MEDIZINISCHE FAKULTÄT INSTITUT FÜR MEDIZINISCHE MIKROBIOLOGIE UND

INFEKTIONSEPIDEMIOLOGIE Liebigstr. 21

04103 LEIPZIG

WWIINNTTEERRSSEEMMEESSTTEERR 22001177//22001188

Skriptum zum Praktikum Medizinische Mikrobiologie

für Studenten der Zahnmedizin

Name:

Kurs vom: bis:

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Praktikumsort: Forschungszentrum Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie Liebigstr. 21, 2. OG, 04103 Leipzig Kursräume 2052 und 2053 Praktikumszeiten: Mikrobiologie und Virologie freitags 14.00 bis 16.15 Uhr (im Anschluss an die Vorlesung) Terminplan: Fr. 20.10.2017 Einführung in die Arbeitsgebiete der Medizinischen Mikrobiologie (nur Vorlesung ) Fr. 27.10.2017 Allgemeine Arbeitstechniken Fr. 03.11.2017 Identifikation von Spezies Fr. 10.11.2017 Resistenztestung Fr. 17.11.2017 Mikrobiologie der Mundhöhle Fr. 24.11.2017 Ausgewählte Infektionen: Endocarditis, Wundinfektionen, Mykologie Fr. 01.12.2017 Serologie, Syphilis Fr. 08.12.2017 Allgemeine Virologie Fr. 15.12.2017 AkuteVirusinfektionen Fr. 05.01.2018 Persistierende (chronische) Virusinfektionen

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Inhaltsverzeichnis Kursordnung Organisatorische Hinweise Arbeitsschutzbestimmungen Hinweise zur Benutzung des Skriptums Literaturhinweise 1. Praktikumstag: Allgemeine, mikrobiologische Arbeitstechniken 2. Praktikumstag: Identifikation von Spezies 3. Praktikumstag: Resistenztestung 4. Praktikumstag: Mikrobiologie der Mundhöhle 5. Praktikumstag: Ausgewählte Infektionen: Endocarditis, Wundinfektionen, Mykologie 6. Praktikumstag: Serologie, Syphilis 7. Praktikumstag: Allgemeine Virologie 8. Praktikumstag: Akute Virusinfektionen 9. Praktikumstag: Persistierende (chronische) Virusinfektionen

In den noch verbleibenden Wochen bis Semesterende werden während der Praktikumszeit schwerpunktmäßige Vorlesungen gehalten: 1. Virologie 2. Parasitologie 3. Wundinfektionen Am letzten Vorlesungstag erfolgt die Ausgabe der Teilnahmebescheinigung.

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Kursordnung Zulassung zum Kurs - Der Kurs der Medizinischen Mikrobiologie für Studenten der Zahnmedizin wird im 4.Sudienjahr durchgeführt. Voraussetzung für die Teilnahme ist die erfolgreiche Absolvierung der Zahnärztlichen Vorprüfung. Es erfolgt eine zentrale Einschreibung für die Praktikumsplätze durch das Studiendekanat. - Der Kurs unterliegt Beschränkungen hinsichtlich der Teilnehmerzahl. Die Zahl der Teilnehmer kann pro Studienjahr maximal 60 betragen. Durchführung der praktischen Übungen - Der Kurs besteht aus der selbständigen Durchführung praktischer Übungen unter Anleitung einer Lehrperson im Kurssaal und anschließenden Seminaren. - Es wird erwartet, dass die Kursteilnehmer sich an Hand des vorliegenden Skriptums auf den jeweiligen Kurstag vorbereitet haben, und dass die praktischen Übungen vollständig durchgeführt werden. Bei grober Nach- lässigkeit bei der Durchführung der Übungen oder bei einem schlechten Vorbereitungsstand des Teilnehmers kann eine Lehrkraft festlegen, dass der entsprechende Kurstag als versäumt gilt. - Die zu Beginn des Praktikums zugeteilten Plätze sin d während der gesamten Praktikumszeit beizubehalten. - Die in den Kapiteln „Arbeitsschutzbestimmungen“ und „Organisatorische Hinweise“ aufgeführten Festlegungen sind strikt einzuhalten. Ihre Anerkennung ist durch jeden Kursteilnehmer zu quittieren. Ihre grob fahrlässige oder bewusste Missachtung kann wegen der Gefährdung anderer den Ausschluss vom Kurs zur Folge haben. Entscheidungen hierfür treffen die verantwortlichen Kursassistenten. Regelmäßigkeit der Teilnahme - Voraussetzung für die Erteilung des Kursscheins ist die Regelmäßigkeit der Teilnahme an den Vorlesungen und Praktika. - Nach jedem Kurstag muss der Teilnehmer die Anwesenheit durch eigene Unterschrift in der Tischliste bestätigen. - Eine regelmäßige Teilnahme wird bescheinigt, wenn nicht mehr als zwei Kurstermine (einschließlich Vorlesungen) versäumt wurden. Kann sie nicht bescheinigt werden, so ist der Kurs insgesamt im nächsten Studienjahr zu wiederholen. Plätze für Wiederholer können nur nach Maßgabe freier Kursplätze vergeben werden. Über Härtefälle entscheidet der Lehrstuhlinhaber.

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Anerkennung von anderweitig erbrachten Teilleistung en Teilleistungen, die anderweitig, insbesondere an anderen Universitäten, erbracht worden sind, werden grundsätzlich nicht anerkannt. Anerkennungen sind deshalb grundsätzlich nicht möglich, weil Praktika und andere Übungen als einheitliche Veranstaltungen zu betrachten sind, von denen nicht Teile herausgelöst werden können. MTLA-Ausbildungen werden aufgrund der anderen Zielstellung ebenfalls nicht als Kursäquivalent anerkannt. Organisatorische Hinweise - Jeder Platz hat eine Nummer. Diese Platznummer benutzen Sie bitte auch zur Beschriftung der von Ihnen angelegten Materialien. - Für den Kurs ist ein Mitarbeiter der Institute zuständig, an den Sie sich mit allen Fragen wenden können und der Ihnen bei der Durchführung der Versuche bzw. Übungen behilflich ist. - Die Anwesenheitskontrolle wird vom Kursassistenten durchgeführt. - Die von Ihnen bearbeiteten Materialien bleiben an Ihrem Arbeitsplatz bzw. werden auf Anordnung des zuständigen Kursassistenten eingesammelt. - Am Ende jedes Praktikums sind die Arbeitsplätze aufzuräumen und zu desinfizieren, die Ölimmersionsobjektive der Mikroskope mit Ethanol abzuwischen und die Mikroskope in die vorgesehenen Schränke zu stellen. Defekte und Verluste am Arbeitsgerät sind unverzüglich der verantwortlichen Lehrkraft zu melden. - Für Ihre Garderobe, Taschen u.ä. übernimmt das Institut keine Haftung. Taschen, Rucksäcke u.a. dürfen in die Infektionsbereiche (Kurssäle) nicht mit hineingenommen werden. - Es ist zweckmäßig, folgende Utensilien zum Kurs mitzubringen: . eine Uhr mit Sekundenzeiger . einen wasser- u. alkoholfesten Faserstift für Plastik und Glas . Bleistift, roten und blauen Buntstift, übliches Schreibgerät . eine kleine Lupe (4 - 10fache Vergrößerung) . Zahnbürste (zum 4.Praktikumstag)

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Arbeitsschutzbestimmungen, Infektionsverhütung (unter auszugsweiser Nutzung des Merkblattes der Bundesarbeitsgemeinschaft der gemeindlichen Unfallversicherungsträger, München 2, in Zusammenarbeit mit der Berufsgenossenschaft für Gesundheitsdienst und Wohlfahrtspflege, Hamburg 36)

Verhalten im mikrobiologischen Labor - Jeder Student ist verpflichtet, im Kurssaal aus Gründen der Infektionsverhütung einen auf der Vorderseite geschlossenen Kittel zu tragen. Diese Kittel müssen als kontaminiert angesehen werden und dürfen nicht an anderer Stelle (etwa in der Klinik) benutzt werden. - Es ist umsichtig und überlegt zu arbeiten, damit für einen selbst und andere keine erhöhte Infektionsgefahr ausgeht (z. B. nichts verspritzen, Aerosolbildung vermeiden, kontaminiertes Material ordnungsgemäß entsorgen, verschüttetes infektiöses Material desinfizieren), Petrischalen mit lebenden Bakterien nur so lange als nötig geöffnet halten, möglichst umgehend wieder mit Deckel verschließen. - In den Kursräumen darf nichts gegessen und getrunken werden (gilt auch für Kaugummi); lange Haare sind zusammenzubinden. - Schwangere Studentinnen dürfen die Kursräume nicht betreten. - In die Kursräume sind nur die nötigsten Utensilien mitzunehmen, kontaminiertes Material darf aus den Kursräumen nicht mitgenommen werden. - Vor dem Verlassen der Kursräume, am Ende des Praktikumstages und bei Berührung von infektiösem Material ist eine hygienische Händedesinfektion vorzunehmen. Desinfektionsmittelspender sind an den Wänden angebracht (ca. 5,0 ml Desinfektionsmittel auf die Handinnenfläche und Handrücken verteilen; mindestens 1 min einwirken lassen, evtl. weiteres Desinfektionsmittel anwenden). - Nach Arbeitsende ist der Arbeitsplatz mit Desinfektionsmittel abzuwischen. - Kontakt mit oder Verschütten von infektiösem Material sowie Unfälle und besondere Vorkommnisse sind sofort der verantwortlichen Lehrkraft mitzuteilen. - Auf die Notwendigkeit des Tragens von Gummihandschuhen wird gesondert hingewiesen.

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Schutzmaßnahmen gegen Laboratoriumsinfektionen Bei Infektionen ist so bald wie möglich ärztliche Hilfe in Anspruch zu nehmen. Die nachstehenden Anordnungen sind daher nur als erste Schutzmaßnahmen aufzufassen. Jede Laboratoriumsinfektion, jede Verletzung durch infizierte Instrumente, jede Beschmutzung von Hautwunden und Schrunden mit infiziertem Material ist ebenso wie jeder Unfall unverzüglich dem Kursleiter zu melden. Ist der Betroffene hierzu nicht imstande, hat die Meldepflicht der Kursteilnehmer, der zuerst von dem Ereignis erfährt. Besondere Schutzmaßnahmen Infektiöses Material ist in den Mund gelangt, aber noch nicht geschluckt worden: Nicht schlucken! Sofort ausspucken! Darauf wiederholt gründlich Mund ausspülen und gurgeln mit frisch angesetzter 0,1 %iger Kaliumpermanganatlösung oder 1%iger Wasserstoffsuperoxidlösung. Jedes Schlucken vermeiden! Zweckmäßig ist, nunmehr wiederholt Brot zu kauen und das zerkaute Brot unter Nachspülen und Gurgeln mit Wasser auszuspucken. Speichel ausspucken! Abschließend soll man zwecks Anregung der Salzsäureabsonderung im Magen Fleischextrakt einnehmen. Mundspülungen sind während der ersten Stunden noch mehrfach zu wiederholen. Infektiöses Material ist geschluckt worden: Kurze kräftige Mundspülung und Gurgeln mit 0,1 %iger frisch angesetzter Kaliumpermanganatlösung. Anschließend zwecks Anregung der Salzsäureabsonderung im Magen Fleischextrakt und salzsäurepepsinhaltiges Mittel einnehmen. Infektiöses Material ist in das Auge gelangt: Bindehautsack mit fließendem Leitungswasser gründlich ausspülen. In den Augenbindehautsack geratene Krankheitserreger können auf dem Wege des Tränenkanals in die Nase und weiterhin in den Rachen, Mund und Magen gelangen. An die Desinfektion des Auges sind deshalb die unter 1 (Mund) aufgeführten Maßnahmen anzuschließen. Infektiöses Material ist in die Nase gelangt: Wiederholtes energisches Ausschnauben in Zellstoff, unter Vermeidung von Einziehen durch die Nase (Luft durch den Mund einholen und bei geschlossenem Munde kräftig durch die Nase ausstoßen). Einstreichen von Betaisodona-Lösung in die Nase. Außerdem sind anschließend die unter 1. (Mund) angegebenen Maßnahmen vorzunehmen.

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Verletzungen der Haut durch infizierte Instrumente, Kratzwunden, Beschmutzung von Hautwunden mit infektiösem Material: Oberflächliche Kratzwunden sofort mit Betaisodona-Lösung überpinseln. Darauf die Umgebung der Wunde abspülen und nach Abtupfen mit Zellstoff die Wunde nochmals mit Betaisodona-Lösung überpinseln. Anschließend Schutzverband! Auf Stichverletzungen, die schlecht bluten, setzt man zweckmäßig den Saugschlauch eine Wasserstrahlpumpe und saugt aus. Ausbluten lassen! Einstichstelle wiederholt mit Betaisodona-Lösung betupfen. Anschließend Schutzverband! Stark blutende Schnittwunden und dergl. erst ausbluten lassen, dann Wund- umgebung (nicht Wunde selbst) mit Betaisodona-Lösung desinfizieren. Anschließend Schutzverband! Hinweise zur Benutzung des Skriptums Das vorliegende Skriptum enthält Anleitungen zur Durchführung von Kurs-experimenten, die dem Studenten den theoretischen Stoff der Vorlesung veranschaulichen sollen. Darüber hinaus soll der Student einen Einblick in die Methodik der Diagnostik von infektionsbedingten Krankheiten gewinnen. Jeder Kursteilnehmer sollte die entsprechenden Teile der Skripte vor Beginn der Kursstunde durchgearbeitet haben. Darüber hinaus sollte jeder Kursteilnehmer das allgemeine Thema, zu dem die durchzuführenden Experimente gehören, in einem Lehrbuch studiert haben. Entsprechende Literaturangaben finden sich im Kapitel „Literaturhinweise“. Die praktischen Übungen werden am Ende des jeweiligen Praktikums testiert.

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Literaturhinweise Blatz, R. (Hrsg.) Mitarbeit von Prof. Blaschke-Hellmessen, Dr. Noack u.a. Medizinische Mikrobiologie und Immunologie systematisch 1. Auflage, UNI-MED Verlag AG, Bremen 1999 Köhler, W., Eggers, H.J., Pulverer, G. (Hrsg.) Fleischer, Marre, Pfister Lehrbuch der Medizinischen Mikrobiologie 8. Auflage, Urban & Fischer Verlag, München-Jena 2001 Hahn, H., Kaufmann, St.H.E., Schulz, T.F., Suerbaum, S. Medizinische Mikrobiologie und Infektiologie 6. Auflage, Springer-Verlag, Heidelberg 2009 Kayser, F.H., Böttger, E.C., Zinkernagel, R.M., Haller, O., Eckert, J., Deplazes, P. Taschenlehrbuch Medizinische Mikrobiologie 11. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 2005 Hof, H., Müller, Dörries, R. Medizinische Mikrobiologie: Immunologie, Virologie, Bakteriologie, Mykologie, Parasitologie, Infektiologie, Hygiene 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 2009 Groß, U. Kurzlehrbuch Medizinische Mikrobiologie und Infektiologie 2. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 2009 Marsh P. D., Martin, M. Oral Microbiology, 5th Edition Churchill Livingstone

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Mikrobiologie im Internet Gramfärbung und-morphologie anschaulich http://www.meddean.luc.edu/lumen/DeptWebs/microbio/med/gram/gram-stn.htm http://www.spjc.edu/hec/vettech/vtde/ATE2639LGS/gramstain.htm Klinische Fälle/Übungen: http://www.hopkins-id.edu/education/id_caserounds/index_case.html http://medinfo.ufl.edu/year2/mmid/bms5300/cases/index.html http://edcenter.med.cornell.edu/Courseware/courseware.html Gute Linksammlung Mikrobiologie/Virologie: http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/linxtee.html Deutsche Seiten zu Infektionskrankheiten, Impfungen, Antibiotikatherapie: http://www.rki.de (Robert-Koch-Institut) http://www.p-e-g.de (Paul-Ehrlich-Gesellschaft),dort: Publikationen/Empfehlungen Bilder zum Thema Infektionskrankheiten/Erreger

Allgemein http://www.google.de http://www.cdc.gov http://www.mediscan.co.uk http://www.microbelibrary.org/visual/page1.htm

Parasiten

http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/Default.htm http://www.cdfound.to.it/html/atlas.htm Viren

http://www.virology.net/Big_Virology/BVHomePage.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Images/index.htm Pilze

http://www.doctorfungus.org http://www.mycology.adelaide.edu.au

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Kurzinformationen zu einigen in der Kursskripte erw ähnten Nährböden Nährbouillon : Fleischextrakt, Pepton, NaCl, pH 7,2 Wachstum weniger anspruchsvoller Bakterien Nähragar : Nährbouillon + 1,5% Agar, pH 7,2 Wachstum weniger anspruchsvoller Bakterien BHI-Bouillon : Brain-Heart-Infusion (Hirn-Herz-Aufguß), Pepton, Glukose, NaCl, Na2HPO4, pH 7,2 hochwertiges Allzwecknährmedium zur Züchtung anspruchsvoller Bakterien Blutagar: Nähragar + 5% Hammelerythrozyten Deutliche Erweiterung kultivierbarer Bakterien des Spektrums in vitro Columbia-Blutagar : Spezialpepton, Stärke, NaCl, 1,5% Agar, pH 7,2, 5 % Schafblut, hochwertiges Allzwecknährmedium zur Züchtung anspruchsvoller Bakterien Columbia-Blutagar für Anaerobier: Zusammensetzung wie oben, zusätzlich supplementiert mit Vitamin K und Hämin, ggf. mit Zusatz eines Aminoglykosid- antibiotikums (Gentamicin) Kochblut- od. Scho- koladenblutagar : 5 min. Erhitzen des bluthaltigen Nährboden- gemischs bei 100 °C (Dampftopf) Für Haemophilus und Neisseria spp., Faktor X (Hämin) und V (NAD) für Bakterien verfügbar Endo-Agar : Pepton, Laktose, K2HPO4, Na2SO3, Fuchsin 1,5% Agar, Wachstum von Vertretern der Entero- bacteriaceae und sog. Nonfermentern wie Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. u. a., Unterscheidung von Laktose positiven Bakterien (rot, u. U. mit Fuchsinglanz) und Laktose negativen Bakterien (hell, in der Farbe des Nährbodens), Grampositive Bakterien wachsen nicht oder nur sehr schwach.

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Leifson Agar : Pepton, Fleischextrakt, Laktose, Natriumdesoxycholat, (Desoxycholat Eisen III citrat, Natriumcitrat, Natriumthiosulfat, Zitrat Agar) Neutralrot, 1,5% Agar selektiv für Salmonellen und Shigellen, andere Enterobacteriaceae werden mehr (E. coli u. ä.) oder weniger (Proteus spp.) gehemmt, Erkennen von Laktose positiven Bakterien (rot), Laktose negativen Bakterien (hell, in der Farbe des Nährbodens), H2S-positiven Bakterien (Kolonien in der Mitte schwarz durch Eisensulfid) Galle Äsculin Agar : Pepton, Hefeextrakt, NaCl, Trockengalle, Äsculin, Ammoniumeisen III citrat, Kanamycinsulfat, 1,5% Agar selektiv für Enterokokken, Kolonien schwarz, durch Spaltung des Glykosids Äsculin in Äsculetin und Glukose , Äsculetin reagiert mit Fe3+ zu einem dunkelbraunen / schwarzen Komplex. Sabouraud Dextrose Agar : Pepton aus Sojamehl, Glukose, 1,5% Agar, Selektiv-Supplement mit Chloramphenicol zur Unterdrückung des Wachstums von Bakterien Wachstum pathogener Pilze (Sproßpilze, Schimmelpilze, Dermatophyten)

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Färbungen und Färbelösungen Vorarbeiten Für alle Färbungen Objektträger von unten mit Fettstift markieren und geschliffenes Feld von oben für Nummerierung (mit Bleistift) benutzen.1 Tropfen NaCl innerhalb der Markierung aufbringen, wenig!! Material einreiben, gleichmäßig verteilen, lufttrocknen lassen, hitzefixieren. Methylenblau Objektträger in Färbeküvette stellen, Farbe 2 min einwirken lassen, mit Leitungswasser abspülen, zwischen Filterpapier trocknen, dann mikroskopieren. Gram-Färbung Objektträger - 2 min in Carbolgentianaviolett stellen - mit Leitungswasser abspülen - 2 min in Lugolsche Lösung

- mit Leitungswasser abspülen - mit Alkohol entfärben, bis keine Farbwölkchen mehr abgehen - mit Leitungswasser abspülen - 1 min in Carbolfuchsin stellen - mit Leitungswasser abspülen

Zwischen Filterpapier trocknen, dann mikroskopieren. Kinyoun- oder Ziehl-Neelsen-Färbung

Präparate bereits fixiert! Objektträger - 5 min in Carbolfuchsin stellen

- mit Leitungswasser abspülen - mit Salzsäurealkohol bedecken, max. 30 s einwirken lassen - mit Leitungswasser abspülen - 1 min in Methylenblau stellen - 10 s mit Leitungswasser abspülen Zwischen Filterpapier trocknen, dann mikroskopieren und semiquantitativ auswerten. Färbung nach Pappenheim (= May-Grünwald / Giemsa-Färbung)

- dünnen Blutausstrich 5 min mit May-Grünwald-Lösung stellen - mit Aqua dest. abspülen, anschließend 20 min mit frisch hergestellter

verdünnter Giemsa-Lösung (50 ml Aqua dest + 50 Tropfen Giemsa-Stammlösung) färben - mit Aqua dest. abspülen, abkippen und zum Lufttrocknen senkrecht aufstellen - mit Ölimmersion auswerten

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1. Praktikum: Allgemeine Arbeitstechniken Fragen zur Vorbereitung und Auswertung des Praktiku ms - Was verstehen Sie unter sterilem Arbeiten? - Nennen Sie wichtige Bestandteile von Nährböden zur Züchtung von Bakterien. - Charakterisieren Sie Optimal-, Selektiv- und Indikatornährböden. Nennen Sie Beispiele für solche Nährböden, wobei finden sie Anwendung? - Geben Sie Beispiele für verschiedene Bakterienformen an. - Nennen Sie typische Abmessungen von Bakterienzellen. - Welche Arten der Mikroskopie und insbesondere der Lichtmikroskopie kennen Sie? - Bei welcher Keimzahl liegt der orientierende Grenzwert, ab dem der lichtoptische Nachweis möglich wird? - Nennen Sie wichtige Bakterienfärbungen! - Was ist das Prinzip der Ziehl-Neelsen-Färbung? - Wie unterscheidet sie sich von der Kinyoun-Färbung? - Wodurch wird das färberische Verhalten der Bakterien bestimmt? - Warum wird bei der Anlage von Primärkulturen das Untersuchungsmaterial in der Regel fraktioniert ausgestrichen? - Warum impft man die Untersuchungsmaterialien auf unterschiedlichen Nährböden aus? - Was versteht man unter einer Reinkultur? Wofür sind sie notwendig? - Was versteht man unter aeroben, anaeroben und fakultativ anaeroben Bakterien?

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Praktische Übungen 1. Lichtmikroskopische Darstellung von Bakterien (M ikromorphologie) Zielstellung Kennenlernen der Möglichkeit, Erreger durch Analyse der Morphologie des einzelnen Keims orientierend zu differenzieren. Erkennen der Bedeutung spezieller Bakterienfärbungen. Materialien - Mikroskop mit Voraussetzung für Ölimmersionsmikroskopie - Objektträger - Bunsenbrenner - Pinzette - Deckgläschen - Sterile Ösen - Uhr - Methylenblau-Lösung - Materialien für die Gramfärbung: Karbol-Gentianaviolettlösung, Jod-Kaliumjodid-Lösung (=Lugolsche-Lösung), Fuchsinlösung, 96%iges Ethanol

- Bakterienkulturen (S.aureus, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, E. coli)

- vergrünende Streptokokken als Bouillonkultur (Thioglykolatbouillon) 1.1 Herstellung von zwei Nativpräparaten von S.aure us und E.coli - auf Objektträger kleine Tropfen, sterile physiologische Kochsalzlösung (NaCl) geben (aus Flasche mit Tropfpipette) - sehr wenig Bakterienmaterial mit Öse von der Platte in den Tropfen einreiben (nehmen Sie zu viel Material ab, wird das Präparat zu dick und Sie sehen keine Einzelbakterien sondern nur eine homogen gefärbte Masse).

- Deckgläschen auflegen, Blasenbildung vermeiden - mit 40er Objektiv bei abgesenktem Kondensor mikroskopieren

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1.2 Ölimmersions-Mikroskopie - Immersionsobjektiv (90er oder 100er, Objektiv mit schwarzem Ring) in den Strahlengang bringen - Präparat auflegen, 1 Tropfen Immersionsöl pro Feld aufbringen - unter seitlicher Sicht Objektiv in das Öl eintauchen und ganz dicht an die Präparatoberfläche heranführen - mit Feintrieb Objektiv langsam heben bis optische Ebene scharf erscheint - nach Beendigung der Mikroskopie Immersionsobjektiv (Linse) und ggf. Kreuztisch mit Ethanol-getränktem weichem Zellstoff abwischen - Entsorgen Sie anschließend die gefärbten Präparate in die schwarzen Tonnen (für infektiöses Material) 1.2.1 Anfertigen von 4 Methylenblau-Präparaten - von Bakterienkulturen: Staphylococcus aureus Neisseria meningitidis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli

- 2 Objektträger mit Fettstift von unten in je 2 Felder teilen und markieren

in jedes Feld einen kleinen Tropfen steriles NaCl geben, geringe Menge Bakterienmasse mit Öse von der Platte einreiben - lufttrocknen lassen - hitzefixieren = luftgetrocknetes Präparat mit der beschichteten Seite nach oben mit der Pinzette 5 x durch die heiße Bunsenbrennerflamme ziehen - Methylenblaufärbung siehe Färbevorschrift S. 12 1.2.2 Anfertigen von 4 Gram-Präparaten - von Bakterienkulturen: S. aureus Neisseria meningitidis Corynebacterium diphtheriae E. coli - Vorgehen wie unter 1.2.1 - Gramfärbung s. Färbevorschrift S. 12 1.2.3 Anfertigen eines Gram-Präparates aus einer St reptokokken-Bouillon - 1 Tropfen Streptokokkenbouillon auf Objektträger geben - Lufttrocknen und Hitzefixieren - Gramfärbung s. Färbevorschrift S. 12

Probe 2 Probe 1 Probe 4 Probe 3

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Fertigen Sie mikroskopische Zeichnungen aller bisher gefärbten und ausgewerteten Präparate an ! _____________________________________________________________ Erreger Nativ- Methylen- Gram- blau- P r ä p a r a t _____________________________________________________________ S.aureus ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Neisseria - meningitidis ------------------------------------------------------------------------------------------------------- E. coli ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Coryne- - bacterium diphtheriae ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Strepto- - - kokken _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ Darstellung der Größenverhältnisse (May-Grünwald-Färbung)

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1.2.4 Darstellung der Größenverhältnisse Durch die gleichzeitige Anfärbung von Erythrozyten, Hefezellen (Candida albicans), E.coli und S.aureus in einem Präparat soll, ausgehend von der Kenntnis des Durchmessers eines Erythrozyten, eine Vorstellung von der Größe der Bakterien erreicht werden. Materialien - 5% Menschen-Erythrozytensuspension - Objektträger - Deckgläschen - sterile Ösen - Bakterienkultur: E.coli, S.aureus, Candida albicans - May-Grünwald-Giemsa Färbung (May-Grünwald-Lösung: Methylenblau, Methanol, Glycerin; Giemsa-Lösung: Azur, Azur-Eosin, Methanol, Glycerin) Durchführung

- Einen Tropfen Erythrozytensuspension auf den Objektträger geben. - In diesen Tropfen werden die Keime nacheinander vorsichtig eingerührt. Dazu wird jeweils mit einer sterilen Öse etwas (wenig! ) Material von einer Bakterien bzw. Pilzkolonie abgenommen und in die Erythrozytensuspension eingerieben. - Nachdem alle drei Mikroorganismen in dem Tropfen verrieben sind, wird die Suspension mit einem Deckgläschen auf dem Objektträger verteilt (durch Aufsetzen des Deckgläschens im Tropfen, der an der unteren Deckglaskante breitläuft, dann mit Schwung zum entgegengesetzten Objektträgerende bewegen, so daß eine „Bürste„ wie bei hämatologischen Ausstrichen entsteht). - anschließend lufttrocknen - nicht hitzefixieren - Färbung nach Pappenheim = May-Grünwald / Giemsa-Färbung s. Färbevorschrift S. 12 - Zwischen Filterpapier trocknen. - Mit Ölimmersionsmikroskopie auswerten. Der gefärbte Blutausstrich läßt eine Beurteilung der Größenverhältnisse zu. Schätzen Sie die Größe der Mikroorganismen im Vergleich zu den Erythrozyten!

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2. Kulturelle Anzucht von Bakterien 2.1 Charakterisierung des Wachstums bzw. der Koloni emorphologie (Makromorphologie) verschiedener Bakterienstä mme auf unterschiedlichen Nährböden

Zielstellung Erkenntnis, dass unterschiedliche Bakterien verschiedene Nährbodenansprüche stellen und unterschiedliche Kolonieformen ausprägen, was zur Differenzierung bzw. Identifizierung von Bakterien von großem Nutzen ist.

Materialien (für jeweils 2 Studenten) Reinkulturen folgender Spezies: 1 - Staphylococcus aureus 2 – Neisseria meningitidis 3 - Escherichia coli 4 – Corynebacterium diphtheriae auf folgenden Nährböden: - Blutagar - Kochblutagar (=Schokoladenagar) - Endoagar - Nähragar Durchführung Beschreibung des Wachstums und der Koloniemorphologie (Größe [Höhe und Breite], Farbe, Oberflächenbeschaffenheit, Randstruktur, Farbe). Lupe benutzen! Auswertung Stamm-Nr. Blut- Kochblut- Endo- Nähragar ................................................................................................................................. 1 ................................................................................................................................. 2 ................................................................................................................................. 3 ................................................................................................................................. 4 .................................................................................................................................

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2.2 Fraktioniertes Beimpfen eines Nährbodens mit ei ner Bakterien-Mischkultur zur Gewinnung von Einze lkolonien Zielstellung Es soll erlernt werden, wie Untersuchungsmaterial auf Nährböden ausgestrichen wird. Durch die Fraktionierung – das Verwenden jeweils einer neuen Impföse – wird ein Verdünnungseffekt, etwa jeweils um den Faktor 10 erreicht. Damit soll erreicht werden, dass die in dem Material vorhandenen Bakterien möglichst einzeln bzw. getrennt voneinander auf dem Nährboden liegen und Einzelkolonien bilden. Das ist eine Voraussetzung, um Reinkulturen zu gewinnen. Materialien - Röhrchen mit einer Bakteriensuspension - Nähragarplatte - 3 sterile Plastikösen Durchführung - Nähragarplatte mit Platznr. auf der Unterseite beschriften. - Unter sterilen Bedingungen eine Öse voll Suspension aus dem Röhrchen

entnehmen. - Rechtshänder nehmen die Nähragarplatte in die linke Hand und streichen rechts mit der Öse die Bakteriensuspension wie dargestellt auf einem Plattensektor aus. Der Ausstrich erfolgt mit leichter Hand (Bewegung aus dem Handgelenk!) auf der Oberfläche des Mediums! Ein Eindringen in den Agar ist zu vermeiden:

Öse anschließend in Behälter mit Desinfektionsmittel geben. - Mit zweiter Öse einmal durch den Anstrich gehen und wiederum einen Sektor ausstreichen:

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Öse in Desinfektionsmittel abwerfen. - Mit dritter Öse einmal durch den zweiten Ausstrich gehen und wiederum ausstreichen.

Öse in Desinfektionsmittel abwerfen. - 24stündige Bebrütung bei 37°C

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2. Praktikum: Identifikation von Bakterienspezies Fragen zur Vorbereitung und Auswertung des Praktiku ms - Welche Eigenschaft von Mykobakterien muss bei ihrer Färbung berücksichtigt und welche kann zur relativen Anreicherung im Untersuchungsmaterial genutzt werden? - Welche Körperregionen sind normalerweise steril? - Welche Erklärungsmöglichkeiten haben Sie für den Fall, dass Sie im mikrosko- pischen Präparat Keime erkennen, aber die Kultivierungsversuche negativ verlaufen (mindestens 3 Möglichkeiten)? - Geben Sie einen Überblick zu den Methoden der Differenzierung von Bakterien. - Wie kann man Staphylokokken differenzieren? - Wie kann man Streptokokken differenzieren? - Wie können Sie Pseudomonas aeruginosa erkennen? - Was versteht man unter KbE (engl.c.f.u.)? - Was versteht man unter der „Bunten Reihe“? - Was sind obligat aerobe, obligat anaerobe und fakultativ anaerobe Bakterien? Nennen Sie Beispiele! - Was versteht man unter Serotypisierung? - Was versteht man unter dem Kauffmann-White-Schema, was unter der Lancefield-Typisierung? - Was versteht man unter O-, K- und H-Antigenen bei Enterobakterien? - Was ist Lysotypie?

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Vorbemerkungen: Die Speziesidentifikation von Bakterien läuft in drei Stufen ab: 1. Mikroskopie 2. Kulturelle Anzucht 3. Nachweis spezifischer Eigenschaften – Identifizierung + Antibiogramm 1. Mikroskopie → Beurteilung der Bakterienmorphologie (Kokken, Stäbchen) → Lagerung (kettenförmig, Diplo-, Paket-, Parallellagerung) → Gramverhalten → Spezialfärbungen z.B. • Ziehl-Neelsen-Färbung: Säure- und Alkoholfestigkeit, • Fluoreszenzfärbung: Speziesidentifikation auf immunologischer Grundlage • Kapselfärbungen Mit Ausnahme der mit monoklonalen Antikörpern durchgeführten spezies- spezifischen Direktfluoreszenz führt die Mikroskopie nicht zu einer Speziesidentifikation ! 2. Kulturelle Anzucht auf festen Nährmedien, Zellkulturen (oder in vivo) → Makromorphologie der Kolonie: Konsistenz, Pigmentbildung, Oberflächen- und Randbeschaffenheit → Geruch → Nährstoffansprüche des kultivierten Keimes Es gibt kein Universalmedium auf dem sich alle Mikroorganismen vermehren! Einige Bakterien vermehren sich nicht auf künstlichen Nährmedien sondern nur auf Zellkulturen (z.B. Chlamydien) oder in vivo (z.B. Treponema pallidum) → Sonstige Vermehrungsbedingungen • Anaerobiose • CO2-Anreicherung • Temperaturoptimum In Verbindung von 1. und 2. lässt sich häufig schon eine Diagnostik auf Genus- bzw. Familienebene durchführen. 3. Nachweis spezifischer Eigenschaften 3.1 Nachweis von Stoffwechselleistungen oder exogen en Stoffwechsel- produkten → Substratabbau (Anzeige durch Farbindikatoren auf Grundlage von pH-Verschiebungen oder Gasbildung, Gelatineverflüssigung) Auf dieser Ebene ist in der Regel immer eine Speziesdiagnostik auf der Basis unterschiedlicher, typischer Leistungsmuster möglich.

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Praktische Übungen – Mischkultur von Kurs 1 Wenn Sie gut gearbeitet haben, sehen Sie auf Ihrer Platte große und kleine Kolonien. - Fertigen Sie von beiden Typen eine GRAM-Färbung an. - Welche Aussagen lassen sich bisher machen? - Warum Mischkultur fraktionieren? 1. Keimzuordnung auf Familienebene Bedeutung der Spezialfärbung (Differenzierung auf Genusebene) Sie erhalten 2 vorgefertigte, fixierte Sputumpräparate, die vom gleichen Patienten- material stammen. Färben Sie - Präparat 1 nach GRAM und - Präparat 2 nach KINYOUN ! siehe Färbevorschrift S. 12 Beschreiben Sie von beiden Präparaten die Morphologie und die Anfärbung der sichtbar gemachten Bakterien! Welche Bakterien sehen Sie in beiden Fällen? GRAM-Färbung KINYOUN-Färbung Bakterienformen und Anfärbung

Um welche Bakterien handelt es sich?

Beschreiben Sie die Schritte der Kinyoun-Färbung ............................................................................................................................ ............................................................................................................................ ............................................................................................................................ Semiquantitative Auswertung von TBC / Lepra-Präparaten 0 Stäbchen / Präparat = ∅ 1 – 3 Stäbchen / 300 GF = ± 1 – 9 Stäbchen / 100 GF = + 1 – 9 Stäbchen / 10 GF = ++ 1 – 9 Stäbchen / 1 GF = +++ > 9 Stäbchen / 1 GF = ++++ GF = Gesichtsfeld

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2. Differenzierung von Pneumokokken (Streptococcus pneumoniae) Material: - Bakterienkulturen: Streptococcus pneumoniae und der Viridans-Streptokokken auf Blutagar mit Optochinblättchen - Pneumokit 2.1. Beschreiben Sie die Koloniemorphologie der beiden Bakterienkulturen ............................................................................................................................ ............................................................................................................................ ............................................................................................................................ 2.2 Pneumokit - Überprüfen Sie mit dem “Pneumokit“, ob es sich um Pneumokokken handelt. Bei diesem Test handelt es sich um einen Koagglutinationstest: Latexpartikel sind mit Antikörpern beschichtet, die gegen das Gruppenantigen (Oberflächenantigen) der Pneumokokken gerichtet sind. Dadurch kommt es im positiven Fall zu einer Vernetzung von Latexpartikeln mit Pneumokokken, was makroskopisch als Flockung erkannt wird. Verwenden Sie als Negativ- kontrolle Viridans-Streptokokken. Geben Sie auf die schwarzen Kärtchen jeweils 1 Tropfen Reagenz und reiben Sie jeweils etwas Material von Streptococcus pneumoniae und Viridans- Streptokokken ein. Leicht schwenken, das Auftreten einer Flockung prüfen. 2.3. Optochintest - Das Wachstum von Pneumokokken wird im Gegensatz zu vergrünenden Streptokokken durch Optochin (ein therapeutisch nicht genutztes Chininderivat) gehemmt (zur Demonstration ausliegend). Verschiedene Möglichkeiten der Diagnostik, um Spezi es zu bestimmen: 3. Spezieseingrenzung anhand des Nachweises ausgewä hlter Eigenschaften Arbeitsmaterial: - KOH - 30%ige H2O2-Lsg. - Humanplasma - Cytochromoxidase-Streifen - 4 Bakterienkulturen (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Escherichia coli auf Blutagar und Endo-Agar) - Kontrollkulturen zum Plamakoagulasenachweis

25

3.1 KOH-Prüfung Bringen sie zwei Tropfen KOH auf je einen Objektträger und rühren sie von den Kulturen mit einer sterilen Öse Kulturmaterial in je einen Tropfen KOH ein. Bei der Probe mit Fadenbildung sollte es sich um gramnegative, bei der ohne Fadenbildung um grampositive Bakterien handeln. Fertigen Sie von den Kulturen ein Gram- Präparat an und überprüfen Sie damit die Aussage! 3.2 Prüfung auf Anwesenheit der Katalase Bringen Sie zwei Tropfen H2O2 auf je einen Objektträger und reiben Sie mit einer sterilen Öse wenig Koloniematerial von den Kulturen in je einen Tropfen ein. Vergleichen Sie die Reaktionen. Vergleichen Sie mit dem Ergebnis der Gram- Färbung. 3.3 Nachweis der zellwandgebundenen Plasmakoagulase (Clumpingfaktor) Geben Sie einen Tropfen humanes Plasma auf je einen Objektträger und reiben Sie etwas Kulturmaterial glatt in diesen Tropfen ein. Bei positivem Reaktionsausfall kommt es zu einer Verklumpung. Zur Kontrolle der Reaktion steht pro Tisch ein S.aureus- und ein koagulase-negativer Staphylokokken-Stamm zur Verfügung (Platte mit Aufschrift „Kontrolle für Koagulase“) 3.4 Prüfung auf Zytochromoxidase Reiben Sie von den Kulturen etwas Koloniematerial auf den Zytochromoxidase- Streifen (getränkt mit 1%iger Lösung von Tetramethyl-p-Phenylendiaminhydro- chlorid. Bei welchem Koloniematerial kommt es zur Blaufärbung? Welcher Spezies ist dieser Keim zuzuordnen? KOH Katalase Plasma

Koagulase Zytochrom Oxidase

Gram- präparat

Staphylococcus aureus

Streptococcus mutans

Pseudomonas aeruginosa

Escherichia coli

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4. Speziesidentifikation anhand charakteristischer biochemischer Reaktionsmuster Arbeitsmaterial: - kommerziell vorgefertigter Teststreifen mit 10 Reaktionskammern Api 10 S

- Kultur von Enterobacteriaceae - 1 Röhrchen mit 5 ml sterilem Aqua dest. - Wattetupfer - Pasteurpipetten

4.1. Biochemische Charakterisierung Eine weitere Differenzierung von auf Endoagarplatten wachsenden gram- negativen Stäbchen kann durch die Bestimmung biochemischer Leistungen der Bakterien erfolgen. Prüfen Sie die Cytochromoxidase! Zur Kontrolle reiben Sie etwas Material von einem Pseudomonasstamm auf den Teststreifen. Gram-negative Stäbchen, die auf Endoagarplatten wachsen und Cytochromoxidase-negativ sind, werden mit Hilfe einer bunten Reihe differenziert! API 10 S ist ein standardisiertes System zur Identifizierung von Enterobacte- riaceae und anderer gramnegativer Stäbchen mit Hilfe von 12 biochemischen Reaktionen Prinzip Der API 10 S Streifen besteht aus 10 Mikroröhrchen, in denen sich die ver- schiedenen Substrate in dehydratisierter Form befinden. Die Röhrchen werden mit der zu untersuchenden Bakteriensuspension beimpft, welche die Substrate löst. Die biochemischen Reaktionen können anhand von Farbumschlägen abgelesen werden, die entweder spontan während der Inkubation oder nach Zugabe der Reagenzien entstehen. Die Ablesung dieser Reaktionen erfolgt mit Hilfe der Ablesetabelle, die Identifikation erhält man entweder anhand der Prozenttabelle oder mit Hilfe des Analytischen-Profil-Indexes. Vorbereitung des Inokulums Bitte verwenden Sie für diesen Versuch die Reinkultur

- Mit einem sterilen Tupfer eine gut isolierte Kolonie vom Agar abnehmen und in 5 ml steriles Aqua dest. einrühren.

- Die Bakterien im Suspensionsmedium sorgfältig homogenisieren. (Im Vergleich soll die Trübung dem Mc-Farland-Standard von 0,5 entsprechen, d.h. eine gerade eben sichtbare Trübung)

- In die Vertiefungen der Inkubationswanne ca. 2 ml Tropfen Aqua dest mit Tropfpipette geben, Streifen in die Wanne legen

27

Beimpfung des Streifens - Die Bakteriensuspension mit einer Pipette in die Mikroröhrchen pipettieren. - Bei CIT das Becherchen und Röhrchen füllen. - Für die anderen Reaktionen nur die Röhrchen füllen. - Die unterstrichenen Reaktionen LDC, ODC, H2S und URE hoch mit Paraffinöl überschichten. - Die Inkubationswanne schließen und bei 35-37°C, 18-24 Stunden inkubieren.

5. Demonstration: Immunologische Serotypisierung Zielstellung: Erregerdifferenzierung durch Serotypisierung Es liegt Ihnen die Reinkultur eines Salmonella Stammes vor, der serotypisiert werden soll. Dazu wird eine Objektträgeragglutination durchgeführt. ________________________________________________________ Antiserum Reaktionsausfall (Agglutination = positiv) ________________________________________________________ Salmonella polyvalent (TPE = Typhus, Paratyphus, Enteritis) Gruppenserum B Gruppenserum D Faktorenserum O : 1 „ O : 4 „ O : 9 „ O : 12 „ vi „ H : d „ H : gm _______________________________________________________

API-Becherchen API-Röhrchen

ONPG GLU ARA ....

Schematische Abbildung eines Api -Streifens mit Becherchen und Röhrchen.

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Anlage 2 Gruppe B Spezies Type

Körper -Antigene (0) Somatic (0) Antigen

Geißel -Antigene Flagellar (H) Antigen

Phase 1 Phase 2 . S.Makoma S.Kisangani S.Hessarek S.Fulica S.Arechavaleta S.Bispebjerg S.Abortus-Equi S.Tinda S.Nakuru S.Paratyphi B S.Java1 S.Limete S.Canada S.Uppsala . S.Sofia S.Abony S.Abortus-Bovis S.Wagenia S.Schleissheim S.Wien S.Legon S.Abortus-Ovis S.Altendorf S.Jericho S.Bury S.Stanley S.Eppendorf S.Schwarzengrund . S.Kluetjenfelde S.Sarajane S.Duisburg S.Salinatis S.Mons S.Ayinde S.Saint-Paul S.Reading . Salmonella S.Kaapstad S.Chester S.San-Diego . S.Makumira . Salmonella S.Derby S.Agona S.Essen . S.Caledon S.Hato S.California S.Kingston S.Budapest . S.Bechuana S.Travis S.Typhi-Murium S.Lagos S.Agama S.Tsevie S.Gloucester S.Massenya S.Neumuenster . Salmonella S.Flubljana S.Texas

4, (5), 12 1, 4, (5), 12 4, 12, 27 4, (5), 12 4, (5), 12 1, 4, (5), 12 4, 12 1, 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 1, 4, (5), 12 1, 4, (5), 12 1, 4, 12, 27 4, 12 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 1, 4, (5), 12 1, 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 4, 12 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 4, 12, 27 1, 4, (5), 12, 27 1, 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 4, 12 4, (5), 12, 27 1, 4, 12, 27 4, 12 1, 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 1, 4, (5), 12 1, 4, (5), 12 4, 12 4, 12 1, 4, (5), 12 4, (5), 12 1, 4, 12, 27 4, 12 1, 4, (5), 12 1, 4, 12 4, 12 4, 12 4, (5), 12 4, 12, 1, 4, (5), 12, 27 1, 4, 12 4, 12, 27 4, (5), 12 1, 4, (5), 12 1, 4, 12 4, 12 4, 12 1, 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 1, 4, 12, 27 4, 12, 27 4, (5), 12

A a a a a a - a a b b b b b b b b b b b c c c c c d d d d d d d, e, h d d e, h e, h e, h e, h e, h e, h e, n, x (f), g f, g f, g, s g, m g, m, t g, m, s g, m, t g, s, t g, t g, t g, z51 i i i i i k k k k k

- 1,2 1,5 1,5 (1,7) e, n, x e, n, x e, n, z15 z6 1,2 (1,2) 1,5 1,6 1,7 (e, n, x) e, n, x e, n, x e, n, z15 - l, w 1,5 1,6 1,7 e, n, z15 z6 1,2 1,5 1,7 e, n, x e, n, x e, n, z15 d, e, n, z15 l, w z6 1,2 1,5 1,6 1,7 e, n, x e, n, z15 1,7 - (1,2) - - (e, n, x) - - (1,2) - - 1,7 1,2 1,5 1,6 e, n, z15 l, w 1,5 1,6 1,6 e, n, x e, n, z15

1d-Tartrat positiv gegenüber S.paratyphi B.

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Anlage 2 Gruppe D Spezies Type

Körper -Antigene (0) Somatic (0) Antigen

Geißel -Antigene Flagellar (H) Antigen

Phase 1 Phase 2 S.Sendai S.Miami . Salmonella S.Os S.Saarbruecken S.Loma-Linda S.Durban S.Onarimon S.Frintrop . S.Mjimwema . S.Blankenese . S.Suederelbe S.Goeteborg S.Ipeko S.Alabama S.Ridge S.Typhi S.Ndolo S.Tarshyne . S.Rhodesiense S.Zega S.Jaffna S.Bournemouth S.Eastbourne S.Israel . Salmonella . S.Lindrick S.Berta S.Enteritidis S.Blegdam . S.Muizenberg . S.Kuilsrivier . S.Manica . S.Hamburg S.Dublin S.Naestved S.Rostock S.Moscow . S.Neasden S.New-Mexico S.Seremban S.Claibornei S.Goverdhan S.Mendoza S.Panama S.Kapemba . Salmonella S.Goettingen . Salmonella S.Victoria . S.Dar-Es-Salaam S.Miyazaki S.Napoli S.Javiana S.Pensacola . Salmonella S.Jamaica S.Lomé S.Lawndale . S.Stellenbosch . S.Angola . S.Hueningen S.Wangata S.Portland . S.Canastel . Salmonella S.Penarth S.Elomrane . S.Wynberg

1, 9, 12 1, 9, 12 9, 12 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 9, 12 9, 12 9, 12 9, 12 9, 12, (Vi) 1, 9, 12 9, 12 1, 9, 12 9, 12 1, 9, 12 9, 12 1, 9, 12 9, 12 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 9, 12 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12, (Vi) 1, 9, 12 1, 9, 12 9, 12 9, 12 9, 12 9, 12 1, 9, 12 9, 12 9, 12 1, 9, 12 9, 12 9, 12 9, 12 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 9, 12 9, 12 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 9, 12 1, 9, 12 9, 12 9, 12 1, 9, 12 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12

a a a a a a a b b b b b c c c c d d d d d d e, h e, h e, h e, n, x e, n, x f, g, (m), t g, m g, m, q g, m, s, t g, m, s, t g, m, s, t g, m, t g, p g, p, s g, p, u g, q g, s, t g, z51 i k k l, v l, v l, v l, v l, v l, v l, w l, w l, z13 l, z13 l, z26 m, t m, t r r z z z z z4, z23 z10 z29 z29 z35 z38 z39

1,5 1,5 1,5 1,6 1,7 e, n, x e, n, z15 1,2 1,5 e, n, x z6 z39 1,5 1,6 e, n, z15 z6 - 1,5 1,6 e, n, x z6 z35 1,2 1,5 e, n, z15 1,6 1,(5),7 - (1,7) - 1,5 e, n, x z42 - - - - - e, n, x 1,5 1,5 1,5 1,6 1,2 1,5 1,7 e, n, x e, n, z15 z39 1,5 e, n, x 1,7 e, n, x 1,5 - e, n, x 1,5 z6 1,5 1,7 z6

z39

(1,7) 1,5 1,5 e, n, x z6 - 1,7

30

3. Praktikum: Resistenzbestimmung Fragen zur Vorbereitung und Auswertung des Praktiku ms - Welche Methoden zur Bestimmung der Empfindlichkeit von Bakterien kennen Sie? - Definieren Sie die Begriffe MHK (minimale Hemmkonzentration), MBK (Minimale bakterizide Konzentration), Breakpoint - Welche Fehlermöglichkeiten können bei der Agardiffusion auftreten? - Bei welchen Bakterien ist eine Resistenzbestimmung mittels MHK nicht möglich? - Nennen Sie mögliche Angriffspunkte von Antibiotika. - Was verstehen Sie unter Synergismus und Antagonismus in Bezug auf die Antibiotikatherapie? - Wie entstehen bakterielle Resistenzen? - Was sind Beta-Laktamasen? Wo sind diese bei Bakterien zu finden? - Welche Bedeutung haben Penicillinbindeproteine? Welche kennen Sie? - Worin liegt die Bedeutung von MRSA? - Was verstehen Sie unter einem postantibiotischen Effekt? - Welche Antibiotika-Gruppen kennen Sie und welche Keimspektren werden durch diese erfasst? - Was verstehen Sie unter kalkulierter Antibiotikatherapie? - Welche Strategien können zur Begrenzung der Antibiotikaresistenzentwicklung beitragen?

31

Vorbemerkungen Antibiotika/ von Bakterien oder Pilzen gebildete Stoffe, die das Antibakterielle Wachstum anderer Mikroorganismen hemmen, Chemotherapeutika: bzw. diese abtöten bzw. synthetisch gewonnene Substanzen mit antibakterieller Wirkung Einteilung: - chemischer Struktur ( z.B. ß-Laktame) - Wirkmechanismus (z.B. Angriff an Zellwand)

- Antibakterielles Spektrum (Schmal-, Breitband- antibiotika)

Geschichte: 1908 Synthese des 1. Sulfonamides 1932 G. Domagk entdeckt dessen antibakterielle

Wirkung (Nobelpreis 1939) 1928 Fleming entdeckt die antibakterielle

Wirkung eines Schimmelpilzes 1939 Reindarstellung des Penicillins MHK (Minimale Hemmkonzentration): niedrigste Konzentration eines Antibiotikums, die die Vermehrung eines Bakteriums verhindert. MBK (Minimale bakterizide Konzentration): niedrigste Konzentration eines Antibiotikums, bei der 99,9% einer definierten Einsaat eines Erregers abgetötet werden. Methoden zur Resistenzbestimmung: • Agardiffusion, • Agardilution, • Bouillon-Makro- und Mikrodilution Formen der bakteriellen Resistenz: • natürliche Resistenz • sekundäre Resistenz • Mutationsresistenz • plasmidvermittelte Resistenz Faktoren, die die Antibiotikawirkung beeinflussen: • Pharmakokinetik (Galenik, Applikationsart, Resorptionsrate- und Geschwindigkeit,

Verteilungsvolumen, Gewebegängigkeit, Serumeiweißbindung, Metabolisierung, Elimination) Serumspitzenspiegel, Halbwertszeit, Penetration Blut-Hirn- und Blut-Liquor-Schranke, Penetration i. Knochengewebe u.a., Ausscheidung renal, biliär

• Nebenwirkungsprofil (toxisch, allergisch-immunologisch, biologisch) • evtl. Comedikation

32

Überlegungen vor dem Einsatz von Antibiotika: • Art und Ort der Infektion • Resistenzsituation • Nebenwirkungsprofil • Alter • Pharmakokinetik (Kann das Antibiotikum in ausreichender Konzentration an

den Infektionsort gelangen?) • Kosten der Therapie Kalkulierte Chemotherapie: In Kenntnis der Beschwerden des Patienten wird auf die am wahrscheinlichsten Infektionserreger geschlossen. Unter Berücksichtigung der immunologischen Abwehrlage des Patienten, möglicher Nebenwirkungen der Antibiotika und möglichst unter Berücksichtigung der regionalen Resistenzsituation wird ein geeignetes Antibiotikum gegen den oder die vermuteten Erreger ausgewählt. Gezielte Chemotherapie: Der Erreger und sein Antibiogramm sind bekannt. Praktische Übungen 1. Auswertung der Biochemischen Leistungsprüfung Werten Sie die biochemische Leistungsprüfung, die Sie in der letzten Stunde angelegt haben, aus. Ablesung des Streifens • Nach 18-24stündiger Inkubation bei 35-37°C den Streifen mit Hilfe der Ablesetabelle ablesen. • Alle Spontanreaktionen auf dem Ergebnisblatt notieren. • Die Reagenzien zugeben: TDA-Test: 1 Tropfen TDA-Reagenz (FeCl3-Lösung) zugeben. Eine dunkelbraune Farbe zeigt eine positive Reaktion an. Auf dem Ergebnisblatt notieren. IND-Test: 1 Tropfen JAMES Reagenz (p-Dimethylamino-2- Methoxybenzaldehyd) zugeben. Ein unmittelbar entstehender Farbumschlag nach rosa zeigt eine positive Reaktion an oder 1 Tropfen IND Reagenz zugeben. Bei positiver Reaktion bildet sich innerhalb von 2 Minuten nach Zugabe des Reagenzes ein roter Ring. Negative Reaktion: der Ring bleibt gelb . Das Resultat auf dem Ergebnisblatt notieren. - NO2-Test: Je einen Tropfen NIT 1 (Lösung von Sulfanilsäure/Essigsäure) und NIT 2 (Lösung von N,N Dimethyl-1-Naphthylamin in Essigsäure) Reagenz ins

GLU-Röhrchen geben. 2-3 Minuten warten. Eine rote Färbung ist als positiv zu bewerten. Auf dem Ergebnisblatt notieren.

33

Identifizierung • mit der Prozenttabelle (S. 36): die auf dem Ergebnisblatt notierten Resultate werden mit dieser Tabelle verglichen. • mit dem ANALYTISCHEN-PROFIL-INDEX: hierbei werden alle Reaktionen in ein numerisches Profil kodiert. Die biochemischen Reaktionen auf dem Ergebnisblatt sind in 3-er Gruppen eingeteilt. Jede positive Reaktion erhält den Wert 1, 2 oder 4 je nach Position der Tests innerhalb der Gruppe (1., 2. oder 3. Test). Die Zahlenwerte jeder Gruppe werden addiert (negative Reaktionen = 0), somit erhält man 4 Zahlen, welche das numerische Profil darstellen. (Die Oxidasereaktion stellt den 11. Test, die NO2 Reaktion den 12. Test dar). • Der Analytische-Profil-Index liegt am Tisch aus.

34

ABLESETABELLE TESTS SUBSTRATE REAKTIONEN/ENZYME ERGEBNISSE NEGATIV POSITIV

ONPG

Ortho-Nitro- Phenyl-ß-D-Galactopyra-

nosid

beta-Galactosidase

farblos

gelb (1)

GLU Glukose Fermentation / Oxidation (3)

blau / blau-grün

gelb gelb / grau

ARA Arabinose Fermentation / Oxidation (3)

blau / blau-grün

Gelb

LDC Lysin Lysindecarboxylase gelb Orange ODC Ornithin Ornithindecarboxylase gelb rot / orange CIT Natriumcitrat Citratverwertung blassgrün /

gelb blaugrün / blau

(2) H2S Natriumthio-sulfat H2S-Produkt farblos /

gräulich schwarzer

Niederschlag URE Harnstoff Urease gelb rot / orange

TDA / sofort TDA Tryptophan Tryptophandesaminase gelb Dunkelbraun

JAMES / sofort oder IND 2 Min.

IND

Tryptophan Indolproduktion

JAMES: farblos

hellgrün / gelb IND: gelb

JAMES: rose

IND: roter Ring

OX / 1-2 Min. OX auf Filterpapier Cytochromoxidase farblos violett (4)

NIT 1 + NIT 2 / 2-3 Min. NO2 (GLU-Röhrchen) NO2 Produktion gelb Rot

(1) Eine leichte Gelbfärbung ist ebenfalls positiv. (2) Ablesung im Becherchen (aerober Bereich) (3) Die Fermentation beginnt im unteren Teil des Röhrchens, die Oxidation im oberen Teil. (4) Durchführung s. Seite 37 API 10 S Auswertungsblatt:

35

Identifikationstabelle für gramnegative Stäbchen (Prozentangaben der positiven Reaktionsausfälle zum Nachweis einzelner Stoffwechselleistungen)

36

2. Resistenz-Testungen 2.1 Agardiffusion Zielstellung Selbständige Durchführung einer gebräuchlichen Methode zur Antibiotika- resistenzbestimmung Materialien - 1 Müller-Hinton-Agar-Platte - Bakterienkultur von S.aureus (Stamm: ATCC 29213) oder E.coli (Stamm: ATCC 25922) - physiologische NaCl-Lösung a 15 ml - 1 sterilerTupfer - Antibiotikatestblättchen im Stempel Durchführung - E. coli oder Staph. aureus in 15 ml physiol. Kochsalzlösung homogen einreiben ( im Vergleich soll die Trübung der des McFarland Standards von 0,5 entsprechen) - mit dem gleichen Tupfer Bakteriensuspension gleichmäßig dicht (wie ausgemalt) auf die Testplatte ausstreichen - Antibiotikablättchen auflegen und leicht andrücken - 20 Stunden bei 37°C aerob bebrüten, Beurteilung am nächsten Kurstag 2.2 Bestimmung der MHK (Minimale Hemmkonzentration) , Makromethode, Bouillondilution Zielstellung Durchführung einer MHK-Bestimmung Materialien - Bakteriensuspension (wie 2.1) - Antibiotika-Stammlösung (Levofloxacin: 160 mg/l) - 8 sterile Reagenzgläser mit Müller-Hinton-Bouillon - physiolog. Kochsalzlösung - Eppendorfpipetten mit sterilen Pipettenspitzen Durchführung (siehe Abb. S. 37, je zwei Studenten arbeiten zusammen) 1. - Herstellung einer Verdünnungsreihe (geometrisch); dazu stehen 8 Reagenzgläser (RG) zur Verfügung. Im 1. RG sind bereits 1,8 ml, in den 7 übrigen RG`s jeweils 1 ml Müller-Hinton-Bouillon enthalten. 2. - In das 1. Reagenzglas werden von Ihnen 0,2 ml Antibiotika-Stammlösung (Levofloxacin 160 mg/l) einpipettiert und durch Schütteln gut gemischt. 3. - Aus dem 1. RG mittels Pipette 1 ml entnehmen und in das 2. RG geben, gut mit dem Inhalt vermischen, 1ml in das 3. RG geben usw. Aus dem 7. RG 1 ml entnehmen und verwerfen. Das 8. RG enthält kein Antibiotikum und dient als Wachstumskontrolle

37

4. - Anfertigen einer Bakteriensuspension (siehe Aufgabe 2.1) - Zugabe von jeweils 1 ml Bakteriensuspension in die 8 Reagenzgläser (Verdünnungsfaktor 2!) - 18 -24 Stunden bei 37°C bebrüten, Beurteilung am nächsten Kurstag (Trübung = Wachstum) - Berechnen Sie die Antibiotikakonzentrationen in den einzelnen RG´s und tragen Sie diese unter 4. und 6. in die Abbildung ein. Die Auswertung erfolgt im kommenden Praktikum. 2.3 Bouillondilution-Mikromethode Sie erhalten Platten zur MHK-Bestimmung, die in der Patientenversorgung des Institutes zum Einsatz kommen. Die MHK-Bestimmung wird in Mikrotitrationsplatten mit einem Volumen von 100 µl pro Vertiefung durchgeführt. Bestimmen Sie die MHK-Werte und tragen Sie diese in das entsprechende Formular ein.

1 Bouillon (= Vorlage) 2. Antibiotika- Stammlösung (Levofloxacin) 160 mg/l 3. Überpipettieren 4. Antibiotika- verdünnung 5. Zugabe der Bakterien- Suspension 6. Endkonzentration des Antibiotikums

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Röhrchen

1,8 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 ml

+ 0,2 - - - - - - - ml

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 - ml

...... ........ ........ ........ ........ ........ ......... µµµµg/ml

+ 1,0 + 1,0 + 1,0 + 1,0 + 1,0 + 1,0 + 1,0 + 1,0 ml

...... ........ ........ ........ ........ ........ ......... - µµµµg/ml

Desin- fektion

38

Lab. Nummer: _____________ Patient: ______________ Datum: ______________ - sensibel Erreger: _____________ - intermediär - resistent Platte A in mg/l 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 AMS PIT CXM CTX IMP MER GEN AMK DOX SXT CIP MOX A 1

0,25

0,5

0,25

0,06

0,125

0,125

0,125

0,5

0,125

0,125

0,03

0,03

B 2

0,5

1

0,5

0,125

0,25

0,25

0,25

1

0,25

0,25

0,06

0,06

C 3

1

2

1

0,25

0,5

0,5

0,5

2

0,5

0,5

0,125

0,125

D 4

2

4

2

0,5

1

1

1

4

1

1

0,25

0,25

E 5

4

8

4

1

2

2

2

8

2

2

0,5

0,5

F 6

8

16

8

2

4

4

4

16

4

4

1

1

G 7

16

32

16

4

8

8

8

32

8

8

2

2

H 8

32

64

32

8

16

16

500

64

GC

16

4

4

9

Platte B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PEN OXA DAPTO VAN TPL RAM CLI FOS LIZ ROX Ceftarolin LEV A 1

0,03

0,125

0,03

0,125

0,25

0,03

0,03

1

0,125

0,125

0,06

0,06

B 2

0,06

0,25

0,06

0,25

0,5

0,06

0,06

2

0,25

0,25

0,125

0,125

C 3

0,125

0,5

0,125

0,5

1

0,125

0,125

4

0,5

0,5

0,25

0,25

D 4

0,25

1

0,25

1

2

0,25

0,25

8

1

1

0,5

0,5

E 5

0,5

2

0,5

2

4

0,5

0,5

16

2

2

1

1

F 6

1

4

1

4

8

1

1

32

4

4

2

2

G 7

2

8

2

8

16

2

2

64

8

8

4

4

H 8

4

GC

4

16

4

4

128

16

16

8

8

9

Platte C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 AMP PIP CFB CAZ AZT LEV ERT TOB COL DORI FOS Ceftarolin A 1

0,25

0,5

0,03

0,25

0,25

0,06

0,03

0,125

0,06

0,125

1

0,06

B 2

0,5

1

0,06

0,5

0,5

0,125

0,06

0,25

0,125

0,25

2

0,125

C 3

1

2

0,125

1

1

0,25

0,125

0,5

0,25

0,5

4

0,25

D 4

2

4

0,25

2

2

0,5

0,25

1

0,5

1

8

0,5

E 5

4

8

0,5

4

4

1

0,5

2

1

2

16

1

F 6

8

16

1

8

8

2

1

4

2

4

32

2

G 7

16

32

2

16

16

4

2

8

4

8

64

4

H 8

32

64

4

32

GC

8

4

16

8

16

128

9

39

2.4. E-Test (Demonstration) Hierbei handelt es sich um eine Methode, die sowohl Aspekte der Agardilution als auch der Agardiffusion in sich vereint: Das Antibiotikum ist in von oben nach unten abfallenden Konzentrationen auf einem Nitrozelluloseträger aufgebracht und diffundiert konzentrationsabhängig in den Agar. 3. Vorbereitung zum nächsten Praktikumstag: Anlegen einer fraktionierten

Sputumkultur Arbeitsmaterial : - Simulierte Sputumkultur - 1 Blut- und 1 Kochblutplatte - Vancomycinblättchen - Platte mit Staphylococcus aureus (Stamm H1=Amme) Durchführung : - Agarplatte wie üblich beschriften, Material mit der Öse auf eine ganze Blut- und eine ganze Kochblutagarplatte ausstreichen. - Anschließend auf der beimpften Kochblutagarplatte mit einer sterilen Pinzette ein Vancomycin-Blättchen auflegen. - auf die beimpfte Blutagarplatte senkrecht zu den Impfstrichen einen Impfstrich mit etwas Koloniematerial von einer Platte mit Staphylococcus aureus H1 aufbringen (sog. Amme). - Inkubation der Platten für 24 Std. bei 37°C. Bringen Sie zum nächsten Praktikum Ihre Zahnbürste mit!

40

4. Praktikum: Mikrobiologie der Mundhöhle Fragen zur Vorbereitung und Auswertung des Praktiku ms - Charakterisieren Sie die Normalflora des Respirationstraktes und der Mundhöhle - Können die Keime der Mundhöhle Infektionen verursachen? Wenn ja, welche? - Welche Infektionskrankheiten können sich u.a. auch in der Mundhöhle manifestieren? - Auf welcher Basis beruht die taxonomische Einteilung der Streptokokken? - Welche Streptokokkenspezies kennen Sie? - Was ist die humanmedizinisch bedeutendste Streptokokkenspezies? - Wie unterscheiden sich Pneumokokken und sonstige vergrünende Streptokokken? - Wie diagnostizieren Sie eine Streptokokkenerkrankung? - Welche Rolle spielen die Anaerobier innerhalb der Standortflora des Menschen? - Welche Infektionen können durch Anaerobier verursacht werden? - Welche Vermehrungsbedingungen werden für Anaerobier benötigt und warum? - Welche Bedeutung kommt Enterokokken als potentiellen Infektionserregern zu? - Was sind Biofilme und worin liegt ihr biologischer Sinn? - Wo kommen Biofilme vor? Bei welcher Lokalisation können sie von klinischer Bedeutung sein? - Nennen Sie die wichtigsten bakteriellen Erreger von respiratorischen Infektionen.

41

Mundflora in Abhängigkeit vom Lebensalter a) Mundflora bei Säuglingen und Kleinkindern *: anaerob: Veillonellen Fusobakterien Propionibakterien aerob: vergrünende Streptokokken nicht-hämolysierende Streptokokken Staphylokokken Mikrokokken saprophytäre Corynebakterien apathogene Neisserien b) Erweiterung der kindlichen Mundflora nach Durchb ruch der Milchzähne durch folgende Spezies: anaerob: Selenomonas-Spezies Porphyromonas-Spezies orale Treponema-, Leptospira-, Borrelia-Spezies Leptotrichia-Spezies Wolinella-Spezies Eubacterium-Spezies Peptostreptococcus-Spezies Actinomyces-Spezies Prevotella-Spezies aerob: Rothia-Spezies mikroaerophil: Eikenella-Spezies Campylobacter-Spezies Vibrio-Spezies Aggregatibacter actinomycetemcomitans Capnocytophaga-Spezies c) zusätzliche Mikroorganismen der Mundflora nach Durchbruch der bleibenden Zähne: Entamoeba gingivalis Trichomonas tenax d) in allen Altersgruppen vorhandene Mundflora (fakultativ und in geringer Keimzahl): Pilze: Sproßpilze (z.B. Candida albicans) _______________________________________________________________

*) NEUMANN, H.J., MERTGEN, C.P. : Antibiotika in der Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde, UP JOHN-Bibliothek MEDIA 1994

42

1. Auswertung vom letzten Kursstag: Resistenzbestim mung 1.1 Agardiffusionstest Messen Sie die Hemmhofdurchmesser der einzelnen Antibiotika und werten Sie das Ergebnis aus: Interpretationstabelle nach European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) Version 6.0 2016-01-01 für Bakterienart: Escherichia coli

Testsubstanz

Hemmhofdurchmesser (mm)

Ihr Ergebnis

Bezeichnung .

Konz. pro Blättchen

Sensibel

>

Intermediär

< >

Resi-stent

<

Hemmhof-durchmesser

(mm)

Bewertung

P = Penicillin 1 unit - - FOX = Cefoxitin 30 µg 19 - - 19 SXT = Trimothoprim- Sulfamethoxazol

25 µg 16 15 14 13

IPM = Imipenem 10 µg 22 21 17 16 LVX = Levofloxacin 5 µg 22 21 20 19 CN = Gentamicin 10 µg 17 16 15 14 für Bakterienart: Staphylococcus aureus

Testsubstanz

Hemmhofdurchmesser (mm)

Ihr Ergebnis

Bezeichnung .

Konz. pro Blättchen

Sensibel

>

Intermediär

< >

Resi-stent

<

Hemmhof-durchmesser

(mm)

Bewertung

P = Penicillin 1 unit 26 - - 26 FOX = Cefoxitin 30 µg 22 - - 22 SXT = Trimothoprim- Sulfamethoxazol

25 µg 17 16 15 14

IPM = Imipenem 10 µg X1) LVX = Levofloxacin 5 µg 22 21 20 19 CN = Gentamicin 10 µg 18 18 X1) Die Empfindlichkeit von Staphylokokken auf Imipenem leitet sich von Cefoxitin ab. 1.2 Bestimmung der MHK Lesen Sie vom Röhrchenverdünnungstest die minimale Hemmkonzentration (MHK) von Levofloxacin ab und dokumentieren Sie das Ergebnis! Röhrchen zuvor aufschütteln ! Interpretationstabelle nach EUCAST Version 6.0:

Bakterienart Testsubstanz Sensibel ≤ Resistenz > E. coli S.aureus

Levofloxacin Levofloxacin

1 1

2 2

Ihre getesteten Bakterienspezies: …………………………………………….. Ihr MHK-Wert: …………………………………………………………………… Ihre Bewertung: …………………………………………………………………

43

2. Untersuchungen zum Biotop Mundhöhle Arbeitsmaterial für 2.1 – 2.3 : - Blut- und Esculinplatten, beimpft mit Enterokokken, vergrünenden Streptokokken und Pneumokokken (mit Optochinblättchen) - Thioglykolatbouillon-Röhrchen - sterile Papierspitzen - sterile Pinzette 2.1 Fraktionierter Sputumausstrich (vom letzten Praktikumstag) - Beschreiben Sie die unterschiedlichen Kolonietypen auf den Agarplatten! - Sehen Sie Unterschiede zwischen der Blut- und der Kochblutplatte? - Diskutieren Sie mit Ihrem Kursassistenten, um welche Keime es sich handeln könnte. Zum Vergleich liegen Ihnen Demonstrationsplatten mit Haemophilus influenzae und dem Ammenphänomen vor. 2.2 Orientierende Differenzierung zwischen vergrüne nden Streptokokken, Pneumokokken und Enterokokken - Sie erhalten je eine Blut und eine Esculin-Agarplatte, die mit allen drei Spezies beimpft ist. - Können Sie auf der Blutplatte makroskopische Unterschiede feststellen? - Wie unterscheiden sich beide Nährböden im Vergleich? - Welche Aussagen leiten Sie von dem aufgelegten Optochinblättchen ab? - Wie haben Sie am zweiten Praktikumstag Pneumokokken nachgewiesen? - Kennen Sie Virulenzfaktoren von Pneumokokken? - Welche Infektionen können Pneumokokken verusachen?

44

2.3 Anlegen einer Interdentalraumkultur

- Ziehen Sie Handschuhe an und entnehmen Sie Sulkusflüssigkeit mittels einer sterilen Papierspitze. Die Papierspitze halten Sie mit einer

sterilen Pinzette fest. - Die Papierspitze wird in Thioglycolatbouillon bebrütet.

- Beschriften Sie das Röhrchen mit Ihrer Platznummer (Weiterbearbeitung am 5.Praktikumstag)

2.4 Anlage vergleichender Abstriche von

- Schneidezahnoberfläche und - Rachenhinterwand

Anliegen : Nachweis unterschiedlicher lokaler Standortflora. Arbeitsmaterial pro Student: - 1 Plattensatz bestehend aus Blut-, Kochblut, Endo-, Sabouraud- und einer Columbia-Blutagarplatte für Anaerobier - Holzspatel - 2 Abstrichtupfer Durchführung : - Beschriften Sie alle Platten von der Unterseite mit der Materialbezeichnung und der Platznummer! - Entnehmen Sie die Abstriche mit Druck und einigem Reiben - Im Anschluß streichen Sie die Tupfer unter leichtem Druck auf allen Plattenhälf- ten des Plattensatzes (Reihenfolge : Columbia-Agar – Kochblutagar – Blutagar – Endo-Agar – Sabouraud-Agar ) einmal ab. - Gehen Sie dann mit einer Öse in die Abstrichfläche und streichen Sie von dieser über die gesamte jeweilige Plattenhälfte aus. Für das gleiche Material kann für den kompletten Plattensatz mit der gleichen Öse gearbeitet werden.

45

2.5 Kultur von Ihrer Zahnbürste Arbeitsmaterial : Röhrchen mit Thioglykolat-Bouillon Durchführung : - Bringen Sie Ihre Zahnbürste in das Röhrchen mit Thioglycolat-Bouillon und schütteln Sie dieses 5 Minuten gut aus. - Beschriften Sie das Bouillonröhrchen mit Ihrer Platz-Nr. - Weiterbearbeitung am nächsten Praktikumstag.

46

5. Praktikum: Ausgewählte Infektionen – Endocardit is Wundinfektionen Mykologie Fragen zur Vorbereitung und Auswertung des Praktiku ms - Nennen Sie wichtige Endocarditis-Erreger - Nennen Sie Ursachen für eine Endocarditis - Welche Möglichkeiten der mikrobiologischen Diagnostik einer Endocarditis kennen Sie? - Was versteht man unter einer Blutkultur, was unter Bakterien, die auf Blutagar kultiviert wurden? - Nennen Sie die wichtigsten Erreger von Wundinfektionen. - Wie gehen Sie vor, die Erreger einer Wundinfektion nachzuweisen? Was ist bei der Materialentnahme zu beachten? - Wodurch sind Anaerobier charakterisiert? - Wo im menschlichen Körper gehören Anaerobier zur Normalflora? - Wie schätzen Sie das Virulenzpotential von anaeroben Keimen ein? - Wie würden Sie eine Aktinomykose diagnostizieren? - Welche Voraussetzungen führen zur Entstehung einer Aktinomykose? - Welche Erreger von Osteomyelitiden kennen Sie? - Welches Material ist geeignet, um Erreger einer Osteomyelitis nachzuweisen? - Nennen Sie die wichtigsten bakteriellen Erreger von Meningitiden. - Wie ist die Pathogenese einer bakteriellen Meningitis? - Wie ist eine bakterielle Meningitis mikrobiologisch zu diagnostizieren?

- Wie unterscheiden sich Pilze von Bakterien? - Was sind Sprosspilze, Fadenpilze und dimorphe Pilze? Nennen Sie Beispiele! - Worauf beruht die Identifikation von Sproß- bzw. Fadenpilzen? - Definieren Sie Assimilation und Fermentation! - Wodurch sind Dermatophyten charakterisiert, warum verursachen sie keine systemischen Infektionen? - Welche Infektionen werden durch Mucor spp. hervorgerufen? - Welche prädisponierenden Faktoren können eine Cryptococcus neoformans Infektion begünstigen? - Welche Infektionen können durch Aspergillus fumigatus bzw. Aspergillus niger hervorgerufen werden? - Wo kann man eine Histoplasmose acquirieren und wie wird sie diagnostiziert? - Was versteht man unter Aflatoxinen? - Welche Pilze produzieren welche Antibiotika? - Benennen Sie Boletus edulis mit einem populären Namen!

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Bakteriämie nach Zahnextraktion *): Mikroorganismen, die aus infektiöser Endokarditis isoliert wurden Mikroorganismen vergrünende Streptokokken Staphylokokken Corynebakterien Haemophilus influenzae HACEK-Gruppe Veillonella-Spezies Peptostreptokokken Fusobakterien Prevotella-Spezies Bacteroides-Spezies HACEK-Gruppe: H = Haemophilus aphrophilus A = Aggregatibacter actinomycetemcomitans C = Cardiobacterium hominis K = Kingella oralis Wodurch unterscheiden sich die aufgeführten Spezies voneinander? Nutzen Sie dafür die Praktikumsunterlagen und ein Lehrbuch!

Spezies Merkmale

vergrünende Streptokokken

Staphylokokken

a) S. aureus

b) KNS

Corynebakterien

H. influenzae

Veillonella – Spezies

Peptostreptokokken

Fusobakterien

Prevotella – Spezies

Bacteroides – Spezies

*) NEUMANN, H.-J., MERTGEN, C.P.: Antibiotika in der Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde, UP JOHN-Bibliothek MEDIA 1994

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1. Versuchsauswertung vom letzten Praktikumstag 1.1 Interdentalraumkultur : - Schütteln Sie die Bouillon gut auf – Gibt es Zeichen für mikrobielles Wachstum? - Fertigen Sie ein Gram-Präparat von der Bouillon an! - Protokollieren Sie die Ergebnisse! - Beimpfen Sie von der Bouillon je ½ Platte Columbia-Blutagar, Blutagar, - und Endoagar! - Auswertung am nächsten Praktikumstag 1.2 Bewertung der verschiedenen Abstrichkulturen - Vergleichen Sie das Wachstum auf den unterschiedlichen Nährmedien

- Protokollieren Sie die Ergebnisse in der nachfolgenden Tabelle - Nutzen Sie ggf. die Anlagen von Kommilitonen

Columbia-

Agar

Blut-Agar

Kochblut-

Agar

Endo-Agar

Sabouraud-Agar

Schneidezahn- Oberfläche

Rachenabstrich

- Wie würden Sie die Ergebnisse interpretieren? - Besprechen Sie Ihre Interpretation mit Ihrem Tischassistenten

- Fertigen Sie nach Absprache mit Ihrem Tischassistenten Gram-Präparate an! 1.3 Kultur von Ihrer Zahnbürste : - Schütteln Sie die Bouillon gut auf – Gibt es Zeichen für mikrobielles Wachstum? - Fertigen Sie ein Gram-Präparat von der Bouillon an! - Protokollieren Sie die Ergebnisse! - Beimpfen Sie von der Bouillon je ½ Platte Columbia-Blutagar, Blutagar, und Endoagar!

- Auswertung am nächsten Praktikumstag

49

2. Ausgewählte Infektionen : 2.1 Blutkultur Vorbemerkungen : Die Anlage von Blutkulturen ist eine der wichtigsten diagnostischen Maßnahmen zur mikrobiologischen Diagnostik systemischer Infektionen. Sie ist indiziert bei allen nicht abzuklärenden fieberhaften Zuständen, spätestens nach 3 Tagen Fieber unklarer Genese. Unter Beachtung sorgfältiger Hautdesinfektion sind 5 – 10 ml Venenblut zu entnehmen und in konfektionierte Flüssignährmedien zu bringen. Bei Zeichen für eine Keimvermehrung werden diese Flüssigkulturen auf feste Nährmedien zur Gewinnung von Reinkulturen für Speziesidentifikation und Resistenzbestimmung abgeimpft und es wird ein Grampräparat angelegt. 2.2 Auswertung eines Wundabstriches Praktische Übung : Sie finden am Tisch beimpfte und bereits kultivierte Plattensätze bestehend aus Columbiablut-, Blut- und Endo-Agarplatte, beschriftet mit „Kultur 1“ und „Kultur 2“. Beschreiben Sie Koloniemorphologie und Wachstum beider Kulturen! Fertigen Sie von beiden Kulturen ein Gram-Präparat an! Protokollieren Sie Ihre Ergebnisse in nachfolgender Tabelle! Um welche Spezies oder Genus könnte es sich handeln? Warum? Wären noch Ergänzungsuntersuchungen erforderlich?

Columbia-Agar

Blut-Agar

Endo-Agar

Gram-Präparat

Kultur 1

Kultur 2

50

3. Pilzsporen in der Raumluft Material 1 Sabouraud-Dextrose-Agarplatte pro Tisch 1 Blutagarplatte Durchführung Zur Untersuchung der Luft lassen Sie 3 Stunden lang am Arbeitsplatz eine geöffnete Petrischale mit Blutagar sowie eine Sabouraud-Platte, ebenfalls geöffnet stehen, die anschließend 24 Stunden bei 37°C und dann zwei Tage bei Raumtemperatur (Sabouraud-Platte 1 Woche) bebrütet wird. 4. Beurteilung der Koloniemorphologie und Mikroskop ie von Sproßpilzkulturen 1 Material Candida albicans auf Sabouraud-Dextrose-Agar Chromogenagar Candida tropicalis auf Sabouraud-Dextrose-Agar Chromogenagar Candida krusei auf Sabouraud-Dextrose-Agar Chromogenagar Cryptococcus neoformans auf Sabouraud-Dextrose-Agar Chromogenagar physiologische Kochsalzlösung Pipetten Durchführung

1Alle Kulturen wurden für 4 Tage bei 37°C bebrütet u nd anschließend abgetötet.

51

4.1. Kulturmorphologie Betrachten Sie die Kulturmorphologie. 4.2. Nativpräparate Stellen Sie von den 4 Sproßpilz-Spezies Nativpräparate her: Pipettieren Sie einen Tropfen physiologische Kochsalzlösung auf einen Objektträger. Nehmen Sie mit einer sterilen Öse wenig Kulturmaterial auf (leichtes Antippen einer Kolonie). Reiben Sie wenig Kulturmaterial zunächst neben den Tropfen physiologische Kochsalzlösung auf den Objektträger und vermischen Sie beides anschließend. Decken Sie dieses Präparat sofort mit einem Deckglas ab. Achtung! Nicht lufttrocknen! Mikroskopieren Sie dieses ungefärbte (!) Nativ-Präparat sofort mittels Durchlicht-, Dunkelfeld- oder Phasen-Kontrastdarstellung bei 100facher und 400facher Vergrößerung! Beobachten Sie die typischen, elongierten Zellen von Candida krusei (Abb. S. 54). 5. Dermatophyten 2 Material 1 Kultur von Trichophyton rubrum und Microsporon gypseum auf Sabouraud-Dextrose-Agar (2 Wochen bei 30°C bebrütet) 1 Flasche mit Laktophenol-Baumwollblau-Lösung Durchführung 5.1. Kulturmorphologie Beachten Sie die Pigmentbildung des Pilzthallus (T. rubrum). 5.2. Nachweis von Konidien Klebestreifenpräparat: Färbung mit Laktophenol-Baum woll- blau-Lösung Geben Sie 1 Tropfen Laktophenol-Baumwollblau-Lösung auf einen Objektträger. Nehmen Sie mit der Klebeseite eines Klebestreifens etwas Material vom Rand der Kolonie von Microsporon gypseum ab. Kleben Sie den Streifen in den Farblösungstropfen. Mikroskopieren Sie das Präparat bei 100- und 400facher Vergrößerung im Durchlicht. Versuchen Sie Makro- und Mikrokonidien zu finden (Abb. S. 54). 2 Alle Kulturen wurden nach Bebrütung abgetötet, so dass keine

Infektionsgefahr besteht.

52

6. Differenzierung von Schimmelpilzen 3 Material 5 verschiedene Kulturen von Schimmelpilzen (A, B, C, D, E) 1 Flasche mit Laktophenol-Baumwollblau-Lösung Durchführung 6.1. Kulturmorphologie Beachten Sie die unterschiedliche Kulturmorphologie. 6.2. Klebestreifenpräparat: Färbung mit Laktophenol -Baumwollblau-Lösung Geben Sie 1 Tropfen Laktophenol-Baumwollblau-Lösung auf einen Objektträger. Nehmen Sie mit der Klebeseite eines Klebestreifens etwas Material vom Rand der Kolonie ab. Kleben Sie den Streifen in den Farblösungstropfen. Mikroskopieren Sie das Präparat bei 100- und 400facher Vergrößerung im Durchlicht. Versuchen Sie, die Pilze anhand ihrer Fruktifikationsorgane zu identifizieren.

3 Alle Kulturen wurden nach Bebrütung abgetötet, so dass keine

Infektionsgefahr besteht.

53

54

A. fumigatus

A. niger

Rhizopus spp.

Penicillium spp

Mucor spp.

Schimmelpilze

55

C. albicans

C. tro picalis

Cryprococcus neoformans

C. krusei

Hefepilze

56

6. Praktikum: Serologie Syphilis Fragen zur Vorbereitung und Auswertung des Praktiku ms - Wann ist eine serologische Diagnostik sinnvoll? - Welche Qualitätsanforderungen sind an ein Serum zu stellen, das als Ausgangsmaterial für die serologische Diagnostik dienen soll? - Wie kann Serum aus Venenblut gewonnen werden? - Was sind die immunologischen Grundlagen einer Antigen-Antikörper-Reaktion? - Welche praktische Bedeutung haben monoklonale Antikörper in der Mikrobiologie? - Wie kann eine Erstinfektion nachgewiesen werden? - Wie unterscheidet sich eine Reaktivierung oder Reinfektion von einer Erstinfektion? - Definieren Sie den Begriff „Titer“! - Sind serologische Einzelbestimmungen sinnvoll? Wenn ja, unter welchen Kautelen? Welche Aussagen lassen sie zu? - Was verstehen Sie unter Sensitivität und Spezifität einer Methode? Wie werden diese berechnet? - Welche Grundtypen der Antikörpernachweismethoden kennen Sie und wie unterscheiden sich diese vom Funktionsablauf, Spezifität und Sensibilität (orientierend)? - Warum werden für den Nachweis gleicher Infektionserreger unterschiedliche Antikörpernachweisverfahren zu unterschiedlichen Zeitpunkten reaktiv? - Erklären Sie den Unterschied zwischen einer direkten und einer indirekten Agglutinationsreaktion, den Unterschied zwischen direkter und indirekter Immunfluoreszenz! - Können mit serologischen Methoden Rückschlüsse auf den möglichen Infektionszeitpunkt gezogen werden? - Welche Möglichkeiten gibt es, eine angeborene Infektion zu diagnostizieren? - Wie diagnostizieren Sie eine Syphilis? - Wie diagnostizieren Sie eine Toxoplasmose? - Wie diagnostizieren Sie eine LYME-Borreliose?

57

1. Versuchsauswertung vom letzten Praktikumstag Pilzsporen in der Raumluft Besprechung der gewachsenen Kolonien mit dem Tischassistenten. Interdentalraum- und Zahnbürstenkultur : - Nehmen Sie einen Geruch beim Öffnen der Columbia-Blutagarplatte wahr? - Vergleichen Sie das Koloniewachstum auf den drei unterschiedlichen Nährmedien! - Beschreiben Sie die Koloniemorphologie! - Um welche Art Keime könnte es sich handeln? - Besprechen Sie mit dem Tischassistenten Ihr Ergebnis und legen Sie fest, von welchen Kolonien Sie ein Grampräparat anfertigen! - Protokollieren Sie Ihre Ergebnisse in nachfolgender Tabelle!

Die weiteren Übungen werden in Arbeitsgruppen durchgeführt.

2. Serologische Bestimmung des Tetanus-Antitoxingeh altes in Serum

Vorbemerkung : Tetanus ist eine tödliche Wundinfektion, gegen die eine effektive und nebenwirkungsarme Impfung zur Verfügung steht, die zu den von der STIKO empfohlenen Regelschutzimpfungen gehört. Nach abgeschlossener Grundimmunisierung ist beim immunkompetenten Organismus mit einem Impfschutz bis zu 10 Jahren zu rechnen. Mit zunehmendem Alter, durch immunsupprimierende Erkrankungen oder Therapie kann der schützende Antikörperspiegel auf ein unwirksames Niveau absinken. Das derzeit am häufigsten angewandte Verfahren für den quantitativen Tetanus-Antitoxin-Nachweis ist ein ELISA. Die Quantifizierung erfolgt in IU/ml (International Units).

Columbia-Agar

Blut-Agar

Endo-Agar

Gram-Präparat

Interdental- raum- kultur

Zahnbürsten- kultur

58

Praktische Übung : - Beschreiben Sie die prinzipiellen Schritte eines Antikörpernachweises (Antikörper = hier Antitoxin, Antigen = Tetatoxoid) mittels ELISA: .............................................................................................................. .............................................................................................................. .............................................................................................................. ………………………………………………………………………………… Auswertung eines Messprotokolls Aufstellen der Eichkurve - Meßwerte der Kalibratoren auf die am Platz liegenden Auswertungsbögen eintragen y-Achse: Extinktion bei 450 nm x-Achse: Konzentration in IU/ml - Punkte verbinden - Die Extinktion des höchsten Kalibrators sollte >1,0 sein. - Proben mit einer Extinktion, die größer als die des Kalibrators 5 ist, müssen in einem 2. Ansatz als Verlängerung geprüft werden. - Ablesung der Antitoxineinheiten der Serumprobe - Protokollieren Sie die Ergebnisse!

Probe

Extinktion

IU/ml

Kalibrator 1 Kalibrator 2 Kalibrator 3 Kalibrator 4 Kalibrator 5 Schwach positive Kontrolle Hoch positive Kontrolle - Welche Konsequenz hat die Kenntnis des Antitoxinstatus für den Patienten? IU/ml Impfschutz empfohlene Impfung < 0,03 Keiner Grundimmunisierung 0,03-0,1 nicht sicher gewährleistet Auffrischung 0,1-0,5 Vorhanden Auffrischung 0,6-1,0 Ausreichend Kontrolle in 2 Jahren 1,1-5,0 Langfristig Kontrolle in 5-10 Jahren > 5,0 sehr hoch Kontrolle in 10 Jahren

59

60

3. Antikörpernachweis, Beispiel: Passive Agglutinat ion (Latexagglutinationstest zum Nachweis von Strept olysin-Antikörpern, qualitative Durchführung) Materialien : - Seren - Agglutinationskärtchen - Rührstäbchen - Latex-Antistreptolysin-(ASL-)-Reagenz - Positiv-Kontrolle - Röhrchen mit 950 µl Puffer - Eppendorfpipette und sterile Spitzen Durchführung : - Herstellen einer 1:20 Vorverdünnung(in einem Röhrchen werden 50µl Serum mit 950 µl Puffer sorgfältig vermischt) - Die Positivkontrolle liegt bereits gebrauchsfertig vor. - 30µl des vorverdünnten Serum auf das Kärtchen geben, - 30µl Latex-ASL-Reagenz daneben tropfen, - mit Stäbchen gut vermischen, - Agglutinationskärtchen 2 Min. kreisförmig bewegen, - Ablesung der Agglutination Bewertung: Agglutination ∅ - < 200 IE ASL/ml Agglutination ⊕ - > 200 IE ASL/ml

61

3. Syphilis Diagnostik mittels TPHA Zielstellung Durchführung eines Treponema pallidum-Hämagglutinations-Testes (TPHA) Materialien für 2 Studenten : - mit Antigen von T. pallidum sensibilisierte Erythrozyten, gebrauchs- fertig (Ery+) - unsensibilisierte Erythrozyten, gebrauchsfertig (Ery-) - Verdünnungsmittel, gebrauchsfertig (Puffer) - positives Kontrollserum, 1:20 vorverdünnt (PKS) - negatives Kontrollserum, 1:20 vorverdünnt (NKS) - Patientenserumprobe (SER) - Eppendorfpipette und gelbe sterile Spitzen - Mikrotitrationsplatte (U-Strips) Die Reagenzien und Seren müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht worden sein. Pipettierschema

Positive Kontrolle mit PKS

Negative Kontrolle mit NKS

Patientenuntersuchung mit SER

A - - 100 µl Puffer 25 µl SER (Verdünnung 1:5)

B - - 75 µl Puffer 25 µl (A) (Verdünnung 1:20)

C 25 µl PKS 75 µl Ery+ (Verdünnung 1:80; Kontrolle +Reaktion)

25 µl NKS 75 µl Ery+ (Verdünnung 1:80; Kontrolle –Reaktion)

25 µl SER (B) 75 µl Ery+ (Verdünnung 1:80; eigentlicher Test)

D 25 µl PKS 75 µl Ery- (Verdünnung 1:80; Kontrolle unspezifischer Hämagglutination)

25 µl NKS 75 µl Ery- (Verdünnung 1:80; Kontrolle unspezifischer Hämagglutination)

25 µl SER (B) 75 µl Ery- (Verdünnung 1:80; Kontrolle unspezifischer Hämagglutination)

- Platten kurz schütteln, - 45 - 60 Min. bei Raumtemperatur inkubieren

62

Beurteilung der Therapiebedürftigkeit einer Syphili s Materialien: - Latex-Antigen-Suspension - positives Kontrollserum - negatives Kontrollserum - Patientenserumprobe 1 und 2 - schwarze Agglutinationskärtchen - Eppendorfpipette und sterile Spitzen (VDRL oder CMT) Durchführung: Geben Sie mit einer Pipette je 50 µl positives Kontrollserum, negatives Kontrollserum, Serumprobe 1 und Serumprobe 2 auf je ein Feld des schwarzen Agglutinationskärtchens. Dazu geben Sie je einen Tropfen Latex-Antigen-Suspension. Verrühren Sie die Lösungen gut mit je einer Öse und schwenken Sie das Kärtchen vorsichtig. Prüfen Sie auf Agglutination (=Verklumpungen) Unmittelbar nach Beendigung mit dem bloßen Auge bei guter Beleuchtung im Vergleich zu den Kontrollseren ablesen. - Positives Ergebnis: deutlich erkennbare Verklumpungen in der Mitte

und am Rand des Feldes, - Schwach positives Ergebnis: schwache Verklumpung am Rand des Feldes, - Negatives Ergebnis: keine sichtbaren Verklumpungen. Jedes positive Ergebnis im Suchtest muss durch einen quantitativen Nachweis bestätigt werden.

63

Bewertung der Flockenreaktion