksidacijskom stresu. Nadalje, sastavni dio plućnih oštećenja je upala i aktivacija upalnih stanica s posljedičnom proizvodnjom ROS i RNS (Vuokko i Crapo, 2003.). Te spojeve inaktiviraju antioksidativne molekule kao što su enzimi superoksid dismutaza, katalaza, glutation peroksi-daza, kao i neenzimske molekule albumini, glutation, lakto-ferin, mokraćna kiselina, vitamini E, A i C (Michiels i sur., 1994.). U plućima i dišnim putovima su utvrđene visoke razine unutarstaničnih i izvanstaničnih antioksidansa koji štite plućne epitelne stanice (Cross i sur., 1994.; Kuwano i sur., 2003.; Rahman i sur., 2006.). Superoksid dismutaza (SOD) je jedini enzim koji katalizira pretvorbu superoksidnog aniona u vodikov peroksid. U organizmu su utvrđena tri izoenzima SOD: bakar cink SOD, manganska SOD i ekstracelularna SOD. Oniimaju speci-fičnu raspodjelu i ulogu u organizmu. Vrlo su važni u zaštiti pluća, pri čemu u upalnim stanjima dolazi do indukcije manganske i ekstracelularne SOD (Vuokko i Crapo, 2003.). Vodikov peroksid uklanjaju glutation peroksidaza i katalaza, čija je aktivnost dokazana u plućnim stanicama i tekućini koja oblaže ove stanice (Cross i sur., 1994.). Neravnoteža između oksidansa i antioksidansa dovodi do oštećenja stanica i patofizioloških oštećenja. Neravnotežu, odnosno intenzitet oksidacijskog stresa, moguće je pratiti određivanjem ROS i sličnih spojeva, određivanjem aktivno-sti/koncentracije antioksidativnih spojeva ili pak proizvodna oštećenja biomolekula kao posljedice djelovanja ROS (Kat-soulis i sur., 2005.). To su najčešće proizvodi oksidacije fos-folipida i drugih nezasićenih masnih kiselina u membranama stanica i staničnih organela, proizvodi oksidacije bjelan-čevina (Levine i sur., 1991.) i oštećenja DNK (Kuwano i sur., 2003.). Cilj rada bio je istražiti intenzitet oksidacijskog stresa, kojim su pluća pilića bila izložena nakon primjene cjepiva HVT soj FC-126 različitim načinima (nebulizacijom i subkutano), praćenjem aktivnosti ukupne superoksid dismutaze, gluta-tion peroksidaze i katalaze. Istovremeno se određivanjem koncentracije lipidskih peroksida želio dobiti bolji uvid u intenzitet stvaranja proizvoda oksidacije fosfolipida i neza-sićenih masti plućnog tkiva potaknutih cijepljenjem.

Materijal i metode

Istraživanje je provedeno na 300 muških pilića hibrida lake pasmine. Pilići su tijekom pokusa kavezno držani u prostoru koji udovoljava pokusnom držanju peradi, a hrana i voda su bili dostupni ad libitum. Razdijeljeni su, s obzirom na pri-mjenu cjepiva, u četiri skupine po 70 životinja te još 20 pilića kojima su uzorci uzeti prije tretmana. Cijepljenje pi-

lića obavljeno je komercijalnim aktivnim liofiliziranim cje-pivom protiv Marekove bolesti. Cjepivo sadrži virus HVT, soj FC-126 (Lyomarex, Merial, SAD). Pilići u prvoj skupini cijepljeni su postupkom nebulizacije tijekom jedne minute (HVTN), druga skupina subkutano (HVTSC), treća postup-kom nebulizacije s fiziološkom otopinom tijekom jedne minute (FON) dok je četvrta skupina bila kontrola. Uzorci pluća nakon žrtvovanja uzeti su prije cijepljenja te 1., 3., 5., 7., 10., 14. i 21. dan nakon cijepljenja. Pilići su prije uzorkovanja omamljeni i žrtvovani 80%-tnim CO2. Uzorci plućnog tkiva nakon vaganja su pohranjeni na -196 °C u tekući dušik tijekom 24 sata, a nakon toga do analize na -76 °C. Uzorci tkiva su homogenizirani pri 2800 okr/min uz hla-đenje tijekom 30 sekundi s teflon-staklo Schüthomogenplus homogenizatorom (Schütt labortechnik, Njemačka) u 0,14 mol/L KCl. Homogenati tkiva su centrifugirani pri 20000 okretaja tijekom 30 minuta pri 4 °C (Sigma 3 K 15, Sigma, Njemačka), a dobivenim supernatantima određene su aktiv-nosti: ukupne superoksid dismutaze (SOD), glutation perok-sidaze (GSH-Px) i katalaze te koncentracija lipidskih perok-sida (LPO) i bjelančevina. Aktivnosti ukupne superoksid dismutaze i glutation peroksi-daze određene su gotovim kompletima tvrtke Randox (Irska) na automatskom analizatoru SABA 18 (AMS, Italija). Aktivnost katalaze je određena po metodi Johanssona i Borga (1988.). Metoda se temelji na reakciji enzima s meta-nolom u prisustvu optimalne koncentracije vodikovog pe-roksida. Produkt reakcije je formaldehid čija se koncen-tracija mjeri spektrofotometrijski (Thermospectronic Helios delta, Unicam, Cambridge, Velika Britanija) s 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto 1,2,4-triazole (Purpald) kao kromoge-nom na 470 nm. Koncentracija lipidskih peroksida određena je po metodi Ohkawa i sur. (1979.) pri 532 nm pomoću spektrofotometra Thermospectronic Helios delta (Unicam, Cambridge, Velika Britanija). Tom metodom se određuje koncentracija malon-dialdehida i drugih spojeva koji reagiraju s tiobarbiturnom kiselinom a nastali su peroksidacijom kolesterola i fosfo-lipida sa slobodnim radikalima. Apsorbancijski koeficijent 1.5 x 105 po Placeru i sur. (1966.) korišten je za prera-čunavanje apsorbancije u mol/L. Koncentracija bjelančevina određena je metodom po Lowryju i sur. (1951.) s goveđim albuminom kao stan-dardom. Aktivnosti antioksidativnih enzima i koncentracija lipidskih peroksida izražene su po gramu bjelančevina plućnog tkiva. Rezultati istraživanja prikazani su kao srednja vrijednost i standardna devijacija ( x ± SD). Značajnost razlika među rezultatima provjerena je LSD testom korištenjem raču-nalnog programa Statistica 7 (StatSoft 2005, SAD). Razlike su statistički značajne ako je p≤0,05.

Rezultati

Aktivnosti antioksidativnih enzima u plućnom tkivu pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti prikazane su u tablicama


1-3, dok je intenzitet lipidske peroksidacije naveden u Tablici 4. Aktivnost ukupne SOD u plućnom tkivu pilića cijepljenih cjepivom HVT soj FC-126 postupkom nebulizacije prvi dan nakon cijepljenja bila je značajno veća nego u HVTSC i kontrolnoj skupini (p<0,05; Tablica 1). Trećeg dana nakon cijepljenja postupkom nebulizacije utvrđena je značajno veća aktivnost ukupne SOD u usporedbi s FON (p<0,05) i kontrolnom skupinom (p<0,01). Ukupna SOD 10. dana na-kon cijepljenja najviša je u HVTSC skupini te je bila zna-čajno viša od aktivnosti u skupini kojoj je cjepivo aplicirano nebulizacijom (p<0,05) i kontrolnoj skupini (p<0,01). Dva tjedna nakon cijepljenja pilića nebulizacijom zabilježena je

značajno viša aktivnost ukupne SOD u plućnom tkivu u odnosu na druge skupine u istraživanju (p<0,01). Aktivnost GSH-Px u plućima pilića treći dan nakon cijep-ljenja postupkom nebulizacije bila je značajno viša nego u drugim skupinama (p<0,01; Tablica 2). Dva tjedna nakon aplikacije cjepiva pod kožu pilića utvrđena je značajno viša aktivnost tog enzima u plućnom tkivu u usporedbi sa skupinom tretiranom fiziološkom otopinom kao i necijep-ljenom kontrolnom skupinom (p<0,01). Nakon 14. i 21. dana od cijepljenja u plućima skupine koja je cjepivo primila nebulizacijom zabilježena je značajno viša aktivnost GSH-Px u usporedbi s FON skupinom i netretiranom kontrolnom skupinom (p<0,01, odnosno p<0,05).

Tablica 1. Aktivnost ukupne superoksid dismutaze u plućnom tkivu pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti cjepivom HVT soj

FC-126 (U/g bjelančevina)

Dani nakon cijepljenja Pokusne skupine 0 1 3 5 7 10 14 21

HVTN 1107±

90a 1175± 450a

1993± 567

1833± 240

1445± 275a

1612± 173a

1052± 144

HVTSC 961± 62b

1010± 174ab

1626± 417

1205± 530

1940± 642b

1323± 178b

969± 101

FON 1036± 144ab

850± 92b

1703± 537

1055± 265

1689± 199ab

1247± 107b

897± 166

Kontrola

693± 188

940± 168b

754± 106b

1426± 465

1592± 567

1283± 204a

1187± 221b

928± 222

HVTN - cijepljena postupkom nebulizacije; HVTSC - cijepljena subkutano; FON - nebulizacija 0,9% NaCl Rezultati predstavljaju srednju vrijednost±standardna devijacija, 0. dan N=10, 1.-21. dan N=6 Vrijednosti u kolonama označene različitim absuperskriptima statistički značajno se razlikuju p≤0,05. Table 1. Total superoxide dismutase activity in lung tissue of chicken vaccinated against Marek's disease with HVT FC-126

vaccine (U/g protein)

Days of vaccination Trial groups

0 1 3 5 7 10 14 21

HVTN 1107±

90a 1175± 450a

1993± 567

1833± 240

1445± 275a

1612± 173a

1052± 144

HVTSC 961± 62b

1010± 174ab

1626± 417

1205± 530

1940± 642b

1323± 178b

969± 101

FON 1036± 144ab

850± 92b

1703± 537

1055± 265

1689± 199ab

1247± 107b

897± 166

Control

693± 188

940± 168b

754± 106b

1426± 465

1592± 567

1283± 204a

1187± 221b

928± 222

HVTN - vaccine was given by means of nebulisation; HVTSC - vaccine was given subcutaneously; FON - received saline solution by means of nebulisation; Control - was not vaccinated Values are expressed as means ± standard deviation Values within columns with different absuperscript statistically significantly differs p≤0,05.


Tablica 2. Aktivnost glutation peroksidaze u plućnom tkivu pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti cjepivom HVT soj FC-126 (U/g bjelančevina)

Pokusne skupine Dani nakon cijepljenja

0 1 3 5 7 10 14 21

HVTN 238±

22 325± 52a

294± 100

200± 147

233± 50

239± 31a

200± 37a

HVTSC 252±

17 241± 84b

241± 45

144± 49

207± 33

261± 8a

170± 45ab

FON 222±

29 202± 20b

288± 63

141± 33

242± 23

212± 15b

157± 16b

Kontrola

277± 36

230± 42

185± 19b

265± 57

138± 18

234± 41

193± 20b

153± 35b

HVTN - cijepljena postupkom nebulizacije; HVTSC - cijepljena subkutano; FON - nebulizacija 0,9% NaCl Rezultati predstavljaju srednju vrijednost±standardna devijacija, 0. dan N=10, 1.-21. dan N=6 Vrijednosti u kolonama označene različitim absuperskriptima statistički značajno se razlikuju p≤0,05. Table 2. Glutathione peroxidase activity in lung tissue of chicken vaccinated against Marek's disease with HVT FC-126 vaccine

(U/g protein)


0 1 3 5 7 10 14 21

HVTN 238±

22 325± 52a

294± 100

200± 147

233± 50

239± 31a

200± 37a

HVTSC 252±

17 241± 84b

241± 45

144± 49

207± 33

261± 8a

170± 45ab

FON 222±

29 202± 20b

288± 63

141± 33

242± 23

212± 15b

157± 16b

Control

277± 36

230± 42

185± 19b

265± 57

138± 18

234± 41

193± 20b

153± 35b

HVTN - vaccine was given by means of nebulisation; HVTSC - vaccine was given subcutaneously; FON - received saline solution by means of nebulisation; Control - was not vaccinated Values are expressed as means ± standard deviation Values within columns with different absuperscript statistically significantly differs p≤0,05. Aktivnost katalaze u plućnom tkivu treći dan nakon cijep-ljenja pilića koji su cjepivo primili nebulizacijom bila je značajno viša nego vrijednosti u necijepljenoj kontrolnoj skupini (p<0,01; Tablica 3). Tijekom istraživanja utvrđena je također značajno viša aktivnost tog enzima 5. dana nakon cijepljenja u HVTN skupini u usporedbi sa skupinom kojoj je cjepivo aplicirano subkutano (p<0,05) i kontrolnom sku-pinom (p<0,01). Unos cjepiva subkutano nakon pet dana do-

veo je do viših aktivnosti katalaze u odnosu na necijepljenu kontrolnu skupinu (p<0,05). Koncentracija lipidskih peroksida 3. i 5. dana nakon cijepljenja postupkom nebulizacije bila je značajno veća ne-goli u netretiranoj kontroli (p<0,01; Tablica 4). U istraži-vanju je utvrđen značajno niži intenzitet oksidacije lipida u skupini cijepljenoj subkutano 7. dan nakon cijepljenja u odnosu na kontrolne vrijednosti (p<0,05), da bi sedam dana poslije (14. dan) bio viši nego u kontrolnoj skupini (p<0,05).


Tablica 3. Aktivnost katalaze u plućnom tkivu pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti cjepivom HVT soj FC-126 (U/g bjelančevina)

Dani nakon cijepljenja Pokusne skupine 0 1 3 5 7 10 14 21

HVTN 82± 18

106± 29a

144± 30a

169± 139

120± 54

71± 25

84± 20

HVTSC 97± 11

88± 10ab

109± 27b

144± 43

111± 34

67± 19

87± 13

FON 90± 9

94± 9ab

127± 15abc

129± 28

84± 17

50± 21

83± 17

Kontrola

127± 45

83± 14

72± 14b

79± 19bc

126± 18

82± 19

61± 28

79± 20

HVTN - cijepljena postupkom nebulizacije; HVTSC - cijepljena subkutano; FON - nebulizacija 0,9% NaCl Rezultati predstavljaju srednju vrijednost±standardna devijacija, 0. dan N=10, 1.-21. dan N=6 Vrijednosti u kolonama označene različitim abcsuperskriptima statistički značajno se razlikuju p≤0,05. Table 3. Catalase activity in lung tissue of chicken vaccinated against Marek's disease with HVT FC-126 vaccine (U/g protein)


0 1 3 5 7 10 14 21

HVTN 82± 18

106± 29a

144± 30a

169± 139

120± 54

71± 25

84± 20

HVTSC 97± 11

88± 10ab

109± 27b

144± 43

111± 34

67± 19

87± 13

FON 90± 9

94± 9ab

127± 15abc

129± 28

84± 17

50± 21

83± 17

Control

127± 45

83± 14

72± 14b

79± 19bc

126± 18

82± 19

61± 28

79± 20

HVTN - vaccine was given by means of nebulisation; HVTSC - vaccine was given subcutaneously; FON - received saline solution by means of nebulisation; Control - was not vaccinated Values are expressed as means ± standard deviation Values within columns with different abcsuperscript statistically significantly differs p≤0,05. Tablica 4. Koncentracija lipidskih peroksida u plućnom tkivu pilića cijepljenih protiv Marekove bolesti cjepivom HVT soj

FC-126 (nmol/g bjelančevina)

Dani nakon cijepljenja Pokusne skupine 0 3 5 7 10 14 21

HVTN 94± 39a

170± 63a

131± 124ab

146± 23

130± 24ab

56± 11

HVTSC 73± 12ab

149± 29ab

86± 9a

137± 19

140± 34a

50± 7

FON 71± 11ab

135± 25ab

117± 13ab

172± 29

120± 23ab

56± 6

Kontrola

164± 22

60± 12b

109± 29b

175± 80b

147± 15

109± 14b

51± 4

HVTN - cijepljena postupkom nebulizacije; HVTSC - cijepljena subkutano; FON - nebulizacija 0,9% NaCl Rezultati predstavljaju srednju vrijednost±standardna devijacija, 0. dan N=10, 1.-21. dan N=6 Vrijednosti u kolonama označene različitim absuperskriptima statistički značajno se razlikuju p≤0,05.


Table 4. Lipide peroxide concentration in lung tissue of chicken vaccinated against Marek's disease with HVT FC-126 vaccine (nmol/g protein)

Days of vaccination Trial groups 0 3 5 7 10 14 21

HVTN 94± 39a

170± 63a

131± 124ab

146± 23

130± 24ab

56± 11

HVTSC 73± 12ab

149± 29ab

86± 9a

137± 19

140± 34a

50± 7

FON 71± 11ab

135± 25ab

117± 13ab

172± 29

120± 23ab

56± 6

Control

164± 22

60± 12b

109± 29b

175± 80b

147± 15

109± 14b

51± 4

HVTN - vaccine was given by means of nebulisation; HVTSC - vaccine was given subcutaneously; FON - received saline solution by means of nebulisation; Control - was not vaccinated Values are expressed as means ± standard deviation Values within columns with different absuperscript statistically significantly differs p≤0,05.


Porast aktivnosti ukupne SOD (1., 3., 14. dan), GSH-Px (1., 14. i 21. dan ) i katalaze (3. i 5. dan) u plućnom tkivu nakon primjene cjepiva postupkom nebulizacije mogao bi ukazivati na aktivnu ulogu stanica pluća u antioksidativnom odgovoru na unos virusa u donje putove dišnog sustava, čime se opo-naša prirodni način zaražavanja pilića virusom Marekove bolesti. Dosadašnja istraživanja primjene vakcine postupkom nebu-lizacije pomoću uređaja SONOVAC 095 koji vodenu sus-penziju cjepiva raspršuje u čestice veličine 2-5 mikrometara pokazala su kod nesilica smanjenje mortaliteta, koji je iznosio 3,7% u odnosu na parenteralnu primjenu cjepiva, kod koje je iznosio 6,1% (Mazija i sur., 2000.). Uz to cijepljenje postupkom zamagljivanja dovodi do povećane tjelesne mase i većeg proizvodnog broja (Mazija i sur., 2005.). U plućima najvažniji izoenzim SOD je mitohondrijska man-ganska SOD (Vuokko i Crapo, 2003.). Aktivna je većinom u epitelu bronha, alveolarnim makrofagima i alveolarnom epitelu, dok je aktivnost citoplazmatske bakar cink SOD naj-izraženija u epitelu bronha. Ekstracelularnu SOD sinteti-ziraju polimorfonuklearne stanice i makrofage u dišnim pro-hodima u sklopu upalnog odgovora tkiva (Tan i sur., 2006.). U ovom istraživanju određivana je aktivnost ukupne SOD; u skupini kojoj je cjepivo aplicirano postupkom nebulizacije bila je značajno veća 1., 3. i 14. dana istraživanja nego u skupini kod koje je cjepivo primijenjeno parenteralno. Prilikom takvog načina unošenja cjepni virus u piliće ulazi duboko u pluća i zračne vrećice te izaziva antioksidativni odgovor tkiva na prisutnost antigena. Naime, Gottstein i sur. (2007.) su u plućima pilića cijepljenih nebulizacijom utvrdili replikaciju vakcinalnog soja HVT FC-126 u prvih 5 dana nakon cijepljena, a u ispirku pluća i zračnih vrećica 1., 3., 5.

i 7. dana nakon cijepljenja (Gottstein, 2008.), što nije bio slučaj kod pilića cijepljenih subkutano. Glutation peroksidaza i katalaza kataliziraju razgradnju vo-dikovog peroksida, pri čemu GSH-Px za katalizu treba koenzim glutation, a katalaza samostalno djeluje. Oba enzima unesena su u pluća i zračnim putovima (Hosakote i sur., 2009.; Cross i sur., 1994.). Prilikom upale zračnih pu-tova respiratornim sincicijskim virusom dolazi do smanjenja aktivnosti GSH-Px i katalaze, što ukazuje na iscrpljivanje kompenzatornih mehanizama antioksidativne obrane dišnog sustava (Hosakote i sur., 2009.), dok je u našem istraživanju zabilježen porast aktivnosti GSH-Px 3., 14. i 21. dana nakon cijepljenja postupkom nebulizacije kao rezultat aktivacije antioksidativnih mehanizama epitelnih stanica pluća i zrač-nih putova. Aktivnost katalaze je porasla i u plućnom tkivu nakon raspršivanja vakcinalnog soja virusa purana 3. i 5. dana nakon cijepljenja u odnosu na necijepljenu kontrolnu skupinu. U patogenezi brojnih upalnih i degenerativnih bolesti pluća važnu ulogu ima razvoj oksidacijskog stresa. Makrofagi kao dio strategije zaštite stanica stvaraju ROS, kao što je super-oksidni anion, koji se smatra glavnim uzrokom staničnih i tkivnih oštećenja (Vuokko i Crapo, 2003.). Tako i kod Marekove bolesti aktivirani makrofagi prosljeđuju virus B limfocitima. Osim aktiviranih upalnih stanica ROS mogu stvarati i same plućne stanice, koje su osjetljive na oksida-tivna oštećenja (Rahman i MacNee, 2000.), a nalaze se i u tekućini koja oblaže plućne stanice (Cross i sur., 1994.). ROS su vrlo reaktivni spojevi koji smanjuju razine antioksi-dansa u stanicama i izazivaju nastanak lipidske peroksidacije nezasićenih masnih kiselina i fosfolipida biomembrana (Rahman i MacNee, 2000.) te promjene u strukturi DNK (Kuwano i sur., 2003.). Značajno veća koncentracija lipidskih peroksida 3. i 5. dana nakon vakcinacije postupkom nebulizacije u usporedbi s necijepljenom kontrolom mogla bi se pripisati umnažanju vakcinalnog virusa u plućnom tkivu pilića. Naime, budući


da se postupkom primjene cjepiva nebulizacijom oponaša prirodni načina ulaska virusa Marekove bolesti u dišni sustav, vjerojatno je došlo i do intenziviranja oksidacijskih procesa u ovom tkivu. Slične rezultate zabilježili su Hosakote i sur. (2009.) pri inficiranju epitelnih stanica pluća i dišnih putova respiratornim sincicijskim virusom. Značajan porast koncentracije lipidskih peroksida koji je utvrđen dva tjedna nakon vakcinacije u skupini pilića koja je cjepivo dobila parenteralno u odnosu na netretiranu kontrolu za sada ne možemo sa sigurnošću objasniti, te dobiveni rezultati upućuju na dodatna istraživanja. Oni ukazuju i na važnost ispravne pripreme uzoraka, odnosno njihovog do-brog ispiranja kako u uzorcima ne bi zaostala krv. Naime, u ovom istraživanju u nekim je uzorcima ostalo ponešto krvi, te ne možemo biti sigurni da zabilježena aktivnost antio-ksidativnih enzima, a naročito katalaze, ne potječe jednim dijelom i od enzima koji se nalaze u krvnim stanicama i plazmi. Štoviše, u cilju što boljeg sagledavanja antioksida-tivne obrane pluća i dišnih putova dobivene rezultate aktiv-nosti SOD trebalo bi nadopuniti aktivnošću svakoga izo-enzima posebno. Prema rezultatima ovoga istraživanja može se zaključiti da primjena cjepiva HVT FC-126 različitim postupcima rezul-tira različitim antioksidativnim odgovorom te da postupak unošenja cjepiva protiv Marekove bolesti nebulizacijom do-vodi do aktivacije antioksidativnog sustava pluća pilića i to naročito u prvim danima nakon cijepljenja. Istraživanja su provedena sukladno Zakonu o dobrobiti životinja NN 19/99 i odobrena od Ministarstva poljo-privrede, šumarstva i vodnog gospodarstva rješenjem ur. br. 525-6-07-2 Lj.Z. od 29. siječnja 2007. godine.

Zahvala

Istraživanja je financiralo Ministarstvo znanosti, obrazova-nja i športa RH projekt br. 053-0531863-1858 i projekt br. 053- 0531854-1866.

Literatura

Calnek, B. W. (2001.): Pathogenesis of Marek’s disease virus infection. U: Curr. Top. Microbiol. Immunol. Ur. Hirai, K., Springer, Berlin, 25-55.

Cross, C. E., A. van der Vliet, C. A. O'Neill, S. Louie, B. Halliwell (1994.): Oxidants, antioxidants, and respiratory tract lining fluids. Environ. Health Perspect 102, 185-191.

Gottstein, Ž., Irena Ciglar Grozdanić, Ž. Cvetić, H. Mazija (2007.): Detection of HVT FC 126 in lung tissue of chickens vaccinated by means of nebulization against Marek’ s disease. 15th World Veterinary Poultry Congress Abstract Book, Ur.: Huiling, S., W. Hongjun, L. Yongqing, L. Jue, Z. Li, W. Jing, G. Xinna, Z. Zhenhua, X. Lei, L. Zhichang, W. Chengyi, Beijing, China, WVPA, 442.

Gottstein, Ž. (2008.): Kinetika imunogeneze soja FC126 herpes-virusa purana unesenog u dišni sustav pilića postupkom ne-bulizacije. Doktorska disertacija. Veterinarski fakultet Sveuči-lišta u Zagrebu

Hosakote, Y. M., T. Liu, S. M. Castro, R. P. Garofalo, A. Casola (2009.): Respiratory Syncytial Virus Induces Oxidative Stress

by Modulating Antioxidant Enzymes. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. Epub ahead of print

Johansson, L. H., L. A. H. Borg (1988.): A spectrophotometric method for determination of catalase activity in small tissue samples. Anal. Biochem., 174, 331-336.

Katsoulis, K., T. Kontakiotis, G. Baltopoulos, A. Kotsovili, I. N. Legakis (2005.): Total antioxidant status and severity of community-acquired pneumonia: are they correlated? Respi-ration 72, 381-387.

Kingham, B. F., V. Zelnık, J. Kopaček, V. Majerčijak, E. Ney, C. J. Schmidt (2001.): The genome of herpesvirus of turkeys: comparative analysis with Marek’s disease viruses. Journal of General Virology 82, 1123-1135.

Kuwano, K., N. Nakashima, I. Inoshima, N. Hagimoto, M. Fujita, M. Yoshimi, T. Maeyama, N. Hamada, K. Watanabe, N. Hara (2003.): Oxidative stress in lung epithelial cells from patients with idiopathic interstitial pneumonias. Eur. Respir. J. 21: 232-240.

Levine, R. L., D. Garland, C. N. Oliver, A. Amici, I. Climent, A.-G. Lenz, B. W. Ahn, S. Shaltiel, E. R. Stadtman (1991.): Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods in Enzymology 186: 464-478.

Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr, R. J. Rendal (1951.): Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-267.

Mazija, H., S. Čajavec, Đurđa Nemarnik, Estella Prukner-Radovčić, W. Ragland (2000.): Safety and immunogenicity of hvt vaccine against marek's disease applied in hatchery by nebulization. International Poultry Scientific Forum. Georgia World Congress Center Atlanta, GA.

Mazija, H., S. Čajavec, Estella Prukner-Radovčić, E. Ergotić, Irena Ciglar Grozdanić, Danijela Horvatek, Ž. Gottstein (2005.): Zaštita zdravlja peradi organskog i slobodnog uzgoja. Zbornik radova Peradarski dani, Poreč, 45-52.

Michiels, C. M., M. Raes, O. Toussaint, J. Remacle (1994.): Importance of Se-glutathione peroxidase, catalase and Cu/Zn-SOD for cell survival against oxidative stress. Free Rad. Biol. Med. 17, 235-248.

Ohkawa, H., N. Ohishi, K. Yagi (1979.): Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal. Biochem. 2, 351-358.

Placer, Z. A., L. L. Cushman, B. Connor Johnson (1966.): Esti-mation of product of lipid peroxidation (malonyl dialdehyde) in biochemical systems. Anal. Biochem. 16, 359-364.

Rahman, I., S. K. Biswas, A. Kode (2006): Oxidant and antioxidant balance in the airways and airway diseases. Eur. J. Phar-macol. 1-3, 222-239.

Rahman, I., W. MacNee (2000.): Oxidative stress and regulation of glutathione in lung inflammation. Eur. Respir. J. 16, 534-554.

Tan, R. J., J. S. Lee, M. L. Manni, C. L. Fattman, J. M. Tobolewski, M. Zheng, J. K. Kolls, T. R. Martin, T. D. Oury (2006.): Inflammatory Cells as a Source of Airspace Extra-cellular Superoxide Dismutase after Pulmonary Injury. Am J Respir Cell Mol Biol 34, 226-232.

Vuokko, L. K., J. D. Crapo (2003): Superoxide Dismutases in the Lung and Human Lung Diseases. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1600-1619.

Witter, R. L., K. A. Schat (2003.): Marek’s disease. U: Diseases of poultry, 11th, ed. Saif, Y. M., H. J. Barnes, A. M. Fadly, J.R. Gllison,, L. R. McDougald, D. E. Sayne (Ur.), Iowa State University Press, Ames, Iowa, 407-465.


EFFECT OF VACCINATION AGAINST MAREK’S DISEASE ON LUNG ANTIOXIDATIVE SYSTEM IN CHICKENS

Summary

Marek´s disease (MD) is caused by a herpes virus that may result in death or severe production loss in chickens. The aim of study was to examine response of lung antioxidative system in chicken after vaccination with vaccine HVT FC 126 (Lyomarex, Merial, SAD). Trial was performed on 300 male chickens of light hybrids, separated in four groups. One group was vaccinated by means of nebulisation (HVTN), second group was vaccinated subcutaneously (HVTSC), third group received saline solution by means of nebulisation (FON) and fourth group was not treated (control). Samples of lung tissue were taken before vaccination and on day 1, 3, 5, 7, 10, 14 and 21 days after vaccination. Activities of total superoxide dismutase (TSOD), glutathione peroxidise (GSH-Px) and catalase as well as concentration of lipid peroxides (LPO) was measured in tissue homogenates. The TSOD in lung tissue one day after vaccination was significantly higher in HVTN than in HVTSC and control groups. Third day after vaccination TSOD was significantly higher in comparison with FON and control group. The TSOD 10th day after vaccination was higher in HVTSC group compared to chicken given vaccine by means of nebulisation and to no vaccinated control. Activity of TSOD two weeks after vaccination was higher than in other trial groups. The GSH-Px in lungs of chicken third day after administration of vaccine by nebuliser was higher than in other groups included in experiment. Activity of GSH-Px 14th day after subcutaneously given vaccine was higher compared to FON and control group. Two and three weeks after vaccination by nebuliser GSH-Px was higher than in FON and untreated group. Catalase activity third day after vaccination in HVTN group was higher in comparison with control chickens. Fifth day after vaccine was given by means of nebulisation catalase activity was significantly higher than in HVTSC group and unvaccinated control. Simultaneously, activity of catalase was higher than in control chickens. Lipid peroxide products were higher third and fifth day after vaccination in lungs of HVTN group in comparison with control. Concentration of LPO 14th day after vaccine was given subcutaneously was higher than in untreated control group. Vaccine HVT FC-126 delivered by nebulisation resulted in better antioxidative protection of lung tissue in this trial. Our results indicate that the mimics of natural route of infection elevated susceptibility of tissue to lipid peroxidation. Key words: Marek’s disease, vaccination, nebulisation, lung, antioxidative system


PRIMJENJIVOST POSTUPAKA IZRAVNE I POSREDNE IMUNOFLUORESCENCIJE PRI DIJAGNOSTICIRANJU KLAMIDIOZE U PTICA

Ksenija Vlahović1, Maja Popović1, Branka Šeol2, Gordana G. Gračner1, Iva Popović3, Alenka Dovč4

1 Zavod za biologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska 2 Zavod za mikrobiologiju i zarazne bolesti s klinikom, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska 3 Klinika za traumatologiju, Zagreb, Hrvatska 4 Inštitut za zdravstveno varstvo perutnine, Veterinarska fakulteta, Universa v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija

Sažetak

Bakterije svrstane u red Chlamydiales mogu uzrokovati bolest (klamidiozu) u ljudi, brojnih vrsta domaćih i divljih životinja, kao i u ptica. Jedna od značajnijih vrsta, patogenih za životinje, ali i za čovjeka, je bakterija Chlamydophila (Cp.) psittaci. Dijagnoza klamidioze u ptica oslanja se, između ostalog, i na imunološke dijagnostičke postupke. U ovom radu prikazat ćemo rezultate postupka izravne imunofluorecencije (engl. direct immunofluorescent test, DIF) za dokaz uzročnika, kao i rezultate serološkog postupka posredne imunofluorescencije (engl. indirect immunofluorescent test, IIF) za dokaz protutijela na bakteriju Cp. psittaci u različitih vrsta ptica. Za izravan dokaz antigena u epitelnim stanicama inficiranih ptica upotrijebili smo monoklonska protutijela za otkrivanje antigena bakterije Chlamydia (C.) trachomatis (uzročnika bolesti u čovjeka) koji se može upotrijebiti i za otkrivanje antigena vrste Cp. psittaci u stanicama inficiranih ptica. Tijekom postupka posredne imunofluorescencije konjugat se veže sa specifičnim IgG protutijelima iz seruma inficiranih ptica u antigen - protutijelo - FITC kompleks vidljiv pod imunofluorescentnim mikroskopom. Na temelju dobivenih rezultata možemo zaključiti da su postupci izravne i posredne imunofluorescencije primjenjivi dijagnostički postupci za dokaz antigena klamidije kao i protutijela na bakteriju Cp. psittaci u inficiranih ptica. Ključne riječi: ptice, Chlamydophila psittaci, klamidioza, dijagnostika, imunofluorescencija Uvod Klamidioza ptica je zoonoza od koje obolijevaju kavezne ptice, ptice selice i druge ptice koje slobodno žive u prirodi, čovjek i neki drugi sisavci. Klamidioza je do sada zabi-lježena u više od 467 vrsta ptica iz 30 redova (Kaleta i Taday, 2003.). Očituje se kao akutna, rjeđe kao kronična, dišna ili crijevna infekcija. Uzrokovana je obvezatnim unu-tarstaničnim bakterijama vrste Chlamydophila (Cp.) psittaci, koje se Gramovim postupkom oboje gram-negativno. Infek-cije ptica vrstom Cp. psittaci proširene su diljem svijeta, najčešće kao lokalna pojava. Svi serovarovi bakterije Cp. psittaci endemično se pojavljuju širom svijeta u različitih vrsta ptica. U papiga samo jedan serovar (serovar A) uzro-kuje endemičnu pojavu bolesti, dok isti serovar u ljudi uzrokuje sporadične zoonoze (Andersen i sur., 1997.). Papige su još osjetljive na infekciju serovarom F. Serovar B se endemično pojavljuje u golubova, izdvojen je iz purana te

kao uzročnik pobačaja u mliječnih krava. Serovarovi C i D izdvojeni su iz pataka, a D i iz purana. Specifični domaćini za serovarove C i D nisu prepoznati, ali je poznato da na-vedeni serovarovi predstavljaju poseban rizik za radnike za-poslene u peradarskoj industriji. Izolati serovara E dokazani su u velikog broja različitih vrsta ptica širom svijeta, ali specifični domaćin nije poznat. Serovarovi M56 i WC izdvojeni su iz sisavaca (Everett i sur., 1999.). Glavni izvor infekcije za pojedine vrste ptica su ptice u akutnoj fazi bolesti tijekom koje se uzročnik izlučuje izmetom i sekretom iz dišnog sustava (Millicent i sur., 1995.). Rezervoari uzroč-nika klamidioze u ptica obično su galebovi, patke, čaplje, golubovi, kosovi, čvorci i vrapci (Biđin,1998.). Čovjek se može inficirati tijekom izravnog dodira s inficiranim živim i uginulim domaćim, te divljim pticama. Najčešće se infici-raju djelatnici u peradarskoj proizvodnji i klaonicama, kao i individualni uzgajivači i držaoci ptica kućnih ljubimaca (papige i golubovi). Ovoj rizičnoj skupini treba pridružiti i

Prof. dr. sc. Ksenija Vlahović; Zavod za biologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Heinzelova 55, Zagreb, Hrvatska; E-mail: [email protected]

PRIMJENJIVOST POSTUPAKA IZRAVNE I POSREDNE IMUNOFLUORESCENCIJE PRI DIJAGNOSTICIRANJU KLAMIDIOZE U PTICA 151

laboratorijsko osoblje. Za ljudsko zdravlje osobito su opasne inficirane ptice bez kliničkih znakova bolesti, ali i one u inkubaciji. Brojni uzročnici tada su stalno ili povremeno prisutni u izmetu, na spojnici oka i sluznici kljuna i ždrijela (Gerlach, 1994.), zbog čega i rezultati dijagnostičkih pretra-ga na uzorcima uzetim s navedenih tkiva ponekad nisu pouzdani za postavljanje konačne dijagnoze. Dijagnostika bakterije Cp. psittaci u ptica i u ljudi još uvijek predstavlja veliki izazov budući da ne postoji jedinstveni specifičan test za dokazivanje tog uzročnika. Najčešće kori-šteni standardni serološki postupak je reakcija vezanja kom-plementa (RVK), no postupak je ograničeno osjetljiv, a moguće su i unakrižne reakcije s drugim bakterijama (OIE, 2004.). Dijagnoza klamidioze u ptica oslanja se, između ostalog, i na imunološke dijagnostičke postupke. Međuna-rodni ured za epizootije (Office International des Epizooties, OIE, 2004., 2008.) propisao je postupke dijagnosticiranja klamidioze u ptica, a imunofluorescenciju navodi kao jedan od postupaka izbora za serološku dijagnostiku klamidioze u ptica. Na Veterinarskom fakultetu u Ljubljani Dovč (1993.) uvodi postupak posredne imunofluorescencije (indirect immunofluorescent test, IIF) za dijagnosticiranje klamidioze golubova i papiga, te svojim rezultatima dokazuje da je taj postupak lako primjenjiv za dijagnosticiranje klamidioze u ptica. U dijagnostici klamidioze ptica preporučljivo je isto-dobno provesti serološku metodu posredne imunoflorescen-cije za dokaz protutijela te dokazati antigen u uzorcima postupkom izravne imunofluorescencije (Andersen i sur., 1998.). Postupkom izravne imunofluorescencije u žive živo-tinje je moguće dokazati uzročnika u strugotinama s konjun-ktiva, u obrisku nosa, ždrijela, kloake, u izmetu ili peritone-alnoj tekućini. Postmortalno je uzročnika najlakše dokazati u upalnom ili fibrinoznom eksudatu, promijenjenim organima, te u tkivima zračnih vrećica, slezene, jetre, bubrega ili perikarda (Dovč i sur., 1993.).

U ovom radu prikazujemo rezultate korištenja postupka izravne imunofluorescencije za dokaz antigena uzročnika, kao i rezultate serološkog postupka posredne imunofluores-cencije za dokaz protutijela na bakteriju Cp. psittaci u različitih vrsta ptica. Za kontrolu dokaza antigena koristili smo brzi orijentacijski enzimski imunološki Clearview test (CW) za izravan dokaz LPS antigena klamidija u biološkom materijalu ptica.

Materijal i metode

Kao ciljnu skupinu u našem istraživanju koristili smo samo one ptice u kojih je CW test na istraživanim uzorcima bio pozitivan na LPS antigen klamidija. CW testom najmanje je jedan od tri pretražena uzoraka (lijevog i desnog oka te kloake) morao biti pozitivan da bismo pticu smatrali poz-itivnom, a potom smo sva tri uzorka pretražili i postupkom izravne imunofluorescencije DIF (Tablica 1). Postupkom DIF tako smo pretražili uzorke od 15 ptica (6 gradskih i 6 uzgojenih golubova te 3 papige nimfe) u kojih je CW test na prije navedenim uzorcima bio pozitivan. Ukupno je postup-kom DIF pretraženo 45 obrisaka epitelnih stanica sluznica i to 30 s površine konjunktiva lijevoga i desnoga oka te 15 obrisaka kloake. Radi uvida u imunološki status serum svih ptica pretražen je i na prisutnost protutijela na bakteriju Cp. psittaci postupkom posredne imunofluorescencije IIF. Krv je uzorkovana iz krilne vene ptica. Odvojeni bistri serumi bili su pohranjeni na -20 °C do izvođenja postupka IIF. Za izvođenje postupka za dokaz antigena CW testom i po-stupkom DIF uziman je materijal iz svakog oka posebnim, vatiranim štapićem tako da je prvo odstranjen suvišak eksu-data. Svaki štapić s obriskom epitelnih stanica uzorkovanih sluznica potom je uronjen u epruvetu ispunjenu transportnim medijem za klamidije (Spencer i Johnson, 1983.), kojeg ujedno preporučuje i OIE (2004., 2008.). Rezultati rada vezani su uz temu projekta MZOŠ-a "Klamidioza ptica i sisavaca" br. 053-0531863-1861.

Tablica 1. Vrsta i broj pretraženih ptica te prikaz rezultata dijagnostičkih postupaka CW i DIF za dokaz antigena i IIF za dokaz

titra protutijela za bakteriju Cp. psittaci

Broj pretraženih uzoraka postupcima

CW Pozitivni uzorci

DIF Pozitivni uzorci

IIF Pozitivni uzorci

Vrste pretraženih

ptica

Broj pretraženih

ptica EIA DIF IIF L* D** K*** L* D** K*** Neg. titar 1:40

titar 1:80

titar 1:160

Gradski golub 6 18 18 6 4/6 3/6 3/6 4/6 2/6 3/6 2/6 4/6 0/6 0/6

Uzgojeni golub 6 18 18 6 5/6 2/6 6/6 4/6 2/6 5/6 2/6 2/6 2/6 0/6

Papiga nimfa 3 9 9 3 0/3 1/3 2/3 0/3 0/3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3

Ukupno 15 45 45 15 9/15 6/15 11/15 8/15 4/15 8/15 7/15 6/15 2/15 0/15 * L - lijevo oko ** D - desno oko *** K - kloaka Neg. = negativno


Table 1. Species and number of examined birds and results of diagnostic methods CW and DIF for confirming the antigen and IIF for confirming the titer of antibodies against Cp. psittaci

Number of examined samples using

diagnostic methods

CW Positive samples

DIF Positive samples

IIF Positive samples Species of

examined birds Number of examined

birds EIA DIF IIF L* D** K*** L* D** K*** Neg.

titar 1:40

titar 1:80

titar 1:160

Feral pigeon 6 18 18 6 4/6 3/6 3/6 4/6 2/6 3/6 2/6 4/6 0/6 0/6

Race pigeon 6 18 18 6 5/6 2/6 6/6 4/6 2/6 5/6 2/6 2/6 2/6 0/6

Nymph-parakeet 3 9 9 3 0/3 1/3 2/3 0/3 0/3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3

Total 15 45 45 15 9/15 6/15 11/15 8/15 4/15 8/15 7/15 6/15 2/15 0/15

* L - Left eye ** D - Right eye *** K - Cloace Neg. = negativno Brzi enzimski imunološki Clearview test (CW) Brzi enzimski imunološki dijagnostički postupak CLEAR-VIEW CHLAMYDIA MF test (UNIPATH LIMITED, Engleska) je komercijalni test prvenstveno namijenjen izrav-nom dokazivanju bakterije C. trachomatis u dijagnostici klamidioze u ljudi. Clearview test upotrijebili smo kao brzi, isključivo orijentacijski, visoko osjetljiv, specifičan dijagno-stički postupak za izravan dokaz LPS antigena klamidija u biološkom materijalu ptica uzetom s površine konjunktiva i kloake (Trap, 1994.; Vanrompay i sur., 1994.).

Izravna imunofluorescencija (DIF) Tijekom postupka DIF koristili smo komercijalna mono-klonska protutijela konjugirana s fluoresceinom CHLA-MYDIA DIRECT IF IDENTIFICATION (BIOMERIEUX, Francuska) i kontrolu CHLAMYDIA DIRECT IF CONTROLE+/- (BIOMERIEUX, Francuska). Najmanje 50 epitelnih stanica iz obrisaka konjunktive i kloake bilo je nazočno na površini predmetnice i pretraženo mikroskopski. Protutijela označena fluoresceinom u vidnom su polju mi-kroskopa fluorescirala zelenkasto, a epitelne stanice su bile crvene, velike i nepravilnog oblika.

Posredna imunofluorescencija (IIF) Za praćenje imunološkog statusa u serumu ptica korišten je postupak posredne imunofluorescencije (IIF). Za dokaziva-nje specifičnih IgG protutijela na bakteriju Cp. psittaci u serumu ptica koristili smo komercijalni pripravak mikro-

skopskih preparata s poznatim antigenom LAMES CHLA-MYDIA PSITTACI, SERVIBIO, Francuska. Rabljeni ko-njugat je pripravak Veterinarskog fakulteta u Ljubljani (Dovč i sur., 1993.; Dovč, 1993.). Od uzoraka seruma s pozitivnim rezultatom reakciju smo ponovili s razrjeđenjima seruma 1:40, 1:80, 1:160. Sve istraživane uzorke seruma pregledali smo imunofluorescentnim mikroskopom Olym-pus AX-70. Rezultat je smatran pozitivnim ukoliko je titar protutijela bio 1:40 ili viši, odnosno ukoliko je uočena poja-va fluorescirajućih elementarnih tjelešaca.

Rezultati

Ni jedna od pretraživanih ptica nije imala izrazitije kliničke znakove koji bi se očitovali na dišnom ili probavnom su-stavu. Rezultati dijagnostičkih pretraga CW testa i postupka DIF za dokaz antigena te rezultati postupka IIF za dokaz protutijela na bakteriju Cp. psittaci prikazani su u Tablici 1. U svih pretraženih ptica barem je jedan od tri pretražena uzoraka (lijevog i desnog oka te kloake) bio pozitivan na pretragu CW testom. Postupkom DIF antigen za bakteriju Cp. psittaci dokazan je u 6 gradskih i 6 uzgojenih golubova, a nije dokazan ni u jedne od 3 pretražene papige čiji su uzorci u postupku pretrage CW testom bili pozitivni. Po-stupkom IIF protutijela za bakteriju Cp. psittaci dokazana su u 4 gradska i 4 uzgojena goluba, a nisu dokazana ni u jedne od 3 spomenute pretražene papige. Na slikama 1 i 2 pri-kazujemo pozitivni i negativni nalaz protutijela za bakteriju Cp. psittaci dobiven tijekom pretrage seruma golubova po-stupkom IIF.


Slika 1. Posredna imunofluorescencija (IIF): pozitivni rezultat (lijevo) i negativni rezultat (desno); povećanje X 400 Figure 1. Indirect immunofluorescence (IIF): positive result (left) and negative result (right); magnification x 400 Diskusija i zaključak

Rezultati naših istraživanja upućuju na činjenicu da je labo-ratorijska dijagnostika klamidioze u ptica izuzetno složena. Tijekom našeg istraživanja nije bilo ptica s izrazitijim kli-ničkim znakovima koji bi se odnosili na dišni ili probavni sustav, stoga, na temelju kliničkih znakova nismo mogli pretpostaviti da li je istraživana ptica inficirana klamidijom. Podsjećamo, uzročnik klamidioze je unutarstanični mikro-organizam koji često uzrokuje prikrivenu (latentnu) bolest. U istraživanih ptica uočili smo samo više ili manje izražene popratne kliničke znakove bolesti, kao što su oskudan mukopurulentni iscjedak iz očiju i nosa te akutni i kronični konjunktivitis, što se podudara s nalazima u literaturi (Krauss i Schmeer, 1992.; Gerlach, 1994.). Opisani oskudni klinički znakovi bili su nam smjernica ka provođenju dalj-njih dijagnostičkih postupaka, prvenstveno korištenju brzog orijentacijskog enzimskog imunološkog CW testa, kojim se ne može postaviti konačna dijagnoza bolesti, već samo sumnja na postojanje antigena uzročnika u istraživanom uzorku. Tom smo se testu priklonili zbog izvješća u nekim radovima (Trap, 1994; Vanrompay i sur., 1994.) koji po-stupak opisuju kao relativno dostupan i lako izvediv. Na temelju rezultata opisanog postupka tako smo mogli izabrati ciljanu skupinu od 15 pozitivnih ptica čije smo uzorke po-tom pretražili imunološkim postupcima. Uzimajući u obzir teškoće pri izdvajanju klamidija koje su obvezatni unutar-stanični mikroorganizmi koji se ne mogu uzgojiti na umjet-nim hranjivim podlogama, već isključivo u pokusnim životi-njama, žutanjčanoj vrećici kokošjeg zametka ili u staničnoj kulturi, CW test u novije vrijeme zauzima posebno mjesto u brzoj izravnoj dijagnostici uzročnika klamidioze u ptica. Tijekom naših istraživanja CW test pokazao se primjenjivim za postavljanje brze, no isključivo orijentacijske dijagnoze, čime se izbjegava pretraživanje neprikladnih uzoraka labora-torijskim pretragama. Iz Tablice 1 razvidno je da su u istraživanih papiga uzorci obrisaka epitelnih stanica sluznica kloake bili pozitivni u pretrazi CW testom, međutim, isti su uzorci, pretraženi postupkom DIF, bili negativni, kao što su bili negativni i rezultati pretrage seruma istih papiga postupkom IIF. Ovdje

treba posebno podsjetiti na mogućnost pojave lažno pozi-tivnih rezultata dobivenih CW testom nastalih zbog una-križne reakcije s nekim drugim uzročnicima (Vanrompay i sur., 1994.). Shodno preporukama u stručnoj literaturi (Grimes, 1989.), u ptica u kojih su pak uzorci pretraženi postupkom DIF bili negativni istu smo pretragu ponovili na nanovo uzetim obriscima iz očiju i kloake. Tek na temelju ponovo dobivenih negativnih rezultata pretraženih uzoraka sa sigurnošću smo mogli tvrditi da su pretražene ptice bile negativne na klamidiozu. Dakle, potvrdimo li klamidije po-stupkom DIF, dijagnoza klamidioze u ptica je potvrđena. Ukoliko, međutim, izostane fluorescencija, ne možemo tvrditi da ptica nije zaražena, već pretragu treba ponoviti ili usmjeriti na korištenje nekih drugih dijagnostičkih po-stupaka. Postupci kao što su DIF i IIF lako su primjenjivi i brzo daju rezultate, a upotrebom monoklonskih protutijela značajno se povećava njihova specifičnost i pouzdanost. Za izravan dokaz antigena koriste se označena monoklonska protutijela koja otkrivaju antigen u tkivu ili stanici zaražene životinje. Kako na tržištu, za sada, nema monoklonskih protutijela specifičnih za bakteriju Cp. psittaci, moguće je u svrhu dijagnosticiranja klamidioze koristiti monoklonska protu-tijela namijenjena otkrivanju antigena C. trachomatis u ljudi. Osobitost tog postupka je da se protutijela označuju tvarima koje fluoresciraju ukoliko ih se obasja svjetlošću određene valne duljine. Fluorescentne tvari ne mijenjaju specifičnost protutijela i ne slabe njihovu sposobnost reakcije s antige-nom. Protutijela su, u ovom slučaju, označena fluorescei-nom, tvari koja fluorescira zelenom svjetlošću. Reakciju je moguće očitati isključivo na fluorescentnom mikroskopu u kojem se preparat obasjava ultraljubičastim svjetlom. Uko-liko su označena protutijela vezana uz antigen, tada se u mikroskopu opaža fluorescencija u preparatu; shodno tome, fluorescencija izostane ukoliko se nevezana obilježena pro-tutijela tijekom postupka pripreme preparata isperu. U novije vrijeme su dijagnostičke mogućnosti osobito po-boljšane korištenjem postupaka koje izdvajaju DNA uzroč-nika kao što su lančana reakcija polimerazom (PCR) i lan-čana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu (RealTime


PCR) (Rasmussen i sur., 1991.; Yang i sur., 2006.; Laroucau i sur., 2007.; Sareyyupoglu i sur., 2007.). Na temelju dobivenih rezultata možemo zaključiti da su postupci izravne i posredne imunofluorescencije primjenjivi dijagnostički postupci za dokaz antigena klamidija kao i protutijela na bakteriju Cp. psittaci u inficiranih ptica. Međutim, dijagnoza prema kliničkim znakovima vrlo je otežana zbog čestih latentnih i kroničnih infekcija, dok one akutnog tijeka nemaju osobite kliničke znakove. Izlučivanje uzročnika nije stalno, stoga rezultati pretrage uzoraka uzetih u određenom trenutku dok ptica nije izlučivala uzročnika ne moraju biti relevantni. Budući da je uzročnik unutarstanična bakterija, može se umnažati jedino u živim stanicama poput staničnih kultura (BGM, McCoy, Vero, L929) ili kokošjim zamecima. Međutim, najveći nedostatak izdvajanja same bakterije na živim stanicama je dugotrajnost dijagnostičkog postupka koji ujedno predstavlja i opasnost po zdravlje laboratorijskog osoblja; postupak, uz to, zahtijeva posebno opremljene laboratorije, pa kao takav nije dokraja prikladan u rutinskoj dijagnostici ove bolesti. Za ostale dijagnostičke postupke, kao što je to dokazivanje prisutnosti protutijela i antigena koji uključuju različita citološka i histokemijska bojenja, ELISA testove ili imunofluorescenciju, možemo reći da su relativno jednostavni za izvođenje, ali im je osjetljivost i specifičnost, u odnosu na postupak izdvajanja uzročnika na staničnim kulturama i kokošjim zamecima, mnogo manja. Prosudba rezultata dijagnostičkih postupaka za dokazivanje infekcije bakterijom Cp. psittaci u velikoj mjeri ovisi o po-znavanju kliničkih znakova, prethodnom liječenju, pravil-nom uzimanju materijala za pretragu, brzom transportu istog te izboru i izvođenju dijagnostičkih postupaka.

Literatura

Andersen, A. A., J. E. Grimes, P. B. Wyrick (1997.): Chlamydiosis (Psittacosis-Ornithosis). Pages 333-349. In: Diseases of Poultry. 10th ed. Iowa State University Press, Ames

Andersen A. A. (1998.): Chlamydiosis. In: A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, Fourth Edition. Kendall Hunt Publishing, Dubuque, Iowa,USA

Biđin, Z. (1998.): Bolesti peradi (odabrana poglavlja). Stranice 197-201. Veterinarski fakultet, Zagreb

Dovč, A. (1993.): Uvajanje imunofluorescenčnih metod v dijag-nostiko klamidioze (Chlamydia psittaci) in epizotioologija pri papigah in golbih. Magistarski rad. Univerza v Ljubljani Veterinarska fakulteta

Dovč, A., Z. Železnik, I. Mrzel (1993.): Uvedba in vrednote direkne imunofluorescence v dijagnostiki klamidioze. zbornik referatov v I simpozija o aktualnih boleznih malih živali. Gozd Matuljek, 15. in 16. aprila 1993. Slovensko združenje vete-rinarjev za male živali in Veterinarska fakulteta, Ljubljana, 116-123.

Everett, K. D., R. M. Bush, A. A. Andersen (1999.): Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Para-

chlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int. J. Syst. Bacteriol 49, 415-440.

Gerlach, H. (1994.): Chlamydia. In: Avian Medicine: Principles and Application. Ritchie, Harrison B. W, G. J., L. R. Harrison, editor. Lake Worth: Wingers Publ., Inc., 984-996.

Grimes, J. E. (1989.): Serodiagnosis of avian chlamydia infections. JAVMA 195, 1561-1564.

Kaleta, E. F., E. M. A. Taday (2003). Avian host range of Chlamydophila spp. based on isolation, antigen detection and serology, Avian Pathol. 32: 435–462.

Krauss, H., N. Schmeer (1992.): Aviaere Chlamydiose. In: Krankheite des Wirtschaftsgefluegels. Heider G., G. Monreal. Band II: Spezieller Teil 2. Gustav Fisher Verlag Jena, Stuttgart. 277-308.

Laroucau K., A. Trichereau, F. Vorimore, A. Mahe (2007.): A pmp genes-based PCR as a valuable tool for the diagnosis of avian chlamydiosis. Vet. Microbiol. 150-157.

Millicent, E., G. M. Etobierski, K. A. Smith, L. P. Williams (1995.): Compendium of chlamydiosis (psitacosis) control. 1995. JAVMA 206, 1874 - 1879.

OIE, Office International des Epizootes (2004.): Avian Chla-mydiosis. In: Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. 5th Edition. Part 2, Section 2.7. Chapter 2.7.4. Pariz, Francuska, 2004.

OIE, Office International des Epizootes (2008.): Avian Chla-mydiosis. In: Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. Part 2. Section 2.3. Chapter 2.3.1. Pariz, Francuska, 2008.

Page, L. A. (1975): Clamidiosis In: Izolations and identiphicasion of avian patogenes. Arnold. 118-131, 354-256, 357-358.

Rasmussen, S., P. Timms (1991.): Detection of Chlamydia psittaci using DNA probes and the polymerase chain reaction. FEMS Microbiol Lett. 15; 61,169–173.

Sareyyupoglu B., Z. Cantekin, B. Bas (2007.): Chlamydophila psittaci DNA detection in the faeces of cage birds. Zoonoses Public Health. 54, 237-242.

Spencer, W. N., F. W. Johnson (1983.): Simple transport medium for the isolation of Chlamydia psittaci from clinical material. Vet. Rec. 23, 535-536.

Rodolakis, A., A. Souriau (1992.): Restriction endonuclease analysis of DNA from ruminant Chlamydia psittaci and its relation to mouse virulence. Vet. Microbiol. 31, 263–271.

Trap, D. A., M. Mahe, E. J. Vandevelde (1994.): Detection of Chlamydia psittaci in birds. Comparison of clearview Chlamydia test, immunofluorescence and embryonated eggs inoculation. Rev. Med. Vet. 145, 261-266.

Vanrompay, D., A. Nerom, R. Ducatelle, and F. Haesebrouck (1994.): Evaluation of five immunoassays for detection of Chlamydia psittaci in cloacal and conjunctival specimens from turkeys. J. Clin. Microbiol. 32, 1470-1474.

Yang J.M., H. X. Liu, Y. X. Hao, H. Cheng, D. M. Zhao (2006.): Development of a rapid real-time PCR assay for detection and quantification of four familiar species of Chlamydiaceae J. Clin. Virol. 36, 79-81.


APPLICABILITY OF DIRECT AND INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE METHODS IN DIAGNOSTICS OF AVIAN CHLAMYDIOSIS

Summary

The order Chlamydiales consists of a diverse group of microorganisms of considerable importance to both animal and human health. Chlamydiosis affects humans as well as the majority of domestic animals and birds. One of the most significant species, which also represents a possible source of infection for humans, is Chlamydophila (Cp.) psittaci. The diagnosis of avian chlamydiosis relies, among other diagnostic methods, on immunological examinations. In this paper, we present some results of the direct immunofluorescent test (DIF) for direct visualisation of the agent as well as some results of the indirect immunofluorescent test (IIF) for visualisation of significant rise of antibody titers to chlamydial antigens in different groups of infected birds. For direct proof of antigen we used conjugated monoclonal antibodies to detect the antigen of Chlamydia (C.) trachomatis (in humans) which can also be used for detection of this antigen in the cells of infected birds. During indirect immunofluorescence, the conjugate will bind to specific IgG antibodies to an antigen-antibody-FITC complex which is visible under the immunofluorescence microscope. Accordingly, we can conclude that direct and indirect immunofluorescence tests are suitable diagnostic methods for the detection of chlamydial antigens and antibodies against Cp. psittaci in birds. Key words: birds, Chlamydophila psittaci, chlamidiosis, diagnosis, immunofluorescence


DELETIONS IN GENES ENCODING CYSTEINE PROTEASES OF MYCOPLASMA SYNOVIAE AND MYCOPLASMA GALLISEPTICUM

Ivanka Cizelj, Rebeka Lucijana Berčič, Daliborka Dušanić, Mojca Narat, Peter Dovč, Dušan Benčina

University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Animal Science, Domžale, Slovenia

Summary

We have determined sequences of genes encoding cysteine proteases (gene cysP) in different strains of M. synoviae and M. gallisepticum. A considerable degree of polymorphisms, including deletions, was found in the cysP gene coding region, as well as in intergenic regions upstream and downstream of this gene. Numerous polymorphic nt were also found in other parts of the cysP sequence, and can be used in epidemiologic analyses of M. synoviae strains. Key words: Mycoplasma, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma gallisepticum, genes encoding cysteine proteases,

Polymerase chain reaction Introduction

The major poultry pathogens M. synoviae and M. gallisepticum belong to different phylogenetic groups, but comparison of their genomes indicates a horizontal gene transfer of at least 14 regions, including gene encoding putative cysteine proteases (MS53_0590 and MGA_1153) (Vasconcelos et al., 2005). These proteases belong to the C1A subfamily of peptidases (MEROPS database no-menclature), like papain, which cleaves immunoglobulin G (IgG), including chicken IgG, into Fab and Fc fragments (Mage, M.G., 1980). Our analyses showed that M. synoviae and M. gallisepticum have protease(s) that can cleave chicken IgG into fragments, including Fc. However, different strains of M. synoviae and M. gallisepticum showed considerably different ability to cleave chicken IgG. Therefore, we decided to analyze the gene sequences for protein MS53_0590 and protein MGA_1153.


We used fourteen different M.synoviae and five different M.gallisepticum strains. The polymerase chain reaction (PCR) was performed with genomic DNA isolated from pelleted cells of MS and MGA strains. To amplify the cysteine protease region by PCR, many sets of primers were used. The sequences of the nucleotide primers were based on the reference hypothetical proteins MS53_0590 and

MGA_1153 (GeneBank accession no.AE017245) (Table 2.) (Vasconcelos et al., 2005). The sequence data were analyzed using BLAST algorithm at the NCBI server (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), compared with data in the GeneBank (Vasconcelos et al., 2005) and aligned with ClustalW (Chenna et al.2003). The translation of the nucleotide sequence into an amino acid sequence was made with EMBOSS Transeq at the EBI server (http://www.ebi.ac.uk/).

Results and discussion

We have determined the nucleotide sequences for the cysteine protease gene of fourteen different M.synoviae strains and five different M.gallisepticum strains. In the cysP gene coding region, as well as in intergenic regions up-stream and downstream of this gene, some polymorphisms were found, including deletions. Interestingly, cysP of the strain 53 (which determined the genome sequence) has a unique deletion of 30nt at the 3'-region, as well as premature stop codon TAA. In the 3'-cysP where M.gallisepticum strains have a 66bp long deletion, three groups of M.synoviae strains, including the type strain WVU1853, showed a deletion of 39bp. Further, the alignment of all strains showed that missense mutations resulting in dissimilar amino acid are approxi-mately twice as common as silent mutation.

Ivanka Cizelj, University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Animal Science, Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenia, e-mail: [email protected]

DELETIONS IN GENES ENCODING CYSTEINE PROTEASES OF MYCOPLASMA SYNOVIAE AND MYCOPLASMA GALLISEPTICUM 157

Conclusion

In our study we found many interesting polymorphisms which could have an important influence in further studies on M.synoviae and M.gallisepticum virulence and patho-genicity. The deletions in the upstream intergenic region of cysteine proteases gene could have an important role in the expression of cysteine proteases gene. As a result the polymorphisms within the strains could present various pathogenicitys of strains.

References

Chenna R, Sugawara H, Koike T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, Thompson JD (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acids Res 31 (13), 3497-3500.

Mage, M.G. (1980). Preparation of Fab fragments from IgGs of different animal species. Meth. Enzymol. 70:142-50.

Vasconcelos, A.T., Ferreira, H.B., Bizarro, C.V., Bonatto, S.L., Carvalho, M.O., Pinto, P.M., Almeida, D.F., et al., (2005): Swine and poultry pathogens: the complete genome sequences of two strains of Mycoplasma hyopneumoniae and a strain of Mycoplasma synoviae. J. Bacteriol. 187:5568-5577.

DELECIJE U GENIMA KOJI KODIRAJU CISTEINSKE PROTEAZE U MYCOPLASMA SYNOVIAE I MYCOPLASMA GALLISEPTICUM

Sažetak

Utvrdili smo sekvence gena koji kodiraju cistein proteaze (gen cysP) u različitim sojevima M. synoviae i M. gallisepticum. Značajna razina polimorfizama, uključujući delecije, pronađena je u regiji koja kodira gen cysP, kao i u međugenskim regijama upstream i downstream tog gena. Brojni polimorfni nt su također pronađeni u ostalim dijelovima cysP sekvence i mogu biti korišteni u epidemiološkim analizama sojeva M. synoviae. Ključne riječi: Mycoplasma, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma gallisepticum, geni koji kodiraju cistein proteaze, lančana

reakcija polimeraze


INTERPLAY BETWEEN MYCOPLASMA SYNOVIAE AND CHICKEN CELLS DURING INFECTION

Daliborka Dušanić1, Miha Lavrič2, Rebeka Lucijana Berčič1, Ivanka Cizelj1, Calvin L. Keeler3, Dušan Benčina1 Mojca Narat1

1Department of Animal Science, Biotechnical Faculty , University of Ljubljana, Domzale, Slovenia 2University of Trieste, Department of Biology, Trieste, Italy 3Department of Animal and Food Sciences, College of Agriculture and Natural Resources, University of Delaware, USA

Summary

Mycoplasma synoviae (MS) is one of the most important poultry pathogens. Strains differ in pathogenicity, but factors associated with their pathogenicity and immunomodulatory capacities are largely unknown. Some of them include the haemagglutination (HA) phenotype and, possibly, neuraminidase activity. Mycoplasma synoviae causes infection of the subclinical respiratory tract, which can progress to respiratory disease or to infectious synovitis (IS). Our previous studies have demonstrated that HA+ clones of MS are more capable of inducing IS than HA- clones of MS and that bacterial membrane fractions and culture supernatant preparations exhibit mitogenic activity in vitro for chicken and mouse tymic cells. Furthermore, we have found that MS proteins, particularly the lipoprotein MSPB, a subunit of the haemagglutinin VlhA, cause alterations in the transcription of numerous immune response genes in macrophages and induce secretion of proinflammatory cytokines IL-1β and IL-6 and nitric oxide in chicken macrophages. In order to further characterise the complex interplay of Mycoplasma synoviae with its host, we investigated the potential of MS strains to invade different non-phagocitic chicken cells in vitro. Using the gentamicin invasion assay, relative invasion frequency (RIF) of four MS strains was determined for chicken erythrocytes (CER), chicken embryonic cell line (CEC-32) and/or primary chicken chondrocytes (CCH). We demonstrated that all tested strains of Mycoplasma synoviae were capable of invading chicken cells within 24 hours after infection. The type strain WVU 1853 showed significantly higher invasiveness in CER and CEC-32 than its field strain ULB 02/T6 and M. gallisepticum strain Rlow. WVU 1853, which is capable of causing synovitis and arthritis in chickens, was less invasive for CCH with a RIF similar to that of Rlow. Key words: Mycoplasma synoviae, chicken erythrocytes, chicken chondrocytes, chicken embryonic fibroblasts, invasion Introduction Mycoplasmas represent the smallest self-replicating orga-nisms. A significant number of their species causes diseases in humans and animals and induces systemic and local immune responses as well as autoimmune reactions (Razin, 1998). Mycoplasma synoviae infection most frequently occurs as a subclinical upper respiratory infection but may become systemic, resulting in infectious synovitis, systemic vasculitis, pathological changes in many organs or auto-immune disorders. The factors responsible for significant differences in pathogenicity of MS strains are largely unknown. The haemagglutination-positive (HA+) phenotype

was found to be associated with the higher frequency of synovitis in chickens inoculated into the hock joint (Narat et al., 1998). Also, several putative immunogenic proteins and lipoproteins have been identified in Mycoplasma synoviae (Berčič et al., 2008), but their role in the process of infection has yet to be determined. A study by Lavrič et al. (2007) indicated that stimulation of macrophages with MS proteins or its lipoprotein MSPB (the N-terminal part of the VlhA haemagglutinin) induces increased synthesis of nitric oxide and proinflammatory interleukins IL-6 and IL-1β, which may contribute to pathologic processes. Also, infection of chicken cells with Mycoplasma synoviae caused upregu-lation of genes involved in inflammatory immune response (Lavrič et al., 2008).

Benčina Dušan, PhD; Department of Animal Science, Biotechnical Faculty University of Ljubljana; Groblje 3, 1230 Domžale, Slovenija; Tel.: +386 1 7217 809; fax: +386 1 7217 888; E-mail address: [email protected]

INTERPLAY BETWEEN MYCOPLASMA SYNOVIAE AND CHICKEN CELLS DURING INFECTION 159

The paradigm that mycoplasmas reside only on the surface of their hosts’ respiratory and urogenital tract and joints became questionable in the near past. It has been proven that Mycoplasma species which are known to be human pathogens, are capable of invading host cells (Lo et al., 1989; Baseman et al., 1995; Giron et al., 1996). Recent studies with Mycoplasma gallisepticum (MG) also provided clear evidence of its capability to invade chicken cells in vitro, as well as in vivo (Winner et al., 2000; Much et al., 2003; Vogl et al., 2008). So far, studies have shown close association of MS with chicken cells, however intracellular presence of Mycoplasma synoviae has not been reported. The aim of this study was to determine whether MS is able to invade non-phagocytic chicken cells.


The gentamicin invasion assay was used to assess the in-vasion frequency of Mycoplasma synoviae reference strains WVU 1853 and ULB 02/T6 as well as field isolates ULB 08/T3 and ULB 08/T4. Mycoplasma gallisepticum strain Rlow, with an already demonstrated invasion capacity, was used as a positive control. Three non-phagocitic chicken cell types were used: chicken erythrocytes (CER), primary chicken chondrocytes (CCH) and a stable transfected chicken embryonal fibroblast cell line (CEC-32). Chicken cells were experimentally infected with a multi-plicity of infection ranging from 10 to 100 mycoplasmas per chicken cell. In each experiment uninfected samples of appropriate chicken cells were used as a negative control. Relative invasion frequency (RIF) was assayed 24 hours after infection, using the gentamicin invasion assay described by Winner et al. (2000) and Vogl et al. (2008). RIF was calculated as the percentage of CFU obtained after gentamicin treatment relatively to the CFU obtained after treatment without gentamicin. Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae colonies were identified using the indirect immunoperoxidase assay (IIPA) and/or direct immunofluorescence as described (Benčina and Bradbury, 1992; Benčina et al., 1994).

Results

All tested strains of Mycoplasma synoviae were capable of invading chicken cells within 24 hours after infection. Mycoplasma gallisepticum strain Rlow showed equal invasiveness in all three cell types. The type strain of Mycoplasma synoviae WVU 1853 showed significantly higher invasiveness in CER and CEC-32 with mean RIF more than 6-fold higher than Mycoplasma gallisepticum Rlow

and field strain ULB 02/T6. Although it is capable of causing synovitis and arthritis in chickens, it was less invasive for CCH with a RIF similar to that of Rlow. The two field isolates of Mycoplasma synoviae ULB 08/T3 and ULB 08/T4 were even less invasive in CCH than WVU 1853 and MG Rlow.

Discussion and Conclusions

The proof of invasion of Mycoplasma synoviae into non-phagocitic chicken cells is an additional contribution to the understanding of the complex interplay between this patho-gen and its host. Invasion into erythrocytes suggests that in cases when MS does penetrate the epithelial surface of the respiratory tract, it can 'use' the erythrocytes as a means of dissemination throughout the host. This ability gives it the advantage of reaching different tissues as well as evading immune surveillance, the final ‘accomplishment' being the vertical transmission of the pathogen into the chicken embryo. The low RIF of MS for CCH does not indicate low possibility of in vivo invasion into chondrocytes, but rather proves that further research needs to be done in vivo to confirm these observations. It remains to be proved that Mycoplasma synoviae also invades chicken cells in vivo. Infections of the upper respiratory tract with Mycoplasma synoviae may be lifelong and are usually detectable by culturing swabs of the upper part of trachea and/or chloanal cleft (Kleven, 2003). Intracellular localisation could help to explain, at least partially, the persistence of Mycoplasma synoviae despite of specific local antibodies, phagocytosis and antibiotic treatment.

References

Baseman, J. B., M. Lange, N. L. Criscimagna, J. A. Giron, C. A. Thomas (1995): Interplay between mycoplasmas and host target cells. Microb. Pathog. 19, 2, 105-116.

Benčina, D., J. M. Bradbury (1992): Combination of immuno-fluorescence and immunoperoxidase techniques for serotyping mixtures of Mycoplasma species. J. Clin. Microbiol. 30, 407-410.

Benčina, D., S. H. Kleven, M. G. Elfaki, A. Snoj, P. Dovč, D. Dorrer, I. Russ, (1994): Variable expression of epitopes on the surface of Mycoplasma gallisepticum demonstrated with monoclonal antibodies. Avian Pathol. 23, 19-36.

Berčič, R. L., B. Slavec, M. Lavrič, M. Narat, A. Bidovec, P. Dovč, D. Benčina (2008): Identification of major immunogenic proteins of Mycoplasma synoviae isolates. Vet. Microbiol. 127, 147-154.

Giron, J. A., M. Lange, J. B. Baseman (1996): Adherence, fibronectin binding and introduction of cytoskeleton reorga-nization in cultured human cells by Mycoplasma penetrans. Infect. Immun. 64, 197-208.

Kleven, S. H. (2003): Mycoplasma synoviae infection. In: Saif, Y. M., H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne (Eds.): Diseases of poultry. 11th edition. Iowa State University Press. Ames. 756-766.

Lavrič, M., D. Benčina, S. Kothlow, B. Kaspers, M. Narat (2007): Mycoplasma synoviae lipoprotein MSPB, the N-terminal part of VlhA haemagglutinin, induces secretion of nitric oxide, IL-6 and IL-1beta in chicken macrophages. Vet Microbiol. 15, 121, 278-287.

Lavrič, M., M. N. Maughan, T. W. Bliss, J. E. Dohms, D. Benčina, C. L. Keeler Jr., M. Narat (2008): Gene expression modulation in chicken macrophages exposed to Mycoplasma synoviae or Escherichia coli. Vet. Microbiol. 1, 126, 111-121.

INTERPLAY BETWEEN MYCOPLASMA SYNOVIAE AND CHICKEN CELLS DURING INFECTION 160

Lo, S. C., M. S. Dawson, D. M. Wong, P. B. Newton III, M. A. Sonoda, W. F. Engler, R. Y. Wang, J. W. Shih, H. J. Alter, D. J. Wear (1989): Identification of Mycoplasma incognitus infection in patients with AIDS: an immunohistochemical, in situ hybridization and ultrastructural study. Am. J. Trop. Med. Hyg. 41, 601-616.

Much, P., F. Winner, L. Stipkovits, R. Rosengarten, C. Citti (2003): Mycoplasma gallisepticum: influence of cell invasiveness on the outcome of experimental infection in chickens. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 34, 181-186.

Narat M., D. Benčina, S. H. Kleven, F. Habe (1998): The hemagglutination-positive phenotype of Mycoplasma synoviae

induces experimental infectious synovitis in chickens more frequently than does the hemagglutination-negative phenotype. Infect. Immun. 66, 12, 6004-6009.

Razin, S., D. Yogev, Y. Naot (1998): Molecular biology and pathogenicity of Mycoplasmas. Microbiology and molecular biology reviews 62, 4, 1094-1156.

Vogl, G., A. Plaickner, S. Szathmary, L. Stipkovits, R. Rosengarten, M. P. Szostak (2008): Mycoplasma gallisepticum invades chicken erythrocytes during infection. Infect. Immun. 76, 1, 71-77.

Winner, F., R. Rosengarten, C. Citti, 2000. In vitro cell invasion of Mycoplasma gallisepticum. Infect. immun 68, 7, 4238-4244.

MEĐUSOBNI UTJECAJ MYCOPLASMA SYNOVIAE I PILEĆIH STANICA TIJEKOM INFEKCIJE

Sažetak

Mycoplasma synoviae (MS) je jedan od najvažnijih patogena u peradi. Sojevi se razlikuju u patogenosti, ali faktori povezani s njihovom patogenošću, a imunomodulatorni kapaciteti su većinom nepoznati. Neki od njih uključuju fenotip hemaglutinacije i moguće aktivnosti, neuraminidaze. Mycoplasma synoviae uzrokuje subkliničku infekciju respiratornog trakta, koja može uznapredovati u respiratornu bolest ili infektivni sinovitis (IS). Naša su prethodna istraživanja pokazala da su HA+ klonovi MS sposobniji inducirati IS za razliku od HA- klonova MS, te da frakcije bakterijske membrane i pripravci supernatanta kulture pokazuju mitogenu aktivnost in vitro za pileće i mišje timusne stanice. Nadalje, doznali smo da MS proteini, posebice lipoprotein (MSPB), podjedinica hemaglutinina VlhA, uzrokuje promjene u tranksripciji brojnih gena imunosnog odgovora u makrofagima i induciraju sekreciju proinflamatornih citokina IL-1β i IL-6 i dušični monoksid u kokošjim makrofagima. Kako bi se dalje karakteriziralo složeno međudjelovanje Mycoplasma synoviae s domaćinom, ispitivali smo potencijal MS sojeva da napadnu različite nefagocitične kokošje stanice in vitro. Koristeći gentamicin uzorak, relativna frekvencija invazivnosti (engl. relative invasion frequency, RIF) četiri soja MS određena je za kokošje eritrocite (engl. chicken erythrocytes, CER), kokošju embrio staničnu liniju (engl. chicken embryonic cell line, CEC-32) i/ili primarne kokošje kondrocite (engl. primary chicken chondrocytes, CCH). Pokazali smo da su svi testirani sojevi Mycoplasma synoviae bili sposobni napasti kokošje stanice unutar 24 sata nakon infekcije. Soj tipa WVU 1853 pokazao je značajno veću invazivnost u CER i CEC-32 nego soj ULB 02/T6 i soj M. gallisepticum Rlow. WVU 1853, koji može prouzrokovati sinovitis i artritis u kokoši, bio je manje invazivan za CCH s RIF sličnim onim od Rlow. Ključne riječi: Mycoplasma synoviae, kokošji eritrociti, kokošji kondrociti, kokošji embrionski fibroblasti, invazija


MIKOPLAZMOZE PURANA I KOKOŠI TEŠKIH HIBRIDA TIJEKOM 2007. I 2008. GODINE U REPUBLICI HRVATSKOJ

Tajana Amšel Zelenika, Vladimir Savić, Mirta Balenović, Luka Jurinović


Sažetak

Istražena je učestalost infekcije purana vrstama Mycoplasma gallisepticum (MG), M. synoviae (MS) i M. meleagridis (MM) i kokoši teških hibrida MG-om i MS-om tijekom 2007. i 2008. godine u Republici Hrvatskoj. Probom brze serumske aglutinacije (BSA) pretraženo je ukupno 3339 seruma rasplodnih nesilica teških hibrida i 288 tovnih pilića na nazočnost protutijela za MG i 2596 seruma rasplodnih nesilica teških hibrida i 288 tovnih pilića na nazočnost protutijela za MS. Na nazočnost protutijela za MG pretraženo je 3217 seruma tovnih purana, za MS 1473 seruma tovnih i 216 rasplodnih purana, a na nazočnost protutijela za MM 3779 seruma tovnih i 216 seruma rasplodnih purana. Tijekom 2007. godine utvrđeno je 11,3% pozitivnih rasplodnih nesilica na MG i 12,5% na MS, a 2008. 3,4% pozitivnih rasplodnih nesilica na MG i 24,6% na MS. Tijekom 2007. godine nismo zabilježili pozitivne nalaze u tovnih pilića, dok je učestalost pozitivnih nlaza tijekom 2008. bila 2,5% pozitivnih na MG i 12,5% na MS. Mali broj pretraženih seruma rasplodnih purana posljedica je malog broja rasplodnih jata u Hrvatskoj, no usprkos tome utvrđeno je 7 pozitivnih od 24 seruma na MM. U tovnih purana u dobi od 4 do 21 tjedan tijekom 2007. utvrđeno je 3,3% pozitivnih seruma na MG, 11,2% na MS i 1,8% na MM. Tijekom 2008. utvrđeno je 4,1% pozitivnih seruma tovnih purana u dobi od 1 dan na MM. U dobi od 4 do 21 tjedan utvrđeno je 0,2% pozitivnih na MG i 13,6% na MM. Rezultati ukazuju na ne preveliku, ali uvijek prisutnu infekciju mikoplazmama u kokoši i purana. Stoga je, osim poboljšanja higijene i uzgojnih mjera, važna pravovremeno postavljena dijagnoza i točno određena terapija kako bi se spriječili gubici u proizvodnji. Ključne riječi: Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma meleagridis, infekcija, kokoš, puran,

Hrvatska

Uvod

Mikoplazmoze peradi prvi su puta opisane 1926. godine u purana, a 1936. godine u kokoši (Charlton i sur., 1996.). Od tada pa sve do danas, unatoč unapređenju uzgoja i proiz-vodnje, mikoplazmoze zauzimaju važno mjesto uzrokujući gubitke u peradarskoj proizvodnji. Mikoplazme pripadaju razredu Mollicutes, redu Mycoplas-matales i porodici Mycoplasmataceae. Nemaju čvrstu sta-ničnu stijenku, što ih čini otpornima prema antibioticima (npr. penicilin) koji djeluju na staničnu stijenku. Smatrane su ekstracelularnim organizmima, no znanstvenici danas tvrde da su neke od mikoplazmi obligatni, a neke fakultativno intracelularni patogeni (Razin i sur., 1998.). Tijekom infek-cije očituje se prolazna supresija humoralne i stanične imu-nosti, imunotolerancija i limfoidna infiltracija respiratornog trakta (Yamamoto, 1990.). U peradi je izdvojen velik broj mikoplazmi, od kojih su za domaću perad najznačajnije

Mycoplasma gallisepticum (MG), M. synoviae (MS), M. iowe (MI) i M. meleagridis (Bradbury, 1993.). Najčešće bolesti uzrokovane mikoplazmama su kronična respiratorna bolest, primarno vidljiva u pilića i zarazni sinu-sitis u purana, uzrokovan MG, zarazni sinovitis, uzrokovan MS-om i upala zračnih vrećica, uzrokovana MG-om, MS-om i MM-om. Mikoplazme često uzrokuju subkliničke in-fekcije koje su tek u kombinaciji s drugim mikroorganiz-mima razlog značajnih gubitaka u peradarskoj proizvodnji. Klinički se infekcija MG očituje dišnim simptomima (kaš-ljanje, kihanje, šmrcanje, suzenje), smanjenim uzimanjem hrane, padom nesivosti, slabom valivošću, otečenjem infra-obitalnih sinusa u purana i povećanim uginućem. U pilića i purana blaži oblik tih simptoma može biti vidljiv i kod infekcije MS-om uz šepavost, blijedu krijestu i otečenje zglobova nogu. No, respiratorna infekcija MS-om najčešće je asimptomtska (Charlton i sur., 1996.). Infekcija MM-om česta je u purana. Najčešće se očituje upalom zračnih vre-

Dr. sc. Tajana Amšel Zelenika, dr.vet.med.. Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Heinzelova 55, Zagreb, Republika Hrvatska; tel: ++385 (0) 1 2441 394; fax: ++385 (0) 1 2441 396; E-mail. [email protected]

MIKOPLAZMOZE PURANA I KOKOŠI TEŠKIH HIBRIDA TIJEKOM 2007. I 2008. GODINE U REPUBLICI HRVATSKOJ 162

ćica kao i simptomima u dišnom i reproduktivnom sustavu, smanjenom valivošću uz povećanu smrtnost embrija i slabom težinom izvaljenih pilića. Vrlo često uzrokuje deformaciju zglobova nogu i vrata tovnih purana. Stres i zimski uvjeti pojačavaju tijek i duljinu bolesti. Vrlo su česte sekundarne infekcije (E.coli, virus zaraznog bronhitisa, new-castleska bolest, virus zaraznog laringotraheitisa, reovirusi, adenovirusi, Hemophilus paragallinarum i dr.) (Chalton i sur., 1996.; Bradbury, 2001.). Prenosi se horizontalno i vertikalno. Dijagnoza bolesti po-stavlja se serološki (brza serumska aglutinacija, imunoen-zimni test, inhibicija hemaglutinacije) (Stipkovits i Kempf, 1996.). Mikoplazme se mogu izdvojiti i identificirati iz obri-ska sluznice nosa, ždrijela, dušnika, zračnih vrećica, kloake, sadržaja infraorbitalnih sinusa i zglobova na selektivnim podlogama. Lančana reakcija polimerazom (engl. Polyme-rasa chain reaction – PCR) u početku je razvijena kao dokaz MG (Nasciemento i sur., 1991.), no danas se upo-trebljava i kao metoda dokazivanja ostalih vrsta mikoplazmi u ptica (Lauerman i sur., 1993.). Liječenje mikoplazmoze peradi najčešće je simptomatsko (Ortiz i sur., 1995.), međutim na taj način ne eliminiramo mikoplazme iz jata (Stipkovits i Kempf, 1996.). Miko-plazme su osjetljive na tetraciklin, makrolidne antibiotike, kinolon i tiamulin. Često se preporučuju lijekovi koji se u visokoj koncentraciji nakupljaju u mukoznoj membrani dišnog i urogenitalnog trakta, kao tiamulin i enrofloksacin (Nasciemento i sur., 1999.). Njihova upotreba otežava seo-lošku dijagnozu MG, MS i MM, jer blokiraju imunosni odziv te smanjuju mogućnost izolacije i dokaz mikoplazmi lančanom reacijom polimerazom. Vrlo je često nakon pre-stanka liječenja moguć recidiv (Kempf, 1991.; Nasciamento i sur., 1999.). U novije vrijeme postoji mogućnost imu-nizacije peradi inaktiviranim ili živim vakcinama (Kleven, 1993.), no taj oblik prevencije se u Hrvatskoj za sada ne provodi. Zbog svega navedenog iskorjenjivanje mikoplazmoze se i dalje postiže prvenstveno poboljšanjem higijene i uzgojnih mjera, terapijom uzgojnih jata te stvaranjem jata slobodnih od mikoplazme. Rasplodna jaja podrijetlom od jata opte-rećenih mikoplazmom mogu se tretirati inokulacijom anti-

mikrobnih preparata u zračnoj komori ili kratkotrajnim zagrijavanjem jaja na 46 °C kroz 12 – 24 sata (Nasciemento i Nasciemento, 1994.; Stipkovits i Kempf, 1996.). Cilj ovog istraživanja je odrediti učestalost infekcije kokoši teških hibrida MG-om i MS-om, kao i rasplodnih i tovnih purana MG-om, MS-om i MM-om tijekom 2007. i 2008. godine.

Materijali i metode

Kokoši Pretraženo je ukupno 3339 rasplodnih nesilica kokoši teških hibrida i 288 tovnih pilića na nazočnost protutijela za MG te 2596 rasplodnih nesilica i 288 tovnih pilića na nazočnost protutijela za MS.

Purani Pretraženo je ukupno 3217 tovnih purana na nazočnost pro-tutijela za MG, 1473 tovna purana i 216 rasplodnih purana na nazočnost protutijela za MS te 3779 tovnih purana i 216 rasplodnih purana na nazočnost protutijela za MM. Krv za serološke pretrage uzorkovana je od nasumično odabranih ptica u različitoj dobi i s različitih farmi diljem Hrvatske tijekom 2007. i 2008. godine.

Laboratorijske pretrage Nazočnost protutijela za MG, MS i MM u krvnim serumima određena je brzom serumskom aglutinacijom (BSA). Kori-šteni su antigeni Mycoplasma gallisepticum (soj S6, Adler), Mycoplasma synoviae (soj WVU-1853) i Mycoplasma meleagridis (soj Yamamoto 529) proizvođača Intervet Inter-national B.V., Boxmeer, Holland. Proba je učinjena prema uputi proizvođača antigena pomoću aglutinacijske kutije s osvijetljenom staklenom pločom zagrijanom na 20 – 25° C. Reakcija je očitavana unutar dvije minute.

Rezultati

Rezultati BSA za nazočnost protutijela za MG i MS u rasplodnih nesilica i tovnih pilića tijekom 2007. i 2008. godine prikazani su u tablicama 1. i 2.

Tablica 1. Rezultati BSA na prisutnost protutijela za MG i MS u rasplodnih nesilica tijekom 2007. i 2008. godine

Godina Dob MG

pozitivno/pretraženo (%)

MS pozitivno/pretraženo

(%) 1 dan 0/540 (0 %) 0/279(0 %)

< 21 tjedan 0/62 (0 %) -

2007. > 21 tjedan 81/715 (11,3 %) 58/464 (12,5 %)

1 dan 0/677 (0 %) 0/500 (0 %) < 21 tjedan 0/155 (0 %) 0/95 (0 %)

2008. > 21 tjedan 40/1190 (3,4 %) 310/1258 (24,6 %)

Ukupno uzoraka 3339 2596


Table 1. The results of the rapid serum agglutination (RSA) in the presence of antibodies to MG and MS in poultry breeding during 2007 and 2008

Year Age MG

positive/tested (%)

MS positive/tested

(%) 1 day 0/540 (0 %) 0/279(0 %)

< 21 week 0/62 (0 %) -

2007. > 21 week 81/715 (11,3 %) 58/464 (12,5 %)

1 day 0/677 (0 %) 0/500 (0 %) < 21 week 0/155 (0 %) 0/95 (0 %)

2008. > 21 week 40/1190 (3,4 %) 310/1258 (24,6 %)

Total sample 3339 2596 Tablica 2. Rezultati BSA na prisutnost protutijela za MG i MS u tovnih pilića tijekom 2007. i 2008. godine

Godina Dob MG



(%) 1 dan 0/125 (0 %) 0/125 (0 %)

2007. 30-42 dana - -

1 dan 4/160 (2,5 %) 20/160 (12,5 %) 2008.

30-42 dana 0/3 (0 %) 0/3 (0 %) Ukupno uzoraka 288 288

Table 2. The results of the rapid serum agglutination (RSA) in the presence of antibodies to MG and MS in fattening chicken

during 2007 and 2008

Year Age MG

positive/tested (%)

MS positive/tested

(%) 1 day 0/125 (0 %) 0/125 (0 %)

2007. 30-42 days - -

1 day 4/160 (2,5 %) 20/160 (12,5 %) 2008.

30-42 days 0/3 (0 %) 0/3 (0 %) Total sample 288 288

Rezultati BSA na prisutnost protutijela za MG, MS i MM u rasplodnih i tovnih purana prikazana je u tablicama 3. i 4. Tablica 3. Rezultati BSA na prisutnost protutijela za MS i MM u rasplodnih purana tijekom 2007. i 2008. godine

Godina Dob MS


MM pozitivno/pretraženo

(%) < 30 tjedana 0/24 (0 %) 0/24 (0 %)

2007. > 30 tjedana 0/24 (0 %) 7/24 (29,2 %) < 30 tjedana 0/72 (0 %) 0/72 (0 %)

2008. > 30 tjedana 0/96 (0 %) 0/96 (0 %)

Ukupno uzoraka 216 216


Table 3. The results of the rapid serum agglutination (RSA) in the presence of antibodies to MS and MM in turkey breeding during 2007 and 2008

Year Age MG

positive/tested (%)

MS positive/tested

(%)

< 30 weeks 0/24 (0 %) 0/24 (0 %) 2007.

> 30 weeks 0/24 (0 %) 7/24 (29,2 %)

< 30 weeks 0/72 (0 %) 0/72 (0 %) 2008.

> 30 weeks 0/96 (0 %) 0/96 (0 %)

Total sample 216 216 Tablica 4. Rezultati BSA na prisutnost protutijela za MG, MS i MM u tovnih purana tijekom 2007. i 2008. godine

Godina Dob MG



(%)

MM pozitivno/pretraženo

(%)

1 dan 0/450 (0 %) 0/450 (0 %) 0/450 (0 %) 2007. 4-21 tjedan 35/1046 (3,3 %) 15/134 (11,2 %) 21/1171 (1,8 %)

1 dan 0/483 (0 %) 0/483 (0 %) 20/483 (4,1 %) 2008.

4-21 tjedan 3/1238 (0,2 %) 0/406 (0 %) 256/1882 (13,6 %)

Ukupno uzoraka 3217 1473 3779 Table 4. The results of the rapid serum agglutination (RSA) in the presence of antibodies to MG, MS and MM in fattening

turkey during 2007 and 2008

Year Age MG

positive/tested (%)

MS positive/tested

(%)

MM positive/tested

(%)

1 day 0/450 (0 %) 0/450 (0 %) 0/450 (0 %) 2007. 4-21 week 35/1046 (3,3 %) 15/134 (11,2 %) 21/1171 (1,8 %)

1 day 0/483 (0 %) 0/483 (0 %) 20/483 (4,1 %) 2008.

4-21 week 3/1238 (0,2 %) 0/406 (0 %) 256/1882 (13,6 %)

Total sample 3217 1473 3779 Rasprava

Tijekom istraživanog razdoblja u Republici Hrvatskoj nije provođeno cijepljenje, pa tako nalaz pozitivnih seruma u krvnim serumima kokoši i purana upućuje na terensku infekciju ovim patogenom. U rasplodnih nesilica dobi do 21 tjedan tijekom 2007. i 2008. nismo našli protutijela za MG i MS. Međutim, nakon proneska uočen je veći broj pozitivnih seruma i to 2007. godine 11,3% pozitivnih seruma na MG i 12,5% na MS, dok je 2008. godine manji postotak pozitivnih seruma na prisutnost protutijela za MG (3,4%) no veći za MS (24,6%) (Tablica 1). Taj podatak zasigurno je zabri-

njavajući s obzirom na to da se mikoplazme prenose i horizontalno i vertikalno (Kleven, 2003.). No, nažalost, tijekom 2007. i 2008. godine pretražen je vrlo mali broj seruma tovnih pilića (Tablica 2). Tako tijekom 2007. godine nismo zabilježili pozitivan nalaz na protutijela za MG i MS usprkos pozitivnim nalazima u nesilica. No tijekom 2008. bilježimo 2,5% pozitivnih seruma na prisutnost protutijela za MG i 12,5% za MS. S obzirom na to da infekcija mikoplazmama u povoljnim uvjetima držanja vrlo često prolazi asimptomatski, može se pretpostaviti da nije bilo većih kliničkih manifestacija u jatima tovnih pilića. No tu činjenicu možemo objasniti i vrlo visokim troškovima uzgo-


ja tovnih pilića i pribjegavanju peradara simptomatskom liječenju. Simptomatsko liječenje uklanja kliničke simpto-me, no ne eliminira mikoplazme iz jata, pa ušteda na dijag-nostici u konačnici može rezultirati velikim gubitcima (Stipkovits i Kempf, 1996.). Nakon takvog liječenja vrlo se često javlja recidiv (Kempf, 1991.; Nasciamento i sur., 1999.). U Republici Hrvatskoj broj rasplodnih jata purana je malen, pa je stoga razumljiv relativno mali broj uzoraka za pretragu na prisutnost protutijela za MG, MS i MM. Tek tijekom 2007. godine bilježimo 7 pozitivnih od 24 seruma (29,1%) na MM u jednom jatu rasplodnih purana (Tablica 3). No značajno je veći broj pretraženih seruma tovnih purana. Tijekom 2007. nismo našli pozitivne serume u tovnih purana u dobi od 1 dana, što ukazuje na to da nije bilo vertikalnog prijenosa. No u purana u dobi od 4 do 21 tjedan utvrdili smo 3,3% pozitivnih seruma na MG, 11,2% pozitivnih na MS i 1,8% pozitivnih na MM. Nasuprot tome, tijekom 2008. godine utvrdili smo 4,1% pozitivnih seruma za MM u tovnih purana dobi 1 dan. U dobi od 4 do 21 tjedan nismo našli pozitivne rezultate za MS, vrlo mali postotak (svega 0,2%) utvrđen je za MG, no značajno je veći broj pozitivnih seruma za MM (13,6%). Pogledamo li Tablicu 4, vidjet ćemo da je od ukupno pretraženih seruma u tovnih purana najmanje seruma pretraženo na prisutnost protutijela za MS. To je i razumljivo s obzirom na to da ova infekcija najčešće prolazi asimptomatski. No infekcije MG-om, a posebice MM-om su vrlo često povezane sa simptomima dišnog su-stava, upalom zračnih vrećica kao i deformacijom zglobova nogu i vrata. Kliničku manifestaciju mikoplazmoze u purana najčešće prate izrazito loši i stresni uvjeti držanja ili sekun-darna infekcija. Naši rezultati ukazuju na ne preveliku, ali uvijek prisutnu infekciju mikoplazmama, kako u kokoši tako i u purana. Stoga uvijek treba imati na umu da samo pravovremenim uvidom u zdravstveno stanje jata, kao i pravilno postav-ljenom dijagnozom možemo točno odrediti liječenje te na taj način spriječiti gubitke u proizvodnji.

Literatura

Bradbury, M. Janet (1993.): Taxonomy and general properties of the Mollicutes including candidate new species of Avian

Origin. International Symposium „Advances in Avian My-coplasma Research“ 27.-29. September 1993. Domžale, Slovenia. 1.1.

Bradbury, M. Janet (2001.): Avian mycoplasmosas. U Poultry Diseases, Jordan F. I sur. (ur) W.B. Saunders, London, UK, 5, 178-193.

Charlton B. R., A. J. Bermudez, M. Boulianne, R. J. Eckroade, J. S. Jeffrey, L. J. Newman, J. E. Sander, P. S. Wakenell (1996.): Avian disease manual. Charlton B.R. (ur), American Asso-ciation of Avian Pathologists, Pensylvania, USA, 115-125.

Kempf, I. (1991.): Influence of the administration of antibioticson the diagnosis of Mycoplasma gallisepticum infection in chickens. Point-veterinaire, 23, 767-773.

Kleven, S. H. (1993.): Vacine developments. International Sym-posium „Advances in Avian Mycoplasma research“ 27.-29. September 1993, Domžale, Slovenia, 4.2.

Kleven, S. H. (2003.): Mycoplasma synoviae infection. U Disease of Poultry, Saif, Y. M. i sur. (ur), Ames Iowa, USA, 9, 756-766.

Lauerman, L. H., F. J. Hoerr, A. R. Sharpton, S. M. Shah, V. L. van Santen (1993.): Development and application of a polymerase chain reaction assay for Mycoplasma synoviae. Avian disease 37, 829-834.

Nasciemento, E. R., M.G. F. Nasciemento (1994.): Eradication of Mycoplasma gallisepticum and M. synoviae from a chicken flock in Brazil, Proc Western Poult Dis Conf 43, 58-59.

Nasciamento, E. R., M. G. F. Nasciemento, O. P. Rodrigues, G. A. Mendonca, G. B. Lignon, S. A. C. Dias, J. Y. Ito (1999.): Avaliacão de antimicrobianos no tratamento da doenca respiratória crônica por Mycoplasma gallisepticum e Escherichia coli em frangos de corte. Brazilian Journal of Poultry Science, 72.

Nasciemento, E. R., R. Yamamoto, K. R. Herick, R. C. Tiat (1991.): Polymerase chain reaction for detection of mycoplasma gallisepticum, Avian disease 35, 62-69.

Ortiz, A., R. Froyman, S. H. Kleven (1995.): evalution of enrofloxacin against egg transmission of Mycoplasma gallisepticum. Avian Diseases 39, 830-836.

Razin, S., D. Yogev, Y. Naot (1998.): Molecular biology and Pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology reviews, (62), 1094-1156.

Stipkovits, L., I., Kempf (1996.): Mycoplasmosis in Poultry (Re-wiew). Bulletin de I Office des Epizooties, 15 (4), 1495-1525.

Yamamoto, R. (1990.): Mollicutes, U rewiew of veterinary microbiology, Biberstien E.L. i Y.C. Zee (ur), Blackwell Scientific Publications, Chicago, 213-227.

MYCOPLASMOSIS IN TURKEYS AND HEAVY HYBRID HENS IN THE REPUBLIC OF CROATIA IN THE PERIOD 2007-2008

Summary

The frequency of infections in turkeys has been researched with the type Mycoplasma gallisepticum (MG), M. synoviae (MS) and M. meleagridis (MM) and in heavy hybrid chickens with MG and MS during 2007 and 2008 in the Republic of Croatia. By the trial of a rapid serum agglutination (BSA), 3339 serums from heavy hybrid breeding egg layers and 288 fattening chickens have been tested for the presence of MG antibodies, and 2596 serums from heavy hybrid breeding chickens and 288 breeding chickens have been tested for the presence of MS antibodies. For the presence of MG antibodies, 3217 serums from fattening turkeys have been tested, for MS, 1473 serums from fattening turkeys and 216 breeding turkeys, and for the presence of MM antibodies, 3779 serums from fattening and 216 serums from breeding turkeys have


been tested. During the year 2007, 11,3% of breeding egg layers have been determined positive for MG and 12,5% for MS, and in 2008, 3,4% breeding egg layers have been positive for MG and 24,6% for MS. During the year 2007 we have not recorded positive results in fattening chickens, while the frequency of positive results during the year 2008 was 2,5% positive for MG and 12,5% for MS. A small number of tested serums from breeding turkey is the consequence of a small number of breeding flocks in Croatia, but despite this 7 positive from 24 serums for MM have been determined. In fattening turkeys of 4 to 21 weeks of age during 2007, 3,3% of serums positive for MG, 11,2% for MS and 1,8% for MM have been determined. During the year 2008, 4,1% of positive serums have been determined from fattening chickens at the age of one day for MM. At the age of 4 to 21 weeks, 0,2% positive for MG and 13,6% for MM have been determined. The results indicate to a not very significant, but an always present mycoplasmal infection in chickens and turkeys. Therefore, besides the improvement of hygiene and breeding measurements, it is also important to make a diagnosis and the precise therapy in time so the losses in production would be prevented. Key words: Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma meleagridis, infection, chicken, turkey,

Croatia


SALMONELE U JAJIMA I IZMETU PERADI TIJEKOM 2007. I 2008. GODINE

Fani Krstulović, Borka Šimpraga, Marijana Sokolović, Radmila Raguž-Đurić

Centar za peradarstvo, Hrvatski Veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Tijekom 2007. i 2008. godine u Laboratoriju za bakteriologiju Centra za peradarstvo ukupno je pretraženo 45 183 uzorka (8 827 uzoraka konzumnih jaja, 4 597 uzoraka rasplodnih jaja, 1 843 uzorka izmeta konzumnih nesilica i 4 033 uzorka izmeta rasplodnih nesilica) na prisutnost bakterija iz roda Salmonella. U 2007. godini izdvojene su 92 salmonele, a u 2008. godini 66 salmonela. Najčešće izdvajan serovar u svim pretraženim uzorcima bio je Salmonella Enteritidis. Serovarovi Salmonella Typhimurium, S. Virchow i S. Hadar nisu izdvojeni iz pretraženog uzorka. Serovar S. Infantis izdvojen je iz četiri uzorka konzumnih jaja. Izdvajanje i identifikacija salmonela iz jaja i izmeta obavljena je prema uputama standardnih metoda (HRN EN 6579: 2003, ISO 6579: 2007. Amandman 1: Dodatak D). Biokemijska karakterizacija izdvojenih salmonela napravljena je primjenom API nizova ID 32E za enterobakterije. Pripadnost serovaru određena je serološkom tipizacijom s polivalentnim i monovalentim antiserumima za pojedine antigene salmonela. Ključne riječi: salmonele, konzum, rasplod, jaja, izmet Uvod Prema izvješću Europske agencije za sigurnost hrane, u većini europskih zemalja broj slučajeva salmoneloze u ljudi posljednjih godina pokazuje trend opadanja (EFSA, 2009.). No, unatoč ovim podacima infekcije bakterijama iz roda Salmonella još uvijek su drugi najčešći uzrok trovanja ljudi hranom. U posljednjih dvadesetak godina znatno je porasla pojavnost salmoneloze u ljudi uzrokovane posebice sero-varom S. Enteritidis koja u ljudi uzrokuje gotovo 80% svih gastrointestinalnih infekcija (Barrow i sur., 2003.; Barrow, 2007.). Hipotetski rečeno, S. Enteritidis potpuno je zamijenila S. Pullorum i S. Gallinarum (Rabsch i sur., 2000.) te S. Typhi-murium kao primarnog uzročnika salmoneloze u svijetu (Baumler i sur. 2000.). Najčešći uzrok infekcija ljudi nespe-cifičnim, invazivnim i virulentnim serovarovima salmonela, od kojih još uvijek vodeće mjesto pripada serovaru Enteri-tidis, su jaja i meso te proizvodi od jaja i mesa peradi. Zbog velike sposobnosti preživljavanja i male domaćin-speci-fičnosti, salmonele su raširene po čitavom svijetu pa tako čine jedan od najznačajnijih bakterijskih rodova. Njihova svojstva zadržavanja u okolišu peradi predstavljaju važnu značajku njihove složene epidemiologije (Davies i Breslin, 2003.). Mnogobrojne vrste domaćih i divljih životinja, ali i

čovjek rezervoari su tih bakterija u prirodi. Izvori infekcije mogu biti voda, stelja i zaražena perad koja izlučivanjem salmonela putem izmeta zagađuje okoliš te tako omogućava njihovo horizontalno širenje. Kao potencijalni izvor infek-cije spominju se i insekti (Davies i Wray, 1994.; Skov i sur., 2004.) te glodavci (Henzler i Opitz, 1992.). Prisutnost sal-monela u sastojcima za hranu i u hrani za perad može uzro-kovati njihovo obolijevanje i smanjenu proizvodnost (Soko-lović i sur., 2006.). U intenzivnoj peradarskoj proizvodnji, salmoneloze i salmonelne infekcije uzrok su velikim eko-nomskim gubitcima prouzročenih uginućima (osobito u prvim tjednima života), smanjenom proizvodnjom jaja, lo-šom kvalitetom pilića i visokim troškovima liječenja, mjera kontrole te suzbijanja (Hafez 2005.). Implementacijom uredbi Europske komisije za smanjenje određenih serovarova salmonela u odraslih rasplodnih jata vrste Gallus gallus (EC, 2005.) i u jatima konzumnih ne-silica vrste Gallus gallus (EC, 2006. a) u nacionalne pro-grame, implementacijom dobre proizvođačke prakse u pro-izvodnji hrane te uvođenjem dobre higijenske prakse tije-kom pripreme hrane zasigurno će se pridonijeti povećanju zaštite potrošača. Također, u nacionalne programe imple-mentirana je uredba Europske komisije o zabrani korištenja antibiotika kao specifične metode kontrole salmonela u pe-radi (EC, 2006. b). Upotreba antibiotika po ovoj uredbi

mr. Fani Krstulović,dr.vet.med., Hrvatski veterinarski institut; Centar za peradarstvo, Heinzelova 55, 10 000 Zagreb, Republika Hrvatska; tel. 00385 (0) 1 2441 394; fax. 00385 (0) 1 2441 396; e-mail: [email protected]

SALMONELE U JAJIMA I IZMETU PERADI TIJEKOM 2007. I 2008. GODINE 168

dozvoljena je samo u pojedinim slučajevima. Strategija kon-trole salmoneloze mora uključivati temeljito čišćenje i ras-kužbu cijelog proizvodnog lanca, uništavanje zaraženih jata (u slučaju invazivnih salmonela), sanitaciju rasplodnih jaja, primjenu najstrožih mjera higijene u nastambama za perad i njihovom okolišu te u tvornicama hrane za perad. Smanjenje rizika od infekcije i redukcija salmonela koje se prenose hranom postiže se primjenom dodataka u hrani, primjenom probiotika, prebiotika i vakcinacijom peradi (Hafez, 2008.). U ovom radu prikazan je pregled pojavnosti salmonela u jajima i izmetu konzumnih i rasplodnih nesilica tijekom 2007. i 2008. godine.

Materijal i metode

Tijekom 2007. i 2008. godine u Laboratoriju za bakterio-logiju Centra za peradarstvo ukupno je pretraženo 45 183 uzorka (8 827 uzoraka konzumnih jaja, 4 597 uzoraka ras-plodnih jaja, 1 843 uzorka izmeta konzumnih nesilica i 4 033 uzorka izmeta rasplodnih nesilica) na prisutnost bak-terija iz roda Salmonella. Izdvajanje salmonela iz konzumnih i rasplodnih jaja obav-ljeno je prema uputama standardne metode HRN EN ISO 6579:2003, a iz uzoraka fecesa u skladu s uputama ISO 6579: 2007. Amandman 1: Dodatak D. Ukratko, iz homoge-nata konzumnih jaja (žumanjak i bjelanjak 10 jaja) odva-gano je 50g i nacijepljeno u 450 mL puferirane peptonske vode (BPW - Buffered Peptone Water, bioMérieux, Fran-cuska). Sadržaj iz 10 rasplodnih jaja uzet je sterilnom mikrobiološkom ušicom i nacijepljen je u 9 mL puferirane peptonske vode. Nacijepljeni bujoni inkubirani su na 37 ºC ± 1 ºC kroz 18 ± 2 sata. Potom je 0,1 mL inkubiranog medija precijepljeno u epruvete s 10 ml Rappaport Vassiliadis bujona (RV- Rappaport Vassiliadis Soya broth, Bio–Rad, Francuska) i 1 mL u epruvete s 10 ml Muller-Kauffmann tetrationat/novobiocin bujona (MKTTn-Muller-Kauffman tetrathionate/novovbiocin broth, bioMérieux, Francuska). Epruvete s RV bujonom inkubirane su na 41,5 ºC ± 1 ºC tijekom 24 ± 3 sata, a s MKTTn bujonom na 37 ºC ± 1 ºC kroz 24 ± 2 sata. Nakon inkubacije iz svakog selektivnog bujona mikrobiološkom ušicom nacijepljeno je oko 10 μL na čvrste selektivne podloge: Xilose lysine desoxycholate (XLD agar- bio Merieux, Francuska) i SM ID 2 kromogenu podlogu za salmonele (bio Mérieux, Francuska). Podloge su potom inkubirane na 37 ºC u periodu od 24 sata. Nakon pregleda ploča sumnjive kolonije (najmanje četiri do pet) porasle na čvrstim hranjivim podlogama, precijepljene su na trostruki šećerni agar sa željezom (TSI agar, Triple sugar iron agar, bioMérieux, Francuska) i inkubirane na 37 ºC ± 1 ºC kroz 24 ± 3 sata. Za biokemijsku identifikaciju salmonela korišteni su API biokemijski nizovi ID 32E, bioMérieux, Francuska, a za serološku tipizaciju polivalentni i monova-lentni antiserumi (Imunološki zavod Zagreb). Aglutinacijom na predmetnom stakalcu potvrđena je pripadnost bakterija rodu Salmonella. Serovar salmonela određen je prema antigenskim formulama serovarova (Popoff i Minor, 1997.).

Od svakog izmeta odvagano je 25 g i nacijepljeno u 225 mL puferirane peptonske vode (BPW- Buffered Peptone Water, bioMérieux, Francuska) te inkubirano na 37 ºC ± 1 ºC kroz 18 ± 2 sata. Nakon prednamnažanja na puferiranoj pepton-skoj vodi, uzorci izmeta precijepljeni su na modificiranu po-lumeku Rappaport Vassiliadis podlogu (MSRV – Modifed Semi-solid Rappaport Vassiliadis, Bio – Rad, Francuska) na način da se sadržaj nacijepljene peptonske vode inokulirao na podlogu na tri mjesta (3 kapi) u količini od 0,1 mL (100 μL). Tako nacijepljene Petrijeve ploče inkubirane su pri 41,5 ºC ± 1 ºC kroz 24 ± 3 sata. U slučaju negativnog nalaza na MSRV podlozi nakon inkubacije od 24 ± 3 sata (odutnost zone migracije) inkubacija se produžila još 24 ± 3 sata. Nakon inkubacije s MSRV podloge u području prisutnosti zone migracije, koristeći mikrobiološku ušicu volumena 10 μL, skupio se rast izbjegavajući mjesto inokulacije i precijepio na XLD i SM ID 2 kromogenu podlogu te inku-birao na 37 ºC. Biokemijska i serološka identifikacija obav-ljene su kao što je prethodno opisano.

Rasprava i zaključci

Učestalost salmonela u pretraženim konzumnim i rasplod-nim jajima te uzorcima izmeta konzumnih i rasplodnih nesi-lica, prikazana je u Tablicama 1 i 2. Na osnovi rezultata nalaza salmonela u konzumnim i rasplodnim jajima te uzor-cima izmeta konzumnih i rasplodnih nesilica u laboratoriju za bakteriologiju Centra za peradarstvo tijekom 2007. i 2008. godine, može se zaključiti da je Salmonella Enteritidis bio dominantan serovar. Takve nalaze potvrđuju i izvješća brojnih autora iz drugih zemalja (Cowden i sur., 1995.; De Louvois, 1997.; Imberechts i Dierick, 2004., Maciorowski i sur., 2004., Little i sur. 2007.; De Reu i sur. 2008.). Iz pretraženih uzoraka u 2007. godini ukupno su izdvojene 92 salmonele. Serovar S. Enteritidis dokazan je u konzumnim jajima u 47 slučajeva (1,02%), S.Infantis u 4 slučaja (0,08%), a ostale salmonele u 21 slučaju (0,45%). U ras-plodnim jajima također je prevladavao serovar S.Enteritidis i to u 7 slučaja (0,29%), a ostale salmonele izdvojene su u samo 2 slučaja (0,08%). U pretraženim uzorcima izmeta konzumnih nesilica nije dokazana niti jedna salmonela. Iz uzoraka izmeta rasplodnih nesilica izdvojeno je 11 bakterija S. Enteritidis. U 2008. godini iz pretraženih uzoraka izdvojeno je 66 salmonela. Najčešće izdvojeni serovar salmonela u uzorcima konzumnih jaja (19 slučajeva – 0,44%) i u uzorcima izmeta konzumnih nesilica (15 slučajeva – 1,07%) bio je S. Enteritidis. Iste godine iz uzoraka rasplodnih jaja nije izdvo-jena niti jedna bakterija S. Enteritidis, dok su u 13 slučajeva izdvojene ostale salmonele. Iz uzoraka izmeta rasplodnih nesilica izdvojena je samo jedna bakterija S. Enteritidis, a u četiri slučaja ostale. Na osnovi rezultata vidljivo je da se ukupan broj izdvojene S. Enteritidis i u konzumnih i u rasplodnih nesilica u 2008. godini smanjio u odnosu na 2007. godinu. Razlog ovakvim rezultatima smanjenog broja izdvojenih salmonela vjerojatno su stroge mjere kontrole kao i sve bolja implementacija dobre proizvođačke prakse.


Rezultati

Tablica 1. Prikaz izdvojenih bakterija roda Salmonella iz konzumnih i rasplodnih jaja te uzoraka izmeta konzumnih i rasplodnih nesilica u 2007. godini

Table 1. Displaying selected bacteria from the genus Salmonella from table and breeding eggs, and samples of feces laying and breeding hens in the year 2007

2007.

Konzumna jaja / Table eggs

Pozitivno / Pretraženo Positive / Tested

(%)

Rasplodna jaja / Breeding eggs


(%)

Uzorci izmeta konzumnih nesilica / Samples of feces

layinf hans Pozitivno / Pretraženo

Positive / Tested (%)

Uzorci izmeta rasplodnih nesilica / Samples of feces

breeding hans Pozitivno /Pretraženo


S. Enteritidis 47 / 4578 (1,02)

7 / 2377 (0,29)

0 / 448 (0)

11 / 2162 (0,5)

S. Typhimurium 0 / 4578 (0)

0 / 2377 (0)

0 / 448 (0)

0 / 2162 (0)

S. Virchow 0 / 4578 (0)

0 / 2377 (0)

0 / 448 (0)

0 / 2162 (0)

S. Infantis 4 / 4578 (0,08)

0 / 2377 (0)

0 / 448 (0)

0 / 2162 (0)

S. Hadar 0 /4578 (0)

0 / 2377 (0)

0 / 448 (0)

0 / 2162 (0)

Ostale 21 / 4578 (0,45)

2 / 2377 (0,08)

0 / 448 (0)

0 / 2162 (0)

Ukupno pozitivnih / Total positive

72 / 4578 (1,57)

9 / 2377 (0,37)

0 / 448 (0)

11 / 2162 (0,50)

Tablica 2. Prikaz izdvojenih bakterija roda Salmonella iz konzumnih i rasplodnih jaja te uzoraka izmeta konzumnih i

rasplodnih nesilica u 2008. godini Table 2. Displaying selected bacteria from the genus Salmonella from table and breeding eggs, and samples of feces laying and

breeding hens in the year 2008

2008.

Konzumna jaja / Table eggs


(%)

Rasplodna jaja / Breeding eggs


(%)

Uzorci izmeta konzumnih nesilica / Samples of feces

layinf hans Pozitivno / Pretraženo


Uzorci izmeta rasplodnih nesilica / Samples of feces

breeding hans Pozitivno / Pretraženo


S. Enteritidis 19 / 4249 (0,44)

0 / 2220 (0)

15 / 1395 (1,07)

1 / 1871 (0,05)

S. Typhimurium 0 / 4249 (0)

0 / 2220 (0)

0 / 1395 (0)

0 / 1871 (0)

S. Virchow 0 / 4249 (0)

0 / 2220 (0)

0 / 1395 (0)

0 / 1871 (0)

S. Infantis 0 / 4249 (0)

0 / 2220 (0)

0 / 1395 (0)

0 / 1871 (0)

S. Hadar 0 / 4249 (0)

0 / 2220 (0)

0 / 1395 (0)

0 / 1871 (0)

Ostale 14 / 4249 (0,32)

13 / 2220 (0,58)

0 / 1395 (0)

4 / 1871 (0,21)

Ukupno pozitivnih / Total positive

33 / 4249 (0,77)

13 / 2220 (0,58)

15 / 1395 (1,07)

5 / 1871 (0,26)


Nalaz serovara S. Infantis i ostalih salmonela u sadržaju jaja može se objasniti njihovim prodorom s onečišćene površine jaja kroz ljusku nakon leženja. O ovakvom, horizontalnom širenju infekcije, izvješćuju Messens i sur. (2007.) i De Reu i sur. (2006. a; 2006. b). Gantois i sur. (2008.) su na temelju rezultata istraživanja onečišćenja sadržaja jaja serovarovima S.Enteritidis, S.Typhimurium, S.Heidelberg, S.Virchow i S.Hadar zaključili da S. Enteritidis i S.Typhimurium imaju bolje sposobnosti kolonizacije reproduktivnog sustava od ostalih spomenutih serovarova kao i da u slučaju prirodne infekcije, kod koje je količina bakterija u jajima mala, serovarovi S.Hadar i S.Virchow bivaju uništeni prije stvaranja jaja. Ovakvi rezultati istraživanja razlog su što serovarovi S.Virchow i S.Hadar gotovo nikad nisu izdvajani iz neoštećenih jaja. Istraživanja Lublina i Selea (2008.) pokazala su da S.Virchow može perzistirati u jajima 6 tjedana na temperaturi od 6 ºC dok CFU S. Enteritidis u uvjetima pohrane na 6 ºC ostaje isti kroz 8 tjedana uz blago povećanje CFU u prva dva tjedna pohrane. Zaključno se može reći da se serovar S. Virchow kao i S. Enteritidis može u velikom broju namnožiti u konzumnim jajima pohra-njenim na sobnoj temperaturi. Na temperaturi hladnjaka S. Virchow može preživjeti i do 6 tjedana poslije čega njena koncentracija opada ispod nivoa otkrivanja.

Literatura

Barrow, P. A., G. C. Mead, C. Wray., M. Duchet-Suchaux (2003.):Control of food-poisoning salmonella in poultry-biological options. World΄s Poult. Sci.J. 59, 373 - 383.

Barrow, P. A.(2007.): Salmonella infections: immnune and non-imune protection with vaccines. Avian Pathol. (36), 1 - 13.

Baumler, A. J., B. M. Hargis, R. M. Tsolis (2000.): Tracing the origins of Salmonella outbreaks. Science 287, 50 - 52.

Cowden, J. M., P. G. Wall, G. Adak, H. Evans, S. Le Baigue, D. Ross (1995.): Outbreaks of foodborne infections intestinal in England and Wales. 1992-1993. Comunicable Dis. Rep. 5, 109 - 117.

Davies, R. H., C. Wray (1994.): Salmonella pollution in poultry units and associated enterprise. In: Pollution in Livestock Production System (Dewi, A., R.Axford, F. M. Marai) (Eds).CAB International, Wallingford, UK, 137 - 165.

Davies, R. H., M. Breslin (2003.): Persistence of Salmonella Enteritidis phage type 4 in the environmental and arthropod vector on an empty free-range chicken farm. Environmental Microbiology, 5, 79 -84.

De Louvois, J. (1997.): Report of study into Salmonella contamination of UK produced retail eggs 1995/1996. Cit. Saeed, A.M. (Ed) Salmonella Enteritidis Serovar Enteritidis in Humans and Animals, Epidemiology of Salmonella enterica Serova

De Reu, K., K. Grijspeerdt, M. Heyndrickx, W. Messens, M. Uyttendawle, J. Debevere, L. Herman (2006. a): Influenceof eggshell condensation on eggshell penetration and whole egg contamination with Salmonella enterica serovar Enteritidis. J. Food Protec. 69, 1539 -1545.

De Reu, K., K. Grijspeerdt, W. Messens, M. Heyndrickx, M. Uyttendawle, J. Debevere, L. Herman (2006. b): Eggshell factors influencing eggshell penetration and whole egg

contamination by different bacteria, including Salmonella Enteritidis. Int. J.Food Microbiol.112, 253 - 260.

De Reu, K., W. Messens, M. Heyndrickx, T. B. Rodenburg, M. Uyttendaele, L. Herman (2008.): Bacterial contamination of table eggs and the influence of housing systems. World΄s Poult. Sci. J.64, 5 - 19.

EC (2005.): Commission Regulation (EC) No 1003/2005 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community terget for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in breeding flocks of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 2160/2003. Official Journal of the European Union L 170, 12 - 17.

EC (2006. a): Commission Regulation (EC) No 1168/2006 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community terget for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in laying hens of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 1005/2005. Official Journal of the European Union L 211, 4 - 8.

EC (2006. b): Commission Regulation (EC) No 1177/2006 of 1 August implementing Regulation (EC) No 2160/2003 of the European Parliament and of the Council as regards requirements for the use of specific control methods in the framework of the national programs for the control of Salmonella in poultry. Official Journal of the European Union L 212, 3 - 5.

EFSA (2009.): The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses Agent in the European Union in 2007, The EFSA Journal (2009.), 223.

Gantois, I., V. Eeckhaut, F. Pasmans, F. Haesebrouck, R. Ducatelle, F. van Immerseel (2008.): A comparative study on the pathogenesis of egg contamination by different serotypes of Salmonella. Avian Pathol. 37 (4), 399 - 406.

Hafez, H. M. (2005.): Govemental regulations and concept behind eradication and control of some important poultry diseases. World΄s Poult. Sci.J. 61, 569 - 581.

Hafez, H. M. (2008.): European perspective on the control and eradication of some poultry diseases. 1st Mediterranean Summit of WPSA, Porto Carras, Chalkidiki, Greece, 07. - 10. May 2008, Book of proceedings, pp 62 - 72.

Henzler, D. J., H. M. Opitz (1992.): The role of mice in the epizootiology of Salmonella Enteritidis infection on chicken layer farms. Avian Dis.36, 625 - 631.

HRN EN ISO 6579:2003. Mikrobiologija hrane i stočne hrane - Horizontalna metoda za otkrivanje Salmonella spp.

Imberechts, H., K. Dierick (2004.): Report on zoonotic agents in Belgium in 2002, 65.Veterinary and Agrochemical Research Centre-Scientific Institute of Public Health.

ISO 6579: 2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal methods for the detection of Salmonella spp. Amendment 1:Annex D: DEtection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage.

Little, C. L., S. Surman-Lee, M. Greenwood, F. J. Bolton, R. Elson, R. T. Mitchell, G. N. Nichols, S. K. Sagoo, E. J. Threlfall, L. R. Ward, I. A. Gillespie, S. O´Brien (2007.): Public health investigation of Salmonella Enteritidis in catering raw shell eggs, 2002 -2004. Lett. Appl. Microbiol. 44, 595 - 601.

Lublin, A., S. Sela (2008.): The Impact of Temperature During The Storage of Table Eggs on the Viability of Salmonella enterica Serovars Enteritidis and Virchow in the Eggs. Poult. Sci. 87,2208 - 2214.


Maciorowski, K. G., F. T. Jones, S. D. Pillai, S. C. Ricke (2004.): Incidence, sources, and control food-borne Salmonella spp. in poultry feeds. World΄s Poult. Sci. J. 60, 446 - 457.

Messens, W., K. Grijspeerdt, K. De Reu, B. De Ketelaere, K. Mertens, F. Bamelis, B.Kemps, J. De Baerdemaeker, E. Decuypere, L. Herman (2007.): Eggshell penetration of various type of hen´s eggs by Salmonella enterica serovar Enteritidis. J.Food Protect. 70, 623 -628.

Popoff, M. Y., L. le Minor (1997.): WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur, Paris, 1 - 151.

Rabsch, W., H. Tschape, A. J. Baumler (2000.): Non-typhoidal salmonellosis: Emerging problems. Microbes Infect.3, 237 - 247.

Skov, M. N., A. G. Spencer, B. Hald, L. Petersen, B. Nauerby, B. Carstensen, M. Madsen (2004.): The role of letter beetles as potencial reservoir for Salmonella enterica and thermophilic Campylobacter spp. between broilers flock. Avian Diseases, 48,9 - 18.

Sokolović, M., F. Krstulović, B. Šimpraga (2006.): Mikrobiološka ispravnost hrane za perad. Krmiva 48, 357 - 362.

SALMONELLA IN EGGS AND FAECES OF POULTRY DURING THE YEARS 2007 AND 2008

Summary

During the years 2007 and 2008 in the Laboratory for Bacteriology of the Center for Poultry, a total of 45.183 samples have been examined (8827 samples of consumable eggs, 4597 samples of breeding eggs, 1843 faeces samples of consumable egg layers and 4033 faeces samples of breeding egg layers) for the presence of bacteria from the species of Salmonella. In the year 2007, 92 salmonellae and in the year 2008, 66 salmonellae were isolated. The most common isolated serovar in all examined samples was Salmonella Enteritidis. Serovars Salmonella Typhimurium, S. Virchow i S. Hadar were not isolated from any samples. Serovar S. Infantis was isolated from four samples of consumable eggs. The isolation and identification of salmonella from eggs and faeces were done according to the rules of standard methods (HRN EN 6579: 2003, ISO 6579: 2007. Amendment 1: Annex D). The biochemical characterisation from the isolated salmonella was done by the usage of API ID 32E identification row for enterobacteria. The determination to the serovar is defined by serological typisation with polyvalent and monovalent antiserums for single salmonella antigens. Key words: salmonella, consumption, breeding, eggs, faeces


ZNAČAJ NALAZA BAKTERIJA IZ RODA SALMONELLA I DRUGIH POTENCIJALNO PATOGENIH BAKTERIJA U HRANI ZA ŽIVOTINJE

Marijana Sokolović, Borka Šimpraga, Fani Krstulović


Sažetak

Hrana za životinje i sastojci hrane za životinje primarni su izvor zdravlja i dobrobiti životinja. Onečišćenje hrane za životinje zbog prisutnost različitih patogenih bakterija (bakterije iz rodova Salmonella, Clostridium, E. coli, Staphylococcus i dr.) može u konačnici utjecati i na kvalitetu hrane za ljude. Patogeni mikroorganizmi svojim sposobnostima prilagođavanja različitim uvjetima okoliša te širenjem u odgovarajućem domaćinu utječu nepovoljno ne samo na zdravlje ljudi i životinja, već mogu uzrokovati značajne ekonomske gubitke u uzgoju životinja. Brojni su čimbenici koji mogu dovesti do onečišćenja sirovina i hrane za životinje. S ciljem sprečavanja i smanjenja bakteriološkog onečišćenja hrane, primjenjuju se različiti postupci kao što su toplinska obrada i kemijsko tretiranje hrane. Navedeni postupci mogu biti uspješni uz redovitu mikrobiološku kontrolu u pojedinim fazama pripreme i korištenja uzoraka hrane te primjene principa HACCP-a i dobre proizvođačke prakse. Redovita mikrobiološka kontrola u svim fazama proizvodnje hrane za životinje i ljude, kao i u uzgoju životinja, omogućiti će i epidemiološku procjenu odnosa između kvalitete hrane za životinje i rizika koju takva hrana ima za zdravlje ljudi. Ključne riječi: mikrobiološka ispravnost, hrana za životinje, Salmonella Uvod

Hrana za životinje jedna je od prvih stavki hranidbenog lanca koja može direktno utjecati na kvalitetu proizvoda ani-malnog podrijetla namijenjenih za prehranu ljudi. Upravo zbog toga, bakteriološka kontaminacija hrane za životinje može predstavljati značajan problem i za javno zdravstvo. Kvaliteta hrane podrazumijeva ne samo odgovarajuća hra-nidbena, tehnološka i organoleptička svojstva, već također i mikrobiološku ispravnost hrane. Primarna važnost hrane je da zbog odgovarajućih prehrambenih vrijednosti osigura pravilan rast i razvoj životinja. Međutim, kontaminirana hrana (jer hrana je istodobno zbog svojih hranjivih sastojaka vrlo dobra podloga i za rast različitih mikroorganizama) često može biti uzrok ne samo zdravstvenih poremećaja, već i izvor bolesti. Gotove smjese za hranidbu životinja vrlo su često kontaminirane različitim patogenim bakterijama, prio-nima, metalima, mikotoksinima te različitim kemijskim agensima (polikloriarni bifenili, dioksini i furani), (Sapkota i sur., 2007.). Prisutnost različitih mikroorganizama prirodna je pojava kako u sirovinama tako i u smjesama za perad. Bakterije iz

roda Salmonella redovito su prisutne u proizvodnji peradi i vrlo često kontaminiraju jaja i meso peradi (FAO, 2001.). Hrana za perad važan je izvor tih bakterija, posebice mesno i riblje brašno. Prisutnost patogenih bakterija (Salmonella, E. coli, Pasteurella, Pseudomonas, Listeria, Clostridium i dr.) u hrani za životinje može rezultirati ili bolešću životinje (bu-dući da patogeni mikroorganizmi ulaze u organizam životi-nje ingestijom) ili prijenosom u proizvode namijenjene za prehranu ljudi. Posljedično, ti proizvodi mogu uzrokovati alimentarne zarazne bolesti ljudi, do kojih vrlo često dolazi konzumacijom upravo neispravnih proizvoda animalnog podrijetla.

Izvori bakteriološkog onečišćenja hrane

Krmiva za pripremu hrane za životinje mogu se kontamini-rati u svim fazama proizvodnje: prilikom uzgoja, žetve, ob-rade, pohrane, dostave u tvornicu stočne hrane i objekte za uzgoj životinja. Čimbenici koji mogu uzrokovati onečišće-nje hrane su brojni te uključuju direktan kontakt (tlo, glo-davci, divlje ptice, predatori, insekti, prašina), indirektan kontakt s okolinom (kontaminirana voda, kanalizacija, živo-

Dr. sc. Marijana Sokolović, dr. med. vet., Hrvatski veterinarski institut – Podružnica Centar za peradarstvo, Henizelova 55, 10 000 Zagreb, Hrvatska; tel: ++385 (0)1 2441 394; E-mail: [email protected]

ZNAČAJ NALAZA BAKTERIJA IZ RODA SALMONELLA I DRUGIH POTENCIJALNO PATOGENIH BAKTERIJA U HRANI ZA ŽIVOTINJE 173

tinjski feces koji se koristi za fertilizaciju usjeva) i kontakt s kontaminiranim sastojcima hrane (Maciorowski i sur., 2006.; Sapkota i sur., 2007.). Najčešće, kontaminacija hrane za životinje posljedica je korištenja pojedinih kontaminira-nih sastojaka hrane (biljnog ili animalnog podrijetla) koji se koriste u proizvodnji (Davies i Hinton, 2000.; Coma, 2003.; Davis i sur., 2003.; Davies i sur., 2004.; Plym i Wierup, 2006.; Mynt i sur., 2007.). Zbog proturječnih rezultata istraživanja o učestalosti kontaminacija pojedinih sirovina za proizvodnju hrane za životinje teško je procijeniti koje su sirovine najčešće onečišćene patogenim bakterijama, iako se smatra da su to sirovine koje služe kao izvor proteina u goto-vim smjesama za hranidbu životinja. Primjerice, McChes-ney i sur. (1995.) utvrdili su prisutnost bakterija iz roda Salmonella spp. u 56% od 101 ispitanog uzorka hrane proizvedenog od animalnog proteina te 36% od 50 ispitanih uzoraka hrane proizvedenih od biljnog proteina. Suprotno tome, Krytenburg i suradnici su 1998. godine utvrdili prisut-nost istih bakterija u svega 9.8% od 295 pretraženih uzoraka gotovih smjesa za prehranu stoke. Slične rezultate dobili su Hofacre i suradnici (2001.) koji su u uzorcima mesnog i koštanog brašna prikupljenih iz tvornica stočne hrane za perad, utvrdili prisutnost navedenih bakterija u 14% uzo-raka. Prema podacima Daviesa i Hintona (2000.) prisutnost salmonele utvrđena je 1997. godine u Velikoj Britaniji u samo 3.1% od 9 603 pretraženih uzoraka animalnih proteina, u 5.6% od 5 965 pretraženih uzoraka brašna od sjemena lana, soje i suncokreta, u 2.2% od 6 039 pretraženih uzorka hrane za svinje i perad. Slični rezultati utvrđeni su i za druge patogene bakterije (Davies i Hinton, 2000.; Sapkota i sur., 2007.). Općenito se smatra da su žitarice (pšenica, ječam, zob i kukuruz) vrlo rijetko kontaminirane salmonelama te da pozitivan nalaz najčešće upućuje na kontaminaciju nastalu pri direktnom i indirektnom kontaktu s okolinom. Ipak, nalaz salmonele u gotovoj hrani za životinje vrlo često je posljedica (više od 80%) kontaminiranih biljnih sastojaka (proizvodi od uljane repice, suncokreta, soje te pšenice (Mcllroy i sur., 1989.; Davies i Hinton, 2000.). Prilikom konzumacije kontaminirane hrane, životinje mogu pokazivati znakove bolesti, smanjenje produktivnosti, ali isto tako ne moraju pokazivati nikakve znakove bolesti (zbog kratkog životnog vijeka), iako se neki kemijski ili biološki faktori mogu akumulirati i prenositi u proizvode za prehranu ljudi (jaja i meso peradi), (Gareis i Wollf, 2000.). Glavni patogeni uzročnici, prisutni u hrani za perad, prven-stveno su bakterije iz roda Salmonella, zatim enterobak-terije, klostridije, stafilokoki, bacili te različite vrste plijesni. Međutim, najčešći problem predstavlja prisutnost salmonele u hrani za perad. Od posebnog su značaja multirezistentni fagotipovi poput S. typhimurium, S. enteritidis, i dr. Iako hrana za životinje direktno ne uzrokuje mikrobiološku kon-taminaciju proizvoda animalnog podrijetla, vrlo se često može utvrditi izravna veza između primjerice serotipova salmonele iz hrane za životinje i serotipova izdvojenih iz oboljelih životinja i ljudi (Davies i Hinton, 2000.; Crump i sur., 2002.; Hafez, 2004.; Foley i Lynne, 2007.; Sapkota i sur., 2007.).

U cilju osiguravanja mikrobiološki ispravne hrane, također je neophodno redovito analitičko testiranje reprezentativnih uzoraka hrane (ISO 6497, 2002.), postupanje prema pravi-lima HACCP-a te sustava dobre proizvođačke prakse. Tako-đer, nužno je i poduzimanje preventivnih mjera na samom početku proizvodnje – u proizvodnji hrane, odnosno u kontroli pri eventualnom sprečavanju uporabe mikrobiološki neispravnih sastojaka u proizvodnji hrane. Nedovoljan nad-zor nad proizvodnjom hrane za životinje onemogućava provedbu epidemioloških istraživanja i procjenu rizika koji bi omogućili određivanje značaja uporabe hrane za životinje u odnosu na zdravlje ljudi (Sapkota i sur., 2007.).

Postupci za sprečavanje i smanjenje bakteriološkog onečišćenja hrane za životinje Preventivne mjere koje se mogu primijeniti s ciljem spre-čavanja bakteriološkog onečišćenja hrane uključuju: sma-njenje rizika kontaminacije sirovina i nusproizvoda sirovina te fertilizirajućih tvari koje se koriste na njivama; smanjenje rizika kontaminacije tijekom transporta i pohrane sirovina; smanjenje kontaminacije u tvornicama stočne hrane te sma-njenje kontaminacije tijekom transporta i pohrane u objek-tima za uzgoj životinja (EFSA, 2008.). Primjena principa dobre proizvođačke prakse u proizvodnji hrane za životinje omogućuju ne samo smanjenje bakterijske kontaminacije tijekom nekoliko faza proizvodnje (Jones i Richardson, 2004.; FEFAC, 2007.; EFSA, 2008.), već i kontrolu potencijalnih unakrižnih kontaminacija (Morita i sur., 2006.; EFSA, 2008.). Pri pohrani sirovina, redovito dolazi do postepenog ugibanja mikroorganizama što znači da svježe sirovine redovito sadrže veći broj potencijalno patogenih mikroorganizama od sirovina koje su pohranjene određeni vremenski period (Davies i Hinton, 2000.; Ha i sur., 2007.). Osim toga, neke sirovine (kao što su primjerice brašna uljarica) koriste se direktno iz procesora pri čemu one mogu biti kontaminirane velikim brojem mikroorganizama. Prolazak sastojaka hrane kroz sustave za usitnjavanje, sita i miješalice hrane, mogu imati tek vrlo mali antibakterijski učinak koji se redovito očituje u razbijanju mikro--kolonija pričvršćenih za čestice hrane što smanjuje mogućnost pre-življavanja mikroorganizama. Nadalje, kako je većina konta-minacije sastojaka hrane poput žitarica upravo na površini, postupci obrade i čišćenja imaju vrlo mali učinak na sma-njenje bakterijskog onečišćenja te se redovito koriste i speci-fični postupci tretiranja hrane (Davies i Hinton, 2000.; EFSA, 2008.). Toplinsko tretiranje hrane najčešće se provodi kao dio procesa peletiranja pri proizvodnji kvalitetnih peleta, posebi-ce za proizvodnju hrane za odrasle preživače i svinje (EFSA, 2008.). Hrana za perad također je često u peletiranom obli-ku, osim za starije konzumne i rasplodne nesilice. Peletirana hrana ima svojih prednosti (povećan unos hrane, rast i kon-verzija hrane) i nedostataka (ulceracije želudca u svinja, disbakterioza, nekrotični enteritis i „proljev“ u peradi), (Vanderwal, 1979.; Sun i sur., 2006.; EFSA, 2008.). Uspješnost tretiranja hrane toplinom potvrđena je u brojnim istraživanjima u kojima je hrana bila umjetno kontaminirana


prvenstveno bakterijama iz roda Salmonella spp., ali i dru-gim patogenim uzročnicima iz rodova Campylobacter, Listeria, Eshcerichia (Ekperigin i sur., 1990.; Veldman i sur., 1995.; Doyle i Erickson, 2006.; EFSA, 2008.). Nešto slabiji rezultati postignuti su s prirodno kontaminiranim uzorcima (Williams, 1981.; EFSA, 2008.). Općenito se smatra da obrada i peletiranje pri 93 °C kroz 90 sekundi pri 15% vlage, smanjuje broj salmonela 10 000 puta (Himathongkham i sur., 1996.; EFSA, 2008.). Ipak, nave-dene vrijednosti često nisu primjenjive u praksi te se najčešće koriste niže temperature (najmanje 70 °C) uz duže trajanje tretiranja (Mcllroy i sur., 1989.; Veldman i sur., 1995.; Jones i Richardson, 2004.). Nedostaci ovog postupka uključuju povećanje ekonomskih troškova, promjenu kvali-tete peleta, promjenu sastava hranjivih tvari te veliku opa-snost ponovne kontaminacije budući da su prilikom po-stupka uništeni i ostali organizmi, odnosno potencijalni zaštitni elementi poput kvasaca (Williams, 1981.; Mattick i sur., 2001.). Također, postoji i mogućnost kondenzacije što olakšava kontaminaciju drugim mikroorganizmima (Davies i Wray, 1997.; Davies i sur., 2001.a, EFSA, 2008.). Kemijsko tretiranje hrane također se vrlo često koristi za tretiranje kontaminiranih uzoraka hrane. Pritom se koriste octena kiselina, propionska kiselina, limunska kiselina, eta-nol, formaldehid, mravlja kiselina, izopropilni alkohol, cin-kov acetat i cinkov propionat (Ha i sur., 1998.; Martin i Maris, 2005.; Van Immerseel i sur., 2002.; Skrivanova i sur., 2006.; EFSA, 2008.). Najbolji rezultati postižu se s masnim kiselinama srednjih dužina lanaca i kiselim solima cinka (Van Immerseel i sur., 2002.; Park i sur., 2003.; Skrivanova i sur., 2006.). Mehanizam djelovanja kiselina karakterizira promjena gradijenta pH i unutar-stanične regulacije pH te interferencija s ekspresijom gena odgovornih za virulentnost pojedinih bakterija (Cherrington i sur., 1990.; Cherrington i sur., 1991.; Van Immerseel i sur., 2006.; De Jonge i sur., 2003.; Greenacre i sur., 2006.; El-Sharoud i Niven, 2007.; EFSA 2008.). Međutim, utvrđen je i određeni stupanj prila-gođavanja bakterija na uvjete s niskim stupnjem pH što može smanjiti uspješnost navedenog postupka (Baik i sur., 1996.; De Jonge i sur., 2003.; Fratamico, 2003.; Theron i Lues, 2007., EFSA, 2008.). Općenito, kemijsko tretiranje poželjno je kao dobra alternativa toplinskom tretiranju, a vrlo često i sprečava ponovnu kontaminaciju. Osim toga, pojedine kombinacije kiselina imaju i povoljne učinke na zdravlje i proizvodnost životinja te se najčešće koriste pri dekontaminaciji hrane za, primjerice, kokoši nesilice kod kojih nije poželjno hranjenje hranom koja je tretirana toplinom ili peletirana (EFSA, 2008.). Ostali postupci tretiranja hrane uključuju zračenje, obradu hrane pod visokim tlakom i primjenu mikrovalova. Ovi su postupci pokazali dobre rezultate u smanjenju broja bakterija, ali zbog visokih ekonomskih troškova nisu primjenjivi u praksi (Leeson i Marcotte, 1993.; Wierup i sur., 1995.; Yuste i sur., 2000.; Lagunas-Solar i sur., 2005.; EFSA, 2008.).

Postupci hranjenja koji osiguravanju smanjenje bakterijskog onečišćenja: Pri hranjenju životinja također je utvrđeno da pojedini po-stupci povoljno djeluju na smanjenje broja bakterija, odno-sno na sprečavanje potencijalnog ulaska bakterija u orga-nizam životinja. Utvrđeno je da veličina čestica hrane za svinje utječe na morfološke karakteristike tankog crijeva i samim time se smanjuje stupanj adhezije salmonela za epi-telne stanice crijeva (Mikkelsen i sur., 2003.; Papenbrock i sur., 2005.; EFSA, 2008.). Dobri su rezultati u hranidbi svinja postignuti i uporabom hrane u tekućem obliku (Lo Fo Wong i sur., 2004.; Farzan i sur., 2006., EFSA, 2008.). Također je utvrđeno da primjena kalijevog diformata kao dodatka hrani ne samo da potiče rast životinja, već i sma-njuje izlučivanje bakterija putem fecesa u svinja (Windisch i sur., 2001.; Papenbrock i sur., 2005.; EFSA, 2008.). Kao preventivne mjere potrebno je osim poboljšanja u ob-radi, odabira odgovarajućih mikrobiološki ispravnih sirovina i uvjeta pohrane, koristiti i specifične dodatke hrane koji ograničavaju umnažanje, kolonizaciju i penetraciju bakterija poput salmonele u crijevima životinje. Većina pripravaka (prebiotici poput monosaharida, disaharida i polisaharida) svoj pozitivni učinak očituju tako što štetno djeluju (antago-nistički) na druge patogene mikroorganizme. Nadalje, kvas-ci, osim povoljnog učinka na proizvodnost životinja, imaju i probiotski učinak jer smanjujući pH probavnog sustava, smanjuju mogućnost razmnožavanja patogenih mikroorgani-zama poput salmonele u organizmu životinje (Diaz, 2002.). Prema zahtjevima Pravilnika o kakvoći stočne hrane, (čl. 71., NN 26/98), mikrobiološki ispravna hrana za životinje ne smije sadržavati patogene mikroorganizme, uključujući bakterije iz roda Salmonella, te bakterije Clostridium botu-linum, Clostridium perfrigens i Staphylococcus pyogenes u 50g ispitivanog uzorka. Pri mikrobiološkoj kontroli hrane također se često određuje i prisutnost drugih bakterija koja ukazuje na potencijalnu kontaminiranost fekalijama, kao i na opću mikrobiološku kvalitetu hrane za životinje. Smatra se da se navedene bakterije mogu koristiti kao indikatori mogu-ćeg onečišćenja patogenim bakterijama poput salmonele (Davies i Hinton, 2000.; EFSA, 2008.).

Zaključci

Do mikrobiološkog onečišćenja hrane za životinje redovito dolazi u neprikladnim uvjetima proizvodnje, prerade i skla-dištenja sirovina te gotovih smjesa. Navedeno ukazuje na potrebu redovite kontrole reprezentativnih uzoraka hrane, ali i na neophodna poboljšanja u proizvodnji, transportu i skla-dištenju hrane. Kontrola bakterioloških infekcija mora započeti osigura-vanjem bakteriološki ispravne hrane za životinje. Stoga je potrebno odabrati higijenski ispravnu sirovinu te primje-njivati principe dobre proizvođačke prakse u svim fazama proizvodnje, kontrolirati mikrobiološku ispravnost hrane, a u odgovarajućim slučajevima mogu se koristiti i različiti spe-cifični dodaci hrani koji sprečavaju razvoj bakterija.


Iz svega navedenog može se zaključiti da su mikrobiološki ispravna sirovina i dobra proizvođačka praksa temelj proiz-vodnje visoko kvalitetnih gotovih krmnih smjesa za hra-nidbu životinja. Upotrebom takvih smjesa postižu se bolji proizvodni rezultati, smanjuje se mogućnost pojave bolesti, a samim time i ekonomskih gubitaka u proizvodnji. Osim toga, sprečava se i mogućnost pojave štetnih mikroorgani-zama i/ili njihovih toksina u hrani za ljude.

Literatura

Baik, H. S., S. Bearson, S. Dunbar, J. W. Foster (1996.): The acid tolerance response of Salmonella Typhimurium provides protection against organic acids. Microbiology, 142:3195 - 200.

Cherrington, C. A., M. Hinton, I. Chopra (1990.): Effect of short-chain organic acids on macromolecular synthesis in Escherichia coli. J. Appl. Bacteriol., 68(1):69 - 74.

Cherrington, C. A., M. Hinton, G. R. Pearson, I. Chopra (1991.): Short-chain organic acids at pH 5.0 kill Esche-richia coli and Salmonella spp. without causing mem-brane perturbation. J. Appl. Bacteriol., 70(2):161-5.

Coma, J. (2003.): Salmonella control in pork: effect of ani-mal nutrition and feeding. Pig News Info., 24:49N–62N.

Crump, H. A., P. M. Griffin, F. J. Angulo (2002.): Bacterial Contamination of Animal Feed and Its Relationship to Human Foodborne Illness. CDC Food Safety, 10/2002, http://www.cdc.gov/enterics/publications/383_crump_2002.pdf, (05. 02. 2009.)

Davies, R., M. Breslin, J. E. Corry, W. Hudson, W., V. M. Allen (2001.a): Observations on the distribution and control of Salmonella species in two integrated broiler companies. Vet. Rec., 149(8):227 - 32.

Davies, R. H., C. Wray (1997): Distribution of Salmonella contamination in ten animal feedmills. Vet. Microbiol., 57(2-3):159 - 169.

Davies, P. R., H. Scott Hurd, J. A. Funk, P. J. Fedorka-Cray, F. T. Jones (2004.): The role of contaminated feed in the epidemiology and control of Salmonella enterica in pork production. Foodborne Pathog. Dis., 1(4):202 - 15.

Davies, R. H., M. H. Hinton (2000.): Salmonella in animal feed. U: „Salmonella in Domestic Animals. Ed. C. Wray, A. Wray, CABI Publishing International, New Yokr, USA.

Davis, M. A., D. D: Hancock, D. H. Rice, D. Call, R. DiGiacomo, M. Samadpour, T. E. Besser (2003.): Feedstuffs as a vehicle of cattle exposure to Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica. Vet. Microbiol., 95(3):199 - 210.

De Jonge, R., W. S. Ritmeester, F. M. van Leusden (2003.): Adaptive responses of Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 and other S. Typhimurium strains and Escherichia coli O157 to low pH environments. J. Appl. Microbiol., 94(4):625 - 32.

Diaz, G. J. (2002.): Evaluation of the Efficacy of a Feed Additive to Ameliorate the Toxic Effects of 4,15-

Diacetoxiscirpenol in Growing Chicks. Poult. Sci., 81:1492 - 1495.

Doyle, M. P., M. C. Erickson (2006.): Reducing the carriage of foodborne pathogens in livestock and poultry. Poult. Sci., 85:960 - 973.

EFSA (2008.): Microbiological risk assessment in feedingstuffs for food-producing animals. The EFSA Journal. 720:63-84. http://www.efsa.europa.eu/EFSA/ efsa_locale-1178620753812_ 1211902004131.htm (05. 02. 2009.)

Ekperigin, H. E., R. H. McCapes, R. Redus, W. L. Ritchie, W. J. Cameron, K. V. Nagaraja, S. Noll, (1990.): Micro-cidal effects of a new pelleting process. Poul. Sci., 69(9):1595 - 1598.

El-Sharoud, W. M., G. W. Niven (2007.): The influence of ribosome modulation factor on the survival of statio-nary-phase Escherichia coli during acid stress. Micro-biology 153:247 - 253.

Farzan, A., R. M. Friendship, C. E. Dewey, K. Warriner, C. Poppe, K. Klotins (2006.): Prevalence of Salmonella spp. on Canadian pig farms using liquid or dry-feeding. Prev. Vet. Med., 73(4):241 - 254.

FEFAC (Fédération Européenne des Fabricants d'Aliments Composés.), (2007.): European Feed Manufacturers Guide (EFMC) 01/2007, http://www.fefac.org/ /file.pdf?FileID=5255, (05. 02. 2009).

FAO (2001.): Joint FAO/WHO Expert Consultation on Risk Assessment of Microbiological Hazards in Foods: Risk characterization of Salmonella Spp. in eggs and broiler chickens and Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods. FAO Headquarters, Rome, Italy, 05/2001. http://www.fao.org/docrep/008/y1332e/y1332e00.htm#Contents (05. 02. 2009.).

Foley, S. L., A. M. Lynne (2007.): Food animal-associated Salmonella challenges: pathogenicity and antimicrobial resistance. J. Anim. Sci., 86(14):173 - 87.

Fratamico, P. M. (2003.): Tolerance to stress and ability of acid-adapted and non-acid-adapted Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 to invade and survive in mammalian cells in vitro. J. Food Prot., 66(7):1115 - 25.

Gareis, M., J. Wolff (2000.): Relevance of mycotoxin conta-minated feed for farm animals and carryover of myco-toxins to food of animal origin. Mycoses. 43:79 - 83.

Greenacre, E. J., S. Lucchini, J. C. Hinton, T. F. Brock-lehurst (2006.): The lactic acidinduced acid tolerance response in Salmonella enterica serovar Typhimurium induces sensitivity to hydrogen peroxide. Appl. Environ. Microbiol., 72(8):5623 - 5625.

Ha, S. D., K. G. Maciorowski, Y. M. Kwon, F. T. Jones, S. C. Ricke (1998.): Survivability of indigenous microflora and a Salmonella Typhimurium marker strain in poultry mash treated with buffered propionic acid. Anim. Feed Sci. Technol., 75(2):145 - 155.

Hafez, H. M. (2004.): European perspective on the control of some poultry diseases. Praxis Vet., 52:7 - 18.


Himathongkham, S., M. D. Gracas Pereira, H. Riemann (1996.): Heat destruction of Salmonella in poultry feed: effect of time, temperature, and moisture. Avian Dis., 40(1):72 - 77.

Hofacre, C. L., D. G. White, J. J. Maurer, C. Morales, C. Lobsinger, C. Hudson (2001.): Characterization of anti-biotic-resistant bacteria in rendered animal products. Avian Dis., 45(4):953 - 961.

ISO 6497 (2002.): Stočna hrana – Uzorkovanje (Animal Feedingstuff – Sampling, ISO 6497:2002.)

Jones, F. T., K. E. Richardson (2004.): Salmonella in com-mercially manufactured feeds. Poult. Sci., 83(3):384-91.

Krytenburg D. S., D. D. Hancock, D. H. Rice, Besser T. E., C. C. Gay, J. M. Gay (1998.): A pilot survey of Salmonella enterica contamination of cattle feeds in the Pacific northwestern USA. Anim. Feed Sci. Technol., 75:75 – 79.

Lagunas-Solar, M. C., N. X. Zeng, T. K. Essert, T. D. Truong, C. Piña, J. S. Cullor, W. L. Smith, R. Larraìn (2005.): Disinfection of fishmeal with radiofrequency heating for improved quality and energy efficiency. J. Sci. Food Agric., 85(13):2273 - 2280.

Leeson, S., M. Marcotte (1993.): Irradiation of poultry feed 1. Microbial status and bird response. World's Poultry Sci. J., 49(1):19 - 33.

Lo Fo Wong, D. M., J. Dahl, A. Wingstrand, P. J. van der Wolf, A. Von Altrock, B. M. Thorberg (2004.): A European longitudinal study in Salmonella sero-negative- and seropositive-classified finishing pig herds. Epidemiol. Infect., 132:903 - 914.

Maciorowski, K. G., P. Herrera, F. T. Jones, S. D. Pillai, S. C. Ricke (2006.): Cultural and immunological detection methods for Salmonella spp. in animal feeds - A review. Vet. Res. Commun., 30(2):127 - 137.

Martin, H., P. Maris (2005.): An assessment of the bac-tericidal and fungicidal efficacy of seventeen mineral and organic acids on bacterial and fungal food industry contaminants. Sci. Aliments, 25(2):105 - 127.

Mattick, K. L., F. Jorgensen, P. Wang, J. Pound, M. H. Vandeven, L. R. Ward, J. D. Legan, H. M. Lappin-Scott, T. J. Humphrey (2001.): Effect of challenge temperature and solute type on heat tolerance of Salmo-nella serovars at low water activity. Appl. Environ. Microbiol., 67(9):4128 - 4136.

McChesney, D. G., G. Kaplan, P. Gardner (1995.): FDA survey determines Salmonella contamination. Feed-stuffs: 20 - 23.

Mcllroy, S. G., R. M. McCracken, S. D. Neill, J. J. O'Brien (1989.): Control, prevention and eradication of Salmonella Enteritidis infection in broiler and broiler breeder flocks. Vet. Rec., 125(22):545 - 8.

Mikkelsen, L. L., P. J. Naughton, M. S. Hedemann, B. B. Jensen (2004.): Effects of physical properties of feed on microbial ecology and survival of Salmonella enterica serovar Typhimurium in the pig gastrointestinal tract. Appl. Environ. Microbiol., 70(6):3485 – 3492.

Morita, T., H. Kitazawa, T. Iida, S. Kamata (2006.): Pre-vention of Salmonella crosscontamination in an oilmeal manufacturing plant. J. Appl. Microbiol., 101(2):464-73

Myint, M. S., Y. J. Johnson, J. C. Paige, D. A. Bautista (2007.): A cross-sectional study of bacterial contami-nation in plant-protein feed from feed stores in Northern Virginia and Maryland. Anim. Feed Sci. Technol. 133(1-2):137 - 148.

Narodne novine (1998.): Pravilnik o kakvoći stočne hrane. NN 26/98.

Orriss, G. D. (1997.): Animal Diseases of Public Health Importance. Emerg. Infect. Dis. 3:497 -502.

Papenbrock, S., K. Stemme, G. Amtsberg, J. Verspohl, J. Kamphues (2005.): Investigations on prophylactic effects of coarse feed structure and/or potassium diformate on the microflora in the digestive tract of weaned piglets experimentally infected with Salmonella Derby. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr., 89(3-6):84 - 87.

Park, S. Y., S. G. Birkhold, L. F. Kubena, D. J. Nisbet, S. C. Ricke (2003.): Survival of a Salmonella Typhimurium poultry marker strain added as a dry inoculum to zinc and sodium organic acid amended feeds. J. Food Safety, 23(4):263 - 274.

Plym, L. F., M. Wierup (2006.): Salmonella contamination: a significant challenge to the global marketing of animal food products. Rev. Sci. Tech., 25(2):541 - 54.

Sapkota, A. R., L. Y. Lefferts, S. McKenzie, P. Walker (2007.): What do We Feed to Food-Production Ani-mals? A Review of Animal Feed Ingredients and Their Potential Impacts on Human Health. Environ. Health Persp., 115(5):663 - 670.

Skrivanova, E., M. Marounek, V. Benda, P. Brezina (2006.): Susceptibility of Escherichia coli, Salmonella sp. and Clostridium perfringens to organic acids and mono-laurin. Veterinarni Medicina, 51(3):81 - 88.

Sun, T., H. N. Laerke, H. Jorgensen (2006.): The effect of extrusion cooking of different starch sources on the in vitro and in vivo digestibility in growing pigs. Anim. Feed Sci. Technol., 131(1 - 2):66 -85.

Theron, M. M., J. F. R. Lues (2007.): Organic Acids and Meat Preservation: A Review. Food Rev. Internat., 23(2):141 - 158.

Van Immerseel, F., K. Cauwerts, L. A. Devriese, F. Haesebrouck, R. Ducatelle (2002.): Feed additives to control Salmonella in poultry. World's Poultry Sci. J., 58(4):501 - 513.

Van Immerseel, F., J. B. Russell, M. D. Flythe, I. Gantois, L. Timbermont, F. Pasmans, F. Haesebrouck, R. Ducatelle (2006.): The use of organic acids to combat Salmonella in poultry: a mechanistic explanation of the efficacy. Avian Pathol., 35(3):182 - 8.

Vanderwal, P. (1979.): Salmonella control of feedstuffs by pelleting or acid treatment. World's Poultry Sci. J., 35(2):70 - 78.


Veldman, A., H. A. Vahl, G. J. Borggreve, D. C. Fuller (1995.): A survey of the incidence of Salmonella species and Enterobacteriaceae in poultry feeds and feed components. Vet. Rec., 136(7):169 - 72.

Wierup, M., B. Engström, A. Engvall, H. Wahlström (1995.): Control of Salmonella enteritidis in Sweden. Int. J. Food. Microbiol., 25(3):219 - 226.

Williams, J. E. (1981.): Salmonellas in poultry feeds - a worldwide review. World's Poultry Sci. J., 37:6 - 105.

Windisch, W. M., G. G. Gotterbarm, F. X. Roth (2001.): Effect of potassium diformate in combination with different amounts and sources of excessive dietary copper on production performance in weaning piglets. Arch. Tierernaehr., 54:87 - 92.

Yuste, J., R. Pla, M. Mor-Mur (2000.): Salmonella Enteritidis and aerobic mesophiles in inoculated poultry sausages manufactured with high-pressure processing. Lett. Appl. Microbiol., 31(5):374 - 377.

SIGNIFICANCE OF ISOLATION OF SALMONELLA SPP. AND OTHER POTENTIALLY PATHOGENIC BACTERIA FROM ANIMAL FEED

Summary

Animal feedstuff and ingredients are the primary source of animal health and welfare. Contamination of animal feed with different pathogenic micro-organisms (bacteria from the genera Salmonella, Clostridium, E. coli, Staphylococcus etc.) may at the end of the food chain deteriorate the food quality intended for human use. Pathogenic micro-organisms have the ability to adapt to various environmental conditions and to live in adequate hosts causing diseases in humans and animals. In addition they cause significant economic costs in the production of animals. There are many factors that can cause microbiological contamination of ingredients and finished animal feed. In order to prevent and reduce bacteriological contamination of feedstuff, different measures including heat treatment and chemical treatment are applied. These procedures have proved to be successful, especially in combination with regular microbiological control in certain phases during the production and with application of principles of HACCP and good manufacture practices. Regular microbiological control in all phases of production of animal feed and in production of animals can contribute to an epidemiological evaluation of a potential correlation between the quality of animal feedstuff and potential risks which are posed to the human health. Key words: microbiological safety, feed, Salmonella


OSJETLJIVOST SOJEVA BAKTERIJE E. COLI IZDVOJENIH IZ TOVNIH PURANA NA ANTIBIOTIKE

Borka Šimpraga, Marijana Sokolović, Fani Krstulović


Sažetak

Ptičje kolibaciloze, uzrokovane sojevima ptičje patogene E. coli, predstavljaju jedan od najčešćih uzroka pobola, smrtnosti i velikih gospodarskih šteta u intenzivno uzgajanih tovnih purana nastalih zbog smanjene tjelesne težine, povećane konverzije hrane i troškova antibiotskog liječenja oboljelih životinja. Iako je bakterija E. coli normalno prisutna u organizmu životinje i njenom okolišu, izvjesni sojevi, tj. male podskupine ove bakterije, posjeduju specifične čimbenike virulencije i sposobni su uzrokovati pojavu bolesti. Uzorci stelje i prašine iz nastambe za tov purana te uzorci promijenjenih organa (jetra, slezena, dušnik, srce i pluća) životinja uginulih od kolibaciloze uzeti su za bakteriološku pretragu. Bakteriološkom pretragom uzoraka prašine, stelje i organa tovnih purana izdvojena su 43 soja bakterije E. coli. Svim izolatima bakterije E. coli određena je osjetljivost prema antibioticima in vitro standardnim disk-difuzijskim postupkom prema preporukama Nacionalnog odbora za kliničko bolničke standarde (NCCLS-a, 2003.) prema kojima su očitani i interpretirani rezultati testa. Za izvođenje testa rabljen je Müller Hintonov agar i standardni diskovi antibiotika natopljeni odgovarajućom koncentracijom antimikrobnog pripravka. Svi testirani sojevi pokazali su osjetljivost prema gentamicinu, većina sojeva pokazala je osjetljivost na trimetoprim-sulfametoksazol i na kloramfenikol (86,04% i 83,72%). Svi testirani sojevi pokazali su otpornost prema ampicilinu, piperacilinu i nalidiksičnoj kiselini. Ključne riječi: E. coli, tovni purani, antibiotici, osjetljivost, neosjetljivost Uvod Bakterija Escherichia coli (E. coli) prisutna je u fiziološkoj mikroflori na površini sluznice stražnjeg dijela probavnog sustava i okolišu peradi. Međutim, izvjesni sojevi, tj. male podskupine ove bakterije, posjeduju specifične čimbenike virulencije i mogu uzrokovati pojavu bolesti (Delicato i sur., 2003.). Podskupina patogenih ptičjih sojeva bakterije E. coli s malim brojem klonova (White i sur., 1993. a, 1993. b) uzrokuje prvenstveno infekcije dišnog sustava ili sistemske bolesti i odgovorna je za velike gospodarske štete u intenzivnoj peradarskoj proizvodnji (Gross, 1994.; Barnes i Gross, 1997.; Barnes i sur., 2003.; Ewers i sur., 2003.). U novije vrijeme, za karakterizaciju patogenih sojeva E. coli rabe se brojne molekularne metode. Određivanje otpornosti na antibiotike (engl. antimicrobial resistance typing) (Gomis i sur., 2001.; Van den Bogaard i sur., 2001.).

Patogeni serovarovi bakterije E. coli u peradi, prvenstveno O1, O2, O35 i O78:K80 uzrokuju bolest u purana i kokoši, a nešto rjeđe u gusaka, pataka i golubova (Barnes i Gross, 1997.; Dho-Moulin i Fairbrother, 1999.). Nekoliko sero-varova koji prije nisu bili povezivani s kolibacilozom – O18, O81, O88, O109, O115, O116 i O132, posljednjih su godina često izdvajani iz oboljelih životinja, a to govori o pojavi novih patogenih serovarova (Silveira i sur., 2002.; Barnes i sur., 2003.).Vertikalnim ili horizontalnim prijenosom pato-geni sojevi E. coli uzrokuju lokalizirane (infekcija žumanj-čane vrećice, celulitis, sindrom otečene glave, enteritis, spolnu septikemiju, salpingitis i peritonitis) i sistemske obli-ke kolibaciloze (koliseptikemija, crijevna koliseptikemija, neonatalna koliseptikemija, akutna septikemija kokoši i pura, koliformna septikemija pataka, produžena kolisepti-kemija, infekcija dišnog sustava, meningitis, panoftalmitis, sinovitis i osteomijelitis i koligranulomatoza). Posljedice tih oboljenja su povećana potrošnja hrane, smanjena tjelesna

Dr. sc. Borka Šimpraga, dr. vet. med., Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Heinzelova 55, 10 000 Zagreb, Hrvatska; tel.: ++385 (0) 1 2441-394; fax.:++385 (0) 1 2441-396; e-mail: [email protected]

OSJETLJIVOST SOJEVA BAKTERIJE E. COLI IZDVOJENIH IZ TOVNIH PURANA NA ANTIBIOTIKE 179

težina, pobol, uginuća te odbacivanje trupova peradi u klaonicama (Dozois i sur., 1994.; Pourbakhsh i sur., 1997.). Antibiotici su još uvijek temelj kontrole kolibaciloze u intenzivnoj puranskoj proizvodnji. Osim za liječenje, oni se rabe i kao promotori rasta u peradi pa otporni sojevi mogu nastati i u zdravim i u bolesnim životinjama (Piddock, 1996.). Kako je problem otpornosti prema antibioticima po-stao vrlo značajan svjetski problem, u humanoj i veterinar-skoj medicini smatra se da je prečesta i neodgovarajuća upo-raba antibiotika, osobito kao promotora rasta, najznačajniji uzrok nastanka, selekcije i širenja otpornih bakterija (Van den Bogaard i sur., 2001.). U novije vrijeme, za karak-terizaciju patogenih sojeva E. coli rabi se pored brojnih molekularnih metoda i metoda određivanja otpornosti na antibiotike (antimicrobial resistance typing), (Gomis i sur., 2001.; Van den Bogaard i sur., 2001.). Četiri su osnovna mehanizma nastanka otpornosti prema antibioticima: inakti-vacija enzimima ili modifikacija antibiotika, nepropusnost stanične stijenke ili membrane bakterije, izbacivanje antibio-tika iz stanice aktivnim transportom pomoću ATP-ovisne pumpe i promjena ciljnih receptora (Poole, 2004.; Tenover, 2006.). Najčešće primjenjivani antimikrobni lijekovi za liječenje za-raza uzrokovanih bakterijom E. coli u peradi su: tetraciklin-ski antibiotici, sulfonamidi i fluorokinoloni (Gross, 1994.). Rezultati istraživanja otpornosti sojeva E. coli ukazuju na činjenicu da ne postoji skupina antibiotika na koju APEC sojevi nisu razvili otpornost (Johnson i sur., 2003.; Yang i sur., 2004.; Khan i sur., 2005.; Miles i sur., 2006.). Budući da je u uzgajanih ptica proširena upotreba antibiotika za lije-čenje i preventivu infekcija patogenim bakterijama, dolazi do brzih mutacija bakterija u crijevima i selekcije otpornih sojeva (Mathew i sur., 2002.). Česta i neodgovarajuća primjena antibiotika u liječenju i kontroli kolibaciloze dove-la je do pojave velikog broja patogenih serovarova bakterije E. coli otpornih na dva ili više antibiotika (Allan i sur., 1993.; Amara i sur., 1995.; Blanco i sur., 1997. b.; Bass i sur., 1999.; Lambie i sur., 2000.; Lanz i sur., 2003.; Miles i sur., 2006.; Salehi i Bonab, 2006.).

Materijal i metode

Uzorci stelje i prašine iz nastambe za tov purana te uzorci promijenjenih organa (jetra, slezena, dušnik, srce i pluća) životinja uginulih od kolibaciloze uzeti su za bakteriološku pretragu. Svi izolati nacijepljeni su na MacConkey sorbitol agar (MacConkey sorbitol agar (Oxoid, Engleska) i na eozin-metilen plavi agar (eosin-methylene blue agar, bio-Merieux, Francuska) za preliminarno biokemijsko razliko-vanje. Za izdvajanje bakterije E. coli, 25 g stelje nacijepljeno je na 225 mL diferencijalne tekuće hranjive podloge MacConkey bujon (Mac Conkey broth, Oxoid, Engleska) i inkubirano tijekom 18 do 48 sati pri 37 °C. Nakon inkubacije, mikrobiološkom ušicom oko 10 μL bujonske kulture na MacConkey bujonu precijepljeno je na čvrste neselektivne podloge – Columbia (Columbia neutral agar, bioMếrieux, Francuska) ili TS neutralni (trypcase soy agar,

bioMeriux, Francuska) i krvni agar (Columbia agar sa dodatkom 5-10% defibrinirane ovčje krvi) te na selektivni MacConkeyev agar (MacConkey agar, bioMerieux, Francu-ska) za enterobakterije. Tako nacijepljene hranjive podloge inkubirane su tijekom 24 sata pri 37 °C. Uzorci prašine uzimani su aparatom MAS – 100 (Micro-biological air sampler for 90 mm standard Petri dishes, Merck, Njemačka) izravno na Petrijeve zdjelice s Columbia neutralnim i MacConkeyevim agarom u trajanju od 5 minuta. Petrijeve zdjelice su zatim inkubirane pri 37 °C tijekom 24 sata. Nakon opaljivanja površine svakog organa (9 slezena, 14 jetara, 3 dušnika, 2 srca i 12 pluća) prethodno opaljenom i ohlađenom špatulom, uzet je materijal iz dubine koji je nacijepljen na čvrste neselektivne i selektivne podloge – Columbia neutralni i krvni agar te na selektivni agar za enterobakterije (MacConkey agar). Tako nacijepljene hra-njive podloge inkubirane su tijekom 24 sata pri 37 °C. Po-stupak nakon primarnog izdvajanja i subkultivacije kolonija bio je isti onom opisanom pod točkom 4.6. Za biokemijsku karakterizaciju vrste E. coli rabljeni su API (Analytical Profile Index) nizovi za enerobakterije – API 20E s 20 biokemijskih testova i ID 32E nizovi sa 32 biokemijska testa za automatsku identifikaciju pomoću ATB identifikacijskog sustava (BioMérieux, Francuska). Svim izolatima bakterije E. coli određena je osjetljivost prema antibioticima in vitro standardnim disk-difuzijskim postupkom prema preporukama Nacionalnog odbora za kli-ničko bolničke standarde (NCCLS-a, 2003.) prema kojima su očitani i interpretirani rezultati testa. Za izvođenje testa rabljen je Müller Hintonov agar (Müller Hinton agar ATB, Merck, Njemačka) i standardni diskovi antibiotika natopljeni odgovarajućom koncentracijom antimikrobnog pripravka. Test osjetljivosti svakog soja proveden je dva puta, a kon-trola pouzdanosti provjerena je referentnim sojevima E. coli - ATCC 25922 i ATCC 35218. Osjetljivost sojeva pretražena je na sljedeće antibiotike: ampicilin (AM) 10 µg, amoksicilin (AMX) 25 µg, amoksicilin + klavulanska kiselina (AMC) 20 µg + 10 µg, piperacilin (PIP) 100 µg, karbenicilin (CB) 100 µg, cefoperazon (CEF) 75 µg, cefalotin (CF) 30 µg, cefotaksim (CTX) 30 µg, streptomicin (S) 10 µg, gentamicin (GM) 10 µg, neomicin (Neo) 30 µg, kloramfenikol (C) 30 µg, oksitetraciklin (OTC) 30 µg, doksicilin (D) 30 µg, linkospektin (LS) 109 µg, trimetoprim-sulfametoksazol (SXT) 23.75 µg + 1.25 µg, nalidiksična ki-selina (NA) 30 µg, enrofloksacin (ENO) 5 µg, ciproflok-sacin (CIP) 5 µg, flubakin (UB) 30 µg, norfloksacin (NOR) 10 µg, nitrofurntoin (F/M) 300 µg, spektinomicin (SPT) 100 µg i ofloksacin (OFX) 5 µg. Svi diskovi bili su proizvodnje Becton Dickinson Microbiology Systems, SAD, osim linko-spektina koji je bio proizvodnje Oxoid, Engleska.

Rezultati

Iz jednog uzorka stelje i jednog uzorka prašine uzetih u dva-naestom tjednu tova, izdvojena su dva izolata bakterije E. coli. Nakon primarnog izdvajanja na osnovi morfoloških


osobina i karakterističnog rasta na diferencijalnim i selek-tivnim podlogama, obavljena je njihova subkultivacija te je biokemijskim testovima potvrđena pripadnost vrsti E. coli. Iz 3 uzorka tkiva dušnika, 12 uzoraka tkiva pluća, 2 uzorka tkiva srca, 14 uzoraka tkiva jetre i 9 uzoraka tkiva slezene (njih 41) 31 tovnog purana, kao i iz uzoraka stelje i prašine, izdvojena je bakterija E. coli. Postupak subkultivacije na diferencijalnim i selektivnim podlogama bio je isti kao i kod stelje i prašine. U Tablici 1 prikazani su rezultati određivanja osjetljivosti izdvojenih sojeva bakterije E. coli prema antibioticima. Svi sojevi bili su otporni na ampicilin, piperacilin i nalidiksičnu

kiselinu. Otpornost prema cefalotinu pokazalo je 37 sojeva (86,05%), oksitetraciklinu 32 soja (74,42%), a prema dok-sicilinu 28 sojeva (65,12%). Na karbenicilin i flubaktin otporna su bila 24 soja (55,81%), prema cefoperazonu i streptomicinu 19 sojeva (44,19%), na norfloksacin i spektinomicin 18 sojeva (41,86%), a njih 17 (39,53%) bilo je otporno prema enrofloksacinu, ciprofloksacinu i ofloksa-cinu. Otpornost na linkospektin pokazalo je 12 (27,91%), na neomicin 11 (25,59%) sojeva, dok je prema nitrofurantoinu bilo otporno 10 sojeva (23,26%). Prema cefotaksimu i tri-metoprim-sulfametoksazolu, otporna su bila 3 (6,98%), a prema kloramfenikolu 2 soja (4,65%).

Tablica 1. Osjetljivost izdvojenih sojeva bakterije E. coli prema antibioticima Table 1. Sensitivity selected strain of bacteria E. coli by antibiotics

Broj i postotak osjetljivih sojeva The number and percentage of

sensitive strain

Broj i postotak srednje osjetljivih sojeva The number and percentage of

medium-sensitive strain

Broj i postotak neosjetljivih sojeva The number and percentage

nonsensitive strain Antibiotik Antibiotic

Broj / Number % Broj / Number % Broj / Number %

ampicilin 0 0 0 0 43 100

amoksicilin 17 39,53 5 11,63 21 48,84

amoksicilin s klavulanskom kiselinom 23 53,49 20 46,51 0 0

piperacilin 0 0 0 0 43 100

karbenicilin 2 4,65 17 39,53 24 55,81

cefoperazon 18 14,86 6 13,95 19 44,19

cefalotin 0 0 6 13,95 37 86,05

cefotaksim 24 55,81 16 37,21 3 6,98

streptomicin 18 41,86 6 13,95 19 44,19

gentamicin 43 100 0 0 0 0

neomicin 20 46,51 12 27,91 11 25,59

kloramfenikol 36 83,72 5 11,63 2 4,65

oksitetraciklin 1 2,32 10 23,25 32 74,42

doksicilin 2 4,65 13 30,23 28 65,12

linkospektin 23 53,49 8 18,60 12 27,91

trimetoprim+sulfometoksazol 37 86,04 3 3,98 3 6,98

nalidiksična kiselina 0 0 0 0 43 100

enrofloksacin 22 51,16 4 9,30 17 39,53

ciprofloksacin 24 55,81 2 4,65 17 39,53

flubaktin 10 23,26 9 20,93 24 55,81

norfloksacin 24 55,81 1 2,36 18 41,86

nitrofurantoin 13 30,23 20 46,51 10 23,26

spektinomicin 17 39,53 8 18,60 18 41,86

ofloksacin 25 58,14 1 2,33 17 39,53


Srednju osjetljivost (46,51%) pokazalo je 20 sojeva prema amoksicilinu s klavulanskom kiselinom i nitrofurantoinu, 17 sojeva (39,53%) prema karbenicilinu, 16 (37,21%) prema cefotaksimu, 13 (30,23%) prema doksicilinu, 12 (27,91%) prema neomicinu, a 10 sojeva (23,25%) prema oksitetra-ciklinu. Prema flubaktinu srednje osjetljivo bilo je 9 sojeva (20,93%). Nadalje 8 sojeva (18,60%) pokazalo je srednju osjetljivost na linkospektin i spektinomicin, 6 sojeva (13,95%) na cefoperazon, cefalotin i streptomicin, dok je na amoksicilin i kloramfenikol srednje osjetljivo bilo 5 sojeva (11,63%). Zatim, 4 soja (9,30%) srednju osjetljivost poka-zala su prema enrofloksacinu, 3 (9,30%) prema trimetoprim-sulfametoksazolu, 2 (4,65%) na ciprofloksacin, a po 1 soj (2,36%) prema norfloksacinu i ofloksacinu. Svi sojevi, njih 43 (100%) bili su osjetljivi na gentamicin. Više od 50% sojeva pokazalo je osjetljivost prema sljedećim antibioticima: trimetoprim-sulfametoksazolu 37 (86,0%) sojeva, kloramfenikolu 36 (83,72%) sojeva, ofloksacinu njih 25 (58,14%), cefotaksimu, ciprofloksacinu i norfloksacinu 24 (55,81%), amoksicilinu s klavulanskom kiselinom i lin-kospektinu 23 soja (53,49%) te prema enrofloksacinu 22 (51,16%) soja. Nadalje, 20 sojeva (46,51%) pokazalo je osjetljivost na neomicin, a 18 sojeva (41,86%) bilo je osjetljivo na cefoperazon i streptomicin. Prema amoksicilinu i spektinomicinu osjetljivost je pokazalo 17 (39,53%) soje-va, na nitrofurantoin 13 (30,23%), a prema flubaktinu 10 sojeva (23,26%). Također, 2 soja (4,65%) osjetljiva su bila na karbenicilin i doksicilin, a 1 (2,32%) na oksitetraciklin.


U istraživanju osjetljivosti izdvojenih sojeva bakterije E. coli bilo je uključeno osam antibiotika iz skupine ß-laktama – 5 penicilinskih antibiotika (ampicilin, amoksicilin, amoksicilin s klavulanskom kiselinom, piperacilin i karbenicilin) i tri cefalosporinska antibiotika (cefoperazon, cefalotin i cefotak-sim), tri aminoglikozida (streptomicin, gentamicin i neomi-cin), jedan fenikolni antibiotik (kloramfenikol), dva tetraci-klina (oksitetracilkin i doksiciln), jedan linkozamid (linko-spektin), jedan sulfonamid (trimetoprim-sulfametoksazol), šest kinolona (nalidiksična kiselina, enrofloksacin, cipro-floksacin, flubaktin, norfloksacin i ofloksacin), jedan nitrofuran (nitrofurantoin) i jedan aminociklitolni antibiotik (spektinomicin). Prema postignutim rezultatima ispitivanja osjetljivosti, odnosno otpornosti izdvojenih sojeva prema antibioticima, kao jedne od metoda za karakterizaciju pato-gene vrste E. coli, dokazani su višestruko otporni sojevi što je u suglasju s istraživanjima drugih autora (Amara i sur., 1995.; Blanco i sur., 1997. a; Bass i sur., 1999.; Lambie i sur., 2000.; Salehi i Bonab, 2006.). Svi testirani sojevi pokazali su osjetljivost prema gentamicinu što je u skladu s rezultatima istraživanja koje se proveli Blanco i sur. (1997. a), Salmon i Wats (2000.), Lanz i sur. (2003.), Miles i sur. (2006.) te Salehi i Bonab (2006.). Nadalje, osim na gentamicin većina sojeva pokazala je osjetljivost na trimetoprim-sulfametoksazol i na kloram-fenikol (86,04% i 83,72%) pa se ovakvi rezultati istraživanja djelomično slažu s istraživanjima Salmona i Watsa (2000.)

po rezultatima osjetljivosti na trimetoprim-sulfametoksazol, Lanza i sur. (2003.) po postotku osjetljivosti sojeva na klo-ramfenikol, dok je na trimetoprim-sulfametoksazol otpor-nost pokazalo svega 11% sojeva. Dobiveni rezultati također su u skladu s rezultatima Milesove i sur. (2006.) koji su dokazali 88,2% sojeva osjetljivih na kloramfenikol. Među-tim, rezultati istraživanja nisu u skladu s rezultatima istra-živanja Amara i sur. (1995.) koji su utvrdili neosjetljivost sojeva, izdvojenih iz organa pilića uginulih od kolibaciloze, na kloramfenikol i trimetoprim-sulfametoksazol. Nisu su-kladni ni s rezultatima Blanca i sur. (1997. a) kod kojih je čak 63% sojeva bilo otporno na trimetoprim-sulfametoksa-zol te Whitea i sur. (2000.) koji su također uočili otpornost sojeva na trimetoprim-sulfametoksazol. Povećanu otpornost sojeva na trimetoprim-sulfametoksazol zapazili su i drugi autori, primjerice Labmie i sur. (2000.) i Altekruse i sur. (2002.). U istraživanjima Salehija i Bonaba (2006.) čak u 80% sojeva također je uočena otpornost na trimetoprim-sulfametoksazol, a u 67% na kloramfenikol. Od tri antibiotika iz skupine cefalosporina u našem istra-živanju na cefotaksim je bilo osjetljivo više od 50% sojeva (55,81%), dok je na preostala dva osjetljivost pokazalo samo 14,86% sojeva (cefoperazon), a nijedan soj nije bio osjetljiv na cefalotin. Ovakvi rezultati istraživanja djelomično su u suglasju s rezultatima Whitea i sur. (2000.) koji su neosjet-ljivost na cefalotin utvrdili samo u 6 od 29 (20,69%) sojeva otpornih na nalidiksičnu kiselinu. Potpuno oprečne rezultate u svojim su istraživanjima postigli Blanco i sur. (1997. a), Salmon i Watts (2000.), Lanz i sur. (2003.) te Salehi i Bonab (2006.). Spomenuti autori izvješćuju o 100 % ili vrlo visokoj osjetljivosti patogenih sojeva bakterije E. coli na cefalo-sporine. Osjetljivost na oksitetraciklin i doksicilin u istraživanju osjetljivosti utvrđena je samo u jednom, odnosno dva soja, dok su neosjetljiva bila 32 (74,42%), odnosno 28 (65,12%). Tako visoki postotak neosjetljivih patogenih sojeva vrste E. coli dokazali su i brojni drugi autori (Amara i sur., 1995.; Blanco i sur., 1997. a; Bass i sur., 1999.; White i sur., 2000.; Miles i sur., 2006.; Salehi i Bonab, 2006.). Više od polovice sojeva (53,49%) pokazalo je osjetljivost na linkospektin, dok prema podacima iz literature osjetljivost na ovaj antibiotik iz skupine linkozamida iznosi samo 15% (Salehi i Bonab, 2006.). Od ukupno šest kinolonskih antibiotika na već spomenutu nalidiksičnu kiselinu neosjetljivost su pokazala sva 43 soja, na flubaktin osjetljivo je bilo samo 10 sojeva (23,26%), na često rabljen enrofloksacin osjetljiva su bila 22 soja (51,16%), dok su 24 soja (55,81%) pokazala osjetljivost prema ciprofloksacinu i norfloksacinu. O sličnim rezultatima stjecanja otpornosti patogenih sojeva vrste E. coli na kinolonske antibiotike, u vrlo kratkom vremenskom razdob-lju od početka korištenja, u peradarskoj proizvodnji izvješ-ćuju i drugi autori (Blanco i sur., 1997. a; White i sur., 2000.; Lambie i sur., 2000.). Nitrofurantoin je pokazao djelovanje na samo 10 sojeva (23,26%), što je u suglasju s izvješćima Lambiea i sur. (2000.) i Salehija i Bonaba (2006.). Potpuno oprečne rezul-


tate osjetljivosti na nitrofurantoin opisali su u svojem članku Lanz i sur. (2003.). U istraživanjima spomenutih autora ni jedan soj nije bio otporan, a samo jedan je pokazao intermedijarnu osjetljivost na nitrofurantoin. Na spektinomicin osjetljivo je bilo 17 sojeva (39,53%), što se ne podudara s rezultatima Salmona i Wattsa (2000.) koji su djelovanje navedenog antibiotika opisali najučinkovitijim na patogene sojeve bakterije E. coli izdvojene iz purića. U istraživanju osjetljivosti intermedijarnu osjetljivost poka-zalo je najviše sojeva prema amoksicilinu s klavulanskom kiselinom i nitrofurantoinu, 17 na karbenicilin, 16 na cefo-taksim, 13 na doksicilin, 12 na neomicin, 10 na oksitetraci-klin, devet na flubaktin, njih osam na linkospektin i spekti-nomicin, šest na cefoperazon, cefalotin i na streptomicin, pet na amoksicilin i kloramfenikol, četiri na enrofloksacin, tri na trimetoprim-sulfametoksazol, dva na ciprofloksacin, jedan na norfloksacin i ofloksacin, a nijedan na ampicilin, pipera-cilin, gentamicin i nalidiksičnu kiselinu. Prema podacima u literaturi, osjetljivost bakterija prema antibioticima najčešće se procjenjuje kao osjetljivost i otpornost. Budući da su re-zultati intermedijarne osjetljivosti na određene antibiotike dokazani u uzastopnim ponavljanjima testova, isti su svrsta-ni u srednje osjetljive te se dobiveni rezultati ne mogu uspo-rediti s rezultatima drugih autora. Zaključno se može reći da je u istraživanju osjetljivosti 55,81% sojeva pokazalo više-struku otpornost na jedan ili više antibiotika jedne skupine. Svi sojevi ptičje patogene bakterije E. coli bili su osjetljivi na gentamicin, a otporni na ampicilin, piperacilin i nalidik-sičnu kiselinu.

Literatura

Allan, B. J., J. V. van den Hurk, A. A. Potter (1993.): Characteri-zation of Escherichia coli isolated from cases of avian coli-bacillosis. Can. J. Vet. Res. 57, 146 - 151.

Altekruse, S. F., F. Elvinger, C. Debroy, F. W. Pierson, J. D. Eifert, N. Sriranganathan (2002.): Pathogenic and fecal Escherichia coli strains from turkeys in a commercial operation. Avian Dis. 46, 562 - 569.

Amara, A., Z. Ziani, K. Bouzouba (1995.): Antibioresistance of Escherichia coli strains isolated in Morocco from chickens with colibacillosis. Vet. Microbiol. 43, 325 - 330.

Barnes, H. J., W. B. Gross (1997.): Colibacillosis. In: Diseases of Poultry, 10th ed. (B. W. Calnek, Ed.), Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, pp. 131 - 141.

Barnes, H. J., J. P. Vaillancourt, W. B. Gross (2003.): Colibacil-losis. In: Diseases of Poultry, 11th ed. (Y. M. Seif, Ed.), Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, pp 631 - 656.

Bass L., C. A. Liebert, M. D. Lee, A. O. Summers, D. G. White, S. G. Thayer, J. J. Maurer (1999.): Incidence and Characterization of Integrons, Genetic Elements Mediating Multiple-Drug Resistance, in Avian Escherichia coli. Antimicrob. Agents. Chemother. 43, 2925 - 2929.

Blanco, J. E., M. Blanco, A. Mora, J. Blanco (1997. a): Prevalence of bacterial resistance to quinolones and other antimicrobials among avian Escherichia coli strains isolated from septicemic and healthy chickens in Spain. J. Clin. Microbiol. 35, 2184 - 2185.

Blanco, J. E., M. Blanco, A. Mora, J. Blanco (1997. b): Production of toxins (enterotoxins, verotoxins and necrotoxins) and

colicins by Escherichia coli strains isolated from septicemic and healthy chickens: relationship with in vivo pathogenicity. J. Clin. Microbiol. 35, 2953 - 2957.

Delicato, E. R., B. G. de Brito, L. C. Gaziri, M. C. Vidotto (2003.): Virulence-associated genes in Escherichia coli isolates from poultry with colibacillosis. Vet. Microbiol. 94, 97 -103.

Dho-Moulin, M., J. M. Fairbrother (1999.): Avian pathogenic E. coli (APEC). Vet. Res. 30, 299 - 316.

Dozois, C. M., N. Chanteloup, M. Dho-Moulin, A. Brée, C. Desautels, J. M. Fairbrother (1994.): Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigen in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli. Avian Dis. 38, 231 -239.

Ewers, C., T. Janβen, L. H. Wieler (2003.): Aviare pathogene Escherichia coli (APEC). Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 116, 381 - 395.

Gomis, S. M., C. Riddell, A. A. Potter, B. J. Allan (2001.): Phenotypic and genotypic characterization of virulence factors of Escherichia coli isolated from broiler chickens with simultaneous occurrence of cellulitis and other colibacillosis lesions. Can. J. Vet. Res. 65, 1 - 6.

Gross, W. G. (1994.): Diseases due to Escherichia coli in poultry. In: Escherichia coli in Domestic animals and Humans. (Gyles, C. L., Ed.) CAB International, Wallingford. pp. 237 - 259.

Johnson, J. R., A. C. Murray, A. Gajewski, M. Sullivan, P. Snippes, M. A. Kuskowski, K. E. Smith (2003.): Isolation and mole-cular characterization of nalidixic acid-resistant extraintestinal pathogenic Escherichia coli from retail chicken products. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 2161 - 2168.

Khan, A. A., M. S. Nawaz, C. Summage West, S. A. Khan, J Lin (2005.): Isolation and Molecular of Fluoroquinolone-Resistant Escherichia coli from Poultry Litter. Poult. Sci. 84, 61 - 66.

Lambie, N. M. Ngeleka, G. Brown, J. Ryan (2000.): Retrospective study on Escherichia coli infection in broilers subjected to postmortem examination and antibiotic resistance of isolates in Trinidad. Avian Dis. 44, 155 - 160.

Lanz R., P. Kuhnert, P. Boerlin (2003.): Antimicrobial resistance and resistance gene determinants in clinical Escherichia coli from different animal species in Switzerland. Vet. Microbiol. 91, 73 - 84.

Mathew, A. G., F. Jackson, A. M. Saxton (2002.): Effects of antibiotic regiments on resistance of Escherichia coli and Salmonella serovar Typhimurium in swine. J. Swine Health Prod. 10, 7 - 13.

Miles T. D., W. Mclaughlin, P. D. Brown (2006.): Antimicrobial resistanec of Escherichia coli isolates from broiler chickens and humans. BMC Vet. Res. 2, 1 - 9.

National Committee For Clinical Laboratory Standards (2003.): Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved standard – 8th edition. NCCLS Document M2-A7, Pennsylvania.

Piddock, L. J. V. (1996.): Does the use of antimicrobial agents in veterinary medicine and animal husbandry select antibiotic-resistant bacteria that infect man and compromise anti-microbial chemotherapy? J. Antimicrob. Chemother. 38, 1 - 3.

Poole, K. (2004.): Efflux-mediated multiresistance in Gram- negative bacteria. Clin. Microbiol. Infect. 10, 12 - 26.

Pourbakhsh, S. A., M. Boulianne, B. Martineau-Doizė, J. M. Fair-brother (1997. b): Virulence mechanisms of avian fimbriated Escherichia coli in experimentally inoculated chickens. Vet. Microbiol. 58, 195 - 213.


Salehi T. Z., S. F. Bonab (2006.): Antibiotics susceptibility pattern of Escherichia coli strains from chickens with colisepticemia in Tabriz province, Iran. Int. J. Poult. Sci. 5, 677 - 684.

Salmon S. A., J. L. Watts (2000.): Minimum inhibitory concen-tration determinations for various antimicrobial agents 1570 bacterial isolates from turkey poults. Avian Dis. 44, 85 - 98.

Silveira, D. W., A. Ferreira, M. Brocchi, L. M. de Hollanda, A. F. P. de Castro, A. T. Yamada, M. Lancellotti (2002.): Biological characteristics and pathogenicity of avian Escherichia coli strains. Vet. Microbiol. 85, 47 - 53.

Tenover, F. C. (2006.): Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am. J. Med. 119, S3 - 10.

Van den Bogaard, A. E., N. London, C. Driessen, E. E. Stob-beringh (2001.): Antibiotic resistance of faecal Escherichia coli in poultry, poultry farmers and poultry.

White, D. G., M. Dho-Moulin, R. A. Wilson, T. S. Whittam (1993. a): Clonal relationships and variation in virulence among Escherichia coli strains of avian origin. Microb. Pathog. 14, 399 - 409.

White, D. G., R. A. Wilson, D. A. Emery, K. V. Nagaraja, T. S. Whittman (1993. b): Clonal diversity among strains of Escherichia coli incriminated in turkey colisepticemia. Vet. Microbiol. 34, 19 - 34.

White, D. G., L. J. Piddock, J. J. Maurer, S. Zhao, V. Ricci, S. G. Thayer (2000.): Characterization of fluoroquinolone resistanca among veterinary isolates of avian Escherichia coli Antimicrob. Agents Chemother. 2897 - 2899.

Yang, H., S. Chen, D. G. White, S. Zhao, P. Mcdermont, R. Walker, J. Meng (2004.): Characterization of multiple-antimicrobial-resistant Escherichia coli isolates from

ANTIBIOTIC SENSITIVITY OF E. COLI STRAINS FROM COMMERCIAL TURKEY FLOCKS

Abstract

Avian colibacillosis, caused by avian pathogenic E. coli strains, is one of the most frequent cause of morbidity, mortality and great economic losses in intensive turkey production. Economic losses are a result of decreased body weight, increased feed conversion ration and costs for antibiotic treatment of diseased animals. Although E. coli bacteria are ubiquitous in the animal organism and its environment certain strains, i.e. small subgroups of this bacterium, possess specific virulence factors and are capable to cause an onset of disease. Samples of dust and litter taken from a poultry house and samples of change organs (liver, spleen, trachea, heart and lung) of animals which died of colibacillosis were taken for bacteriological analysis. Bacteriological analysis were results of the samples, litter and organs from a comercial turkey flock with isolation of 43 E. coli strains. For all E.coli isolates antibiotic sensitivity was performed with standard disc diffusion procedure according to the recommendations of the National Committee on Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2003). For tests we used the Muller Hinton agar and standard discs of antibiotics with an adequate concentration of antimicrobial. All tested strains showed to be sensitive to gentamicin and most of the strains were sensitive to trimetophrim-sulphametoxasol and chlorophorm (86.04% and 83.72%). All tested strains were resistant to ampicillin, piperacillin and nalidixic acid. Key words: E. coli, commercial turkyes, antibiotics, sensitivity, resistance


POJAVNOST CAMPYLOBACTER SPP. U FECESU, BRISEVIMA S PILEĆIH TRUPOVA I OTPADNE VODE NA LINIJI KLANJA

Tihomir Zglavnik, Marijana Sokolović


Sažetak

U radu je prikazano istraživanje učestalosti bakterija iz roda Campylobacter spp. tijekom prosinca 2008. i siječnja 2009. godine u 10 jata tovnih pilića u trenutku privođenja klanju. Ispitani su uzorci briseva s pilećih trupova, izmeta i otpadne vode od ispiranja trupova na liniji klanja. Dobiveni rezultati ukazuju na različitu prisutnost bakterija; u izmetu su nađene u 80% slučajeva, u otpadnoj vodi na liniji klanja od ispiranja trupova u 85%, u brisevima nakon evisceracije u 72,5% te u brisevima nakon završnog pranja u kloriranoj vodi i hlađenja u rashladnoj komori jakom strujom zraka u 30% slučajeva. Navedene bakterije utvrđene su u uzorcima porijeklom iz svih ispitivanih jata pilića. Od izdvojenih sojeva bakterija Campylobacter spp. biokemijski je, pomoću API Campy testova (BioMerieux), identificirano 10 sojeva koji su pripadali vrstama C. jejuni jejuni 1 (1 soj), C. jejuni jejuni 2 (7 sojeva), C. coli (2 soja) te Campylobacter spp (2 soja). Budući da je procijenjeno da je točnost APi Campy testova 92% unutar prva 24 sata inkubacije, te 94% nakon daljnja 24 sata (Huysmans i sur., 1995.) te da test nije dovoljno precizan za određivanje podvrste, učestalost bakterija u dobivenim uzorcima procijenjena je na razini roda Campylobacter spp. Ključne riječi: Campylobacter, kontaminacija, pileći trupovi Uvod Infekcije bakterijama roda Campylobacter, posebice vrstom C. jejuni, su zbog sve većeg broja slučajeva oboljenja u ljudi značajan problem za javno zdravstvo. Najčešći izvor zaraze u ljudi predstavljaju meso peradi, svinja, ovaca i goveda, mlijeko, voda kao i kontakt s oboljelim ljudima i životinja (Clark i Bueschkens, 1985.; Havelaar i sur., 2007.; EFSA, 2009.). Zaraza se u ljudi očituje već nakon 1-7 dana in-kubacije simptomima proljeva, groznice, boli u trbuhu, vrto-glavice, glavobolje i bolova u mišićima. Bolest uobičajeno traje 7-10 dana, a u liječenju se koriste najčešće antibiotici iz skupine makrolida, koji mogu smanjiti prisutnost uzročnika bolesti u organizmu. Moguće komplikacije te zaraze u ljudi su meningitis, upala gušterače, septični artritis i teška dehi-dracija (FDA, 2001.; Conlan i sur., 2007.). Bakterije roda Campylobacter spp. kao uzročnike crijevnih zaraza u ljudi dokazala je Elizabeth King 1962. godine. Međutim, tek su Butzler i suradnici jedanaest godina kasnije utvrdili poveza-nost između kampilobakterioze u ljudi i konzumacije konta-miniranog mesa peradi (Skirrow, 1977.). Skirow (1977.) je potvrdio patogenost (prisutnost specifičnog enteritisa, izdva-

janje sojeva bakterije iz krvi te detekcija specifičnih antiti-jela u serumu oboljelih osoba) izdvojenih sojeva C. jejuni i C. coli iz stolice oboljelih pacijenata kao i mogućnost da je meso peradi izvor zaraze u ljudi. Bakterije roda Campylobacter su gram negativne, zavinute (zakrivljenog ili „S“ oblika), mikroaerofilne i termofilne, dugačke 0,5-5 µm te široke 0,2- do 0,8 µm. Smanjena temperatura, oksidativni stres i gladovanje u kombinaciji s ostalim čimbenicima iz okoliša mogu uzrokovati promjene u morfologiji (okrugli oblik), preživljavanju i vijabilnosti bakterijskih kultura (Klančnik i sur., 2008.). Bakterije mogu rasti na krvnom agaru i na selektivnim hranjivim podlogama (modificirane dodavanjem vankomicina, polimiksina B, tri-metoprima ili drugih antibiotika) u mikroaerofilnim uvje-tima (sa 5-10% kisika) kao prozirne, odnosno sivkaste okrugle plosnate kolonije nepravilnih rubova veličine 1-4 mm. Bakterije posjeduju jednopolarne ili bipolarne flagele koje im omogućuju „svrdlasto“ kretanje. Pokretljivost bakte-rija važna je za kolonizaciju mukozne površine probavnog sustava. Prema novijim istraživanjima flagele su odgovorne i za sekreciju neflagelarnih proteina značajnih za virulent-nost sojeva (Konkel i sur. 2001.; Hendrixson i DiRita. 2004.;

Tihomir Zglavnik, dr.vet.med., Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: ++385 (0) 1 2441-392, 2441-394; fax: ++385 (0) 1 2441-396

POJAVNOST CAMPYLOBACTER SPP. U FECESU, BRISEVIMA S PILEĆIH TRUPOVA I OTPADNE VODE NA LINIJI KLANJA 185

Guerry, 2007.). Termofilnost pojedinih sojeva bakterija roda Campylobacter (C. jejuni, C. coli, C. laris i C. upsaliensis) smatra se rezultatom prilagodbe na uvjete u probavnom sustavu toplokrvnih životinja (Vučković i sur., 2007.). Opti-malni uvjeti rasta bakterije na hranjivim podlogama uklju-čuju raspon temperature od 42-43 °C, iako većina sojeva može rasti i pri 37 °C. Pojedine bakterije roda Campylo-bacter mogu izlučivati enterotoksine i citotoksine (Wasse-naar, 1997.). Bakterije se mogu identificirati na temelju morfoloških karakteristika, biokemijskog profila, imunološ-kim i molekularnim metodama, serotipizacijom i testiranjem osjetljivosti prema antibioticima (Marshall i Warren, 1984.; Marshall, 1985.; Humphries i sur., 1986.; Abubakar i sur., 2007.). Bakterije roda Campylobacter uvjetno su patogene bakterije i normalno su prisutne u probavnom sustavu različitih vrsta toplokrvnih životinja, ptica i ljudi. Budući da im za rast pogoduje temperatura od 42-43 °C, probavni sustav peradi smatra se izrazito povoljnom okolinom (Newell i Fearnely, 2003.; Vučković i sur., 2007.). Bakterije se u jatima najčešće prenose horizontalnim putem od drugih životinja u jatu, a vektori mogu biti i divlje ptice, druge životinje na farmi, insekti, kontaminirana vodat te radnici na farmi (Adkin i sur., 2006.; Conlan i sur., 2007.). Osim toga, neki autori na-vode i mogućnost vertikalnog prijenosa bakterija s rasplod-nih kokoši na tovne piliće, koji predstavljaju potencijalni izvor širenja zaraze za ostale životinje u jatu. Ipak, navedeni prijenos se smatra rijetkim i upitno je preživljavanje sojeva u crijevima izleženih pilića zbog prisutnosti naslijeđenih antitijela (Clark i Bueschkens, 1985.; Newell i Fearnley, 2003.; Stern 2008.; Snelling i sur. 2005.; Cox i sur., 2006.). Veća učestalost bakterija uočena je u mlađih životinja (ali ne i u pilića u dobi do 2-3 tjedna) te u gusto naseljenim i u ekstenzivno držanim jatima (Van Overbeke i sur., 2006.; Conlan i sur., 2007.). Nadalje, pojavnost bakterija također ovisi o klimatskim prilikama, te je češća ljeti, pri višim temperaturama zraka (Nylen i sur., 2002.; Meldrum i sur., 2004.; Louis i sur., 2004.; Patrick i sur., 2004.). Čimbenici koji pogoduje preživljavanju bakterija u jatu su vlažnost zraka (Stern i sur., 2002.), klimatske prilike (više tem-perature objekta) (Guerin i sur., 2008.) te prisutnost insekata koja je najznačajnija u sistemima slobodnog držanja živo-tinja (Huneau-Salaün i sur., 2007.). Neodgovarajući uvjeti transporta te prijema u objekt također pogoduju širenju zaraze. Do naseljavanja bakterija u crijevima tovnih pilića najčešće dolazi od 2. do 5. tjedna starosti, pri čemu izlučivanje putem izmeta traje tjednima a da životinje ne pokazuju nikakve znakove bolesti (Waldenström i sur., 2002.). Do infekcije u jednodnevnih pilića bakterijama roda Campylobacter može doći ako je prisutno samo 40 CFU, iako je u prirodno inficiranih pilića infekciozna doza najčešće veća (Cawthraw i sur., 1996.). U slučaju infekcije bakterije se unutar jata vrlo brzo prenose oralnim putem i to hranom, koprofagijom te vodom za piće. U rijetkim slučajevima bakterije uz pomoć flagela prodiru kroz mucin do submukoze te izlučenim tok-sinima oštećuju stanice mijenjajući stanični polaritet u mu-kozi. Navedena oštećenja očituju se kao hemoragična ne-

kroza crijevnih resica uz pojačanu sekreciju, koja je klinički vidljiva kao vodenast do hemoragični proljev (Konkel i sur 2001.; Picket i sur., 1996.). Navedeno može uzrokovati značajne ekonomske štete zbog smanjenog prirasta, poja-čane konverzije hrane i produženja tova. Kod peradi starijeg uzrasta djelovanjem toksina, naročito hepatotoksina, može doći do pojave ptičjeg vibrijskog hepatitisa pri kojem patološko-anatomskom pretragom nalazimo difuzne nekroze uz subkapsularna krvarenja jetre. Kod kroničnih oboljenja dolazi do kronične degeneracije jetre i nakupljanja tekućine u perikardijalnoj i torakalnoj šupljini (Burch, 2005.). Osim navedenog utvrđena je i značajna ekonomska šteta zbog pada nesivosti do 35% i mortaliteta u matičnim jatima do 15% (Shane, 1997.). Cilj ovog istraživanja bio je odrediti učestalost bakterija roda Campylobacter spp. u jatima peradi prije klanja tijekom zimskih mjeseci, kao i procijeniti učinak postupaka obrade na liniji klanja u odnosu na moguće smanjenje broja bakterija.

Materijal i metode

Uzorkovanje Istraživanje je provedeno u novoizgrađenoj klaonici prve kategorije u prosincu 2008. godine i siječnju 2009. godine. Pritom je u 10 neovisnih uzorkovanja praćena pojavnost bakterija roda Campylobacter u deset jata tovnih pilića. Iz svakog jata sakupljena su dva uzorka izmeta na istovarnoj rampi iz transportnih kutija (ukupno 20 uzoraka), dva uzorka otpadne vode od ispiranja trupova na liniji klanja (ukupno 20 uzoraka po 250 ml), četrdeset briseva trupova nakon drugog ispiranja u kloriranoj vodi (ukupno 400 uzoraka) i deset briseva trupova na izlazu iz rashladnog tunela (ukupno 100 uzoraka). Brisevi su uzimani prema standardnoj metodi uzimanja uzoraka s trupova (ISO 17604:2003).

Izdvajanje bakterija Za izdvajanje bakterija korištene su standardne metode de-tekcije i brojenja kolonija Campylobacter spp u hrani i životinjskim proizvodima (ISO 10272-1:2006(E), ISO/TS 10272-2:2006(E)).

Postupak izdvajanja bakterija iz uzoraka izmeta tovnih pilića U po dva paralelna uzorka izmeta dodan je isti volumen puferirane peptonske vode. Uzorci su homogenizirani mije-šanjem u trajanju od pet minuta. Iz tako pripremljenih uzo-raka izmeta napravljene su odvage u količini od 10 g kojima je dodano 90 ml Boltonovog bujona (Oxoid, Engleska) koje su inkubirane u mikroaerofilnim uvjetima pri 37 °C u tra-janju od četiri sata. Zatim su uzorci inkubirani pri 42 °C daljnjih 40-48 sati. Nakon toga, sto mikrolitara uzorka ino-kulirano je na selektivne hranjive podloge Campylobacter blood-free selective medium (modificirani CCDA- Preston agar, Oxoid, Engleska) i na Campylobacter agar base (Karmali, Oxoid, Engleska). Tako nacijepljene ploče inku-birane su u mikroaerofilnim uvjetima pri 42 °C daljnjih 40-48 sati. Porasle sumnjive kolonije nacijepljene su na


krvni agar (Columbia agar uz dodatak 5% ovčje krvi) te inkubirane u mikroaerofilnim uvjetima pri 37 °C u trajanju od 24 sata.

Postupak izdvajanja bakterija iz uzoraka vode Sakupljeni uzorci otpadne vode od ispiranja trupova na liniji klanja su membranski filtrirani. U dobiveni filtrat dodano je 125 ml Boltonovog bujona (Oxoid, Engleska). Daljnji po-stupak izdvajanja odgovarao je prethodno opisanom postup-ku za uzorke izmeta.

Postupak izdvajanja bakterija iz uzoraka briseva Od sakupljenih uzoraka briseva deset ih je sačinjavalo skup-ni uzorak u koji je dodano 50 ml Boltonovog bujona. Daljnji postupak identičan je opisanom postupku za uzorke izmeta. Od svih sumnjivih kolonija bakterija napravljeni su raz-masci, obojeni po Gramu i karbol-fuksinom, te su naprav-ljeni testovi na oksidazu i katalazu.

Rezultati

Od pretraženih 20 uzoraka izmeta tovnih pilića prisutnost bakterija roda Campylobacter utvrđena je u 14 uzoraka. U otpadnoj vodi sa trupova na liniji klanja od pretraživanih 20 uzoraka utvrdili smo prisutnost bakterije u njih 17. Od 400

briseva trupova (40 skupnih uzoraka briseva) utvrđena je prisutnost bakterije u 29 skupnih uzoraka. U 100 briseva (10 skupnih uzoraka) trupova nakon hlađenja i ispiranja klori-ranom vodom te hlađenja u rashladnoj komori utvrđena je prisutnost bakterija u 3 pretražena skupna uzorka. Prilikom istraživanja nije utvrđen točan broj poraslih bakterija. Pripadnost bakterija rodu Campylobacter spp. određena je na temelju izgleda rasta kolonija na hranjivim agarima, re-zultata mikroskopkse pretrage te pozitivnih rezultata testova na oksidazu i katalazu. Od navedenih sojeva odabrano je 12 izdvojenih sojeva bakterija (porijeklom iz šest različitih jata peradi) te su određene biokemijske karakteristike pomoću API Campy testova (BioMerieux, Francuska). Prema dobi-venim rezultatima utvrđena je prisutnost bakterije C. jejuni jejuni 2 u 2 uzorka izmeta. U uzorcima otpadne vode od ispiranja trupova na liniji klanja utvrđeni su Campylobacter spp. i C. jejuni jejuni 1. U brisevima trupova nakon evi-sceracije utvrđeni su: 1 soj Campylobacter spp., 4 soja C. jejuni jejuni 2 te 1 soj C. coli. U brisevima trupova nakon hlađenja kloriranom vodom i rashladne komore identificiran je soj C. jejuni jejuni 2. Budući da navedeni test nije do-voljno specifičan za identifikaciju podvrsta bakterija ovog roda te da se bakterije identificirane kao C. jejuni jejuni 1 i C. jejuni jejuni 2 razlikuju samo u jednom testu (test gama-glutamil transferaze), navedeni rezultati označavaju pripad-nost skupini C. jejuni.

Tablica 1. Prisutnost bakterije roda Campylobacter spp. iz uzoraka izmeta, otpadne vode od ispiranja trupova na liniji klanja,

briseva trupova nakon evisceracije (BRISEVI-A), te briseva trupova nakon hlađenja kloriranom vodom i rashladne komore (BRISEVI-B)

Vrsta uzorka Izmet Voda Brisevi-A Oznaka jata 1 2 1 2 1 2 3 4

Brisevi-B

Jato 1 +A C- 2 + + + + + + +A

C-3 +

Jato 2 + + +A C- 1 + +A

C-4 + + + +

Jato 3 + + + + + - + - - Jato 4 + + + + - + - + - Jato 5 + + + + + + - + -

Jato 6 + - + +A C-4

+A C.- 2 + - - -

Jato 7 - - - + - +A C-3 - - -

Jato 8 + - - + + + + + -

Jato 9 +A C - 2 + + + + +A

C- 2 + + +A C- 2

Jato 10 - - - + +A C -2 + +A

C -2 - -

Uupno* 8 6 7 10 8 9 6 6 3

+ - izdvajanje bakterija roda Campylobacter; nisu izolirane bakterije roda Campylobacter; C-1 = Campylobacter jejuni jejuni 1; C-2 = Campylobacter jejuni jejuni 2; C-3 = Campylobacter coli C-4 = Campylobacter spp;-A- identifikacija pomoću API Campy testova (BioMérieux, Francuska); * - ukupan broj uzoraka iz kojih su izdvojene bakterije roda Campylobacter



Prema podacima iz literature sudeći, u Republici Hrvatskoj se ne provodi redovita kontrola učestalosti bakterija roda Campylobacter spp. u jatima peradi u primarnoj proizvodnji, kao ni u klaoničkim objektima. Rezultati ovog istraživanja ukazuju na značajnu prisutnost sojeva bakterije Campylo-bacter spp. u uzorcima izmeta tovnih pilića (80%). Uzorci izmeta uzeti su iz deset jata peradi od 600 do 2000 tovnih pilića u trenutku privođenja klanju. Slične rezultate istraživanja dobili su Jeffrey i sur. (2001.), koji su izdvojili navedene bakterije u 94% uzoraka iz crijeva tovnih pilića. Prema izvješću Europske agencije za sigurnost hrane (2009.) visoka učestalost bakterija roda Campylobacter spp. u 2007. godini utvrđena je u Italiji (82,8%), Francuskoj (80,2%), Njemačkoj (78,4%), Sloveniji (75,3%), Austriji (60%), Španjolskoj (46,1%), Republici Češkoj (45,1%) i Švicarskoj (43,4%). U ostalim zemljama Europske unije koje su sudje-lovale u izradi izvješća zastupljenost navedenih bakterija iznosi od 4,4 do 37%, dok u Estoniji i Finskoj nije utvrđeno ni jedno pozitivno jato tovnih pilića. Prosječna učestalost bakterija Camyplobacter spp. u jatima tovnih pilića pretra-ženih u zemljama Europske unije iznosila je 2007. godine 25,2% (u 10.260 pretraženih jata), 21,7% 2006. godine (u 13.813 pretraženih jata), 23,8% 2005. godine (u 13.450 pre-traženih jata) te 25,7% 2004. godine (u 4353 pretraženih jata). Pretragom izmeta različitih kategorija peradi u Hrvatskoj utvrđena je pojavnost bakterije Campylobacter spp. od 34,75% u tovnih pura, od 15,85% u konzumnih nesilica, 14,54% u pilenki te 11,69% u tovnih pilića (Krstulović i sur., 2003.). Istraživanjem učestalosti bakterije Campylo-bacter spp. u brisevima kloake prikupljenih na tri lokacije u sjevernom dijelu Hrvatske utvrđena je prisutnost bakterije od 45,45% u 91 pretraženom uzorku. Daljnjom analizom izdvojenih sojeva provedenom multipleks-PCR metodom dokazano je da su najčešće zastupljeni sojevi pripadali C. jejuni i C. coli (Prukner-Radovčić i Horvatek, 2006.). U istraživanju pojavnosti bakterije u organima 180 tovnih pilića u Hrvatskoj utvrđena je učestalost u tankom crijevu od 12,2% (od 180 pretraženih životinja), a u debelom crijevu od 11,64% (od 558 pretraženih životinja). Od 21 izoliranog soja utvrđeno je da je 6 pripadalo C. jejuni biotipu 1, te 15 izolata soju C. coli. (Milaković-Novak i sur.1984.). Tako velike razlike mogu se objasniti različitim brojem pre-traženih uzoraka te primjenom različitih metoda za izdva-janje bakterija. Osim toga, klimatske prilike jedan su od najznačajnijih čimbenika koji utječu na pojavnost bakterija u jatima peradi. Učestalost bakterija u jatima smatra se znatno većom tijekom ljeta (više temperature, veći broj insekata i dr.). Guerin i sur. (2008.) su pri istraživanju pojavnosti bak-terija roda Campylobacter spp. na Islandu tijekom ljetnih mjeseci (temperature zraka su iznosile od 4,4 - 8,9 °C) utvrdili prisutnost bakterija u jatima peradi od 54,4%. Sličnu razliku u učestalosti bakterija u izmetu peradi ovisno o vremenskim prilikama utvrdili su i drugi autori, pri čemu je učestalost bakterija u izmetu tijekom zimskog razdoblja iznosila 7 - 32%, odnosno tijekom ljetnog razdoblja od 87 -

97% (Willis i Murray, 1997.). Iz navedenog se može zaključiti da utvrđena velika učestalost bakterija u našem istraživanju upućuje ili na mogući veći postotak pojavnosti bakterije u izmetu ne samo u zimskom već i u ljetnom razdoblju ili na mogućnost brzog širenja zaraze u jatu peradi prilikom transporta. U istraživanju širenja zaraze tijekom transporta peradi na klanje, provedenog na deset farmi tovnih pilića, kontaminacija prije transporta iznosila je 12,1%, a prije klanja 56 - 62,4% (Stern. 1995.; Byrd i sur., 1998.). Do kontaminacije preko fekalnog materijala pri transportu može doći zbog načina smještaja životinja (premali kavezi, postavljanje kaveza jedan na drugi) te zbog dužine boravka na istovarnoj rampi prije klanja. U cilju procjene kontaminiranosti mesa peradi bakterijama roda Campylobacter na liniji klanja određivana je prisutnost bakterija iz uzoraka otpadne vode od ispiranja trupova na liniji klanja nakon ručnog odstranjivanja organa te u uzor-cima briseva sa trupova nakon ispiranja. Također je ispitana prisutnost bakterija u uzorcima briseva trupova nakon za-vršnog ispiranja u kloriranoj vodi i hlađenja (u rashladnom tunelu u trajanju od sat i pol uz snažno strujanje zraka, pri čemu se trupovi ohlade na 1-2 °C). Analizom rezultata prikupljene otpadne vode od ispiranja trupova na liniji klanja utvrđena je prisutnost bakterija roda Campylobacter spp. u 17 od 20 pretraženih uzoraka (85%). Bakterije su izolirane iz svih 10 promatranih jata peradi. Analizom uzoraka briseva trupova utvrđena je prisutnost bakterija roda Campylobacter u 29 od 40 pretraženih sku-pnih uzoraka (72,5%)a u uzorcima briseva trupova nakon završnog ispiranja u kloriranoj vodi i hlađenja u tri od 10 ispitana uzorka (30%). Dobiveni rezultati ukazuju na zna-čajno smanjenje kontaminacije trupova navedenim bakteri-jama. Brisevi trupova uzimani su s područja vrata, gdje se slijeva sav sadržaj s površine trupova budući da je gustoća folikula na vratu velika, te se pretpostavlja da je to područje trupa peradi najčešće kontaminirano bakterijama (EFSA, 2009.). Slične rezultate dobili su i Uyttendaele i sur. (1999.), koji su utvrdili prisutnost bakterija roda Campylobacter spp. u mesu i proizvodima od mesa peradi u 21,9% uzoraka porijeklom iz Belgije, u 30,2% uzoraka porijeklom iz Francuske, 15,4% uzoraka porijeklom iz Italije te 54,5% uzoraka porijeklom iz Velike Britanije. Pritom je 25% izdvojenih bakterija pripa-dalo sojevima C. jejuni i C. coli. Tako visok postotak kontaminacije trupova rezultat je poten-cijalne križne kontaminacije mesa peradi bakterijama iz probavnog trakta na liniji klanja. Kao mjera smanjenja broja bakterija u klaonicama se redovito koriste šurionici, u ko-jima temperatura vode iznosi 72 °C . Međutim, prema istra-živanju Berrang i suradnika (2000.) navedena mjera sma-njenja broja bakterija nije dovoljno učinkovita ne samo zbog kratkog vremena izlaganja navedenoj temperaturi već i zbog prisutnosti perja. Pri daljnjoj obradi u klaonici trupovi peradi prolaze kroz aparat za linijsko čupanje perja, pri čemu može doći i do zadržavanja Campylobacter spp. i drugih bakterija u vratnim folikulima (Carson i sur. 1999.).


Ipak, prisutnost navedenog postotka bakterija na trupovima tovnih pilića smatra se još uvijek značajnom budući da je meso peradi najčešći izvor zaraze bakterijama Campylo-bacter spp. u ljudi te da infekciozna doza za ljude iznosi 500-700 bakterija. Osim toga, neprikladno pakiranje uzoraka u plastičnoj ambalaži može rezultirati nastankom povoljnih uvjeta (visoka vlaga) za duže preživljavanje bakterija na mesu peradi (EFSA, 2009.). Navedena prisutnost bakterija u jatima peradi uspoređena je s potvrđenim slučajevima obo-ljenja u ljudi 2007. godine. Pritom je utvrđen porast broja slučajeva Kampilobakterioze u ljudi od 14,2% u odnosu na prisutnost iste bolesti proteklih godina kao i na prisutnost drugih bakterijskih bolesti u istom razdoblju (salmoneloza, histerioza i dr.) (EFSA, 2009.). Prema podacima klinike za infektivne bolesti „Fran Miha-ljević“ u razdoblju 1994.-2002. godine su u Republici Hrvat-skoj hospitalizirana 1632 pacijenta sa sumnjom na kampilo-bakteriozu. U 1104 slučajeva (67,65%) utvrđena je infekcija bakterijom C. jejuni, a u 433 (26,53%) bakterijom C. coli (Balen Topić i sur., 2007.). U Primorsko-goranskoj županiji od 6416 pretraženih slučajeva oboljenja u ljudi sa znako-vima dijareje utvrđena je bakterija Campylobacter u 407 slu-čajeva (6,3%), od čega je 187 izolata pripadalo C. jejuni te 50 izolata C. coli (Vučković i sur., 2007.). Budući da je liječenje kampilobakterioze u ljudi nespeci-fično te da bolest može uzrokovati značajne posljedice u osjetljivih skupina ljudi, nužno je poduzeti mjere smanji-vanja prisutnosti bakterija u jatima peradi, kao i mjere sprečavanja kontaminacije mesa preradi pri klaoničkoj obradi. Također se preporuča provođenje redovitog monito-ringa jata peradi i klaonica na prisutnost navedenih bakterija (WHO, 2003.; Mulder i Hupkes, 2007.). U cilju smanjivanja prisutnosti bakterija u jatima peradi pre-poručaju se mjere uništavanja pozitivnih uzgoja i brojlerskih jata te uporaba bakteriofaga i vakcinacija uzgojnih jata. Na-dalje, preporuča se odgovarajući odmor objekata te kontrola hrane, vode i stelje prije useljavanja novog jata. Uporaba probiotika i zakiseljivača u hrani za životinje, koji pomažu pri uspostavi optimalne kompetitivne antagonističke mikro-flore u mlade peradi, također se smatra prikladnom pre-ventivnom mjerom u sprečavanju kampilobakterioze u ja-tima peradi (Mead, 2002.; WHO, 2003.). Od ostalih pre-ventivnih mjera poželjno je ograničiti kontakt s divljim pticama, smanjiti prisutnost insekata i glodavaca, prekinuti hranjenje životinja najmanje 12 sati prije klanja te skratiti vrijeme čekanja životinja na istovarnoj rampi (Craven i sur., 2000.; EFSA, 2009.). Također se preporučaju standardne preventivne mjere kao što su ograničenje kretanja osoblja, redovito čišćenje i dezinfekcija pribora opreme i tran-sportnih sredstava te čišćenje, dezinfekcija, deratizacija i dezinsekcija u vrijeme kad su objekti prazni. Za smanjivanje kontaminacije mesa peradi porijeklom od pozitivnih jata u klaonici preporuča se uporaba hladne klorirane vode (koncentracije do 50 ppm) te postupak hla-đenja kloriranom vodom i potom hladnom strujom zraka (WHO, 2003.). Nadalje, preporuča se primjena organskih kiselina (octena kiselina, mliječna kiselina, propionska

kiselina, limunska kiselina) koje smanjuju pH površine tru-pova stvarajući nepovoljne uvjete za preživljenje bakterija. Također se mogu koristiti klor dioksid, tri-natrijev fosfat, kiseli natrijev klorit i postupak zračenja (0,12-0,25 kGy) (Berrang i Mungsrove, 2000.; Keener i sur., 2004.; Berrang i sur., 2006.). Rezultati ovog istraživanju ukazuju na potrebu procjene učestalosti bakterija roda Campylobacter spp u primarnoj peradarskoj proizvodnji kao i u klaoničkim objektima u Hrvatskoj. Razlog tome su ne samo usklađivanje sa zahtje-vima Europske zajednice o praćenju navedene zoonoze (EC, 2003) već i značajan broj slučajeva oboljenja u ljudi u Hrvatskoj te potreba određivanja stvarne opasnosti koju ta alimentarna infekcija predstavlja po zdravlje ljudi.

Literatura

Abubakar I, L. Irvine, C. F. Aldus, G. M. Wyatt, R. Fordham, S. Schelenz, L. Shepstone, A. Howe, M. Peck, P. R. Hunter (2007.): A systematic review of the clinical, public health and cost-effectiveness of rapid diagnostic tests for the detection and identification of bacterial intestinal pathogens in faeces and food. Health Technol Assess. 11(36):1-26.

Adkin, A., E. Hartnett, L. Jordan, D. Newell, H. Davison (2006.): Use of a systematic review to assist the development of campylobacter control strategies in broilers. J. Appl. Micro-biol. 100:306–315.

Balen Topić, M., A. Beus, B. Desnica, N. Vicković, V. Šimić, D. Šimić (2007.): Epidemiološke osobitosti kampilobakterioza u hospitaliziranih bolesnika. Infektološki glasnik. 27(1):15-22.

Berang, M. E., D. P. Smith, Jr. A. Hinton (2006.): Organic acid placed into the cloaca to reduce Campylobacter contamination of broiler skin durnig defeathering. J. Appl. Poult. Res. 15:287-291.

Berrang, M. E., J. A. Mungsrove (2000.): Effects of hot water application after defeathering on the levels of Campylobacter, Coliform bacteria, and Escherichia coli on broiler carcasses. Poult. Sci. 79:1689-1693.

Burch, D. G. S. (2005.): Avian vibrionic hepatitis in laying hens. Vet. Rec. 22(157):528.

Byrd, J. A., D. E. Corrier, M. E. Hume, R. H. Bailey, L. H. Stanker, B. M. Hargis (1998): Incidence of Campylobabter in crops of preharvest market-age broiler chicken. Poult. Sci. 77:1303-1305.

Carson, J. A., R J. Buhr, J. A. Dickens, M. T. Mungsrove, N. J. Stern (1999.): Carcass microbiological quality following intermittent scalding and defeathering. J. Appl. Poultry Res. 8:368-373.

Cawthraw, S. A., T. M. Wassenaar, R. Ayling, D. G. Newell (1996.): Increased colonization potential of Campylobacter jejuni strain 81116 after passage through chickens and its implication on the rate of transmission within flocks. Epidemiol. Infect. 117:213–215.

Clark, A. G., M. Bueschkens (1985.): Laboratory infection of chi-cken eggs with Campylobacter jejuni by using temperature or pressure differentials. Appl. Environ. Microbiol. 49(6):467-1471.

Conlan, A. J. K, C. Coward, A. J. Grant, D. J. Maskell, J. R. Gog (2007.): Campylobacter jejuni colonization and transmission in broiler chickens: a modelling perspective. J. R. Soc. Interface. 4(16):819-829.


Cox, N., R. Bhur, M. Musgrove, L. Richardson, P. Cary (2006.): Natural presence of Campylobacter and salmonella in spleen, liver/gallbladder and reproductive tract of commercial leghorn laying hens. Poultry Science Association Meeting Abstract. 85(1):77.

Craven, S. E., N. J. Stern, E. Line, J. S. Bailey, N. A. Cox, P. Fedorka-Cray (2000.): Determination of incidence of Salmo-nella spp., Campylobacter jejuni, and Clostridium perfingens in waild birds near broiler chicken houses by sampling intestinal droppings. Avian Dis. 44:715-720.

EC, 2003. Europska direktiva 2003/99/EC(18). EFSA, (2009.): The community summary report on trends and

sources of zoonoses and zoontic agents in european union in 2007., 20.1.2009. www.efsa.europa.eu/cs/BlobServer/Report/ /2007_Zoonoses_Community_Summary_Report,0.pdf?ssbinary=true

FDA (2001.): Bacteriological analitic manual Online Capter 7, Isolation of Campylobacter species from food and wather http://www.foodsafety.gov/~ebam/bam-7.html

Guerin, M. T., P. Martin, S. W. Relersen, O. Berke, S .A. McEven, V. Friöriksdóttir, J. R. Bisaillon, Lowman, The“Campy-on-ice“Consortion (2008.): Temperature-related risk factors associated with the colonization of broiler-chicken flocks with Campylobacter spp. in Icleand, 2001-2004. Preventive Vete-rinary Medicine Volume 86, Issue 1-2,.Pages 14-29.

Guerry, P. (2007.): Campylobacter flagella: not just for motility. Trends in Microbiology. 15(10):456-461.

Hendrixson, D. R., V. J. DiRita, (2004.): Identification of Cam-pylobacter jejuni genes involved in commensal colonization of the chick gastrointestinal tract. Wiley Inter Science

Humphries, H., Dooley, C., O'Leary, D. (1986.): Effect of therapy on Campylobacter pyloridis a randomised trial. Gut, 27:611.

Huneau-Salaün, A., M. Denis, G. Balaine, G. Salvat, G. (2007.): Risk factors for Campylobacter spp. colonization in French free-range broiler-chicken flocks at the indor rearing period. Preventive Veterinary Medicine. 80(1):34-48.

Huysmans, M. B., J. D. Turnidge, J. H. Williams, (1995.): Eva-luation of API Campy in comparison with conventional-methods for identification of thermophilic campylobacters., Journal of clinical microbiology. 3345–3346.

ISO 10272-1:2006 (E): Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp.-Part 1: Detection method

ISO 17604:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Carcass sampling for microbiological analysis

ISO/TS 10272-2:2006 (E): Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for detection and enume-ration of Campylobacter spp.-Part 2:Colony-count technique

Jeffrey, J. S., E. R. Atwill, A. Hunter (2001.): Farm and manage-ment variables linked to fecal shedding of Campylobacter and Salmonella in commercial squab production. Poult. Sci. 80:66–70.

Keener, K. M., M. P. Bashor, P. A. Curtis, B. W. Sheldon, S. Kathariou (2004.): Comprehensive reviw of Campylobacter and poultry procesing. Comprehensive reviws in food science and food safety. Vol 3.

Klančnik, A., T. Zorman, S. Smole Možina (2008.): Effects of Low Temperature, Starvation and Oxidative Stress on the Physiology of Campylobacter jejuni Cells. Croatica Chemica Acta. 81(1):41-46.

Konkel, M. E., M. R. Monteville, V. Rivera-Amill, and L. A. Jones (2001.): The Pathogenesis of Campylobacter jejuni-Mediated Enteritis Curent Issues in Intestinal Microbiology.2(2):55.

Krstulović, F., B. Šimpraga, T. Zglavnik, M. Tišljar, S. Volarević (2003.): Pojavnost bakterije Campylobacter u izmetu peradi. Zbornik peradarski dani 2003.

Louis, V. R., I. A. Gillespie, S. J. O'Brien, E. Russek-Cohen, A. D. Pearson, R. R. Colwell (2004.): Temperature-driven campylo-bacter seasonality in England and Wales. Appl. Environ. Microbiol. 71:85–92.

Marshall, B. J. (1985.): Nervous dyspepsia (letter). Med. J. Aust. 142:704.

Marshall, B. J. Warren, J. R. (1984): Unidetified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet. 1:1311-1314.

Mead, G. C. (2002.): Factor affecting intestinal colonisation of poultry by campylobacter and role of microflora in control. Word s poultry science journal. 58.

Meldrum, R. J., J. K. Griffiths, R. M. M. Smith, M. R. Evans (2004.): The seasonality of human Campylobacter infection and Campylobacter isolates from fresh, retail chicken in Wales. Epidemiol. Infect. 133:49–52.

Milaković-Novak, LJ., S. Kalenić, A. Nemanič, D. Ramljak (1984.): Campylobacter jejuni/coli u peradi. 1. Nalazi u pro-bavnom sustavu pilića u tovu i kokoši nesilica. Vet. arhiv. 54(5)175-181.

Mulder R. W., A. W., H. Hupkes (2007.): European Legislation in Relation to Food Safety in Production of Poultry Meat and Eggs. J. Appl. Poult. Res. 16:92-98.

Newell, D. G., C. Fearnely (2003): Sources of Campylobacter Colonization in Broiler Chickens. Appl. Environ. Microbiol. 69(8):4343-4351.

Nylen G, F. Dunstan, S. R. Palmer, Y. Andersson, F. Bager, J. Cowden, G. Feierl, Y. Galloway, G. Kapperud, F. Megraud, K. Molbak, L. R. Petersen, P. Ruutu (2002.): The seasonal distribution of Campylobacter infection in nine European countries and New Zealand. Epidemiol. Infect. 128:383–390.

Patrick, M. E, L. E. Christiansen, M. Waino, S. Ethelberg, H. Madsen, H. C. Wegener (2004.): Effects of climate on incidence of Campylobacter spp. in humans and prevalence in broiler flocks in Denmark. Appl. Environ. Microbiol. 70:7474–7480.

Pickett, C. L., E. C. Pesci, D. L. Cottle, G Russell, A. N. Erdem and H. Zeytin (1996.): Prevalence of cytolethal distending toxin production in Campylobacter jejuni and relatedness of Campylobacter spp. cdtB gene. Infect. Imun. 64(6): 2070-2078.

Prukner-Radovčić. E., D. Horvatek (2006.): Prevalence of Cam-pylobacter spp. in broiler chickens in Croatia. EPC- XII European Poultry Conference, Verona, Italy, 10.-14. Septem-ber 2006.

Shane, S. M. (1997.): Chapter 10. Campylobacteriosis. In: Diseases of Poultry, 10th Edition. Editor-in-Chief, Calnek, B.W. Iowa State Press, Iowa, USA, pp 235-245.

Skirow. M. B. (1977.): Campylobacter enteritis: a „new“ disease. British Medical Journal, pubmedcentral.nih.gov

Snelling, W. J., J. E. Moonroe, J. S. G. Dooley (2005.): The colonization of broiler with Campylobacter. World s Poultry Science Journal. 61:655-662.


Stern, N .J. (2008.): Salmonella species and Campylobacter jejuni cecal colonization model in brojler. Poultry Science Journal. 87:2399-2403.

Stern, N. J.(1995.): Campylobacter spp. in broilers on the farm and after transport., Poultry science, 74(6):937-941.

Stern,N. J, M. C. Robach, N. A. Cox, M. T. Mungsrve (2002.): Effect of drinking water chlorination on Campylobacter spp. colonization of broilers. Avian Dis. 46(2):401-404.

Uyttendaele, M., P. De Troy, J. Debevere (1999.): Incidence of Salmonella, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli and Listeria monocytogenes in Poultry Carcasses and Different Types of Poultry Products for Sale on the Belgian Retail Market. J. Food Protection. 62(7):735-740.

Van Overbeke, I., L. Duchateau, L. De Zutter, G. Albers, R. A. Ducatelle (2006.): Comparison survey of organic and conventional broiler chickens for infectious agents affecting health and food safety. Avian Dis. 50:196–200.

Vučković, D., P. Gregorić-Kesovija, B. Tičac, M. Abram (2007.): Kampilobakter kao uzročnik akutne dijarejične bolesti u

primorsko-goranskoj županiji tijekom godine 2006. Medicina. 43:72-77.

Waldenström, J., T. Broman, I. Carlsson, D. Hasselquist, R. P. Achterberg, J. A. Wagenaar, B. Olsen (2002.): Prevalence of Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, and Campylobacter coli in different ecological guilds and taxa of migrating birds. Appl. Environ. Microbiol. 68:5911-5917.

Wassenaar, T. M. (1997.): Toxin production by Campylobacter spp. Clinical Microbiol. Rev. 10(3):466-476.

Wassenaar, T. M., B. A. van der Zeijst, R. Ayling, and D. G. Newell (1993.): Colonization of chicks by motility mutants of Campylobacter jejuni demonstrates the importance of flagellin A expression. J. Gen. Microbiol. 139:1171–1175.

WHO/FAO,82003: Discusion paper on risk menagment strategies for Campylobacter spp. in poultry. Codex alimentarius commission. ftp://ftp.fao.org/codex/ccfh35/fh0305be.pdf

Willis, W. L., C. Murray (1997.): Campylobacter jejuni seasonal recovery observations of retail market broilers. Poult. Sci. 76:314.

INCIDENCE OF CAMPYLOBACTER SPP. IN FECES, MEAT SURFACE AND WASTEWATER SWABS ALONG THE SLAUGHTER LINE

Summary

The paper shows the research of the frequency of bacteria from the species Campylobacter spp. during December 2008 and January 2009 in 10 flocks of fattening poultry at the moment they are brought to slaughter. Examined samples come from chicken carcasses, faeces and carcass rinsing water at the slaughter line. The obtained results indicate the presence of bacteria: in the faeces 80%, in carcass rinsing water at the slaughter line 85%, in samples after evisceration in 72,5% and in samples after the finishing wash in chlorinated water and cooling in the cooling chamber with strong air current in 30% of the cases. The mentioned bacteria are determined in the samples from each examined chicken flock. From the isolated strains of Campylobacter spp. bacteria, we identified biochemically through API Campy tests (BioMerieux) 10 strains which belong to the species C. jejuni jejuni 1 (one strain), C. jejuni jejuni 2 (seven strains), C. coli (two strains) and two strains Campylobacter spp. Since it is estimated that the accuracy of the APi Campy tests is 92% inside the first 24 hours of incubation, and 94% after further 24 hours (Huysmans and co., 1995) and that the test is not precise enough for determining the subspecies, the frequency of the bacteria in the obtained samples is estimated at the level of the Campylobacter spp. Species. Key words: Campylobacter, contamination, chicken carcasses


ISTRAŽIVANJE OSJETLJIVOSTI BAKTERIJA RODA CAMPYLOBACTER SPP. NA ANTIMIKROBNE TVARI DIFUZIJSKIM POSTUPKOM

Estella Prukner-Radovčić, Danijela Horvatek, Katja Krivičić

Zavod za bolesti peradi s klinikom,Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Bakterije roda Campylobacter uobičajeni su komenzali u crijevima zdravih kokoši, no vrlo često ova bakterija uzrokuje bolest u čovjeka. Broj prijavljenih slučajeva kampilobakterioze u ljudi raste posljednjih godina u čitavom svijetu, pa je tako i u Hrvatskoj druga po redu najučestalija zoonoza - toksoinfekcija koja se prenosi hranom. Epidemiološke studije pokazuju da je meso peradi najčešći izvor infekcije ljudi ovom termofilnom bakterijom. Nekontrolirana uporaba antibiotika, posebice u tovu pilića, sve češće dovodi do razvoja rezistencije uzročnika. Obrisci kloake, porijeklom od kokoši različitih dobnih i proizvodnih kategorija te pogodni za izdvajanje kampilobaktera, uzeti su na farmama i drugim objektima u Republici Hrvatskoj, te su dostavljeni na pretragu u bakteriološki laboratorij Zavoda za bolesti peradi s klinikom. Izdvojeni sojevi kampilobaktera pretraženi su difuzijskim postupkom na osjetljivost prema šest antimikrobnih tvari: azitromicinu, ciprofloksacinu, enrofloksacinu, eritromicinu, gentamicinu i tetraciklinu. Istraživanje osjetljivosti bakterija roda Campylobacter spp. izdvojenih iz kokoši dokazalo je njihovu pretpostavljenu vrlo visoku rezistenciju na antibiotike (od 21,0% pa sve do 100%). Uporaba fluorokinolona u liječenju peradi u Hrvatskoj vrlo je učestala, pa rezistencija istraživanih sojeva kampilobaktera (od 21,05% pa do 61,11%) na enrofloksacin i ciprofloksacin nikako nije zanemariva. U našem istraživanju visoka rezistencija kampilobaktera očitovala se i na eritromicin, azitromicin i gentamicin (od 52,63% za C. jejuni pa do 100% za C. coli), koji su vrlo važna sredstva izbora u liječenju ljudi od kampilobakterioze. Svjesni smo da ćemo još dugo morati koristiti lijekove u liječenju bakterijskih bolesti peradi, no njihova uporaba mora biti ciljana i pod strogim nadzorom stručnjaka, a sustavno istraživanje njihove osjetljivost na najčešće primjenjivane lijekove je dužnost znanstvenika koji se bave ovom problematikom. Ključne riječi: rezistencija, bakterije, Campylobacter spp., kokoš Uvod Bakterije roda Campylobacter, najčešće Campylobacter jejuni (C. jejuni) i C. Coli, uobičajeni su komenzali u crijevima ptica, pa su tako nađeni kod zdravih kokoši, purana, pataka, prepelica, golubova i druge domaće peradi, te divljih ptica i noja (Newell, 2001.). Primarno koloniziraju crijevnu sluznicu i mogu se izdvojiti iz svih dijelova crijeva, ali i iz slezene, jetra i krvi. Ipak, najveća koncentracija bak-terija nalazi se u slijepim crijevima (Cawthraw i sur., 1996.). U ljudi ta je bakterija uzročnik opasne zoonoze, kampilo-bakterioze koja se klinički očituje akutnim vodenastim do krvavim proljevom s jakim bolovima u trbuhu koji traje od tri do pet dana. Bolest prati još i povišena tjelesna tempe-ratura, grčevi u crijevima, mučnina, a ponekad i povraćanje

(Blaser, 1995.; Blaser, 1997.). Klinička slika varira od blage do teške, koju prate dehidracija i loše opće stanje. Teža klinička slika može se javiti kod dojenčadi, male djece, starijih, te odraslih osoba koje boluju od teških kroničnih bolesti zbog kojih im je oslabljen imunitet. Iako rijetko, kao komplikacija može se javiti bakterijemija, hepatitis, artritis, Reiterov sindrom i Guillian-Barreov sindrom (Bereswill i Kist, 2003.). Antibiotici su često upotrebljavani i djelotvorni lijekovi, no bakterije imaju dobro razvijene mehanizme genetske prila-godbe te njihova česta upotreba rezultira razvojem bakte-rijske rezistencije. Budući da prilikom liječenja infekcija antibiotici ne razlikuju patogene od nepatogenih bakterija, rezistencija se razvija i u bakterijama normalne flore stva-rajući tako u prirodi rezervoare gena za rezistenciju

Prof. dr. sc. Estella Prukner-Radovčić, dr. vet. med., Zavod za bolesti peradi s klinikom,Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: ++385 1 23 90 135; fax: ++385 1 23 90 280; e-mail: [email protected]

ISTRAŽIVANJE OSJETLJIVOSTI BAKTERIJA RODA CAMPYLOBACTER SPP. NA ANTIMIKROBNE TVARI DIFUZIJSKIM POSTUPKOM 192

(Heritage i sur., 1999.; Thomson, 2000.). Horizontalno ši-renje gena rezistencije moguće je ne samo unutar iste bak-terijske vrste nego i istoga roda, ali i sasvim različitih rodova (Opal i sur., 2000.; Martinez i Baquero, 2000.). Mehanizmi rezistencije uključuju tvorbu enzima koji inaktiviraju djelo-vanje lijekova, mijenjaju permeabilnost bakterijske mem-brane aktivirajući «effluks» pumpe (Charvalos i sur., 1995.; Lin i sur., 2002.; Randall i sur., 2003.) i modificiraju ciljno mjesto djelovanja lijeka u stanici (Sefton, 2002.). Postoji vrlo različita rezistencija bakterija na antibiotike u različitim područjima svijeta, ali i u različitim dijelovima jedne zemlje, pa i na različitim odjelima jedne te iste bolnice (White i sur., 2000.). Zbog toga je vrlo važno istraživati rezistenciju po-jedinih bakterijskih vrsta na antibiotike koji se često koriste na određenom području. Neke laboratorijske metode kao disk difuzija, mikrodilucija, metoda dilucije agara i Epsilometer-test (E-test) koriste se za otkrivanje osjetljivosti bakterija na niz antibiotika (Gaudreau i Gilbert, 1997.; Engberg i sur., 1999.; Ge i sur., 2002.; Luber i sur., 2003.; Oncul i sur., 2003.). Iako su dostupni razni standardizirani komparativni testovi za istraživanje rezistencije velikog broja bakterija, prema Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), ne postoji interna-cionalno odobren kriterij za istraživanje rezistencije kampi-lobaktera. U lipnju 2002. godine CLSI je preporučio metodu dilucije agara kao metodu za istraživanje rezistencije kampi-lobaktera, ali Community Reference Zoonosis Laboratory pri EU nije još preporučio specifičnu metodu, pa se smatra da napredak na tom području istraživanja nije ostvaren (Moore i sur., 2005.). Iako je metoda dilucije agara u mediju s dodatkom 5% krvi i uzgajanjem u mikroaerofilnim uvjetima najčešće preporu-čen način istraživanja osjetljivosti bakterija (Nachamkin i sur., 2000.; Aaerstrup i Engberg, 2001.), ta metoda zahtijeva dosta vremena, pa se rijetko koristi kao rutinska metoda, dok su E-test (Baker i sur., 1991.) i difuzijski postupak puno lakše i brže metode te dovoljno pouzdane za objektivno prosuđivanje rezultata (Baker, 1992.; Huang i sur., 1992.; Funke i sur., 1993.; Engberg i sur., 1999.).

Materijal i metode

Obrisci kloake, porijeklom od kokoši različitih dobnih i proizvodnih kategorija te pogodni za izdvajanje kampilo-baktera, uzeti su na farmama i drugim objektima u Republici Hrvatskoj, te su dostavljeni na pretragu u bakteriološki laboratorij Zavoda za bolesti peradi s klinikom. Prikupljeni uzorci su u laboratoriju nacijepljeni u selektivni tekući bujon (Campylobacter Selective Enrichment Broth- Preston; Oxoid, Unipath, UK) i inkubirani u mikroaerofilnim uvje-tima (85% dušika, 10% ugljik dioksida, 5% kisika) pri 42 °C kroz 48 sati. Nakon obogaćivanja rasta bujon je nacijepljen na selektivnu modificiranu čvrstu podlogu mCCDA (modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar- mCCDA; Oxoid, Unipath, UK), koja je također inkubiranana pri 42 °C kroz 48 sati u mikroaerofilnim uvjetima. Kolonije koje su na osnovu makroskopskog

izgleda, bojanja po Gramu i pozitivnih katalaza i oksidaza reakcija identificirane kao Campylobacter spp. precijepljene su na ploče Tryptose Blood Agara (TBA, Oxoid, Velika Britanija) s dodatkom 5 % lizirane konjske krvi i inkubirane u mikroaerofilnim uvjetima pri 37 °C kroz 48 sati. Narasle bakterije spremljene su na -80 °C u tekućem selektivnom bujonu s dodatkom sterilnog glicerola za daljnja istraživanja. U svrhu točne identifikacije vrsta bakterija roda Campylo-bacter izolirana im je DNK ekstrakcijom 48-satne kulture bakterija naraslih u neutralnom bujonu br. 2 (Oxoid, Hampshire, UK) postupkom po Jacksonu i sur. (1993.). Za identifikaciju sojeva korišten je tzv. multiplex PCR (mPCR), metodom opisanom po Manfredi i sur. (2003.), koja se te-melji na upotrebi više različitih početnica (primera) za isto-dobnu identifikaciju različitih vrsta bakterija roda Campylo-bacter. Nakon umnažanja dobiveni su produkti PCR reak-cije: 857 parova baza za Campylobacter genus, 589 parova baza za C. jejuni i 462 parova baza za C. coli. Za vizu-alizaciju umnožaka korišten je 1% agarozni gel, na koji je naslojeno 15 µL produkta, dok elektroforeza traje 1,5 sat na 100 V. Etidij bromid u količini 0,1-0,5 µg dodan je u 1,0 mL gela. Iz kulture bakterijskih stanica C. jejuni i C. coli (sveukupno 37 sojeva bakterija) napravljene su suspenzije u 5 ml fiziološke otopine NaCl-a gustoće od 0,5 po McFarlandu. Svaka suspenzija je sterilnim štapićem (povlačeći zavojitim potezima u tri različita smjera) nacijepljena na Mueller-Hinton agar (BBL, Velika Britanija) s dodatkom 5 % konjske krvi, nakon čega su Petrijeve zdjelice ostavljene poluotklopljene kraj plamenika da bi se osušile. Na površinu hranjivih podloga dodani su diskovi s antimikrobnim tva-rima: azitromicinom (15 μg, Bio-Rad, SAD), ciprofloksa-cinom (5 μg, Bio-Rad, SAD), enrofloksacinom (5 μg, Bayer, Njemačka), eritromicinom (15 i.j., Becton Dickinson, Velika Britanija), gentamicinom (10 μg, Bio-Rad, SAD) i tetra-ciklinom (30 μg, Bio-Rad, SAD). Tako pripremljene Petri-jeve zdjelice inkubirane su pri 37 °C kroz 24 sata u mikro-aerofilnim uvjetima te su očitane zone inhibicije rasta nacijepljenih bakterija.


Istraživanje osjetljivosti 37 uzoraka bakterija roda Campylo-bacter spp. porijeklom od različitih dobnih i proizvodnih kategorija kokoši dokazalo je pretpostavljenu vrlo visoku rezistenciju (od 21,05% pa sve do 100%) na čak šest istraživanih antimikrobnih tvari (tablice 1 i 2). Najčešće se rezistencija očitovala na azitromicin (od 72,73% pa sve do 100%), koji se sve češće upotrebljava u liječenju, posebice djece sa težom kliničkom slikom (Vukelić i sur., 2003), dok se na enrofloksacin i ciprofloksacin rezistencija bakterija najmanje očitovala (od 21,05% pa do 61,11%). Od 37 istraživanih uzoraka metodom lančane reakcije poli-merazom 18 (48,65 %) sojeva identificirano je kao C. coli, a 19 sojeva (51,35%) kao C. jejuni, no značajna razlika u rezistenciji pojedinih vrsta bakterija nije se očitovala.


Tablica 1. Osjetljivost sojeva C. jejuni porijeklom od kokoši na različite antimikrobne tvari (n=19)

Broj sojeva (postotak) Antimikrobna tvar

Osjetljiv Umjereno osjetljiv Rezistentan Azitromicin* 2 (18,18 %) 1 (9,09 %) 8 (72,73 %) Ciprofloksacin 4 (21,05 %) 11 (57,89 %) 4 (21,05 %) Enrofloksacin 3 (15,78 %) 12 (63,16 %) 4 (21,05 %) Eritromicin 3 (15,79 %) 6 (31,58 %) 10 (52,63 %) Gentamicin** 2 (25,00 %) 2 (25,00 %) 5 (62,50 %) Tetraciklin 4 (21,05 %) 0 (0 %) 15 (78,95 %) *pretraženo 11 sojeva; ** pretraženo 8 sojeva Table 1. Antibiotic sensitivity of C. jejuni isolated from chickens (n=19)

Number (%) of isolates Antimicrobial agents

Susceptible Intermediate Resistant Azithromycin* 2 (18,18 %) 1 (9,09 %) 8 (72,73 %) Ciprofloxacin 4 (21,05 %) 11 (57,89 %) 4 (21,05 %) Enrofloxacin 3 (15,78 %) 12 (63,16 %) 4 (21,05 %) Erythromycin 3 (15,79 %) 6 (31,58 %) 10 (52,63 %) Gentamicin** 2 (25,00 %) 2 (25,00 %) 5 (62,50 %) Tetracycline 4 (21,05 %) 0 (0 %) 15 (78,95 %) *11 strains examined; ** 8 strains examined Tablica 2. Osjetljivost sojeva C. coli porijeklom od kokoši na različite antimikrobne tvari (n=18)

Broj sojeva (postotak) Antimikrobna tvar

Osjetljiv Umjereno osjetljiv Rezistentan Azitromicin* 0 (0 %) 0 (0 %) 17 (100 %) Ciprofloksacin 4 (22.22 %) 6 (33.33 %) 8 (44.44 %) Enrofloksacin 1 (5.55 %) 6 (33.33 %) 11 (61.11 %) Eritromicin 0 (0 %) 4 (22.22 %) 14 (77.77 %) Gentamicin** 0 (0 %) 0 (0 %) 1 (100 %) Tetraciklin 3 (16.66 %) 0 (0 %) 15 (83.33 %)

* pretraženo 17 sojeva; **pretražen 1 soj Table 2. Antibiotic sensitivity of C. coli isolated from chickens (n=18)

Number (%) of isolates Antimicrobial agents

Susceptible Intermediate Resistant Azithromycin* 0 (0 %) 0 (0 %) 17 (100 %) Ciprofloxacin 4 (22.22 %) 6 (33.33 %) 8 (44.44 %) Enrofloxacin 1 (5.55 %) 6 (33.33 %) 11 (61.11 %) Erythromycin 0 (0 %) 4 (22.22 %) 14 (77.77 %) Gentamicin** 0 (0 %) 0 (0 %) 1 (100 %) Tetracycline 3 (16.66 %) 0 (0 %) 15 (83.33 %)

* 17 strains examined; **one strain examined


Broj prijavljenih slučajeva kampilobakterioze u ljudi raste posljednjih godina u čitavom svijetu, pa je tako i u Hrvatskoj druga po redu najučestalija zoonoza - toksoinfekcija koja se prenosi hranom (Matica i Grbinić-Senji, 2006.; Balen Topić i sur., 2007.), pri čemu je očekivati da je i prijenos re-zistentnih sojeva bakterija na čovjeka sve učestaliji. Iako se zna da nakon prestanka liječenja zbog redukcije normalne crijevne flore ili nakon valjenja u «čistoj» valionici zbog odsutnosti crijevne flore postoji kratko razdoblje u kojem je perad vrlo osjetljiva prema infekciji patogenim crijevnim bakterijama (Seuna i sur., 1980.; Coloe i sur., 1984.; Gorham i sur., 1991.), praksa je u Hrvatskoj da se lijekovi koriste već pri prijemu jednodnevnih pilića u nastambe. Uporaba fluorokinolona od zemlje do zemlje varira (Nelson i sur., 2007.); u liječenju peradi u Hrvatskoj vrlo je učestala, pa valja imati na umu da rezistencija od 21,05% pa do 61,11% istraživanih sojeva kampilobaktera na enroflok-sacin i ciprofloksacin nikako nije zanemariva. U našem istraživanju visoka rezistencija kampilobaktera očitovana je i na eritromicin (od 52,63 % za C. jejuni pa do 83,33% za C. coli), koji je jedan od važnih sredstava izbora u liječenju ljudi od kampilobakterioze (Hariharan i sur., 2008.), ali i na gentamicin (od 62,5 do 100% za jedan soj C. coli). Epi-demiološke studije pokazuju da je meso peradi najčešći izvor infekcije ljudi tom termofilnom bakterijom (Humphrey i sur., 2007.). U prosjeku 40% jata tovnih pilića u zemljama EU pozitivno je na nalaz Campylobacter spp., a najviše pozitivnih slučajeva pojavljuje se u tzv. organic ili free-range proizvodnji (Ellerbroek i Alter, 2006.). Nekontrolirana uporaba antibiotika, posebice u tovu pilića, sve češće dovodi do razvoja rezistencije uzročnika, pa je moguće da postotak rezistentnih bakterija u sljedećim go-dinama bude i veći. Svjesni smo da ćemo još dugo morati koristiti lijekove u liječenju bakterijskih bolesti peradi, no njihova uporaba mora biti ciljana i pod strogim nadzorom stručnjaka, a sustavno istraživanje njihove osjetljivost na najčešće primjenjivane lijekove je dužnost znanstvenika koji se bave ovom problematikom.

Zahvala

Prikazani rezultati proizašli su iz znanstvenog projekta “Nove mogućnosti suzbijanja bakterijskih bolesti peradi i drugih ptica”, provedenog uz potporu Ministarstva znanosti, obrazovanja i športa Republike Hrvatske.

Literatura

Aaerstrup, F. M., J. Engberg (2001.): Antimicrobial resistance of thermophilic Campylobacter. Vet. Res. 32, 311-321.

Baker, C. N., S. A. Stocker, D. H. Culver, C. Thornsberry (1991.): Comparison of the E test to agar dilution, broth microdilution, and agar diffusion susceptibility testing techniques by using a special challenge set of bacteria. J. Clin. Microbiol. 29, 533-538.

Baker, C. N. (1992.): The E test and Campylobacter jejuni. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 15, 469-472.

Balen-Topić, M., A. Beus, B. Desnica, N. Vicković, V. Šimić, D. Šimić, (2007.): Epidemiološke osobitosti kampilobakterioza u hospitaliziranih bolesnika. Cro. J. Inf. 27(1), 15-22.

Bereswill, S., M. Kist (2003.): Recent developments in Campylo-bacter pathogenesis. Curr. Opin. Infect. Dis. 16 (5), 487–491.

Blaser, M. J. (1995.): Campylobacter and related species. U: Prin-ciples and practice of infectious diseases, vol. 2. Churchill Livingstone,1948–1956.

Blaser, M. J. (1997.): Epidemiologic and clinical features of Cam-pylobacter jejuni infections. J. Infect. Dis. 176 (Suppl. 2), 103–105.

Cawthraw, S. A., T. M. Wassenaar, R. Ayling, D. G. Newell (1996.): Increased colonization potential of Campylobacter jejuni stain 81116 after passage through chickens and its implication on the rate of transmission within flocks. Epidemiol. Infect. 117, 213-215.

Charvalos, E., Y. Tselentis, M. M. Hamzehpour, T. Kohler, J. C. Pechere (1995.): Evidence for an efflux pump in multidrug-resistant Campylobacter jejuni. Antimicrob. Agents Chemo-ther. 39 (9), 2019–2022.

Coloe, P. J., T. J. Bagust, L. Ireland (1984.): Development of the normal gastrointestinal microflora of specific pathogen free chickens. J. Hyg. Camb. 92, 79-87.

Ellerbroek, L., T. Alter (2006.): Campylobacter monitoring in broiler. U: Final COST 920 Conference «Future challenges to foodborne zoonosis», Ploufragan, Francuska, 2006.

Engberg, J., S. Andersen, R. Skov, F. M. Aarestrup, P. Gerner-Smidt (1999.): Comparison of two agar dilution methods and three agar diffusion methods, including the Etest, for antibiotic susceptibility testing of thermophilic Campylobacter species. Clin. Microbiol. Infect. 5, 580–584.

Funke, G., J. Luethy-Hottenstein, M. Altwegg (1993.): The E test for antibiotic susceptibility testing of clinical Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolates. Med. Microbiol. Lett. 2, 168-175.

Gaudreau, C., H. Gilbert (1997.): Comparison of disk diffusion and agar dilution methods for antibiotic susceptibility testing of Campylobacter jejuni subsp. jejuni and Campylobacter coli. J. Antimicrob. Chemother. 39, 707-712.

Ge, B., S. Bodies, R. Walker, D. White, S. Zhao, P. McDermott, J. Meng (2002.): Comparison of E-test and agar dilution for in vitro antimicrobial susceptibility testing of Campylobacter. J. Antimicrob. Chemother. 50, 487-494.

Gorham, S. L., K. Kadavil, H. Lambert, E. Vaughan, B. Pert, J. Abel (1991.): Persistence of Salmonella enteritidis in young chickens. Avian Pathol. 20, 433-437.

Hariharan, H., S. Sharma, A. Chikweto, V. Matthew, C. DeAllie (2008.): Antimicrobial drug resistance as determined by the E-test in Campylobacter jejuni, C. coli and C. lari isolates from ceca of broiler and layer chickens in Grenada. Comp. Immunol., Microbiol. Infect. Dis., doi: 10.1016/j.cimid. 2008.01.010

Heritage, J. M., F. H. Zali, D. Gascoyne-Binzi, P. M. Hawkey (1999.): Evolution and spread of SHV extended-spectrum betalactamases in Gram-negative bacteria. J. Antimicrob. Chemother. 44, 309-318.

Huang, M. B., C. N. Baker, S. Banerjee, F. C. Tenover (1992.): Accuracy of the E test for determing antimicrobial sus-ceptibilities of staphylococci, enterococci, Campylobacter jejuni and gram- negative bacteria resistant to antimicrobial agents. J. Clin. Microbiol. 30, 3243-3248.

Humphrey, T., S. O' Brien, M. Madsen (2007.): Campylobacters as zoonotic pathogens: A food production perspective. Int. J. Food Microbiol. 117, 237-257.


Jackson, P. D., J. D. Hayden, P. Qirke (1993.): Extraction of nucleic acid from fresh and archival maretial. U: PCR, A Practical Approach. Oxford Univ. Press, 29-50.

Lin, J., L. O. Michel, Q. Zhang (2002.): CmeABC functions as a multidrug efflux system in Campylobacter jejuni. Antimicrob. Agents Chemother. 46 (7), 2124–2131.

Luber, P., E. Bartelt, E. Genschow, J. Wagner, H. Hahn (2003.): Comparison of broth microdilution, Etest and agar dilution methods for antibiotic susceptibility testing of Campilobacter jejuni and Campylobacter coli. J. Clin. Microbiol. 41, 1062-1068.

Manfreda, G., A. De Cesare, V. Bondioli, A. Franchini (2003.): Comparison of the BAX® System with a multiplex PCR method for simultaneous detection and identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in environ-mental samples. Int. J. Food Microbiol. 87, 271-278.

Martinez, J. L., F. Baquero (2000.): Mutation frequencies and anti-biotic resistance. Antimicrob. Agents Chemoth. 44, 1771-1777.

Matica, B., D. Grbinić-Senji (2006.): Dijagnostika infekcija probavnog sustava u Zavodu za javno zdravstvo Grada Zagreba (The Diagnosis of Gastrointestinal Infection at Zagreb Institute of Public Health). Hrvatski časopis za javno zdravstvo 2 (8).

Moore, J. E., D. Corcoran, S. G. J. Dooley, S. Fanning, B. Lucey, M. Matsuda (2005.): Campylobacter. Vet. Res. 36, 351-382.

Nachamkin, J., J. Engberg, F. M. Aarestrup (2000.): Diagnosis and antimicrobial susceptability of Campylobacter species. U: Campylobacter. 2nd edition. ASM Press, 45-66.

National Committee for Clinical Laboratory Standards (2000.): Methods for dilution antimicrobial susceptability tests for bacteria that grows aerobically; approved standard M7-A5, vol. 20, no.2. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa.

Nelson, J. M., T. M. Chiller, J. H. Powers, F. J. Angulo (2007.): Fluoroquinolone-resistant Campylobacter species and the

withdrawal of fluoroquinolones from use in poultry: A public health success story. Food Safety 44, 977-980.

Newell, D. G. (2001.): Animal models of Campylobacter jejuni colonization and disease and the lessons to be learned from similar Helicobacter pylori models. Symp. Ser. Soc. Appl. Microbiol. 30, 57-67.

Oncul, O., P. Zarakolu, D. Gur (2003.): Antimicrobial suscep-tibility testing of Campylobacter jejuni: a comparison between Etest and agar dilution method. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 45 (1), 69–71.

Opal, S. M., K. H. Mayer, A. A. Mediross (2000.): Mechanisms of bacterial antibiotic resistance. U: Principles of Practice of In-fectious Diseases, 5th edition. Churchill Livingstone, 236-52.

Randall, L. P., A. M. Ridley, S. W. Cooles, M. Sharma, A. R. Sayers, L. Pumbwe (2003.): Prevalence of multiple antibiotic resistance in 443 Campylobacter spp. isolated from humans and animals. J. Antimicrob. Chemother. 52 (3), 507–510.

Sefton, A. M. (2002.): Mechanisms of antimicrobial resistance: their clinical relevance in the new millennium. Drugs 62 (4), 557–566.

Seuna, E., C. Schneitz, E. Nurmi (1980.): Combined therapy of Salmonella infection in chickens by antimicrobial agents followed by cultured cecal bacteria. Poultry Sci. 59, 1187-1192.

Thomson, K. S. (2000.): Minimizing quinolone resistance: are the new agents more or less likely to cause resistance? J. Antimicrob. Chemother. 45, 719-723.

Vukelić, D., D. Pavić-Sladoljev, D. Božinović, A. Baće, B. Benić (2003.): Liječenje gastroenterokolitisa uzrokovanog bakte-rijama roda Campylobacter u dječjoj dobi. Medicus 12, 133-137.

White, R. L., L. V. Friedrich, L. B. Mihm, J. A. Bosso (2000.): Assessment of the relationship between antimicrobial usage and susceptibility: differences between the hospital and specific patient-care areas. CID 31, 16-23.

ANTIMICROBIAL RESISTANCE OF CAMPYLOBACTER SPP. ISOLATED FROM CHICKENS AS DETERMINED BY DISK DIFFUSION METHOD

Summary

Campylobacter species are commensally bacteria in the intestinal tract of poultry, but also a leading cause of food-borne disease worldwide. In Croatia campylobacteriosis is second reported zoonosis. Epidemiological studies revealed a important correlation between consumption of poultry meat and human infection. Mainly uncontrolled use of antibiotics, especially in broiler rearing has caused the emergence of resistant strains of bacteria. Cloacal swabs from chickens of different ages and categories were taken on different farms located in Croatia. Isolated strains were subjected to antimicrobial sensitivity testing using the disk diffusion method. Antimicrobial agents on disk and concentrations were as follows: azithromycin (15 μg, Bio-Rad, USA), ciprofloxacin (5 μg, Bio-Rad, USA), enrofloxacin (5 μg, Bayer, Germany), erythromycin (15 IU, Becton Dickinson, UK), gentamicin (10 μg, Bio-Rad, USA), and tetracycline (30 μg, Bio-Rad, USA). The study determined the high frequency of resistant Campylobacter strains (from 21.05% to 100.00%). Flouroquinolones are mainly used in the treatment of bacterial poultry diseases, so the resistance of 21.05% to 61.11% examined strains is highly expected. Overall, the highest resistance was observed to azithromycin, followed by erythromycin, and gentamicin (52.63% for C. jejuni to 100.00% for C. coli, respectively), and these are the antibiotics that are currently used in the treatment of campylobacteriosis. Fluoroquinolones and other antimicrobial agents will continuously be used in human and veterinary medicine, but it should be judiciously and under control, together with routinely susceptibility testing. Kew words: drug resistance, bacteria, Campylobacter spp., chicken


NALAZ OSTATAKA ANTIMIKROBNIH TVARI U HRANI ZA ŽIVOTINJE I SIROVINAMA ZA NJIHOVU PRIPREMU UPORABOM SCREENING TESTA

Vesna Jaki1, Darko Majnarić1, Manuela Zadravec2

1Hrvatski veterinarski institut, Veterinarski zavod Križevci, Hrvatska 2Hrvatski veterinarski institut Zagreb, Hrvatska

Sažetak

U radu su prikazani rezultati određivanja ostataka antibiotika u hrani za životinje i sirovinama za njihovu pripremu. U razdoblju od početka 2006. godine do kraja 2008. godine ukupno je pretraženo 319 uzoraka, a 6 uzoraka (1,9%) bilo je pozitivno na prisutnost rezidua antibiotika. Analize su izvršene postupkom u kojem se koristi agar prema Kundratu i suspenzija spora Geobacillus stearothermophilus. Ključne riječi: hrana za životinje, ostaci antibiotika Uvod Antibiotici su proizvodi metabolizma mikroorganizama čije male količine mogu oštetiti i uništiti jednu ili više vrsta mikroorganizama. Antibiotici imaju značajnu ulogu u liječenju i u prevenciji pojave različitih bolesti domaćih životinja. Mogu se koristiti u obliku dodataka stočnoj hrani kod intenzivnog uzgoja peradi, svinja i goveda da bi se smanjio rizik od oboljenja životinja, a povećao njihov prirast (Mulalić i sur., 2006.). Na tržište je dopušteno stavljati samo ljekovitu hranu koja od-govara Pravilniku o uvjetima za proizvodnju, stavljanje na tržište i upotrebu ljekovite hrane za životinje (NN 101/2005.) i Pravilniku o dodacima hrani za životinje (NN 9/2007.). Ostala hrana i sirovine za njihovu pripremu ne smiju sadržavati ostatke antimikrobnih tvari u količini većoj od maksimalno dopuštenih koncentracija navedenih u Pra-vilniku o najvećim dopuštenim količinama rezidua veteri-narsko-medicinskih proizvoda u hrani životinjskog podri-jetla (NN 75/2008.). Metode utvrđivanja rezidua antibakterijskih lijekova mogu biti kvalitativne (mikrobiološki i imuno-enzimni testovi) i kvantitativne (neki imuno-enzimni testovi, plinska i viso-kotlačna tekućinska kromatografija). Kemijske metode kao što su HPLC i GC-MS su osjetljive i vrlo specifične, ali preskupe za rutinsku upotrebu (Koenen-Dierck i sur.,1995.). Mikrobiološki testovi mogu se koristiti kod ispitivanja na rezidue antibiotika, brzi su, jednostavni za primjenu i eko-

nomični, te su se koristili tijekom monitoringa u laborato-rijima u Belgiji (Koenen-Dierick i sur., 1995.), Ujedinjenom Kraljevstvu (Stead i sur., 2004.) i u Finskoj (Myllyniemi, 2004.). Nakon opsežnih istraživanja visoku osjetljivost de-tekcije određenih antibiotika kao što su eritromicin, genta-micin, streptomicin, klortetraciklin, oksitetraciklin, penicilin G, amoksicilin i polimiksin B je pokazao Geobacillus stearothermophilus, te se čini najprikladnijim testom mikro-organizama. Osjetljivost je bila unutar maksimalno dopušte-nih granica koje je postavila Europska zajednica (Werber D., i T. Bergann, 1997.).

Materijal i metode

Utvrđivanje ostataka antibiotika provedeno je na uzorcima gotovih krmnih smjesa za perad, svinje, ribe i kuniće, hrani za pse i mačke, mliječnim zamjenicama, ribljem brašnu i do-dacima stočnoj hrani. Analize su izvršene postupkom u ko-jem se koristi agar prema Kundratu (Merck, Njemačka) i suspenzija spora Geobacillus stearothermophilus (Merck, Njemačka). To je osjetljiv test za brzo ali kvalitativno doka-zivanje rezidua antibiotika koji se temelji na inhibiciji rasta navedenog mikroorganizma uzrokovanog prisutnošću anti-biotika. Kad inhibitor nije prisutan u uzorku, inkubacijom na 65 °C spore će rasti, umnožavati se i fermentirati glukozu prisutnu u podlozi do kiseline, što uzrokuje promjenu ljubičaste boje agara u žutu (Slika 1 i Slika 2). Agar se otapa u destiliranoj vodi, sterilizira autoklaviranjem na 121 °C kroz 20 minuta, a

Vesna Jaki, dr. vet. med., Hrvatski veterinarski institut, Veterinarski zavod Križevci, Zakmardijeva 10, 48260 Križevci, Hrvatska; tel: ++385 48 681 416; fax: ++385 48 681 944; e-mail: [email protected]

NALAZ OSTATAKA ANTIMIKROBNIH TVARI U HRANI ZA ŽIVOTINJE I SIROVINAMA ZA NJIHOVU PRIPREMU UPORABOM SCREENING TESTA 197

pH prilagodi na 6,8±0.2. Kad se medij ohladi na 50 °C, doda se suspenzija spora koja sadrži 108 cfu/ml Geobacillus stearothermophilus i razlije se u Petri ploče. Nakon što se agar ohladi i očvrsne, pripremljeni uzorak se stavlja na povr-šinu agara, zatim se inkubira u termostatu na 65 °C 3 sata. Kao pozitivni standardi koriste se poznate koncentracije an-tibiotika: oksitetraciklin 30mg, cefaleksin 30mg i strepto-micin 10 mg (Bio-Rad).

Slika 1. Petri ploča sa Kundrat agarom nakon inkubacije; vidi se žuta boja podloge bez zone inhibicije (nema antibiotika) Figure 1. Kundrat test plate, Yellow medium without inhibition zone (negative results)

Slika 2. Petri ploča sa Kundrat agarom nakon inkubacije; ljubičasta boja podloge je zona inhibicije (prisutan antibiotik) Figure 2. Kundrat test plate, Purple medium with inhibition zone (positive results)

Rezultati

U razdoblju od početka 2006. godine do kraja 2008. godine ukupno je pretraženo 319 uzoraka. Udio pojedinih vrsta uzoraka pretraživanih na ostatke antibiotika prikazani su u Grafikonu 1.

74

14

97

121

13

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

gotove smjese

mliječna zamjenica

dodaci stočnoj hrani

hrana za pse i mačke

riblje brašno

Grafikon 1. Broj pojedinih vrsta uzoraka pretraženih na rezidue antibiotika Graf 1. Number of different samples tested for presence of antibiotic residues

NALAZ OSTATAKA ANTIMIKROBNIH TVARI U HRANI ZA ŽIVOTINJE I SIROVINAMA ZA NJIHOVU PRIPREMU UPORABOM SCREENING TESTA 198

Tijekom našeg pretraživanja 6 uzoraka (1,9%) dalo je pozi-tivan rezultat na ostatke antibiotika, što je prikazano u Gra-fikonu 2. Kod pozitivnih uzoraka boja podloge agara ostala je ljubičasta, a zona inhibicije veća od 10 mm. Kod kontrolnih diskova izmjerene zone bile su za oksi-tetraciklin 26 mm, cefaleksin 36-38 mm i streptomicin 24-26 mm.

Grafikon 2. Odnos uzoraka koji su pozitivni na prisustvo osta-taka antibiotika i uzoraka koji su negativni na pri-sustvo ostataka antibiotika

Graf 2. Relation of positive and negative samples

Diskusija i zaključci

Primjena antibakterijskih lijekova u životinja koje se koriste kao hrana za ljude može rezultirati reziduima tih lijekova ako se pri liječenju ne slijedi uputa za doziranje lijeka i trajanje terapije. Rezidui antibiotika negativno utječu na preradu mesa u me-sne prerađevine ili mlijeka u mliječne proizvode (Kozačinski i sur., 2003.). Ostatke štetnih tvari antibiotika, tj. rezidua moguće je utvrditi korištenom screening metodom. Od ukupno pretraženih 319 uzoraka 6 ih je (1,9%) dalo po-zitivan rezultat na rezidue antibiotika. Konfirmacija pozitiv-nih uzoraka nije rađena potvrdnim metodama. Prema poda-cima iz deklaracije proizvoda uzorci u kojima su utvrđeni antibiotici sadržavali su streptomicin i stavljeni su na tržište kao ljekovita hrana za ishranu kunića.

U ostalim uzorcima koji su dostavljani na pretrage nisu dokazani ostaci antibiotika. Ovim testom možemo brzo i jednostavno dokazati prisutnost ili odsutnost ostataka antibiotika u uzorku, ali ne možemo znati o kojem se antibiotiku radi i u kojoj količini je prisutan u uzorku. Zato je kod pozitivnog nalaza potrebna potvrda kvantitativnim analitičkim metodama da bi se pozitivni uzorak smatrao neispravnim. Preduvjet učinkovite zaštite zdravlja ljudi od štetnih ostataka u namirnicama životinjskog podrijetla su: poštivanje pro-pisanih karencija, sustavni nadzor antibiotika u stočnoj hrani i sirovinama, te kontrola njihove distribucije i primjene sukladno važećim propisima Republike Hrvatske.

Literatura

Koenen-Dierick, K., L. Okerman, L. De Zutter, J. M. Degroodt, J. Van Hoof, S. Srebrnik (1995.): A one- plate microbiological screening test for antibiotic residue testing in kidney tissue and meat: an alternative to the EEC four-plate method? Food Additives and Contaminants, Vol. 12, No 1, 77-82.

Kozačinski, L., M. Hadžiosmanović, Ž. Cvrtila, D. Bažulić, J. Sapunar Postužnik (2003.): Nalaz ostataka inhibitornih tvari u mesu peradi. Zbornik radova, Peradarski dani 2003., 115-117.

Mulalić, J., L. Kozačinski, A. Benussi Skukan, I. Filipović, M. Runje (2006.): Metode utvrđivanja ostataka antibiotika i sulfo-namida u mesu. Meso Vol. VIII, 37-42.

Myllyniemi A. (2004.): Development of microbiological methods for the detection and identification of antimicrobial residues in meat. Academic dissertation

Pravilnik o dodacima hrani za životinje (NN 9/2007.) Pravilnik o najvećim dopuštenim količinama rezidua veterinarsko-

medicinskih proizvoda u hrani životinjskog podrijetla (NN 75/2008.)

Pravilnik o uvjetima za proizvodnju, stavljanje na tržište i upotrebu ljekovite hrane za životinje (NN 101/2005.)

Stead S., M. Sharman, J. A. Tarbin, E. Gibson, S. Richmond, J. Stark, E. Geijp (2004.): Meeting maximum residue limits: an improved screening technique for the rapid detection of antimicrobial residues in animal food products. Food Additives and Contaminants, Vol. 21, No 3, 216-221.

Werber D., T. Bergann (1997.): Detection of antibiotic residues in sloughter animals by using an ampedimetric method. Fleischwirtschaft 77 (6), 556-559.

FINDINGS OF RESIDUES IN FEED AND RAW MATERIAL FOR FEED PREPARATION USING SCREENING TEST

Summary

The paper presents the results of the determination of antibiotic residues in samples of feed, raw material for feed preparation and feed for pets. From January 2006 until December 2008, 319 samples were tested for the presence of antibiotic residues. Antibiotic residues were found in six (1,9%) samples. The microbiological method with Kundrat agar and Geobacillus stearothermophilus was used for the testing of antibiotic residues. Although this screening test is very suitable for detecting antibiotic residues in feed and raw material for feed preparation, confirmation test methods are still necessary for a final decision.

Key words: feed, antibiotic residues


UČINAK PROBIOTIKA NA PROIZVODNE REZULTATE BROJLERSKIH PILIĆA

Aida Kavazović, Abdulah Gagić, Emina Rešidbegović, Fahira Alibegović-Zečić, Teufik Goletić, Ćazim Crnkić, Aida Kustura, Almira Softić

Zavod za zootehniku i peradarstvo, Univerzitet u Sarajevu, Veterinarski fakultet Sarajevo, Sarajevo, Bosna i Hercegovina

Sažetak

Cilj istraživanja bio je ispitati utjecaj dodatka komercijalnog (Probios®) i pokusnog (kultura L. acidophilus izolirana iz acidofilnog mlijeka, inaktivirani pekarski kvasac, vitamin C i laktoza) probiotičkog preparata putem vode za piće na relevantne proizvodne parametre kod brojlerskih pilića u tovu. Ukupno 105 jednodnevnih pilića provenijencije Cobb 500 podijeljeno je u tri skupine (dvije pokusne i jedna kontrolna). Probiotički tretman obje pokusne skupine pilića provođen je prva tri dana života i trodnevno pri vakcinacijama pilića (dan prije, na dan i dan nakon vakcinacije). Tijekom cijelog pokusnog perioda pilići su hranu i vodu dobivali ad libitum, pri čemu su hranjeni s tri vrste krmnih smjesa (starter, grover i finišer). Korištenje eksperimentalnog i komercijalnog probiotika rezultiralo je na kraju tova od 42 dana povećanjem prosječne tjelesne mase i prirasta te boljom konverzijom hrane. Iskazano kroz vrijednosti proizvodnog indeksa (EPI), najbolje proizvodne rezultate tova ostvarili su pilići tretirani eksperimentalnim probiotikom. Pilići pokusnih skupina ostvarili su veću prosječnu masu obrađenog trupa i bolji randman u odnosu na piliće kontrolne skupine. Klučne riječi: probiotici, brojlerski pilići, tov, proizvodni rezultati Uvod

Uspješnost proizvodnje brojlerskog mesa utemeljena je na odabiru najboljih komercijalnih hibrida, provođenju odgova-rajućih tehnoloških rješenja smještaja i ishrane, te primjeni nespecifičnih i specifičnih mjera zdravstvene zaštite proiz-vodnih jedinki. U cilju poboljšanja proizvodnih rezultata i očuvanja dobrog zdravstvenog stanja brojlera koriste se različiti biostimulatori i neterapeutski dodaci stočnoj hrani. Dugi niz godina u tu svrhu su primjenjivani antibiotici. Me-đutim, njihovo korištenje rezultiralo je brojnim negativnim učincima izraženim prije svega u rezistenciji mikroorgani-zama i zadržavanju rezidua u mesu, što se potvrdilo kao moguće štetno po ljude. Navedene činjenice dovele su do in-tenziviranja istraživačkog rada na iznalaženju adekvatnih zamjena za antibiotike kao stimulatore rasta, čija bi upotreba bila ekonomski isplativa i koji ne bi imali štetne posljedice po ljudsko zdravlje. Kao moguća prihvatljiva alternativa u tom smislu duži se niz godina koriste probiotici. Probiotici su "jedna ili miješana kultura živih mikroorgani-zama koji korisno djeluju na domaćina poboljšanjem oso-bina vlastite mikroflore" (Havenar i sur., 1992.). Kao mi-krobni probiotici koriste se bakterije iz rodova Lacto-

bacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Enterococcus, Pediococcus, a zajedno s Bacillus spp., kvascima (Saccha-romyces cerevisiae) i filamentoznim gljivicama (Aspergillus oryzae, Candida pintolopesii) glavna su komponenta pro-biotičkih preparata koji se najčešće koriste u ishrani farmskih životinja (Guillot J. F.,1990.; Fuller R.,1999.). Dodavanjem probiotičkih preparata mogu se ostvarati poten-cijalne koristi za peradarsku proizvodnju prije svega kroz poboljšanje tjelesne mase i efikasnost iskorištavanja hrane. Brojni su radovi koji potvrđuju pozitivne učinke primjene probiotičkih sredstava na proizvodne parametre (prirast, tje-lesna masa, randman, utrošak hrane, konverzija) i zdravlje kod brojlera. Primjena probiotika Probios® (L. acidophilus i drugi lakto-bacili), sa ili bez dodatka antibiotika, u hrani za brojlerske piliće provenijencije Cobb tijekom prva tri tjedna života, rezultira povećanjem tjelesne mase, ali ne i poboljšanjem konverzije hrane kod tretiranih jedinki (Fethiere i Miles, 1987.). Ispitivanjem utjecaja dodavanja različitih količina (0,05%, 0,10% i 0,15%) Lactobacillus kultura izoliranih iz crijeva kokošaka na proizvodne rezultate kod brojlerskih pilića utvrđeno je značajno (p<0,05) poboljšanje tjelesne mase i konverzije hrane 21. i 42. dana tova kod pilića s

Dr. sc Aida Kavazović, Veterinarski fakultet Sarajevo, Zmaja od Bosne 90, 71000 Sarajevo, Bosna i Hercegovina; tel/fax: ++387 33 61 88 32, e-mail: [email protected]

UČINAK PROBIOTIKA NA PROIZVODNE REZULTATE BROJLERSKIH PILIĆA 200

najvećim sadržajem probiotičkih bakterija, kako u odnosu na kontrolne grupe brojlera, tako i u odnosu na jedinke čiji je obrok sadržavao samo 0,05% i 0,10% Lactobacillus kultura (Jin i sur., 1998.). Vicente i sur. (2007.) navode da je primje-nom probiotika koji sadrži Lactobacillus spp. u proizvodnim uvjetima, uz povećanje tjelesne mase za 2,06%, kod tre-tiranih pilića ostvarena i bolja konverzija hrane za 3,5%. Značajno (p<0,01) povećanje konzumacije hrane i značajno bolju konverziju na kraju tova utvrdili su Aftahi i sur. (2006.) kod pilića tretiranih sa 5 g jogurta/l vode u odnosu na kontrolnu grupu. Sultan i sur. (2006.) navode manju konzumaciju hrane i značajno bolju konverziju tijekom perioda tova kod pilića koji su dobivali 5ml jogurta/l vode u usporedbi sa kontrolnom i grupom tretiranom probiotikom (Protexin). Pozitivni učinci na tjelesnu masu i konverziju hrane, ali ne i na kvalitetu trupova kod pilića u tovu, ostvareni su tijekom eksperimentalnih ispitivanja zamjene flavomycina u starter i grover smjesama s probiotčkim mikroorganizmima (L. plan-tarum, S. faecium, S. cerevisiae). Osim toga, utvrđen je i za 4% niži mortalitet na kraju tova u odnosu na tehnološke normative (Brzoska i sur., 1999.). Primjena probiotika Vebac koji sadrži Enterococcus faecium M-74 u vodi za piće kod brojlera tijekom 42 dana tova rezultirala je, u odnosu kontrolnu grupu, povećanjem žive mase tijela pilića za 10,8%, smanjenjem konverzije hrane za 6,44% i skraćenjem perioda tova za 0,6 tjedana (Ivanković i sur., 1999.). Nakon dva provedena eksperimenta Onifade i sur. (1999.) utvrdili su da dodatak S. cerevisiae u obroku poboljšava rast i težinu trupova uz istovremeno smanjenje odlaganja abdominalne masti. Upotreba aktivnog pekarskog kvasca, vitamina C i laktoze u tretmanima peradi odražava se uglavnom pozitivno, kako na proizvodne rezultate i povećanje imuniteta, tako i u preveni-ranju infekcija patogenim mikroorganizmima. Ispitivanjem probiotičkih sredstava pripremljenih od pekarskog kvasca, vitamina C i laktoze kod peradi u eksperimentalnim i pro-izvodnim uvjetima bavili su se mnogi autori, koji su potvr-dili pozitivne efekte njihove primjene (Gagić i sur., 2003.; Sivro, 1998.; Softić i sur., 2003.; Kavazović i sur., 2004.). Kontinuirano, programsko korištenje probiotskog sredstva pripremljenog od inaktiviranog pekarskog kvasca, vitamina C i laktoze kod nesilica konzumnih jaja rezultiralo je 2,96% većom prosječnom nesivosti i boljom težinskom strukturom jaja u usporedbi s kontrolnom, netretiranom grupom nesilica (Sivro, 1998.). Nakon korištenja istog probiotičkog sredstva kod brojlerskih pilića provenijencije Cobb 500 tijekom tova od 42 dana u eksperimentalnim uvjetima, utvrđeno je pove-ćanje dužine sternuma i obujma grudi tretiranih brojlera (Softić i sur., 2003.), povećanje završne tjelesne mase za 4,89%, smanjenje konverzije hrane za 2,36% i povećanje proizvodnog broja za 19,35% u odnosu na kontrolne grupe pilića (Kavazović i sur., 2004.). Razmatrajući rezultate dosadašnjih istraživanja upotrebe probiotika, ali i na temelju vlastitih saznanja, odlučili smo pripremiti pokusno probiotičko sredstvo (kultura L. acido-philus izolirana iz acidofilnog mlijeka, inaktivirani pekarski kvasac, vitamin C i laktoza), te utvrditi učinke njegove primjene.

Osnovni cilj istraživanja bio je ispitati utjecaj dodatka ko-mercijalnog i pokusnog probiotičkog preparata putem vode za piće na relevantne proizvodne parametre kod brojlerskih pilića u tovu.

Materijal i metode

Istraživanja su provedena na tovnim pilićima provenijencije Cobb 500. Za pokusni tov pilića primijenjen je podni sistem smještaja. Odabrana tehnička i tehnološka rješenja smješta-ja, te ishrana i napajanje pilića bili su u skladu sa preporu-kama selekcionara za podni sistem držanja (Anon., 2003.). Tov pilića trajao je 42 dana, a tijekom cijelog perioda tova hranu i vodu pilići su dobivali ad libitum. Istraživanje je provedeno na ukupno 105 pilića podijeljenih u tri skupine: dvije pokusne (P1 i P2) i jednu kontrolnu skupinu (K). Svaka je brojala po 35 pilića koji su pri useljenju bili ujednačeni u odnosu na tjelesnu masu. Pokusna skupina 1 (P1) dobivala je komercijalni probiotik Probios®, topivi prašak za perad firme Chr. HANSEN A/S, Danska u vodi za piće prema preporuci proizvođača (1mg po piletu pri svakom tretmanu), a pokusna skupina 2 (P2) eksperimentalni probiotik pripremljen od dvije odvojeno pri-premljene komponente. Komponenta koja je sadržavala inaktivirani pekarski kvasac, vitamin C i laktozu davana je u količini od 0.3g po piletu, a kultura L. acidophilus izolirana iz acidofilnog mlijeka aplicirana je u količini od 1ml pri-premljene suspenzije (106 CFU/ml) po piletu u vodi za piće pri svakom tretmanu. Kontrolnu skupinu predstavljali su pilići bez probiotičkog tretmana. Probiotički tretman obje pokusne skupine pilića dobile su u prva tri dana života i tro-dnevno pri vakcinacijama pilića (dan prije, na dan vakci-nacije i dan nakon vakcinacije). Krmne smjese korištene tijekom tova pripremljene su na temelju kemijski analiziranih krmiva i izradi receptura u skladu s normativno-nutritivnim preporukama za piliće provenijencije Cobb 500 (Anon., 2003.). Tijekom provođenja pokusa praćeni su sljedeći proizvodni pokazatelji: tjelesna masa i prirast tjelesne mase pilića, utro-šak i konverzija hrane, proizvodni indeks (European Pro-duction Index- EPI) i randman mesa (izračunat nakon klanja pilića iz odnosa mase ohlađenog trupa bez jestivih iznutrica (jetra, srce, želudac i abdominalna mast) i tjelesne mase prije klanja. Za obradu dobivenih podataka korišten je statistički program Minitab Student Release® 14 for Windows (MINITAB® Handbook, 2005.). Rezultati su obrađeni analizom varijance (One-way ANOVA), a za testiranje razlika srednjih vrijed-nosti korišten je Tukey test (Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals). Statistička značajnost određena je na nivou p<0,05.


Prosječna tjelesna masa i prirast tjelesne mase među naj-važnijim su proizvodnim parametrima koji pokazuju uspješ-nost tova i prikazani su u grafikonima 1 i 2. Na početku tova


prosječna tjelesna masa pilića bila je ujednačena u svim skupinama i kretala se od 46,19 do 47,03 g. Analizom rezultata tvrđeno je da su najbolju prosječnu tjelesnu masu na kraju tova postigli pilići pokusne P2 skupine (2.424,35 g) - za 2,20% više u odnosu na piliće kontrolne K skupine (2370,85 g). I pilići pokusne P1 skupine imali su veću

prosječnu tjelesnu masu (2377,81 g) u odnosu na kontrolne jedinke (Tablica 4). U Tablici 1 prikazani su statistički parametri prosječne tjelesne mase u završnoj fazi tova pilića. Analizom varijance nisu utvrđene statistički značajne razlike (p<0,05) između srednjih vrijednosti tjelesne mase pilića 35. i 42. dana.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

2600

Tjel

esna

mas

a (g

)

1 7 14 21 28 35 42

Dob pilića (dana)

K

P1

P2

Grafikon 1. Prosječna tjelesna masa pilića (g) tijekom tova Graph 1. Mean body weight of chicks (g) during fattening

Tablica 1. Statistički pokazatelji prosječne tjelesne mase pilića (g) u završnoj fazi tova Table 1. Statistical parameters of mean body weight in finisher phase of fattening

Dob pilića (dana) Parametar K P1 P2 Pooled StDev x 1.847,67 1.832,24 1.850,56 204,8

SE 32,06 39,17 33,40 S 189,67 228,40 194,73

35.

CV 10,27 12,47 10,52 x 2.370,85 2.377,81 2.424,35 264,8

SE 38,27 53,14 43,26 S 226,41 309,91 252,24

42.

CV 9,55 13,03 10,40

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

Prira

st tje

lesne

mas

e(g)

1 do 7 1 do 14 1 do 21 1 do 28 1do 35 1 do 42

Dana tova

K

P1

P2

Grafikon 2. Prosječan prirast tjelesne mase pilića (g) tijekom tova Graph 2. Mean body weight gain of chicks (g) during fattening


Vrijednosti prirasta tjelesne mase pilića iskazane kao ukupni ili kumulativni prirast pokazuju da su pilići pokusne P2 skupine ostvarili najbolji prosječan prirast tjelesne mase na kraju tova od 2376,17 g, a slijede pilići pokusne P1 skupine (2330,26 g). Pilići kontrolne K skupine su ostvarili najslabiji prosječan prirast tjelesne mase od 2323,82 g (Tablica 4). Slično našim rezultatima, pozitivne, ali ne i statistički zna-čajne učinke probiotika na tjelesnu masu pilića tijekom tova, potvrdili su brojni autori (Brzoska i sur., 1999.; Onifade i sur., 1999.; Djouvinov i sur., 2005.). Primjena probiotika Vebac koji sadrži Enterococcus faecium M-74 u vodi za piće kod brojlerskih pilića tijekom 42 dana tova prema na-vodima Ivanković i sur. (1999.) dovela je do povećanja završne tjelesne mase za 10,8% . Pozitivno djelovanje kulture L. acidophilus (izolirane iz aci-dofilnog mlijeka), koju je sadržavalo eksperimentalno pro-biotičko sredstvo, u skladu je s istraživanjima Aftahi i sur. (2006.) i Sultan i sur. (2006.), koji su ispitivali utjecaj

jogurta kao probiotika na proizvodne rezultate tovnih pilića. Pozitivne učinke primjene probiotičkog sredstva koje je sadržavalo inaktivirani pekarski kvasac, vitamin C i laktozu kod pilića u tovu utvrdili su Softić i sur. (2003.), te Kava-zović i sur. (2004.). Iz Tablice 2 vidljivo je da su pilići kontrolne K skupine kon-zumirali najviše hrane (4350,19 g). Najmanji kumulativni utrošak hrane na kraju tova uvrdili smo kod pilića pokusne P1 (4251,88 g), a zatim kod pilića pokusne P2 skupine (4293,89 g), što je bilo za 2,26%, odnosno 1,29% manje u odnosu na piliće kontrolne skupine. Konverzija hrane tije-kom prva dva tjedna tova bila je bolja kod jedinki kontrolne K skupine, da bi idućih tjedana i taj pokazatelj bio u korist jedinki iz pokusnih skupina. Tako su na kraju tova najbolju konverziju hrane postigli pilići pokusne P2 skupine (1,81), a zatim pilići pokusne P1 skupine (1,82), što je bilo za 3,21%, odnosno 2,67% bolje u usporedbi s pilićima kontrolne K skupine koji su ostvarili konverziju od 1,87 (Tablice 3).

Tablica 2. Utrošak hrane (g/jedinki) tokom perioda tova Table 2. Feed consumption (g/chicks) during fattening

Dana tova K P1 P2 1-7 171,09 171,85 165,78 % 100,0 100,44 96,90

1-14 569,31 558,28 559,73 % 100,0 98,06 98,32

1-21 1.211,82 1.169,77 1.177,88 % 100,0 96,53 97,20

1-28 2.103,14 2.026,87 2.067,64 % 100,0 96,37 98,31

1-35 3.117,62 3.018,16 3.063,33 % 100,0 96,81 98,26

1-42 4.350,19 4.251,88 4.293,89 % 100,0 97,74 98,71

Tablica 3. Konverzija hrane (g/g) tokom tova Table 3. Feed conversion (g/g) during fattening

Dana tova K P1 P2 Konverzija hrane, g/g

1-7 X 1,38 1,45 1,42 % 100,0 105,07 102,90

1-14 X 1,51 1,51 1,52 % 100,0 100,0 100,66

1-21 X 1,54 1,49 1,53 % 100,0 96,75 99,35

1-28 X 1,64 1,60 1,58 % 100,0 97,56 96,34

1-35 X 1,73 1,69 1,70 % 100,0 97,69 98,26

1-42 X 1,87 1,82 1,81 % 100,0 97,33 96,79


Analizom rezultata utroška hrane iskazanih kroz pokazatelje konverzije vidljivo je da su na kraju tova pilići pokusnih skupina ostvarili neznatno bolju konverziju hrane, što uz povećanje tjelesne mase i veći prirast ukazuje na pozitivne učinke primjene probiotika i na te proizvodne pokazatelje kod brojlera. Iako tijekom naših istraživanja kod pokusnih pilića na kraju tova nije ostvarena statistički značajno bolja konverzija hrane, dobijeni rezultati jasno sugeriraju da je primjena, kako eksperimentalnog, tako i komercijalnog pro-biotika pozitivno utjecala na navedeni parametar, što je bilo u skladu s afirmativnim navodima većeg broja autora koji su u tom pogledu također potvrdili pozitivne učinke upotrebe probiotičkih sredstava tijekom tova (Jin i sur. 1998.; Abdul-rahim i sur., 1999.; Brzoska i sur., 1999.; Ivanković i sur., 1999.; Zorman-Rojs i sur., 2000.; Zulkifli i sur., 2000.; Djouvinov i sur., 2005.; Aftahi i sur., 2006.; Sultan i sur., 2006.; Vicente i sur., 2007.). Korištenjem probiotičkog sred-stva koje je sadržavalo inaktivirani pekarski kvasac, vitamin C i laktozu Kavazović i sur. (2004.) su utvrdili za 2,36% bolju konverziju hrane kod probiotski tretiranih pilića pro-venijencije Cobb 500. Najbolje komercijalne učinke tova iskazane kroz proizvodni indeks ostvarili su pilići pokusne P2 skupine (310), dok je vrijednost tog pokazatelja kod pilića druge dvije skupine bila gotovo identična – 301 za P1 i 302 za K skupinu (Tablica 4).

Povećanje proizvodnog broja za 19,35% u odnosu na kon-trolnu skupinu pilića utvrđeno je (Kavazović i sur., 2004.) kod pilića u tovu koji su dobivali probiotičko sredstvo pripremljeno od inaktiviranog pekarskog kvasca, vitamina C i laktoze. Timmerman i sur. (2006.) su u četiri pokusa (tri provedena u proizvodnim i jedan u eksperimentalnim uvje-tima) utvrdili za 1,84-8,70% veći proizvodni indeks kod probioticki tretiranih pilića. Najveći proizvodni indeks (321) imali su pilići u pokusu provedenom u eksperimentalnim uvjetima. Vrijednost proizvodnog indeksa u tri proizvodna pokusa kretala se od 249 do 269. Nakon klanja pilića, hlađenja i obrade izvršeno je pojedi-načno vaganje obrađenih trupova. Na taj način utvrđena je masa trupova bez jestivih iznutrica (jetra, srce, želudac i abdominalna mast), a stavljanjem dobijenih vrijednosti u međuodnos s tjelesnom masom pilića prije klanja izračunati su randmani mesa bez jestivih iznutrica. Najveću prosječnu masu obrađenih trupova nakon klanja imale su jedinke pokusnih skupina - P2 skupine (1736,77 g) i P1 skupine (1709,41 g). Jedinke kontrolne K skupine ostva-rile su najmanju prosječnu masu obrađenih trupova - 1692,86 g - uz najnižu standardnu devijaciju i koeficijent varijacije. Prosječna masa obrađenih trupova brojlera iz pokusnih skupina bila je veća za 2,53%, odnosno za 0,97 % u odnosu na kontrolnu skupinu pilića, ali bez statističke opravdanosti utvrđenih razlika (Tablica 5).

Tablica 4. Rezultati tova pilića od 1. - 42. dana Table 4. Fattening results of 1st – 42nd day

Proizvodni pokazatelj K P1 P2 Broj pilića 1. dan 35 35 35 Broj pilića 42. dan 35 34 34 Prosječna tjelesna masa 1.dan (g) 47,03 46,19 46,79 Prosječna tjelesna masa 42.dan (g) 2.370,85 2377,81 2.424,35 Prosječan prirast tjelesne mase (g) 2.323,82 2.330,26 2.376,17 Prosječan utrošak hrane (g) 4.350,19 4.251,88 4.293,89 Dnevna konzumacija (g) 103,58 101,24 102,23 Konverzija (g/g) 1,87 1,82 1,81 Dnevni prirast (g) 55,33 55,48 56,58 Mortalitet % 0 2,88 2,88 Proizvodni indeks (EPI) 302 301 310 Tablica 5. Statistički pokazatelji mase obrađenih trupova Table 5. Statistical parameters of carcass wights

Proizvodni pokazatelj K P1 P2 Pooled StDev x 1.692,86 1.709,41 1.736,77 178,4

SE 24,43 36,97 28,94 S 144,54 215,56 168,77

Masa trupa (g)

CV 8,54 12,61 9,72


71,40

71,89

71,64K

P1

P2

Grafikon 3. Randman mesa (%) nakon 42 dana tova Graph 3. Carcass yield (%) at 42nd day of fattening Utvrđene vrijednosti randmana mesa (Grafikon 3) bile su ujednačene kod sve tri skupine pilića (71,4% - 71,89%) ali ipak neznatno veće u u korist pokusnih skupina. Premda ostvareni u diskontinuiranom probiotičkom tret-manu pilića, naši se rezultati slažu s navodima Abdollahija i sur. (2003.), prema kojima dodatak probiotika BioPlus 2B u količini od 1000 i 1200g/toni smjese tijekom tova od 42 dana rezultira povećanjem randmana tretiranih pilića (70,16% i 70,30%) u odnosu na randman od 68,49%,utvrđen kod kontrolnih netretiranih pilića. I Djouvinov i sur. (2005.) su utvrdili da kontinuirano dodavanje probiotika Lactina® u tovnim smjesama za hibridne brojlere Ross 500 na kraju tova od 42 dana rezultira statistički značajnim povećanjem težine trupova (1420,5 g) i boljim randmanom mesa (70,40%) u odnosu na kontrolne jedinke (1340,0 g, odnosno 68,96%). Statistički značajan pozitivan utjecaj na randman mesa (67,82%) utvrdili su Sultan i sur. (2006.) kod pilića tretiranih s 5ml jogurta/l vode u odnosu na vrijednost ovog pokazatelja (62,89%) kod pilića kontrolne, netretirane skupine. Međutim, prema navodima Brzoske i sur. 1999. za-mjenom flavomycina probiotskim mikroorganizmima (L. plantarum, S. faecium, S. cerevisiae) u starter i grover smjesama za tovne piliće u eksperimentalnim uvjetima nisu utvrđeni pozitivni učinci na kvaliteti trupova.

Zaključci

Korištenje eksperimentalnog probiotika koji je sadržavao kulturu L. acidophilus, inaktivirani pekarski kvasac, vitamin C i laktozu kod brojlera rezultiralo je na kraju tova od 42 dana povećanjem prosječne tjelesne mase i prirasta, te bo-ljom konverzijom hrane. Pilići koji su dobivali komercijalni probiotik Probios® tako-đer su ostvarili na kraju tova od 42 dana bolje proizvodne rezultate (prosječna tjelesna masa, prirast tjelesne mase, konverzija hrane) u odnosu na kontrolnu, netretiranu sku-pinu pilića.

Iskazano vrijednostima proizvodnog indeksa (EPI), najbolje proizvodne rezultate tova ostvarili su pilići pokusne P2 sku-pine, tretirani eksperimentalnim probiotikom. Pilići pokusnih skupina ostvarili su veću prosječnu masu obrađenog trupa i bolji randman u odnosu na piliće kon-trolne skupine.

Literatura

Abdollahi, M. R., A. Kamyab, A. Bazzazzadekan, A. Nik-Khan, A. Z. Shahneh (2003.): Effect of different levels of probiotic on broilers performance. Proc. British Society of Animal Science. http//:www.bsas.org.uk/meetings/annlproc/ Pdf 2003/185.pdf

Abdulrahim, S. M., M. S. Y. Haddadin, N. H. M. Odetallah, R. K. Robinson (1999.): Effect of Lactobacillus acidophilus and zinc bacitracin as dietary additives for broilers chickens. Br Poult Sci. 40:91-94.

Aftahi, A., T. Munim, M. A. Hoque, M. A. Ashraf (2006.): Effect of Yoghurt and Protexin Boost on Broiler Performance. International Journal of Poultry Science 5 (7): 651-655.

Anonymus (2003.): Broiler Management Guide COBB 500, The C.B.C. Ltd.

Brzoska, F., Grzybowski R., Stecka K., Pieszeka M. (1999.): Effect of probiotic microorganisms vs. antibiotics on chicken broiler body weight, carcass yield and carcass quality. Ann. Anim. Sci. – Rocz. Nauk. Zoot., Vol 26, No.4 , 303-315.

Djouvinov, D., Stefanov M., Boicheva S., Vlaikova T. (2005.): Effect of diet formulation on basis of digestible amino acids and supplementation of probiotic on performance of broiler chicks. Trakia Journal of Science, Vol. 3, No. 1, pp 61-69.

Fethiere, R., Miles R. D. (1987.): Intestinal tract weight of chicks fed an antibiotic and probiotic. Nutrition reports International Vol. 36 No.6, 1305-1309.

Fuller, R. (1999.): Probiotics for Farm Animals. In Probiotics A Critical Review. Ed. by Gerald W. Tannock. pp 15-22. Horizon Scientific Press, Wymondham, Engleska

Gagić, A. Kavazović A., Alibegović-Zečić F., Rešidbegović E. (2003.): Primjena probiotika u peradarstvu. Veterinaria 52, 1-4, 205-212, Sarajevo


Guillot, J. F. (1990.): Qu est –ce qu un probiotique. Bulls des GTV 90: 15-19.

Havenar, R., Brink B. T., Huis Veld J. H. H., Fuller R. (1992.): Selection of strains for probiotics se. In: probiotics: The Scientific Basis (Ed. Fller R.), Chapman and Hall, London, 209-224.

Ivanković, S., Kralik G., Milanković Z., Bogut I. (1999.): Effect of ptobiotic Vebac on the growth of broilers. Acta Agraria Kaposvariensis, Vol.3 No 2, 353-360.

Jin, L. Z., Ho Y. W., Abdullah N., Jalaludin S. (1998.): Growth Performance, Intestinal Microbial Populations, and Serum Cholesterol of Broilers Fed Diets Containing Lactobacillus Cultures. Poultry Sci. 77:1259-1265.

Kavazović, A., Sivro Š., Rešidbegović E., Alibegović-Zečić F., Gagić A. (2004.): Utjecaj probiotika na proizvodne rezultate tovnih pilića provenijencije Cobb. Krmiva 46, 3; 135-139.

MINITAB®Handbook (2005.): Student Release 14 for Windows. Statistical Softwer for Education. Minitab Inc.

Onifade, A. A., Odunsi A. A., Babatunde G. M., Olrede B. R., Muma E. (1999.): Comparison of the supplemental effects of Saccharomyces cerevisiae and antibiotics in low protein and high fibre diets fed to broiler chickens. Arch Tierernahr. 52(1): 29-39.

Sivro, Š. (1998.): Korištenje probiotika u profilaksi proizvodnje konzumnih jaja. Magistarski rad. Sarajevo

Softić, A., Gagić A., Kustura A., Goletić T., Alibegović-Zečić F., Kavazović Aida, Rešidbegović E. (2003.): Probiotiski učinak na rast pojedinih dijelova tijela tovnih pilića. Veterinaria 52, 1-4, 21-26.

Sultan, A. Durrani F. R., Suhail S. M., Ismail M., Durrani Z., Naila Chand (2006.): Comparative Effect of Yogurt as Probioticon the Performance of Broiler Chicks. Pak. J. Biol. Sci., 9 (1), 88-92.

Timmerman, H. M., Veldman A., van den Elsen E., Rombouts F. M., Beynen A. C. (2006.): Mortality and growth Performance of Broilers Given Drinking Water Supplemented with Chicken-Specific Probiotics. Poultry Sci. 85: 1383-1388.

Vicente, J. L., Avina L., Torres-Rodriguez A., Hargis B., Tellez G. (2007.): Effect of Lactobacillus Spp - Based Probiotic Culture Product on Broiler Chicks Performance under Commercial Conditions. Inter. J. Poult. Sci. 6 (3): 154-156.

Zorman-Rojs, O., Jurišić R., Marčić V., Mrzel I. (2000.): Some effects of AVIGUARD on commercial broiler chickens in field conditions. 1st Symposium of Croatian Branch of World Veterinary Poultry Association with International Partici-pation, Šibenik

Zulkifli, N., Abdullah N., Azrin M., Y. W. Ho (2000.): Growth performance and immune response of two commercial broiler strains fed diets containing Lactobacillus cultures and oxytetracycline under heat stress conditions. Br Poult Sci. 41: 593-597.

EFFECT OF PROBIOTICS ON PRODUCTION RESULTS OF BROILER CHICKS

Summary

The aim of this study was to evaluate the effects on relevant production results when commercial (Probios®) and experimental (culture L. acidophilus, inactivate bakery yeast, vitamin C and lactose) probiotic preparation were added to drinking water of broiler chicks during fattening. The experiment was conducted on 105 chicks of the Cobb 500 strain which were divided into three groups (two experimental and one control group) through a 42 days fattening period. Feed and water were offered ad libitum throughout the whole experimental period. The chicks were fed by three kinds of feed mixture (starter, grower and finisher). At the end of the 42 days fattening period it was shown that addition of experimental and commercial probiotics improved the mean body weight, gain of body weight and FCR. The best production index (EPI) was obtained in chicks treated by experimental probiotics. Treatment with experimental and commercial probiotic preparation resulted in increasing of the mean carcass weight and better carcass yield compared to the control group, too. Key words: probiotic, broiler chicks, fattening, production results


ZDRAVLJE CRIJEVA U PERADI

Milivoj Mikec1, Zdenko Biđin2, Mirta Balenović1

1 Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska 2 Zavod za bolesti peradi s klinikom, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska

Sažetak

Sluznica želučano-crijevnog trakta u peradi najizloženija je površina organizma za djelovanje vanjskih štetnih noksi koje mogu vrlo brzo ugroziti njihovo zdravlje i proizvodnost. Crijevna stijenka je zapravo selektivna barijera između tkiva ptice i sadržaja crijevnog lumena, a sastavljena je od fizičkih, kemijskih, imunoloških i mikrobijelnih komponenti. Površina crijeva prekrivena je tankim i visokoselektivnim epitelnim slojem koji je zaštićen od štetnih tvari iz okoliša i hrane urođenim i adaptivnim obrambenim mehanizmima. Taj mehanizam osigurava integritet crijevne sluznice da bi ona obnašala svoju temeljnu funkciju, a to je apsorpcija nutrienata i kvalitetna imunosna reakcija. Očuvati crijeva zdravima veoma je važna zadaća stručnjaka u peradarskoj proizvodnji, poglavito nakon što je uvedena zabrana uporabe antibiotskih promotora rasta. Ključne riječi: perad, crijeva, zdravlje, proizvodnost Uvod Iskorištenost ingestirane hrane u gastrointestinalnom traktu uvelike utječe na proizvodne rezultate peradi. U postoje-ćim aglomeracijskim proizvodnim uvjetima zdravlje pro-bavnog trakta, a poglavito crijeva, na velikoj je kušnji i teško ga je očuvati. Sluznica probavnog trakta najizloženi-ja je površina raznim noksama iz okoliša, kojih u postoje-ćim uvjetima proizvodnje ima jako puno. Veliki broj bak-terija, virusa, gljivica, plijesni i toksina svakodnevno prolazi kroz probavni trakt peradi i može izazvati upalna stanja s oštećenjem crijevnog epitela, što se očituje u slabi-joj apsorpciji nutrienata i oslabljenom imunosnom statusu životinje. Crijeva su dio probavnog trakta u kojem se konzumirana hrana probavlja i apsorbira. Ingest se razgrađuje pomoću probavnih sokova jetre, gušterače i samog crijeva, dok se apsorpcija obnaša putem visokospecijaliziranih i selektiv-nih epitelnih stanica crijeva. Dužina i težina crijeva u raz-ličitih kategorija peradi prilično se razlikuje, pa tako nesilice, za razliku od brojlera, imaju kraća i lakša crijeva. Tanko crijevo u nesilica pokriva 78% ukupne dužine probavnog trakta, dok je ono u brojlera 83%, a u purana 86% (Deaton i sur., 1985.) Svakako valja spomenuti vrlo važnu ulogu crijeva kao imunosnog organa. Zapravo, cri-jeva su jako dobro opskrbljena limfoidnim tkivom i osta-

lim imunosnim stanicama, pa u sisavaca tvore gotovo 80% imunosnog kapaciteta, dok je to u peradi nešto manje. Razvijeni crijevni sustav ima veoma postojanu vezu izme-đu postojeće mikroflore, imunosnih medijatora i epitelnih stanica (Berg, 1996.) Epitelni sloj crijeva karakterizira ve-lik obrtaj stanica i stalna proizvodnja zaštitne obloge sluz-nice. Ti morfološki i fiziološki mehanizmi čine velik dio urođene obrane organizma od prijetnji iz lumena crijeva. Barijera je još pojačana stečenim imunosnim odgovorom sluznice, kojjeg reguliraju i kontroliraju T i B stanice (Deplancke i Gaskins, 2001.). Zabrana uporabe antibiotika i ostalih promotora rasta koja je u posljednje vrijeme stu-pila na snagu vjerojatno će utjecati na promjenu mikro-biološke slike crijeva komercijalne peradi i njihovog oko-liša, pa je svrha ovog rada upozoriti na fiziološke, mikro-bijelne i imunološke crijevne resurse u smislu očuvanja njihova zdravlja i proizvodnosti.

Razvoj crijeva Tijekom postembrionalnog razvitka crijevna se masa u prvim danima života pileta povećava brže od tjelesne, no to se ne može reći i za enzimatsku crijevnu aktivnost, koja se u cijelosti uspostavlja tek u trećem tjednu života (Sklan, 2001.). Najveći porast crijeva bilježi se u pilića u petom i šestom danu, dok kod purića on nastupa kasnije. Dužina se najbrže povećava u jejunumu i ileumu, dok je porast mase

Dr. sc. Milivoj Mikec, dr.vet.med., Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; Tel: ++385 1 2441-392, ++385 1 2441-394; fax: ++385 1 2441-396; E-mail: [email protected]

ZDRAVLJE CRIJEVA U PERADI 207

najveći u duodenumu i jejunumu (Uni i sur., 1999.), što je izravno povezano s porastom sluzničkih struktura. Uspo-redbom morfološkog razvoja crijeva purića s razvojem u pilića utvrđeno je da je rast u purića sporiji nego u pilića (Uni i sur., 1995.). Naime, u pilića se visina resica i dubina kripti naglo povećava nakon leženja i u duodenumu dosižu razvojnu visinu u šestom danu, a u jejunumu i ileumu u 10 danu.. Kod purića su oba pokazatelja u tom vremenu iznosila tek oko 55% vrijednosti u pilića. To je upravo i razlog bržeg porasta pilića u prvim danima života. Valja naglasiti da su vrijednosti crijevnih sluzničnih enzima bile slične. Porast crijevne mase u korelaciji je s početkom hranjenja (Mikec i sur., 2003.), poglavito s količinom ugljikohidrata u hrani (Noy i Sklan, 1999.). Naime, uko-liko je nakon leženja hranjenje odgođeno, porast crijevne mase je znatno sporiji, što se odražava i na porast tjelesne mase. Perad u kasnijoj fazi tova teško može nadoknaditi izgubljeno, jer je poznato da pilići manje tjelesne mase na kraju prvog tjedna života imaju manje tjelesne mase na kraju tovnog ciklusa. Osim toga, odgođeno hranjenje utje-če i na razvitak crijevnog limfatičnog sustava (Bar Shira i sur., 2005.); dokazana je njegova smanjena aktivnost kod uskrate hrane od 72 sata nakon leženja i to u prva dva tjedna života. Dakle, hranu nakon leženja treba što prije ponuditi ukoliko želimo ostvariti dobru proizvodnost i zdravlje pilića.

Imunosni sustav ptičjeg crijeva Organiziranost i imunosni mehanizmi u peradi nalik su onom u sisavaca i pod utjecajem su nasljeđa, hranidbe i okolišnih čimbenika (Sharma, 2003.). Reaktivan i snažan imunosni sustav za intenzivno držanu perad od velike je važnosti zbog načina uzgoja, jer su životinje u takvim okolnostima izložene brzom širenju uzročnika bolesti kroz jato. Limfoidni organi čine glavnu strukturnu kategoriju ptičjeg imunosnog sustava. Fabricijeva burza i Timus pri-marni su limfoidni organi (Qureshi i sur.,1998.), dok su sekundarni rasuti po cijelom tijelu. To su: slezena, koštana srž, Harderova žlijezda i limfoidno tkivo vezano za bronhije i crijeva (Sharma, 2003.). U pilića limfoidno tkivo vezano za crijeva uključuje Fabricijevu burzu, cekalne tonzile, Peyerove ploče i limfoidne nakupine u urodeumu i proktodeumu (Befus i sur., 1980.). Dok nespecifična imu-nost uključuje fizičku prepreku, fagocite i leukocite, spe-cifična je vezana uz stanične i humoralne imunosne me-hanizme, limfocite i njihove sekrete kao što su citokini i protutijela (Didierlaurent i sur., 2002.). Crijevna stijenka je međuprostor između stranih tvari kao što su hrana i mikroflora i organizma ptice. Iako većina tih tvari nije patogena, one mogu poticati imunosnu reakciju, a u prvim danima života i ubrzati razvitak imunocrijevnog sustava (Hughes, 2005.). No, valja reći da učestale i pre-jake imunosne reakcije u probavnom traktu nepovoljno djeluju na iskoristivost hrane i skreću hraniva od proizvod-nosti u smjeru imunosti (Korver, 2006.). Ta činjenica uve-like ukazuje na nužnost očuvanja zdravlja crijeva, budući da velika opterećenost imunosnog sustava za posljedicu ima slabiji prirast zbog određene kompetitivnost između

imunosti i proizvodnosti za neke nutriente. Tako Klasing (2001.) procjenjuje da je potreba za specifičnim hranivima poput lizina i minerala potrebnih za sintezu imunoglobu-lina i proizvodnju limfocita u vrijeme imunosne reakcije povećana za 5 i 18%. No, najveći učinak na dostupnost hranjivim tvarima i kasniji prirast ima smanjeni unos hrane povezan s oslobađanjem postinflamatornih citokina za vrijeme imunosnog odgovora, kao i smanjena apsorpcija hraniva prouzročena imunosnim odgovorom na patogene (Koutsos i Klasing, 2001.).

Prirođena i stečena sluznična imunost Postojanje urođenog i stečenog imuniteta pojačava sposob-nost životinje u njenoj borbi protiv niza antigena. Urođeni imunitet odnosi se na prirodne obrambene mehanizme kao što su fagocitne stanice ili inflamatorni medijatori, a ste-čeni imunitet na prepoznavanje specifičnih antigena. Prirođena sluznična imunost osigurava veoma dobru za-štitu peradi bez prethodnog kontakta s mikroorganizmom. Zapravo, urođeni zaštitni mehanizmi sprečavaju izravnu interakciju mikroorganizma s mukoznim intersticijem, a u to je uključena barijerna uloga čvrsto povezanih epitelnih stanica i izlučivanje antimikrobijelnih tvari kao što su defenzin, cekropin, laktoferin i lizocim na površinu sluz-nice (Madara i sur., 1990.). Te molekule izravno inhibiraju razmnožavanje mikroorganizama i štite epitel sprečavajući adheziju mikroba i zadržavajući antimikrobne peptide i sekretorna protutijela u blizini površine epitela. Budući da crijeva sadržavaju sve elemente imunosnog sustava (T i B stanice, plazma stanice), ona nakon početnog signala prim-ljenog od epitelnih stanica, kontroliraju upalnu reakciju izazvanu virusima, bakterijama ili protozoama, proizvod-njom citokina, interleukina i prostaglandina, dakle daju kompletni imunosni odgovor na infekciju (Yun i sur., 2000.). Jačanje te sposobnosti od najveće je važnosti za očuvanje zdravlja peradi i njihove proizvodnosti. No, kako je prije navedeno, da bi prirast bio što bolji, dobro je imunosni sustav držati ,kolokvijalno rečeno, u mirovanju i mjerama biosigurnosti te ga korištenjem nekih hranidbenih suplemenata (organske kiseline i probiotici) i vakcinaci-jama poštediti od imunosnog stresa (Klasing, 2001.).

Epitelna barijera Crijevne epitelne stanice imaju tri funkcije. Primarna im je zadaća apsorpcija hranjivih tvari iz probavljene hrane. Budući da je sluznica crijeva velika površina koja je u stal-nom kontaktu s okolišnim antigenima, ona je prva crta obrane od ingestiranih patogena. Konačno, epitelne crijev-ne stanice prolaze stalni ciklus stanične smrti i regeneracije uklanjajući one koje su oštećene od probavnih procesa i okolišnim antigenima. Do nedavno se smatralo da su epi-telne stanice u crijevu isključivo odgovorne za održavanje integriteta crijevne barijere, no danas se zna da su one važan regulator prirođene i stečene imunosti. Sluznički epitel probavnog trakta djeluje kao selektivna barijera pro-pusna za hranjive ione i makromolekule, dok zadržava ulaz ingestiranih patogena i normalne crijevne mikroflore. Ta barijera nije samo fizičke prirode već se tu radi o kemi-


kalijama koje one proizvode i koje su štetne za mikroorga-nizme. Dakle, crijevni epitel je prepreka za prodor komen-salnih mikroorganizmima crijevne flore i enteropatogenim bakterijama i virusima. Zaštita samog epitela kao i njegova regeneracija pod utjecajem je mucinskih glikoproteida, koje proizvode vrčaste stanice epitela (Yun i sur., 2000.). No, i ta barijera popušta pred nekim patogenim mikroorga-nizmima koji imaju stečene mehanizme kojima lome uro-đenu obranu domaćina; oni su uglavnom prisutni kod bakterija, a kod virusa nisu poznati. Tako je, primjerice, Salmonella typhimurium otporna na crijevne stresove kao što su pH, kisikova napetost i detergente, a osim toga posjeduje adhezin i invazijski program što joj omugućava prodor kroz epitelnu barijeru (Lucas i Lee, 2000.). Epitelne stanice ne samo da se brane od mikroorganizama aktivaci-jom i proizvodnjom prije spomenutih antimikrobnih tvari već i prizivaju, potaknute mikrobijelnim signalima, mono-cite, makrofage i dendritične stanice, koje pak oslobađa-njem kemokina i citokina privlače dodatne leukocite da uklone infekt (Siero i sur., 2001.). Nije jasno zašto komensali, odnosno stalna crijevna mikroflora, ne pokreće imunosnu reakciju u mukoznom limfoidnom tkivu, iako je za to ponuđeno nekoliko objašnjenja. Prvo je da crijevna mikroflora ima slabe ili nikakve signalizacijske molekule (Berg, 1996.), drugo ukazuje na moguću relativnu nerea-ktivnost epitelnih stanica (Funda i sur., 2001.) i treće da komensali mogu programirati epitelne stanice (Neish i sur., 2000.). Dakle, može se reći da epitelne stanice crijeva u tom segmentu funkcioniraju kao psi čuvari za mukozni imunosni sustav i kao veza između urođene i adaptivne imunosti.

Mikroflora probavnog sustava Mikroflora želučano-crijevnog trakta mješavina je različi-tih mikroorganizama od kojih su bakterije dominantni mikroorganizmi (Gabriel i sur., 2006.). Poznato je da mikroflora uvelike ovisi o vrsti hrane koju, primjerice, uzi-maju tovni pilići, pa se tako kod smjesa temeljenih na ku-kuruzu povećava broj Enterococcusa, kod onih na ječmu Lactobacillusa, onih na zobi Escherichie i Lactococcusa, a kod raženih smjesa povećava se broj Streptococcusa (Apa-jalahti i sur., 2004.). Osim konzumirane smjese, velik utje-caj na mikrofloru ima i način držanja te gustoća naseljeno-sti peradnjaka, dob životinje i zemljopisna lokacija, no valja reći da svaki dio želučano-crijevnog trakta razvija vlastiti jedinstveni mikrobni oblik koji postaje komplek-sniji s dobi kokoši (Richards i sur., 2005.). Za etabliranje crijevne mikroflore najvažniji je postembrionalni brzi po-rast. Nakon leženja je gastrointestinalni trakt sterilan, no već dan nakon toga u cekumu i ileumu nalazimo od deset do sto milijuna stanica po gramu digesta, a taj se broj za-država do dobi od 30 dana. Općenito govoreći, mikro-organizme u gastrointestinalnom traktu dijelimo na korisne i potencijalno patogene. Korisna mikroflora stimulira imu-nosni sustav i inhibira porast škodljivih mikroorganizama (suparničko isključivanje), te je korisna za sintezu vitamina (Jeurissen i sur., 2002.). Obično je to mukozna mikroflora, dakle ona koja je, za razliku od lumenske, vezana uz ente-

rocite i koja ovisi o staničnom i imunitetnom djelovanju. Posebno dobre su bakterije iz roda Lactobaccila i Bifido-bacteria. Sastav hrane i mikroflora crijeva od najveće su važnosti za sluzničnu strukturu i zdravlje, što se očituje u tovne i druge peradi kao dobra proizvodnost. Nepoželjna i prevelika kolonizacija anaerobnih štetnih bakterija, na primjer, vrlo loše utječe na digestiju lipida, ugljikohidrata, proteina i inhibira vitaminsku sintezu. Očigledna je velika važnost korisne mikroflore crijeva za domaćina, pa njen porast i održivost svakako valja poticati i to ne samo uobi-čajenom hranom već i nekim suplementima. Prije svega su to tvari koje poznamo kao prebiotike i probiotike. Radi se o suplementima koji djeluju na porast crijevne mikroflore bilo da je stimuliraju ili da se u crijeva unose žive ko-lonije.

Čimbenici što remete zdravlje crijeva

U lumenu crijeva normalno je da nalazimo hranu i njene sastojke, naseljenu i prolaznu mikrofloru, izlučevine ga-strointestinalnog trakta i s njim povezanih organa. Nor-malna funkcija crijevne stijenke je da omogućava prolaz nutrienata u tijelo i da sprečava ulaz štetnim tvarima iz lumena crijeva. Ta je selektivna barijera sastavljena od fi-zičkih, kemijskih, imunoloških i mikrobijelnih komponen-ti. Raspon čimbenika povezanih uz hranu, okoliš i tehnolo-giju koji mogu oštetiti obujam rasta crijeva, razgradnju i apsorpciju hrane, čime negativno utječu na proizvodnost peradi je širok (Hughes, 2005.). U daljnjem tekstu opisat ću neke važnije.

Hrana Neškrobni polisaharidi dio su smjesa koji svrstavamo u nehranidbene komponente. Sadrže ih gotovo sve žitarice i uglavnom se radi o glukanima i askorbinoksilanima (Iji, 1999.). Uobičajeno svojstvo neškrobnih polisaharida je nji-hova otpornost na probavne enzime i njihova sklonost stvaranju viskoznog ljepljivog crijevnog sadržaja (Choct i Annison, 1992. a, b). Takva viskoznost sadržaja uzrok je probavnih i zdrastvenih problema u peradi jer usporava i smanjuje mogućnost prolaza digesta i apsorpciju hraniva. Povećano vrijeme zadržavanja uzete hrane odražava se bakterijskim naseljavanjem i njihovom aktivnošću u tankom crijevu (Waldenstedt i sur., 2000.). Ječam, pšenica, raž i zob imaju visoke razine neškrobnih polisaharida koji vode povećanoj viskoznosti digesta i njegovom slabijem obujmu pasaže, slabijoj enzimatskoj aktivnosti i probavlji-vosti hrane (Bedford i Schulze, 1998.). U posljednje vri-jeme zbog toga se u smjese ugrađuju egzogeni enzimi (glu-kanaze, xylanaze, galaktozidaze), koji vrlo dobro utječu na smanjenje viskoznosti digesta i anuliraju moguće štetne posljedice. Fizički oblik žitarica u smjesama može poremetiti morfo-loška i fiziološka svojstva crijeva (Brunsgaard, 1998.; Eng-berg i sur., 2004.) , premda veći broj objavljenih radova iz tog područja nije dosljedan. No, ipak se može iz više radova iščitati da završne smjese u tovu, za razliku od onih koje u svom sastavu imaju krupniju strukturu žitarica,


utječu na pojačanu pojavnost nekrotičnog enteritisa i ugi-nuće (Branton i sur., 1987.). Poznato je da hranjenje, na primjer, cijelim zrnevljem pšenice pridonosi boljem raz-voju gastrointestinalnog trakta i utječe povoljno na razvi-tak poželjne crijevne mikroflore (Engberg i sur., 2004.; Taylor i Jones, 2004.). Svihus i sur. (2004.) ne nalaze značajno djelovanje hrane koja je sadržavala cijelu pšenicu na prirast tjelesne mase i učinkovitost prijetvora hrane, ali rezultati pokazuju da su hraniva iz te hrane bila mnogo bolje probavljena nego ona iz smjese s fino mljevenom pšenicom. Isti autor drži da davanje takvog oblika pšenice u smjesi utječe na veći broj želučanih pasaža i bolje izlučivanje gušterače i jetre, vjerojatno zbog potrebe jačeg mljevenja i veće količine enzima da bi se takva hrana bolje razgradila, a taj poticaj istodobno dobro utječe na probavu ostalih ingredijenci u smjesi (Banifield i sur., 2002.). No, Gabrijel i sur. (2003.) zapazili su da smjesa s cijelim zrnima pšenice u tovnih pilića pokusno zaraženih Eimeria tenellom ubrzava njihov razvoj u cekumu, što je znatno umanjilo tjelesni prirast za razliku od pilića koji su dobi-vali smjesu s mljevenom pšenicom. Na temelju opisanih rezultata moglo bi se zaključiti da unos cijele pšenice u smjesu poboljšava funkciju probave ako je gastrointe-stnalni trakt zdrav, ali ako je probavni trakt oštećen, unos cijele pšenice u hranu nije preporučljiv.

Zarazni uzročnici Treba još jednom naglasiti važnost crijevne sluzi, izluče-vina vrčastih stanica uklopljenih u crijevni epitel, koje štite ne samo enterocite od autodigestije i želučane kiseline već i od štetnih noksi, dospjelih u crijevo iz okoliša te putem hrane i vode. U slučaju manje količine sluzi crijevni inte-gritet je jako narušen, epitel biva brzo uništen i imuni sustav biva ugrožen. Dakle, crijevni trakt ima urođene i stečene mehanizme kojima osigurava svoje zdravlje te pri-jetvor i apsorpciju ingestirane hrane. Pod utjecajem nekih od zaraznih čimbenika koji su često u kombinaciji s dje-lovanjem nezaraznih taj mehanizam popušta, što se očituje kao bolest i poremećaj u probavi hrane (Reynolds, 2003.). Već i manje oštećenje crijevnog trakta dovodi do slabije učinkovitosti prijetvora hrane i posljedično manjeg prirasta tjelesne mase. Teža oštećenja bakterijske etiologije kao, primjerice, kod nekrotičnog enteritisa rezultiraju otvore-nom bolešću i visokim uginućem (Porter, 1998.). Za razliku od bakterija koje stvaraju toksine kojima uni-štavaju sluznički epitel crijeva i tako prodiru do krvotoka i limfe, virusi imaju afinitet prema epitelnim stanicama u kriptama koje razaraju pri repliciranju, što znatno umanjuje apsorptivnu površinu crijeva i čija je posljedica slab prirast. U slučajevima crijevnih infekcija (virusnih i bak-terioloških) dolazi do izlučivanja vode i javlja se proljev, što je, ustvari, obrambena reakcija organizma - uzročnik se pokušava otplaviti. Krvavi proljev je posljedica prodora mikroorganizma (bakterija, virus, protozoa) do krvožilja u lamini proprii crijeva, kao primjerice, kod hemoragičnog enteritisa i kokcidioze. Više je vrsta proljeva u peradi, a najčešći su :

- sekrecijski - kao posljedica povećanog izlučivanja klo-rida u kripti koji prikuplja tekućinu u lumen crijeva (vi-rusi i enterotoksini bakterija);

- osmotski - kao posljedica povećanog tlaka u lumenu cri-jeva (višak soli u hrani ili neškrobnih polisaharida koji na sebe navlače vodu);

- eksudativni - proljev koji se javlja kod kokcidioze, histo-monijaze, nekrotičnog enteritisa i u njegovom sadržaju prevladavaju nekrotične stanice i krvavi sadržaj.

Najzastupljeniji uzročnici crijevnih zaraznih bolesti u pe-radi ipak su virusi. U posljednje vrijeme najčešće se spo-minju rotavirusi (McNulty, 2003.), astrovirusi (Reynolds i Schultz-Chery, 2003.), koronavirusi (Guy, 2003.), entero-virusi (Pierson i Fitzgerald, 2003.) i reovirusi (Rosen-berger, 2003.). Posljedice tih infekcija najčešće se svode na smanjen prirast, povećanje konverzije i slabu ujedna-čenost jata (Guy, 1998.). Crijevne virusne zaraze mogu se pojaviti u svih dobnih kategorija peradi, no ipak su naj-zahvaćenije mlađe skupine, a stanje se znatno pogoršava uz pojavu uginuća u jatu ukoliko se bolest zakomplicira s drugim zaraznim uzročnicima i nekim okolišnim čim-benicima. U etiologiji crijevnih bolesti veoma važno mjesto zauzi-maju i mikotoksini koji su označeni kao široko prošireni uzrok gospodarskih gubitaka zbog poremećenog zdravlja i slabije proizvodnosti peradi (Sklan i sur., 2003.). Glavne mikotoksikoze u peradi su trikotecenski mikotoksini (Schiefer i Beasley, 1989.) koji uništavaju crijevni epitel izazivajući krvarenja i nekroze po sluznici sa posljedicom slabijeg prirasta i uginuća. Biogeni amini (histamin, kada-verin), koji se mogu naći u proteinskim proizvodima životinjskog podrijetla, također mogu poremetiti zdravlje crijeva i pokazalo se da su uključeni u sindrom malap-sorpcije (Barnes i sur., 2001.). Vjerojatno najproširenije i najštetnije crijevne zarazne bo-lesti za peradarsku proizvodnju su nekrotični enteritis i kokcidioza, pa ih treba ukratko zasebno obraditi.

Nekrotični enteritis Uzročnik nekrotičnog enteritisa je Clostridium perfrin-gens. Radi se o jako proširenom mikroorganizmu koji mo-že onečistiti sve proizvodne peradarske pogone (Craven i sur., 2001.; 2003.). Lezije crijevne sluznice kod nekrotič-nog enteritisa najteže su od svih bolesti u crijevu. Za nekrozu crijevne sluznice odgovorni su toksini što ih pro-izvodi bakterija (Al-Sheikhly i Truscott, 1977.). Bolest se klinički može očitovati kao akutna i subakutna; dok akutni oblik bolesti prati povećano uginuće, kod subakutnog do-minira slaba probava, smanjen prirast tjelesne mase i povećana konverzija (Kaldhusdal i Hofshagen, 1992.; Hofacre i sur., 2003.). Drži se da je Clostridium perfrin-gens dio normalne crijevne flore u peradi, pa za nastanak bolesti mora postojati predisponirajući čimbenik. Jedan od njih svakako je oštećena sluznica crijeva od kokcidija (Long i sur., 1974.; McDevitt i sur., 2006.), dok se u purana uz kokcidiju spominju i askaridije i hemoragični enteritis (Norton i sur., 1992.; Droual i sur., 1995.). Neki


istraživači ukazuju na čvrstu povezanost određenih sasto-jaka hrane s pojavom nekrotičnog enteritisa. Visoka razina ribljeg brašna (Truscott i Al-Sheikhly, 1977.), pšenice (Branton i sur., 1997.), ječma (Kaldhusdal i Skjerve, 1996.) ili raži (Riddel i Kong, 1992.) mogu utjecati na po-jačani porast bakterije u crijevu zbog pojačanja viskoziteta sadržaja i smanjenja obujma pasaža (Waldenstedt i sur., 2000.). Osim toga, visoka razina metionina u donjim parti-jama crijeva može biti čimbenik pretjeranog rasta C. perfringens i kliničke pojave nekrotičnog enteritisa (Drew i sur., 2004.).

Kokcidioza Kokcidioza se istražuje gotovo cijelo stoljeće, ali je i na-dalje bolest koja nanosi najveće štete peradarskoj proiz-vodnji (Williams, 2005.) u cijelom svijetu. Posljedica je to velike proširenosti uzročnika, njihove brzine širenja i invazivnosti (McDougald, 1998.). Protozoarni paraziti roda Eimeria umnožavaju se u crijevnom traktu i u njemu stvaraju oštećenja koja rezultiraju uginućem peradi, sla-bom probavom i apsorpcijom hraniva, smanjenim tjele-snim prirastom i povećanom osjetljivošću na druge uzroč-nike bolesti. Težina crijevnih lezija ovisi o količini ingesti-ranih oocista (Williams, 2005.). Subklinička kokcidioza može biti važan čimbenik u pojavi nekrotičnog enteritisa u tovnih pilića jer je oštećena sluznica idealan medij za umnožavanje C. Perfringens (Baba i sur., 1992. b). Ta-kođer se pokazalo da neke starosjedilačke bakterijske vrste kao, primjerice, Streptococcus faecalis, E.coli, Lacto-bacillus i Bacteroides vrste mogu imati ulogu u patologiji cekumske kokcidioze (Bradely i Radhakrishnan, 1973.). Cekumska kokcidioza prouzročena E. tenellom može pri-donijeti povećanoj osjetljivosti na histomonijazu (McDou-gald i Hu, 2001.), a imunosupresivna stanja (Marekova bolest, zarazna bolest burze) značajno mogu otežati kokcidiozu (McDougald i sur., 1979.). Antibiotici kao poticatelji rasta koriste se u peradarstvu više od pola stoljeća. Utvrđeno je da njihova uporaba poboljšava zdravlje i proizvodnost životinja (Miles i sur., 2006.). Njihovo uklanjanje iz hrane vjerojatno će prido-nijeti promjenama mikrobijelnog sastava crijeva, što može imati štetne posljedice za komercijalnu perad (Knarreborg i sur., 2002.). Skupina istraživača na Sveučilištu John Hopkins nedavno je istražila gospodarske učinke uklanja-nja antibiotika korištenih za poticanje rasta tovnih pilića i zaključila da povećan tjelesni prirast zbog ugradnje anti-biotika u hranu za piliće ne opravdava cijenu koštanja antibiotika (Graham i sur., 2007.). No, neka prijašnja istraživanja pokazuju da korištenje antibiotika u tovnih pilića znatno umanjuje štetu koja nastaje zbog nekih bak-terijskih infekcija te tako opravdava njegovu ugradnju u smjese (Caswell i sur., 2003.). Nadalje, zabrana uporabe antibiotika pridonijela je većoj pojavnosti nekrotičnog en-teritisa u tovnim jatima pilića (Williams, 2005.). Pojavnost nekrotičnog enteritisa kod pilića u zemljama koje su zabranile uporabu antibiotika daleko je veća nego u onima koje to nisu učinile. Malo je vjerojatno da postoji, odnosno da će postojati učinkovita alternativa antibioticima, jer bi

takav suplement trebao osigurati bolje zdravlje i proizvod-nost životinja (Collett, 2004.). Neantibiotski dodaci sami ili u kombinaciji mogu biti učinkoviti u sprečavanju nekrotičnog enteritisa (Hofacre i sur., 2003.), a dokazano je i da obrada jednodnevnih pilića crijevnom florom odra-slih i zdravih kokoši povoljno utječe na odgodu pojave nekrotičnog enteritisa (Kalhudal i sur., 2001.). Osim toga, stalna uporaba probiotika (Klose i sur., 2006.), kao i imunizacija roditelja protiv nekrotičnog enteritisa (Lovland i sur., 2004.) ,pokazale su se dobrom mjerom u smanjenju porasta C. perfringens. Odbacivanje kokcidiostatika za sada ne bi bilo dobro zbog ogromnih šteta po peradarsku proizvodnju koje bi tim činom nastale (ACAF, 2007.).

Literatura

Advisory Committee on Animal Feedingstuffs (2007.): European commission review of the regulation of coccidiostats and histomanostats as feed additives. 39th meeting of ACAF, September 11, 2007.

Al-Sheikhly F., R. B. Truscott (1997.): The interaction of Clostridium perfringens and its toxins in the production of necrotic enteritis of chickens. Avian Dis. 21: 256-263.

Apajalahti, J. H. A., A. Kettunen, H. Graham (2004.): Charac-teristics of the gastrointestinal microbial communities with special reference to the chicken. World s Poultry Sci. J. 60: 223-232.

Baba, E., H. Wakeshima, K. Fukui, T. Fukata, A. Arakawa (1992. b): Adhesion of bacteria to the cecal mucosal surface of conventional and germ-free chickens infected with E. tenella. Am. J. Vet. Res. 53: 194-197.

Banfield, M. J., R. P. Kwakkel, M:J: Forbes (2002.): Effects of wheat structure and viscosity on coccidiosis in briler chickens. Anim. Feed Sci. Technol. 98: 37-48.

Bar Shira, E., D. Sklan, A. Friedman (2005.): Impaired immune responses in broiler hatchling hindgut following delayed access to feed. Vet. Immunol. Immunopathol. 105: 33-45.

Barnes, D. M., Y. K. Kirby, K.G. Oliver (2001.): Effects of biogenic amines on growth and the incidence of proven-tricular lesions in briler chickens. Poult. Sci. 80: 906-911.

Bedford, M. R., H. Schulze (1998.): Exogenus enzymes for pigs and poultry. Nutr. Res. Rev. 11: 91-114.

Befus, A. D., N. Johnston, G. A. Leslie, J. Bienenstock (1980.): Gut- asssociated lymphoid tissue in the chicken. I. Morpho-logy, ontogeny and some functional characteristics of Payer s patches. J. Immunol. 125: 2626-2632.

Berg, R. D. (1996.): The indigenous gastrointestinal microflora. Trends Microbiol. 4: 430-435.

Bradley, R. E., C. V. Radhakrishnan (1973.): Coccidiosis of chickens: Obligate relationship between E. tenella and certain species of cecal microflora in the pathogenesis of the disease. Avian Dis. 17: 461-476.

Branton, S. L., B. D. Lott, J. W. Deaton, W. R. Maslin, F. W. Austin, L. M. Pote, R. W. Keirs, M. A. Latour, E. J. Day (1997.): The effect of added complex carbohydrates or added dietary fiber on necrotic enteritis lesions in broiler chickens. Poult. Sci. 76: 24-28.

Branton, S.L., F.N. Reece, W.M. Hagler Jr. (1987.): Influence of a wheat diet on mortality of broiler chickens associated with necrotic enteritis. Poult. Sci. 66: 1326-1330.


Brunsgaard, G. (1998.): Effects of cereal type and feed particle size on morphological characteristics, ephitelial cell proli-feration and lecitin binding patterns in the large intestine of pigs. J. Anim. Sci. 76: 2787-2798.

Casewell, M., C. Friis, E. Marco, P. McMullin, I. Phillips (2003.): The European ban on growth-promoting antibiotics and emerging consequences for human and animal health. J. Antimicrob. Chemoter. 52:159-161.

Choct, M., G. Annison (1992. a): Antinutritive effect of wheat pentosans in broiler chickens: roles of viscosity and gut microflora. Brit. Poult. Sci. 33: 821-834.

Choct, M., G. Annison (1992. b): The inhibition of nutrient digestion by wheat pentosans. Brit. J. Nutr. 67: 123-132.

Collett, S. R. (2004.): Cntrolling gastrointestinal disease to improve absorptive membrane integrity and optimize digestion efficiency. Pages 77-91 in Interfacing Immunity, Gut Healt and performance. Tucker, L.A. and J.A. Taylor- Picard, ed. Nottingham University Press, Notthingam, UK.

Craven, S. E., N. A. Cox, J. S. Bailey, D. E. Cosby (2003.): Incidence and tracking of C. perfringens trough an integrated broiler chicken operation. Avian Dis. 47: 707-711.

Craven, S. E., N. J. Stern, J. S. Bailey, N. A. Cox (2001.): Incidence of C. perfringens in broiler chickens and their environment during production and processing. Avian Dis. 45: 887-896.

Deaton, J.W., J. L. Branton, B.D. Lott (1985.): Noted difference in the digestive system in cages and floor reared commercial egg type pullets. Poult. Sci. 64: 1035-1037.

Deplancke, B., H. R. Gaskins (2001.): Microbial modulation of innate defense: goblet cells and intestinal mucus layer. Am. J. Nutr. 73: 1131-1141.

Didierlaurent, A., J.C. Sirara, J. P. Kraehentuhl, M. R. Neutra (2002.): How the gut sense its content. Cellular Microbiol. 4 (2): 61-72.

Drew, M. D., N. A. Syed, B. G. Goldade, B. Laarveld, A. G. Van Kessel (2004.): Effects of dietary protein source and level on intestinal populations of C. perfringens in broiler chickens. Poult. Sci. 83: 414-420.

Droual, R., T. B. Farver, A. A. Bickford (1995.): Relationship of sex, age and conccurent intestinal disease to necrotic enteritis in turkeys. Avian Dis. 39: 599-605.

Engberg, R. M., M. S. Hedemann, S. Steenfeldt, B.B. Jensen (2004.): Influence of whole wheat and xylanase on broiler performance and microbial composition and activity in the digestive tract. Poult. Sci. 83: 925-938.

Funda, D. P., L. Tuckova, M. A. Farre, T. Iwase, J. Moro, H. Tlaskalova – Hogenova (2001.): CD 14 in expresed and released as soluble CD14 by human intestinal epithelial cells in vitro: lipopolysaccharide activation of epthitelial cells revisited. Infect. Immun. 69: 3772-3781.

Gabriel, I., M. Lessire, S, Mallet, J.F. Guillot (2006.): Microflora of the digestive tract. Critical factors and consequences for poultry. World s Poult. Sci. J. 62: 499-511.

Gabriel, I., S. Mallet, M. Leconte, G. Fort, M. Naciri (2003.): Effects of whole wheat feeding on the development of coccidial infection in broiler chickens. Poult. Sci. 82: 1668-1676.

Graham, J. P., J. J. Boland, E. Silbergeld (2007.): Growth promoting antibiotics in food animal production: An economic analysis. Public Health Rep. 122: 79-87.

Guy, J. S. (1998.): Virus infections of the gastrointestinal tract of poultry. Poult. Sci. 77: 1166-1175.

Guy, J. S. (2003.): Turkey coronavirus enteritis. Pages 300-307 in diseases of poultry. Y.M. Saif, ed. State University Press, Ames.

Hofacre, C. L., T. Beacorn, S. Collett, G. Mathis (2003.): Using competitive exclusion, mannan oligosaccharide and other intestinal products to control necrotic enteritis. J. Appl. Poult. Res. 12: 60-64.

Hughes, R. J. (2005.): An integrated approach tto understanding gut function and gut health of chickens. Asia Pac. J. Clin.Nutr. 14: S27.

Iji, P. A. (1999.): The impact of cereal non starch polysaccharides on intestinal development and fuction in broiler chickens. Worl d Poult. Sci. J. 55: 375-387.

Jeurissen, S. H., F. Lewis, J.D. van der Klis, Z. Mroz, J. M. Rebel, A.A. ter Huurne (2002.): Parameters and techniques to determine intestinal health of poultry as constituted by immunity, integrity and functionality. Curr. Issues Intest. Microbiol. 3: 1-14.

Kaldhusdal, M., M. Hofshagen (1992.): Barley inclusion and avoparcin supplementation in broiler diets. Clinical, pathological and bacteriological findings in a mild form of necrotic enteritis. Poult. Sci. 71: 1145-1153.

Kaldhusdal, M., C. Schneitz, M. Hofshagen, E. Skjerve (2001.): Reduced incidence of C. perfringens associated lesions and improved performance in broiler chickens treated with normal intestinal bacteria from adult fowl. Avian Dis. 45: 149-156.

Kaldhusdal, M., E. Skjerve (1996.): Association between cereal contents in the diet and incidence of necrotic enteritis in broiler chickens in Norway. Prev. Vet. Med. 28:1-16.

Klose, V., M. Mohnl, R. Plail, G. Schatzmayr, A. P. Loibner (2006.): development of a competitive exclusion product for poultry meeting the regulatory requirements for registration in the European Union. Mol. Nutr. Food Res. 50: 563-571.

Knarreborg, A., M. A. Simon, R.M. Engberg, B.B. Jensen, G.W. Tannock (2002.): Effects of dietary fat source and subtherapeutic levels of antibiotic on the bacterial community in the ileum of broiler chickens at various ages. Appl. Environ. Microbiol. 68: 5918-5924.

Korver, D.R. (2006.): Overview of the immune dynamics of the digestive system. J. Appl. Poult. Res. 15: 123-135.

Koutsos, E. A., K. C. Klasing (2001.): Interactions beetwin the immune system, nutrition and productivity of animals. In „ Recent advances in animal nutrition „. Pp. 173-190. Nottingham University Press. Notingham.

Long, J. R., J. R. Pettit, D.A. Barnum (1974.): Necrotic enteritis in broiler chickens. Pathology and proposed pathogenesis. Can. J. Comp. Med. 38: 467-474.

Lovland, A., M. Kaldhusdal, K. Redhead, E. Skjerve, A. Lillehaug (2004.): Maternal vaccination against subclinical necrotic enteritis in broilers. Avian Patholol. 33: 83-92.

Lucas, R. L., C. A. Lee (2000.): Unravelling the mysteries of virulence gene regulation in Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol. 36: 1024-1033.

Madara, J. L., S. Nash, R. Moore, K. Atissok (1990.): Structure and function of the intestinal epithelial barrier in health and disease. Monogr. Pathol. 31: 306-324.

McDevitt, R. M., J. D. Brooker, T. Acamovic, N.H.C. Sparks (2006.): Necrotic enteritis; a continuing challenge for the poultry industry. World s Poult. Sci. 62: 221-247.

McDougald, L. R. (1998.): Intestinal protozoa important to poultry. Poult. Sci. 77:1156-1158.


McDougald, L. R., L. Fuler, R. Mattiello (1997.): A survey of coccidia od 43 poultry farm in Argentina. Avian Dis. 41: 923-929.

McDougald, L. R., J. Hu (2001.): Blackhead disease aggravated in broiler chickens by conccurent infection with cecal coccidiosis. Avian Dis. 45: 307-312.

McNulty, M.S. (2003): Rotavirus infections. Pages 308-320 in Diseases of Poultry. Y.M. Saif, ed. Iowaq State University Press, Ames.

Miles, R.D., G.D. Butcher, P.R. Henry, R.C. Littell (2006): Effect of antibiotic growth promoters on broiler performance, intestinal growth parameters and quantitive morphology. Poult. Sci. 85: 476-485.

Mikec, M., Z. Biđin, A. Valentić (2001): Utjecaj temperature okoliša i načina hranjenja na reserpciju sadržaja žumanjčane vrećice i prirast tovnih pilića. Zbornik „ Peradarski dani „ 2001, 18-20 svibnja, Poreč.

Neish, A.S., A.T. Gerwirtz, H. Zeng, A.N. Young, M.E. Hobert, V. Karmali (2000): Prokaryotic regulation of epithelial responses by inhibition of B alfa ubiquiation. Science 289: 1560-1563.

Norton, R.A., B.A. Hopkins, J.K. Skeeles, J.N. Beasley, J.M. Kreeger (1992): High mortality of domestic turkeys associated with Ascaridia dissimilis. Avian Dis. 36: 469-473.

Noy, Y., D. Sklan (1999): Energy utilization in newly hatched chicks. Poult. Sci. 78: 1750-1756.

Pierson, F.W., D. Fitzgerald (2003): Hemorrhagic enteritis and related infections. Pages 237-247 in Diseases of Poultry. Y.M. Saif, ed. State University Press, Ames.

Qureshi, M.A., I. Hussain, C.L. Heggen (1998): Understanding immunology in disease development and control. Poult. Sci. 77: 1126-1129.

Reynolds, D.L. (2003): Multicausalenteric diseases. Pages 1169-1171 in Diseases of Poultry. Y.M. Saif, Iowa State University Press, Ames.

Reynolds, D.L., S.L. Schultz-Cherry (2003): Astrovirus infections. Pages 320.326 in Diseases of Poultry. Y.M. Saif, ed. Iowa State University Press, Ames.

Richards, J.D., J. Gong, C.F.M. de Lange (2005): The gastrointestinal microbiota and its role in monogastric nutrition and health with an emphasis on pigs: Current

understanding, possible modulations and new technologies for ecological studies. Can. J. Anim. Sci. 85: 421-435.

Schiefer, H.B., V.R. Beasley (1989): Effects on the digestive system and energy metabolism. Pages 61-89 in Tricothecene Mycotoxicosis: Pathophysiologic Effects. V.R. Beasley, ed. CRC Press, Boca Raton, FL.

Sharma, J.M. (2003): The avian immune system. Pages 5-16 in Diseases of Poultry. Y.M. Saif, ed. Iowa State University Press, Ames.

Siero, F., B.Dubois, A. Coste, D. Kaiserlian, I.P Kraehenbuhl, J.C. Sirard (2001): Flagellin stimulation of intestinal epithelial cells triggers CCL20 mediated of dendritics cells. Proc. Nat. Acad. Sci. uSA, 98: 13722-13727.

Sklan, D. (2001): Development of the digestive tract of poultry.World s Poult. Sci. J. 57: 415-427.

Sklan, D., M. Shelly, B. Makovsky, A. Geyra, E. Klipper, A. Friedman (2003): the effect of chronic feeding of diacetoxyscirpenol and T-2 toxin on performance, health, small intestinal physiology and antibodi production in turkey poults. Br. Poult. Sci. 44: 46-52.

Svihus, B., E. Juvik, H. Hetland, A. Krogdahl (2004): Causes for improvement in nutritive value of broiler chicken diets with whole wheat instead of ground wheat. Br. Poult. Sci. 45: 55-60.

Taylor, R.D., G.P. Jones (2004): The incorporation of whole grain into pelleted broiler chicken diets. Br. Poult. Sci. 45: 237-246.

Truscott, R.B., F. Al Sheikhly (1977): Reproduction and treatment of necrotic enteritis in broilers. Am. J. Vet. Res. 38: 857-861.

Uni, Z., Y. Noy, D. Sklan (1999): Posthatch development of small intestinal function in the poult. Poult. Sci. 78: 215-222.

Waldenstedt, L., K. Elwinger, A. Lunden P. Thebo, M.R. Bedford, A. Uggla (2000): Intestinal digesta viscosity decreases during coccidial infection in broiler. Br. Poult. Sci. 41: 459-464.

Williams, R.B. (2005): Interccurent coccidiosis and necrotic enetritis of chickens. Avian Pathol. 34: 159-180.

Yun, C.H., H.S. Lillehoj (2000): Intestinal immune response to coccidiosis. Develop. Comp. Immunol. 24: 303-324.

HEALTH OF THE BOWEL OF POULTRY

Summary

Mucosa of the stomach bowel tract in poultry is the most exposed surface of the organism to the effects of outside toxins which easily and quickly endanger their health and production. The bowel wall is actually a selective barrier between the tissue of the bird and the contents of the bowel tract and it contains physical, chemical, immunologic and microbiologic components. The surface of the bowel is covered with a thin and highly selective epithelium layer which is protected from toxic material from the environment and food with inborn and adaptive defense mechanisms. That mechanism ensures integrity of the bowel mucosa that it could be able to carry out its basic function, which is absorption of nutrients and a quality immunologic defense. It is a very important task of the experts in poultry production to maintain the health of the bowel, especially since the use of antibiotic growth promoters has been forbidden. Key words: poulty, bowel, health, production


UTJECAJ PRIMJENE RAZLIČITIH NAČINA DEZINFEKCIJE RASPLODNIH JAJA NA REZULTATE INKUBACIJE

Aida Kustura, Abdulah Gagić, Emina Rešidbegović, Teufik Goletić, Aida Kavazović

Zavod za zootehniku i peradarstvo, Univerzitet u Sarajevu, Veterinarski fakultet Sarajevo, Sarajevo, Bosna i Hercegovina

Sažetak

U suvremenoj praksi peradarske proizvodnje pod pojmom sanitarni tretman rasplodnih jaja podrazumijeva se samo profilaktička dezinfekcija rasplodnih jaja koja prethodno moraju biti odabrana i tretirana po jasno utvrđenom redoslijedu tehnoloških tretmana. Širom svijeta se provode brojna istraživanja u cilju pronalaženja novih, alternativnih sredstava koja će, uz zadržavanje neospornih pozitivnih učinaka primjene formalina i formaldehida, biti bez navedenih negativnih svojstava i čija eventualna upotreba u sanitarnom tretmanu rasplodnih jaja neće biti štetna po zdravlje ljudi. Sanitarni tretman rasplodnih jaja u našim istraživanjima realiziran je na tri način: parama formaldehida, ultravioletnim zrakama i primjenom kombinacije ultravioletnih zraka s negativnim ionima. Najbolji rezultati valenja - 79,73% - utvrđeni su kod kombiniranog sanitarnog tretmana, slijedi prosječna valivost od 74,14% iz rasplodnih jaja tretiranih ultravioletnim zracima, a najniža - 70,52% - nakon fumigacije parama formaldehida. Posebno raduje činjenica da je kombinirana primjena ultravioletnih zraka i negativnih iona kao moguća zamjena za fumigaciju jaja parama formaldehida pokazala proizvodnu opravdanost i značajno manji rizik primjene po zdravlje ljudi te neosporne tehnološke prednosti. Ključne riječi: inkubacija, dezinfekcija, valivost, ultravioletno zračenje, negativni ioni Uvod

Osnovna biološka pretpostavka za uspjeh intenzivne pera-darske proizvodnje je, bez obzira na vrstu peradi ili pro-izvodne ciljeve, produkcija kvalitetnih rasplodnih jaja s ciljem potpunog izražavanja svih genetskih potencijala se-lekcioniranih jedinki uz maksimalnu moguću redukciju rizi-ka unakrsnih kontaminacija, vertikalnog prijenosa uzročnika specifičnih bolesti i ugrožavanja zdravlja peradi (Gagić, 1999.; Kustura i Goletić, 2004.; Hafez, 2007.) U suvremenoj praksi peradarske proizvodnje pod pojmom sanitarni tretman rasplodnih jaja podrazumijeva se samo profilaktička dezinfekcija rasplodnih jaja koja prethodno moraju biti odabrana i tretirana po jasno utvrđenom redo-slijedu tehnoloških tretmana – od farme gdje su snesena, preko objekta skladištenja, načina i sredstava transporta do ulaska u valionicu. Sredstva koja se koriste u sanitarnom tretmanu rasplodnih jaja, kao i metode njihove primjene, ne

smiju negativno utjecati na rast i razvoj embrija. U svrhu provođenja profilaktičke dezinfekcije rasplodnih jaja kao završnog dijela njihovog sanitarnog tretmana kroz relativno dugo razdoblje primjenjivao se formalin ili pare formalde-hida koji imaju izuzetno dobra germicidna svojstva, efikasni su i relativno lako primjenjivi dezinficijensi za masovnu pri-mjenu, ali imaju dokazana kancerogena svojstva i negativan učinak na ljude koji su izloženi njihovom djelovanju. Širom svijeta provode se brojna istraživanja s ciljem iznala-ženja novih, alternativnih sredstava koja će, uz zadržavanje neospornih pozitivnih učinaka, kao što je to slučaj nakon primjene formalina i formaldehida, biti bez navedenih nega-tivnih svojstava i čija eventualna upotreba u sanitarnom tret-manu rasplodnih jaja neće biti štetna po zdravlje ljudi. Ohrabrujući pozitivni rezultati i naših i svjetskih istraživanja kandidirali su ekstremne ultravioletne zrake i negativne ione za moguća alternativna sredstava sanitarnog tretmana ras-plodnih – valioničkih jaja.

Dr. sc. Aida Kustura, Veterinarski fakultet, Univerzitet u Sarajevu, Zavod za zootehniku i peradarstvo, Zmaja od Bosne 90, 71 000 Sarajevo, Bosna i Hercegovina; tel/fax: ++387 33 61 88 32; e-mail: [email protected]

UTJECAJ PRIMJENE RAZLIČITIH NAČINA DEZINFEKCIJE RASPLODNIH JAJA NA REZULTATE INKUBACIJE 214

Materijal i metode

Eksperimentalni dio pokusa realiziran je u proizvodnim objektima jednog domaćeg reprocentra teške linije. Osnovni eksperimentalni materijal predstavljalo je ukupno 201.600 komada rasplodnih jaja proizvedenih u matičnoj farmi teškog roditeljskog jata provenijencije COBB - 500. Po jed-nom tretmanu uvijek je u isti predvalionik ulagan identičan broj rasplodnih jaja – 16.800, što je u četiri eksperimentalna ciklusa predstavljalo ukupno 67.200 komada. Dezinfekcija rasplodnih jaja parama formaldehida vršena je primjenom 37%-tnog tehničkog formalina koji predstavlja vodeni rastvor formaldehida (HCHO) s dodatkom metanola. Oslobađenje para formaldehida je inicirano dodavanjem for-malina u mješavinu destilovane vode i KMnO4 u odgovara-jućim omjerima unutar komora predviđenih za plinjenje jaja. Sanitarni tretman rasplodnih jaja ultravioletnim zrakama pri-je ulaganja u predvalionike vršen je uz primjenu živine UV lampe koja emitira ekstremne ultravioletne zrake valne duljine 254 nm, odnosno ultravioletne zrake iz skupine C, koje imaju dokazana germicidna svojstva. U komori oblo-ženoj aluminijskom folijom valionička jaja su postavljana na dva metra udaljenosti od izvora, a doza zračenja iznosila je 474 mW/ sec/cm2. Kombinirani sanitarni tretman rasplodnih jaja realiziran je uz primjenu UV zraka prije početka inkubacije, a potom kontinuirano tijekom prvih 18 dana inkubacije negativnim ionima iz Clear Air ionizatora. Taj aparat ne zahtijeva po-sebnu instalaciju, a stavlja se u rad uključivanjem u električnu mrežu napona 220 V. Proizvodi 2,5 x 1012 ili 2,5 triliona negativnih iona, odnosno 1000 negativnih iona po cm3 zraka unutar područja od 24 m2 površine. U realizaciji našeg eksperimenta, a pri identičnim drugim uvjetima proizvodne tehnologije, izvršili smo kontrolu utje-

caja različitih sanitarnih tretmana rasplodnih jaja na proiz-vodne aspekte inkubacije.


Inkubacija je jedna od najosjetljivijih faza u reprodukciji peradi, a rezultati valjenja iskazani postotkom valivosti uvjerljiv su argument ostvarivosti određenih tehnoloških rješenja. Pravu naučnu i stručnu valorizaciju novoprimije-njene sanitarne mjere i postupci dobit će usporedbom proiz-vodnih rezultata. Tijekom perioda predvalenja, koji kod jaja kokoši traje 18 dana, najčešće se iskazuju utjecaji pozitivnih, ali i negativ-nih faktora inkubacije, što se može odraziti na embrionalni razvoj i krajnje rezutate valjenja, odnosno valivost (Gagić, 1999.; Ernst, 2004.; Bobko, 2004.; Hafez, 2007.; Sutton, 2007.). Za šestomjesečnog trajanja pokusa sanitarno je obrađeno i inkubirano 201.600 komada rasplodnih jaja iz teškog rodi-teljskog jata provenijencije COBB – 500. Na kraju svakog ciklusa inkubacije odredili smo rezultate valivosti, a po za-vršetku pokusa i prosječnu valivost za svaki pojedini sani-tarni tretman rasplodnih jaja (Grafikon 1). Najbolju prosječnu valivost - 79,73% - utvrdili smo iz ras-plodnih jaja kombiniranog sanitarnog tretmana (dezinfekcija UV zrakama i kontinuirano 18-dnevno izlaganje djelovanju negativnih iona). Prosječna valivost iz rasplodnih jaja dezin-ficiranih ultravioletnim zrakama iznosila je 74,14%, a iz rasplodnih jaja dezinficiranih parama formaldehida 70,52%. Kombinirani sanitarni tretman rasplodnih jaja rezultirao je dakle boljim prosječnim pokazateljima valjivosti za oko 5% u odnosu na jaja tretirana samo UV zrakama, odnosno za oko 9% u odnosu na jaja tretirana parama formaldehida.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

formaldehid U.V. zraci U.V. zraci + negativni ioni

1. ciklus 2. ciklus 3. ciklus 4. ciklus

Grafikon 1. Uporedni rezultati valenja različito sanitarno tretiranih valioničkih jaja Graph 1. Comparativ hatchability results differently sanitary treated hatching eggs


Tablica 1. Prosječni rezultati inkubacije za tri saniterna tretmana valioničkih jaja Table 1. Average incubation results for three hatching egg sanitation treatments

Tretman jaja Uloženo jaja Oplođenost Ukupno izvaljenih pilića Valivost UV zraci i ionizacija 67 200 91,51% 53 577 *79,73% UV zraci 67 200 88,54% 49 820 74,14% Formaldehid 67 200 88,72% 47 390 *70,52%

*statistička opravdanost razlika na nivou p < 0,05 Iz navedenih rezultata jasno se vidi da je najbolja valivost, što je krucijalan tehnološki i proizvodni pokazatelj, u tijeku provođenja eksperimenta ostvarena nakon kombiniranog sa-nitarnog tretmana rasplodnih jaja ultravioletnim zrakama i negativnim ionima, za što smo utvrdili i statističku oprav-danost razlika na nivou p < 0,05 u usporedbi s rezultatima ostvarenim iz jaja tretiranih parama formaldehida (Tablica 1). Budući da u dostupnoj literaturi nismo naišli na podatke o identičnoj kombinaciji prilikom sanitarnog tretmana ras-plodnih jaja, naše rezultate donekle možemo usporediti samo s odgovarajućim rezultatima pojedinačnih tretmana negativnim ionima, parama formaldehida, odnosno UV zračenjem ili nekim drugim kombinacijama. Tako, na primjer, Higgins i sur. (2005.) tvrde da pri standardnom sanitarnom tretmanu rasplodnih jaja parama formaldehida primjena negativnih iona u tijeku inkubacije može poboljšati valivost za 5% do 10% u odnosu na iste pokazatelje kontrolne, netretirane grupe. U tom kontekstu naši rezultati ostvarene valivosti potpuno su u skladu sa njihovim navodima. Također je neosporno da se pare for-maldehida koriste u rutinskoj sanitaciji rasplodnih jaja u valionicama širom svijeta i da se u takvim okolnostima ostvaruju vrhunski tehnološki rezultati inkubacije (Rodgers i sur., 2001.; Novak i sur., 2001.; Coufal i sur., 2003.; Management Hatchery Guide – COBB 500, 2003.; Artur i Sullivan, 2005.). S tog aspekta gledajući, naš rezultat prosječne valivosti od 70,52%, ostvaren nakon primjene tog dezinficijensa, ne spada u kategoriju tehnološki dobrih rezultata. To više ako imamo u vidu da su rezultati valivosti kod druga dva tret-mana, ostvareni s jajima istog porijekla, bili mnogo bolji, a kod kombiniranog tretmana i statistički značajno bolji. Kombinirani tretman rasplodnih jaja parama formaldehida prije ulaganja, te UV zračenjem i filtracijom zraka tijekom inkubacije rezultirao je, prema navodima Coxa i Baileya (1991.), boljom valivosti (77,4%) u odnosu na kontrolni tretman jaja parama formaldehida (71,4%). Ostvarena vali-vost iz jaja kontrolne grupe prema navodima ovih autora neznatno je bolja u odnosu na naše rezultate, dok je njihov pokusni tretman za oko 2% lošiji od našeg (Wilson i Mauldin, 1990.; Ruano i sur., 2001.; Steinlage i sur., 2002.; Mitchell i Waltman, 2003.). Rezultati prosječne valivosti od 74,14%, koje smo utvrdili nakon jednokratnog sanitranog tretmana valioničkih jaja ultravioletnim zrakama, potvrđuju naše ranije navode, ali i navode drugih autora (Kustura, 2000.; Yakimenko i sur.,

2002.; Bobko, 2004.). Potvrđuju, naime, da su ultravioletne zrake dobra alternativa formaldehidu kao dezinfekcijskom sredstvu u intenzivnoj peradarskoj proizvodnji i da su pode-sne za korištenje u masovnoj dezinfekciji rasplodnih jaja bez negativnog utjecaja na na rast i razvoj embrija i na krajnje rezultate inkubacije.

Zaključci

1. Promatrano kroz valivost kao najvažniji proizvodno – tehnološki parametar uspjeha inkubacije, najbolje rezul-tate valenja, sa prosječnom valivosti od 79,73%, za četiri ciklusa inkubacije utvrdili smo nakon kombiniranog sani-tarnog tretmana rasplodnih jaja ultravioletnim zrakama i negativnim ionima.

2. Jednokratni sanitarni tretman valioničkih jaja ultraviolet-nim zrakama prije početka inkubacije imao je za rezutat 5% nižu prosječnu valivost u odnosu na jaja tretirana kombiniranim načinom dezinfekcije i za9 % u odnosu na jaja dezinficirana parama formaldehida.

3. Profilaktička dezinfekcija valioničkih jaja ultravioletnim zrakama i kombinirani način dezinfekcije (UV zrake s negativnim ionima) nisu imali negativan utjecaj na rast i razvoj embrija i krajnje rezultate inkubacije.

4. Kombinirani sanitarni tretman primijenjen po metodo-logiji korištenoj u našim pokusima predstavlja potpuno prihvatljivu metodu dezinfekcije rasplodnih jaja u inku-batorskim stanicama popraćenu dobrim proizvodnim re-zultatima bez ugrožavanja zdravlja ljudi.

Literatura

Artur, J., N. O' Sullivan (2005.): Breeding chickens to meet egg quality needs, International Hatchery Practice, Vol. 19, No. 7, 7-11.

Bobko, M. (2004.): Učinak rozneho sposobu dezinfekcie nasa-dovych vajec na liahnivost, doktorska disertacija, Slovenska polnohospodarska univerzita v Nitre, Slovačka

Cox, N. A., J. S. Bailey (1991.): Efficacy of various chemical treatments over time to eliminate Salmonella on hatching eggs, Poultry Science 70, Supplement:31.

Coufal, C. D., C. Chavez, K. D. Knape, J. B. Carey (2003.): Evaluation of a method of ultraviolet light sanitation of broiler hatching eggs, Poultry Science, Vol 82, No. 5, 754-759.

Ernst, A. Ralph (2004.): Hatching Egg Sanitation: The Key Step in Successful Storage and Production, Avian Bowl Manual 4,


Division of Agriculture and natural Resources, University of California, Davis

Gagić A. (1999.): Reprodukcija u peradarstvu, Univerzitetska knjiga, Sarajevo

Hafez, M. H. (2007.): Breeder farms and hatchery as integrated operation, Lohmann Information, Vol. 42.

Higgins, S. E., A. D. Wolfenden, L. R. Bielke, C. M. Pixley, A. Torres-Rodriguez, J. L. Vicente, D. Bosseau, N. Neighbor, B. M. Hargis, G. Tellez (2005.): Application of Ionized Reactive Oxygen Species for Disinfection of Carcasses, Table Eggs and Fertile Eggs, Poultry Science14:716-720.

Kustura Aida, A. Gagić, Emina Rešidbegović, T. Goletić, Mevla Škandro (2004.): Primjena ultravioletnih zraka i negativnih iona u dezinfekciji rasplodnih jaja i inkubatorskog zraka, Peti znanstvenostručni skup iz DDD-a, Zbornik radova, 369-377, Mali Lošinj

Kustura Aida (2000.): Efekti sanitarnih tretmana rasplodnih jaja i inkubatorskog zraka na rezultate inkubacije kokošijih jaja, Magistarski rad, Veterinarski fakultet, Sarajevo

Management Breeder Guide (2003.) - COBB 500, The COBB Breeding Company LTD, East Hanningfield Chelmsgord Essex CM3 8BY, United Kingdom

Mitchell, B.W., W.D. Waltman (2003.): Reducing airborne pathogens and dust in commercial hatching cabinets using an electrostatic space charge system, Avian Diseases 47:247-253.

Novak, P., K. Kubicek, F. Zabloudil, J. Odehnal, A. Tofant (2001.): Disinfection – an integral part of farm animal biosecurity, Četvrti znanstveno stručni skup iz DDD-a, Zbornik, 125-130,Bizovačke Toplice

Rodgers, J. D., J. J. McCullagh, P. T. McNamee, J. A. Smyth, H. J. Ball (2001.): An investigation into the efficacy of hatchery disinfectants against strains of Staphylococcus aureus associated with the poultry industry, Veterinary Microbiology, Vol. 20, 131-140.

Ruano, M., J. El-Atrache, P. Villegas (2001.): Efficacy Com-parisons of Disinfectants Used by the Commercial Poultry Industry, Avian Disease 45: 972-977.

Steinlage Thorne Sara, J. E. Sander, J. L. Wilson (2002.): Comparison of Two Formaldehyde Administration Methods of In Ovo-Injected Eggs, Avian Diseases: Vol. 46, No 4, 964-970.

Sutton, V.W.S (2007.): Disinfectant Rotation in Cleaning/Disin-fection Program for Clean Rooms and Controlled Environments, Disinfection and Decontamination Principles – Applications and Related Issues, CRC Press, New York

Wilson L. Jeanna, J. M. Mauldin (1990.): New Formaldehide Rules Change Hatchery Sanitation,Poultry International, Vol. 29, 3.

Yakimenko, I., V. Besulin, A. Testik (2002.): The Effects of Low Intensity Red Laser Irradiation on Hatching Eggs in Chicken and Quail, International Journal of Poultry Science 1, 06-08.

DIFFERENT HATCHING EGGS DISINFECTION INFLUENCE ON HATCHABILITY

Summary

Sanitary treatment of the hatching eggs in the modern poultry production facilities has the meaning of the prophylactic disinfection of the eggs previously selected and treated according to the clearly established sequence of the technological treatments. Numerous researches are conducted worldwide aiming to discover new, alternative means, that would maintain indisputable positive effects of formalin and formaldehyde but which would be free of the above-mentioned negative characteristics and the use of which would not be detrimental to the humans’ health. In our research, three different sanitary treatments were used: the formaldehyde steam, the ultraviolet rays and the combination of the ultraviolet rays with the negative ions. The best hatching rate of 79,73%, was recorded in the combined treatment, average rate of 74,14% after the application of the U.V. rays and the worst rate of 70,52% after the formaldehyde fumigation. Combined treatment of the hatching eggs with the ultraviolet rays and the negative ions has the most favorable expenditure structure for the price forming for the hatching eggs and one-day broiler chicken. Especially encouraging is that the combined use of the ultraviolet rays and negative ions as a possible substitution for formaldehyde fumigation proved to be economically and otherwise justified. The most important aspect is the significant risk decrease for humans’ health and indisputable hygienic and technological advantages. Key words: incubation, disinfection, hatchability, ultra violet rays, negative ions


MORFOMETRIJSKE KARAKTERISTIKE ERITROCITA PTICA – PRELIMINARNA STUDIJA

Nina Poljičak-Milas1, Matko Kardum 2, Terezija Silvija Marenjak1, Ika Kardum-Skelin 3, Suzana Milinković-Tur4

1 Zavod za patološku fiziologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska 2 Apsolvent Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu 3 Klinička bolnica “Merkur”, Laboratorij za citologiju i hematologiju Klinike za unutarnje bolesti Zagreb, Hrvatska 4 Zavod za fiziologiju i radiobiologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Eritrociti različitih vrsta ptica, iako imaju iste morfološke karakteristike stanica s jezgrom, znatno se razlikuju u veličini i obliku, uz fiziološke varijacije unutar svake vrste. Uspoređujući eritrocite kokoši, noja, patke i purana, našli smo statistički značajne razlike u svim ispitivanim morfometrijskim pokazateljima: površini, opsegu, minimalnom i maksimalnom polumjeru, ispupčenosti, odnosno konveksitetu površine, duljini i širini te pravilnosti (engl. form factor) i izduženosti cijele stanice, odnosno citoplazme eritrocita kao i u nukleo-citoplazmatskom omjeru. Isto vrijedi i za ispitivane pokazatelje jezgre: za površinu, opseg, minimalni i maksimalni polumjer, pravilnost i izduženost jezgre. Velike ptice kao što su nojevi imaju najveće stanice relativno manjih jezgara u odnosu na ostale vrste, što se očituje manjim nukleo-citoplazmatskim omjerom, jezgre su im izduženije i nepravilnije. Eritrociti purana su drugi po površini, opsegu te konveksitetu, ali manjih površina jezgara koje su izduženije. Kokošji eritrociti su najmanji, ali s relativno najvećim jezgrama u odnosu na citoplazmu; uz to su najokrugliji i najpravilniji. Karakteristike eritrocita patke su između te tri jasnije definirane vrste. Morfometrijska analiza normalnih eritrocita objektiviziranjem kvantitativnih pokazatelja može biti osnova izrade referentnih vrijednosti za pojedine vrste ptica. Takve brojčane referentne vrijednosti bile bi kvalitetniji standard za određivanje odstupanja u fiziološkim i patološkim stanjima te preciznija polaznica u dijagnostici hematoloških poremećaja i bolesti ptica. Ključne riječi: eritrociti, ptice, morfometrija Uvod

Morfološke karakteristike ptičjih eritrocita Eritrociti ptica su stanice s jezgrom eliptičnog oblika. Kro-matin se boji jasno, a citoplazma jednoliko narančasto ili ru-žičasto. Ptičji eritrociti su mnogo veći od eritrocita sisavaca. Ptice pjevice imaju eritrocite manje veličine, dok ptice trkačice (noj) i pingvini imaju jedne od najvećih eritrocita. Mnoge vrste kućnih ptica imaju eritrocite volumena 130-180 fL, za razliku od pasa (65 fL) i mačaka (50 fL). Analiza eritrocita i leukocita moguća je samo na dobro priprem-ljenom jednoslojnom krvnom razmazu na kojem se eritrociti ne preklapaju. U razmazima anemične krvi eritrociti su ri-jetko raspoređeni. Abnormalna morfologija je česta, ali mor-

folog mora razlikovati artefakte od pravih morfoloških pro-mjena. Crvene krvne stanice bez jezgre zovu se eritroplastidi (Campbell, 1995.), a nastaju ponajprije zahvaljujući neade-kvatnoj pripremi (artefaktni). Nepravilnosti stanične mem-brane nisu normalan nalaz u eritrocita ptica. Općenito govo-reći, eritrociti nabubre ukoliko razmaz postane vlažan, a po-prime zeleno-plavu boju citoplazme ukoliko je razmaz tije-kom dostave u laboratorij ili pripreme izložen parama for-malina (Fudge, 2000.). Ptičji retikulociti uključuju 2-10 % normalnih cirkulirajućih eritrocita i nešto su veći od zrelih oblika (Campbell, 1994.). Ukoliko su bojeni novim metilen-skim modrilom, bazofilni citoplazmatski agregati postaju vidljivi. Mlađi eritrociti su okrugliji i pokazuju polikroma-tofilnu citoplazmu te su obično bazofilniji u usporedbi sa zrelim narančasto-crvenim eritrocitima.

Prof. dr. sc. Nina Poljičak-Milas, dr. vet. med., Zavod za patološku fiziologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Heinzelova 55, 10 000 Zagreb, Hrvatska; tel: ++385 1 2390 182; faks: ++385 1 2390 184; e-mail: [email protected]

MORFOMETRIJSKE KARAKTERISTIKE ERITROCITA PTICA – PRELIMINARNA STUDIJA 218

Digitalna analiza slike

Uvođenjem računala u analizu slike omogućena je njena obrada, analiza, usporedba, selekcija određenih segmenata slike te pohranjivanje slika s mogućnošću kreiranja baze podataka (Van Diest i Baak, 1991.). Kompjutorska analiza slike omogućava numeričku objektivizaciju najsuptilnijih promjena nedostupnih vizualnoj inspekciji te umjesto sub-jektivne procjene imamo objektivnu kvantifikaciju odre-đenih parametara. Kao takva, ima brojne kliničke i istra-živačke primjene, a naročita je pomoć u staničnoj mor-fologiji (citologiji i patohistologiji) (Seili-Bekafigo i Kardum-Skelin, 2003.). Tipični sistem za slikovnu analizu sastoji se od mikroskopa, kamere visoke rezolucije, kolor monitora, mikrokompjutora i podržavajućeg programa za prihvat i analizu slike. Svjetlosni mikroskop sliku pretvara u analogni električni signal pomoću videokamere. Signal se nakon toga digi-talizira u mikrokompjutoru u elemente slike nazvane pixels. Tamo gdje ljudsko oko može razlučiti 30-40 zona sivila (Kisner, 1988.), kompjutor može razlučiti 256 zona po svakom pixelu. Digitalni signal može se vratiti u analogni i prikazati na kolor monitoru. Za slikovnu analizu podesni su različiti tipovi uzoraka. Specifičnost uzorka ovisi o tipu analize (jezgra, citoplazma ili oboje) i opremi. Cijele stanice mogu se analizirati u svježim citološkim preparatima (pripremljeni kao razmazi ili u citocentrifugi) kao i u smrznutim citološkim preparatima te parafinskim rezovima (Kardum-Skelin, 2008.).

Morfometrija

Morfometrija je kvantitativni opis geometrijskih struktura u svim dimenzijama (Baak, 1985.). Za razliku od drugih mor-foloških metoda, ona omogućava numeričku objektivizaciju, a kvantitativni pokazatelji su objektivni i reproducibilni (Oberholzer i sur., 1991.). Prednost joj je i u tome što je jeftina i tehnički jednostavna, a može se koristiti standardno obrađeni materijal (Baak i sur., 1986.). Planimetrija kao širi pojam označava mjerenja geometrijskih karakteristika u dvodimenzionalnoj slici, iako te strukture mogu biti i trodimenzionalne. Sama morfometrija je uži po-jam i opisuje dvodimenzionalne slike (opseg, površinu, strukturu), za razliku od stereometrije kojom se dobivaju trodimenzionalne vrijednosti. Koncept transformacije trodi-menzionalnih u dvodimenzionalne objekte na histološkim preparatima naziva se redukcija dimenzije. Faktori kao što su ugao i debljina reza rezultiraju značajnom varijacijom u dvodimenzionalnoj redukcijskoj slikovnoj analizi pod mi-kroskopom (Machevsky i Erler, 1994.). Tako u histološkim rezovima normalne jetre debljine 3-7 mikrona površina jezgara varira više od 15% između rezova, iako je realna razlika mnogo manja. Za patohistološke rezove je važno razumjeti razlike između aktualne veličine i izmjerene vrijednosti stanica, jezgre i nukleola (Schmidt i Black,

1992.). Redukcija dimenzije u mjerenjima citoloških uzo-raka je manja nego u histološkim uzorcima. Citološki uzorci ne ovise o rezovima (npr. stanice i jezgre u citološkim uzor-cima su spljoštene, dvodimenzionalne slike, te ako faktor povećanja nije jako visok, njihova debljina je zanemariva). Premda je termin planimetrija adekvatniji, studija na cito-loškim uzorcima se češće zove morfometrija. Stereološke metode se ne mogu primijeniti na pojedinačne cijele stanice, te se trodimenzionalni podaci ne mogu dobiti iz citoloških preparata. Za označavanje objekata mjerenja koristi se interaktivni pe-riferni sistem kao što je touch-sensitive screen ili kompju-torski miš. Za razliku od mnogo skupljeg automatskog analizatora koji je i tehnički limitiran, naročito za istra-živačke protokole, jer sadrži komercijalni program koji se ne može lako prilagoditi korisniku, interaktivni program je pogodan i za rutinski i za istraživački rad (Baak, 1991.). Za praktične svrhe stanice se tretiraju kao dvodimenzionalni objekti. Pritom se najčešće koristi metoda interaktivne kompjutorske analize slike, gdje se dijelom automatski, dijelom ručno ocrtavaju konture struktura koje želimo mjeriti. Mogu se određivati različiti planimetrijski parametri (Van Diest i Baak, 1991.) koji su grupirani u: jednostavne parametre (površina, opseg, promjer, polumjer, najduža i najkraća os), faktore oblika ili pravilnosti (form factor- FF, ili FF izduženosti) koji opisuju nepravilnost objekta, dvo-fazne parametre (nukleocitoplazmatski omjer - N/C, nukleo-nukleolarni omjer - N/N) te kontekstualne parametre kao što su površina nakupina, broj elemenata po nakupini i udaljenost između nakupina. Faktor pravilnosti je parametar koji je sredinom 80-ih godina u praksu uveo Crocker (Crocker i sur., 1983.; Crocker i sur., 1983. a), a mjeri stupanj zaokruženosti objekta. Ima vrijednost 1 za krug, <1 za elipse, i <<1 za jako nepravilne oblike – oblike nepravilnih rubova ili velike varijabilnosti (Tosi i sur., 1986.; Collan i sur., 1987.). Morfometrijske analize zbog svojih kontinuiranih kvantitativnih obilježja omogućavaju korelaciju morfometrijskih podataka sa tradicionalnom kla-sifikacijom tumora, koja se temelji na subjektivnoj inter-pretativnoj histopatologiji i veću pouzdanost i reproducibil-nost citoloških i patohistoloških dijagnoza (Antonangelo i sur., 1994.) te reklasifikaciju tumora i korelaciju morfo-metrijskih podataka s prognostičkim parametrima (Collan i sur., 1987.). Osim planimetrijskih mogu se određivati i parametri teksture, parametri u vezi sa razinama sivila i denzitometrijski parametri (Oberholzer i sur., 1991.). Morfometrijska analiza normalnih eritrocita objektivizira-njem kvantitativnih parametara može biti osnova izrade referentnih vrijednosti za pojedine vrste ptica. Takve broj-čane referentne vrijednosti bile bi kvalitetniji standard za određivanje odstupanja u fiziološkim i patološkim stanjima i preciznija polaznica u dijagnostici hematoloških poremećaja i bolesti ptica. Stoga je upravo cilj ovog istraživanja bio izmjeriti morfometrijske pokazatelje eritrocita četiri vrste ptica: noja, kokoši, patke i purana.


Materijal i metode

Istraživanje je provedeno na po pet razmaza periferne krvi kokoši, noja, patke i purana. Analizirano je najmanje 101-209 stanica po uzorku, prosječno po 125 stanica. Ukupan broj analiziranih stanica je iznosio 2510 i isto toliko jezgara (ukupno 5020 objekata) na svih 20 razmaza. Kompjutorska analiza slike obavljena je na osobnom ra-čunalu s podržavajućim programom SFORM tvrtke VAMSTEC, Zagreb. Sistem se sastoji od visokorezolucijske kamere u boji «Pulinix», koja sliku (x100 oil) iz mikroskopa „Olympus BH2“ digitalizira i prenosi u osobno računalo. Morfometrijska analiza je izvršena na standardno obojenim razmazima po Pappenheimu, odnosno (May-Grünwald-Giemsi). Granice citoplazme i jezgre su označavane inter-aktivno (prvo citoplazma, a nakon toga jezgra) uz ručnu korekciju (Slika 1). Za citoplazmu i jezgru određivani su: površina (μm2), opseg (μm), konveksitet (ispupčenost) (μm2), minimalni i maksimalni polumjer, duljina i širina (μm), faktori pravilnosti (FF i FF izduženosti) te omjer jezgre i citoplazme. Statistička obrada rezultata izvršena je uz pomoć kompju-torskog programa STATISTIKA 7.1. Za svaku kontinu-iranu varijablu su izračunati osnovni opisni statistički pokazatelji (aritmetička sredina, medijan, minimalna/mak-simalna vrijednost aritmetičke sredine) i mjere varija-bilnosti (koeficijent varijacije i standardna devijacija) te je za svaku procijenjen oblik distribucije. Aritmetičkom sre-dinom (X) je predstavljena mjera prosjeka, a standardnom devijacijom (SD) mjera varijabilnosti (Ivanković i sur., 1988.). Medijan (Med) kao mjera centralne tendencije i vrijednost koja se u nizu vrijednosti poredanih po veličini nalazi točno u sredini, standardnom greškom (SG) mjera odstupanja aritmetičkih sredina uzoraka iz jedne populacije od aritmetičkih sredina populacije. Friedman ANOVA and Kendall's concordance neparametrijskim testom testirane su razlike aritmetičkih sredina multiplih uzoraka (Statistika 7.1.).

Rezultati

Ukupno je analizirano 5200 objekata (2510 cijelih stanica i 2510 jezgara) u 20 razmaza periferne krvi kokoši, noja, patke i purana (Slika 2). Osnovne morfometrijske ka-rakteristike (ukupan broj analiziranih eritrocita svake vrste, srednja, minimalna i maksimalna vrijednost, varijanca, standardna varijacija i standardna pogreška) prikazane su u tablicama 1 - 4. Uspoređujući različite vrste ptica, statistički značajnu razliku na razini p<0,01 našli smo u svim ispitivanim vari-jablama: površini, opsegu, minimalnom i maksimalnom

polumjeru, ispupčenosti, odnosno konveksitetu površine, duljini i širini te pravilnosti (engl. form factor) i izdu-ženosti cijele stanice, odnosno citoplazme eritrocita kao i u nukleo-citoplazmatskom omjeru. Isto vrijedi i za ispitivane parametre jezgre: površinu, opseg, minimalni i maksimalni polumjer, pravilnost i izduženost jezgre (tablice 1 - 4.). Najveću prosječnu površinu, konveksitet površine i opseg cijele stanice eritrocita imao je noj (86,69 μm2; 87,90 μm2;

36,81 μm - redom), zatim puran (83,04 μm2; 84,64 μm2;

35,69 μm), slijedila je patka (70,06 μm2; 70,95 μm2; 32,68 μm), dok su navedeni pokazatelji bili najmanji za eritrocite kokoši (61,94 μm2; 63,92 μm2; 31,24 μm). Najmanji minimalni polumjer eritrocita imala je kokoš (3,23 μm), nakon toga patka (3,43 μm), pa noj (3,71 μm), a najveći puran (3,97 μm). Najveći maksimalni polumjer citoplazme pokazivali su eritrociti noja (6,94 μm), zatim patke (6,13 μm), purana (5,97 μm) pa kokoši (5,80 μm). Što se tiče duljine stanice, statistički značajno najdulji eri-trociti izmjereni su u noja (13,66 μm), a manji u purana (12,58 μm), patke (12,02 μm) i na kraju kokoši (11,34 μm). Najširi su bili eritrociti purana (8,59 μm), a najuži kokoši (7,02 μm), dok su eritrociti noja (7,89 μm) bili širi od patkinih (7,33 μm). Najveći omjer jezgre i citoplazme imala je kokoš (0,20), slijedila je patka (0,16), noj (0,14), te puran (0,13). Za razliku od cijelog eritrocita najveću površinu jezgre imala je kokoš (12,85 μm2), noj je bio na drugom mjestu s 12,59 μm2, puran je imao najmanju površinu jezgre (10,99 μm2), dok su patke imale nešto veću jezgru od purana (11,90 μm2). Opseg jezgre bio je veći u noja (15,21 μm) i patke (13,79 μm) nego u kokoši (13,68 μm) i purana (12,91 μm). Najmanji polumjer jezgara bio je statistički značajno najveći u kokoši (1,40 μm), zatim u purana (1,20 μm), patke (1,16 μm), dok je noj imao najmanji polumjer jezgara (1,08 μm). Kako je za jezgre eritrocita noja izmjeren najmanji minimalni polumjer, ali i najveći mak-simalni polumjer jezgre od 3,17 μm, smatramo da to govori o izrazitoj anizonukleozi. Najmanji maksimalni polumjer imao je puran (2,51 μm), zatim patka (2,74 μm), dok je kod kokoši bio nešto veći (2,53 μm). Najizduženije su jezgre nađana u eritrocitima noja s najvećom duljinom (6,11 μm) i najmanjom širinom (2,65 μm) te najvećim faktorom izduženosti (2,34), dok su najokruglije jezgre eritrocita bile u kokoši s najmanjom dužinom (4,81 μm) i najvećom širinom (3,29 μm) te najmanjim faktorom izdu-ženosti (1,47). Faktor izduženosti jezgara eritrocita patke bio je veći (1,90) od onog u purana (1,70). Najpravilnije eritrocite imale su patke (FF 0,82), a najnepravilnije noj (FF 0,80), dok su najpravilnije jezgre eritrocita imale kokoši (0,86), a najnepravilnije također noj (0,68).


Slika 1. Morfometrijska analiza stanica i jezgri u razmazu periferne krvi ptica Figure 1. The Morphometrical analysis of cells and nucleus in avian peripheral blood smears

a) b) c) d)

Slika 2. Eritrociti: a) kokoš, b) noj, c) patka, d) puran Figure 2. Erythrocytes: a) hen, b) ostrich, c) duck and d) turkey


Tablica 1. Morfometrijski pokazatelji eritrocita (cijele stanice i jezgre) kokoši

Objekt Pokazatelji N X MED MIN MAX V SD SG Površina (μm2) 742 61,94 62,06 59,64 63,24 2,20 1,48 0,66 Opseg (μm) 742 31,24 31,00 30,13 32,41 0,77 0,88 0,39 Minimalni polumjer (μm) 742 3,23 3,23 3,09 3,32 0,00 0,08 0,03 Maksimalni polumjer (μm) 742 5,80 5,76 5,45 6,07 0,06 0,25 0,11 Konveksitet površine (μm2) 742 63,92 63,21 60,81 68,53 8,31 2,88 1,28 Duljina (μm) 742 11,34 11,24 10,62 11,80 0,23 0,48 0,218 Širina (μm) 742 7,02 6,99 6,74 7,28 0,04 0,21 0,09 Faktor pravilnosti 742 0,80 0,81 0,78 0,82 0,00 0,01 0,00

Stanica

Faktor izduženosti 742 1,62 1,62 1,48 1,76 0,00 0,09 0,04 Površina (μm2) 742 12,85 12,75 11,89 13,89 0,51 0,71 0,32 Ospeg (μm) 742 13,68 13,67 13,14 14,29 0,16 0,40 0,18 Minimalni polumjer (μm) 742 1,40 1,43 1,33 1,45 0,00 0,05 0,02 Maksimalni polumjer (μm) 742 2,53 2,51 2,44 2,64 0,00 0,07 0,03 Faktor pravilnosti 742 0,86 0,85 0,85 0,87 0,00 0,01 0,00 Faktor izduženosti 742 1,47 1,45 1,41 1,56 0,00 0,05 0,02

Jezgra

Odnos jezgra/citoplazma 742 0,20 0,20 0,20 0,21 0,00 0,00 0,00

Legenda: N - ukupan broj analiziranih eritrocita, X - aritmetička sredina, MED - medijan, MIN - minimalna vrijednost, MAX - maksimalna vrijednost, V - koeficijent varijabilnosti, SD - standardna devijacija i SG - standardna pogreška Table 1. Morphometric parameters of hen erythrocytes (cell in whole and nucleus)

Object Parameters N X MED MIN MAX V SD SEM Area (μm2) 742 61,94 62,06 59,64 63,24 2,20 1,48 0,66 Outline (μm) 742 31,24 31,00 30,13 32,41 0,77 0,88 0,39 Minimal radius (μm) 742 3,23 3,23 3,09 3,32 0,00 0,08 0,03 Maximal radius (μm) 742 5,80 5,76 5,45 6,07 0,06 0,25 0,11 Convex area (μm2) 742 63,92 63,21 60,81 68,53 8,31 2,88 1,28 Length (μm) 742 11,34 11,24 10,62 11,80 0,23 0,48 0,218 Breadth (μm) 742 7,02 6,99 6,74 7,28 0,04 0,21 0,09 Form-factor 742 0,80 0,81 0,78 0,82 0,00 0,01 0,00

Cell

Elongation factor 742 1,62 1,62 1,48 1,76 0,00 0,09 0,04 Area (μm2) 742 12,85 12,75 11,89 13,89 0,51 0,71 0,32 Outline (μm) 742 13,68 13,67 13,14 14,29 0,16 0,40 0,18 Minimal radius (μm) 742 1,40 1,43 1,33 1,45 0,00 0,05 0,02 Maximal radius (μm) 742 2,53 2,51 2,44 2,64 0,00 0,07 0,03 Form-factor 742 0,86 0,85 0,85 0,87 0,00 0,01 0,00 Elongation factor 742 1,47 1,45 1,41 1,56 0,00 0,05 0,02

Nucleus

Nuclear/cytoplasmatic ratio 742 0,20 0,20 0,20 0,21 0,00 0,00 0,00

Legend: N – number of analysed objects, X - arithmetic mean, MED - median, MIN - minimal value, MAX – maximal value, V - coefficient of variability, SD – standard deviation and S.E.M. - standard error of the mean.


Tablica 2. Morfometrijski pokazatelji eritrocita (citoplazme i jezgre) noja


Stanica


Jezgra


Legenda: N - ukupan broj analiziranih eritrocita, X - aritmetička sredina, MED - medijan, MIN - minimalna vrijednost, MAX - maksimalna vrijednost, V - koeficijent varijabilnosti, SD -standardna devijacija i SG - standardna pogreška Table 2. Morphometric parameters of ostrich erythrocytes (cell in whole and nucleus)


Cell


Nucleus


Legend: N – number of analysed objects, X - arithmetic mean, MED - median, MIN - minimal value, MAX – maximal value, V - coefficient of variability, SD – standard deviation and SE - standard error of the mean.


Tablica 3. Morfometrijski pokazatelji eritrocita (citoplazme i jezgre) patke


Stanica


Jezgra


Legenda: N - ukupan broj analiziranih eritrocita, X - aritmetička sredina, MED - medijan, MIN - minimalna vrijednost, MAX - maksimalna vrijednost, V - koeficijent varijabilnosti, SD - standardna devijacija i SG - standardna pogreška Table 3. Morphometric parameters of duck erythrocytes (cell in whole and nucleus)


Cell


Nucleus




Tablica 4. Morfometrijski pokazatelji eritrocita (citoplazme i jezgre) purana


Stanica


Jezgra


Legenda: N - ukupan broj analiziranih eritrocita, X - aritmetička sredina, MED - medijan, MIN - minimalna vrijednost, MAX - maksimalna vrijednost, V - koeficijent varijabilnosti, SD - standardna devijacija i SG - standardna pogreška Table 4. Morphometric parameters of turkey erythrocytes (cell in whole and nucleus)


Cell


Nucleus




Diskusija i zaključci

Različite vrste ptica, iako imaju iste morfološke karakte-ristike eritrocita s jezgrom, znatno se razlikuju u veličini i obliku (Fudge, 2000.). Uz to su uočene i fiziološke varijacije unutar jedne vrste, a primijećeno je da, kao i druge vrste krvnih stanica, i ove mogu biti podložne stresu (Poljičak-Milas i sur., 2004.). Ptičji eritrociti mogu varirati od okruglih do izduženih ili nepravilnih, a jezgra može poka-zivati različitu staničnu lokaciju, kao što može imati i suže-nja i ispupčenja (Campbell, 1995.). Precizno poznavanje svih normalnih hematopoetskih stanica u razmazu periferne krvi, pa tako i eritrocita, osnova je za razumijevanje raznih fizioloških i patoloških stanja te dijagnostiku bolesti ptica (Campbell, 1994.). Morfologija eritrocita ptica je područje interesa znanstvenika već cijelo stoljeće (Cleland i Johnston, 1912.; Hartman i Lessler, 1963.). Ribe također imaju sličnu morfologiju izduženih eritrocita s jezgrama, te su se mje-renja njihovih eritrocita temeljila na dva različita promjera stanica i jezgara: dužem (CLD ili NLD, engl. cell or nucleus long diameter) i kraćem (CSD ili NSD, engl. cell or nucleus short diameter). Na osnovu njih izračunavane su površine stanice (CA, engl. cell area) i jezgre (NA, engl. nucleus area). Formule za izračunavanje uzimale su u obzir izduže-nost stanica i jezgri kao i srednji volumen eritrocita (MCV) koji se također može mjeriti, ali hematološkim brojačima. Međutim, vrijednosti srednjeg volumena eritrocita i površine nisu komparabilne. Promjer stanice izražava se u µm, povr-šina u µm2, a volumen u µm3 (Gregory, 2003.). Budući da je morfometrija kvantitativni opis geometrijskih struktura u svim dimenzijama (Baak, 1985) te da za razliku od drugih morfoloških metoda omogućava numeričku objektivizaciju, a kvantitativni parametri su objektivni i reproducibilni (Oberholzer i sur., 1991.), postala je metoda izbora u različi-tim mjerenjima, naročito na humanim stanicama. Vrijednost morfometrije proučavana je na cijelom nizu staničnih ele-menata u humanoj medicini (Waltz i sur. 1993.) kako u svrhu razlikovanja pojedinih dijagnostičkih kategorija, od-nosno benignih i malignih promjena, tako i sa ciljem vred-novanja morfometrijskih karakteristika u predviđanju tijeka bolesti i prognoze. Korisni podaci dobiveni su i analizom limfatičnih stanica u razmazu periferne krvi zdravih osoba i bolesnika s kroničnom limfocitnom leukemijom (Strojny i sur., 1987.), pojedinih tipova stanica u ne-neoplastičnim limfnim čvorovima (Ricco i sur., 1985.). Morfometrijske ka-rakteristike eritrocita koreliraju s dijagnostičkim pokazate-ljima koronarne insuficijencije u ljudi (Alexandratou i sur., 1999.), a u alkoholičara su utvrđene znatno veće vrijednosti površine i promjera eritrocita, što se dovodi u vezu s di-rektnim djelovanjem alkohola i oštećenjem jetre (Gil Extre-mera i sur., 1989.). U veterinarskoj medicini do sada je utvr-đeno da hemoragični šok u pasa dovodi do morfometrijskih promjena eritrocita (Berezina i sur., 2001.). Morfometrijska analiza eritrocita različitih vrsta ptica na našem uzorku pokazala je značajne razlike u ispitivanim parametrima stanice i jezgre. Kao što se i očekivalo prema podacima iz literature (Fudge, 2000.), noj je imao najveće stanice relativno manjih jezgara u odnosu na ostale vrste, što

se očitovalo manjim nukleo-citoplazmatskim omjerom, a jezgre su bile izduženije i nepravilnije. Eritrociti purana su bili drugi po površini, opsegu te konveksitetu, ali manjih površina jezgara koje su izduženije. Kokošji eritrociti bili su najmanji, ali s relativno najvećim jezgrama u odnosu na citoplazmu, te su najokrugliji i najpravilniji. Eritrociti u patke su imali karakteristike između sve ostale tri jasnije definirane vrste. Morfometrijska analiza normalnih eritrocita objektiviziranjem kvantitativnih parametara može biti temelj izrade referentnih vrijednosti za pojedine vrste ptica. Takve brojčane referentne vrijednosti bile bi (kvalitetniji) standard za određivanje odstupanja u fiziološkim i patološkim sta-njima te preciznija polaznica u dijagnostici hematoloških poremećaja i bolesti ptica. Ovaj rad je napravljen uz financijsku potporu Ministarstva znanosti, obrazovanja i športa Republike Hrvatske, projekt (053-0531854-1850).

Literatura

Alexandratou, E., D. Yova, D. V. Cokkinos (1999.): Morphometric characteristics of red blood cells as diagnostic factors for coronary artery disease. Clin. Hemorheol. Microcirc. 21, 383 - 388.

Antonangelo, L., P. H. N. Saldiva, E. Amaro, V. L. Capelozzi (1994.): Utility of computerized morphometry combined with AgNOR staining in distinguishing benign from malignant pleural effusions. Analyt. Quant. Cytol. Histol.16, 247-252.

Baak, J. P. A. (1985.): The Principies and Advances of Quantitative Pathology. Anal. Quant. Cytol. Histol. 9, 89 - 95.

Baak J. P. A. (1991.): Manual of quantitative pathology in cancer diagnosis and prognosis. Springer Verlag New York., 19-26.

Baak, J. P. A., E. C. M. Wisse-Brekelmans, F. A. Langley, A. Talerman, J. F. M. Delemarre (1986.): Morphometric data to FIGO stage and histological type and grade for prognosis of ovarian tumours. J. Clin. Pathol. 39, 1340-1346.

Berezina, T. L., S. B. Zaets, V. L. Kozhura, I. S. Novoderzhkina, A. K. Kirsanova, E. A. Deitch, G. W. Machiedo (2001.): Morphologic changes of red blood cells during hemorrhagic shock replicate changes of aging. Shock 15, 467 - 470.

Campbell, T. W. (1994.): Hematology. U: Avian Medicine, Principles and Application (Ritchie, B. W., G. J. Harrison, L. R. Harrison, urednici). F. L. Wingers Lake Worth. 176 - 198.

Campbell, T. W. (1995.): Avian Hematology and Cytology, 2. izdanje. Iowa State University Press Iowa City. str. 3 –17.

Cleland, J. B., T. H. Johnston (1912.). Relative dimensions of the red blood cells of vertebrates, especially of birds. Emu. 11, 188-197.

Collan, Y., T. Torkkeli, E. Pesonen, E. Jantunen, V. M. Kosma (1987.): Application of morphometry in tumor pathology. Analyt. Quant. Cytol. Histol. 9, 79-88.

Crocker, J., E. L. Jones, R. C. Curran (1983.): A comparative study of nuclear form factor, area and diameter in non-Hodgkin’s lymphomas and reactive lymph nodes. J. Clin. Pathol. 36, 298-302.

Crocker, J., E. L. Jones, R. C. Curran (1983. a): The form factor of alpha-naphthyl acetate esterase-positive cells in non-Hodgkin’s lymphomas and reactive lymph nodes. J. Clin. Pathol. 36, 303-306.


Fudge, A. M. (2000.): Laboratory Medicine, Avian and Exotic Pets. W. B. Saunders Company Philadelphia. str. 9-33.

Gil Extremera, B., R. Ortiz, M. A. Maldonado, L. A. A. Rubio, I. J. Rico (1989.): Erythrocyte morphometry in alcoholism. An. Med. Interna. 6, 454-457.

Gregory, R. T. (2003.): [serial online] [cited October 16th] [9 screens] Avaliable from: http://www.genomesize.com/ /cellsize/fish.htm

Hartman, F. A., M. A. Lessler (1963.): Erythrocyte measurements in birds. The Auk. 80, 467-473.

Ivanković, D, J. Božikov, J. Kern, B. Kopljar, G. Luković, S. Vuletić (1988.): Osnove statističke analize za medicinare. Bi-blioteka udžbenici i priručnici Medicniskog fakulteta Zagreb.

Kardum-Skelin, Ika (2008.): Morfometrijski i kinetički parametri kao dijagnostički i prognostički čimbenici leukemijskih oblika kroničnih limfoproliferativnih bolesti. Doktorska disertacija. Sveučilište u Zagrebu, Medicinski fakultet Zagreb. str. 160.

Kisner, H. J. (1988.): Principles and clinical application of image analysis. Clin. Lab. Med. 8, 723 - 736.

Machevsky, A. M., B. S. Erler (1994.): Morphometry in pathology. U. Machevsky, A. M., ur. Image Analysis. A Primer for Pathologists. Raven Press, New York, str.125-180.

Oberholzer, M., H. Christen, R. Ettlin, M. Buser, M. Oestereicher, R. Gschwind (1991.): Some fundamental aspects of mor-phometry in clinical pathology, demonstrated on a simple, multipurpose analysis system. Analyt. Quant. Cytol. Histol.13, 316-320.

Poljičak-Milas, Nina, Suzana Milinković-Tur, Z. Stojević, Z. Biđin (2004.): Vergleich des weissen Blutbildes bei Junghähnen und

Junghennen während des Fastens und nach der erneuten Fütterung. Tierärztl. Umsch. 59, 464-469.

Ricco, R., G. De Benedictis, C. Giardina, P. Bufo, L Resta, V. Pesce Delfino (1985.): Morphometric analytical evaluators of lymphoid populations in nonneoplastic lymph nodes. Analyt. Quant. Cytol. Histol. 7, 288-293.

Schmidt, J. A., J. Black (1992.): Determination of three-di-mensional morphometry of adherent cells by surface profilometry. Biomaterials. 13, 483-487.

Seili-Bekafigo, Irena, Ika Kardum-Skelin (2003.): Kompjutorizi-rana analiza slike. U: Audy-Jurković. Ginekološka citologija u Hrvatskoj, 50 godina poslije. Prvi internacionalni zananstveni simpozij kliničke citologije „Jasna Ivić“. Zagreb. 261 – 270.

Statistika 7.1 –Electronic Textbook StatSoft [serial online] 2006. [cited November 28] [9 screens] Avaliable from: URL:http://statsoftinc.com/

Strojny, P., Z. Traczyk, M. Rozycka, W. Bem, W. Sawicky (1987.): Fourier analysis of nuclear and cytoplasmic shape of blood lymphoid cells from healthy donors and chronic lymphocytic leukemia patients. Anal. Quant. Cytol. Histol. 9, 475-479.

Tosi, P., C. Miracco, P. Luzi, M. Cintorino, R. Kraft, H. Cottier (1986.): Morphometric distinction of granulomas in tuberculosis and sarcoidosis. Difference in nuclear profiles. Analyt. Quant. Cytol. Histol. 8, 233-240.

Van Diest, P. J., J. P. A. Baak (1991.): Morphometry. U: Comprehensive cytopathology, (Bibbo, M. urednici). W. B. Saunders Company Philadelphia. str. 946-964.

Waltz, A. E., R. Morimoto, Y. Machevsk (1993.): Computerized interactive morphometry and the diagnosis of lymphoid-rich effusion. A. J. C. P. 99, 570-575.

MORPHOMETRIC CHARACTERISTICS OF AVIAN ERYTHROCYTES – PRELIMINARY STUDY

Summary

Although erythrocytes of different bird species have the identical characteristics of cells with a nucleus, they differ significantly in size and shape, along with physiological variations within each species. Comparing erythrocytes of a hen, ostrich, duck and turkey, we have found statistically significant differences in all examined variables: area, outline, minimal and maximal radius, cell protrusion or convex area, length, breadth and form-factor as well as elongation of a cell in whole, that is erythrocyte cytoplasm and in nucleo-cytoplasmic ratio. The same goes for the examined nucleus parameters: area, outline, minimal and maximal radius, form-factor and elongation of the nucleus. Large birds, such as ostriches, have the largest cells with relatively smaller nuclei in comparison to other species which can be seen in smaller nucleo-cytoplasmic ratio, their nuclei are more extended and more unsymmetrical. Turkey erythrocytes are second in area, outline and convex area but with smaller nuclei area which are more extended. Hen erythrocytes are the smallest but have the relatively largest nuclei in comparison to the cytoplasm as well as they are the most rounded and most symmetrical. Duck erythrocyte characteristics are somewhere between the other three more clearly defined species. By objectifying quantitative parameters, morphometrical analysis of normal erythrocytes can be the basis for elaboration of reference values for each avian species. Such numerical reference values would provide more quality standards for the determination of aberrations in physiological and pathological conditions as well as a more precise starting point in diagnostics of avian haematological disturbances and diseases. Key words: erythrocytes, birds, morphometry


KONCENTRACIJE SERUMSKIH BJELANČEVINA I AKTIVNOST AMINOTRANSFERAZA U JETRI I BUBREZIMA PAČIĆA TIJEKOM GLADOVANJA

Suzana Milinković-Tur1, Nina Poljičak-Milas2, Jasna Aladrović1, Blanka Beer Ljubić1, Nikolina Novak1, Ivona Žura Žaja1

1 Zavod za fiziologiju i radiobiologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska 2 Zavod za patološku fiziologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Istražen je utjecaj šestodnevnog gladovanja na koncentracije pojedinih frakcija serumskih bjelančevina te aktivnost aspartat aminotransferaze (AST) i alanin aminotransferaze (ALT) u homogenatima jetre i bubrega kod 28 dana starih pačića. U dobi od 28 dana pačići su podijeljeni u dvije skupine: kontrolnu skupinu pačića koja je i dalje normalno hranjena te pokusnu skupinu pačića koja je podvrgnuta šestodnevnom gladovanju. Obje skupine imale su pristup vodi ad libitum. Trećeg, četvrtog, petog i šestoga dana gladovanja žrtvovano je dekapitacijom po osam izgladnjivanih i po sedam normalno hranjenih pačića, a uzorci krvi i tkiva za analize uzeti su istovremeno od obje skupine pačića. Koncentracije pojedinih frakcija serumskih bjelančevina su određene elektroforezom, a aktivnosti AST i ALT u homogenatima tkiva su određene spektrofotometrijski. Tijekom šestodnevnog gladovanja utvrđene su značajne promjene promatranih pokazatelja. Tako je u svim pokusnim razdobljima utvrđena značajno niža koncentracija serumskih albumina kod izgladnjivanih pačića u odnosu na normalno hranjene i to trećeg (P = 0,004), četvrtog (P = 0,003), petog (P = 0,0012) i šestoga (P = 0,0477) dana gladovanja. Dok se koncentracija serumskih alfa-1 globulina nije značajnije razlikovala od kontrolne skupine, koncentracija alfa-2 globulina kod izgladnjivanih pačića bila je značajno niža četvrtoga dana gladovanja (P = 0,0192). Značajno niže koncentracije serumskih beta (P = 0,0040) i gama globulina (P = 0,0034) utvrđene su petoga dana gladovanja kod izgladnjivanih pačića u odnosu na normalno hranjene pačiće. Aktivnost AST u jetri izgladnjivanih pačića bila je značajno viša od kontrolnih petog (P = 0,0300) i šestoga dana gladovanja (P = 0,0144), a aktivnost ALT značajno niža četvrtog (P = 0,0393) i šestoga (P = 0,0114) dana gladovanja. U odnosu na kontrolnu skupinu aktivnost AST u bubrezima izgladnjivanih pačića bila je značajno niža trećega dana gladovanja (P = 0,0275), dok se aktivnost ALT nije značajnije razlikovala od kontrole. Promjene koncentracija serumskih bjelančevina te aktivnosti aminotransferaza u jetri i bubrezima izgladnjivanih pačića vjerojatno su posljedica smanjene obnove bjelančevina u organizmu uslijed nedostatka aminokiselina u vrijeme gladovanja ali i različitog obima glukoneogeneze. Istovremeno rezultati upućuju na zaključak da tijekom šestodnevnog gladovanja još uvijek nije došlo do značajnije razgradnje tkivnih bjelančevina u svrhu namicanja prijeko potrebne energije. Ključne riječi: gladovanje, pačići, serumske bjelančevine, aminotransferaze Uvod Određivanje serumskih bjelančevina važna je dijagnostička metoda u kliničkoj biokemiji, jer i malene promjene poje-dinih frakcija serumskih bjelančevina mogu biti značajne u procjeni zdravstvenoga statusa životinja. Kod ljudi i primata albumini su najzastupljenije serumske bjelančevine i čine 60 do 67% ukupnih bjelančevina, dok kod životinja oni čine 35 do 50% ukupnih serumskih bjelančevina. Albumini su glav-na rezerva bjelančevina i njihovih sastavnih jedinica amino-kiselina, ali i važni prenosioci masnih kiselina, minerala i vi-

tamina. Alfa-1 i alfa-2 globulini su sastavni dio lipoproteina plazme, beta globulini imaju važnu ulogu u metabolizmu že-ljeza, a gama globulini sudjeluju u imunološkim reakcijama. Bjelančevine plazme osjetljive su na promjene u sastavu i načinu ishrane. Nedostatak bjelančevina u hrani dovodi do hipoproteimemije i hipoalbuminemije kod štakora, pilića i pasa (Kaneko i sur., 1997.), a tvorba i obnavljanje bjelan-čevina krvne plazme odvija se u jetri. Uzme li se u obzir postojanost glukoze u krvi ptica tijekom gladovanja (Brady i sur., 1978.) te brzo iscrpljivanje zaliha glikogena, očekivati je da će u gladovanju svi metabolički

Prof. dr. sc. Suzana Milinković-Tur; Zavod za fiziologiju i radiobiologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Heinzelova 55, 10 000 Zagreb Republika Hrvatska; tel: ++385 1 2390 171; fax: ++385 1 2441 390; e-mail: [email protected]

KONCENTRACIJE SERUMSKIH BJELANČEVINA I AKTIVNOST AMINOTRANSFERAZA U JETRI I BUBREZIMA PAČIĆA TIJEKOM GLADOVANJA 228

putevi, što znači i metabolizam bjelančevina, morati brzo i usklađeno mijenjati svoje funkcije (Bordel i Haase, 1993.; Cherel i sur., 1993.; Cherel i sur., 1994.; Lien i sur., 1999.). Kada se potroši oko 80% spremišne masti, dolazi do poja-čanog katabolizma bjelančevina u tkivima i ulaska amino-kiselina u energetski metabolizam (Cherel i sur., 1994.). Jetra u intermedijarnim pretvorbama sudjeluje više od bilo kojeg drugog organa, jer se u jetrenim stanicama sastaju i križaju putevi razgradnje i sinteze ugljikohidrata, masti i bjelančevina. Aminotransferaze, osim što posredno sudjeluju u procesu glukoneogeneze, sudjeluju i u tvorbi nekih aminokiselina koje organizam u vrijeme gladovanja ne prima hranom, te su važne za brojne procese biokemijske izgradnje i pregradnje. Najznačajnije aminotransferaze koje povezuju metabolizam ugljikohidrata i bjelančevina su aspartat aminotransferaza (AST) i alanin aminotransferaza (ALT). Aktivnost AST i ALT u pojedinim tkivima kao i njihova lokacija u različitim staničnim strukturama ovisi o životinjskoj vrsti. U ptica ALT nije jetreno specifični enzim kao što je to u sisavaca. U pilećoj jetri ALT je gotovo isključivo mitohondrijski enzim, gdje se i nalazi više od 90% enzima, a svega 6% se nalazi u citosolu. Za razliku od ALT, AST je u pilećoj jetri većinom citosolni enzim, a svega 8 do 10% se nalazi u mitohon-drijima (Sarkar, 1977.). Procjene metaboličkih zbivanja tijekom gladovanja važne su zbog problema realimentacije prethodno izgladnjele živo-tinje. S obzirom na višestruke i značajne uloge serumskih bjelančevina u organizmu koje u različitim stresnim uvje-tima mogu biti narušene, cilj ovoga rada bio je istražiti kretanje koncentracija pojedinih frakcija serumskih bjelan-čevina kod pačića tijekom šestodnevnog gladovanja. Isto-vremeno smo željeli istražiti aktivnost aminotransferaza u homogenatima tkiva, koje imaju važnu ulogu u metabolizmu bjelančevina, ali i održavanju normoglikemije tijekom gla-dovanja.

Materijal i metode

Jednodnevni pačići teške linije Peking Ducks uzgajani su u standardnim uvjetima držanja i hranjeni komercijalnom smjesom. Do 28 dana starosti pačići su imali pristup hrani i vodi ad libitum. U starosti od 28 dana pačići su podijeljeni u dvije skupine: kontrolnu skupinu pačića koja je i dalje imala pristup vodi i hrani ad libitum (28 pačića) te pokusnu sku-pinu pačića koja je podvrgnuta šestodnevnom gladovanju (32 pačića), čime je i započeto pokusno razdoblje. Pačići su žrtvovani dekapitacijom 3., 4., 5. i 6. dana gladovanja i to po osam pačića pokusne i po sedam pačića kontrolne skupine. Krv za analizu uzimana je iz krvarećeg vrata istovremeno pokusnoj i kontrolnoj skupini pačića. Centrifugiranjem ugrušane krvi izdvojen je krvni serum. U dobivenim uzor-cima krvnoga seruma koncentracije albumina, alfa-1 globu-lina, alfa-2 globulina, beta globulina i gama globulina određene su elektroforezom na trakama geliranog celuloza-acetata, a dobivene vrijednosti izražene su u g/L. Nakon žrtvovanja životinja odstranjeni su jetra i bubrezi, koji su odmah osušeni izvagani i narezani na komadiće.

Komadići tkiva homogenizirani su s 250 mM saharozom u staklenom Potter-Elvehjem homogenizatoru uronjenom u ledenu kupelj. Homogenati su potom centrifugirani ultracen-trifugom s hlađenjem na 100 000 g/60 minuta pri 0 °C. Supernatant je upotrijebljen za određivanje aktivnosti cito-solne aspartat aminotransferaze [aspartate:2-oxoglutarate aminotransferase (AST); EC 2.6.1.1] i alanin aminotrans-feraze [L-alanine:2-oxoglutarate aminotransferaze (ALT); EC 2.6.1.2]. Aktivnosti AST i ALT u supernatantu homogenata tkiva određene su UV-Assay, metodom po Bergmeyer and Bernt (Bergmeyer, 1974), kemikalijama “Boehringer”, Mannheim, Germany, a rezultati su izraženi u U/mg bjelančevina. Bjelančevine su određene metodom po Lowry i sur. (1951.) s humanim albuminom kao standardom. Dobiveni rezultati obrađeni su statistički i prikazani kao medijan, te donji i gornji kvartil. Značajnost razlika između pokusne i kontrolne skupine te unutar skupina provjerena je ANOVA Kruskal-Wallis testom računalnim programom STATISTICA 7.1 (StatSoft, SAD).

Rezultati

Koncentracije pojedinih frakcija serumskih bjelančevina prikazane su u Tablici 1, a aktivnosti AST i ALT u homo-genatima jetre i bubrega prikazane su u tablicama 2 i 3. Stres potaknut šestodnevnim gladovanjem rezultirao je značajnim promjenama koncentracije serumskih albumina. Tako je u svim pokusnim razdobljima tijekom šestodnev-nog gladovanja utvrđena značajno niža koncentracija se-rumskih albumina kod izgladnjivanih pačića nego kod normalno hranjenih. Značajnost razlika iznosila je 3. dana P = 0,004, 4. dana P = 0,003, 5. dana P = 0,0012 i 6. dana gladovanja P = 0,0477. Koncentracija serumskih albumina unutar izgladnjivane skupine pačića ovisila je o trajanju gladovanja, te je značajan pad njihove koncentracije utvr-đen 5. dana gladovanja (P = 0,0008), da bi se vrijednosti značajno povisile po završetku šestodnevnog gladovanja (P = 0,0109). Uspoređujući vrijednosti unutar kontrolne skupine pačića značajan pad koncentracije albumina ta-kođer je utvrđen 5. dana pokusa (P = 0,0027) u odnosu na prethodno pokusno razdoblje. Tijekom cijelog pokusnog razdoblja koncentracija serum-skih alfa-1 globulina nije se značajnije razlikovala od kon-trolnih vrijednosti. No, uspoređujući vrijednosti unutar po-kusne skupine pačića utvrđen je značajan pad koncentracije alfa-1 globulina 4. (P = 0,0109) i 5. dana gladovanja (P = 0,0016) te značajan porast vrijednosti 6. dana gladovanja (P = 0,0012). Unutar kontrolne skupine pačića značajan pad koncentracije alfa-1 globulina utvrđen je 5. (P = 0,0027) u odnosu na 4. dan pokusa. Za razliku od serumskih alfa-1 globulina, koncentracija alfa-2 globulina u izgladnjivanih pačića bila je značajno niža od kontrolnih vrijednosti 4. dana gladovanja (P = 0,0192). Uspoređujući rezultate unutar izgladnjivane skupine pačića, koncentracija alfa-2 globulina nije se značajnije mijenjala tijekom šesto-dnevnog gladovanja, dok je u kontrolnoj skupini utvrđen značajan porast 4. (P = 0,0284) u odnosu na 3. dan pokusa.


Tablica 1. Kretanje koncentracija serumskih bjelančevina kod normalno hranjenih i izgladnjivanih pačića

Dani gladovanja 3. 4. 5. 6.

Kontrola 26,77 25,66-27,15

26,19 24,52-29,47

19,91 b

19,37-21,83 22,68

18,85-23,90 Albumini (g/L) Gladovanje 23,57 **

20,75-25,41 22,40 **

20,71-23,36 16,53 **, C

15,70-16,80 18,05 *, A

17,34-19,12

Kontrola 3,61 2,94-5,41

3,18 2,82-3,85

1,85 b

1,73-1,95 2,65

2,24-5,55 Alfa-1 globulini (g/L) Gladovanje 3,89

3,79-4,37 3,16 A

3,00-3,42 2,15 B

1,66-2,45 3,63 B

3,09-3,85

Kontrola 3,79 1,74-7,00

9,62 a

7,46-9,75 6,21

0,94-7,68 1,33

1,11-5,00 Alfa-2 globulini (g/L) Gladovanje 3,87

1,28-4,71 4,23 *

1,02-5,03 3,27

3,10-4,40 3,85

0,71-4,38

Kontrola 1,00 0,85-7,74

1,19 1,01-3,76

1,89 1,04-6,73

7,11 1,28-7,63 Beta globulini

(g/L) Gladovanje 7,17 1,45-3,88

1,57 0,70-6,50

0,42 **, B

0,35-0,57 1,91

0,37-3,89

Kontrola 0,80 0,70-1,09

1,13 0,86-1,92

2,19 1,81-2,46

0,85 a

0,77-1,31 Gama globulini (g/L) Gladovanje 0,93

0,64-1,10 0,81

0,22-0,97 0,67 **

0,52-0,86 0,89

0,80-1,05

Vrijednosti su prikazane kao medijan te donji i gornji kvartil. Značajnost razlika između izgladnjivane i kontrolne skupine po danima gladovanja: * P < 0,05; ** P < 0,01. Značajnost razlika kod pokusne skupine pačića u odnosu na prethodno pokusno razdoblje: A P < 0,05; B P < 0,01; C P < 0,001. Značajnost razlika kod kontrolne skupine pačića u odnosu na prethodno pokusno razdoblje: a P < 0,05; b P < 0,01 Table 1. Changes of serum proteins concentrations in the normally fed and fasted ducklings

Days of fasting 3. 4. 5. 6.

Control 26.77 25.66-27.15

26.19 24.52-29.47

19.91 b

19.37-21.83 22.68

18.85-23.90 Albumin (g/L) Fasted 23.57**

20.75-25.41 22.40**

20.71-23.36 16.53**, C

15.70-16.80 18.05*,A

17.34-19.12

Control 3.61 2.94-5.41

3.18 2.82-3.85

1.85 b

1.73-1.95 2.65

2.24-5.55 Alfa-1 globulin (g/L) Fasted 3.89

3.79-4.37 3.16A

3.00-3.42 2.15B

1.66-2.45 3.63B

3.09-3.85

Control 3.79 1.74-7.00

9.62 a

7.46-9.75 6.21

0.94-7.68 1.33

1.11-5.00 Alfa-2 globulin (g/L) Fasted 3.87

1.28-4.71 4.23 *

1.02-5.03 3.27

3.10-4.40 3.85

0.71-4.38

Control 1.00 0.85-7.74

1.19 1.01-3.76

1.89 1.04-6.73

7.11 1.28-7.63 Beta globulin

(g/L) Fasted 7.17 1.45-3.88

1.57 0.70-6.50

0.42**

0.35-0.57B 1.91

0.37-3.89

Control 0.80 0.70-1.09

1.13 0.86-1.92

2.19 1.81-2.46

0.85 a

0.77-1.31 Gamma globulin (g/L) Fasted 0.93

0.64-1.10 0.81

0.22-0.97 0.67**

0.52-0.86 0.89

0.80-1.05

The values were expressed as median and upper and lower quartille. The significance of difference between control and experimental group: * P<0.05; ** P< 0.01. The significance of difference in experimental group (3. vs 4. days, 4. vs 5. days and 5. vs 6. days of fasting): A P < 0.05; B P < 0.01; C P < 0.001. The significance of difference in control group (3. vs 4. days, 4. vs 5. days and 5. vs 6. days of fasting): a P < 0.05; b P < 0.01.


Provjerom značajnosti rezultata između pokusne i kon-trolne skupine utvrđena je značajno niža koncentracija beta globulina kod pokusnih pačića 5. dana gladovanja (P = 0,0040). Uspoređujući vrijednosti beta globulina unutar pokusne skupine pačića, značajan pad koncentracije utvrđen je također 5. dana gladovanja (P = 0,0054) u odnosu na prethodno pokusno razdoblje. Vrijednosti beta globulina unutar kontrolne skupine nisu se značajnije razli-kovale tijekom istraživanja. U odnosu na kontrolne vrijednosti značajno niža koncen-tracija gama globulina utvrđena je kod izgladnjivanih pačića 5. dana gladovanja (P = 0,0034). Međusobnom

usporedbom vrijednosti koncentracija gama globulina unu-tar izgladnjivane skupine pačića nisu utvrđene značajnije razlike, dok su kod kontrolne skupine vrijednosti bile značajno niže 6. dana (P = 0,0118) u odnosu na 5. dan pokusa. Tijekom cijelog pokusnog razdoblja omjer albumina i globulina (A/G) bio je iznad jedan i kod pokusne i kod kontrolne skupine pačića. Tako je kod pokusne skupine pačića omjer A/G 3. dana gladovanja iznosio 1,49, 4. dana 2,29, 5. dana 2,54, a 6. dana gladovanja 1,76. Kod nor-malno hranjene skupine pačića omjer A/G iznosio je 3. dana 2,91, 4. dana 1,73, 5. dana 1,64 i 6. dana 1,89.

Tablica 2. Aktivnost AST i ALT aminotransferaza u jetri normalno hranjenih i izgladnjivanih pačića


AST (U/mg bjelančevina) Kontrola 0,297

0,23-0,30 0,350

0,29-0,40 0,198 a

0,16-0,21 0,200

0,18-0,21

Gladovanje 0,277 0,22-0,32

0,315 0,25-0,36

0,220 *, A 0,21-0,23

0,270 *

0,24-0,28 ALT

(U/mg bjelančevina) Kontrola 0,040 0,03-0,05

0,030 a

0,02-0,03 0,020

0,01-0,03 0,030 b

0,03-0,04

Gladovanje 0,030 0,05-0,04

0,015 *, A 0,01-0,02

0,015 0,01-0,02

0,020 * 0,02-0,025

Vrijednosti su prikazane kao medijan te donji i gornji kvartil. Značajnost razlika aktivnosti AST i ALT u jetri između izgladnjivane i kontrolne skupine po danima gladovanja: * P < 0,05 Značajnost razlika aktivnosti AST u jetri izgladnjivanih pačića u odnosu na prethodno pokusno razdoblje: A P < 0,01. Značajnost razlika aktivnosti AST u jetri kontrolne skupine pačića u odnosu na prethodno pokusno razdoblje: a P < 0,01. Značajnost razlika aktivnosti ALT u jetri izgladnjivanih pačića u odnosu na prethodno pokusno razdoblje: A P < 0,05. Značajnost razlika aktivnosti AST u jetri kontrolne skupine pačića u odnosu na prethodno pokusno razdoblje: a P < 0,05; b P < 0,01. Table 2. Activity of AST and ALT aminotransferase in the liver of normally fed and fasted ducklings


AST (U/mg protein) Control 0.297

0.23-0.30 0.350

0.29-0.40 0.198 a

0.16-0.21 0.200

0.18-0.21

Fasted 0.277 0.22-0.32

0.315 0.25-0.36

0.220 *, A 0.21-0.23

0.270 *

0.24-0.28 ALT

(U/mg protein) Control 0.040

0.03-0.05 0.030 a

0.02-0.03 0.020

0.01-0.03 0.030 b

0.03-0.04

Fasted 0.030 0.05-0.04

0.015 *, A 0.01-0.02

0.015 0.01-0.02

0.020 * 0.02-0.025

The values were expressed as median and upper and lower quartille. The significance of difference of AST and ALT activities in the liver between control and experimental group: * P < 0.05. The significance of difference of AST activity in the liver of experimental group (3. vs 4. days, 4. vs 5. days and 5. vs 6. days of fasting): A P < 0.01. The significance of difference of AST activity in the liver of control group (3. vs 4. days, 4. vs 5. days and 5. vs 6. days of fasting): a P < 0.01. The significance of difference of ALT activity in the liver of experimental group (3. vs 4. days, 4. vs 5. days and 5. vs 6. days of fasting): A P < 0.05. The significance of difference of ALT activity in the liver of control group (3. vs 4. days, 4. vs 5. days and 5. vs 6. days of fasting): a P < 0.05; b P < 0.01.


U odnosu na kontrolne vrijednosti aktivnost AST u jetri iz-gladnjivanih pačića bila je značajno viša 5. i 6. dana glado-vanja (P = 0,0300, P = 0,0144). No, tijekom cijelog poku-snog razdoblja utvrđena su slična kolebanja aktivnosti enzima kod izgladnjivanih i normalno hranjenih pačića. Tako je u obje skupine pačića značajan pad aktivnosti AST u homogenatu jetre utvrđen 5. dana i to u pokusnoj skupini na razini značajnosti P = 0,0025, a u kontrolnoj na razini značajnosti P = 0,0027. Istovremeno, u obje skupine pačića izmjerene su najniže vrijednosti AST koje su u pokusnoj skupini iznosile 0,220 U/mg proteina, a u kontrolnoj 0,198 U/mg proteina. Aktivnost ALT u jetri izgladnjivanih pačića bila je značajno niža od kontrolnih vrijednosti 4. (P = 0,0393) i 6. (P = 0,0114) dana gladovanja. Tijekom pokusnog razdoblja ak-tivnost ALT u jetri također je pokazala značajnija i slična kolebanja unutar istraživanih skupina. Kod izgladnjivane skupine pačića aktivnost ALT značajno se smanjila 4. dana gladovanja (P = 0,0146), dok je u kontrolnoj skupini, nakon značajnog pada aktivnosti 4. dana (P = 0,0146), aktivnost

značajno porasla 6. dana gladovanja (P = 0,0060). Aktivnost AST u jetri kontrolne skupine pačića bila je prosječno za oko 9 puta, a u jetri pokusne skupine za oko 15 puta viša od aktivnosti ALT. U odnosu na kontrolnu skupinu aktivnost AST u homoge-natu bubrega pokusne skupine bila je značajno niža (P = 0,0275) 3. dana gladovanja. Uspoređujući aktivnost AST u homogenatu bubrega unutar izgladnjivane skupine pačića, vrijednosti su značajno porasle 4. dana gladovanja (P = 0,0054), da bi se 5. dana gladovanja značajno smanjile (P = 0,0026) i bile slične onima u ostalim pokusnim razdob-ljima. Tijekom pokusnog razdoblja aktivnost ALT u homo-genatu bubrega pokusne skupine pačića nije se značajnije razlikovala od onih u kontrolnoj skupini. Uspoređujući ak-tivnost ALT u homogenatu bubrega unutar izgladnjivane skupine pačića, vidljivo je da se aktivnost značajno smanjila 5. dana gladovanja (P = 0,0045) u odnosu na prethodno raz-doblje, dok se vrijednosti unutar kontrolne skupine nisu zna-čajnije razlikovale. Kod obje skupine pačića aktivnost AST u bubrezima bila je za oko 1,3 puta viša od aktivnosti ALT.

Tablica 3. Aktivnost AST i ALT aminotransferaza u bubrezima normalno hranjenih i izgladnjivanih pačića


AST (U/mg bjelančevina) Kontrola 0,560

0,480-0,620 0,580

0,560-0,590 0,300

0,250-0,370 0,330

0,270-0,380

Gladovanje 0,380 * 0,330-0,470

0,590 A

0,480-0,710 0,290 A

0,265-0,330 0,285

0,275-0,350 ALT

(U/mg bjelančevina) Kontrola 0,430 0,240-0,400

0,320 0,220-0,420

0,320 0,230-0,350

0,290 0,240-0,400

Gladovanje 0,325 0,265-0,470

0,390 0,290-0,500

0,245 A 0,215-0,265

0,240 0,230-0,300

Vrijednosti su prikazane kao medijan te donji i gornji kvartil. Značajnost razlika aktivnosti AST u bubrezima između izgladnjivane i kontrolne skupine po danima gladovanja: * P < 0,05. Značajnost razlika aktivnosti AST i ALT u bubrezima izgladnjivanih pačića u odnosu na prethodno pokusno razdoblje: A P < 0,01. Table 3. Activity of AST and ALT aminotransferase in the kidney of normally fed and fasted ducklings


AST (U/mg protein) Control 0.560

0.480-0.620 0.580

0.560-0.590 0.300

0.250-0.370 0.330

0.270-0.380

Fasted 0.380 * 0.330-0.470

0.590 A

0.480-0.710 0.290 A

0.265-0.330 0.285

0.275-0.350 ALT

(U/mg protein) Control 0.430 0.240-0.400

0.320 0.220-0.420

0.320 0.230-0.350

0.290 0.240-0.400

Fasted 0.325 0.265-0.470

0.390 0.290-0.500

0.245 A 0.215-0.265

0.240 0.230-0.300

The values were expressed as median and upper and lower quartille. The significance of difference of AST activity in the kidny between control and experimental group: * P<0.05. The significance of differences of AST and ALT activities in the kidny of experimental group (3. vs 4. days, 4. vs 5. days and 5. vs 6. days of fasting): A P < 0.01.



Kao što je već spomenuto, tijekom gladovanja, ili nedostatne ishrane, svi metabolički putevi djeluju brzo i usklađeno s ciljem održavanja normoglikemije i pribavljanja prijeko potrebne energije. Sve dok ne dođe do pojačane razgradnje tjelesnih bjelančevina i ulaska aminokiselina u metaboličke puteve, tkivnom proteolizom pribavljaju se aminokiseline za sintezu vitalnih bjelančevina kao što su hormoni i enzimi (Cherel i sur., 1994.). Kada se količina bjelančevina u bilo kojim stanicama smanji, cirkulirajuće bjelančevine mogu poslužiti kao izvor za njihovu brzu nadoknadu. Na taj su na-čin koncentracije bjelančevina u krvnoj plazmi usko pove-zane sa sintezom i razgradnjom bjelančevina u organizmu. Razgradnja bjelančevina pogađa sve topljive i netopljive bjelančevine stanične strukture hepatocita, a obim razgrad-nje je manje-više podjednak, tako da se ni jedna frakcija jetrenih bjelančevina ne može smatrati zalihom. Prema tome, organizam pri gladovanju razgrađuje funkcionalno sposobne dijelove jetrenog staničja da bi iskoristio sve zalihe bjelančevina. Kako pačići tijekom gladovanja nisu primali potrebne hranjive tvari, pa tako ni bjelančevine, došlo je do značajnog smanjenja serumskih albumina te u manjoj mjeri serumskih alfa-2, beta i gama globulina. Omjer A/G bio je tijekom cijelog pokusnog razdoblja kod obje skupine pačića veći od 1. Smanjenje koncentracije serumskih albumina, ko-je je često povezano i sa smanjenjem ukupnih bjelančevina, upućuje na nedovoljnu opskrbu organizma bjelančevinama u hrani te nedovoljnu energetsku opskrbu, pri čemu dolazi do katabolizma tkivnih bjelančevina. Prema našim dosadašnjim rezultatima vidljivo je da gladovanje rezultira smanjenjem koncentracije ukupnih bjelančevina u krvnoj plazmi pačića, što se može pripisati njihovoj smanjenoj obnovi, ali i pose-zanju za bjelančevinama plazme s ciljem sinteze potrebnih bjelančevina (Tlak i sur., 2008.). No, smanjenje koncen-tracije bjelančevina u krvnoj plazmi može biti posljedica i njihove pojačane razgradnje u svrhu održavanja normo-glikemije kao i direktne proizvodnje energije. Pojedini autori navode da se tijekom gladovanja odvija izdašna glu-koneogeneza uz istovremenu smanjenu biosintezu bjelanče-vina (Ayuso i sur., 1986.). Smanjenom biosintezom bje-lančevina štede se aminokiseline za njihovu pretvorbu u glukozu, što upućuje na zaključak da je glukoneogeneza vitalno važniji put biosinteze tijekom gladovanja. U slučaju nestašice bjelančevina u obroku ili potpunog gladovanja aktivnost plazmatskih enzima se smanjuje usporedo sa sadržajem bjelančevina u jetri ili još i brže (Forenbacher, 1993.). U gladovanju sadržaj bjelančevina u jetri kao i masa organa naglo se smanjuju (Milinković-Tur i sur., 1996.; Poljičak-Milas i sur., 2003.). Aminotransferaze imaju značajnu ulogu u povezivanju metabolizma ugljikohidrata i bjelančevina te je očekivati da će u vrijeme gladovanja doći do promjena u njihovoj aktivnosti. Kao što se vidi iz rezultata ovoga istraživanja, promjene aktivnosti AST u jetri i bubrezima značajno su se razlikovale unutar izgladnjivane skupine pačića, ali i u odnosu na normalno hranjenu skupinu pačića. Istovremeno su i kod normalno hranjenih pačića utvrđene značajne

razlike aktivnost navedenih enzima, koje bi se mogle pripi-sati dobro poznatim oscilacijama koncentracija aminokise-lina i enzima tijekom 24-satnog ciklusa. Aktivnost AST u jetri pokusnih pačića bila je viša od kontrole 5. i 6. dana gladovanja, no s obzirom na to da je 5. dana utvrđena najniža aktivnosti enzima u kontrolnoj skupini, ne može se sa sigurnošću tvrditi da se radi o stvarnom porastu aktivnosti AST. Štoviše, u jetri je došlo do pada aktivnosti AST 5. dana gladovanja, a u bubrezima nakon porasta 4. dana do pada aktivnosti 5. dana gladovanja. Iako Sarkar (1977.) na-vodi da aspartat nije tako učinkovit supstrat za glukoneo-genezu u jetri, s obzirom na značajna kolebanja aktivnosti AST u jetri izgladnjivanih, ali i kontrolnih pačića, ne može se sa sigurnošću reći da AST nije imala udjela u glukoneo-genezi tijekom šestodnevnog izgladnjivana pačića. Aminokiseline su, kao supstrat za glukoneogenezu, usko vezane uz održavanje homeostaze glukoze, a efikasnost njihove pretvorbe u glukozu ovisi o životinjskoj vrsti, vrsti tkiva te unutarstaničnoj lokaciji enzima glukoneogeneze. Glavna funkcija mitohondrijskog izoenzima ALT in vivo je sinteza piruvata iz alanina, dok je glavna funkcija citosolnog izoenzima pretvorba piruvata u alanin. Za razliku od jetre sisavaca, u pilećoj jetri su ALT, fosfoenolpiruvat karboksi-kinaza (PEPCK) i glutaminska dehidrogenaza isključivo mi-tohondrijski enzimi, a alanin u mitohondrijima može biti pretvoren u fosfoenolpiruvat (PEP) koji se potom transpor-tira u citosol za glukoneogenezu. Na taj je način smanjena opskrba citoplazme s NADH reduciranim ekvivalentima potrebnim za odvijanje procesa glukoneogeneze. S obzirom na nižu aktivnost ALT u jetri izgladnjivanih pačića može se pretpostaviti da alanin nije bio izdašan prekursor glukoneogeneze u tom tkivu. Dickson i Langslow (1978.) također navode da su alanin i glicerol vrlo slabi prekursori glukoneogeneze u hepatocitima izgladnjivanih pilića. Slabi odgovor na alanin kao prekursor glukoneo-geneze djelomično je pripisan niskoj aktivnosti ALT u pilećoj jetri, čija aktivnost iznosi svega 1 % od one u jetri štakora (Dickson i Langslow, 1978.). Alanin se vjerojatno u tkivima, kao što su npr. mišići, metabolizira do laktata, a laktat se tada slijedom reakcija u jetri prevodi u glukozu te se uloga jetre u glukoneogenezi sastoji u recikliranju laktata (Sarkar, 1971.; Soling i sur., 1973.). Kako je u bubrezima, za razliku od jetre, PEPCK citosolni enzim, bubrezi se smatraju važnim organom u kojem se odvija glukoneogeneza iz aminokiselina, piruvata i glicerola tijekom gladovanja pilića i golubova (Tinker i sur., 1983.). Održavanje normoglikemije u ptica tijekom produljenog gla-dovanja mnogi autori pripisuju izdašnoj glukoneogenezi u bubrezima iz različitih prekursora (Tinker i sur., 1983.; Yamano i sur., 1988.). Prema rezultatima Poljičak-Milas i sur. (2003.) šestodnevno gladovanje u pačića rezultira po-rastom aktivnosti enzima priključenih u glukoneogenetski put iznad stepenice trioza fosfata u jetri i bubrezima, te porastom aktivnosti PEPCK u bubrezima. No, aktivnost aminotransferaza ovisi o životinjskoj vrsti kao i vrsti tkiva. Tako je ukupna aktivnost AST u pilećoj jetri 14 puta viša od ukupne aktivnosti ALT. I u ovom istraživanju


utvrđena je viša aktivnost AST od aktivnosti ALT i to u jetri kontrolnih pačića za oko 9 puta, a u jetri pokusnih pačića za oko 15 puta. U bubrezima je aktivnost AST bila također viša od aktivnosti ALT i to prosječno za oko 1,3 puta kod obje skupine pačića. Nadalje, usporedbom aktivnosti ALT u jetri i bubrezima utvrđena je viša aktivnost ALT u bubrezima i to u kontroli za oko 12 puta, a u izgladnjivanih pačića za oko 15 puta, dok je aktivnost AST u jetri i bubrezima bila slična kod obje skupine pačića. Franson (1982.) te Jenkins i sur. (1982.) su također utvrdili četiri puta višu aktivnost ALT u bubrezima nego u jetri i sličnu aktivnost AST u jetri i bubrezima divlje patke. S obzirom na to da su tkivni enzimi i enzimi krvne plazme bjelančevine, njihova aktivnost, općenito uzevši, ovisi i o ishrani. Promjena koncentracije serumskih bjelančevina te aktivnosti navedenih enzima u tkivima kod izgladnjivanih pačića vjerojatno su posljedica neujednačene i smanjene obnove bjelančevina u organizmu, ali i različitog obima glukoneogeneze i različite učinkovitosti pojedinih prekur-sora. Istovremeno rezultati upućuju na zaključak kako tije-kom šestodnevnog gladovanja još uvijek nije došlo do zna-čajnije razgradnje tkivnih bjelančevina u svrhu namicanja prijeko potrebne energije.

Literatura

Ayuso, Matilde S., P. Vega, C. G. Manchón, R. Parrilla (1986.): Interrelation between gluconeogenesis and hepatic protein synthesis. Biochim. Biophys. Acta 883, 33-40.

Bergmeyer, H. U. (1974.): Methods of Enzymatic Analysis. Verlag Chemie, 2nd Ed., vol 2, Academic Press, Inc. pp 727-758.

Bordel, R., E. Haase (1993.): Effect of flight on blood parameters in homing pigeons. J. Comp. Physiol. – B. 163, 219-224.

Brady, Linda J., D. R. Romsos, P. S. Brady, W. G. Bergen, G. A. Leveille (1978.): The effects of fasting on body composition, glucose turnover, enzymes and metabolites in the chicken. J. Nutr., 108, 648-657.

Cherel, Y., J. B. Charrassin, Y. Handrich (1993.): Comparison of body reserve buildup in prefasting chicks and adults of king penguins (Aptenodytes-Patagonicus). Physiological Zoology, 66, 750-770.

Cherel, Y., J. Gilles, Y. Handrich, Y. Lemaho (1994.): Nutrient reserve dynamics and energetics during long-term fasting in the king penguin (Aptenodytes-Patagonicus). J. Zoology, 234, 1-12.

Dickson, A. J., D. R. Langslow (1978): Hepatic gluconeogenesis in chickens. Mol. Cell. Biochem. 22, 167-181.

Forenbacher, S. (1993.): Klinička patologija probave i mijene tvari domaćih životinja. Svezak II, Jetra. Hrvatska akademija znananosti i umjetnosti, Školska knjiga. Zagreb. str. 84-112.

Franson, J. C. (1982.): Enzyme activities in plasma, liver and kidney of black ducks and mallards. J. Widl. Dis. 18, 481-485.

Jenkins, Sharon J., Shirley, A. Green, Peggy A. Clark (1982.): Clinical chemistry reference values of normal domestic animals in various age groups- AS determined on the ABA-100. Cornell Vet. 72, 403-415.

Kaneko, J. J., J. W. Harvey, M. L. Bruss (1997.): Clinical Biochemistry of Domestic Animals. Academic Press. San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto, 1997.

Lien, T. F., R.C.R. Chou, S. Y. Chen, Y. I. Jeng, D. F. Jan (1999.): Lipid metabolism of Tsaiya ducks: plasma and liver related traits under ad libitum and fasting. J. Science Food & Agriculture 79, 1413-1416.

Lowry, O. H., N. J. Rosenbrough, L. A. Farr, R. J. Randal (1951.): Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275.

Milinković-Tur, Suzana, D. Emanović, Z. Stojević, Nina Poljičak-Milas (1996.): Effect of fasting on changes in blood glucose concentration and tissues glycogen contents in ducklings. Vet. arhiv 66, 241-249.

Poljičak-Milas, Nina, Mirjana Šušnjić, Terezija Silvija Marenjak, Suzana Milinković-Tur, Z. stojević (2003.): Effect of fasting on hepatic and renal gluconeogenic enzyme activities in ducklings. Vet. arhiv 73, 153-165.

Sarkar, N. K. (1971.) Gluconeogenesis and the factors that control the process in chickens. Life Sci., 10, 293-300.

Sarkar, N. K. (1977.): Implication of alanine and aspartate aminotransferase and phpsphoenolpyruvate Carboxykinase in glucose production in rats, chicken and pigs. Int. J. Biochem. 8, 427-432.

Soling, H.D., J. Kleineke, B. Willims, G. Janson, A. Kuhn (1973.): Relationship between intracellular distribution of phospho-enolpyruvate carboxykinase, regulation of gluconeogensis, and energy cost of glucose formation. Eur. J. Biochem. 37, 233-243.

Tinker, D. A., M. Kung, J. T. Bronsan, G. R. Herzberg (1983.): Avian phosphoenolpyruvate carboxykinase. Effect of age, starvation and photoperiod. Int. J. Biochem. 15, 1225-1230.

Tlak, Ivana, Suzana Milinković-Tur, Z. Stojević, Jasna Piršljin (2008.): The effect of fasting on the concentrations of total proteins and uric acid as well as on aminotransferase activity in duckling blood plasma. Vet. arhiv, 78, 377-386.

Yamano, T., K. Yorita, H. Fujii, R. Uchimoto, M. Shiota, M. Ohta, T. Sugano (1988.) Gluconeogenesis in perfused chicken kudney. Effects of feeding and starvation. Comp. Biochem. Physiol., 91B, 701-706.

Istraživanja je financiralo Ministarstvo znanosti, obra-zovanja i športa RH, projekt br. 053- 0531854-1866.

CONCENTRATIONS OF SERUM PROTEINS AND HEPATIC AND RENAL AMINOTRANSFERASE ACTIVITIES IN FASTING DUCKLINGS

Summary

The concentrations of serum protein fractions and aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) activities in hepatic and renal homogenates were investigated during a six-day fasting period in 28-day-old ducklings. 28-


day-old ducklings were divided into two groups: a normally fed control group and an experimental group which was fasting for six days. During the experiment drinking water was available to both groups of ducklings ad libitum. After a fasting period of three, four, five and six days, eight ducklings of the experimental group and seven ducklings of the control group were sacrificed by decapitation, and blood and tissue samples were collected from both groups of ducklings for the analysis. The concentrations of serum protein fractions were determined by electrophoresis, and AST and ALT activities in tissue homogenates were determined spectrophotometrically. The six-day fasting period resulted in significant differences of the examined parameters. Significantly lower concentration of serum albumin was observed on fasting days three (P = 0.004), four (P = 0.003), five (P = 0.0012) and six (P = 0.0477) in the experimental group of ducklings. While the concentration of alfa-2 globulin in the experimental group was not significantly different from the control group, the concentration of alfa-2 globulin was significantly lower on fasting day four (P = 0.0192). Significantly lower concentrations of serum beta (P = 0.0040) and gamma globulins (P = 0.0034) were observed in the experimental group of ducklings on fasting day five. The activity of AST in the liver of fasting ducklings was significantly higher than in the control group on fasting days five (P = 0.0300) and six (P = 0.0144), and ALT activity was significantly lower on fasting days four (P = 0.0393) and six (P = 0.0114). In relation to the control group, AST activity in the kidney of fasting ducklings was significantly lower on fasting day three (P = 0.0275), while the activity of ALT was not statistically different from the control group. Changes in the concentrations of blood serum proteins as well as hepatic and renal aminotransferase activities in fasting ducklings were probably the consequence of lower protein renewal due to insufficient amino acid supply during starvation, and different intensity of gluconeogenesis. At the same time, the results indicate that during the six-day fasting period there has not been a significant degradation of tissue proteins in order to gain necessary energy supply. Key words: fasting, ducklings, serum proteins, aminotransferase


ULOGA HRVATSKOG STOČARSKOG CENTRA U PERADARSKOJ PROIZVODNJI U REPUBLICI HRVATSKOJ

Gordana Duvnjak1, Maja Dražić1, Dalibor Bedeković2

1 Hrvatski stočarski centar, Zagreb, Hrvatska 2 Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Hrvatski stočarski centar je ustanova koja se bavi poslovima u poljoprivredi, posebice u stočarstvu, te prikuplja podatke o proizvodnim rezultatima matičnih jata kako uveznih hibridnih tako i registriranih domaćih izvornih pasmina. Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja potiče uzgoj matičnih hibridnih jata peradi s 9,00 kuna po kljunu, te je za ta jata 2007. godine isplaćeno 3,883.311,00 kuna. Novčana potpora za matična jata domaćih izvornih pasmina za kokoš hrvaticu iznosi 60 kn, a zagorskog purana 150,00 kn po kljunu. U 2007. godini umatičene su 122 kokoši pasmine hrvatica, za koje je isplaćen novčani poticaj u iznosu od 7320,00 kn. Iste godine umatičeno je i 2136 zagorskih purana, a isplaćeni je novčani poticaj iznosio 320.400,00 kuna. U Hrvatskoj su u postupku priznavanja dvije nove pasmine peradi: posavska kukmasta kokoš i hrvatska patuljasta kokoš „Jurek i Katica“. Upravo se provodi praćenje njihovih proizvodnih svojstava kako bi se te nove pasmine uvrstile u program očuvanja izvornih i zaštićenih pasmina. Ključne riječi: hibridna matična jata, izvorne pasmine, potpora Uvod Današnja proizvodnja peradskog mesa i jaja zasniva se na intenzivnom iskorištavanju selekcioniranih hibrida peradi u svijetu, pa i u Hrvatskoj, gdje ima sve veću tendenciju rasta. U Hrvatsku se uvoze rasplodna roditeljska jata koja se za proizvodnju mesa i jaja iskorištavaju u F-1 generaciji. Hrvatski stočarski centar registrira sva uvezena matična jata peradi i njihove uvoznike, prati broj uvezenih kljunova matičnih jata, vrstu i liniju peradi, mortalitete do uvođenja u proizvodnju te proizvodne pokazatelje. Posljednjih desetak godina u Hrvatskoj i u zemljama EU raste interes za mesom peradi i jajima dobivenim slobodnim načinom uzgoja. U programu Zaštite i očuvanja izvornih i zaštićenih pasmine nalaze se zagorski puran i kokoš hrva-tica, za koje Hrvatski stočarski centar (HSC) posjeduje bazu podataka sastavljenu od registracije svakog pojedinog ma-tičnog jata i njihovih uzgajivača te proizvodnih pokazatelja. Osim za zagorskog purana i kokoši hrvatice HSC je počeo prikupljati podatke praćenjem proizvodnih svojstava i po-savske kukmaste kokoši i hrvatske patuljaste kokoši „Jurek i Katica“.

Cilj ovoga rada bio je prikazati ulogu HSC-a u praćenju proizvodnih rezultata matičnih jata, kako uveznih hibridnih, tako i registriranih domaćih izvornih pasmina peradi.

Materijal i metode

Hrvatski stočarski centar prikuplja podatke o uvezenim ma-tičnim jatima iz raznih zemalja na standardiziranim obras-cima koje uvoznici dostavljaju prilikom uvoza. Nakon pre-vođenja jata u proizvodnju proizvođači HSC-u prosljeđuju obrazac s podacima o matičnom jatu, iz kojeg, između osta-log, dobivamo uvid u brojčano stanje, odnosno mortalitet do tog perioda. Podaci za matična jata izvornih i zaštićenih pasmina pro-sljeđuju se HSC-u nakon registracije, odnosno prstenovanja određenog jata u obliku obrasca registracije. Nakon prone-ska, odnosno po završetku prve sezone nesenja, HSC-u se prosljeđuju obrasci očevidnika na kojima se prati početak nesenja te broj nasađenih jaja i odgojene peradi . Od 2007. godine prikupljaju se podaci na standardiziranim obrascima za posavsku kukmastu kokoš. Prati se dob pri pronesku, broj snesenih i nasađenih jaja te broj odgojenih pilića. Isti postupci će se primijeniti za praćenje hrvatske patuljaste kokoši „Jurek i Katica“.

Gordana Duvnjak, dipl. ing. agr., Hrvatski stočarski centar, Ilica 101, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: ++385 (0) 1 390 3122, fax: ++385 (0) 1 390 3191, e-mail: [email protected]

ULOGA HRVATSKOG STOČARSKOG CENTRA U PERADARSKOJ PROIZVODNJI U REPUBLICI HRVATSKOJ 236


U Tablici 1 dan je pregled prikupljenih zahtjeva za potpore i broja kljunova u razdoblju od 2003. do 2007. godine (HCS, 2007.) Tablica 1. Pregled prikupljenih zahtjeva za potpore i broja kljunova u razdoblju od 2003. do 2007. godine

Broj Godina

Vlasnika Zahtjeva Kljunova Isplaćeno poticaja (kn)

2003 12 22 330.167 990.501 2004 7 9 67.010 * 2005 13 25 344.446 * 2006 12 30 395.287 3.557.583 2007 18 34 431.479 3.883.311

* podaci dostupni u Ministarstvu poljoprivrede ribarstva i ruralnog razvoja Table 1. The review of applications for subsidies in poultry breeding and the number of registered breeding hens in period

from 2003 to 2007 (CLC, 2007)

Number of Year

Owners Applications Hens Subsidies paid (kn)

2003 12 22 330.167 990.501 2004 7 9 67.010 * 2005 13 25 344.446 * 2006 12 30 395.287 3.557.583 2007 18 34 431.479 3.883.311

* Data available at the Ministry of agriculture, fisheries and rural development Tablica 2. Broj uvezenih i prevedenih kljunova po državama porijekla u 2007. godini (HSC, 2007.)

Zemlja podrijetla Broj uvezenih kljunova Ukupno prevedenih Mortalitet (%) Francuska 7.824 7.602 2,41 Mađarska 63.098 59.173 6,41 Nizozemska 8.976 8.800 1,96 Njemačka 50.832 44.999 9,62 Velika Britanija 310.512 288.255 6,77 Ukupno 441.242 408.829 6,76 Table 2. The number of imported and conveyed hens per country of origin during year 2007 (CLC, 2007)

Country of origin Imported hens Conveyed hens Mortality (%) Francuska 7.824 7.602 2,41 Mađarska 63.098 59.173 6,41 Nizozemska 8.976 8.800 1,96 Njemačka 50.832 44.999 9,62 Velika Britanija 310.512 288.255 6,77 Total 441.242 408.829 6,76


Kako je vidljivo iz Tablice 1, u razdoblju od 2003. do 2007. godine došlo je do velikih promjena u broju evi-dentiranih uvezenih kljunova. Godine 2004. zbog admi-nistrativnih promjena, NN (87/02), dolazi do naglog sma-njivanja broja registriranih kljunova. Nakon svladavanja administrativnih barijera evidencija uvezenih kljunova se naglo povećala. U posljednje dvije godine evidencija broja uvezenih kljunova bitno se ne mijenja, te se kreće oko 400.000 kljunova . U Tablici 2 prikazan je broj uvezenih i prevedenih klju-nova po državama podrijetla u 2007. godini.

Godine 2007. su registrirani kljunovi uvažani iz 5 država. Najveći broj uvezenih kljunova bio je iz Velike Britanije (70 % ukupnog uvoza). Iz Tablice 2 je vidljiv znatno manji prosječni mortalitet kljunova uvezenih iz Francuske i Nizozemske, no radi se o jatima s malim brojem životinja. U Hrvatskoj se uzgajaju četiri soja zagorskih purana, i to: crni, brončani, sivi i svijetli. Zastupljenost pojedinog soja na određenom području plod je tradicije i navike lokalnog pučanstva (Janječić i Mužic, 2007.). U Tablici 3 dan je broj umatičenih purana u razdoblju od 2003. do 2007. godine po županijama.

Tablica 3. Broj umatičenih purana u razdoblju od 2003. do 2007. godine po županijama (HSC, 2007.)

Godina Županja

2003 2004 2005 2006 2007

Krapinsko-zagorska 1.315 1.203 1.242 1.317 1618

Varaždinska 486 488 486 335 343

Koprivničko-križevačka 99 130 101 98 103

Zagrebačka 50 30 30 30 45

Međimurska 25 40 25

Bjelovarsko-bilogorska 15 18 18 18 25

Grad Zagreb 10

Osječko –baranjska 7 18 18 18 17

Splitsko-dalmatinska 6 6

Ukupno 2.013 1.933 1.920 1.816 2.151 Table 3. The number of herd-book Zagorje turkeys in period from 2003 to 2007 per County (CLC, 2007)

Year County

2003 2004 2005 2006 2007

Krapinsko-zagorska 1.315 1.203 1.242 1.317 1618

Varaždinska 486 488 486 335 343

Koprivničko-križevačka 99 130 101 98 103

Zagrebačka 50 30 30 30 45

Međimurska 25 40 25

Bjelovarsko-bilogorska 15 18 18 18 25

Grad Zagreb 10

Osječko –baranjska 7 18 18 18 17

Splitsko-dalmatinska 6 6

Total 2.013 1.933 1.920 1.816 2.151 Kako je vidljivo iz Tablice 3, ukupan broj registriranih purana u razdoblju od 2003. do 2007. godine nije se bitno mijenjao ni u odnosu na ukupni broji ni u odnosu na regiju.

Budući da je izvorno područje zagorskog purana Kra-pinsko-zagorska županija, očito je da se najveći broj purana uzgaja upravo u spomenutoj županiji.


U Grafikonu 1 prikazani su udjeli zagorskih purana po sojevima. Grafikon 1. Udjeli zagorskih purana po sojevima

brončani65%

crni12%

sivi11%

svijetli12%

Graph 1. Percentage of Zagorje turkeys per strain

Light 12%

Gray11%

Black12%

Bronze 65%

Iz Grafikona 1 vidljivo je da je u uzgoju najzastupljeniji brončani soj purana, dok su ostala tri soja podjednako zastupljena. U Tablici 4 prikazani su prosječni pokazatelji nesivosti zagorskih purana po sojevima.

Tablica 4. Prosječni pokazatelji nesivosti zagorskih purana po sojevima (HSC, 2007.)

Prosječan broj Soj purana

Snesenih jaja Nasađenih jaja Izvaljenih purića Odgojenih purića Brončani 16,40 14,91 11,74 10,17 Crni 14,68 13,10 10,23 8,05 Sivi 14,30 13,42 10,88 8,55 Svijetli 16,52 15,46 13,70 11,41 Ukupno 15,98 14,60 11,70 9,89 Table 4. Average results of egg-laying of zagorje turkeys per strain (CLC, 2007)

Average number Strain

Eggs laid Hatching eggs Hatched poults Alive poults Bronze 16,40 14,91 11,74 10,17 Black 14,68 13,10 10,23 8,05 Gray 14,30 13,42 10,88 8,55 Light 16,52 15,46 13,70 11,41 Total 15,98 14,60 11,70 9,89 Tablica 5. Ukupan iznos isplaćenih poticaja za matična jata zagorskih purana po županijama u 2007. godini

Ukupno Županija

Vlasnika Zahtjeva Kljunova Iznos (kn) Bjelovarsko-bilogorska 3 3 37 5.550,00 Koprivničko-križevačka 7 7 103 15.450,00 Krapinsko-zagorska 126 127 1.550 232.500,00 Međimurska 1 1 10 1.500,00 Osječko-baranjska 1 1 18 2.700,00 Sisačko-moslavačka 1 1 30 4.500,00 Varaždinska 44 44 343 51.450,00 Zagrebačka 2 2 45 6.750,00 UKUPNO 185 186 2.136 320.400,00


Table 5. Total amount of subsidies paid for herd book flocks of Zagorje turkeys per County during year 2007 (CLC, 2007)

Total County

Owners Applications Turkeys Amount (kn)

Bjelovarsko-bilogorska 3 3 37 5.550,00

Koprivničko-križevačka 7 7 103 15.450,00

Krapinsko-zagorska 126 127 1.550 232.500,00

Međimurska 1 1 10 1.500,00

Osječko-baranjska 1 1 18 2.700,00

Sisačko-moslavačka 1 1 30 4.500,00

Varaždinska 44 44 343 51.450,00

Zagrebačka 2 2 45 6.750,00

Total 185 186 2.136 320.400,00 Prosječan broj snesenih jaja kod brončanog i svijetlog soja bio je za gotovo 15% veći od broja jaja kod crnog i sivog soja. S tim u vezi proizlaze i bolji rezultati izvaljenih i odgojenih purića (Tablica 4). Ukupan iznos isplaćenih poticaja za matična jata zagorskih purana po županijama u 2007. godini prikazan je u Tablici 5 (HSC, 2007.). Kako je već ranije navedeno, zbog najvećeg broja uma-tičenih rasplodnih jata u Krapinsko-zagorskoj županiji, od ukupnog iznosa isplaćenih poticaja najveći udio (72,5%) isplaćen je upravo uzgajivačima u toj županiji (Tablica 5). Kokoš hrvatica spada u pasmine kombiniranih svojstava, a uzgaja se u četiri osnovna soja glede obojenosti perja: crveni, crni, jarebičasto-zlatni i crno-zlatni. Za sve su sojeve karakteristični bijeli podušnjaci te kod crvenog i jarebičasto-zlatnog soja bijele noge, dok su kod crnog i crno-zlatnog soja noge sivkaste boje (Janječić i sur., 2007.). Na Popis izvornih i zaštićenih pasmina i sojeva domaćih životinja kokoš hrvatica je uvrštena 1998.godine (NN 127/98). Registracija matičnih jata i prikupljanje proiz-vodnih pokazatelja za tu pasminu počeli su prije nekoliko godina. Tijekom 2007.godine umatičeno je 11 rasplodnih jata sa 122 kljuna kod dva uzgajivača na području Zagre-bačke i Vukovarsko-srijemske županije. To su bila dva nukleusa od kojih je započelo intenzivno širenje uzgoja kokoši hrvatice na područje cijele Hrvatske. Dobar po-kazatelj sve većeg interesa za uzgoj kokoši hrvatice je i više od 10 obiteljskih gospodarstva iz šest hrvatskih županija ko-ja su se tijekom 2008. godine prijavila za umatičavanje rasplodnih jata. Uzgoj posavske kukmaste kokoši započeo je na području Zagrebačke županije u selima uz rijeku Savu i danas se njen uzgoj odvija u više sojeva i u velikom broju na području cijele Hrvatske. Hrvatski stočarski centar trenutno radi na

praćenju proizvodnih pokazatelja posavske kukmaste kokoši u dva soja kod 5 uzgajivača na 10 matičnih jata. Posljednjih je godina pokrenuta inicijativa za očuvanjem hrvatske patuljaste kokoši. U nekim krajevima lijepe naše je zovu „Jurek i Katica“, „Đuro i Kata“, „Đurina i Katena“, kredlike, itd. Sve većim uvozom stranih ukrasnih pasmina „Jurek i Katica“ nestaju iz seoskih dvorišta. Do danas su se održali u svom izvornom obliku tek u nekim selima. Uglav-nom ih još drže staračka domaćinstva koja drže do tradicije. Hrvatski stočarski centar priprema praćenje proizvodnih rezultata za hrvatsku patuljastu kokoš „Jurek i Katica“, koja se uzgaja u više sojeva.

Zaključak

Na temelju prikazanih pokazatelja o broju uveznih hibridnih rasplodnih jata i registriranih domaćih izvornih pasmina može se zaključiti da je broj uzgajivača posljednjih godina povećan, te da postoji interes za praćenje proizvodnih svojstava novih pasmina peradi kako bi se uvrstile u pro-gram očuvanja izvornih i zaštićenih pasmina.

Literatura

HSC (2007.): Godišnji izvještaj. Zagreb Janječić, Z., Mužic, S. (2007.): Phenotypic traits in zagorje turkey.

Agriculture, 13:205-208. Janječić, Z, Mužic, S., Vlasta Herak-Perković, Kos I., Šimić B.

(2007.): Fenotipska obilježja kokoši hrvatica. Zbornik radova „Peradarski dani 2007“, 127-131.

NN (87/02) –.Zakon o državnoj potpori u poljoprivredi, ribarstvu i šumarstvu.

NN(127/98) – Popis izvornih i zaštićenih pasmina i sojeva domaćih životinja


THE ROLE OF THE CROATIAN LIVESTOCK CENTER IN POULTRY PRODUCTION IN THE REPUBLIC OF CROATIA

Summary

The Croatian Livestock Center is an institution which is involved in agriculture, particularly in livestock production. One of its regular tasks is to collect data on production results of flocks as well as of autochthonous poultry breeds in a herd book. The Ministry of Agriculture, Fisheries and Rural Development supports breeding flocks of hybrid lines with 9,00 kuna per bird. The total amount paid in 2007 was 3.883.311,00 kuna. Financial support for flocks of native breeds is paid for Hrvatica hen in amount of 60,00 kn and for Zagorje turkey in amount of 150,00 kn per bird. In 2007, 122 Hrvatica hens were included in the herd book, and breeders received 7.332,00 kn. Also in 2007, 2.136 Zagorje turkeys were entered in the herd book, and breeders received financial subsidy in amount of 320.400,00 kuna. Currently in Croatia a procedure for recognition of two poultry breeds is in progress: Posavina crested hen and Croatian dwarf hen, “Jurek and Katica”. A data collection program on production results for these breeds has been running for many years, and the main goal is the inclusion of these breeds in the list of autochthonous breeds. Key words: hybrid flocks, autochthonous breeds, subsidy


IMUNOGENOST TERENSKOG SOJA VIRUSA NEWCASTLESKE BOLESTI NB ZG-2000. PRIMIJENJENOG NA SPF PILIĆIMA

Marina Biđin, Hrvoje Mazija

Zavod za bolesti peradi s klinikom, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska

Sažetak

Istražena je imunogenost terenskog soja virusa NB Zg-2000., izdvojenog iz tovnih pilića u tijeku enzootije newcastleske bolesti 1999. godine na farmi u sjevernom dijelu Hrvatske. Imunogenost izdvojenog virusa je dokazana cijepljenjem SPF pilića bilo okulonazalno ili nebulizacijom neposredno nakon leženja, a učinak je uspoređen s kontrolnom necijepljenom skupinom. Klinički nije bilo reakcije na dano cjepivo bez obzira na način, a titar specifičnih protutijela za cjepni virus, određen serološkom probom inhibicije hemaglutinacije (HI proba) i imunoenzimski (ELISA), dokazao je specifična protutijela u cijepljenih pilića. Značajno viši bili su titrevi u pilića cijepljenih postupkom nebulizacije, te im je vrijednost bila zaštitna sve do kraja pokusa u dobi 42 dana. Postignuti uspjeh istraživanja ukazuje na imunogenost virusa NB Zg-2000., te bi ga se moglo koristiti kao cjepivo. Ključne riječi: newcastleska bolest, soj ZG-2000., SPF pilići, nebulizacija, imunogenost

Uvod

Newcastleska bolest (NB) diljem svijeta predstavlja jednu od najznačajnijih virusnih zaraza peradi koja još nije u cijelosti suzbijena. Prirodni rezervoari, tj. slobodnoživuće ptice lako mogu prenijeti virus NB na jata peradi i pernate divljači, što može uzrokovati izbijanje ozbiljne bolesti i veliki pomor, kao i teške gospodarske štete (Alexander, 1998.; 1997.; 2000.; Kaleta i Baldauf., 1988.). One su višestruke, no u osnovi se svode na troškove sprečavanja pojave i suzbijanja NB i troškove nastale uslijed pojave bolesti. Nespecifičnim profilaktičkim mjerama NB se ne uspijeva suzbiti, zbog čega se provode specifične mjere, odnosno cijepljenje peradi aktivnim („živim“) sojevima virusa lentogenih, rjeđe mezogenih svojstava i inaktiviranim sojevima virusa NB, koji se primjenjuju parenteralno (Aldous i Alexander, 2001.; Al-Garib i sur., 2003.). Učinak živih cjepiva često je ometan majčinskim protutijelima, pa se za uspješnu imunoprofilaksu koriste nešto patogeniji sojevi, poput sojeva B1 ili La Sota. Blaži sojevi, primjerice Queensland V4, pokazali su se nedovoljno imunogenim u područjima mogućeg širenja virusa velogenih svojstava. Od mnoštva cjepnih sojeva virusa NB očekuje se neškodljivost u primjeni, uz istodobnu značajnu imunogenost. Učinak pojedinih sojeva razlikuje se s obzirom na način i mjesto primjene (Beard i Easterday, 1962.). Dišni sustav je

podložniji prirodnoj infekciji i zato je bolji izbor za primjenu cjepiva nego probavni sustav, dok su iznimka enterotropni sojevi virusa NB (Seal i sur., 2000.). U Hrvatskoj je razmjerno malo istraživanja koja se odnose na svojstva virusa NB kojima su izazvane pojedine enzo-otije, a ni jedan izdvojeni soj nije očitovao lentogena svoj-stva koja bi ga svrstala u skupinu moguće cjepnih virusa. Ovaj rad opisuje upravo takav soj; on je 2000. godine izdvojen u Hrvatskoj, a njegova su molekulska svojstva dokazala njegovu lentogenost (Runjić, 2006.). Zato je trebalo istražiti da li je, i u kojoj mjeri taj soj virusa, nazvan NB Zagreb-2000., imunogen i neškodljiv ukoliko se primijeni različitim postupcima, od kojih valja istaknuti davanje vrlo sitne čestice u dišni sustav ultrazvučnim raspršivačem To je, naime, postupak kojim su ostali cjepni virusi NB uspješno primijenjeni (Mazija i sur., 2009., u tisku). Istodobno odgovara na pitanje da li je soj NB Zagreb-2000. jedan od virusa koji bi se mogao koristiti za buduću izradu komercijalnog cjepiva.

Materijali i metode

Plan pokusa Pokusom su obuhvaćene tri skupine SPF pilića. Pilići su ci-jepljeni neposredno nakon leženja postupkom nebulizacijom

Marina Biđin, dr. vet. med.; Zavod za bolesti peradi Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu; Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska, tel: 01 2390-281; fax: 01 2390-280; e-mail: [email protected]

IMUNOGENOST TERENSKOG SOJA VIRUSA NEWCASTLESKE BOLESTI NB ZG-2000. PRIMIJENJENOG NA SPF PILIĆIMA 242

(skupina A), okulonazalno (skupina B), dok je treća skupina pilića C poslužila kao kontrolna i nije bila cijepljena. Pilićima je vađena krv punkcijom v. jugularis 1., 7., 14., 21., 28., 35. i 42. dana života. Tijekom pokusa su poštivane odredbe Zakona o dobrobiti životinja. Dijagnostički su u po-kusu korištene proba inhibicije hemaglutinacije (IH) i imu-noenzimna proba (ELISA).

Smještaj i zdravlje pilića u pokusu Pilići su bili smješteni u pokusne prostorije Zavoda za bolesti peradi s klinikom Veterinarskog fakulteta u Zagrebu. Cijepljeni pilići držani su odvojeno od onih iz kontrolne sku-pine. Svakodnevno su klinički promatrani. Cjepna reakcija, inače česta popratna pojava cijepljenja dišnim putem, nije se očitovala niti u jednoj skupini pilića. Nije bilo nikakvih kliničkih znakova koji bi se mogli povezati s primijenjenim virusom NB ili načinom njegovog davanja. Pilići su jeli, pili i bili uobičajeno živahni.

Virus korišten u pokusu Virus korišten u pokusu je izdvojen iz epizootije NB, koja je izbila 1999. godine na farmi tovnih pilića u sjevernom dijelu Hrvatske. Jato od 16.150 pilića je tijekom 12 dana pretrpjelo 75 %-tno uginuće. Osnovana sumnja na NB je temeljena na rezultatu pretrage parnih seruma, što je pokazao porast titra HI protutijela. Anamnestički je poznato da tovno jato pilića nije bilo prethodno cijepljeno protiv NB, pa je nalaz jedino mogao uputiti na izbijanje te bolesti. Temeljem tog rezultata i osnovane sumnje na NB pretraženi su i uzorci tkiva ugi-nulih ili žrtvovanih moribundnih pilića; mozga i pluća, koja su bila gotovo potpuno prožeta krvlju. Takav je patomor-fološki nalaz neuobičajen pri ugušenju pilića, pa se posum-njalo da mu je osnova u trovanju. Ipak, već 48 sati nakon inokulacije SPF kokošjih zametaka suspenzijom tkiva pluća izdvojen je hemaglutinabilni agens, koji je specifično neu-traliziran specifičnim serumom protiv newcastleske bolesti. Time je nedvojbeno dokazano da se radi o virusu NB kao izdvojenom mikroorganizmu, odnosno o newcastleskoj bo-lesti. Istodobno je uzorak tkiva mozga dao negativan rezultat. Uginuće inokuliranih kokošjih zametaka je nastupilo 5. i 6. dana nakon inokulacije, a postignuti titrevi virusa su bili izrazito niski, te su nakon 48 sati iznosili 1 : 64. Isti je virus pretražen i genetskim sekvencioniranjem, čime je dokazano da se radi o lentogenom soju virusa NB različitom od svih

do tada poznatih sojeva (Runjić, 2006.). Podrijetlo soja NB Zg-2000. još je neistraženo, ali se pretpostavlja da je jato tovnih pilića iz kojih je virus izdvojen bilo zaraženo posredstvom slobodnoživućih ptica.

Postupci primjene virusa NB Zg-2000.

Nebulizacija Nebulizacija je jednostavan postupak cijepljenja koji osigu-rava da virusna čestica dospije što dublje u dišni trakt, čime se osigurava bolja imunosna reakcija (Mazija i sur., 2009., u tisku; Ciglar-Grozdanić, 2005.). Korišten je uređaj SONO-VAC 095®, koji su izradili i patentno zaštitili Mazija i Šti-mac (1995.). Pilići su cijepljeni nebulizacijom neposredno nakon leženja. Izlaganje pilića vodenoj suspenziji cjepiva je trajalo 60 sec.

Okulonazalno cijepljenje Okulonazalno cijepljenje je dugo bio jedini način cijepljenja protiv NB; ono osigurava da pilići budu cijepljeni približno istom količinom virusa i umanjuje pojavnost cjepne reakcije. Nedostatak te metode je potreba za brojnom radnom snagom i izazivanje stresa u životinja (Alexander, 2001.; Allan, i sur., 1978.). Okulonazalno je cijepljenje, baš kao i nebulizacija, obav-ljeno 1. dana života pilića.

Dijagnostički postupci Probama HI i ELISA, korištenima u pokusu, odredila se humoralna imunost nastala nakon primjene virusa NB Zg-2000. Proba HI, beta postupak (Allan i Gough, 1974.) izveden je u mikrotitarskim pločicama s U dnom. Kako je proba uobi-čajena, ne opisujemo je posebno. Titar heminhibicijskih (HI) protutijela iskazan je kao recipročna vrijednost najvećeg se-rumskog razrjeđenja, što je u cijelosti inhibiralo hemaglu-tinaciju. Imunoenzimna proba je učinjena komercijalnim ELISA FlockCheck kompletom, (IDEX, Portland, Maine, USA). Postignuti rezultati su izračunati prema uputi proiz-vođača (FlockCheck Flock Manager Software).

Rezultati

Rezultat pretrage krvnih seruma pilića u pokusu probom HI prikazujemo slikom (Slika 2.).

Tablica 1. Shematski prikaz pokusa Table 1. Shematic review of the trial

Pokusna skupina Broj pilića u skupini Način cijepljenja pilića Vađenje krvi (dana)

A 30 nebulizacija 1., 7., 14., 21., 28., 35. i 42.

B 30 okulonazalno 1., 7., 14., 21., 28., 35. i 42.

C 30 necijepljeni 1., 7., 14., 21., 28., 35. i 42.


Kazalo: A skupina – pilići cijepljeni nebulizacijom B skupina – pilići cijepljeni okulonazalno C skupina – kontrolna

Legend: Group A – nebulizated chickens Grup B – oculonasal vaccinated chickens Group C - control

Slika 2. Titrevi HI protutijela seruma pilića tijekom pokusa Picture 2. HI serum antibody titres in chickens durig trial Rezultat dobiven korištenjem ELISA-e prikazujemo slikom (Slika 3.).

Kazalo: A skupina – pilići cijepljeni nebulizacijom B skupina – pilići cijepljeni okulonazalno C skupina – kontrolna

Legend: Group A – nebulizated chickens Grup B – oculonasal vaccinated chickens Group C - control

Slika 3. ELISA titrevi protutijela seruma pilića tijekom pokusa Picture 3. ELISA serum antibody titres in chickens durig trial


Rasprava

Iznalaženje boljih postupaka suzbijanja bolesti peradi opće-nito, a posebice NB, stalna je zadaća istraživača i onih koji vode brigu o sprečavanju bolesti peradi. S obzirom na go-spodarski značaj, NB je u tom smislu suvereno na prvom mjestu, pa postoji i obilje podataka kojima se opisuju po-boljšani postupci imunoprofilakse NB primjenom različitih, sve učinkovitijih cjepiva, tj. postupci njihove primjene. U tom smislu postupci raspršivanja cjepiva su prisutni svugdje u svijetu (Biđin, Z. i sur., 1979.). Međutim, davanje sitne čestice aerosola cjepnog virusa veličine 3 – 5 μ duboko u dišni sustav gotovo je nepoznato, te se tek u najnovije vrijeme koristi u peradarskoj proizvodnji u Hrvatskoj. Sojevi virusa poput La Sota i B1 daju se netom izleženim pilićima, a specifična imunost je dugotrajna i štiti najmanje sedam tjedana (Mazija i sur., 1997.; 2009., u tisku). Stečena iskustva primjene cjepiva bila su prilika za istra-živanje imunogenosti soja NB Zg-2000., koji je izdvojen iz enzootije bolesti 1999. godine, pri čemu je tijekom 12 dana u jatu od 16.150 pilića njih 75% uginulo. Stvarna etiologija tog uginuća nije razjašnjena jer je virus NB, izdvojen iz pluća (Mazija i sur., neobjavljeno), bio lentogenih svojstava, što je dokazano pretragom genoma tog virusa (Runjić, 2006.). Očevidno je uz virus djelovalo više čimbenika koji su izazvali bolest. Može se samo nagađati da su to bili virusi imunosupresivnog učinka, poput virusa zarazne kržljavosti kokoši, a moguće je uzrokom bilo trovanje hranom, na što je djelomično ukazivao patološki nalaz (enteritis). Soj virusa NB Zg-2000. izdvojen je iz pluća, ali ne i iz mozga pilića. Na njegovo podrijetlo od divljih ptica, a ne kokoši upućuje različiti genom u odnosu na cjepne viruse koji se koriste u Hrvatskoj (uglavnom La Sota i B1) te niski titar HI protutijela pri prvom izdvajanju. Njegova svojstva lentogenosti i tropizam prema dišnom sustavu su bili izraziti (nalaz opsežnih krvarenja u plućima) i stoga su postali osno-va istraživanja mogućeg korištenja ovog soja kao cjepnog virusa. Pilići korišteni u pokusu bili su SPF podrijetla, te nisu nosili specifična HI protutijela newcastleske bolesti. Prema tome je i nastala imunosna reakcija nakon primjene opisanim postupcima (okulonazalno i nebulizacijom) bila isključivo posljedica djelovanja primijenjenog virusa i nači-na njegovog davanja. Klinička reakcija na dani virus, bez obzira na način, nije se razlikovala, te se nisu mogli uočiti bilo kakvi znakovi koji bi ukazivali na štetnost postupka cijepljenja. Tijekom trajanja pokusa - 42 dana - pilići su bili zdravi, a imunosna reakcija ocijenjena HI probom dokazala je značajni porast HI protutijela u obje skupine od 7. – 14. dana. Istodobno, dakako, HI protutijela nisu dokazana u kontrolnih pilića. U skupini pilića cijepljenih okulonazalno (Slika 2) u dobi od 14 dana postignut je HI titar 1:22,6, dok je istodobno u pilića cijepljenih postupkom nebulizacije iznosio 1:24, što počevši od 21. dana pokusa narasta na 1:25,0, a zatim postupno do kraja pokusa pada na 1:23,0. Isto-dobno, pilići cijepljeni okulonazalno uz blage su oscilacije na kraju pokusa imali titar HI protutijela 1:21,5. Time je neosporno dokazana imunogenost istraživanog virusa. S obzirom na način davanja, značajniji je učinak nebulizacije.

Krvni serumi pilića pretraživani tijekom pokusa probom ELISA pokazali su različitosti u pojavi specifičnih imuno-globulina. Do njihovog je porasta došlo počevši od 7. dana u pilića cijepljenih nebulizacijom, a u onih cijepljenih oku-lonazalno od 14. dana pokusa. U pilića cijepljenih okulona-zalno titar narasta vrlo sporo do 7. dana, a zatim naglo do 35. dana pokusa. Istodobno, najviši titar nakon okulonazal-nog davanja je dvostruko manji nego u pilića cijepljenih postupkom nebulizacije. Slični su odnosi titreva i 42. dana života pilića. Izdvojen soj virusa NB Zg-2000. je u cijelosti opravdao istraživanje neškodljivosti i imunogenosti. Poka-zalo se da ne izaziva štetne reakcije u pilića, a potaknuta specifična imunost mjerena HI i ELISA protutijelima je za-dovoljavajuća, te opravdava pretpostavku da bi se spomenuti soj mogao koristiti kao cjepni. Zbog toga bi trebalo nastaviti istraživanje pokusnim zaražavanjem pilića u različitom vre-menu nakon cijepljenja, kao i utvrditi stabilnost izdvojenog virusa s obzirom na činjenicu da se svojstvo patogenog virusa može promijeniti. Ukoliko navedene postavke budu zadovoljavajuće i pokaže li se na predloženi način imunogenost i stabilnost soja virusa NB Zg-2000., on bi se mogao prihvatiti kao cjepni soj u imunoprofilaksi newcastleske bolesti.

Literatura

Aldous, E. W., D. J. Alexander (2001.): Detection and dif-ferentiation of Newcastle disease virus (avian paramyxovirus type 1). Avian Pathol. 33 (2), 117-128.

Alexander, D. J. (1988.): Newcastle disease: Historical aspects. U: Newcastle disease.

Ed. D. J. Alexander. Kluwer Acad. Publ. Boston – Dordrecht – London, pp. 1-10.

Alexander, D. J. (1997.): Newcastle disease and other avian paramyxoviridae infections. U: B. W. Calnek, H. J. Barnes, C. W. Beard, L. R. Mc Dougald, Y. M. Saif, Diseases Of Poultry, 101t edn.

Alexander, D. J. (2000.): Newcastle disease and other avian paramyxoviruses. Sci Tech. Rev. 19., 443-462.

Alexander, D. J. (2001.): Newcastle disease. Br. Poult. Sci. 42, 5-22. Al-Garib, S. O., A. L. J. Gielkens, E. Gruys, G. Kochi (2003):

Review of Newcastle disease virus with particular references to immunity and vaccination. World's Poult. Sci. J. 59, 185-200.

Allan, W. H., J. E. Lancaster, B. Toth (1978.): Newcastle disease vaccines. Their production and use. FAO Animal Production and Health Series No. 10, Rome

Allan, W. H., R. E. Gough (1974.): A standard hemagglutination inhibition test for Newcastle disease. 2. Vaccination and challenge. Vet. Rec. 95, 147-149.

Beard, C. W., B. C. Easterday (1962.): The influence of Route of Administration of Newcastle Disease Virus on Host Response. I. Serological and Virus Isolation Studies. J. Infect. Dis. 117, 55-61.

Biđin, Z., H. Mazija, M. Kralj, Ana Kostanjevec, B. Juraković, A. Prstec, A. Kranjc (1979.): Vakcinacija iz nužde pilića u tovu protiv atipične kuge peradi upotrebom spreja. Veterinarski arhiv, 49, 77-89.


Ciglar Grozdanić, I. (2005.): Imunoreaktivnost pilića na inakti-virani virus Newcastleske bolesti primijenjen metodom za-magljivanja. Disertacija. Sveučilište u Zagrebu, Veterinarski fakultet.

Kaleta, E. F., C. Baldauf (1988.): Newcastle disease in free-living and pet birds. U: Newcastle disease. Ur. D. J. Alexander. Kluwer Acad. Publ. Boston – Dortrecht – London, 198-246.

Mazija, H., N. Franjković, I. Ciglar, E. Prukner-Radovčić (1997.): Vaccination of day old chickens with Ulster 2C strain of newcastle disease virus by use of ultrasound nebulizer SONOVAC 095 // X th International Congress of the World Veterinary Poultry Association / Szekely, A. (ur.).Budapest :

Hungarian Branch of the WVPA and Veterinary Medical Research Ins, 206.

Mazija, H., S. Čajavec, Estella Prukner-Radovčić, Neda Ergotić, Irena Ciglar-Grozdanić, Ž. Gottstein, W. L. Ragland (2009.): Immunogenicity and safety of La Sota strain of Newcastle disease virus administered to newly hatched chicks by nebulization. Acta Veterinaria Brno 1, (u tisku)

Runjić, I. (2006.): Genomske značajke virusa soja Zg-2000 newcastleske bolesti. Diplomski rad. Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet

Seal, B..S., D. J. King, H. S. Sellers (2000.): The Avian response to Newcastle disease virus. Develop. Comp. Immunol. 24, 257-268.

IMMUNOGENICITY OF FIELD STRAIN OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS ND ZG-2000 APPLIED TO SPF CHICKENS

Summary

Immunogenicity of the field strain of NDV (Newcastle disease virus) Zg-2000 was studied. Cited virus strain was isolated from epizootic of Newcastle disease in 1999 on a farm with fattening chickens in the northern part of Croatia. Immunogenicity of the field strain of NDV Zg-2000 was determined by oculonasal or nebulization vaccination of SPF chickens immediately after hatching (0-day of trial) and for control there was used an unvaccinated group of chickens. Titer of specific antibodies for vaccinal virus was determined by serological tests (HI test and ELISA). Blood samples for the serological tests were taken in equal time periods of seven days until the end of trial, i.e. chicken age of 42 days. Obtained results present immunogenicity of the NDV strain Zg-2000. Key words: Newcastle disease, SPF chickens, nebulization, immunogenicity

246

247

Okrugli stol / Round table


RESULTS OF SALMONELLA CONTROL IN POULTRY IN THE NETHERLANDS

Tjep de Vries

Animal Health Service, Deventer, The Netherlands

Summary

Monitoring based on bacteriology only, implementation in the Netherlands through Government approved Action Plan, Product Board. Results 2008 Reproduction stock SE and ST 0.34% of all flocks positive in layer breeders no S. Hadar, Infantis, Virchow total Salmonella <5% during lifetime of broiler breeders

Commercial layers • SE and ST in rearing period: none • SE and St in production period: bacteriology 3.5%

positive flocks

Broilers total Salmonella on carcasses <5% S. Paratyphi var. Java about 2/3 of all Salmonella

Conclusion With chicks from free origin, an accurate monitoring system, sufficient diagnostic facilities, good bio-security and proper use of reliable vaccines, Salmonella in poultry can be controlled

REZULTATI KONTROLE SALMONELOZE U PERADI U NIZOZEMSKOJ

Sažetak

Praćenje temeljeno samo na bakteriologiji, provedba u Nizozemskoj prema Planu aktivnosti koji je odobrila Vlada, Odbor za proizvodnju. Rezultati 2008

Rasplodna jata SE i ST 0.34% svih jata pozitivno U nesilica nema S. Hadar, Infantis, Virchow ukupna Salmonella <5% tijekom životnog razdoblja

uzgojnih brojlera Komercijalne nesilice • SE i ST u uzgojnom periodu: nema • SE i St u produktivnom periodu: bakteriologija 3.5%

pozitivnih jata

Brojleri ukupna Salmonella na truplima <5% S. Paratyphi var. Java oko 2/3 Salmonelle

Zaključak

S pilićima slobodnog podrijetla, pravilnim sustavom praćenja, prikladnom diagnostičkom opremom, kvalitet-nom bio-sigurnošću, pravilnim korištenjem pouzdanog cjepiva, moguće je kontrolirati salmonelozu u peradi.


ASPECTS OF VACCINATIONS IN SALMONELLA CONTROL IN POULTRY

Tjep de Vries

Animal Health Service, Deventer, The Netherlands

Summary

Salmonella control in poultry is based on • Regular monitoring of flocks, to act adequately if infection occurs • Hygienic measurements, to kill germs and prevent re-contamination • Specific measurements, to treat birds and improve their resistance 1. Antibacterials: to cure clinical symptoms 2. Organic acids and salts: to delete Salmonella in feed or water 3. CE (intestinal flora): to improve or restore resistance by competitive exclusion 4. Antibacterials + CE: to kill Salmonella and restore resistance in intestines 5. Vaccines, live or dead: to induce specific resistance

Vaccination significance is limited, in time, in resistance level and in serotypes (for most serotypes vaccines are not available), infection pressure should allways be low. Prevention is allways very important: chicks from free origin, hygiene, biosecurity. Vaccines have to be tested for safety, efficacy, shedding, spreading a.o. Vaccines, recommendations • Only officially registered vaccines should be used as per registration terms • Administration should be according to the manufacturers recommendation • Combinations of vaccines should be tested in field-trials before their use can be recommended Vaccines use in NL • (G)GPS: no vaccination, regarding manufacturer’s claims of "reduction“ only • Broiler breeders: Salenvac T (for progeny protection), vaccination rate circa 50% • Layer breeders: Salenvac T or Avipro Salmonella Vac E, vaccination rate almost 100% • Commercial layers: SG9R or Gallivac SE or Avipro Salmonella Vac E, incidentally Avipro Salmonella Vac T,

vaccination rate: almost 100% Results 2008 In all reproduction flocks 0.34% of flocks positive In commercial layers 3.5% of flocks positive, February - December In broilers 0.1% of flocks positive at slaughter age Conclusion With chicks from free origin, an accurate monitoring system, sufficient diagnostic facilities, and good bio-security, proper use of reliable vaccines helps to control Salmonella in poultry.

ASPECTS OF VACCINATIONS IN SALMONELLA CONTROL IN POULTRY 250

ASPEKTI CIJEPLJENJA U KONTROLI SALMONELOZE U PERADI

Sažetak

Kontrola salmoneloze u peradi temeljena je na sljedećem: • Redovitom praćenju jata, adekvatnom djelovanju ukoliko se pojavi infekcija • Higijenskim mjerama, ubijanjem klica i prevencijom re-kontaminacije • Specifičnim mjerama, tretiranjem ptica i poboljšanjem njihove otpornosti:

1. Antibakterijski preparati: za liječenje kliničkih simptoma 2. Organske kiseline i soli: za uklanjanje Salmonelle u hrani i vodi 3. CE (crijevna flora): poboljšanje ili vraćanje rezistentnosti pomoću kompetitivne ekskluzije 4. Antibakterijski preparati + CE: ubijanje Salmonelle i vraćanje otpornosti u crijevima 5. Cjepiva, živa i inaktivirana: za induciranje specifične otpornosti

Značajnost vakcinacije je limitirana, vremenom, u razini rezistentnosti i serotipima (za većinu serotipa vakcina nije dostupna), pritisak infekcije bi uvijek trebao biti nizak. Prevencija je uvijek vrlo važna: pilići slobodnog podrijetla, higijena, biosigurnost. Cjepiva moraju biti testirana na sigurnost, efikasnost, odbacivanje, širenje a.o. Vakcine, preporuke • Trebalo bi koristiti samo službena registrirana cjepiva prema registracijskim uvjetima • Administracija bi trebala biti provedena prema preporuci proizvođača • Kombinacije cjepiva bi trebale biti testirane na terenu prije nego se preporuči njihovo korištenje Korištenje cjepiva u Nizozemskoj • (G)GPS: bez cijepljenja, vezano samo za zahtjev proizvođača za "reduciranjem“ • Brojleri: Salenvac T (za zaštitu potomaka), stopa cijepljenja otprilike 50% • Nesilice: Salenvac T or Avipro Salmonella Vac E, stopa cijepljenja gotovo 100% • Komercijalne nesilice: SG9R ili Gallivac SE ili Avipro Salmonella Vac E, sporadično Avipro Salmonella Vac T, stopa

cijepljenja gotovo 100% Rezultati 2008 U svim reproduktivnim jatima 0,34% jata pozitivno U komercijalnih nesilica 3,5% jata pozitivno, veljača - prosinac U brojlera 0,1% jata pozitivno u dobi za klanje Zaključak S pilićima slobodnog podrijetla, pravilnim sustavom praćenja, prikladnom dijagnostičkom opremom, kvalitetnom bio sigurnošću, pravilnim korištenjem pouzdanih cjepiva, moguće je kontrolirati Salmonelozu u peradi.


NACIONALNI PROGRAMI KONTROLE SALMONELOZE U PERADI VRSTE GALLUS GALLUS U REPUBLICI HRVATSKOJ

Ivana Lohman

Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja Republike Hrvatske, Uprava za veterinarstvo, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Peradarstvo predstavlja jednu od najznačajnijih i najmodernijih grana stočarske/ prehrambene industrije u Republici Hrvatskoj. Prema posljednjim statističkim podacima na peradarsku proizvodnju otpada 18% ukupne stočne proizvodnje RH. Kontrola zdravlja peradi regulirana je propisima Ministarstva poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja. Usklađivanje europskog zakonodavstva s područja salmoneloze peradi te izrada istovjetnih nacionalnih programa s jasno definiranim ciljevima i rokovima za postizanje istih, osnovni je preduvjet za omogućavanje plasmana svih vrsta proizvoda hrvatskog peradarstva na tržištu zemalja članica Europske Unije. Prema podacima Hrvatskog zavoda za javno zdravstvo salmoneloza predstavlja važan javnozdravstveni problem te se smatra najznačajnijom zoonozom u Republici Hrvatskoj s prosječnim brojem prijavljenih 5000 slučaja na godinu. Zaključak: Sustavnom provedbom Nacionalnih programa kontrole salmoneloze u peradi vrste Gallus gallus omogućava se pravovremeno otkrivanje zaraženih jata, poduzimanje odgovarajućih mjera za njihovo uklanjanje iz proizvodnje te osigurava kvalitetan i zdravstveno ispravan krajnji proizvod siguran za potrošača.

NATIONAL PROGRAM OF SALMONELLA CONTROL IN POULTRY SPECIES GALLUS GALLUS IN THE REPUBLIC OF CROATIA

Summary

Poultry farming is an important branch of livestock/food industry which produces high quality and cheap food (chicken and eggs), and therefore is of special interest to the Republic of Croatia. According to last statistical data poultry farming makes approximately 18% of total Croatian livestock production. Control of poultry health is prescribed throughout legislation issued by MAFRD. Harmonization of national legislation with European regarding Salmonellosis in poultry and implementation of national programs with clear goals and time frame for their achievement is consider as basic precondition for trade with products of Croatian poultry industry on the EU market. According to data taken from Croatian Public Health Institute Salmonellosis in humans is considered as an important public health issue due to the 5000 reported salmonella cases per year. Conclusion: Continuous implementation of National control programs is necessary for early detection of salmonella positive flocks, taking of all eradication measures and, finally, insurance of good quality and healthy final product safe for the consumer.


NUTRITIONAL APPROACHES TO CONTROLLING SALMONELLA

Zöe Stevenson

Solutions Deployment Team, Alltech Europe, Ireland

Summary

Salmonellosis is generally accepted to be one of the most important zoonoses transmitted by meat and eggs in the developed world. The impact of salmonellosis on human health results in a significant economic loss at the hands of this disease. Salmonellae are responsible for a number of transmissible and non-transmissible poultry diseases. Public health concern about the spread of this pathogen through the food chain to humans is currently of major importance and increasingly the scientific community is concerned about the spread of antimicrobial resistance determinants within Salmonella. Surveillance programs have been initiated and underway within the EU, USA, Canada and Japan and a multitude of other countries. The ability of Salmonella to survive in a variety of environments for prolonged periods of time makes the eradication of this organism very difficult once it has entered the farm. Therefore, only through integrated management strategies that take into account biosecurity, control of pests and insects, all in/all out systems, training of staff, feed management, appropriate use of vaccines and use of specialised feed ingredients can result Salmonella be controlled at farm level. The control of Salmonella by use of bacteriostatic or bacteriocidal compounds has traditionally been a failure due to the rapid appearance in resistance. The understanding of host-microbe relationships has led to a new generation of anti-infectives based on blocking the colonisation of the Salmonella and thereby preventing pathogenesis. The majority of Salmonellae adhere to mannose receptors in the gastrointestinal tract as a first step in the colonization of the host. The introduction of a material rich in mannose, specifically in the correct structure, allows for an oligosaccharide decoy to attach to the Salmonella and prevent colonization and hence infection from taking place. Bio-Mos, a mannan oligosaccharide product from Saccharomyces cerevisiae, is the first commercial anti-infective that can be added to feed to prevent salmonella colonization as part of an integrated strategy. Recent studies have demonstrated the ability of Bio-Mos to control the prevalence and dissemination of antibiotic resistant bacteria within the food chain.

PREHRAMBENI PRISTUPI KONTROLI SALMONELE

Sažetak Salmoneloza je općenito prihvaćena kao jedna od najvažnijih zoonoza prenosivih mesom i jajima u razvijenom dijelu svijeta. Utjecaj salmoneloze na ljudsko zdravlje rezultira značajnim ekonomskim gubitkom. Salmonele su odgovorne za značajan broj prenosivih i neprenosivih bolesti peradi. Zabrinutost javnog zdravstva o širenju ovog patogena kroz pehrambeni lanac na ljude u današnje je vrijeme od izuzetne važnosti te je povećan interes i zabrinutost znanstvene zajednice o širenju antimikrobne otpornosti otkrivene kod salmonele. Programi nadzora su instalirani i provode se u EU, SAD-u, Kanadi, Japanu te mnogima drugim zemljama. Sposobnost salmonele da preživi produžen vremenski period u različitim uvjetima okoliša, uzrok je velike teškoće u eradikaciji organizma kad jednom uđe na farmu. Iz toga proizlazi da jedino strategija integriranog menadžmenta koja uzima u obzir biološku sigurnost, kontrolu različitih nametnika i insekata, sustav svi-unutra-svi-van (all-in-all-out), treniranje osoblja, kontrolu hrane, ispravnu upotrebu cjepiva i upotebu specijalnih dodataka hrani može rezultirati kontrolom salmonele na razini farme. Kontrola salmonele upotrebom bakteriostatskih ili baktericidnih supstanci tradicionalno je doživljavala neuspjeh zbog brzog razvoja otpornosti. Razumijevanje odnosa domaćin-mikrob dovelo je do nove generacije anti-infektiva baziranih na blokiranju kolonizacije salmonele, a time i prevencije patogeneze. Većina salmonela se lijepi za receptore manoze u gastrointestinalnom traktu što je prvi korak u kolonizaciji inficiranog domaćina. Uvođenje materijala bogatih manozom, pogotovo s korektnom strukturom, dozvoljava oligosaharidnom mamcu da se veže za salmonelu te na taj način sprječava kolonizaciju te na kraju i samu infekciju. Bio–Mos, proizvod mannan oligosaharida iz Saccharomyces cerevisiae, je prvi komercijalni anti-infektiv koji može biti dodan prehrani s ciljem sprječavanja kolonizacije salmonele kao dijela integrirane strategije. Nedavne studije su pokazale sposobnost Bio-Mosa da kontrolira učestalost i diseminaciju bakterija otpornih na antibiotike u okviru prehrambenog lanca.


JESMO LI USTUKNULI PRED PARAZITIMA KOJI UGROŽAVAJU PROFITABLNOST PROIZVODNJE U NESILICA?

Albert Marinculić

Zavod za parazitologiju i invazijske bolesti s klinikom, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Hrvatska

Sažetak

Dosadašnja istraživanja te epizootiološka izvješća govore da pored svih ostalih problema uzgoj i proizvodnju nesilica ugrožavaju i dva dobro znana parazita, oblić Ascaridia galli i i tekut Dermanyssus gallinae. Je li Ascaridia galli bezazleni oblić tankog crijeva peradi. Kako se radi o obliću dugom i do 12 cm koji se odlikuje velikom reprodukcijom, razvojem unutar sluznice te dužim životnim vijekom, za zaključiti je da uvriježeno mišljenje ni najmanje ne podržavaju rezultati znanstvenih istraživanja. Je li askaridioza emergentna bolest ili se pak radi o zanemarenom stvarnom problemu? Može li se provesti eradikacija? Sva ova pitanja traže hitne odgovore. Ni drugog redovitog uljeza ni najmanje ne treba zanemariti. Dosadašnja primjena insekticida nije ni u svjetskim razmjerima dala rezultat u kontroli ovog napasnika. Krije li se možda bolja budućnost kontrole tekuti u primjeni inertnog praha i gljivica?

DO WE RECEDE IN FRONT OF PARASITES THAT ENDANGER THE PROFITABILITY OF LAYING HENS PRODUCTION?

Sunnary

Current investigations show that beside other problems, in laying hens production, common parasites like roundworm and mite are still big threats. Is Ascaridia galli, the small intestine roundworm inocuous? Due to the body length, extreme reproduction, development in the mucosa and longevity it can be stressed that the traditional opinion is not correlated at all to the results of scientific investigations. Is ascaridiosis an emerging disease or only a neglected but real problem? Is eradication possible? All these queries need urgent replies. The second intruder, common red mite is also very important. Current application of insecticides neither at the global level gives sufficient results. Maybe the better future will be featured by the use of inert dusts and biological control with fungi?


UPRAVLJAČKI LIMS KAO NEIZOSTAVNI ALAT PRI PRAĆENJU DOSLJEDNOSTI DOBAVLJAČA, UJEDNAČENOSTI PROIZVODA, TE STRATIFIKACIJI FINALNOG PROIZVODA PREMA RAZNIM LEGISLATIVNIM I NORMATIVNIM OKRUŽENJIMA U SVRHU KONTROLE RIZIKA I PREVENCIJE INCIDENATA

Sandra Zavadlav1, Tomislav Petrak², Marijan Katalenić3, Vedran Poljak3, Damir Kropf1

1 PARDUS d.o.o., Zagreb, Hrvatska ² Zavod za prehrambeno-tehnološko inženjerstvo, Prehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatka 3 Hrvatski zavod za javno zdravstvo, Zagreb, Hrvatska Sažetak Prehrambena industrija danas je izložena povećalu javnosti kao nikada do sada u suvremenoj povijesti. Sve češći incidenti povezani sa zdravstvenom ispravnošću namirnica i vode kao temeljnim egzistencijalnim potrebama čovjeka imaju snažan odjek te je javnost izrazito senzibilizirana na opasnosti vezane uz prehranu. U svrhu značajnog smanjenja, a gdje je moguće i eliminiranja zdravstvenih rizika države sve više reguliraju prehrambenu industriju (procesu snažne regulacije i kontrole već smo svjedočili u farmaceutskoj industriji). Kako bi svi zainteresirani bili sigurni da subjekti uključeni u trgovanje, proizvodnju i distribuciju prehrambenih sirovina i proizvoda provode zakonom propisane postupke zaštite neophodna je uspostava transparentnog i sljedivog sustava kontrole namirnica. Upravljački LIMS je alat za nadzor procesa i postupaka kao rezultat analiza sirovina, poluproizvoda, proizvoda i ambalaže. Upotreba LIMS-a osigurava potpunu, pouzdanu i relevantnu informaciju u pravom trenutku za sve sudionike unutar tvrtke.

MANAGEMENT LIMS: AN INDISPENSABLE TOOL FOR MONITORING SUPPLIER CONSISTENCY, PRODUCT UNIFORMITY AND STRATIFICATION OF THE FINAL PRODUCT IN VARIOUS LEGISLATIVE AND NORMATIVE ENVIRONMENTS FOR THE PURPOSE OF RISK MANAGEMENT AND PREVENTION OF FOOD RELATED INCIDENTS

Summary

Food industry is in the focus of public scrutiny as never before. Increasingly frequent incidents related to food and drinking water safety receive strong attention, and general public is conditioned to follow with apprehension even minor events perceived as jeopardizing the supply of such basic necessities. In order to minimize and, when possible, eliminate health risks, governments increasingly resort to strong regulations and control of food industry, not unlike those we have previously witnessed in pharmaceutical and biotech industry. The need of all interested parties to ensure the strict compliance to these regulations by all entities involved in manufacturing, trading and distribution of raw, processed and final alimentary products necessitates introduction of a system of transparent monitoring and traceability of food. Management LIMS is a tool that facilitates monitoring of processes and procedures resulting from analysis of raw materials, packaging and final products. LIMS provides all participants with relevant, timely, complete and reliable information of interest.

Sandra Zavadlav, dipl.ing., PARDUS d.o.o. software development and Laboratory Information Management System and HACCP consulting, Folnegovićeva 10 000 Zagreb, Hrvatska; E-mail: [email protected]


MOGUĆNOST KORIŠTENJA USITNJENOG KUKURUZNOG OKLASKA ZA STELJU U PERADARSKOJ PROIZVODNJI

Ivan Hunjadi1, Stjepan Vukušić1, Marijan Hren2

1 EKOFER d.o.o., Zagreb, Hrvatska 2 VELEBIT. I. International, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Već se duže vrijeme za stelju u podnom uzgoju peradi koriste razni materijali, no najčešće je to otpad iz drvne industrije. Obično se radi o drvenim strugotinama i piljevini, ali je u posljednje vrijeme došlo do promjena i prerađivači drveta taj otpad sve više koriste za loženje i izradu građevinskih ploča (iverice i panel ploče). U traženju odgovarajuće zamjene dobre rezultate pokazuje usitnjeni kukuruzni oklasak. Radi se zapravo o dijelu klipa bez zrnja kojeg se godišnje, tijekom obrade sjemenskog i žetve merkantilnog kukuruza, nakupi oko 5000 tona. Njegovim usitnjavanjem dobiva se rahli zrnati materijal jako dobrih hidrofilnih i termoizolacijskih svojstava, koji se, osim toga, u tlu razgradi u tijeku jedne godine.

Ključne riječi: perad, stelja, kukuruzni oklasak Uvod

Stelja ili prostirka važan je čimbenik zdravlja i proizvodnosti peradi u intenzivnoj proizvodnji. Njena temeljna zadaća je toplinska izolacija poda i upijanje suviška vlage iz fecesa i zraka peradnjaka. Tijekom razvoja peradarske proizvodnje za stelju su se koristili različiti materijali, ovisno o njihovoj dostupnosti na tržištu, a svi su imali, u manjoj ili većoj mjeri, izolacijska i hidrofilna svojstva. Već duže vrijeme se uglavnom koristi otpadni materijal iz drvne industrije u formi piljevine ili drvenih strugotina, no prerađivači drveta u posljednje vrijeme taj materijal koriste za loženje ili izradu građevinskih ploča (iverice i panel ploče). Time su stvorili velik problem uzgajivačima peradi, pa se u novije vrijeme intenzivno istražuje mogućnost korištenja drugih materijala za nasteljavanje peradnjaka. Jednim od mogućih, a kako se sada čini, dobrih materijala, pokazao se usitnjeni kukuruzni oklasak. Radi se o otpadnom poljoprivrednom materijalu ko-jeg kod nas nakon obrade sjemenskog i žetve merkantilnog kukuruza ima oko 5000 tona, a vrlo je dobrih hidrofilnih i termoizolacijskih svojstava. Važno je naglasiti i to da se usitnjeni kukuruzni oklasak razgradi u tlu u tijeku jedne go-dine i nakon rasipanja po oranicama dobro utječe na fizi-kalna svojstva tla (Žilić, 2005.). Ukoliko želimo popraviti kakvoću takve stelje, dobro je u nju umiješati zeolit jer je tada primijećena bolja kakvoća zraka u peradnjaku i mine-ralni sastav stelje je kompletiran (Vučemilo, 2007.).

Rasprava i mogućnosti

Stelja u peradnjaku je termoizolacijski materijal koji štiti perad od hladne podloge. Ovisno o dobu godine, kakvoći poda i mikroklimi debljina nasteljavanja kreće se od 10 do 20 cm. Stelja je istodobno i medij koji prihvaća izmet peradi i iz njega upija suvišnu vlagu kao i onu iz zraka nastambe. Stoga je hidrofilnost vrlo važno svojstvo materijala za naste-ljavanje. U tijeku cijelog proizvodnog ciklusa stelja treba biti dobre kakvoće, dakle rahla i suha, jer samo takva može ispuniti svoju temeljnu zadaću. Ukoliko dođe do njenog brzog propadanja (učestali proljev u peradi, prolijevanje vode, velika vlažnost zraka u nastambi, slaba hidrofilnost), njeno djelovanje postaje opasno za zdravlje i proizvodnost useljene peradi. Do sada su za stelju korišteni mnogi materijali i kao najbolji su se pokazali suhi biljni ostaci, sami ili izmiješani. Naj-korišteniji su otpaci iz drvne industrije i to piljevina i drvene strugotine, ali valja napomenuti naknadni problem koji se javlja ukoliko se koristi takva stelja. Naime, drvo se u zemlji sporo raspada (nekoliko godina) i kao takvo mijenja fizikal-no-kemijski sastav tla, što loše utječe na rast i razvoj biljaka. Usitnjeni kukuruzni oklasak se, za razliku od navedenih materijala, razgrađuje u tijeku jedne godine i ima veoma dobra hidrofilna svojstva, zbog čega se koristi za sakupljanje prolivenih tekućina (voda, nafta, ulje, kemikalije). Utvrđeno je da usitnjeni kukuruzni oklasak može upiti čak četiri puta

Ivan Hunjadi, dipl.ing.biotehnologije, EKOFER d.o.o. Nova cesta 171 A, 10000 Zagreb, Hrvatska, tel: ++385 (0) 91 5615 311, fax: ++385 (0) 1 5619-984, e-mail: [email protected]

MOGUĆNOST KORIŠTENJA USITNJENOG KUKURUZNOG OKLASKA ZA STELJU U PERADARSKOJ PROIZVODNJI 256

više tekućine od svog obujma (Žilić, 2005.). Dobra termo-izolacijska svojstva kukuruznog oklaska prepoznata su u građevinarstvu, pa se on koristi kao materijal za proizvodnju izolacijskih sendvič-ploča. Jedan dio oklaska za sada je čisti otpadni materijal, što je velika šteta, no kada se jasno definira njegova namjena za prostirku u peradarskoj proizvodnji, on će se u cijelosti iskoristiti. Primjena i skladištenje kukuruznog oklaska vrlo su jedno-stvani; ukoliko raspolažemo ograničenim skladišnim prosto-rom, usitnjeni se oklasak može prešati u bale i zaštititi pla-stičnom folijom. Tim načinom pohrane sprečavamo njegovo zagađivanje i rasipanje, a obujam mu se smanjuje za dvije trećine. Prije uporabe bale se razrahljuju pomoću jednostavnog uređaja i tijekom tog procesa odvajaju se veći elementi usitnjenog oklaska. Ukoliko se odlučimo za stelju koja će ostvariti bolju mikro-klimu u nastambi i biti kvalitetnije gnojivo, treba prije use-ljavanja pilića na pod nanijeti tanki sloj zeolita (oko 5 mm) i na njega usitnjeni kukuruzni oklasak (oko 10 cm). Nakon 15

dana na stelju valja nasuti još jedan tanki sloj zeolita (2 mm). Takav postupak kompletirat će mineralni sastav stelje kao gnojiva i osigurati bolju kakvoću zraka u peradnjaku zbog inhibiranja stvaranja amonijaka i drugih štetnih plinova iz stelje. Takva se stelja može ubrzano sušiti u bubnjastoj su-šari i otpremati na oranice kao izvrsno gnojivo ili upakira-vati i skladištiti do iskorištenja. U tijeku su daljnja istraživanja, te očekujemo da će ostvareni rezultati opravdati uporabu usitnjenih kukuruznih oklasaka kao stelje u peradarskoj proizvodnji.

Literatura

Vučemilo, M., B. Vinković, K. Matković, R. Brezak (2007.): Kvaliteta zraka i dobrobit peradi. Peradarski dani, Poreč, 2007.

Žilić, S. (2005.): Kukuruz pročistač opasnih materija.

Zahvala

Autori zahvaljuju g. Mati Rokiću, vlasniku farme brojlera, što nam je omogućio provođenje pokusa primjene stelje od usitnjenog oklaska kukuruza u stvarnim uvjetima.

REPLACEMENT OPTION OF WOOD WASTE BEDDING WITH MASTICATED CORN COB BEDDING

Summary

Wood waste material like sawdust or wood shavings has been used as bedding in floor-breeding of poultry for a long period of time. However, the supply market has encountered some unfavourable changes, due to the fact that wood manufacturers steer more and more wood waste for the purpose of heating and production of construction panels (chipboards and panels). In quest of the best suitable replacement, masticated corn cob has shown the best results. Corn cob is the part of the corn which bears its grains. Every year 2000 tons of corn cob are produced during the seed of corn cultivation in Croatia. Additional 3000 tons are produced during the harvest of mercantile corn, but with necessary configuration of combined harvester. Mastication of corn cob produces crumbly, grainy material of excellent liquid absorption capacity, of quality heat isolation characteristics and of fast decomposition in the ground capacity (within a year). Key words: bedding, wood waste, corncob


DALMATINSKA TUKA - ARHAIČNA FORMA PERADI

Anamaria Ekert Kabalin1, Šandor Horvath, Velimir Sušić1, Tomislav Balenović1, Ivo Karadjole1, Mirta Balenović2, Drago Marguš3, Davorin Marković4, Ana Grgas5, Željko Pavičić6, Igor Štoković1, Sven Menčik1, Mario Ostović6

1 Zavod za stočarstvo, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu 2 Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Zagreb 3 Nacionalni park “Krka”, Šibenik 4 Državni zavod za zaštitu prirode, Zagreb 5 Hrvatski zavod za poljoprivrednu savjetodavnu službu, Zagreb 6 Zavod za animalnu higijenu, okoliš i etologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Sažetak

Potpisom Konvencije o biološkoj raznolikosti Republika Hrvatska aktivno se uključila u očuvanje ukupnog biodiverziteta. Od autohtonih pasmina peradi za sada su u Popis izvornih i zaštićenih pasmina i sojeva domaćih životinja nastalih na teritoriju Republike Hrvatske upisani zagorski puran i kokoš hrvatica. No, proces identifikacije te karakterizacije pojedinih tradicionalnih formi životinja koje se uzgajaju na nekom području još traje. Među takve tradicionalne oblike spada i dalmatinska tuka, koja se na području dalmatinskog zaleđa uzgaja generacijama. Navedena forma pura, povijesno uključena u tradiciju kraja, uspjela se održati zbog izričite sklonosti žitelja tog područja tradicionalnom te zbog njihove visoke primjerenosti ruralnom uzgoju, kao i lokalnim društvenim i gospodarskim prilikama. Svjesni činjenice da se u arealu dalmatinskih tuka sve češće ekstenzivno uzgajaju različiti hibridi pura, nalazimo nužnim što prije utvrditi njihove prosječne morfološke i fiziološke odlike da bismo mogli dati osnovne smjernice za karakterizaciju pasmine, procijeniti veličinu populacije čistih jata, ustanoviti jata sa primjesama krvi hibrida te usmjeriti uzgoj roditeljskih parova u čistoj krvi. Uz znanstvenu, stručnu te komercijalnu podršku od dalmatinskih bi se tuka mogao razviti još jedan snažan gastronomski simbol Dalmatinske zagore. Na taj bi način njihov tradicionalni, a pritom komercijalni uzgoj na obiteljskim poljoprivrednim gospodarstvima mogao imati primjetne promidžbene učinke i donositi znatne prihode. Ključne riječi: dalmatinska tuka, pura, biološka raznolikost, tradicionalni uzgoj Uvod

Uzgoj pura je prema ekonomskoj važnosti na drugom mje-stu u peradarstvu. Zbog visoke hranjive vrijednosti i uku-snosti purećeg mesa trend potrošnje je visok te raste i u zemljama u kojima je njegova potrošnja manja. Tome uve-like pridonosi i industrijalizacija proizvodnje purećeg mesa (Uremović i sur., 2002.). U komercijalnoj intenzivnoj proiz-vodnji, uz širokoprsnog brončanog i širokoprsnog bijelog purana, uglavnom se koriste hibridi selekcionirani i uzgojeni da u što kraćem vremenu i uz što manji ekonomski utrošak ostvare brži prirast i veću tjelesnu masu, a time i povećanje dobiti. No, posljednih desetljeća se, kako u svijetu, tako i u Hrvatskoj, sve više pažnje posvećuje očuvanju autohtonih, prilagođenih, često niskoproizvodnih vrsta i pasmina živo-

tinja te gastronomskoj ponudi tradicionalnih proizvoda (FAO, 2007.; Kuterovac i sur., 2001.; WWL-DAD3, 2000.; Rege, 1999.). Potpisom Konvencije o biološkoj raznolikosti 1992. godine i njenom ratifikacijom 1996. Republika Hrvat-ska aktivno se uključila u očuvanje ukupnog biodiverziteta. Uz genetsku bioraznolikost, autohtone pasmine i forme ži-votinja tradicionalno uzgajane na području Hrvatske sastav-ni su dio kulturne baštine pojedinih regija (Sušić i sur., 2008.; Ekert Kabalin i Štoković, 2007.; DZZP i Ministarstvo kulture RH, 2002.; Posavi i sur., 2002. i 2001.; Sušić i sur., 2001.). Od autohtonih pasmina peradi za sada su u Popis izvornih i zaštićenih pasmina i sojeva domaćih životinja nastalih na teritoriju Republike Hrvatske upisani zagorski puran i kokoš hrvatica (NN 127/98, 72/03, 39/06, 126/07). No, proces identifikacije te karakterizacije autohtonih pa-

Doc. dr. sc. Anamaria Ekert Kabalin, Zavod za stočarstvo, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: 01 2390138; e-mail: [email protected]

DALMATINSKA TUKA - ARHAIČNA FORMA PERADI 258

smina još traje s obzirom na pojedine tradicionalne oblike životinja koje se uzgajaju na nekom području (primjerice, dravska guska). Na području dalmatinskog zaleđa tradicio-nalno se uzgaja arhaična forma pura, tzv. dalmatinska tuka. Povijesno uključena u tradiciju kraja, navedena forma pura uzgaja se već generacijama kako zbog sklonosti žitelja tog područja tradicionalnim oblicima i gastronomskim specijali-tetima, tako i zbog njihove primjerenosti ekstenzivnom uz-goju. Narav gospodarstva i ekološki uvjeti kojima je dal-matinska tuka prilagođena suzbile su rasprostranjivanje nje-nog uzgoja na morsku obalu i otoke, kao i na njeno širenje na planinsko zaleđe prema sjeveru. No, iako imaju pre-poznatljive tjelesne odlike te se uzgajaju na ograničenom arealu, dalmatinske tuke još nisu znanstveno obrađene kao zasebna, prepoznatljiva autohtona pasmina. Tradicionalni, a pritom komercijalni uzgoj te pasmine na obiteljskim poljo-privrednim gospodarstvima mogao bi imati primjetne pro-midžbene učinke i donositi znatne prihode. Stoga je krajem 2008. godine predložen i prihvaćen projekt “Dalmatinska tuka – morfološke odlike i ekološke odrednice areala”, koji je financiralo Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja RH te sufinancirali Državni zavod za zaštitu prirode i Nacionalni park „Krka“. U ovom radu ukratko bismo predstavili osnovne pretpo-stavke i ciljeve istraživanja pokrenutog u svrhu identifikacije i karakterizacije dalmatinske tuke kao početne točke u nji-hovom očuvanju, a time i očuvanju biološke raznolikosti kraja.

Materijali i metode

U prvoj fazi provedbe istraživanja potrebno je identificirati jata dalmatinskih tuka na obiteljskim poljoprivrednim go-spodarstvima (OPG-ima) te odrediti 8-10 roditeljskih jata u kojima ćemo utvrditi prosječne fenotipske (morfološke i fi-ziološke) osobitosti. Morfološke izmjere obuhvaćaju: utvrđi-vanje standardne boje, prosječne težine jedinki (prosječna masa po spolu i dobi) te pojedinih izmjera (duljina trupa, duljina prsne kosti, duljina natkoljenice i potkoljenice, du-ljina glave, duljina kljuna, širina glave, širina trupa, dubina prsiju), kao i osobine nesivosti (prosječna nesivost, težina jaja). Navedene morfološke izmjere višekratno će se pratiti tijekom 7-8 mjeseci (jedanput mjesečno) da bi se utvrdio intenzitet prirasta i izračunala krivulja rasta. Podaci o nesivosti bit će prikupljeni anketiranjem vlasnika OPG-a. Nadalje, po 5-10 jedinki u jatu bit će vađena krv radi utvrđivanja metaboličkog statusa. Disekcijom utovljenih je-dinki utvrdit će se udio pojedinih komponenti u trupu (bjelančevina, masti, suhe tvari i vode), dok će dio njih biti organoleptički i gastronomski ocijenjen. Prikupljeni podaci bit će obrađeni računalnim programom Statistica 8.1. (StatSoft 2008).

Očekivani rezultati i diskusija

Unatoč kratkom provođenju istraživanja, na pojedinim su obiteljskim gospodarstvima u dalmatinskom zaleđu prona-đena jata pura koja svojim morfološkim obilježjima

odgovaraju arhaičnoj formi tradicionalno uzgajanoj na tom području (Slika 1). Ekstenzivan tov pura koji se provodi na tim gospodarstvima usmjeren je na sezonsku potrošnju, što znači da se većina utovljenih jedinki prodaje tijekom kasne jeseni i zime, posebice kao specijalitet za blagdane. Takav način uzgoja na otvorenom podrazumijeva raspolaganje ozelenjenim zemljišnim površinama i čvrstim objektima za toplu fazu uzgoja. Izuzev prvih mjesec do mjesec i pol dana života purića, te oštrih zimskih mjeseci, životinje se drže na otovrenom i same pronalaze hranu (trava, djetelina, skakav-ci, masline), dok im vlasnik po potrebi nadopunjuje obrok mekinjama, manjom količinom prekrupe, salatom, lupinama luka, kupusom, itd. Uzgoj podmlatka obavlja se na prirodan način, što podrazumijeva da brigu o zaštiti purića vodi majka pura. Pojedini uzgajivači u toj prvoj fazi života do 1-1,5 mjeseca puriće hrane komercijalnim predstarterom i starterom (Pur 1 i 2), no postoje i oni koji u potpunosti uzgajaju i hrane tuke na tradicionalan način, dajući purićima koprive, jaja, kuhanu rižu, mljeveni kukuruz. Uzgoj na otvorenom počinje u dobi od 4-6 tjedana. Veličina do sada utvrđenih rasplodni jata kretala se od 4 (3 pure i 1 puran) do 23 (20 pura i 3 purana) rasplodne jedinke. Omjer spolova koje uzgajivači ostavljaju za rasplod u idućoj godini ovisi o veličini jata (od 3:1 do 7:1). Pura prosječne mase 3,5 - 4,5 kilograma tijekom proljetne sezone snese 20-ak jaja iz kojih se izvali do 18 purića. Time se postiže godišnja proizvodnja od po prilici 50 do 400 utovljenih jedinki za prodaju, ovisno o veličini rasplodnog jata. Tjelesna masa purana kreće se oko 5 - 7 kg. Prema boji perja u svim jatima prevladavaju crne ili crno-prošarane jedinke, s manjom zastupljenošću bijelo prošaranih i vrlo malo smeđih, iako je u pojedinim jatima njihov udio znatniji (više od 10%), zavisno o boji rasplodnog purana. Nakon što u idućoj fazi provedbe istraživanja obavimo detaljne morfometrijske izmjere roditeljskih jata i njihovih potomaka, očekujemo da će se obradom podataka utvrditi da su jedinke unutar promatranih jata vrlo sličnih fenotipskih odlika, da se uzgajaju na karakterističan tradicionalni način na određenim mikrolokacijama te u specifičnim ekološkim uvjetima dalmatinskog zaleđa. Utvrđivanjem prosječnih morfoloških i fizioloških odlika dalmatinskih tuka moći ćemo dati osnovne smjernice za karakterizaciju pasmine, procijeniti veličinu populacije čistih jata, utvrditi jata sa pri-mjesama stranih pasmina/hibrida te usmjeriti uzgoj roditelj-skih parova u čistoj krvi. To bi nadalje predstavljalo osnovu za daljnju genetsku karakterizaciju i moguću identifikaciju još jedne autohtone pasmine. Uz to će se analizom sastava trupa te sastava i kakvoće mesa dalmatinskih tuka moći znanstveno utemeljeno ukazati na kakvoću izvornog proizvoda. Na temelju preliminarnih zapažanja predložit će se modeli proizvodnje koji bi bili ekonomski prihvatljivi za obiteljska poljoprivredna gospodarstva te potpomogli ruralni razvoj kraja i porast plasmana tradicionalnih kulinarskih specijali-teta. Očekivani ekonomski učinak je i porast prihoda te zaposlenosti putem usmjeravanja šire javnosti na samo-dostatnost ekstenzivnog uzgoja ove prilagođene forme pura kojim se omogućuje OPG-ima da uz manja ulaganja pove-


ćaju prihode u relativno kratkom roku. Uz znanstvenu i stručnu te komercijalnu podršku od dalmatinskih bi se tuka mogao razviti još jedan snažan gastronomski simbol, čime bi tradicionalni, a pritom komercijalni uzgoj te pasmine na obiteljskim poljoprivrednim gospodarstvima mogao imati primjetne promidžbene učinke i donositi znatne prihode.

Zaključak

Najznačajniji postupci u očuvanju tradicionalnih oblika i autohtonih pasmina domaćih životinja uključuju njihovu identifikaciju i karakterizaciju, procjenu veličine populacije i statusa ugroženosti, genetsku identifikaciju, konzervaciju in situ i ex situ metodama, ali i potporu države, kao i promociju njihovih izvornih proizvoda na tržištu (Sušić i sur., 2008.; Štoković i sur., 2007. a i b; Dadić i Jakopović, 2007.; FAO, 2007.). U pojedinim starim obiteljskim gospodarstvima meso dalmatinske tuke predstavlja prepoznatljivu gastro-nomsku deliciju te se one s pokoljenja na pokoljenje uz-gajaju na tradicionalni način, bez utjecaja genetike stranih hibrida i/ili drugih pasmina. Identifikacija takvih jata, određivanje fenotipskih odlika roditeljske generacije i kvali-tativnih karakteristika trupova predstavlja prvi korak ka opisu možebitne autohtone pasmine. Uz karakterizaciju for-me pura zatečene na području dalmatinskog zaleđa, ovo istraživanje pridonosi i rješavanju problema poljoprivrednih proizvođača u sklopu cjelokupnog socio-ekonomskog su-stava gospodarenja te ruralnom razvoju kraja.

Literatura

Dadić, M., I. Jakopović (2007.): Zakonske odrednice uzgoja izvornih i zaštićenih pasmina i sojeva domaćih životinja u Republici Hrvatskoj. Konferencija o izvornim pasminama i sortama kao dijelu prirodne i kulturne baštine. Šibenik, 13. - 16. studenog 2007. Knjiga sažetaka (Radna verzija), Zagreb, 67-70.

Državni zavod za zaštitu prirode – Ministarstvo kulture Republike Hrvatske (2006.): Biološka raznolikost Hrvatske. Ur: Radović, J., K. Čivić, R. Topić. Zagreb

Ekert Kabalin, A., I. Štoković (2007.): Očuvanje hrvatskih izvornih pasmina. Drugi kongres studenata veterinarske medicine s međunarodnim sudjelovanjem. Zagreb, 13. - 16. lipnja, 2007. Zbornik, Zagreb, 19-20.

FAO (2007.): The State of the World’s Animal Genetic Resources for Food and Agriculture Ed: Rischkowsky, B., D. Pilling. Roma

Kuterovac, K., A. Kljujev, M. Janeš, A. Pezo, K. Sinković, Z. Nushol, M. Dražić (2001.): Zaštita i očuvanje raznolikosti domaćih životinja u Hrvatskoj. Biološka raznolikost u stočarstvu Republike Hrvatske, Zbornik radova, HAZU, Zagreb, 13-27.

Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja RH (1998., 2003., 2006., 2007.): Popis izvornih i zaštićenih pasmina i sojeva domaćih životinja. Izmjene i dopune popisa izvornih i zaštićenih pasmina i sojeva domaćih životinja te njihov potrebni broj. NN 127/98, 73/03, 39/06, 126/07.

(Foto: mr. Ana Grgas)

Slika 1. Dalmatinske tuke u njihovom prirodnom okruženju Figure 1. Dalmatian Turkey in their natural environment


Posavi M., M. Ernoić, R. Ozimec, F. Poljak (2002.): Hrvatske pasmine domaćih životinja. Ministarstvo zaštite okoliša i prostornog uređenja, Zagreb

Posavi, M., M. Ernoić, R. Ozimec, F. Poljak (2001.): Hrvatske izvorne pasmine domaćih životinja. Veterinarski dani 2001. Znanstveno-stručno savjetovanje s međunarodnim sudjelo-vanjem. Opatija, 17.-19. listopada 2001., Zbornik, Zagreb, 187-189.

Rege, J. E. O. (1999.): Economic valuation of farm animal genetic resources. Proceedings of an FAO/ILRI Workshop, Roma, 25-27.

Sušić, V., A. Ekert Kabalin, I. Štoković, Ž. Pavičić, B. Mioč, V. Pavić, Z. Barać, S. Menčik (2008.): Autochthonous Ruminant Breeds in Croatia. Zbornik radova XVI. kongresa Medite-ranske federacije za zdravlje i produktivnost preživača, 13-24.

Sušić, V., T. Balenović, I. Martinić, D. Katica, I. Štoković, A. Ekert Kabalin (2001.): Hrvatske autohtone pasmine domaćih ži-votinja. Veterinarski dani 2001. Znanstveno-stručno savjeto-

vanje s međunarodnim sudjelovanjem. Opatija, 17.-19. listopada 2001., Zbornik, Zagreb, 177-186.

Štoković, I., A. Ekert Kabalin, V. Sušić, I. Karadjole, T. Balenović, A. Kostelić (2007. a): Zaštita zdravlja i rizici u in situ mo-delima očuvanja ugroženih izvornih pasmina domaćih živo-tinja. Konferencija o izvornim pasminama i sortama kao dijelu prirodne i kulturne baštine. Šibenik, 13. - 16. studenog 2007. Knjiga sažetaka (Radna verzija), Zagreb, 261-264.

Štoković, I., A. Ekert Kabalin, V. Sušić, I. Karadjole, T. Balenović, A. Kostelić, S. Menčik (2007. b): Zaštita zdravlja, zakonska regulativa i rizici u očuvanju izvornih pasmina domaćih životinja. Stočarstvo 61 (6), 481-487.

Uremović, Z., M. Uremović, V. Pavić, B. Mioč, S. Mužic, Z. Janječić (2002.): Stočarstvo. Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu. Zagreb, 601-606.

WWL-DAD:3 (World watch list for domestic animal diversity), 3rd edition. Ed. Beate, D. Scherf FAO, Rome, 2000.

DALMATIAN TURKEY – AN ARCHAIC FORM OF POULTRY

Summary

After signing the Convention of Biological Diversity, the Republic of Croatia has been actively included into preservation of biological and landscape diversity. Today, Hrvatica Hen and Zagorje Turkey are the only two autochthonous breeds of poultry that are included into the National Register of Autochthonous Breeds. However, processes of identification and characterization of autochthonous breeds are still continuing. Dalmatian Turkey can also be included in those traditional forms. As an archaic form of turkey it has been traditionally reared in the area of the Dalmatian hinterland. It is historically involved in the tradition of this region and maintained due to local inhabitants and their tendency towards traditional forms. Furthermore, those turkeys are suitable for extensive breeding, as well as for the local social and agricultural conditions. The daily increasing number of hybrids causes decrease of the amount of Dalmatian Turkey in this area. For that reason we find it necessary to determine their average morphological and physiological characteristics as soon as possible. In this way it will be possible to determine the main trends for breed characterization, to find flocks without influence of other breeds or hybrids, to determine the average population size, as well as to find parental flocks for further breeding and selection. With the scientific, professional and commercial support, Dalmatian Turkey may also present a culinary speciality from the Dalmatian hinterland. In this way, traditional, but commercial breeding on family farms could increase the budget and the standard of this region. Key words: Dalmatian Turkey (“Tuka”), biodiversity, traditional rearing


THE "TELEVET SYSTEM”® AN INNOVATIVE AND POWERFUL INSTRUMENT FOR THE POULTRY WELFARE SELF-CONTROL

Luciano Giovannetti

General Executive Manager of Italia Pegasus Institute SpA

Introduction

We can consider the PLF (Precision Livestock Farming) as an application of the principles and the technologies to livestock farming to check, model and manage the animal welfare, production and health. The Televet project was developed through a business partnership between Italia Pegasus Institute Confor and the University ‘La Sapienza’, to respond to emerging poultry farming requirements dictated by new European regulations, aimed at animal wellbeing and auto-control of poultry farms. The common scarce environmental parameter controls within the farms are cause of poor hygienic conditions that influence on the average mortality rate of the farm. The supply of water and feed non calibrated and the daily weight not checked can create problems of growth, physical stress and increased illnesses. The Prolonged exposures of carcasses on the premise promote proliferation of bacteria. All this conditions in any case are cause of stress with dangerous welfare losses for the quality production too.

The “Televet System”

The “Televet System” permits automated shelter manage-ment by detecting the state of the following conditions: • Internal Temperature • External Temperature • Relative Humidity • Premise / Bedding Humidity • Internal Shelter Depression • Feed consumption • Water consumption • Animal weight • Light intensity The automated devices guarantee the control of the following parameters: • Internal temperature • Internal shelter depression • Humidity • Visual capture devices that control and send shelter

images and short footage • Ability to implement automated device processes

• Humidification • Ventilation • Temperature conditioning

The complete control of the various shelters and produc-tive cycles are managed through a synoptic framework to access system functions for the management of: • Daily operations • Overtime operations • Other management functions The “Televet System” is an integrated tele-control model for aviary farms with this innovative and powerful carachteristics: • Remote control via web or satellite • Radio bridges to enable communication between the

remote Data Processing Server and the shelters • Evolving communication mechanisms

• Wireless systems server in the vicinity of the shelters

• Satellite systems • Adaptable also for 3rd Generation handhelds and

cellular phones (xhtml-mp interface)

Dr. Luciano Giovannetti, Veterinary Surgeon (DVM), Diploma of Specialist in Avian Pathology and Avian Technology, Diploma in Sanitary Law, Diploma in Food Inspection; Via Punta di Ferro, 2b; 47100 Forli’ - Italy; E-mail: [email protected] Mobile: +39 348 3813078

THE "TELEVET SYSTEM”® AN INNOVATIVE AND POWERFUL INSTRUMENT FOR THE POULTRY WELFARE SELF-CONTROL 262

• Increased competitive zootechnical product • Better cost/benefit production

• Work Optimization • Great reduction in costs related to on-site visits at

remote production units • Reduced mortality rate within aviary farms

• Improved general quality (animal welfare, greater production yield, less therapeutic treatments)

• Reduced environmental impact (challenges in the disposal of animal carcasses)

• Automated detection of environmental conditions with the aviary farms • 24x7 continual monitoring • Capable of automatic restore of healthy environ-

mental conditions • Historical archiving of detected data

• Decision support instruments • Reporting and On-Line graphs

• Localization Independence • Controller and Controlled • System communication selection

• System of Welfare Self – Control in armony with the European Rules • 24x7 continual monitoring • Capable of automatic restore of the optimal

environmental conditions • Innovative and powerful, ready for the future….for the

presence of some diseases…or some very dangerous zoonoses………and more………

Conclusions

The “Televet System” is a very good opportunity of the industrial application of the Precision Livestock Farming in the poultry and is a solution for an industry that increasingly requires improvements in environmental controls, public health and animal welfare.

Televet Technological Architecture


THE BENEFITS OF ELLAGITANNINS AND ENCAPSULATED CALCIUMBUTYRATE IN POULTRY NUTRITION

Martina Novak

Tanin Sevnica d.d.

Summary

Ellagitannins are the basic compounds of natural extract obtained from Hardwoods. Because of their astringency properties, antioxidative and antimicrobial activities they assure a higher litter dry matter, better environmental conditions, less infections, less breasts and clows lesions and better production performance. Encapsulated calciumbutyrate is the main energy source for the enterocytes and improves the health and functionality of the gut wall and mucosa. It serves also as organic Ca- source. It improves laying rate, hatchability, FCR, egg shell strenght and decreases mortality, and downgradeded eggs. Both products combined result in additive to syngeristic effects and could be considered as a health and growth promotor.

KORISTI OD ELAGITANINA I KAPSULA KALCIJ BUTIRATA U PREHRANI PERADI

Sažetak

Elagitanini su bazični spojevi prirodnog ekstrakta koji je dobiven iz tvrdog drveta. Zbog njihovih astrigentnih svojstava, antioksidantnih i antimikrobnih aktivnosti oni osiguravaju veću suhoću podloge, bolje stanje okoliša, manje infekcija, manje lezija na prsima i kandžama te bolje proizvodne rezultate. Kapsula kalcij butirata je glavni izvor energije za enterocite i poboljšava zdravlje i funkciju zida crijeva i crijevnu mukozu. Također služi kao organski izvor kalcija. Povećava broj snešenih i izleženih jaja, FCR, čvrstoću ljuske jaja te smanjuje smrtnost kao i broj jaja snižene kvalitete. Kombinacija oba proizvoda rezultira dodatnim sinergijskim učinkom te se može smatrati podsticajem za zdravlje i rast.

Martina Novak, M&D Manager, Tanin Sevnica d.d., Hermanova 1, 8290 Sevnica, Slovenia; Tel: ++ 386 41 386 706; e-mail: [email protected]

Documents

ZBORNIK PROCEEDINGS