Wykład 2 – Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych · 2014-12-02 · Przedmiot: Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna Wykład 2 – Biologiczne podstawy procesów

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot:

Wykład 2 – Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych

TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy Biotechnologii

Komórka i jej składniki11




Najważniejsze rodzaje komórek stosowanych w biotechnologii przemysłowej

Komórki prokariotyczne:

1. Bakterie gramdodatnie i gramujemne producenci kwasów, alkoholi, aminokwasów, białek

- w tym promieniowce producenci antybiotyków

Komórki eukariotyczne

2. Grzyby

drożdże producenci etanolu i białek

grzyby pleśniowe producenci białek i antybiotyków,i niektórych związków prostych

3. Komórki zwierzęce- komórki owadzie, CHO, BHK producenci białek




Komórki bakteryjne

Morfologia komórek bakteryjnych

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA


Prokariotyczna komórka bakteryjna



Skład i funkcja biologiczna elementów komórki prokariotycznejSkładnik Skład molekularny Funkcja biologiczna

Polisacharydy usieciowane peptydami, otoczone lipopolisacharydami

Biwarstwa lipidowo (40%)-białkowa (60%); mezosomto wpuklenie błony

Zawiera chromatynę -kompleks DNA i białek histonowych

Kompleksy RNA (65%) i białek (35%)

Małe cząsteczki, białka rozpuszczalne, enzymy, sole nieorganiczne

Ściana komórkowa, wici i rzęski

Błona komórkowa, mezosom

Obszar jądrowy

Rybosomy

Cytoplazma

Ochrona przed stresemosmotycznym i mechanicznym,Ruch (wici), adhezja i koniugacja (rzęski)

Selektywnie przepuszczalna barieraumożliwiająca transport składnikówpokarmowych i metabolitów

Genom. Miejsce przechowywaniai powielania informacji genetycznej

Miejsce biosyntezy białek

Miejsce zachodzenia większościreakcji metabolicznych

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNAPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii


Komórki bakteryjne są otoczone ścianą komórkową

Uproszczone struktury osłon zewnętrznych komórek bakteryjnych


Wykład 2 – Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Bakteryjna ściana komórkowa i jej biosynteza to miejsca działania ważnych antybiotyków

Antybiotyki beta-laktamowe

WankomycynaPeptydoglikan

Liza komórki bakteryjnej



Promieniowce (Actinomycetales)



Eukariotyczna komórka zwierzęca



Eukariotyczna komórka roślinna




Skład i funkcja biologiczna organeli komórki eukariotycznejOrganela Skład molekularny Funkcja biologiczna

Biwarstwa lipidowo (50%)-białkowa (50%);

Zawiera chromatynę -kompleks DNA i białek histonowych + RNA

Zespoły błon lipidowo-białkowych+ rybosomy

j.w. + polisacharydy

Otoczone podwójną błoną, zawierają enzymy, DNA i RNA

Pęcherzyki zawierające enzymy hydrolitycznePęcherzyki zawierające katalazę i inne enzymy utleniające

Otoczone podwójną błoną, zawierają białka, lipidy, chlorofil,RNA, DNA i rybosomy

Małe cząsteczki, białka rozpuszczalne, enzymy, sole nieorganiczne, cytoskeleton

Selektywna bariera transportowa;komunikacja międzykomórkowa

Miejsce przechowywania i powielania informacji genetycznej i transkrypcji

Miejsce biosyntezy białek

Miejsce wydzielania „odpadów”komórkowych i obróbki białek

Miejsce części reakcji katabolicznych i syntezy ATP

Metabolizm materiałów pobranychna drodze endocytozyMiejsce reakcji katabolicznych, w których powstaje H2O2

Miejsce fotosyntezy

Miejsce zachodzenia większościreakcji metabolicznych oraz struktura nadająca kształt komórce

Błona komórkowa

Jądro

Siateczka środplazmatyczna z rybosomami

Aparat Golgiego

Mitochondria

Lizosomy (zwierzęta)

Peroksysomy (zw.) lub glioksysomy (rośliny)

Chloroplasty (rośliny)

Cytoplazma



Jądro komórkowe

Obraz komórek HeLa z jądrami komórkowymi zaznaczonymi barwnikiem Hoechst



Mitochondrium

Obraz w mikroskopie elektronowymmitochondriów komórek pęcherzyków płucnych



Siateczka śródplazmatyczna – retikulum endoplazmatyczne

Obraz w mikroskopie elektronowymretikulum endoplazmatycznego1- jądro; 2 – por jądrowy;

3 – szorstkie RE; 4 – gładkie RE;5 – rybosom; 6 – białko transportowane w RE; 7 – pęcherzyk transportowy;8 – aparat Golgiego (AG); 9 – strona cis AG; 10 – strona trans AG; 11 – cysterna AG




Struktura rybosomuKatalityczny rdzeń rybosomuzbudowany jest z rRNA

Rybosomy

Rybosomy prokariotyczne: 30S + 50S → 70SRybosomy eukariotyczne: 40S + 60S → 80S

Wizualizacja struktury rybosomu




Grzyby w biotechnologii

Grzyby są organizmami heterotroficznymi – pasożyty lub saprofity

Przykłady ról grzybów w środowisku:

- dekompozycja martwej tkanki biologicznej (np. degradacja składnikówdrewna)

- czynniki chorobotwórcze – rośliny (ponad 5 000 chorób), zwierzęta- Mycorrhizae – symbioza z korzeniami roślin

W biotechnologii - procesy fermentacyjne, wytwarzanie antybiotykówproducenci białek terapeutycznych



Drożdże

Budowa komórki drożdżowej

Obraz komórek drożdży w skaningowym mikroskopie elektronowym

Morfologia drożdży




chityna

mannoproteiny

Struktura grzybowej ściany komórkowej

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Wykład 2 – Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Przedmiot: Podstawy Biotechnologii

GRZYBY

Mucor racemous

Penicillium chrysogenum

Aspergillus fumigatus

Zygomycetes – grzyby pleśniowe,sprzężniaki Grzybnia zbudowana z niepodzielnego mycelium. Rozmnażanie płciowe poprzez zarodniki zwanezygosporami lub bezpłciowe poprzez spory w sporangium.

Ascomycetes – workowceGrzyby jednokomórkowe lub tworzące grzybnię w postaci podzielnych strzępek.Rozmnażanie płciowe poprzez askospory lub bezpłciowe przez konidia. Do tej klasy należą m.in. Neurospra, Penicillium.



TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy BiotechnologiiPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii

Basidomycetes – podstawczaki Grzyby jednokomórkowe lub rozgałęzione. Rozmnażanie płciowe poprzez basidospory lub bezpłciowe poprzez konidia. Do tej klasy należą grzyby kapeluszowe.

Deuteromycetes – grzyby niedoskonałeGrzyby jednokomórkowe lub rozgałęzione. Cecha charakterystyczna – brak rozmnażania płciowego.

Amanita phalloides

Candida albicans



Grzyby pleśniowe

Aspergillus nidulans



Grzyby - rozmnażanie



Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych potencjalnych lekówDrobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne wytwarzają olbrzymią ilość małocząsteczkowych metabolitów wtórnych, z których wielewykazuje selektywną toksyczność wobec innych drobnoustrojów(antybiotyki przeciwdrobnoustrojowe), działanie przeciwnowotworowe(antybiotyki przeciwnowotworowe), ale także obniżające ciśnienie, hamujące biosyntezę cholesterolu, o działaniu przeciwbólowym, immunosupresyjnym i innym.

- wyizolowano i opisano około 20 000 metabolitów wtórnych;- połowa z nich działa antybiotycznie lub cytostatycznie- zastosowanie medyczne – około 150

Potencjalne dalsze możliwości:- z 40 000 gatunków bakterii poznano około 5 000- z 1,5 mln gatunków grzybów poznano około 70 000- bardzo słabo poznane: drobnoustroje morskie, ekstremofilne



Biofarmaceutyki białkowe

Systemy ekspresyjne:Komórki ludzkie – gen zmodyfikowany w obszarze promotoraCHO – Chinese hamster ovary (komórki jajnika chomika

chińskiego)BHK – baby hamster kidney (komórki nerki chomika)Komórki owadzie, gen włączony w genom baculowirusaAutographa californicaDrożdże – S. cerevisiae, Pichia pastorisBakterie – E. coli, Bacillus spp. Transgeniczne rośliny i zwierzęta




The purpose of micro-organism is....

...to make another micro-organism

Cel procesu biotechnologicznego:

1) jak najwięcej komórek drobnoustrojów w jak najkrótszym czasie...

lub 2) jak najwięcej pożądanego produktu

Przypadek 2) sprzeczny z życiowym celem drobnoustroju



TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Metabolizm = anabolizm + katabolizm

Procesy anaboliczne – endoergiczne i redukcyjneProcesy kataboliczne – egzoergiczne i utleniające




Bilans masowy utleniania glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych



Metabolizm

kluczowe cząsteczki

A + B + ATP → AB + ADP + Pi

A + B + ATP → AB + AMP + PPi

A + ATP → A-P + ADP




Etapy katabolizmu



Katabolizm

Główne szlaki kataboliczne jako źródła prekursorów dla biosyntezy składników biomakromolekuł



Cykl CorichMleczan powstający w pracującym mięśniuulega w wątrobie przekształceniu w glukozę

W warunkach beztlenowych w mięśniu pirogronian jestprzekształcany w mleczan

Obecność dodatkowej reakcji umożliwiaregenerację NAD+



Przekształcenie pirogronianu w etanol w komórkach drożdży w warunkach fermentacji alkoholowej




Produkty metabolizmu beztlenowego w różnych drobnoustrojachReakcje prowadzące do odtworzenia NADH są zaznaczone jako R




Regulacja metabolizmu drobnoustrojów

Zasady podstawowe

1. Równowaga pomiędzy procesami wytwarzającymii zużywającymi metabolity pośrednie

2. Energetyczne sprzężenie metabolizmu – bilansowanie zysku reakcji katabolicznych z sumą potrzeb energetycznychkomórki




Etapy ekspresji genu




Regulacja ekspresji genu przez białka regulatorowe




Główne mechanizmy regulacji transkrypcji genówkodujących enzymy metabolizmu podstawowego

Katabolizm:indukcja substratowa

Substrat lub jego metabolit działa jako induktor lub efektor pozytywny aktywatora. Regulacja dotyczy szlaku katabolizmu danego substratu

-represja katabolicznaŁatwiej przyswajalne źródło węgla lub efektor syntezowany w komórce w jegoobecności działa jako korepresor lub efektor negatywny aktywatora.Regulacja dotyczy szlaku katabolizmu trudniej przyswajalnego źródła węgla

-represja azotowaj.w., ale dotyczy szlaku przyswajania źródła azotu. Dotyczy także białek

transportowych

Anabolizm:- represja końcowym produktem szlakukońcowy produkt szlaku działa jako korepresor lub efektor negatywny aktywatora. Dotyczy szlaku biosyntezy -atenuacjamechanizm specyficzny dla drobnoustrojów prokariotycznych




Diauksja – dwufazowość wzrostu drobnoustrojóww obecności dwóch źródeł węgla

Produkcja penicyliny przez Penicillum chrysogenum



Inne mechanizmy regulacji metabolizmu podstawowego

Regulacja aktywności enzymów

1. Enzymy regulatorowe – regulacja allosteryczna

2. Kowalencyjna modyfikacja enzymów

3. Kompleksy wieloenzymowe

Regulacja transportu metabolitów

1. Transport białek przez błony

2. Regulacja ilości i aktywności białek transportowych(permeaz)




Grupy specyficznych produktów metabolizmu drobnoustrojów

alkaloidy fenazyny pirydynyaminocukry flawonoidy piroleaminoglikozydy fosfoglikolipidy pironyaminokwasy ftalaldehydy poliacetylenyantocyjaniny glikozydy polienyansamycyny hydroksyloaminy polieteryantrachinony laktony polikwasyantracykliny makrolidy polipeptydychinoliny naftochinony polisacharydychinolinony nitryle salicylanychinony nukleozydy steroidydepsipeptydy peptydy tetracykliny



TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Przemiany peryferyjne a przemiany centralne




Idiolity są syntezowane w idiofazie




Koncepcje wyjaśniające przyczyny biosyntezy idiolitów 1. Uzyskanie przewagi w danym środowisku

2. Przystosowanie się do zmieniających się warunkówśrodowiska dzięki dodatkowym szlakom metabolicznym

3. Utrzymanie stanu równowagi ze otoczeniem, gdy normalny wzrost nie jest możliwy

4. Wynik rozregulowania metabolizmu. Nadprodukcja idiolitów rodzajem „wentyla” dla niezbilansowanych przemian

5. Obszar „wolnej gry” ewolucyjnej poza zakresem ścisłychreguł selekcji eliminujących zmiany niekorzystne dla organizmu. Niektóre z idiolitów znajdują w końcu zastosowanie w metabolizmie producenta




Szlaki biosyntezy metabolitów wtórnych

1. Szlak poliketydowy2. Polimeryzacja jednostek izoprenoidowych3. Nierybosomalna synteza peptydów4. Mieszana biosynteza poliketydów i peptydów5. Biosynteza aminoglikozydów oraz amino- i peptydylonukleozydów

Fazy biosyntezy metabolitów wtórnych

1. Biosynteza i aktywacja prekursorów2. Oligomeryzacja3. Modyfikacja4. Kondensacja składników5. Modyfikacje końcowe6. Ukierunkowany eksport




Szlak poliketydowy – biogeneza niektórych antybiotyków




Regulacja biosyntezy idiolitów

MECHANIZMY KONTROLI BIOSYNTEZY IDIOLITÓW

- indukcja substratowa; - indukcja powodowana przez regulatory metaboliczne;- represja i hamowanie kataboliczne;- regulacja związkami azotu;- regulacja fosforanowa i energetyczna;- hamowanie w sprzężeniu zwrotnym – zarówno

przez metabolity podstawowe jak i specyficzne;- regulacja z udziałem pierwiastków śladowych;- regulacja tlenowa;- regulacja innymi czynnikami, takimi jak temperatura lub pH




Regulacja biosyntezy idiolitów

Indukcja substratowa

1. Biosynteza cefalosporyny C w C. acremonium – obecność w podłożu DL-cysteiny lub DL-norleucyny

2. Biosynteza alkaloidów sporyszu przez grzyby Clavicepsis– DL-tryptofan

Warunek – induktor dodawany w fazie wzrostu, a nie w fazie produkcji



Regulacja biosyntezy idiolitówRegulacja fosforanowa

Zasada ogólna – niskie stężenie fosforanu stymuluje biosyntezę idiolitów




Inżynieria metaboliczna szczepów przemysłowych

Producenci metabolitów pierwotnych:

- wprowadzenie zmian umożliwiających nadprodukcję- maksymalizacja nadprodukcji- zmiany umożliwiające pozakomórkowe wydzielanie produktu

Producenci metabolitów wtórnych:

- maksymalizacja wydajności produktu- możliwość wytwarzania produktów innych niż naturalny




Cechy szczepu wysokowydajnego

maksymalna wydajność pożądanego produktu

minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych

stabilność genetyczna

odporność na zakażenia wirusowe




Klasyczne metody otrzymywania i hodowli szczepów wysokowydajnych

nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza

wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów

optymalizacja warunków wzrostu




Mutanty szczególnie przydatne dla otrzymywania wysokowydajnych producentów metabolitów pierwotnych

MUTANTY AUKSOTROFICZNE (ŻYWIENIOWE)

Komórki pozbawione aktywności co najmniej jednegoenzymu katalizującego reakcję szlaku biosyntetycznego

MUTANTY REGULATOROWE

-mutacja w genie regulatorowym lub w obszarze promotorowympowodująca stałą derepresję biosyntezy;

-mutacja w genie strukturalnym, w efekcie której produkt genuma niezmienioną aktywność katalityczną, ale traci wrażliwośćna działanie inhibitora allosterycznego




Możliwość osiągnięcia celu:

Mutant auksotroficzny wobec związku F

Cel – uzyskanie nadprodukcji związku G




Biosynteza kwasu cytrynowego

Cykl Krebsa




Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger

Aktywność fosfofruktokinazy I, kluczowego enzymu regulatorowegoglikolizy jest hamowana przez ATPi cytrynian

Efekt Pasteura

U drobnoustrojów względnie anaerobowych, wydajność biomasy jest dużo większa w obecności tlenu, który hamuje fermentację alkoholową.Mechanizm: hamowanie glikolizy przez ATP i cytrynian

Efekt Crabtree

W hodowlach tlenowych następuje częściowe hamowanie oddychania przy bardzo dużych stężeniach glukozy




Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger

Droga alternatywna funkcjonuje w warunkach niskiego stężenia fosforanówI silnego napowietrzania




Jakie warunki należy spełnić, aby możliwa była wysoko wydajna produkcja kwasu cytrynowego?

1. Wysoko wydajny szczep Aspergillus niger- obecność alternatywnego łańcucha oddechowego- mutant regulatorowy – PFK-I niewrażliwa na hamowanie przez cytrynian

2. Odpowiednie warunki hodowli- skład pożywki: wysokie stężenie cukru; niskie stężenie jonów Fe(II) i Mn(II; niskie pH, około 2);

niskie stężenie fosforanów- bardzo intensywne napowietrzanie




Hybrydyzacja – fuzja protoplastów

Przykłady zastosowania:

• Praktycznie wszystkie szczepy przemysłowe używane do produkcji antybiotyków w wiodących firmach farmaceutycznych są rekombinantami otrzymanymi w wyniku fuzji protoplastów;

• Szczepy zawierające wiele kopii genów odpowiedzialnych za biosyntezęantybiotyku (np. Penicillium chrysogenum zaw. 20 zestawów genów kodujących wytwarzanie penicyliny G);

• Fuzja protoplastów dwóch szczepów Cephalosporium acremoniumwytwarzających cefalosporynę C: wysokowydajnego, ale wolno rosnącego i nie wytwarzającego spor oraz drugiego o cechach odwrotnych. Rekombinant posiadał kombinację cech korzystnych; wydajnośćo 40% lepsza niż wydajniejszy ze szczepów rodzicielskich.

Documents

Wykład 2 – Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych · 2014-12-02 · Przedmiot: Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna Wykład 2 – Biologiczne podstawy procesów