Wstęp do radiobiologiiWykład 2 – radiobiologia komórkowa

DNA jest komórkową tarcządla promieniowania jonizującego

jądro6%

aparatGolgiego

6%

siateczkaśródplazmatyczna

9%

mitochondrium22%

błona komórkowa

lizosom1%

endosom1%

rybosom

cytoplasma54%

Częstości popromiennych i spontanicznych uszkodzeń DNA

rodzaj uszkodzenia

pęknięcie podwójnoniciowe

pęknięcie pojedynczoniciowe

utrata zasady

uszkodzenie zasady

uszkodzenia spontanicznew komórce na godzinę

< 1

5000

1500

1250

uszkodzenia w komórce na 1 Gy

40

1000

950

950

Dawka 1 Gy wywołuje ~100,000 jonizacji w komórce

OH .O

H

H O2

(OH Radikal)

Radiolyse

Basenschaden

Einzelstrangbruch

Einzelstrangbruch

Doppelstrangbruch

Indirekte Wirkung

H.

(hydratisierter Wasserstoff)

promienie X, gamma, beta

pojedynczoniciowepęknięcie DNA

pojedynczoniciowepęknięcie DNA

uszkodzeniezasady DNA

podwójnoniciowepęknięcie DNA

radioliza

rodnik

rodnik

popromienne uszkodzenia DNA

neutrony, protony, ciężkie jony

tlen potęguje efekt pośredni:

H. + O2 HO2.

2 HO2. H2O2 + O2

2 HO2. + H. H2O2

Ciąg zdarzeń w napromienionej komórce

• Uszkodzenia pośrednie i bezpośrednie

• Wychwyt wolnych rodników przez zmiatacze

• Rozpoznanie uszkodzeń DNA

• Zatrzymanie cyklu i naprawa uszkodzeń DNAlub skierowanie komórki na drogę apoptozy

Radioochraniacze, czyli zmiatacze wolnych rodników

glutationCys GlyGlu

SH

GSH + .OH H2O + GS. GS. + GS. GSSG

powstaje disulfid glutationuatak przez rodnik .OH

grupa tiolowa

GSH

GSSG

GS.RH

R.GSOH

NADPH

NADP+ + H+reduktaza

glutationowa

H2O2H2O

peroksydazaglutationowa

ATP ADP + P

GS-Q

Q-XHX

transferazaglutationowa

elektrofiloweksenobiotyki

Pierwszy krok w naprawie DNA: rozpoznanie uszkodzenia(mocno uproszczone!)

Atm

Waf1

naprawa DNAnaprawa DNA

zatrzymanie w cykluzatrzymanie w cyklu

Rb

p53 Mdm2

BaxPuma Noxa

Bcl2

śmierć apoptotycznaśmierć apoptotyczna

białka genów supresorowych

białka onkogenówaktywacjasupresja

ale najpierw trochę o cyklu komórkowym...

G1 S G2 M

Chromatyna ulega dekondensacji

Chromatyna rozluźniona

Chromatyna ulega kondensacji

Chromatyna spakowana

+

Drugi krok w naprawie DNA: mechanizmy naprawy

Naprawa DNA: schemat głównych szlaków

dsb

rodzaje uszkodzeń DNA:

uszkodzenie w S / G2

naprawa rekombinacyjna przy użyciu chromatydy siostrzanej jako matrycy

naprawa stosunkowo powolna ale wierna

HRR - homologousrecombination repair

uszkodzenie w G1

naprawa przez sklejeniewolnych końców DNApo ich nadtrawieniu

naprawa stosunkowopowolna i błędna

NHEJ - non homologousend joining

ssb - single strand breakbd - base damagedsb - double strand break

ssb bd

naprawa z wycięciemprzy użyciukomplementarnejnici DNA jako matrycy

naprawa szybka i wierna

BER - base excision repairNER - nucleotide excision repairNMR - nucleotide mismatch repair

ssb i bd powstają w komórkachspontanicznie z częstościąokoło 8000 / komórkę / godzinę

uszkodzenia letalne – subletalne – potencjalnie letalne

pojęcia operacyjne wprowadzone do wytłumaczenia zjawiskawzrostu odporności na promieniowanie przez:

1. rozbicie dawki na frakcje (Elkind repair)2. przez trzymanie komórek po napromienieniu w warunkach

suboptymalnych (liquid holding) powodujących zatrzymanie komórek w cyklu.

W obu przypadkach komórka zyskuje czas na naprawę uszkodzeń!

ssb bd

głowa ogon

0 min

15 min

30 min

180 min

czas naprawy (min)

20

0

dług

ość

ogon

a

0 180

Pomiar naprawy DNA - test kometowy(elektroforeza pojedynczych komórek)

kinetyka naprawy w czasie

10

Naprawa DNA jest przestrzennie uporządkowana"ogniska" z udziałem białka Rad51 (białko naprawy HRR)

B.C. Godthelp, M. Zdzienicka i wsp., Nucleic Acid Research 30, 2002

traktowanemitomycyną C

traktowanepromieniami X

beztraktowania

komórki V79B(dzikie - wt)

komórki CL-V4Bmutanty rad51c

komórki CL-V4B z skomplementowanym

genem rad51c

ogniska

ogniska

brakognisk

Poziom podwójnoniciowych pęknięć DNA można mierzyćbadając ogniska gamma-H2AX

M. Löbrich et al.

Kinetyka powstawania ognisk w jądrze komórkinapromienionej światłem laserowym

dicentrykfragmenty

acentrycznetranslokacja

Naprawa DNA nie zawsze przebiega w sposób bezbłędny...

schemat powstawania popromiennych aberracji chromosomowych

prowadzi do śmiercikomórki

może prowadzićdo procesunowotworzenia

dic

ace

Komórka z chromosomem dicentrycznym

podział chromosomuna dwie chromatydy

wrzecionamitotyczne

Jeszcze trochę o cyklu i podziale mitotycznym...

Podział chromosomu podczas mitozy

cytoplazma

G0

G2 G1

S

M

jądro

wrzeciono mitotyczne

fragment acentryczny

mikrojądro

Schemat powstawania mikrojąder popromiennych

mikrojądra są przyczyną śmierci mitotycznej komórki

Komórki dwujądrzaste z mikrojądrami

Mn Mn

Rzut oka na całość: los komórki napromienionej

naprawa DNAbłędna

komórka z uszkodzonym DNA

śmierćnekrotyczna

po wysokiej dawce

efektsomatyczny

naprawa DNA

bezbłędna

komórka zdrowa

brak efektu

niestabilneaberracje

chromosomowe

mikrojądra

śmierć mitotyczna

efektsomatyczny

brak efektu

stabilneaberracje

chromosomowe,mutacje

tormutacyjny

nowotwór

śmierć apoptotyczna

efektsomatyczny

efektkancerogenny

efektgenetyczny

w komórkachrozrodczych

Gy

Dlaczego i w jaki sposób umierająkomórki z uszkodzonym DNA?

śmierć apoptotyczna komórka umiera ponieważ włączaprogram autodestrukcji

śmierć nekrotyczna komórka umiera ponieważ traci zdolnośćdo zachowania równowagi wodno-elektrolitowej

śmierć interfazalnakomórka umiera zanim zdoła

się podzielić

śmierć mitotycznaśmierć jest konsekwencją błędówpodczas podziału komórkowego

Alexis Carrel (1873 – 1944) chirurg francuskiLaureat nagrody Nobla

1912 – hodowla tkanki sercowej wyizolowanej z 18-dniowego zarodka kurczaka – do 1946.Hodowla w osoczu krwi zwierzęcej

Scientific Amercian January 1942

Historia hodowli tkankowej

1951: pierwsza stała linia komórkowa HeLaZałożona przez George’a i Margaretę Gey

Wyizolowana z wycinka nowotworu szyjki macicyHenrietty Lacks

Komórki HeLa

Test prze ywalnoż ści - schemat eksperymentu

komórki w hodowli

trypsyna

zawiesinakomórek

inkubacja: 1 - 2 tygodnie

rozsianie

100 200 300 400

0 Gy 1 Gy 2 Gy 3 Gy

liczba kolonii:wydajność klonowania:frakcja przeżywalności:

70 70%

1

60 -

0,42

50 -

0,23

40 -

0,14

frakcja prze ywalnoż ści (SF)

SF =liczba kolonii

liczba komórek x PE/100

PE = wydajność klonowania

Ważny punkt końcowy w radiobiologii: ocena przeżywalności komórek

Pierwsza krzywa przeżywalnościPuck i Markus, 1956

ramię krzywej (shoulder)

eksponencjalnaczęść krzywejsk

ala

log

2,00 4,03,01,0 5,0

0,1

DQ

D0 D0

D0

D0

0,037

1

Dawka (Gy)

Przeży

wal

ność

krzywa 1

krzywa 2= 1,5 Gy

= 0,6 Gy

DQ = miara szerokości ramienia

D0 = miara promieniowrażliwości= dawka, która powoduje obniżenie

przeżywalności do e-1

= do 37% mierzonej na prostej

krzywa przeżywalności

duże D0

małe D0

Jak wytłumaczyć eksponencjalnączęść krzywej?Prawdopodobieństwo przeżycia komórek nie trafionych jako funkcja średniej liczby trafieńna komórkę

Według równania Poissona:P(0) = e-λ

(λ = średnia trafień na komórkę)

zależność dawka-efekt

liczba trafień w komórkę

liczba trafień w komórkę

liczba trafień w komórkę

Modele wyjaśniające przebieg krzywej

Model wysyconej naprawy (repair saturation model)

naprawa

naprawa

naprawa sprawnaale nie w 100%=> część komórek ginie

naprawa wysycona=> przeżywalność zależy od liczby trafień

DQ = miarą zdolności naprawy uszkodzeń subletalnych

Modele wyjaśniające przebieg krzywejModel liniowo-kwadratowy (LQ model, Douglas and Fowler 1976)

P(0) = e(-αD - βD2)

Dose (Gy)

uszkodzenia typu one-hit (zależność liniowa)– prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D

uszkodzenia typu two-hit (zależność liniowo-kwadratowa)– prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D2