Werkplanll1ell11984

Het Nederlands Kanker Instituut

Kanker Onderzoek Laboratoiium en Kanker Verpleging

Antoni van Leeuwenhoekhuis PIesmanlaan 121 1066 ex Amsterdam telefoon (020) 5129111

inhoudsopgave

inleiding

I fundamenteel biochemisch onderzoek ....................... .

II chemische carcinogenese ..................................... 5

III cel biologie ........................•..................... 13

IV tumor immunologie ......................................... 23

V virologie ................................................. 27

VI genetische faktoren bij-het ontstaan van tumoren bij dier en mens ..... -......................................... 31

VII hormonale faktoren bij het ontstaan en de groei van tumoren ................................................... 47

VIII experimentele chemotherapie en radiotherapie .............. 53

IX ontwikkelingsresearch voor radiotherapie .................. 61

X klinische oncologie ....................................... 69

INLEIDING

In de werkplannen. worden voornamelijk ombuigingen van het onderzoek en nieuw onderzoek aangegeven. Een wetenschappelijk verslag in de Engelse taal wordt als Annual Report uitgegeven. De nummering·van onderzoek­programma's en projekten is in werkplannen en Annual Report gelijk gehouden.

SEKTIE I. FUNDAMENTEEL BIOCH~iISCH ONDERZOEK

l.I. Analytisch Centrifugeren

W.S. Bont, W.L. van Es, C.J.P. Slee

De diameters van alle membraanblaasjes ZlJn termen van twee meetkundige reeksen. Op twee manieren werd. aangetoond dat plasma membranen van hele cellen in dezelfde reeksen passen. Ten eerste kon Dr. Walters (Afd. Biofysika, Universiteit van Nijmegen) aantonen, in nauwe samenwerking met ons laboratorium, dat zeer grote blaasjes (tot 8 ~m) ook nog in diskrete groottes voorkomen, die passen in de reeksen. Ten tweede kon worden aangetoond dat de diskrete differentiatie stadia van de lymfo­cyten precies passen in de 2 reeksen (W.S. Bont: A model for the lympho­cyte production pathway in bone marrow. J. Theor. Biol. 96: 707-722 1982) • De konsekwenties van deze resultaten maken het op hun beurt weer moge­lijk een beter inzicht te krijgen in het fysische kader waarin de pheno­typische expressie van cellen, in het bijzonder ook van tumorcellen, tot uitdrukking komt. Aan dit laatste aspekt zal veel aandacht worden geschonken.

I.2.1. Celscheidingen met de bloed componenten separator (BCS)

a) Een prototype van de BCS heeft bewezen dat deze techniek van groot belang is om een leukocyten preparaat uit humaan bloed te bereiden. Bestudeerd zal worden in hoeverre het apparaat gewijzigd moet worden om de resolutie te vergroten. Met name de isolatie van leukocyten-vrije thrombocyten suspensies is van groot belang voor de kliniek. b) De BCS zoals nu gebruikt, moet worden geadapteerd om kleine hoeveel-heden bloed te verwerken (50 mI en minder). . c) Voor een routinematige toepassing van deze apparatuur in de kliniek is het van groot belang dat de BCS in disposable vorm beschikbaar is. De ontwikkeling hiervan hangt mede af van de beschikbaarheid van vol­doende financiële middelen. d) Nu gebleken is dat de BCS ook voor het verrijken van beenmerg-stam­cellen geschikt is zal de apparatuur voor beenmerg geoptimaliseerd wor­den. Aangezien de isolatie van beenmerg-stamcellen van groot belang is· voor de beenmerg transplantatie technologie is toekomstige klinische toepassing niet uitgesloten. In dit verband is er een nauwe samenwerking met het Ernrna Kinder Ziekenhuis, Prof. Dr. P. Voute en het Radboud Zie­kenhuis in Nijmegen, Prof. Dr. C. Haanen.

I. 2.2·. Celscheidingen met de elutriator rotor (ER)

W.S. Bont, W.L. van Es, C.G. Figdor, J. Leemans, C.J.P. Slee, J.E. de Vries

a) Het scheiden van grote hoeveelheden bloedcellen met de ER is nu via de BCS een routine procedure geworden. Als "service" voor het eigen

1

laboratorium en in het kader van de samenwerking met andere laboratoria wordt er nu 2x per week een buffy coat gescheiden in lymfocyten en mono­cyten subpopulaties. b) Met het oog op .. beenmerg transplantaties zal de scheiding van been­mergcellen meer aandacht krijgen. Het is onlangs door de groep van Prof. Haanen aangetoond dat met de ER de lymfocyten van de beenmerg-stamcellen verwijderd kunnen worden, wat de graft versus host disease zou kunnen voorkomen bij beenmerg transplantaties. Ook zal de mogelijkhelQ om stamcellen uit perifeer bloed te isoleren onderzocht worden. Dit in verband met het feit dat het afnemen van been­merg van een donor toch een zeker risiko inhoudt (anaesthesie). c) Gezien de belangrijke rol die de monocyte - macrofaag (b.v. Langer­hans cel) speelt in talloze gebieden is een verder onderzoek van sub­populaties van monocyten beslist noodzakelijk. Gekeken zal worden wat de relevantie is van de door ons gevonden subpopulaties van monocyten. Zijn het maturatie/differentiatie stadia en zo ja, in welke richting verloopt dit proces dan via de subpopulaties? Hiertoe zal o.a. de aktiviteit van LDH, lysozyme, prostaglandine en ook chemoluminiscentie, zure phosphatase en antigeen presentatie, bestudeerd worden. We hopen door middel van dit onderzoek atypische monocyten in uatiënten beter te kunnen opsporen en karakteriseren. d) Vooral bij het onderzoek van bloed vàn patiënten is het van belang de cellen uit kleine volumina bloed zo goed mogelijk te scheiden met een zo groot mogelijke opbrengst. Daartoe is het noodzakelijk dat er zeer snel een monitor gebouwd wordt, die de cellen tijdens het elutriëren kan tellen en karakteriseren. e) Onlangs is een opstelling gerealiseerd waardoor het mogelijk is met 2 rotoren in serie te werken. Hierdoor kunnen de volumina van de frakties beperkt blijven en wordt het mogelijk kleine hoeveelheden bloed te scheiden. Hierdoor wordt het nu voor het eerst mogelijk routinematig patiëntenbloed, respektievelijk beenmerg te scheiden en de cellen in de verschillende frakties funktioneel te onderzoeken. f) Onderzocht wordt of het in principe mogelijk is neuroblastoom cellen te scheiden van beenmerg-stamcellen, i.v.m. autologe beenmerg re­infusies. Bovendien zal onderzocht worden of the seleen verbindingen zoals beschreven onder punt 1.3.1. selektief cytotoxisch zijn voor neuroblastoom cellen. g) Gekeken wordt of' uit 50 ml bloed granulocyten geïsoleerd kunnen worden in zeer kleine volumina «10 ml). Deze worden dan gelabeld en gebruikt voor het opsporen van ontstekingsreakties.

1.2.3. Apparatuur voor onderzoek van celmengsels door middel van sedimentatie analyse

W.S. Bont, W.L. van Es, C.G. Figdor, J. Leemans, C.J.P. Slee, J.E. de Vries

Nadat de ijking van het' apparaat was voltooid werd begonnen met de ana­lyse van bloedcellen. Een publikatie is in voorbereiding waarin de werking yan het apparaat en de verkregen resultaten worden beschreven. Het ligt in de bedoeling de procedure nog verder te vereenvoudigen zodat grote hoeveelheden bloedmonsters routinematig kunnen worden ge­analyseerd. Verder zal de temperatuur beter gekontroleerd moeten worden.

1.3. Onderzoek naar de remmende werking van selenotrisulfiden op de eiWit-synthese in normale- en tumorcellen

L.N. Vernie, M. de Vries, W.S. Bont, P. Emmelot

Selenium is een essentieel spore-element. Tegelijkertijd behoren sele­'niumverbindinge tot de meest giftige stoffen die bestaan. Daarbij is

2

door het toevoegen van selenium aan het voer of drinkwater van proef­dieren aangetoond dat dit element een verlaging van zowel de chemisch­als viraal geïnduceerde tumorincidentie kan geven. Epidemiologisch on­derzoek laat een verminderde kankersterfte zien bij een hogere selenium­opname. De essentiële werking van selenium werd duidelijk toen gevonden werd dat dit element gebonden zit op de aktieve plaats van het enzym glutathione peroxidase. Vervolgens werd ook 'de anti-carcinogene werking van selenium aan de aanwezigheid van selenium in dit enzym toegeschreven. Onlangs is in enkele publikaties aangetoond dat ook zonder dat er sprake is van een verhoging van de glutathione peroxidase aktiviteit toch een daling van de chemisch geïnduceerde tumor incidentie kan worden bereikt door toevoeging van selenium aan het voer. Ook is gevonden dat selenium de groei remt van geïnoculeerde tumoren. Dit tezamen maakt dat selenium naast de aktiviteit in het enzym glutathion peroxidase nog op andere wijze betrokken is bij het ontstaan- of de groei van tumoren. Over het mechanisme van de giftige werking van seleniumverbindingen is .nogweinig bekend. Uitgezonderd hierop is de door ons beschreven rem­mende werking van reaktieprodukten van selenie~ en thiolen, op de aminozuur inbouw in vitro en de eiwitsynthese van cellen in weefselkweek. Dit laatste effekt dat niet omkeerbaar is, leidt tot celdood. In vivo is door ons gevonden dat met twee van deze reaktieprodukten, selenodiglutathion, GSSeSG, en selenodicysteine, een reduktie van ascites tumor celgroei kan worden bereikt. Door anderen zijn dergelijke experimenten verricht met o.a. seleniet. Deze auteurs schrijven hun resultaten toe aan het anticarcinogene voedingsaspekt van selenium, terwijl onze interpretatie berust op de toxiciteit van de gevormde seleniumverbindingen. Een en ander sluit elkaar niet uit, maar maakt wel dat de omzettingsprodukten van selenium in vivo belangrijk zijn. Een van de metabolieten van seleniet in vivo is selenoglutathion, welk produkt in vivo in erythrocyten gevormd wordt. Ook lymfocyten spelen een rol bij de omzetting van seleniet. Dit is reden om te veronderstellen dat in het algemeen cellen van het bloedvormend systeem minder gevoelig voor bepaalde seleniumverbindingen 'kunnen zijn dan tumorcellen. In grote lijnen zal het onderzoek worden voortgezet zoals hieronder aangegeven. In 1984 zal speciaal aandacht geschonken worden aan punt 1 en 3 .

• 1 Onderzoek naar het groeiremmend effekt van selenotrisulfiden op cellen in weefselkweek

Experimenten met reaktieprodukten van seleniet en thiolen hebben grote verschillen in remmend effekt op de eiwitsynthese van cellen in weef­selkweek te zien gegeven. Ook tussen diverse cellijnen en bij gebruik­making van hetzelfde reaktieprodukt bleken er aanzienlijke verschillen te bestaan. De oorzaak hiervan is niet duidelijk. Bekeken zal worden of er een verschil in opname van de produkten bestaat en/of dit verschil te korreleren is met de struktuur van de verbinding. Uit onze proeven is gebleken dat erythrocyten indien geïnkubeerd met GSSeSG deze verbinding, b.v. i.t.t. L1210, zeer snel opnemen (d.w.z. binnen 1 minuut) en omzet­ten tot een niet giftig produkt. Maximale opname van GSSeSG in L1210 cellen wordt bereikt na ongeveer 40 minuten en leidt tot celdood. Gebruikmakend van deze eigenschappen zal geprobeerd worden of er in het algemeen een verschil bestaat tussen beenmergcellen en tumorcellen .

• 2 Onderzoek naar het mechanisme van de inaktivering van elongatie­faktor 2 door selenotrisulfiden

De tot nu toe verkregen reaktieprodukten van seleniet met thiolen werken alle remmend op de aminzouurinbouw in het celvrije systeem. Nader onder­zoek met GSSeSG leerde dat er een specifieke in aktivering optreedt van elongatiefaktor 2 (EF2). Hierdoor vindt geen hydrolyse meer plaats van GTP en stopt de aminozuur-inbouw. Het is zeer goed mogelijk dat de in-

3

aktivering van EF2 geheel of ten dele ten grondslag ligt aan de giftige verschijnselen welke in vivo door selenium worden veroorzaakt. Echter ook een reaktie van GSSeSG, of vergelijkbare seleniumverbindingen, met de in enzymen (eiwitten) naast elkaar gelegen SH groepen is mogelijk. Het mechanisme van de remming op EF2 is nog niet bekend. Dit is' een gevolg van de moeizame isolatieprocedure van EF2 en de uiteindelijke geringe opbrengst hiervan. Een inaktivering door GSSeSG van ~nzymen, welke in meerdere mate beschikbaar zijn, zou de opheldering van het mechanisme van de remming van EF2, naar analogie hiervan vereenvoudigen. Kennis van de giftige werking van selenium is om meerdere redenen van belang. Een van deze redenen is dat het niet uitgesloten is dat geprobeerd zal worden bepaalde bevolkingsgroepen die een verhoogd risiko lopen tot het krijgen van kanker hiertegen te beschermen met antioxidantia waaronder selenium .

• 3 Onderzoek naar de mogelijkheid de niergiftigheid van platinumver­bindingen te verlagen met selenium

In samenwerking met Dr. J.G. McVie zal in enkele pilot dier-experimenten bekeken worden of selenium de giftigheid voor nieren van bepaalde platinumverbindingen kan verlagen. Van Hg en Cd is bekend dat deze me­talen nierbeschadigingen veroorzaken welke overeenkomen met die van cis­platinum. Tevens is bekend dat de giftigheid van Hg, zelfs tot enkele uren na toediening hiervan, verminderd kan worden door selenium. In vergelijking met deze experimenten zal nagegaan worden of een dergelijke pr.oefopzet ook mogelijk is met cis-platinum.

4

SEKTIE 11. CHEMISCHE CARCINOGENESE

I 11.1. Interaktie van N-acetyl-2-arninofluoreen (AAF) en verwante ~~~m~~~~~~ aminen met nucleïnezuren in relatie tot di vorming

E. Kriek, J.G. Westr'a, A. Visser" M. Welling I Aromatische aminen vormen een groep van chemicaliën m~t een uitgebreid industrieel toepassingsgebied, o.a. als tussenprodukt bij de synthese van kleurstoffen, geneesmiddelen, pesticiden en plastiks. De toxische en carcinogene eigenschappen van een aantal aromatische aminen zijn nu goed bekend, vooral door het optreden van blaaskanker bij de mens als gevolg van blootstelling aan deze verbindingen. De belangrijkste ver­bindingen zijn 4-aminobiphenyl, benzidine en derivaten, diphenylamine en naftylamine. Opname door de mens kan geschieden via de ademhalings­wegen, het maag-darmkanaal en door de huid. Leek de blootstelling aan aromatische aminen vroeger hoofdzakelijk een probleem van industriële hygiëne, tegenwoordig vormen bepaalde groepen aromatische aminen een algemeen probleem omdat zij in het milieu voorkomen (IARC, 1981, 1982). Dit geldt bijvoorbeeld voor azokleurstoffen afgeleid van benzidine, fenacetine'en aromatische aminen uit andere bronnen dan synthetische. Vooral de groep van heterocyclische aromatische aminen heeft de laatste jaren veel belangstelling gekregen, omdat deze stoffen worden gevormd door verhitting van aminozuren, eiwitten en eiwithoudend voedsel (roosteren van vis en vlees). De bètekenis voor de etioiogie van tumoren van maag-darmkanaal bij de mens "is echter nog niet duidelijk voor deze verbindingen. Opvallen is dat zij in chemische struktuur veel overeen­komst vertonen met 2' ,3-dimethyl-4-aminobiphenyl en 3,..inethyl-4-aminobi­phenyl, stoffen die bij ratten colontumoren kunnen induceren. Veel van onze huidige kennis en inzichten over het metabolisme en reakties van aromatische aminen zijn verkregen uit studies met N-acetyl-2-aminofluoreen (AAF), 4-aminobiphenyl (ABP), benzidine (BZ) en 1- en 2-naftylamine (NA) in experimentele systemen. Aangezien de interaktie met DNA als een belangrijke stap wordt gezien in de initiatie van het carcinogenese proces, zijn veel studies verricht over de interaktie van reaktieve metabolieten van aromatische aminen met DNA (zie voor een overzicht E. Kriek, Proc. 13th Int. Cancer Congress). Alle aromatische aminen die op dit punt zijn onderzocht, geven in vivo guanine-8-aryla­mine als voornaamste eindprodukt in het DNA van verschillende organen. In sommige gevallen is dit zelfs het enige produkt, dat werd gevonden. Daarnaast ontstaan soms ook de N-acetylderivaten. Aan de hand van stu­dies met de modelverbinding AAF is gebleken dat deze DNA addukten kunnen worden bepaald met behulp van zeer specifieke antisera (zie Annual Report 1980, 1981). Het lag voor de hand na te gaan of een methode kon worden ontwikkkeld die algemeen bruikbaar was voor het bepalen van DNA adduktenvan aromatische aminen. Het probleem deed zich echter voor, dat guanine-8-arylamines instabiel zijn onder bepaalde kondities en gemakke­lijk overgaan in de guanine imidazolring geopende derivaten (E. Kriek en J.G. Westra, Carcinogenesis ,1: 459, 1980). De:;;e laatste produkten zijn echter wel stabiel, zodat met behulp van een antiserum tegen ro-Guo-8-AF

5

een bepaling kon worden uitgewerkt voor dit type produkten in DNA (zie Annual Report 1982 II.l en II.6). We hebben hiermee een methode die algmeen toepasbaar lijkt voor alle aromatische aminen die guanine-8-arylaminen in DNA vormen, en kunnen worden overgevoerd in een stabiel eindprodukt. Deze immunologische bepalingsmethode zal bij de hierna volgende onderzoeken worden toegepast.

I. Interaktie van N-2-acetylaminofluoreen (AAF) in vivo

De vormings- en verdwijnkinetiek van AAF derivaten in het DNA van dis­tinkte celpopulaties van de ratte lever zal verder worden bestudeerd in samenwerking met A. Tulp (projekt II.4). De eerste resultaten vertonen een duidelijk verschil tussen de relatieve hoeveelheden dGuo-AAF en dGuo-AF·in het DNA van hepatocyten en stromale cellen; deze laatsten bevatten veel minder dGuo-AAF. Door de aanschaf van een elutriator rotor in 1982 zijn de mogelijkheden voor scheiding van de verschillende lever­celpopulaties aanzienlijk verbeterd. Ook kunnen grotere hoeveelheden materiaal worden gescheiden. Er deden zich echter problemen voor bij de isolatie van het DNA uit de verschillende celfrakties. Daar vooral voor de immunologische methode behoefte bestaat aan een snelle en goed re­produceerbare manier om kleine hoeveelheden DNA te isoleren, zal hier eerst aandacht aan worden besteed. De volgende methoden zullen worden vergeleken wat betreft snelheid, opbrengst en kwaliteit van het DNA: (i) isolatie op polycarbonaatfilters volgens Leadon & Cerutti (Anal. Biochem. 120 282, 1982), (ii) hydroxyapatietchromatografie volgens Beland et-aI. (J. Chromatogr. 174, 177, 1979) en (iii) lyseren met SDS, gevolgd door behandeling met proteinase K en fenolextraktie. De meest geschikte methode zal worden gestandaardiseerd en worden gebruikt voor het isoleren van DNA uit cellen en weefsels.

II. Interaktie van 2',3-dimethyl-4-aminobiphenyl (DMABP) in vivo

De 3-methyl- en 2' ,3-dimethylderivaten van 4-aminobiphenyl bezitten een zeer specifieke orgaanwerking. Het 2' ,3-dimethyl-4-aminobiphenyl (DMABP) geeft bijvoorbeeld bij ratten overwegend colontumoren, bij hamsters daarentegen blaastumoren. Uit recente onderzoekingen van anderen, o.a. E. Fiala (Prod. 2nd Int. Conf. on Carcinogenic and Mutagenic N-Substi­tuted Aryl Compounds) is gebleken, dat deze organotrophie samenhangt met een preferentiële uitscheiding van het N-hydroxy-N-glucuronide via de gal bij ratten. De interakties van de verschillende reaktieve metabolie­ten op molekulair niveau en de effekten hiervan zijn echter nog onvol­doende onderzocht. Aangezien er gelijkgerichte belangstelling op dit gebied bestaat bij de groep van F.F. Kadlubar (National Center for Toxicological Research, Food & Drug Administration; Jefferson, AR, USA) werd besloten een deel van het onderzoek gezamenlijk uit te voeren. Synthesemethoden werden uitgewerkt voor 3-methyl-4-nitrobiphenyl en 2' ,3-dimethyl-4nitrobiphenyl, die als uitgangsmateriaal dienen voor de bereiding van de N-hydroxyderivaten. Het belangrijkste reaktieprodukt van N-hydroxy-DMABP met DNA in vitro werd geïdentificeerd als N-(deoxy­guanosin-8-yl)-Dl4ABP. De eerste experimenten met (3H)DMABP in vivo wijzen erop dat hetzelfde addukt in ongeveer gelijke mate aanwezig is in het DNA van lever en colon na toediening van één dosis (Annual Report 1982). ·Het onderzoek zal als volgt worden voortgezet: 1. Eerst zullen de belangrijkte DNA addukten worden gekarakteriseerd.

De chemische en fysische eigenschappen van N-dG-DMABP, N-dG-MABP en N-dG-ABP zullen worden vergeleken, o.a. de vorming van guanine imi­daz·olring-geopende produkten.

2. Het addukt N-(guanosin-8-yl)-D~ffiBP zal worden gesynthetiseerd in voldoende hoeveelheid, zodat het kan worden gekoppeld aan BSA voor immunisatie. Hierbij zal tevens aandacht worden gegeven aan het pro­bleem van kruisreaktiviteit van aromatische aminen onderling, b.v. reaktie van anti Guo-8-DMABP met dGuo-8-ABP.

3. Analyse van de Dl4ABP addukten in DNA volgens de methode die voor AAF addukten is uitgewerkt (Annual Report 1982), waarbij gebruik wordt

6

gemaakt van anti Guo-8-DMABP antiserum. 4. In samenwerking met A. Tulp (projekt 11.4) zal worden geprobeerd de

verschillende celpopulatiesvan de colon te scheiden. Begonnen zal worden een scheiding te verkrijgen tussen proliferatieve en niet~ proliferatieve cellen volgens een onlangs gepubliceerde methode van Brasitus (Anal. Biochem, 123, 364, 1982).

5. Daarna zal een aanvang worden gemaakt met het onderzoek over de vormings- en verdwijnkinetiek van de DMABP addukten in de verschil­lende celpopulaties van de colon.

Bovenstaande onderzoekingen vormen onderdelen van een langer lopend projekt dat meerdere jaren zal duren.

11.2 DNA-MODIFICATIES EN DNA-HERSTEL IN CELLEN NA BLOOTSTELLING AAN CHEMISCHE CARCINOGENEN. RELATIES MET BIOLOGISCHE EFFECTEN.

L. den Engelse, R.J. de Brij, B.G.J. Floot

N.B.: Delen van het hieronder opgevoerde werkplan vormen het ombouwpro­jekt NKI 83-22. De algemene vraagstelling van projekt 11.2, een over langere termijn gepland projekt omvat de beperkter vraagstelling van het projekt NKI 83-22; gepland voor de jaren 1983 tot en met 1986.

DNA-modificaties spelen een essentiële rol bij de mutagene, clastogene (chromosoombeschadigende) en carcinogene effekten van alkylerende ver­bindingen. Daar een enkel alkylerend agens een heel skala (tot meer dan een dozijn) verschillende gealkyleerde DNA-addukten en andere DNA-modi­fikaties kan induceren, rijst de vraag of een bepaald biologisch effekt aan één of enkele van deze DNA-modifikaties kan worden toegeschreven. Verder is van belang de onderlinge relatie tussen de biOlogische effek­ten te weten, bijvoorbeeld: zijn puntmutaties of wellicht juist chromo­somale afwijkingen belangrijk voor tumorvorming? Om op bovenstaande vragen een antwoord te geven is het o.a. nodig om over gevoelige technieken te beschikken waarmee - in de betreffende doelwitcellen - een analyse van de vorming en de stabiliteit van de diverse DNA-modifikaties kan worden uitgevoerd.

De scheiding van de in de rattelever voorkomende cellen (hepatocyten, endotheelcellen, Kupffer cellen) zal.·naar verwacht benut kunnen worden om in deze afzonderlijke celtypen DNA-modifikaties te kunnen aantonen. Na perfusie met collagenase zal - in samenwerking met Dr. A. Tulp (projekt 11.4) - een scheiding van genoemde celtypen worden gerealiseerd met de 1-g-methode of met de elutriator-rotor. Deze scheiding is van belang omdat verschillende celtypen in een orgaan kunnen verschillen m.b.t. zowel de vorming als de stabiliteit van gealkyleerde basen. Bovendien worden de meeste biologische effekten juist voor één bepaald celtype waargenomen. Met een snelle DNA-isolatie die zich zoveel.mogelijk bij lagere temperaturen afspeelt zal DNA uit de betreffende celfrakties worden geïsoleerd en vervolgens op het voorkomen van DNA-modifikaties worden onderzocht.

Voor deze laatste analyse staat een binnen dit projekt ingevoerde. HPLC-methodiek ter beschikking. Een meer complete analyse zal mogelijk worden door een aantal thans nog ontbrekende markerverbindingen te synthetiseren. Hierbij wordt gedacht aan enkele gemethyleerde thymidines, derivaten van 7- (m) ethyl guanine met geope.nde imidazolring, gedeamineerde ge (m)ethyleerde DNA-basen etc. Met behulp van mengsels van verschillende fosfatasen zal worden nagegaan of een totale afbraak tot nucleosiden voor alle ge(m)ethyleerde DNA-produkten kan worden bereikt.

Met behulp van bovenstaande methoden zal in de genoemde celtypen van de knaagdierlever alsmede in enkele andere organen (gedacht wordt aan hersenen, darm, longen, thymus, nier, testis) de vorming en stabiliteit van door 3H-ENU gevormde DNA-addukterr worden onderzocht. Het END zal

7

hierbij worden gesplitst in een aantal (b.v. 10) wekelijkse injekties, dit om zoveel mogelijk de omstandigheden van herhaalde blootstelling aan lage doseringen na te bootsen. Als knaagdier zal vermoedelijk de muis (een stam op BlO-achtergrond) worden geselekteerd. Dit niet alleen om de dosis 3H-ENU betaalbaar te houden maar ook en met name om de ge­noemde bepalingsmethoden uit te werken in een diersoort die wellicht als modelsysteem voor het ontstaan van door END geïnduceerde tumoren (in darm, long thymus en lever van een aantal muizestammen op BlO-achter­grond) kan worden benut. Met drs. L. Oomen (projekt VI.2g), die tumor­vorming onder invloed van END in genoemde stammen onderzoekt zal de geschiktheid van deze stammen nader worden onderzocht, om meer gede­tailleerd het verloop van de initiatiefase (vorming, herstel en cellu­laire lokalisatie van DNA-modifikaties) te onderzoeken.

Niet alleen in dit projekt maar ook in een aantal nauw verbonden projekten (NKI II.7, met dr. G. Menkveld; SG 82-15, met dr. J.W.I.M. Simons en Drs. A. de Kok) en in een EEG-werkgroep "Genetic effects of environmental chemicals" is grote behoefte om de kwaliteit van de ge­bruikte alkylerende verbindingen te bewaken. Dit niet alleenomde juiste dosis te weten maar ook om de eventuele aanwezigheid van toxische bij­of ontledingsprodukten te kunnen vaststellen. Bij het vaststellen van biologische parameters, b.v. mutaties of chromosoombeschadigingen, hebben verschillende onderzoekers de indruk dat de resultaten mede af­hankelijk zijn van de gebruikte batches alkylerende verbindingen. De optische (UV-spectrum) en chromatografische (HPLC) eigenschappen van een aantal (radioaktieve en ongelabelde) (handels-) preparaten van o.a. END, DMN, DEN, MAM-acetaat zullen worden onderzocht.

II.3 ONDERZOEK VAN HET CARCINOGENE PROCES AAN DE HAND VAN MORFOLOGISCHE VOORSTADIA VAN DE KANKERCEL IN DE LEVER

E. Scherer, P. Emmelot, A.W. Feringa, H. Winterwerp

Door vergelijkende bepaling van a) DNA-modifikatie en reparatie en b) de cellulaire veranderingen die gedurende de induktie van tumoren in de rattelever te onderscheiden zijn wordt in dit langer lopende projekt nagegaan hoe volledige chemische carcinogenen tijdens de verschillende fasen van het carcinogene proces werkzaam zijn. De vorming van precance­reuze lesies (eilandcellen), welke causale voorstadia zijn van het hepatocarcinoma, werd gedurende de laatste jaren kwantitatief in haar relatie tot DNA alkylering en reparatie onderzocht (Emmelot en Scherer, Biochim. Biophys. Acta 605, 247, 1980). UIt recente experimenten (Annual Report 1983, II.3) is gebleken dat deze eilandcellen na de extra proli­feratieve stimulus van een promotie behandeling (Slot-Faber protocol; Nature 263, 701, 1976) onder invloed van carcinogeen en verdere staps­gewijze verandering kunnen ondergaan: In de eilandjes ontstaan dan door prolifratie van het nieuwe celtype focY-met veranderde marker eigen­schappen en een meer kankerachtig gedrag. Dit resultaat wijst er sterk op dat levertumoren in de rat door een meer-hit mechanisme geïnduceerd worden, waarbij de overgang naar het volgende precancereuze ~adium op een initiatie-achtig proces, mogelijk de induktie van een relevante somatische mutatie, berust. De rol van promotie in het carcinogene proces wordt hierdoor mogelijk beperkt tot de vergroting van de pre­cancereuze celpopulaties (Emmelot en Scherer, Biochim. Biophys. Acta, 605, 247, 1980); V.R. Potter, Carcinogenesis 2, 1375, 1981). Het door ons geïntroduceerde nieuwe experimentele systeem maakt nu het bestuderen van de·rol van carcinogenen bij de induktie van de tweede stap tijdens de experimentele lever carcinogenese mogelijk. Er zal onderzocht worden in hoeverre verschillende voor de ratte lever beschre­ven promotiesystemen (Solt-Farber, Peraino, Pitot, zie Biochim. Biophys. Acta 605, 247-304, 1980; meer recente systemen: Cancer Res. 40, 3616, 1980; Carcinogenesis 3, 851, 1982; Chem. Biol. Interactions 39, 363, 1982; Cancer Res. "42, 2426, 1982; Cancer Res. 42, 2330, 1982; Cancer

8

Letters 16, 137, 1982; Ibid. 191) geschikt zijn om met behulp van een enkele dosis direkt werkend carcinogeen (ethylnitrosourea) foci van veranderde cellen in eilandjes te induceren. Voorts zal er nagegaan worden of langs enzymhistochemsiche weg (b.v. Gamma glytamyltranspeptidase, butyrylcholinesterase (Cancer Res. 42, 4158, 1982) of door immunofluorescentie een positieve marker voor de nieuwe, in eilandjes ontstane, celpopulaties te verkrijgen is. In de meest geschikte systemen zal onder meer onderzocht worden: • de dosis-respons relatie voor de induktie van foci in de eilandjes

door een enkele dosis carcinogeen; • de invloed van de grootte en proliferatie-aktiviteit van de eilandcel-

populatie op de induktie van de sekundaire foci; ! de (enzym)histochemische en cytologische eigenschappen van de nieuwe .. foci; .

• de ontwikkeling van deze foci met de tijd, eventueel tot tumoren; • de effektiviteit van verschillende carcinogenen om in dit systeem

nieuwe foci en tumoren te induceren. Zoveel mogelijk zal in deze experimenten de DNA modifikatie en. reparatie onder invloed van de gebruikte carcinogenen bepaald worden (in samenwer­king met de projekten 11.4 en het voor 1984 aan te vragen KWF-projekt over immuunhistochemische detektie van DNA modifikaties).

11.4. Celscheidingstechieken toegepast op de carcinogenese

A. Tulpen M.G. Barnhoorn

Interpretatie van biochemisch onderzoek is in de regel gebaat bij het isoleren van homogene celpopulaties uit complexe mengsels van cellen. In de afgelopen jaren zijn binnen het kader van dit projekt· een aantal cel­scheidingskamers ontwikkeld (te weten: de lxg ·kamer, de lage g kamer­zowel voor snelheidssedimentatie als voor evenwichtsdichtheid centrifu­gatie geschikt- en een elektroforese kamer), die hun waarde in andere projekten bewezen hebben. Met het in gebruik nemen van de centrifugele elutriator . (Beckmann) is ons scheidingspotentieel zo zeer versterkt dat de volgende scheidingsstudies onderwerp van onderzoek zullen zijn. • Metafase chromosomen van mens, muis en rat zullen worden gescheiden om tot lokalisatie van bepaalde genen te kunnen besluiten. Menselijke chromosomen zullen bij lage g waarden worden gescheiden om vervolgens te dienen als genen-bank voor klonering (in samenwerking met dr. J.G. Collard, projekt 11.3). • Binding van de chemische carcinogenen N-OHAAF, AAP en DEN aan basen afkomstig van DNA uit. geïsoleerde endotheel - en Kupffer cellen zal worden bepaald met HPLC en immunologische detektie-methoden (in samen­werking met dr. J.G. Westra, 11.1, dr. E. Scherer,.II.3 en dr. C.J. van der Laken, ,11. 6 ) . • In samenwerking met dr. L. den Engelse (projekt 11.2 en 11.7) zal de mogelijkhei'd worden onderzocht om (d.m.v. dichtheidscentrifugatie in Percoll gra'diënten) periportale en centrolobulaire hepatocyten te schei­den zodat in deze gescheiden populaties DNA-modifikaties kunnen worden gemeten. Eveneens zullen mikronuclei - door mutagene stoffen in de rat­telever geïnduceerd - gescheiden worden en op hun alkyleringsgraad.enDNA gehalte worden onderzocht. e Eilandcellen geïnduceerd door een Scherer-Emmelot regime zullen worden gescheiden van normale parenchymale levercellen m.b.v. snelheidssedimen­tatie, evenwichtsdichtheid centrifugatie, elutriatie en/of elektroforese. • In samenwerking met dr. A.D. Tates (Universiteit Leiden), wordt onder­zoek naar de effekten van mutagene stoffen op de spermatogenese bij muizen voortgezet, waarbij de lxg - en elutriatie techniek voorkeur ver­dienen. • In samenwerking met dr. P. Lens (projekt 11.5) zullen hersencellen van perinatale ratten worden gescheiden met de elutriatie techniek t.b.v. onderzoek naar ethylnitrosoureum geïncudeerde carcinogenese in de hersenen.

9

• In samenwerking met dr. W.J. van Blitterswijk (projekt III.5) zullen celpopulaties uit de milt van leukemische muizen worden gescheiden en op membraan antigenen worden gescreend. e Humane beenmergcellen van leukemische patiënten zullen worden geschei­den voor het bepalen van membraan fucosyl-glycopeptiden in de onder­scheiden celpopulaties (dr. W.P. van Beek, projekt III.2). • Ontwikkeling van celscheidingsapparatuur: het onderzoek aan de sekto­riële scheidingskamer wordt voortgezet. • Onderzoek naar het scheiden van B en T cellen in onze elektroforese kasette zal worden voortgezet. • Het hoge scheidend vermogen van onze lage g kamer zal baat vinden bij de bouw van een gradiënt vormer van bij zondere konstruktie .. • Om de grote volumina, die bij elutriatie verkregen worden, te vermin-. deren, ial onderzocht worden of door middel van het principe van de "binary stable fluid switch" - zonder gebruik te maken van zuigers - in de elutriator rotor verzamel vaten kunnen worden ingebouwd.

II.5 In vivo/in vitro analyse van ethylnitrosoureum-geïnduceerde hersentumoren in ratten (NKI·S2-2)

P.F. Lens, E. Kriek, R. Nusse, A. Riethorst

Indien ethylnitrosoureum (END) wordt toegediend 'aan BDIX ratten tijdens de perinatale periode leidt dit tot tumorinduktie in het centraal zenuwstelsel bij bijna 100% van de behandelde ratten (Iv'ankoviè-en Druckrey, Zo. Krebsforsch. 71: 320-360, 1968). We bestuderen de veran­deringen die plaatsvinden bij, na verschillende tijden, in kweek ge­brachte ongefraktioneerde hersencellen van ENU-behandelde ratten. De veranderingen zullen via een aantal transformatie kriteria worden ge­volgd: celmorfologie, kolonievorming in zachte agar, tumorigenteit. In samenwerking met Dr. A,. Tulp (projekt II. 4) worden de hersencellen gefraktioneerd en afzonderlijk in kweek gej:)r.acht om de celtypen die ver­antwordelijk zijn voor tumorvorming te identificeren:

Als aanvulling willen wij starten met transfektie-:experimenten (C. Shih et al., Nature 291: 261, 1981; R. Weinberg, Adv. Cancer Res. 26: 149, 1982) om zodoende DNA-sekwenties' die betrokken kunnèn zijn'bij de door ethylni trosoureum (END) ..,-,geïnduce,erde tumorigenese te kunnen analyseren. Door veel onderzoekers is reeds aangetoond dat DNA geïsoleerd uit tumoren of tumorcellijnen in staat is NIH/3T3-fibroblast;en te,transfor~ meren. Shih et al. (Nature 291: 261, 1981) toonden aan dat DNA afkomstig van een aantal neuroblastoom-cellijnen in staat was NIH/3T3 fibroblasten te transformeren. Paddhy et al. (Cell 28: 865, 1982) hebben transfektie­experimenten uitgevoerd met DNA afkomstlg van END-geïnduceerde ratte­neuroblastomen. Het DNA van de getransformeerde cellen werd vervolgens gebruikt in een nieuwe 'cyklus van transfectie-experimenten met deze sekundaire transfektanten en dit resulteerde in de vorming van fibro­sarcomen. De sera van de geïmmuniseerde muizen werd vervolgens getest op reaktiviteit met ratteneuroblastoomcel eiwitten. De sera immunopreci­piteerden een 185 Kd fosfo-eiwit. Dit eiwit was ook aanwezig ~n de DNA­getransformeerde fibroblasten, in de neuroblastoom cellijnen en in transfèktanten verkregen via transfektie van DNA afkomstig van een ENU­geïnduceerd gliablastoom. Door onderzoek naar transformatiesekwenties willen wij inzicht krijgen in genetische veranderingen die plaatsvinden tijdens tumorontwikkeling en progressie. Wij zijn van plan de volgende experimenten uit te voeren:

• 1 DNA-transfektie assays met de volgende DNA-preparaten: a. DNA geïsoleerd uit ENU-geïnduceerde tumoren; b. DNA afkomstig van cellijnen van de tumoren; c. DNA van cellijnen afkomstig van foetale rattehersenen, die gedurende

verschillende tijden met ENU waren behandeld.

10

• 2 Bepaling van de restriktie enzymgevoeligheid van de transformerende aktiviteit van de verschillende DNA-preparaten .

• 3 Indien het 185 Kd fosfo-eiwit inderdaad het produkt is van een transforffierend gen in neuroblastomen, zou de expressie van het 185 Kd eiwit een marker kunnen zijn voor tumorprogressie en ontwikkeling. Monoklonale antilichamen (mcAb's) zouden een belangrijk hulpmiddel zlJn om de expressie van dit eiwit te bestuderen. Wij zijn van plan McAb's te genereren volgens het volgende schema: Immunisatie van muizen met NIH/3T3 cellen die getransformeerd zijn met tumor-DNA en fusie van de miltcellen met non-producer muizemyeloomcellen (Köhler & Miltstein, Nature 256: 495, 1982). Selektie zal plaatsvinden via vergelijking van binding aan getransformeerde fibroblasten met binding aan niet-getrans­formeerde fibroblasten. Positieve hybridomen zullen -verder geselekteerd worden via immunoprecipitatie met een lysaat van metabool-(35S-methioni­nel-gelabelde cellen. Het geprecipiteerde antigeen zal worden gekarak­teriseerd via SDS-PAGE en autoradiografie.

II.7 Chromosoombeschadigingen en DNA-modifikaties na expositie aan alkylerende verbindingen en mitomycine C-analoga (NKI-81-7)

G.J. Menkveld'en L. den Engelse (NKI), A. Bos, A.D. Tates (R.U. Leiden)

Een aantal alkylerende verbindingen blijkt in een door Tates et al. (Mut. Res. 74: 11, 1980) enkele jaren geleden ontwikkelde ratte lever­modelsysteem tot chromosoombeschadiging the leiden. Onderzocht zijn tot op heden DMN*, DEN*, MMS*, EMS*, ENU* en mitomicine C (MMC). Het te onderzoeken agens wordt ingespoten in een rat, waarvan na verloop van 1 of meer (tot 56) dagen een deel van de lever wordt weggenomen. Nadat de resterende, levercellen zich massaal hebben gedeeld kunnen in het cyto­plasma van hepatocyten chromosoomfragmenten (micronuclei) worden waar­genomen. Behalve MMC waren 'ook DMN, DEN en ENU in staat de vorming van micronuclei te induceren. MMS en EMS waren niet aktief onder deze om­standigheden. Door het biologische effekt te vergelijken met het (m)ethyleringspatroón van lever-DNA kon worden gekonkludeerd dat, al­thans in het geval van de alkylerende verbindingen, O-alkylering veel belangrijker was dan N-alkylering. Tevens, dat niet het voorkomen van 06_a lkylguanine maar wel dat van alkylfosfotriesters (of daarmee in de tijd parallel verlopende ge(m)ethyleerde basen) redelijk korreleerde met de vorming van mikronuclei. Met name het preklastogene effekt van DEN bleek interessant: na één enkele injektie van 50 mg/kg bleef het aantal hepatocyten met een mikronucleus konstant over een periode van tenminste 56 dagen. Ook kon na 5 wekelijkseinjekties van 10 mg/kg DEN een kwanti­tatief vergelijkbaar effekt worden opgebouwd. Voor MMC werd zelfs een tweevoudige toename van het preklastogene effekt gevonden in de week na injektie, en het is de vraag of dit een weerspiegeling vormt van de om­zetting van een MMC-addukt aan DNA, b.v. de omzetting van een monovalent addukt tot een crosslink of omgekeerd, of de omzetting van een DNA-DNA cross link tot een DNA-eiwit cross link.

Er zal worden getracht de micronuclei nader te karakteriseren b.v. door in geïsoleerde hepatocyten de grootte van en de hoeveelheid DNA in een mikronucleus te bepalen. Verder zal door A. Tulp (projekt II.4) een poging worden ondernomen om mikronuclei te isoleren. Dit is van belang om te kunnen nagaan of deze mikronuclei een zeer heterogene populatie vormen of niet. Een antwoord op deze vraag kan een aanwijzing zijn voor het proces van mikronucleus-vorming: naar willekeur over de chromosomen verdeeld of met een voorkeur voor bepaalde breekplaatsen.

*Gebruikte afkortingen: DMN, dimethylnitrosamine; DEN, diethylnitrosamine; MMS, "methyl methanesulfonaat; EMS, ethyl methaan'sulfonaat; -ENU, ethylnitrosoureum.

11

Omdat er een reële kans bestaat dat vorming van mikronuclei samenhangt met het optreden van breuken en/of crosslinks in DNA, zal in 1984 met behulp van filterelutie-methoden gekeken worden naar het optreden van enkelstrengsbreuken, dubbelstrengsbreuken en cross links zowel tussen twee DNA strengen onderling als tussen DNA en eiwit. Het voordeel van deze filterelutie, die zowel onder alkalische als neutrale omstandighe­den kan worden uitgevoerd, is dat slechts kleine aantallen cellen (~106) benodigd zijn. Om omslachtige fluorescentiemetingen in de geëlueerde frakties te vermijden is het van groot belang te kunnen beschikken over een immunologische methode ter bepaling van g-hoeveelheden DNA. Voor het opzetten van een dergelijke immunologische bepaling zal worden samengewerkt met dr. C.J. van der Laken (projekt II.6). De door'Kohn ontwikkelde elutiemethode (in: Friedman en Hanawalt, DNA Repair, Marcel Dekker, Inc., New York, 1981) zal allereerst gebruikt worden met in vitro gekweekte cellen, die met alkylerende agentia zijn behandeld en vervolgens toegepast op hepatocyten van met MMC en MMC­analoga behandelde ratten. Deze analoga zullen worden gesynthetiseerd door de groep van Prof. Dr. Ir. D.N. Reinhoudt (TH-Twente). De klasto­gene eigenschappen zullen worden onderzocht door dr. A.D. Tates (R.U. Leiden) . Bovengenoemde DNA-elutietechniek is ook bruikbaar voor het bepalen van eventuele effekten van andere DNA-brekers en crosslinkers. Samen met drs. J. van Maanen (projekt VIII-7, NKI 81-15) zullen de als chemo­therapeutica interessante podophyllotixine-derivaten VP 16-213 en VM 26 worden onderzocht. Met Dr. V.J. Feron (CIVO-TNO) zullen cross links van DNA in gekweekte cellen en, indien technisch realiseerbaar, ook in epi­theelcellen'van de ratteneusholte, onder invloed van formaldehyde en aceetaldehyde worden onderzocht. Eventuele effekten op DNA kunnen inzicht verschaffen in het mechanisme waarbij deze aldehyden tumoren in de neusholte veroorzaken. Tenslotte zal de mogelijkheid worden nagegaan om de ·filterelutietechniek toe te passen op lymfocyten en middels sedimentatie technieken gefraktioneerde (lever)celpopultaties.

Door dr. C. Heyting is een immunohistochemische methode uitgewerkt om 06-ethylguanine addukten te bepalen in histologische coupes van ratte­hersenen. Deze methode is inmiddels overgenomen in het huidige projekt, waarbij voor enkele alkylerende agentia (DEN en ENU) na wordt gegaan of er verschillen in DNA-binding en herstel bestaan tussen de in lever voorkomende celtypen onderling en tussen centrolobulaire en perifeer­lobulaire hepatocyten. Onderzocht zal worden wat de verdere technische mogelijkheden van deze lokalisatiemethoden zijn. In principe zijn zeer interessante mogelijkheden aanwezig voor lokalisatie van carcinogeen­DNA addukten in doelwitcellen, met name in die organen die door hun geringe omvang of grote heterogeniteit niet met de thans beschikbare methoden onderzocht kunnen worden.

12

SEKTIE lIl. CEL BIOLOGIE

III.l. Veranderingen in molekulaire samenstelling en dynamiek in het plasmamembraan van turnorcellen in relatie tot extracellulaire omgeving

In dit projekt wordt vergelijkend onderzoek gedaan aan (geïsoleerde) plasmamembranen van normale- en tumorcellen, in het bijzonder die van het leverhepatoom in het lymfoïde celsysteem. De nadruk wordt hierbij gelegd op de lipide-samenstelling en vloeibaarheid omdat dit van invloed is op het gedrag van de cellen en de expressie aan hun oppervlak. De extracellulaire omgeving, in het bijzonder de samenstelling van de plasma lipoproteinen is hiervoor ook van belang.

III.la Vergelijkende biochemie van plasmamembranen van normale- en tumorcellen (voorheen projekt III.l)

R.P. ·van Hoeven, G.M. Hengeveld, R.B. Pastoors, m.m.v. W.J. van Blitterswijk, H.A.M. Hilkmann en P. Emrnelot.

In dit projekt staan de isolatie van het plasmamembraan van normale en neoplastische cellen c.q. weefsels en de karakterisering daarvan met biochemische, biofysische en enzyrrologische methoden centraal. Een be­langrijk onderdeel is de bestudering van de lipide matrix, in het bij­zonder de lipidevloeibaarheid. Daarnaast worden samenstelling en eigenschappen van de glycolipiden onderzocht. Voorts worden aspekten van tumorprogressie en tumorpromotie bestudeerd voor zover deze zijn te relateren aan plasmamembraan-veranderingen . • Recent is door ons het begrip membraanvloeibaarheid opnieuw gedefi­nieerd en wel als het omgekeerde van de lipide ordeparameter zoals gemeten met fluorescentie polarisatie aan diphenylexatrieen (DPH"j. Getracht zal nu worden de relatie met de samenstellende lipideklassen exact vast te legen. Wanneer men intakte cellen labelt met fluorescente lipideprobes van het type DPH, verkrijgt men een gewogen gemiddelde van de fluorescentie polarisatie van alle lipide-pools. Er zijn in principe twee mogelijk­heden om de bijdragen van celinhoud en plasmamembraan te scheiden: 1) het gebruik van meer polaire probes die een strikt beperkte verdeling ten gunste van het celoppervlak hebben en 2) toevoeging van een tot het celoppervlak beperkte dovende stof, die via "non-radiative energy transfer" de plasmamembraan-bijdrage van DPH dooft. De reeds aangevangen experimenten met het trimethylamino-DPH zullen worden uitgebreid met onder·zoek aan 1-stearoyl, 2- "in -parinaroyl phosphatidylcholine. Als quenchers zullen bixine (gekoppeld aan glucosamine) en trinitrobenzeen­sulfonzuur worden bestudeerd. Bij slagen van deze opzet kan reeds met ca. 10 7 cellen de plasmamembraanvloeibaarheid worden bepaald, d.i. met ca. 1% van de hoeveelheid die nodig is om voldoende membraanmateriaal te isoleren. Een ander voordeel is dat geen selectie plaats kan vinden, zoals dat tijdens de isolatieprocedure kan optreden. Geschatte tijdsduur 1 jaar.

13

• Glycolipiden kunnen een rol spelen bij cellulaire interakties, diffe­rentiatie en oncogenese. In geisoleerde plasmamembranen van Novikoff asciteshepatoomcellen vonden wij gesubstitueerde cerebrosiden en lacto­sylceramiden die Jvoor zover ons bekend) niet in de literatuur zijn beschreven. Ook in Sprague Dawley ratte lever-plasmamembranen vonden wij soortgelijke glycolipiden, echter in andere koncentraties en naast de normale niet-gesubstitueerde glycolipiden. Nadere bestudering d.m.v. chromatografische en andere technieken is nodig om te kunnen vaststellen in hoeverre hier van een nieuwe klasse glycolipiden kan worden gesproken. Hierbij zullen ook andere hepatomen en lymfoide cellen worden betrokken. Geschatte tijdsduur 2 jaar .

• Er bleek gedurende de natuurlijke historie van het enthepatoom T143066 een korrelatie te hebben bestaan tussen de steeds snellere groei ener­zijds en het geleidelijk verlies aan funktioneel celkontakt, het ver­loren gaan van N-glycolylgroepen op het voornaamste ganglioside, het langzaam verdwiinen van 5' nucleotidase aktiviteit en alkalische fosfo­diesterase aktiviteit en veranderingen in de fosfolipide samenstelling van de plasmamembranen anderzijds. Deze bij toeval ontdekte expressie op het celoppervlak van tumorprogressie zal thans meer doelgericht wor­den vervolgd aan een uit vloeibaar stikstof opgekweekte 36e transplan­tatie generatie (sublijn S). De oorspronkelijke tumor is thans in de ca. 200 e transplantatie generatie. Hiernaast zullen spontane hepatomen en hieruit reeds ontwikkelde langzaamgroeiende ent-hepatomen (ca. 2Se transplantatie) worden onderzocht. Als verdere parameters zullen de membraanvloeibaarheid, het Na+-K+-ATPase en de d.m.v. elektronenmikros­kopie bepaalde morfologie (zowel in situ als van het geisoleerde plasmamembraan-preparaat) worden onderzocht. Geschatte tijdsduur: Incidentele onderzoekingen, uitgesmeerd over een aantal jaren .

• Een van de wegen, waarlangs tumorpromoters van het phorbolester-type hun werking uitoefenen, zou verlopen via aktivering van het plasmamem­braan-enzym fosfolipase A2. Het hierbij vrijkomende vetzuur arachidon­zuur is de precursor van prostaglandines. Uit ons werk kan niet worden gekonkludeerd dat forbolmyristaatacetaat (PMA, TPA), in vitro toegevoegd in diverse koncentraties, enige invloed heeft op de enzym-aktiviteit van geisoleerde plasmamembranen van levers en hepatomen als radioaktief arachidonzuur-bevattend fosfolipide als exogeen substraat wordt aange­boden. Plasmamembranen, geisoleerd uit levers van dieren die van tevoren waren behandeld met TPA, 2 uur vóór een top in de ornithine decarboxy­lase aktiviteit in de lever aanwezig was, gaven geen verschil met kontroles met inaktieve forbolester en onbehandelde dieren. Wij veron­derstellen dat de uitwisselingsreaktie tussen exogeen (radioaktief) substraat en de eigenlijke fysiologische substraatpool snelheidsbepalend was. De experimenten zullen daarom worden herhaald met natieve membranen en meting van de afgesplitste vetzuren met capillaire gaschromatografie. De detektiegrens hiervan is per vetzuur ca. 1 nanogram. Geschatte tijdsduur: 1-2 jaar.

Afhankelijk van de honorering van het aangevraagde'projekt NKI-83-23 zullen akute effekten van forbol en f9rbolesters op cellen en plasmamem­branen wo'rden bestudeerd als veranderingen van de lipidevloeibaarheid. De te bestuderen systemen zijn o.a. 3T3 cellen die door TPA tot proli­feratie, en HL60 cellen die juist tot differentiatie worden aangezet (zie voor nadere bijzonderheden betreffende dit laatste systeem projekt III. 2).

III.1b Veranderde lipide-vloebaarheid en expressie in het celoppervlak bij leukemie (voorheen projekt ~II.S)

W.J. van Blitterswijk, P. Emmelot, H.A.M. Hilkman, J.M.M. de Widt

. De lipide-vloeibaarheid in het plasmamembraan van GRSL asci tes cellen kan

14

, in vitro worden verlaagd door inkubatie met cholesterylhemisuccinaat (CES) in een medium met polyvinylpyrrolidon. De~e membraanrigidisering heeft tot gevolg dat de expressie van sommige o~pervlakteantigenen, waaronder H-2 en het MLr tumorantigeen wordt verhoogd. Er zal worden nagegaan hoe stabiel deze door CHS geïnduceerde verandèringen zijn, o.a. in aanwezig­heid van bloed- en ascitesplasma, en of dit gebruikt kan worden voor immunotherapie. Hiertoe worden cellen beh~ndeld met CHS, vervolgens bestraald (blokkeert verdere celdeling) en als immunogeen ingespoten bij proefdieren. Dit principe kan eventueel odk bij andere typen tumoren worden toegepast, bijvoorbeeld bij lymfos~rcoom en mammacarcinoom.

I De eigenschappen van het tumorceloppervlak worden mede bepaald door de extracellulaire omgeving. Zo hebben plasmkmembranen van GRSL tumorcellen geïsoleerd uit de milt een aanzienlijk ho~ere lipide-ordeparameter (hoger cholesterol- en sphingornyelinegehalte) dan die van GRSL ascitescellen. Ook de expre'ssies van een aantal oppervlakte antigenen geven verschillen te zien, die met de FACS nader gekwantifiteerd zullen worden; Er zal worden nagegaan of er in de diversè tumorcelpopulaties, eventueel na toepassing van celscheidingstechnieken l (dr. A. Tulp), een korrelatie bestaat tussen de membraan-lipide-vloeibaarheid, de expressie van anti­genen en enkele funktionele eigenschappen, zoals de gevoeligheid voor cytolyse als gevolg van immunologische interakties. Er zal worden nagegaan of, en in welke mate "shedding" van membraan­blaasjes ook plaats vindt bij GRSL tumorcellen in de leukemische milt: Er zal worden getracht nader inzicht te krijgen in de mechanismen die leiden tot de veranderde cholesterol verdeling in lymfoïde organen en lichaamsvloeistoffen bij leukemische muizen, en de betekenis hiervan. De cholesterolbiosynthese in de diverse celtypen zal nader worden ge­kwantificeerd aan de hand van het snelheidsbepalende enzym HMG-Q:oA reductase. Geschatte duur van dit projektonderdeel: tot eind 1985.

III.lc Plasma lipoproteinen in relatie tot kanker (projekt NKI 81-9)

J. Damen, J. van Ramshorst, R.P. van Hoeven, W.J. van Blitterswijk

De lipide-vloeibaarheid in het plasmamembraan van normale en tumorcellen wordt mede bepaald door interakties met de extracellulaire plasma­lipoproteinen. Tijdens de groei van de GRSL ascites tumor in GR muizen, voltrekken zich opvallende veranderingen in de lipide- en lipoproteine-samenstelling van het bloedplasma. Het cholesterolgehalte neemt sterk af en weerspie­gelt daarmee het bijna volledig verdwijnen van de high density Upoproteins (HDL). De oorzaak hiervan zal worden onderzocht, met name het effekt van de tumorgroei op de aktiviteit van de drie belangrijkste enzymen die betrokken zijn bij het HDL metabolisme, nl. het lecithine: cholesterol­acyltransferase, het lipoproteine lipase en het leverlipase. Tevens zal worden onderzocht welke effekten verhoging van het cholesterolgehalte van plasma (door middel van een cholesterolrijk dieet of door intra­veneuze of intraperitoneale toediening van cholesterolrijke lipoprotein­en of cholesterol-albumine emulsies) heeft op het lipoproteine metabo­lisme tijdens ,de tumorgroei, en of die gepaard gaan met veranderingen in de lipide-samenstelling en de vloeibaarheid van de plasmamembranen van tumorcellen.

In Sprague-Dawley ratten met een Novikoff ascites hepatoom voltrekken veranaeringen in de plasma lipoproteinen zich langs een andere weg: het gehalte aan triglyceriden en very low density Upoproteins (VLDL) in het bloedplasma gaat sterk omhoog en bereikt 7 dagen na inoculatie van de ~umor een drie- tot vijfmaal hogere koncentratie dan 'normaal; het gehal­te aan HDL is slechts weinig lager dan normaal. Het ascitesplasma bevat eveneens HDL maar is volledig gedepleteerd van zowel LDL als VLDL. Dit kan wijzen op een gretig gebruik van deze lipoproteinen door de tumor-

15

cellen in de ascites. Omdat er uit de literatuur slechts we~n~g en dan nog tegenstrijdige gegevens bekend zijn over de interaktie van VLDL met tumorcellen, willen we volgend jaar beginnen met een onderzoek naar het mechanisme van deze interakties. Geschatte duur van'dit projektonderdeel: tot eind 1984.

III.1d Liposomen als drug carriers in de experimentele chemotherapie (projekt NKI 83-3)

W.J. van Blitterswijk, R.P. van Hoeven

Afhankelijk van de beoordeling en honorering van dit KWF-projekt zal een onderzoek worden gestart om de mogelijkheden van liposomen als drug carriers voor de behandeling van kanker na te gaan. Hiertoe zullen cel­lijnen van de humane "smalI cell cancer of the lung" (SCCL) als model worden gebruikt.

111.2 Tumor glycoproteinen

III.2a Glycoproteinen in het celoppervlak van normale en tumorcellen

W.P. van Beek en Géke J. Blanken

Maligne getransformeerde cellen worden over het algemeen gekarakteri­seerd door een verandering in samenstelling of struktuur van fucosyl glycopeptiden op het celoppervlak. Deze verandering bestaat uit een vergroting van oligosaccharidestrukturen die via de gelfiltratie tech­niek gemakkelijk aantoonbaar is. Deze strukturen worden daarom snel eluerende of maligne gerelateerde glycopeptiden genoemd. Met behulp van HL-60 cellen, afkomstig van een patient met een akute promyelocyten leukemie, is onderzocht hoe deze oligosaccharidestruktuien zich gedragen tijdens het proces van differentiatie. HL-60 cellen in vitro kunnen namelijk geïnduceerd worden tot differentiatie, waarbij veel eigenschap­pen van normale cellen tot expressie komen. Na de differentiatie blijven de maligne gerelateerde glycopeptiden echter onveranderd aanwezig, zodat gekonkludeerd is dat. het differentiatie stadium als zodanig niet bepa­lend is voor het voorkomen van deze klasse van glycopeptiden op de cel­membraan. Fucosyl glycopeptiden van granulocyten en van HL-60 cellen voor en na differentiatie zullen nu in grote hoeveelheid worden geïso­leerd en gezuiverd. De struktuur zal bepaald worden met o.a. hoogfrequen­te 1H-NMR, zoals beschreven voor het BHK/Py-BHK systeem (zie Annual Report 1981, pg. 111.2-30). Gezuiverde glycopeptiden zullen dan eveneens beschikbaar zijn voor het verkrijgen van monoclonale antilichamen. Dit laatste in samenwerking met dr. A. Kolk. Dit onderzoek is ten dele reeds vermeld in het werkplan 1983. Door organisatorische problemen bij de NMR metingen in Utrecht is echter een vertraging in het onderzoek ontstaan van een jaar. De verwachting nu is dat bovengenoemd onderzoek zeker tot 1986 zal doorlopen.

Uit gezond beenmerg (BM) z~Jn met grote zuiverheid myeloïde cellen geïsoleerd die van elkaar verschillen wat betreft de mate van rijping. Promyelocyten blijken fucosyl glycopeptiden op het celoppervlak tot expressie te brengen die vrijwel gelijk zijn aan die van polymorfonu-' cleaire (PMN) cellen uit het perifere bloed (PBI). Ook hier blijkt dus dat maligne gerelateerde glycopeptiden geen direkt verband hebben met het onrijpe celtype. Op het celoppervlak van rijpe PMN cellen geïsoleerd' uit gezond BM daarentegen zijn echter zeer verrassend maligne gerela­teerde glycopeptiden aangetoond Het verschijnen van maligne gerelateerde glycopeptiden op een normaal celóppervlak is in verband gebracht met een fysiologisch gebeuren waarbij het verbreken van intercellulaire kontak­ten een rol spelen. Bij witte bloedcellen lijkt dit proces essentieel om de overgang van rijpe cellen van het BM naar het PBI compartiment

16

mogelijk te maken. Bij maligne cellen verloopt dit proces vermoedelijk voortijdig en irreversibel. Om dit gebeuren verder te bestuderen zal uit PBl en BM van patienten met een bakterie infektie, waarbij onrijpe cel­len van de myeloïde reeks in het PBl verschijnen, myeloïde cellen geïsoleerd en onderzocht worden op het al of niet voorkomen van maligne gerelateerde glycopeptiden. Verder zal de mogelijkheid onderzocht worden om het onderzoek voort te zetten aan een proefdiermodel, waarbij de muis met het genotype SLjSLd, die in zijn myelopoiese gestoord is, een moge­lijke kandidaat is. De onderzoeksduur zal naar verwachting 2 jaar bedragen.

De hematopoietische starncel bezit de mogelijkheid zich tot verschillende bloedcellen te ontwikkelen zoals tot een erytrocyt, een granulocyt, een" lymfocyt etc. Eenmaal aangekomen op het punt van de zgn. "cornrnitted" starncel is deze mogelijkheid van differentiatie tot verschillende bloed­cellen beperkt. Afhankelijk van het ontwikkelings stadium waarin een beschadiging optreedt, zoals bij leukemie, kunnen één of meerdere ont­wikkelingslijnen zijn aangedaan. Zo zal in het geval van een akute myelomonocyten leukemie, mogelijk wel de monocytaire maar niet de granu­locytaire reeks maligne getransformeerd zijn. Dit laatste resultaat heb­ben we kunnen vaststellen in een "pilot" experiment waarbij verschillen­de PBl en BM cellen van een leukemiepatient geïsoleerd werden. In geval van - een chronische myeloïde leukemie is de starncel beschadigd en valt te verwachten dat behalve de myeloïde ook andere bloedcellen in bepaalde mate veranderd zullen zijn. Van een aantal leukemiën zullen de verschil­lende Bl en BM na isolatie (in samenwerking met dr. A. Tulp) op hun glycopeptiden worden onderzocht. Dit onderzoek zal, gezien het beperkte aanbod van geschikte leukemiën, zeker 2 jaar vergen.

III.2b Membraankoolhydraten van turnorcellen en celinterakties (voorheen III.3b)

A. Smets en H. van Rooy

Cellen geïsoleerd uit tumoren en cellen na oncogene transformatie in vitro vertonen veranderingen in de struktuur van de fucose-bevattende koolhydraatunits die het extra-cellulaire deel vormen van de integrale membraanglycoproteinen. Deze verandering in moleculen betrokken bij processen van celherkenning en cel-cel interakties, is de meest konse­quente fenotypische verandering geassociëerd met maligniteit en onder­werp van studie sedert 1972 (zie ook projekt III.2a). In dit projekton­derdeel wordt vooral aandacht besteed aan de konsequenties van verander­de membraan koolhydraten voor het biologisch gedrag van de tumorcel. Uitgangspunt is de waarneming dat de tumor-geassocieerde veranderingen de vorming van funktionele kontakten belemmeren (Smets, Enninga en van Rooy, Exp. Cell Res., 139: 181, 1982) en specifiek gekorreleerd zijn met het turnorigene vermogen van getransformeerde cellen (De Ley, Smets, Jochemsen en van der Eb, Virology, 121: x-x, 1982). In aansluiting op deze studies zullen de volgende onderwerpen worden bestudeerd:

a) Membraankoolhydraten en gevoeligheid voor "natural killer (NK) cells".

NK cellen vormen een subpopulatie van lymfocyten die in staat zijn om de meeste tumorcellen en sommige normale cellen spontaan te doden. Aan NK cellen wordt een rol toegekend in de immuunbewaking en het doden van metastaserende cellen. Het cytolytisch proces berust op herkenning van een (glycoproteine) receptor gevolgd door de vorming van cytoplasma­tische verbindingen. Vanwege de overeenkomst met andere processen van funktionele celkontakten waarbij membraankoolhydraten een rol spelen (zie boven) zal modulatie van de gevoeligheid voor NK cellen door deze strukturen zeer wel mogelijk zijn. Uit hamster A3 cellen kunnen fenotypische varianten worden geïsoleerd die verschillen in de mate van struktuurverandering van het membraan-

17

koolhydraat, in een reeks van normaal tot "supermaligne". Deze varianten worden getest op hun relatieve gevoeligheid voor NK cellen in kolonie­vorming en uridine inbouw. Vervolgens zullen geïsoleerde membraanglyco­peptiden worden o~derzocht op hun vermogen om deze reaktie te beïnvloe­den. Op deze wijze willen wij onderzoeken of veranderingen in gevoelig­heid voor NK lysis berusten op veranderingen in de receptor struktuur dan wel op interferentie van veranderde membraanglycoproteinen met af­zonderlijke stappen van het cytolytisch proces.

b) Membraankoolhydraten en infiltratieve groei (in samenwerking met dr. M. Mareel, Gent)

Tumorcellen zijn in staat tot infiltratieve groei en dus niet onderwor­pen aan topoinhibitie. Uit de literatuur is niet bekend of tumor-geasso­cieerde veranderingen in membraankoolhydraten een rol spelen bij het ontsnappen aan topoinhibitie. Wij willen deze fundamentele vraagstelling benaderen in het model van invasie van embryonale kippen hartcellen dat door dr. Mareel werd ontwikkeld. In dit model worden variante fenotypen getest. In andere modellen zal het effekt van modifikatie van het cel­oppervlak (glycosyleringsremmers, enzymatische modifikatie, temperatuur­gevoelige mutanten) worden onderzocht.

Geschatte duur: Het ligt in de bedoeling beide projektonderdelen in de loop van 1984 af te ronden.

111.3 Genetische kontrole van getransformeerde groei

J.G. Collard, J.W.G. Janssen*, J.F. Schijven, A.C.M. Steenvoorden* en E.J. Philippus (20%)

In samenwerking met projekt 11.4 is een methode ontwikkeld om grote hoeveelheden metafase chromosomen op grootte te scheiden door middel van 30xg sedimentatie. Indien noodzakelijk kunnen deze voorverrijkte chromo­soomfrakties verder gezuiverd worden door middel van flow sorting (zie o.a. Collard et al., Exp. Cell res. 130: 217, 1980; 133: ~41, 1981). In voorgaand onderzoek werd DNA van gefraktioneerde chromosomen gebruikt om strukturele genen van de rat te lokaliseren op rattechromosomen door middel van filterhybridizatie (Collard et al., Exp. Cell Res. 137: 463, 1982). Op dezelfde manier zijn we in staat genen, geïntroduceerd in cellen, te lokalizeren in het genoom van de gastheercel. De resultaten wijzen uit dat geïntroduceerde genen en cogetransfekteerde DNA sequen­ties gezamenlijk integreren op één plaats in het genoom van de gastheer­cel. Het chromosoom waarin de integratie plaatsvindt kan verschillen en is afhankelijk van welke transfektant bestudeerd wordt.

In toekomstige experimenten zal DNA, geïsoleerd uit gefraktioneerde chromosomen getest worden op bruikbaarheid voor DNA transfektieëxperi­menten. In eerste instantie zullen deze experiment~n uitgevoerd worden met DNA geïsoleerd uit gefraktioneerde chromosomen van thymidine kinase (tk+) transfektanten waarin het geïnt~oduceerde tk gen biochemisch gelokaliseerd is op het DNA van chromosomale frakties. Vervolgens willen wij deze techniek toepassen in morfologische transformatie experimenten. Misschien is het op deze manier mogelijk specifieke chromosoom trans­lokaties in bepaalde tumoren (b.v. Burkitt lymphoma, CML) te korreleren met het transformerend vermogen van DNA afkomstig van deze translokatie­chromosomen. Deze transformatie- of oncogenen kunnen worden gekloneerd en nader bestudeerd. (Verwachtte duur van dit projekt onderdeel 2-3 jaar").

"*KWF-projekt 81-6

18

NIH 3T3 cellen worden morfologisch getransformeerd met HL-60 tumor DNA afkomstig van een patiënt met akute promyelocytische leukemie. In samen­werking met projekt IIL 2 (W. van Beek) zullen deze transfektanten onder­zocht worden op veranderingen in samenstelling van fucosyl glycopeptiden op het celoppervlak. Gehoopt en verwacht wordt dat de HL-60 karakteris­tieke maligne gerelateerde glycopeptiden verschijnen op het celopper­vlak van de morfologisch getransformeerde NIH 3T3 cellen. Dit zou be­tekenen dat de genetische informatie welke direkt of indirekt verant­woordelijk is voor de expressie van deze maligne glycopeptiden gelntroduceerd is in muizecellen. Deze genen (oncogenen?) kunnen weer via sekundaire transfektie experimenten en eventueel na chromosoomfrak­tionering worden gekloneerd en nader worden bestudeerd. Misschien is het op deze manier mogelijk de genen verantwoordelijk voor de expressie van de maligne gerelateerde glycopeptiden op het celoppervlak van tumorcel­len te karakteriseren. Tevens zal onderzocht worden of DNA afkomstig van terminaal gedifferentieerde HL-60 tumorcellen nog in staat is morfolo­gische transformatie te veroorzaken. Zo niet dan is dit een interessant systeem om'de regulatie en expressie van transformatie of oncogenen te bestuderen. (Duur van dit projektonderdeel 2-4 jaar).

In samenwerking met Prof. P. Pearson (Leiden) en Prof. D. Bootsma (Rotter­dam) wordt getracht cosmide genenbanken te konstrueren van individuele humane chromosomen. Hierbij wordt o.a. uitgegaan van mens-muis celhybri­den welke slechts 1 humaan chromosoom bevatten. Via de chromosoom fraktioneringsprocedure en eventueel chromosoom sortering wordt dit humane chromosoom verrijkt. Het DNA wordt vervolgens partieel geknipt waarna + 40 Kb DNA fragmenten worden gekloneerd in cosmiden. Deze benadering heeft het voordeel dat met behulp van repetitieve DNA sequen­ties de humane- en muizeklonen herkend kunnen worden. Bovendien overlap­pen de klonen elkaar door het partieel knippen, zodat de banken voor "chromosome walking" kunnen worden gebruikt. Na het oplossen van proce­durele moeilijkheden, veroorzaakt door de kleine hoeveelheden beschik­baar DNA, zal het accent worden gelegd op het konstrueren van genen banken van individuele humane chromosomen en translokatie chromo-somen welke verondersteld worden een rol te spelen bij het ontstaan van bepaalde tumoren. (Verwachtte duur van dit projektonderdeel 2-4 jaar.)

III.4 Tumorcelmembraan en metastasering

III.4a Adhesiemechanismen in relatie tot invasie en metastasering

E. Roos, O.P. Middelkoop, I.V. van de Pavert & P. van Bavel

Ons doel is mechanismen van invasie en metastasering op te helderen. Het gebruikte model is de invasie van leverweefsel door tumorcellen vanuit de bloedbaan. Na onderzoek in de intakte lever wordt dit nu voornamelijk bestudeerd in kultures van gelsoleerde hepatocyten en leverendotheel­cellen. De nadruk ligt op mechanismen van adhesie tussen tumorcellen en deze levercellen. Onze waarnemingen doen ons veronderstellen dat deze mede bepalend zijn voor vorm en uitgebreidheid van leverinvasie. Adhesiemechanismen bleken te verschillen voor MB 6A lymfosarcoomcellen vergeleken met TA3 mammacarcinoomcellen, zowel op het niveau van de betrokken mernbraankomponenten op levercellen als van de benodigde intra­cellulaire processen. Endotheelcellen bleken wel te hechten aan MB 6A, maar niet aan TA3 cellen, hetgeen het grote verschil in invasief ver­mogen in de lever zou kunnen verklaren (voor meer details zie Annual Report 1982, III.4al.

\'lij beschikken nu over meerdere antisera, gericht tegen tumorcellen en tegen verschillende frakties var. leverplasmamembranen , die de interaktie tussen tumorcellen en levercellen remmen. Met behulp hiervan worden de betrokken membraankomponenten gezuiverd. Een deel van dit werk, vooral aan tumorkomponenten, geschiedt op basis van KWF-projekt NKI 80-6

19

(O.P. Middelkoop & P. van Bavel). Doel van dat projekt is het verkrijgen van specifieke antisera gericht tegen de tumorkomponenten, die efficiënt de adhesie kunnen remmen, en wellicht ook invasie en metastasering in vivo. De specifieke antisera, zowel tegen de tumor- als de lever­cellulaire adhesiemolekulen (CAM's) zullen gebruikt worden ter bepaling van lokalisatie en dichtheid van deze CAM's op diverse celtypen en de strukturele relatie met het membraancytoskelet (zie III.4c), voorname­lijk met EM-technieken. Neoplastische cellen zullen vergeleken worden met bijbehorende normale cellen. De eerste specifieke antisera zullen naar verwachting in de loop van 1983 beschikbaar zijn. Het beschreven onderzoek zal niet voor eind 1985 beëindigd zijn.

Op basis van remming door verschillende drugs is gebleken dat adhesie van hepatocyten aan lymfosarcoom-, maar niet aan mammacarcinoomcellen, afhankelijk is van tubuline en van het Ca-metabolisme. Er zijn paralel­len met processen volgend op binding van bepaalde hormonen aan cellen. Dit zal nader onderzocht worden met behulp van bekende remmers voor specifieke stappen in deze processen. De mogelijke rol van bepaalde, met Ca-gestuurde processen samenhangende reakties, zoals verhoogde turnover van fosfatidylinositol of verhoogde methylering van fosfatidylethanola­mine, zal worden onderzocht in samenwerking met 111.1. Ook hier zullen tumorcellenvergelekenworden met bijbehorende niet-neoplastische cellen. Het testen van diverse drugs in ons modelsysteem zal worden voortgezet, opdat met name over de intracellulaire processen betrokken worden bij de adhesie van TA3 cellen meer aanwijzingen beschikbaar komen.

Afhankelijk van toewijzing van subsidie op het aangevraagde KWF-projekt NKI 83-13 zal het onderzoek worden voortgezet aan interakties tussen tumorcellen en levermakrofagen (Kupffercellen), en de mogelijke akti­vering van de anti-tumoraktiviteit van deze makrofagen.

Het opzetten van in vivo levermetastaseringsmodellen zal worden gekoördineerd met dr. P. de Graaf.

III.4b De rol van domeinen in het plasmamembraan bij de metastasering

C.A. FeItkamp (55%); A.W.M. van Waarden

Een belangrijke stap bij het proces van metastasevorming in de lever is adhesie tussen tumorcellen en hepatocyten. Uit onderzoek binnen III.4a is gebleken dat de adhesiemechanismen van hepatocyten met respektieve­lijk lymfosarcoomcellen en TA3 mammatumorcellen verschillen. Ook morfo­logisch onderzoek naar veranderingen in het vlak van de membraan toonde verschillen tussen beide systemen. In het geval van TA3 cellen werden er op de plek van adhesie complexe junctions, in de vorm van vreemde concentrische tight-junction strands, gevormd. Deze komen morfologisch overeen met komplexen tussen TA3 cellen onderling, en verschillen van die tussen hepatocyten. Hier wordt door de turnorcel een verandering gelnduceerd in het vlak van een deel van de hepatocytmembraan. Bij in­teraktie.tussen .MB 6A lymfosarcoom cellen met hepatocyten werden met behulp van vriesklieftechnieken geen veranderingen in het vlak van de membraan waargenomen.

Bij het morfologisch onderzoek naar interaktie van cellen bij adhesie wordt het ac~, lt gelegd op 2 facetten:

• veranderingen in het vlak van de membraan Met behulp van de vriesklieftechniek wordt door het proces van junc­tion-vorming tussen TA3 cellen en hepatocyten en de invloed daarop door stoffen die de adhesie en de daarop volgende infiltratie be ln­vloeden (zie III.4al onderzocht. Hierbij wordt ook aandacht gegeven aan verspreiding van cholesterol in de adhesie domeinen, daar bekend is dat fluiditeit en cholesterol-gehalte adhesie processen in het

20

l

algemeen kunnen beïnvloeden. Dit onderzoek kan waarschijnlijk begin 1984 worden afgesloten.

• verspreiding van adhesiemolekulen en/of -receptoren De hoeveelheid, beweeglijkheid en daardoor de mogelijkheid tot veran­deringen in koncentratie van deze molekulen op bepaalde gebieden van het celoppervlak zijn waarschijnlijk belangrijke faktoren bij adhesie en de daarop volgende interaktie tussen cellen. Voor dit onderzoek zijn specifieke antisera tegen deze molekulen nodig. Zolang deze nog niet beschikbaar zijn voor onderzoek aan de metastase modellen (zie III.4a en b) zal dit onderzoek worden gestart aan de hand van een ander model. In samenwerking met IV. la (Spits en de Vries) zal de adhesie tussen cytotoxische T cel klonen en hun specifieke targetcel­len worden onderzocht. Dit systeem heeft zeer veel overeenkomsten met adhesie tussen MB 6A cellen en hepatocyten (o.m. vergelijkbare reaktie op remmers). In dit model zijn wel zeer specifieke celoppervlak mole­kulen bekend die bepalend zijn voor adhesie; bovendien zijn specifiek hiertegen gerichte (monoklonale) antisera beschikbaar. Met behulp van immuno-EM technieken zal verspreiding van deze mole­kulen vóór en tijdens adhesie, en met en zonder remmers, worden onderzocht. Mogelijk moet dit gedaan worden met nieuw te ontwikkelen immuno-vriesklieftechnieken,waarbij het adhesie-domein wordt "open~ gebroken". -

III.4c De rol van het membraan-geassocieerde cytoskelet bij de metas­tasering en de receptor gestuurde endocytose

D.A.M. Mesland, H. Spie Ie

MB 6A lymfosarcoma cellen en TA3 mammatumor cellen hechten aan mono lagen van geïsoleerde hepatocyten en infiltreren deze op een wijze die ge­lijkenis vertoont met de invasie van deze cellen in de lever. Deze celinteraktie verschilt voor beide tumorceltypen (zie III.4a). Op grond van de gelijkenis met andere cel-kontakt reakties en op grond -van de waarneming dat tubuline-bindende drugs de interaktie sterk beïnvloeden, wordt aangenomen dat het corticale cytoskelet een belangrijke rol speelt.

Doel van ons onderzoek is de betrokkenheid van het cytoskelet bij cel­kontakt en celinfiltratie aan te tonen en de onderliggende mechanismen te beschrijven.

Hiertoe is door ons ten eerste een methode ontwikkeld om cytoplasma­celmembraan associaties in de hepatocyt zichtbaar te maken. Wij toonden met de nieuwe techniek ("droogklieven") een met de membraan geassocieerd, cytochalasine B-gevoelig, filamenteus netwerk aan dat o.m. betrokken leek te zijn bij de endocytose.

Ten tweede moest niet alleen het corticale cytoskelet van de hepatocyt doch ook die van de gesuspendeerde tumorcel zichtbaar gemaakt worden. Daartoe werd qebruik gemaakt van artificiele hechting van gefixeerde cellen op poly-L-Iysine gecoate oppervlakken, waardoor ook deze cellen konden worden droog-gekliefd. Zij bleken een membraan-geassocieerd net­werk te bezitten dat onderling sterk verschilde. Tenslotte werd recen­telijk door drs. J. Traas (volontair) een techniek ontwikkeld waarmee ook de medium-gerichte kant van de gespreide hepatocyt door droogklieven gevisualiseerd kon worden.

Deze technieken stellen ons thans in staat het corticale cytoskelet van alle bij de interaktie betrokken cellen te bestuderen onder omstandig­heden die deze interaktie beïnvloeden. Dit onderzoek is reeds op gang. Echter, de visualisatie van het netwerk tijdens de interaktie zelve is vooralsnog een moeilijk probleem. Terwijl hieraan wordt gewerkt zal worden begonnen met de studie van lokale veranderingen in het corticale

21

netwerk van de hepatocyt die optreden na aanbieding van latex bolletjes (of andere dragers) gecoat met 'tumorcel plasmamembraan of gelsoleerde komponenten hiervan (in samenwerking met III.4a), ter simulatie van interaktie.

Tijdens de ontwikkeling 'van de droog-klief technieken werden gegevens verkregen over het corticale netwerk in diverse hepatoma cellen. Deze leidden tot de hyptohese dat afwijkingen in het netwerk in verband zou kunnen staan met gestoorde groeiregulatie. Een werkplan ter toetsing van

'deze hypothese werd ingediend als KWF-projekt en voorbereidende experi­menten hiertoe worden, in samenwerking met dr. R. van Wijk (Utrecht) uitgevoerd door drs. F.Wiegant op ons Instituut.

22

SEKTIE IV. TUMOR IMMUNOLOGIE

IV.la Cytotoxische T lymfocyten (CTL) klonen met auto tumor reaktiviteit: Analyse van fenotype, specificiteit en CTL en tumor targetcelstrukturen die betrokken zijn bij cytotoxiciteit

J.E. de Vries, H. Spits, M. Poelen, W. v.d. KasteeIe, B. Honing, Ph. Rümke

Het onderzoek naar de cytotoxische T lymfocyte-tumor target cell inter­aktie zal worden voortgezet en uitgebreid. Van geselekteerde melanoom patiënten zullen nieuwe CTL klonen geïsoleerd worden uit allogene mixed leukocyte cultures (MLC) en autologe mixed ieukocyte tumor cel 1 cultures (MLTC). Met name zal dit onderzoek ook worden uitgevoerd bij patiënten met meerdere huidmetastasen die volgens een klinisch protokol lokaal op de huidmetastasen met DNCB behandeld worden. Deze behandeling lijkt de prognose te verbeteren. De vraag of dit het geval is door een verbeterde cellulaire immuniteit tegen autologe tumorcellen, kan beantwoord worden door met behulp van "limiting dilution" na te gaan of het aantal precursor-CTL na DNCB behandeling toeneemt. Deze CTL klonen zullen gefenotypeerd worden en hun specificiteit zal onderzocht worden met behulp van recent ontwikkelde en nieuw te ontwikkelen monoklonale antistoffen die de CTL reaktiviteit kunnen blokkeren. Nieuwe antigenen op de CTL klonen die betrokken zijn bij de cytotoxische reaktie zullen biochemisch gekarakteriseerd worden. Monoklonale antistoffen zullen bovendien geproduceerd worden tegen reeds bestaande CTL klonen met sterke autotumor reaktiviteit. Deze monoklonale antistoffen zullen geselekteerd worden op hun kapaciteit om de cytotoxische reaktie van deze klonen tegen de autologe melanoom cellen te blokkeren. Tegelijker­tijd zullen er monoklonale antistoffen geproduceerd worden tegen de autologe melanoom target cellen. Ook deze monoklonale antistoffen zullen geselekteerp worden op hun vermogen om de cytotoxische reaktie van de CTL klonen ~egen de autologe melanoom cellen te blokkeren. M.b.v. deze monoklonalel antistoffen zullen de determinanten op de melanoom cellen, die door CTL klonen met autotumor reaktiviteit herkend worden, bioche­misch gekarkkteriseerd worden. Tenslotte zal het in vitro effekt van "biological\response modifiers" (retinoïden, vitamine E, interferon, etc.) op de expressie van deze membraan determinanten worden nagegaan.

I IV.ld Produktie en karakterisatie van monoklonale antistoffen tegen funktioneel I verschillende monocyten subpopulaties (waarvan KWF projekt NKI 81-12 een onderdeel is) .

J.E. de Vries, C.G. Figdor, J. Leemans, J. Klomp, W. Bont, Ph. Rümke

De produktie en karakterisatievanmonoklonale antistoffen die subpopula­ties van humane perifere bloed monocyten (PBM) detekteren zal worden voortgezet en uitgebreid. Van recent geproduceerde monoklonale antistof­fen zoals RUPI-1 en 5 is aangetoond dat zij voornamelijk met de meest dichte PBM subpopulatie reagéren, het·geen kan betekenen dat RUPI-I en

23

5 verschillende differentiatie stadia van PBM kunnen detekteren. Het ligt nu in de bedoeling om na te gaan of PBM in verschillende differen­tiatie stadia ook verschillen in funktie. Daarom zullen RUPI-l en 5 positieve PBM met behulp van de FAC5 gescheiden en wat betreft hun immunoregulatorische funkties vergeleken worden met de RUPI-l en 5 negatieve PBM. Omdat dr.' Figdor en dr. Bont (zie projekt 1.1) er recent met behulp van de elutriator rotor in geslaagd zijn funktioneel verschil­lende monocyten frakties uit relatief kleine volumina bloed (50 ml) te isoleren zal er een begin gemaakt worden om vergelijkbare experimenten

"met monocyten subpopulaties van tumorpatiënten uit te gaan voeren. De reaktiepatronen van anti-monocyten monoklonale antistoffen met monocyten subsets van melanoom, Hodgkin, long-, colon- en maagcarcinoom patiënten zullen bestudeerd worden, dit ook in relatie tot de stadia. Met name zullen de monocyten bestudeerd worden van die melanoompatiënten, die een monocytose hebben en/of een verhoogde opname hebben van colloïd in de milt, zoals bij lever/milt scintigrafie nogal eens het geval blijkt te zijn. Het is van belang om na te gaan of er verschuivingen t.O.V. het normale reaktiepatroon op zullen treden hetgeen een aanwij­zing voor veranderingen in monocyten differentiatie bij deze tumor patiënten zou zijn. Tevens zal nagegaan worden of veranderingen in het reaktiepatroon mogelijk korreleren met veranderde immunoregulatorische funkties van de PBM. Op deze wijze is het mogelijk om na te gaan of de zgn. defekten in PBM funkties zoals die bij deze tumorpatiënten beschre­ven zijn, inderdaad "defekten" zijn, of dat de verminderde immunoregu­latorische funkties toegeschreven moeten worden aan verschuivingen in PBM differentiatie stadia.

IV. Ie Melanoom antigenen

C. Vennegoor, F. van Buitenen, Ph. Rümke

Voor zover de biologische en de biochemische karakterisering van de monoklonale antilichamen tegen melanoom die reeds zijn gemaakt en die in 1983 nog zullen worden gemaakt niet is afgerond, zal dit in 1984 worden voortgezet. Wij rekenen erop dat, nu door de opgedane ervaring zowel de bereidingsmethode als de screeningsmethode sterk is verbeterd, wij in staat zullen zijn muize-monoklonale antilichamen te bereiden die geschik­ter zijn voor diagnostische doeleinden dan nu reeds het geval is met de reeds door ons ontwikkelde monoklonale antistof (NKI-C3) die selektief met melanomen, enkele andere tumoren en sommige benigne naevi reageert in gefixeerd weefseL Er zal worden uitgezocht in hoeve.rre m. b. v. deze monoklonale antilichamen melanoma markers in serum of urine aangetoond kunnen worden die van belang zijn voor vroeg opsporen van recidief of metastasen. Nu de enzym-immunologische test (EIA) goed loopt en ook nog gevoeliger zal kunnen worden gemaakt (5halev et al., J. Immunol. Method. 38: 125, 1980), zal dit in eerste instantie met een EIA worden gepro­beerd. Er zal worden gestart met het aantonen van melanoom-geassocieerde antigenen in immuunkomplexen van patiënten sera. Begonnen zal worden met de immuunkomplexen die door fagocytose in granulocyten gekoncen­treerd worden. Voor deze onderzoekingen zullen ook monoklonalè anti­lichame.n worden gebruikt die wij van medewerkers in EORTC verband zullen krijgen (5. Carrel, Lausanne en G. Riethmuller, München). Omdat de screening van patiënten sera voor melanoom-geassocieerde antilichamen en immuunkomplexen tot nu toe niet is gelukt, en bovendien zal moeten worden uitgezocht of de in 1983 bereide monoklonale antilichamen hiertoe geschikt zullen zijn, zal dit onderdeel van het projekt geruime tijd duren (schatting ~ jaar).

In samenwerking met Ph. Hageman (projekt X.18.3), die de antilichamen in een vroeg stadium na de fusie zal screenen op verse en gefixeerde weefsels, zullen nieuwe monoklonale antilichamen tegen melanoom worden bereid (planning voor bereiding en biologisch-chemische karakterisering 3 jaar).

24

Door HelIstrom et al. is gerapporteerd (Int. 'Cancer Congress, Seattle, September 1982) dat radio isotoop gelabelde monoklonale antistoffen tegen p97 zich in vivo bij de mens in melanoom metastasen lokaliseert. Wij hopen soortgelijke experimenten in samenwerking met anderen (H. Haisma en C.A. Hoefnagel) in een niet te verre toekomst eveneens te kunnen uitvoeren. Deze experimenten zullen de basis zijn voor immuno­therapie met monoklonale antistoffen. Zodra geschikte humane myeloom lijnen ter beschikking staan zal getracht worden hybridoma's te ontwikkelen door fusie met lymfocyten uit lymf­klieren van patiënten die wegens metastasen lymfklier dissektie onder­gaan. Hiermee wordt gehoopt humane monoklonale antistoffen te ontwikke­len waarmee nog beter dan met muize monoklonale antistoffen in de toe­komst immunotherapie bedreven kan worden,

IV.2 Membraan antigenen van leukemische en normale lymfoïde cellen

A. Hekman, J. Sein, E. Rankin*, H. IJssel**

Een belangrijk deel van het werk in dit projekt blijft het maken en karakteriseren van monoklonale antistoffen tegen membraan antigenen van leukemie en lymfoom cellen. Deze antistoffen zullen worden toegepast . voor diagnostische en zo mogelijk therapeutische doeleinden. Daar ver­wacht kan worden dat verkregen antistoffen in vele gevallen gericht zullen zijn tegen differentiatie antigenen, zullen ze ook gebruikt worden bij de bestudering van induktie van differentiatie en van cellu­laire interakties (F. Vyth, projekt X.la; J.'E. de Vries, projekt IV.l). In samenwerking met F. Vyth (projekt X.la) is begonnen met het maken van een aantal monoklonalen tegen tumorcellen van verschillende patiën­ten met non-Hodgkin lymfoom. Deze serie zal worden uitgebreid. De speci­ficiteit van de'verkregen antistoffen wordt getest op verschillende typen lymfoom, op normale weefsels en op andere tumoren. De betreffende antigenen worden gekarakteriseerd d.m.v. immunoprecipitatie en polyacry­lamide gel elektroforese. In het kader, van een KWF fellowship tracht H. IJssel cytotoxis'che T cel (CTL) klonen te genereren tegen maligne lymfoom, meer in het bijzonder in de autologe situatie. Dergelijke CTL klonen zullen gebruikt worden om: a. te bestuderen welke determinanten zowel op de CTL klonen als op de

lymfomacellen een rol spelen in de herkennings- en cytotoxische reaktie,

b. na te gaan of er in het serum van lymfoompatiënten faktoren voorkomen die de cytotoxische reaktie kunnen beïnvloeden,

c. na te gaan of deze specifieke CTL klonen eventueel gebruikt kunnen worden voor therapeutische doeleinden.

Bovendien kunnen dergelijke CTL klonen gebruikt worden bij het screenen van hybridoom kweeksupernatanten om d.m.v. inhibitie van de cytotoxische reaktie antistoffen aan te tonen gericht tegen het antigeen dat door de kloon op de tumorcel herkend wordt. Met deze methodiek werden goede resultaten bereikt bij het maken van antistoffen tegen antigenen op de effektor T cel (zie Annual Report 1981, projekt IV.4). Door MilIer et al. (New Engl. J. Med. 306: 517, 1982) is beschreven 'dat na behandeling van een lymfoompatiënt met monoklonale antistoffen gericht tegen het idiotype van het immuun globuline van de maligne cel een dramatische klinische verbetering werd bereikt. Naar aanleiding van deze resultaten zullen dergelijke monoklonalen als eerste in aanmerking komen voor therapeutische pogingen. Preliminaire resultaten wijzen erop dat wij bij de eerste fusie een anti-idiotype hebben verkregen. Als dit definitief wordt bevestigd zal de produktie van deze antistoffen op

* EORTC research fello\1 **KWF fell0\1

25

grotere schaal worden opgezet en aandacht geschonken worden aan aspekten als zuivering, steriliteit en pyrogeen-vrij zijn. Uiteindelijk wordt een fase I clinical trial opgezet. Aan de hand van de resultaten hiervan moet dan besloten worden of het nodig is volgende fusies specifiek te richten op het maken van anti-idiotype antistoffen, en minder aan-dacht te geven aan B cel differentiatie antigenen. Zoals beschreven door Miller et al. kan het immuun globuline van de tumorcel verkregen worden na fusie van de lymfoomcel met een muize-myeloomcel tot een producerend hybridoom, waarna met het geïsoleerde eiwit, i.p.v. met de lymfoomcel,

. kan worden geïmmuniseerd. Een dergelijke omslachtige en tijdrovende procedure zou niet nodig zijn in geval van patiënten met multipele myeloom, waar het immuunglobuline geproduceerd door de tumorcel uit het serum kan worden geïsoleerd. In samenwerking met A. Kolk*** zijn fusies verricht waarbij geïmmuni­seerd werd met glycopeptiden of oligosacchariden van CEM cellen (zie Annual Report 1981, projekt III.2c). Er zijn onder andere 3 klonen verkregen die in immunofluorescentietesten wel reageren met CEM cellen en niet met perifere T lymfocyten. Deze groep wordt afgesloten met enkele andere oligosaccharide frakties als immunogeen. De karakterise­ring van deze monoklonalen wat betreft hun reaktiepatroon met normale en leukemiecellen wordt in 1983 afgerond; de biochemische karakterisering van het antigeen is geen onderdeel van dit projekt.

IV.4 De invloed van UV-straling op het immuunsysteem als model voor het ontstaan van huidtumoren (KWF projekt NKI 82-4)

J.E. de Vries, H. Spits, A. Voordouw en C.G. Figdor

Er zal een begin gemaakt worden om de effekten van UV-A en UV-B straling op het immuunsysteem te bestuderen. Om enig inzicht te krijgen in het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de verminderde immuunafwee4 zullen in de eerste plaats een groot aantal monocyten funkties na in vivo en in vitro toegediende UV-bestraling bestudeerd worden. Het accent zal hierbij komen te liggen op het effekt van UV op de antigeen presen­terende funktie van de monocyt. Antigeen presentatie van monocyten voor en na UV-bestraling zal bestudeerd worden in een systeem waarbij in vivo priming met het antigeen al plaats gevonden heeft. Tegelijkertijd zal, in samenwerking met prof. R. Cormane (Afd. Dermatologie, Universiteit van Amsterdam) bestudeerd worden of bij gezonde vrijwilligers antigeen­specifieke suppressorcellen gegenereerd kunnen worden in vivo, indien een maagdelijk antigeen (zoals Helix pomatia haemocyanine of Keyhole limpet haemocyanine) na een serie UV-A bestralingen toègediend wordt.

i'** Huidig adres: Koninklijk Instituut voor de Tropen, Amsterdam __________ _

26

SEKTIE V. VIROLOGIE

V.I. De molekulaire biologie van het muizen mammatumor virus (MMTV)

R. Michalides, L. van Deemter, V. Kwee, R. Nusse, A. van Ooyen, M. Paape, E. Wagenaar.

Het MMTV int gebied is een gebied in het genoom van C3H muizen waar in een groot aantal gevallen provirussen van MMTV integreren. In het midden bevindt zich een transkriptionele eenheid, waarvan een 2.6 Kb RNA wordt overgeschreven, vermoedelijk als gevolg van integratie van een provirus in de omgeving. Dit vormt een sterke aanwijzing dat het int gebied een pncogen bevat. Dit oncogen is niet identiek aan tot nu toe bekende oncogenen. Het in kaart brengen van het MMTV int gebied zal verder worden voortge­zet. Van de geïntegreerde provirussen zal de precieze plaats van inte­gratie alsmede de oriënatie t.o.v. het cellulaire DNA worden bepaald. Van verschillende tumoren en normale weefsels zal RNA worden geïsoleerd en met behulp van hybridizatie worden geanalyseerd op het voorkomen van transkripten van het int gebied. Gelet zal worden op verschillen in grootte van de RNA's aangezien dit interessante aanwijzingen kan op­leveren over het mechanisme van de transkriptie stimulatie. Er zullen een aantal biologische proeven worden ingezet om de expressie van int te meten gedurende progressie van tumoren. Primaire BALB/cfC3H tumoren zullen worden getest op de aanwezigheid van een MMTV provirus in het int gebied, en vervolgens op verschillende manieren worden getransplanteerd. Er zal uitgebreide histologie van de tumoren worden gedaan. Ook zullen cellijnen van de tumoren worden gemaakt. Tevens zal de chromosomale lokalisatie van het int gebied worden bepaald met behulp van somatische cel genetica. De chromosomale lokalisatie van diverse onc genen heeft recentelijk aanwijzingen opgeleverd omtrent de betrokkenheid van deze genen bij chromosomale afwijkingen in menselijke tumoren. Menselijk DNA bevat een duidelijk detekteerbaar restriktie fragment dat met de int probes reageert. Wij zullen trachten di.t fragment te kloneren ui t een menselijke library, alsmede de chromosomal'è plaats bepalen (in samenwerking met A. Geurts van Kessel, Rotterdam). Geschatte tijdsduur: 2-3 jaar.

Onderzoek naar specifieke integratie regio's voor MMTV in mamma tumoren en T celleukemieën van GR

In dit onderdeel wordt nagegaan of extra MMTV provirussen in de DNA's van mamma tumoren en T celleukemieën van GR geïntegreerd zijn in speci­fieke regio's van het cellulaire genoom van GR en welk effekt deze specifieke integratie heeft op de expressie van genen in dit gebied. Uit voorgaand onderzoek is gebleken dat mammatumoren van GR muizen bestaan hit hormoon-afhankelijke en hormoon-onafhankelijke cellen die verschil­lende extra MMTV provirussen bezitten. Integratie van extra MMTV . provirussen in een specifiek cellular DNA gebied dat informatie bevat die relevant is voor mammaturnor-ontwfkkeling z·ou kunnen leiden tot

27

ontwikkeling van hormoon-afhankelijke dan wel hormoon-onafhankelijke mammatumoren. In een aantal gevallen (3 uit 8) bleek dat bij hormoon­onafhankelijke transplantaten van GR mamma tumoren integratie van een extra MMTV provirus in een bepaald cellulair DNA gebied was opgetreden. De hierbij gebruikte probes en restriktie enzymen gaven informatie over een 10 Kb DNA gebied. Dit onderzoek wordt uitgebreid door probes en restriktie enzymen te gebruiken die een groter cellulair DNA gebied beslaan; daarnaast wordt ook nagegaan of integratie in een dergelijk gebied ook detekteerbaar is in primaire mamma tumoren van GR en andere virus geïnduceerde mammatumoren. Eveneens wordt nagegaan welke RNA's van dit cellulair DNA gebied tot expressie komen en hoe deze expressie veranderd kan zijn in GR mammatumoren. Evenzo .wordt nagegaan of in hormoon-gevoelige tumoren extra MMTV-pro­virussen integreren in een specifieke regio van het cellulair DNA. Een extra MMTV provirus dat karakteristiek is voor hormoon-gevoelige cellen in een oorspronkelijke GR mamma tumor is inmiddels met zijn naastliggend cellulair DNA gekloneerd. Het naastliggend cellulair DNA, dat erg klein is, een HpaII-EcoRI fragment van 0.15 Kb, wordt gebruikt om in een genenbank van normaal DNA naar grotere fragmenten te zoeken. Probes hiervan zullen dan worden gebruikt om na te gaan of extra MMTV provirus­sen integreren in een specifiek cellulair DNA gebied van GR mamma tumor DNA. De samenhang tussen de verschillende integratie regio's, die van hormoon-afhankelijke en hormoon-onafhankelijke mammatumoren van GR en de integratie regio int die is gevonden in viraal geïnduceerde C3H mammatumoren wordt bestudeerd. Evenzo wordt de expressie van genen in een mogelijk specifiek integratiegebied voor extra MMTV provirussen in hormoon-afhankelijke GR mammatumoren nagegaan en wordt naar soortgelijke expressie gezocht in menselijke mammatumoren en cellijnen hiervan. T celleukemieën van GR mannetjes bevatten extra MMTV provirussen met een afwijkende LTR volgorde (zie Annual Report 1982). Het merendeel van deze leukemieën bevat een groot aantal extra l-1M'l'V provirussen . Een leukemie met een gering aantal extra MMTV provirussen wordt geselekteer~ De extra MMTV provirussen van dit leukemie DNA wordt gekloneerd en voor twee doeleinden gebruikt: . 1. Met probes van de naast liggende cellulaire DNA fragmenten wordt na­

gegaan of extra MMTV provirussen geïntegreerd zijn in specifieke regio's van het cellulaire genoom van GRSL cellen en welk effekt deze integratie heeft op de expressie van genen in dit gebied. Ook Hier wordt een eventueel specifieke integratie regio vergeleken met de bovengenoemde specifieke integratie regio's bij mammatumoren en wordt de expressie van betrokken genen na gegaan in andere leukemieën van muis en mens.

2. De nucleotiden volgorden van de LTR fragmenten van de gekloneerde extra MMTV provirussen uit GR leukemie DNA worden bepaald en nage­gaan wordt welke deletie hierin is opgetreden in vergelijking tot de reeds bekende nucleotiden volgorden van andere LTR's van MMTV.

De geschatte tijdsduur·van dit projekt is 2-3 jaar.

Onderzoek naar mogelijke funkties voor genen in specifieke integratie regio's van MMTV provirussen

Bij een biologische betekenis voor een specifieke integratie regio voor MMTV provirussen in DNA van mamma tumoren dan wel T celleukemieën kan men zich voorstellen dat genen binnen dit gebied direkt.transformerend werken, dan wel dat dit gebied via het induceren van een groeifaktor transformatie van cellen bevordert. De eerste veronderstelling zal worden getoetst door geschikte indikatorcellen, NIH 3T3 cellen, te transfekteren met· DNA fragmenten van deze integratie regio's, al dan niet met een geïntegreerd MMTV provirus en na te gaan of morfologische transformatie optreedt. De tweede veronderstelling, dat genen uit deze integratie regio's zouden koderen voor tumorgroeifaktoren wordt nagegaan door NIH 3T3 cellen te transfekteren met DNA fragmenten en vervolgens het supernatant van deze getransfekteerde cellen te onderzoeken op de aanwezigheid van tumorgroei-

28

faktoren. Dit laatste geschiedt door dit medium toe te voegen aan ge­schikte indikatorcellen, NRK cellen, en te bepalen of dit medium deze cellen aanzet tot koloniegroei in halfzachte agar assays. De hiervoor beschreven specifieke integratie regio's worden op deze wijze getest. Hiervoor is het ook nodig integratie regio's met gelntegreerde MMTV provirussen te kloneren uit tumor DNA's. Geschatte tijdsduur 2-3 jaar.

Kloneren van RNA's betrokken bij de cellulaire transformatie

Integr.atie van MMTV in tumoren blijkt in een specifiek DNA gebied plaats te vinden en gaat vergezeld van synthese van een RNA vanaf in het naastliggende cellulaire DNA. Het is aannemelijk dat dit cellulaire gen een rol speelt bij de transformatie tot tumorcellen, omdat het alleen in tumoren tot expressie komt. Het blijkt dat, afhankelijk van de plaats van inte'gratievan .de extra MMTV kopie, RNA' s van verschillende lengte kunnen worden gesynthetiseerd'. Deze RNA' szullen als cDNA' s in E. col i gekloneerd worden waarbij de volgende vragen beantwoord kunnen worden. (i) Wat is de struktuur van het chromosomale gen. (ii) Welk eiwit wordt gesynthetiseerd. (iii) Wat is de oorzaak van het verschil in lengte tussen RNA's in verschillende tumoren. Verder zal met behulp van ge­schikte expressie' vektoren worden nagegaan of het eiwit, waarvoor deze' RNA's koderen, gesynthetiseerd kan worden in E.coli. Dit opent de mogelijkheid antistoffen op te wekken en de funktie'van dit eiwit te bestuderen.' .

V.Sa. Exogeen muizen mammatumor'virus (MMTV) als mitogene faktor in gekweekte cellen

J. Links, O. Tol en Y. Schaap' da Silva de Freitas

Lage koncentraties van gezuiverde MMTV-virionen hebben groeifaktor-akti­vi tei t in kul turen van primaire en sekundaire muizen nier- en ·longcellen. Ook kulturen van de heterologe permanente cellijn BHK 21/C13 (fibroblas­tolde niercellen van de Syrische hamster), in hetzelfde medium gekweekt, werden door MMTV in hun groei gestimuleerd. Door de aanwezigheid van relatief grote hoeveelheden serum-protelnen en -lipiden konden aspeci­fieke effekten van virion-protelnen en -lipiden uitgesloten worden. Deze aktiviteit lijkt op die van een aantal, grotendeels recent ontdekte, mitogene faktoren met een polypeptidestruktuur. Deze faktoren hebben gemiddeld een vrij hoge mitogene aktiviteit, een lage soortspecificiteit en stimuleren zowel epitheelcellen als fibro­blastolde cellen. Misschien is de MMTV-GF-aktiviteit gebonden aan één van de polypeptiden van het MMTV-virion. Of wordt een GF gesynthetiseerd en/of uitgescheiden na kontakt met de cellen. MMTV-GF-aktivi'teit is praktisch de enige zichtbare en kwantificeerbare eigenschap van MMTV in celkweken. Deze aktiviteit weerspeigeIt misschien een essentieel deel van het mechanisme van de door exogeen MMTV gelnduceerde mammatumorigenese.

Onderzocht zullen worden:

1. Waar de MMTV-GF-aktiviteit zetelt in het MMTV: in de lipiden-fraktie, in één van de MMTV-antigenen, of in het intakte virion.

2. Als de MMTV-GF-aktiviteit gebonden is aan het intakte virion, zal ge­zocht worden naar een GF in het medium van de met MMTV behandelde cellen.

3. Als (1) en (2) geen resultaat geven, is de volgende logische stap te zoeken naar een extraheerbare GF in de met MMTV behandelde cellen.

We schatteri de duur van dit werk op 1 à 2 jaar.

29

V.Sb. Het mechanisme van de induktie van endogeen muizen mamma tumor virus (MMTV) in lage-MT-muizestammen

J. Links en o. Tol

Daar onze kennis over de expressie van endogeen MMTV in de muis frag­mentarisch is en we nog minder weten over de induktie van endogeen MMTV in gekweekte muizecellen, bestudeerden we induktie van MMTV in kweken van "MMTV-vrije" "baby-mouse-kidney" (BMK) cellen, afgeleid van lage én hoge mammatumor (MT) muizestammen. Ter vergelijking maten we steeds ook de induktie van endogeen MuLV. Induktie van MuLV is reeds goed bekend en wordt elders bestudeerd. Ons kriterium was het verschijnen van MMTV­en MuLV-antigenen, die gemeten werden met een immunologische methode (ELISA; PAP modifikatie). Het bleek, dat MMTV en MuLV regelmatig tot een zwakke vroege expressie kwamen in primaire en sekundaire BMK-celkweken. De BMK-celkweken gingen daarna al snel een ca. 2 maanden durende kwetsbare "rust"-periode in (2e en 3e maand van de kweken). De cellijnen, die deze periode overleef­den, waren veranderd in snel groeiende epitheliale lijnen. Endogeen MMTV en endogeen MuLV kwamen in enkele van die cellijnen tot expressie. Soms beide tegelijk, soms alleen MuLV. Een cellijn waarin alleen MMTV tot expressie kwam, vonden we (nog) niet. Statistisch heeft dit geen betekenis. De late spontane expressie bleek minder duurzaam dan de, tot nu Thoe gelijktijdig optredende, late MuLV expressie.

Onderzocht zullen nog worden:

1. De BMK-cellijnen, die nog niet helemaal doorgemeten z1Jn. Hiertoe behoren de lijnen, die afgeleid werden van de 2 hoge-MT-muizestammen (GR; C3HjHe).

2. De invloed van enkele steroïd- en peptide-hormonen (o.a. hydrocorti­son en insuline) op de spontane ind'.lktie en expressie van MMTV en MuLV.

3. De invloed van exogeen MuLV op de expressie van endogeen MMTV, en omgekeerd.

4. De koncentratie van MMTV-DNA in de BMK-cellijnen met en zonder MMTV expressie verge~ken met de vers bereide BMK-cellen.

We willen V.Sb. in de loop van 19~4 afsluiten.

30

SEKTIE VI. GENETICA EN PROEFDIEREN

VI.1 Genetica van de resistentie en gevoeligheid voor tumoren in de muis

VI.1a Genetische karakterisering van ingeteelde muizenstarr~en

J. Hilgers, J. Hilkens, R. Keesom en V. Kroezen

De genetische typering van de ingeteelde muizenstammen wordt voortgezet. In ons eerste grote overzicht van de genealogie en genetische markers van de stammen van het NKI (Hilkens et al., in: Mammary tumors in the mouse, Hilgers en Sluyser (eds.), Elsevier North-Holland Biomedical Press, 11, 1981) werden de resultaten gegeven voor ca. 70 verschillende marker loci. In de daarna uitgekomen jaarverslagen van het NKI van 1981 en 1982 werden polymorphismen van nog enkele tientallen markers bespro­ken in relatie tot de verwantschap van de ingeteelde stammen van ons Instituut. Hierbij werden ook de patronen betrokken van de meest ge­bruikte inteeltstammen elders, speciaal die van de J.ackson Laboratories in de USA. Er blijken hier en daar in de veel qebruikte stammen van Amerikaanse origine verschillen voor te komen, hetgeen van belang kan zijn bij de interpretatie van de vraag waarom verschillende starr~en zul­ke uiteenlopende tumor incidenties vertonen.

Het verder typeren van de muizenstarr~en zal op nog grotere schaal dan . voorheen voortgezet worden. Er is hiertoe een zeer uitgebreide samenwer­king opgebouwd met een groot aantal genetici van buitenlandse groepen. De belangrijkste samenwerkingsverbanden zijn ontstaan met Dr. R. Holrnes (Griffith University, Brisbane, Australië) die isoenzymen bepaalt die

. met het alcohol metabolisme te maken hebben; met Prof. dr. o. von Deim­ling (Universität Freiburg, BRD) die voornamelijk esterases bepaalt, een groep van zeer waardevolle isoenzymen, waarvan er bij de muis nu onge­veer 25 bekend zijn; met Dr. L. Skow (National Institute of Environmen­tal Health Sciences, North Carolina, USA) die een serie isoenzymen be­paalt die door hem ontdekt zijn (bv. van ooglens eiwitten) en daarnaast een aantal klassieke markers doet; met Dr. L. Lundin (University of Uppsala, Sweden) die een serie markers doet van de lysozomale enzym reeksen.

Inmiddels is er ook een begin gemaakt met het typeren van de stammen voor endogene MTV en MuLV sequenties. Wat Mtv loci betreft gebeurt dit voornarr.elijk nog aan de Europese stammen die verwant zijn met de GR stam, in sarr:enwerking met Dr. R. Michalides (Sektie V). \'Jat NuLV loci betreft,

. gebeurt dit enerzijds met de groep van Dr. A. Eerns in Nijmegen en ancler­zijd~ met enkele groepen in de USh, speciaal de groep van Dr. N. Jenkins van de Jackson Laboratories.

Ook de typering voor willekeurige DNA fragmenten gekloneerd· in vectoren en het polymorphisme hierin, is begonnen, nl. de samenwerking met Dr. R. Elliott van het Rosweil Park Nemorial Institute (Buffalo, USA). Een aan­tal van zulke polyrr.orphisrr.en op DNA niveau is al gerelateerd aan bepaal-de chromosomen en de verwachting is dat dit een zeer groot aantal nieuwe

31

markers voor alle muizenchromosomen zal opleveren. Dit is van het groot­ste belang om met behulp van RI stammen de genetica van de resistentie tegen verschillende typen van tumoren te bestuderen.

VI.1b Endogene MTV genen in relatie tot mammatumorigenese

R. van Nie en J. de Moes

De ontwikkeling van drie congene lijnen, (1) congene GR lijn zonder Mtv-2, (2) congene BALB/c lijn met Mtv-3 en (3) congene B6 lijn met Mtv-3, wordt voortgezet. De ontwikkeling van de congene GR nadert het einde. Na 12 cross-intercross cycli zal een nieuwe sublijn worden begon­nen met een broer x zuster paar, dat geselecteerd moet worden op de af­wezigheid van het Mtv-2 gen. Daarna zal door fosteren van nakomelingen bij moeders van een MTV-vrije stam het exogene MTV uit deze lijn moeten worden verwijderd.

In een aantal lopende proeven wordt het effect van het Mtv-2 gen in con­gene 020 muizen bestudeerd. Evenals in de stam GR worden zowel hormoon­afhankelijk alsook hormoon onafhankelijke mammatumoren gezien. Het voor­komen van deze twee typen tumoren wordt nagegaan in verschillende proef­omstandigheden. In een proef met force-breeders zal een nauwkeurige ver­gelijking worden gemaakt tussen congene 020 lijn en de GR stam. Ook zal komend jaar een controle proef met 020 muizen worden ingezet.

In GR muizen blijkt het Mtv-2 gen betrokken te zijn bij de thymus leuke­mogenese daar deze tumoren niet gezien worden in dieren van de congene lijn GR-Mtv-2-. Tot nu toe wordt geen effect van Mtv-2 gezien in muizen van de congene 020-Mtv-2+ lijn. Dit probleem zal nader bekeken worden in een F1-populatie (GR-Mtv-2- x 020-Mtv-2+). Indien in dieren van deze F1 populatie thymus tumoren worden aangetroffen zal in een terugkruisings­populatie kunnen worden nagegaan of Mtv-3 in dit proces een rol speelt.

VI.1c Genetica van resistentie tegen mammatumoren en leukemie bestudeerd met recombinant ingeteelde staw~en

J. Hilgers, J. Arends, G. Röpcke, A.A. Verstraeten en R. Keesom

CXB serie

Het ontstaan van mamrr.atumoren na toediening van exogeen MTV wordt uitge­zocht in de 7 RI stammen van Bailey als vervolg op het vroegere werk van Dux en Mühlbock. Een en ander in relatie tot-de expressie van MTV in de melk, gemeten met een radioimmunoassay voor virale eiwitten enerzijds en infectiviteit bij gefosterde jongen anderzijds. Inmiddels zijn een aan­tal intermediaire phenotypes gevonden tussen de ouderlijke stammen die het nodig maken om tumor incidenties in F1 bastaargen tussen verschillen­de RI stammen te bepalen. De gene~ische typering van deze RI serie zal voortgang vinden wat be­treft nieuwe polymorphismen, speciaal wat betreft de endogene MTV se­quenties (in samenwerking met Dr. R. Michalides, Sektie V) .

CXS serie

Er is een aanvang gemaakt met het bepalen van mammatumor incidenties in ·de 14 zelf gemaakte CXS stammen en de ouderlijke stammen BALB/cHeA en . STS/A. Hiertoe is C3H-MTV ingespoten en zijn vrouwtjes in de forced breeding gezet. Daarnaast is b~gonnen met het implanteren van hypophyses onder het nierkapsel bij vrouwtjes. Bovendien worden de spontane tumor incidenties bepaald in virginale en kwekende vrouwtjes enerzijds en man­netjes anderzijds. Het gaat hierbij niet alleen om mammatumoren, maar ook om leukemie, longtumoren, levertumoren en hypophyse adenomen. Dit

32

laatste wordt uitgevoerd in samenwerking met Drs. M. van der Valk (pro­ject VI. 4) • Dr. R. van Nie zal de cdm en rd markers bepalen (de STS/A is blind en de verwachting is dat de helft van de 14 stammen ook blind zal zijn, het­geen implicaties heeft voor hormoonspiegels) en daarnaast gewichten en van enkele orgaansystemen bepalen om te kijken of dit op eenvoudig gene­tische wijze bepaald wordt (in dit geval kunnen de genen hiervoor gelo­kaliseerd worden) . Het zoeken naar meer genetische verschillen tussen de ouderlijke stammen vindt voortgang. Ieder gevonden verschil wordt zo spoedig mogelijk be­paald in de 14 RI stammen. Dit is reeds gebeurd voor Mtv genen door Dr. R. Michalides hetgeen zal leiden tot lokalisering van vrijwel alle endo­gene MTV sequenties van de STS/A (en daarmee ook die van verwante stam­men zoals de GRS/A) enerzijds en de BALB/c anderzijds. Polymorphismen voor willekeurig gecloneerde muizen DNA fragmenten worden bepaald door Dr. R. Elliott (RoswellPark Memorial Institute, USA). Dr. E. Boyse zal een grote serie Ly antigeen polymorphismen bepalen in Sloan-Kettering. Wat antigenen betreft wordt ook de hulp verkregen van Dr. I. McKenzie (Melbourne, Australië). Verder. zullen de groepen genoemd onder VI.l voor isoenzymen testen.

Op het moment van het schrijven van dit werkplan z~Jn 20 ve:çschillende genetische markers gedetermineerd hetgeen reeds heeft geleid tot koppe­ling op chromosoom 11 van een nieuwe isoenzym marker (Tcn-2 met Dr. M. Fráter, Zürch) en een serie Mtv genen op chromosoom 1 en 11 (met Dr. R. Michalides) . De verwachting is dat er met deze serie RI stammen regelma­tig nieuwe genen vanaf nu gelokaliseerd zullen worden. Een en ander geldt dan als voorbereiding voor de uiteindelijke lokalisatie van de ge­nen verantwoordelijk voor het optreden van mammatumoren in de BALB/c en andere tumoren in beide ouderlijke stammen.

AKRx020 serie

Veertien stammen van deze serie z~Jn nu rond de 12de inteeltgeneratie. Eind 1984 zal de 20ste generatie bereikt worden en kan deze RI serie op­genomen worden in het genlokaliseringsproces en bij het bepalen van ge­voeligheidsgenen voor AKR leukemogenese enerzijds en 020 longtumorigene­se anderzijds.

MOLxGR serie

Van deze serie is éen stam bij de 13de inteeltgeneratie en op dit moment 24 sublijnen rond de 6de inteeltgeneratie. Het blijkt zeer moeilijk te zijn om voorbij de 7de tot 10de inteeltgeneratie te komen vanwege het homozygoot worden van recessief lethale genen. Er zal daarom opnieuw zeer breed begonnen worden met deze RI serie, waarvan verwacht mag wor­den dat het in de toekomst de belangrijkste serie van RI stammen zal zijn die er tot nu toe gemaakt is, vooral lokalisatie werk van die genen die bij de muis weinig of geen polymorphisme vertonen.

VI.1d Chromosoom analyse van tumoren bij muizen

R. Dofuku* en J. Hilgers

·De chromosoom analyses van in vivo maw~atumoren en primaire cultures daarvan worden voortgezet. De voorlopige conclusie is dat trisomie van 13 vrijwel niet meer aangetroffen wordt in primaire cultures van tumoren, terwij I dat een constante afwijking is in meer dan 70% van de cellen ver-

*Cancer Institute, Tokyo, Japan; met steun van Stichting Benevolentia.

33

kregen uit een in vivo primaire tumor. Wellicht groeien voornamelijk normale cellen van een mammatumor uit onder de weefselkweek condities die tot nu toe zijn aangewend. Chromosoom analyses van hormoon afhankelijke primaire mammatumoren bij de GR muis worden uitgevoerd in samenwerking met Dr. R. van Nie. Er zal gekeken worden of ook deze tumoren al trisomie van 13 vertonen als con­stante afwijking. In samenwerking met Dr. M. Sluyser en medewerkers zal gekeken'worden naar chromosoom patronen van hormoon afhankelijke en hormoon onafhanke­lijke mammatumor transplantaten. Wellicht gaat overgang van afhankelijke naar onafhankelijke gepaard met een steeds aanwezige zelfde chromosomale verandering. Chromosoom analyses van somatische celhybriden tussen GR mammatumor cel­len enerzijds en Chinese hamster celien (E36) anderzijds zullen uitge­voerd worden in verband met lokalisatie onderzoek van muizengenen met somatische celhybriden. Een en ander zal gebeuren in samenwerking met Ir. J. Hilkens (project VI.3). In samenwerking met Drs. A. Sonnenberg (project VI.3) zullen een aantal gekloneerde mammatumor cellijnen van de BALB/c geïnfecteerd met RIII-MTV op hun chromosomale aberraties bekeken worden. Er zal vooral aandacht besteed worden aan de eventuele verandering op chromosomaal niveau als functie van transformatie karakteristieken van deze cellijnen. Spontane leukemieën van de GR stam die MTV-DNA amplificatie vertonen zul­len bestudeerd worden op eventuele trisomie van chromosoom 15 of trans­locaties waarbij 15 betrokken is. Tot nu toe is een B lymphoom gevonden met trisomie van 15 in 7 van de 8 bestudeerde karyotypes. T cel lympho­men worden nu gekaryotyoeerd. Met behulp van mamma tumoren in een translocatie stock waarbij chromosoom 13vastzit aan een ander chromosoom (Robertsonian translocation) zal ge­keken 'worden'of ook hier trisomie van 13 optreedt, d.w.z. trisomie van het enige "metacentrische" chromosoom aanwezig. In F1 bastaarden tussen deze stock en GR wordt nagegaan welke "13" verdubbelt., de normale van de GR stam of de 13 waarin een ander chromosoom via het centromeer vast­zit. Met behulp van 3 translocatie stocks waarin reciproke translocaties van een stuk van 13 met een ander stuk chromosoom voorkomen wordt nagegaan welk stuk van chrom~soom 13 steeds in drievoud aanwezig is in mammatu­moren. Er wordt hulp verleend aan de karyologische programma's van Dr. J. Col­lard en frof.dr. L. Smets (Sektie 111).

VI.2 Histocompatibiliteit en neoplasia

Jnlc,iding Histocompatibi 1 i lcj lsrv·nen VOt-men een klasse genen die interacties tus­sen verscid 11 ende cel t~'l)e,; kunnen bc=palen en hun product.en kunnen immu­!lolog isch hE'rkend I·.'orden. Omvangr ij ke geCJeven s l.Jewi j zen dat deze genen een grote invloed kunnen Ilitoefenen op resistentie van het organisme te­gen ecn 'Jantal tumoren: verscheidene leukemieën, miJmmatumoren, longtumo­Tun, e.iJ. Deze resistentie is echter eerder specifiek dan alge~een en is l.Jepaald door een aantal verschillende genen. Sommige mechanismen van dic resistentie zijn immunologisch, andere Zijn nog niet bekend, maar zij kunnen te maken hebben met de hormonale regulatie. Dit project is ge­baseerd op twee l.Jenaderingen: • studie van oncologische effecten van de histocompatibiliteitsgenen, • analyse van de structuur en functie ViJn de H-genen met als einddoel een moleculaire interpreLatie van de reeds bekende oncologische effecten, voor mogelijke praktische toepassingen. Ten aanzien van de vele mogelijkheden is dit project geconcentreerd op bepaalde richtingen waiJrvan potentieel de meest nieuwe gegevens verwacilt kunnen worden en waarin de traditie binnen het inslituut en mogelijk­heden tot samenwerking ~Gt andere groepen van het Instituut (virologie,

34

chemische carcinogenese) het grootst zlJn. Daarom concentreert dit pro­ject zich voornamelijk op mamma- en longtumoren, K en D regio's die een belangrijke maar nog onverklaarbare rol spelen in resistentie tegen tu­moren, complement genen als een model voor de studie van het polymor-' phisme van hormonale regulatie, en deT/t regio, waarvan de werking en ge­netica nog steeds enigmatisch blijft.

VI.2a Genetische analyse van de K en D regio's

D. Iványi, M. Oudshoorn-Snoek, W. van de Meugheuvel en P. Démant

De laatste tijd heeft men cDNA clones van de genen die voor de MHC pro­ducten coderen, geïsoleerd. Deze clonen zijn gekarakteriseerd en worden gebruikt om klasse 1 gen clonen te verkrijgen. Gecloneerde genen kunnen in gekweekte cellen geïntroduceerd worden, waarna de expressie van his­tocompatibiliteitsantigenen op het celoppervlak bestudeerd kan worden.

Er is al aangetoond dat de gen producten (klasse I antigenen) in de ge­transformeerde cellen aangemaakt worden en in het celmembraan geïnte­greerd worden. Deze antigenen konden gedetecteerd worden met behulp van toepasselijke antilichamen of met behulp van functionele testen (doden door allogene cytotoxische T cellen gericht tegen de tot expressie komen­de antigenen).

Alloantisera gemaakt tegen getransformeerde cellen zullen nieuwe moge­lijkheden kunnen bieden om de heterogeniteit van H-2 moleculen meer ge­detailleerd te bestuderen voor vergelijking van deze reagentia met con­ventionele alloantisera en monoclonale antilichamen. Na onze ontdekking aangaande de kruisreactiviteit van anti-H-2 sera met Qa-2 antigen (Iványi et al., Immunogenetics 1982) werd ook kruisreactiviteit tussen Qa-1 en H-2K 'regioproducten gerapporteerd (Figueroa, H-2 meeting Amsterdam, 1982) . Daarnaast waren ook kwantitatieve verschillen in expressie van Qa-2 anti­genen tussen verschillende stammen aangetoond (oudshoorn et al., Trans­plantation 1981). Onlangs is gevonden dat deze kwantitatieve verschillen veroorzaakt worden door een hogere expressie van Qa-2 op B-cellenvan sommige stammen (Murphy, H-2 Meeting, Amsterdam 1982).

De bovengenoemde nieuwe gegevens worden verwerkt in ons verdere onder­zoek naar de moleculaire complexiteit van H-2 antigenen (voor nadere analyse van voorheen bestudeerde haplotypen zowel als nog niet geanaly­seerde haplotypen) .

Er zal gebruik gemaakt worden van antisera gemaakt tegen getransfecteer­de cellen; bestudeerd wordt dan de heterogeniteit van H-2 moleculen op B cellen in vergelijking ~et T cellen. Van de nieuwe haplotypen zullen bij voorkeur die haplotypen geanalyseerd worden waarvan reeds gen clonen bestaan en waarvan de moleculaire heterogeniteit van H-2 producten op normale lymfocyten nog niet was geanalyseerd (zoals b.v. H-2P). Een aan­tal monoclonale antilichamen geproduceerd in ons laboratorium alsook di­verse antilichamen, te verkrijgen van andere laboratoria, zullen bij deze analyse gebruikt worden.

Cellijnen van L cellen getransformeerd met H-2 gen dragende cosmiden zijn geanalyseerd in samenwerking met het laboratorium van Dr. R. A. Flavell. Behalve de al bekende K en D regio genen zijn vele van deze cel­lijnen getransformeerd met cosmiden die nog onbekende MHC genen bevatten.

Met ons uitgebreide panel van antisera en monoclonale antilichamen zul­len tests van - en immunisatie tegen deze cellijnen uitgevoerd worden, om informatie te verkrijgen over de tot nu toe onbekende producten van deze genen. In een later stadium zullen ook biochemische tests (SDS-PAGE, peptide maps) toegepast worden om deze antigenen nader te karakteriseren.

35

VI.2b Genetische analyse van het histocompatibiliteitsgen complex van "Europese" muizenstammen

P. Démant, R. Michalides, W. van de Meugheuvel, A. Czarnomska*, D. Iványi, M. Oudshoorn-Snoek en M.H. Roos

De analyse van de genen op chromosoom 17 van de muis is erbij gebaat ge­bruik te maken van materiaal van gedifferentieerde genetische" oorsprong. Daarom kunnen de inteelt stammen van Europese oorsprong nieuwe inzichten bieden in de organisatie van het genoom, welke niet te verkrijgen zijn met de standaard ("Amerikaanse") stammen. Dankzij deze benadering zijn b.v. al twee nieuwe genetische polymorfismen ontdekt: ede rds mutatie (retinaldegeneration-slow chromosoom 17) en .het biochemische polymorfisme van de complement B factor (BF). Beiden zijn gekoppeld aan het MHe en daarmee dus belangrijke genetische en biologische markers voor verder onderzoek aan dit project (Van Nie et al., 1978, Roos & Démant, 1982).

Een aantal nieuwe stammen en recombinanten zijn in de laatste jaren voor­bereid om een meer nauwkeurige lokalisatie van verscheidene genen te be­palen, en nieuwe analyses van hun biologische eigenschappen mogelijk te maken. In de komende periode zullen deze stammen gebruikt worden voor productie van nieuwe antisera en monoclonale antilichamen, gen-mapping studies van de rds, TL, T/t regio's en enzymatische polymorfismes. Een nieuwe facet aan deze studies is de toepassing van nieuwe DNA technieken. Ten eerste, met behulp van gecloneerde en vervolgens in allogene cellen overgebrachte (getransfecteerde) H-2 genen (zie projekt VI.2a), worden reagentia en controle reacties aangewend om een nauwkeurige correlatie tussen de twee genetische benaderingen te bepalen. Zo is er een aantal recombinante haplotypes bereid om te proberen de genen die tot nu toe in een regio lijken te liggen, nogmaals van elkaar te scheiden. Ten tweede een aantal cDNA probes van verschillende laboratoria zullen worden aan­gewend om het DNA restrictie polymorfisme te bepalen en met behulp van onze nieuwe recombinanten verder te mappen. Deze studie zal probes voor H-2, Ia en complement genen inhouden. De resultaten moeten een basisvor­men voor verder DNA onderzoek.

VI.2c Expressie van MHe producten op tumorcellen

M. Oudshoorn-Snoek en P. Démant

Abnormale expressie van MHe producten in de vorm van expressie van de­terminanten van een ander haplotype naast de eigen H-2 determinanten (extra-specificiteiten) en/of verlies aan expressie van eigen determi­nanten, is voor een aantal transplanteerbare tumoren en in vitro tumor­cellijnen beschreven. Uitgebreide studies aan AKR muizen in vitro lym­foma zijn bekend, zodat dit voor ons de reden was om in vivo de primaire lymfomate bestuderen. De thymocyten van leukemische dieren werden gety­peerd met een panel van alloantisera, in cytotoxiciteits testen. Type­ringen ~an tientallen primaire lymfornas wezen erop dat extra specifici­teiten en/of verlies van expressie van H-2 determinanten niet of spora­disch voorkomen op de lymfoma cellen in vivo. De resultaten gaven indi­catie dat er misschien kwantitatieve verschillen optraden in vergelij­king met thymocyten van preleukemische AKR muizen. Het gedrag van dé K en D antigenen kan gekoppeld zijn met bepaalde karakteristieken van de tumoren. Gezocht wordt naar meer monospecifieke antisera om dit fenomeen nauwkeuriger te definiëren. Geanalyseerd zal ook worden of de toename van een deel van de H-2 antigenen in relatie staat met de toename van virale

-*Institute of Oncology, \1arschau, Pol,.=n.

36

antigenen op het celoppervlak in de loop van de leukemogenese. Van belang hierbij zal zijn een goed systeem te vinden waarin cytotoxische H-2 an­tilichamen naast virale antilichamen getest kunnen worden.

VI.2d Hormonale regulatie en structuur van H~2 gekoppelde complement componenten in verband met de H-2 gereguleerde resistentie tegen tumoren

M.H. Roos en P. Démant

Dit onderzoek is een onderdeel van de studie van hormonale effecten en genetische factoren die betrokken zijn bij de afweer tegen tumoren in de muis. Veel van deze genetische factoren zijn gekoppeld aan het MHC in de muis op chromosoom 17. Het mechanisme van deze afweer is niet bekend; de MHC-gekoppelde complement genen (C2, BF en C4) echter bieden een goede mogelijkheid om de hormonale regulatie van MHC gekoppelde genen te be­studeren, omdat zij een onder invloed van androgenen staand sexueel di­morfisme vertonen.

In het eerste jaar van een 4 jaar durend KWF projekt, zullen wij onder­zoeken welke hormonen betrokken zijn bij de regulatie van de componenten BF en C4-S1p (sex-limited allotype van C4). De hormonale regulatie van de gen expressie zal bekeken worden door middel van een in vivo regula­tie systeem. Voor de complement comj:onent BF zal de androgen controle van het sexuele dimorfisme nader worden bekeken, 'door het behandelen van vrouwelijke muizen met testosteron en het castreren van mannelijke mui­zen. Dit is voor C4 bij de muis al eerder gedaan bij bepaalde stammen en wij zullen dit ook onderzoeken bij stammen waarbij dit nog niet gedaan is . Uit de literatuur betreffende het door androgenen gereguleerde 0( 2u globuline bij de rat is gebleken dat ook ande're hormonen bij de regula­tie betrokken zijn. Daarom zullen wij ook de :invloed van schildklier hormonen, bijnierschorshormonen en hypofyse h'ormonen bekijken. De regu­latie zal bekeken worden door het plasma nive'au van C4 en SIp te bepalen (dit niveau is hoog bij mannen en laag bij vrouwen) en bij BF door het polymorfisme na agarose electroforese te bekijken (mannelijke muizen vertonen 5 à 6 banden, vrouwelijke muizen 3 bij deze scheiding). Wanneer een verschil gevonden wordt na ectomie zal de invloed van substitutie met de juiste hormonen bekeken worden. De invloed van ectomieën op het totale eiwit niveau zal ook gecontroleerd worden. De stammen waarmee be­gonnen zal worden zijn B10.A(H-2d ) en 020 (H-2PZ) en de congenen B10.020 (H-2pZ) en 020.A(H-2d ). Op deze manier hopen wij uit te vinden welke hormonen betrokken zijn bij de regulatie van het sexuele dimorfisme van C4-Slp en BF en tevens hopen wij eventuele genetische koppeling van de gevoeligheid voor éen of meer hormonen vast te stellen.

VI.2e Histocompatibiliteitsgenen en resistentie tegen reammatumoren

A. Dux, G. Röpcke, P. Démant en H. Daams

Het project is gebaseerd op uitgebreide gegevens die aantonen dat de histocompatibiliteitsgenen een grote invloed kunnen h~bben op de resis­tentie tegen viraal en hormonaal geïnduceerde mamma tumoren in de muis. Het mechanisme van deze effecten blijft echter onbekend. De twee cruci­ale uitgangspunten voor het onderzoek daarvan zijn: (a) virus specifici­teit van deze effecten (reuizen met bepaalde histocompatibiliteit (H-2) genotype zijn gevoelig voor C3H-MTV maar resistent tegen DBA-MTV, terwijl in muizen met een ander histocompatibilitBitsgen de situatie omgekeerd is) en (b) invloed op gevoeligheid tegen hormonale inductie van mamma­tumoren in afwezigheid van infectieus MTV. ea Het resistentie patroon zal getest worden met een aantal stammen met verschillende MTV varianten, te beginnen met het C3H-MTV. Wij willen ook trachten te bepalen of het H-2 een bepaalde resistentie heeft die alge­meen of lokaal (weefselspecifiek) is. Om dit -Ce onaerzoeken zullen mamma-

37

klieren van resistente (C57BL/10) en gevoelige (B10.A(5R» . stammen ge­transplanteerd worden naar F1 bastaarden (B10xB10.A(5R» gecombineerd met de toevoeging van C3H-MTV en hormonale stimulatie. Wij zullen ver­gelijken of er verschillen tussen het aantal tumoren en tijdstip van hun optreden bestaan tussen de mammaklieren van twee verschillende stammen (wat dus zou betekenen dat de H-2 resistentie weefselspecifiek is), of

de incidentie en tijd van optreden hetzelfde zijn in klieren afkomstig van de twee stammen (een aanduiding dat de resistentie algemeen is). eb Het is al enige tijd bekend dat resistentie en gevoeligheid voor mam­matumoren geïnduceerd met exogeen MTV onder invloed van de MHC genen staan. Nu zijn onlangs aanwijzingen verkregen dat deze genen ook de re­sistentie en gevoeligheid voor marnrnatumoren geïnduceerd door hormonen beïnvloeden.

De methode van hormonale inductie was voornamelijk die van forced breed­ing , terwijl de sterkere hormonale behandeling van het implanteren van 2 hypofysen onder het nierkapsel slechts in beperkte mate werd toegepast. Om nu de invloed van de verschillende H-2 haplotypen op de gevoeligheid voor hormonale inductie van mamma tumoren door middel van deze laatste methode uitgebreider te onderzoeken werden 16 ingeteelde muizenstammen en hun congene lijnen gekozen. Dit zijn: BALB/cHe, BALB/cBy, C57BL/10 en 020, en de congene lijnen: BALB.B, BALB/c-H-2dm2, B10.A, B10.A(2R), B10.A(3R), B10.A(4R), B10.A(5R), B10.AKM, OIR, B10.Q, B10.BR en B10.D2/ new. Mammatumoren worden geïnduceerd door bij intacte vrouwelijke muizen 2 hypofysen van mannelijke dieren van dezelfde stam te implanteren in de linker nier'; op deze manier wordt continu prolactine geproduceerd. Dit hormoon is van primair belang gebleken bij het induceren van mammatumo­ren. Hormoon-induceerbaarheid van Ia (klasse 11) antigenen op de mamma-epi­theelcellen zal immunohistologisch onderzocht worden. Door de lange duur van de experimenten en het grote aantal muizen zijn deze werkplannen het eerstkomende jaar nog niet beëindigd.

VI.2f Histocompatibiliteitsgenen en resistentie tegen longtumoren

L. Oomen, P. Démant, P. Emmelot en M. van der Valk

In het verleden is aangetoond dat het H-2 complex van invloed is op de ontwikkeling' van longtumoren in de muis. Experimenten uitgevoerd in ons instituut met betrekking tot de spontane longtumorvorm~ng, of longtumor­vorming na chemische inductie (in jong volwassen dieren dan wel trans­placentair) geven parallel lopende resultaten re zien. Ontwikkeling van longtumoren in muizen van bepaalde H-2 congene stammen op B10 achter­grond is in alle drie de gevallen afhankelijk van het aanwezige H-2 haplotype. Van twee hap'lotypes met een duidelijke invloed op de longtumor ontwikkeling (haplotypes a en b) komen bovendien de effecten in deze drie verschillende experimentele systemen sterk overeen. Hoewel er dus zeer sterke aanwijzingen zijn dat het H-2 complex van invloed is op de long­tumorvorming is het definitieve bewijs, d.m.v. koppelingsstudles nog niet geleverd. Vrouwtjes van de "longtumor-gevoelige" B10.A(H-2 a ) stam en van ~e "resistente" B10(H-2b ) stam zullen gekruist worden met (B10.A XB10)F1 mannetjes. In hun nakomelingen (Bc1 dieren) zal de gevoeligheid voor transplacentair geïnduceerde longtumorvorming worden nagegaan, ter­wijl tevens voor H-2 haplotype getypeerd wordt om eventuele koppeling te kunnen vaststellen. Tevens zal door dit experiment nagegaan kunnen wor­den of maternale effecten een rol spelen in het systeem van transpla­centair geïnduceerde longtumoren.

Van verschillende regio's van het H-2 complex is aangetoond dat ze be­trokken zijn bij de longtumorvorming: de I-B regio in het geval van spontane longtumoren, en in het geval van transplacentair geïnduceerde longtumoren tenminste drie regio's (waaronder mogelijk ook I-B). Om de

38

effecten van deze H-2 of sterk H-2 gekoppelde regio's (Qa, TL) na te kunnen gaan, zullen stammen met recombinant haplotypes op B10 achter­grond en enkele geselecteerde F1 hybrides van deze stammen ingezet wor­den om ze te testen op hun gevoeligheid voor transplacentair geïndu­ceerde longtumorvorming. Door middel van transplantatie en preïmmunisatie experimenten met inmid­dels ontwikkelde in vivo longtumor lijnen zal getracht worden na te gaan of de waargenomen H-2 effecten op longtumor ontwikkeling werken via im­muunrespons genen of via de regulatie van expressie van tumor antigenen (H-2 of non-H-2). Transplantatie in F1 hybrides tussen gevoelige en on­gevoelige stammen maakt het misschien mogelijk deze twee effecten te on­derscheiden. Met betrekking tot de rol van achtergrondgenen versus H-2 genen (en hun mogelijke interacties) van belang bij de longtumor ontwikkeling, zal na­gegaan worden of, en zo ja welke H-2 congene lijnen op een andere dan B10 achtergrond en/of welke andere inteelt stammen bestudeerd zullen worden. Daarnaast zal de manier van verdere genetische analyse d.m.v. bepaalde kruisingen tussen inteelt stammen of met gebruik van recombinant inteelt series bekeken worden. Bij het maken van de keuze zal ook in be­schouwing worden genom~n, welke andere tumortypen (in de darm, het lym­foreticulaire systeem of de lever) tegelijkertijd bestudeerd kunnen wor­den.

VI.2g Het T/t regio en de genetische controle van normale en maligne dif­ferentiatie

w. van de Meugheuvel en P. Démant

Een aantal genen gekoppeld aan het MHC hebben invloed op de embryonale differentiatie en h~t gedrag van teratocarcinoma cellen. Dit project, dat gestart is in 1982, heeft als doel de genetische en functionele factoren, die verantwoordelijk 2ijn voor deze fenomenen te karakterise­ren. De verhouding tussen de histocompatibiliteitsgenen en de T/t genen zal onderzocht worden door middel van biologische en biochemische bena­deringen. Het polymorfisme van de celoppervlak antigenen van teratocar­cinoma cellen zal onderzocht worden door studies aan genen die verant­

'woordelijk zijn voor afstoting van teratocarcinoma's in allogene ont­vangers. Een aantal nulli-potente en pluri-potente teratocarcinoma cel­lijnen zijn ingevoerd en na bacteriologische controle zullen deze worden getransplanteerd in verschillende genetische situaties. Het aantal en de lokalisatie van teratocarcinoma rejectionloci zullen be­paald worden. Deze studie zal verbonden zijn met biochemische analyse van MHC-achtige producten op deze lijnen (abnormale expressie) en door de genetische ka­rakterisering van T/t regio met behulp van recombinante haplotypes en door de analyse van DNA polymorfisme met gebruik van MHC klasse I en C3 eDNA probes (zie ook project VI.2b).

VI.3 Somatische celgenetica, differentiatie en monoclonale antilichaam­productie

VI.3a Somatische celgenetica van het muizengenoom

J. Hilkens, F. Buijs, R. Dofuku*, J. Hilgers en V. Kroezen

In de afgelopen jaren werden twee sets van somatische celhybriden ge­maakt tussen mui.zen (GRSL en GR mamma tumor cellen) en Chinese hamster cellen (C36), de zgn. EGR en EMT hybriden. Beide sets hybriden segrege­ren muizcnchromosomen. Deze laatste eigenschap maakt de hybriden ge­schikt vuor gen mapping. Voor deze doeleinden hebben we een panel van EGR en EMT clones samengesteld waarin zoveel mogelijk alle chromosomen minstens eenmaal afwezig zijn en eenmaal aanw~zig zijn. We testen de

39

aanwezigheid van chromosomen m.b.v. karyotypering en chromosoom markers zoals isoenzymen, celoppervlakte antigenen en specifieke DNA sequenties. Helaas zijn er nog geen markers beschikbaar voor chromosomen.3 en 13 en voor een aantal chromosomen beschikken we slechts over éen geschikte marker. Er zal geprobeerd worden om het aantal markers zoveel mogelijk uit te breiden. Bijvoorbeeld isoenzymen (i.s.m. Dr. Meehra Kahn, Leiden), celoppervlakte antigenen (m.b.v. monoclonale antilichamen) en DNA mar­kers (i.s.m. Dr. R. Michalides, R. Nusse (NKI) en J. Trapman, Erasmus Universiteit, Rotterdam).

VI.3b Lokalisatie van genen voor receptoren van MuLVen MTV

J. Hilkèns, F. Buijs, J. Hilgers, V. Kroezen en B. van der Zeijst**

De cellulaire receptoren voor ecotroop, amphotroop, xenotroop en recom­binant MuLV zijn allen verschillend i dit is gebleken uit onderzoek dat wij, en ook andere onderzoekers, de afgelopen jaren hebben uitgevoerd. Van de recombinant MCF virussen is echter niet bekend of zij allen de­zelfde of verschillende receptoren gebruiken, en op welk chromosoom de genen voor die receptoren gelokaliseerd zijn. Wanneer de MCF virussen inderdaad verschillende receptoren gebruiken, kan dit een verklaring zijn voor de weefselspecifieke tumoren die door sommige van deze virus­sen worden veroorzaakt. In het afgelopen jaar hebben we geprobeerd om m.b.v. hybrides met verschillende chromosoom samenstelling na te gaan of verschillende chromosomen en dus verschillende receptoren nodig zijn voor infectie met MCF virussen. Deze aanpak leidde echter niet tot duidelijke resultaten omdat de MCF virus preparaten onvoldoende infectieus. bleken te zijn. We zullen daarom deze experimenten uitvoeren met pseudotypes tussen MCF virussen en VSV zoals we dit eerder hebben gedaan voor MTV.

C3H-MTV en GR-MTV gebruiken een receptor waarvan het gen op chromosoom 16 is gelokaliseerd (Hilkens et al., J. Virol., in press) . Andere MTV's zoals het C3Hf virus en het "alternated" C3H virus dat niet-muizencellen infecteert, gebruiken waarschijnlijk andere receptoren want VSV(MTV) pseudotypen van deze virussen kunnen niet door een monoclonaal antili­chaam (VII P2G6 van Dr. R. Massey) worden geneutraliseerd i.t.t. VSV(MTV-C3H) pseudotypen. . Nieuwe pseudotypen tussen VSV en deze laatste MTV's zullen daarna ge­bruikt worden om een panel van somatische celhybriden te infecteren. Hieruit zal moeten blijken of er inderdaad meerdere reqeptoren zijn voor MTV, en op welk chromosoom de genen ervoor gelokaliseerd zijn. Met behulp van monoclonale antilichamen gericht tegen gp52, het virale envelopeiwit dat bindt aan de cellulaire receptor, zullen we proberen de MTV receptor te isoleren en te karakteriseren. Voor dit doel zal een ge­schikt monoclonaal anti~gp52 serum, dat niet de receptor bindingsplaats blokkeert aan sepharose gekoppeld worden. Vervolgens kan m.b.v. affini­teitschromatografie het gp52-receptor complex worden geïsoleerd.

VI.3c Expressie van MTV in somatische celhybriden

J. Hilkens, F. Buijs en V. Kroezen

De expressie van endogeen MTV in somatische celhybriden is afhankelijk van de differentiatielijn van de ouderlijke cellen. In "interlineage hybriden" tussen een epitheliale MTV producerende cel en een fibroblast komt MTV niet tot expressie i.t.t. "interlineage hybriden" tussen bij-

*Cancer Institute, Tokyo, Japan **Rijksuniversiteit Utrecht

40

voorbeeld twee mammakliercellen. In het eerste geval blijkt MTV echter wel te kunnen worden geïnduceerd m.b.v. langdurige groei in dexametha­sone bevattend medium. Er zal geprobeerd worden uit te zoeken of de regulatie van de expressie op DNA niveau plaatsvindt, bijvoorbeeld door methylering van het pro­virale MTV in de interlineage hybriden. Dit laatste kan gemakkelijk wor­den onderzocht m.b.v. restrictie enzymen. Het mechanisme van de MTV in­ductie m.b.v. dexamethasone (dat afwijkt van de normale reeds lang be­kende MTV stimulatie) zal eveneens onderzocht worden met behulp van re­strictie enzymen, omdat hier ofwel dereethylatie ofwel herintegratie van MTV-DNA plaatsvindt dat niet door het repressie mechanisme na fusie wordt beïnvloed.

VI.3e Differentiatie markers van de mammaklier en mammatumoren

J. Hilkens, F. Buijs, H. Haisma, ph. Hageman, J. Hilgers, V. Kroezen, D. Schol en M. van der Valk

Gedurende de afgelopen jaren z~Jn er in totaal 22 monoclonale antilicha­men tegen melkvet globule membranen gemaakt. Een deel hiervan is reeds goed gekarakteriseerd en het betrokken antigen kon in sommige gevallen worden geprecipiteerd. Een aantal monoclonalen vertonen dezelfde reactie­patronen op weefselcoupes en op weefselkweekcellen. Dit kan voor een ge­deelte worden verklaard doordat ze dezelfde epitopen op eenzelfde anti­geen detecteerden, hetgeen bleek uit blokkingstests. Anderen kunnen el­kaar niet blokkeren, maar binden moge-lijk toch dezelfde antigenen maar van een ander epitoop. Het komende jaar zullen we proberen na te gaan welke antisera hetzelfde antigeen detecteren door middel van immuunpre­cipitatie of kolomchromatografie. Wanneer we de antigenen voldoende kun­nen zuiveren zal er geprobeerd worden om RIA's te ontwikkelen voor het aantonen van de antigenen in het serum van patienten met metastasen. Verdere specificiteitstests zullen worden uitgevoerd op weefselcoupes, waarna geprobeerd zal worden correlaties te leggen tussen prognostische en diagnostische gegevens en de aanwezigheid van bepaalde antigenen (zie ook Sektie X). Een en ander zal in samenwerking met Dr. B. Rasmussen '(Breas-t Cancer Registry, Denemarken) en Dr. U. Koldovsky (Frauenklinik, Dortmund) geschieden. 'Inmiddels hebben we de beschikking gekregen over een aantal monoclonale antilichamen tegen HMFG uit andere laboratoria. We zullen proberen na te gaan in hoeverre die vergelijkbaar zijn met de onze. In samenwerking met Dr. Hoefnagel zijn we begonnen met de in vivo lokalisatie van humane mamma tumoren in naakte muizen. We zullen de daarvoor noodzakelijke tech­nieken van in vivo imaging (zie VI.3) verder verfijnen en tenslotte deze toepassen bij de lokalisatie vanlymfklier metastasen bijpatienten.

De expressie van het Mam-3 en het Mam-6 is heterogeen op.weefselcoupes maar ook op in vitro cellijnen. We zullen proberen de oorzaak hiervan op te sporen op in vitro cellijnen met behulp van de celsorter. Mogelijk is dit afhankelijk van de celcyclus of van het differentiatiestadium waarin de cellen zich bevinden. Ook de functie van deze moleculen op het cel­oppervlak zal indien mogelijk worden bestudeerd. Wat betreft de genetica van de expressie van deze antigenen zal gepoogd worden somatische celhybriden te genereren met human melkklier-en mamma­tumorcellen, speciaal interlineage hybriden met muizenmelkklier- en tu­morcellen. Een en ander vlOrdt uitgevoerd .mede in het kader van een pro­iect in het Scripps Institute (Dr. T. Edgington)

VI.3f Monoclonalen tegen humaan zure ~-glucosidase

J. Hilkens, F. Buijs, O. Damsma*, J. Hilgers en J. Tager*

Het aantal monoclonale antisera tegen~-glucosidase werden de afgelopen

41

jaren gemaakt en gekarakteriseerd. Tenminste 5 epitopen konden worden onderscheiden waarbij twe~ alleen op gedenatureerd en drie op gedenatu­reerd en natief~-glucosidase voorkwamen. Een van de laatsten bleek de binding van het substraat te remmen en dit epitoop bleek niet op de 96kD ~-glucosidase precursor voor te komen. Het komende jaar zal geprobeerd worden om nog een aantal anti~-glucosi­dase monoclonalen te maken die vooral op het natieve enzym voorkomen. Een geschikte test is hiervoor ontwikkeld. Ook zal geprobeerd worden meer monoclonale antilichamen te verkrijgen die een onderscheid maken tussen de precursor en het "mature" enzym. Er zal gestart worden met productie van monoclonale antilichamen tegen andere lysozomale enzymen dan het~-glucosidase.

VI.3g In vitro differentiatie van mammatumor stamcellen

A. Sonnenberg

In het afgelopen jaar zijn van een virus-geïnduceerde mamma tumor een groot aantal cellijnen geïsoleerd met verschillende morfologie en karak­teristieken. Deze cellijnen zullen eerst worden getypeerd met celmarker antisera zoals myosine, keratine en vimentine om ze hiermee te correle­ren aan de in vivo situatie. Verder zullen de twee processen van diffe­rentiatie en transformatie verder worden bestudeerd op moleculair-bio­logisch- en op eiwitniveau. Op moleculair-biologisch niveau zal verder worden nagegaan in hoeverre herintegratie van MTV belangrijk is voor het transformatieproces. Op eiwitniveau zal getracht worden om monoclonalen te maken tegen antigenen die differentiëren tussen de verschillende celtypen. Deze monoclonalen kunnen dan later worden gebruikt bij de bestudering van deze processen. Allereerst zullen de reeds aanwezige monoclonale antilichamen hierop ge­test worden. Tevens zullen deze monoclonalen getest worden op primaire tumoren en metastasen om na te gaan of hiertussen verschillen bestaan in antigen expressie.

VI.3h Immunotherapie met monoclonale antistoffen in twee muizeturr.or sys­temen: GRSL en DBA/SL2

H. Haisma, J. Hilgers, J. Hilkens, H. Dullens** en W. den Otter**

Al sinds het begin van deze eeuw probeert men tumoren ~e behandelen met antisera (review: Currie, Br. J. Cancer 26: 141, 1975). Onder bepaalde omstandigheden bleek het mogelijk tumor regressie te verkrijgen door be­handeling met (monoclonale) antisera (Wright & Bernstein, Prog. Exp. Tumor Res. 25: 40, 1980). Ons onderzoek hiernaar ~icht zich voornamelijk op de productie van rr.ono­clonale antilichamen die een zekere specificiteit hebben ten opzichte van twee leukemieën, de van de GR stam afkomstige GR leukemieëndie geïn­duceerd worden door wrv, en de uit de DBA/2 stam afkomstige SL2. In het Annual Report van 1981 berichtten wij over celoppervla'kte anti­genen van de GRSL tumoren, welke onderzocht werden met behulp van be­staand~ monoclonale antisera. Wij lieten zien dat geen van de onderzoch­te antisera erg specifiek was voor de GRSL ccl] Ljnen, cn dat zij daarom niet 1n aanmerk1ng konden komen voor immunotherapie expcrimcmten. We willen proberen om de komende jaren zelf speçifieke rr.onoclonale anti­sera te produceren. Deze monoclonale antilichamen zullen dan getest wor­den op hun specificiteit voor de tumorcel, maar vooral ook voor de affi­niteit van het antilichaam voor het antigeen op het celmembraan. Ook zal

*Univer!'litelt van IImsterrlam **RijkhlunivC'rsiteit Utr"chl".

42

nagegaan worden of de gevonden antigenen moduleerbaar z~Jn, daar dit voor de immuuntherapie van leukemie belangrijk kan zijn (Ritz et al., Blood 58: 141, 1981). Deze antisera zullen we dan gebruiken voor tumor­lokalisatie in vivo door ze met een geschikt isotoop te labelen (b.v. 123I), en ze vervolgens bij tumordragende muizen in te spuiten. Het dier wordt hierna met behulp van een gamma camera "gescand" (Ballon et al., Science 206: 844, 1978). Verder willen we de antilichamen gebruiken voor therapie experimenten, waarbij de antilichamen eerst uitgetest worden op in vitro cellijnen van de leukemieën. In deze experimenten willen we vooral nagaan of er een synergistische werking bestaat van antilichamen met cytostatica of toxi­nes (Dulbecco, Nature 248: 81, 1974; Vennegoor et al., Europ. J. Cancer 11: 725, 1975). Ook zal getracht worden.conjugaten te maken van anti­stoffen met cytostatica of toxines, welke biologisch actief zijn, in vitro en in vivo (Thorpe et al., Nature 271: 752, 1978; Dullens & De Weger, Cancer Chemother. Pharm. 4: 29, 1980). Tenslotte zullen dan deze combinaties van antistoffen met cytostatica of toxines, en de conjugaten tussen de antistoffen met de beide andere stoffen in vivo uitgetest worden naar hun vermogen om een reeds gemetas­taseerde tumor na verwijdering van de primaire tumor, te behandelen.

VI.4 Pathologie van tumoren bij proefdieren

M.A. van der Valk

Zoals beschreven in het jaarverslag van 1982 blijkt dat van enkele mui­zenstammen de overleving zowel als de tumorincidentie zich heeft gewij­zigd sinds de'sanering in het nieuwe gebouw. Derhalve zullen voor deze en nog enkele andere stammen deze gegevens worden uitgewerkt c.q. verza­meld worden. Daar ook de BALB/cHefC3H stam opnieuw beschikbaar lijkt te zijn gekomen, zal gecontroleerd worden of, evenals dit destijds, vóor de sanering, het geval was, metastasering van mammacarcinomen naar de long optreedt. Hierbij zal speciaal gelet worden op de eventuele relatie tussen mammatumor incidentie/metastaseringsfrequentie en de groeisnel­heid van onderhavige tumoren. Soortgelijk werk, zoals gepland in de werkplannen van 1983, lijkt minder vruchtbaar t.g.v. cysteuse degenera­tie van de gebruikte (chemisch geïnduceerde) longtumoren. Groeisnelheid, differentiatie en invasie dan wel infiltratie van mamma­tumoren zullen ook de komende tijd onderwerp van studie zijn: hetafge­lopen jaar werd een serie GR-mammatumor transplantatielijnengeselecteerd, welke in diverse eerder genoemde eigenschappen sterk verschillen. Het feit dat al deze tumoren afkomstig zijn van slechts enkele primaire (spontane) GR mammatumoren en continu in een "in vivo" systeem zijn aan­gehouden, verschaft de mogelijkheid de waarschijnlijk van nature aanwe­zig zijnde variatie in differentiatie mogelijkheden binnen éen tumor, te bestuderen. De tot nu toe uit dit systeem verkregen gegevens m.b.t. hormonale groei­behoefte, differentiatie t.g.v. toegevoegde hormonen, biologisch gedrag en grover histologisch en vasculair patroon zullen nader worden uitge­werkt. Hierbij zal gebruik worden gemaakt van peroxidase gelabelde lec­tines (Dr. Ph. Hageman) en waar mogelijk, van monoclonale antilichamen zoals geproduceerd door Drs. A. Sonnenberg. Diverse tumortypen uit deze serie zullen bovendien op de eventuele extra inbouw van MMTV-DNA kopieën worden bestudeerd door Dr. R. Nusse. Aldus bestaat de mogelijkheid de invloed van dergelijke kopIeën, wat betreft het aantal zowel als hun plaats in het genoom der tumoren te correleren met eerder genoemde bio­logische en histologische variabelen. Het feit dat enkele van de tumor sublijnen in groeipatroon en differen­tiatie gelijkenis vertonen met bij de hond en kat bekende beelden en te­vens met huid-"adnex"-tumoren - andere dan die van de mamma - bij deze dieren en de mens, lijkt betekenisvol voor vergelijkende studies. . Op de in het jaarverslag van 1982 vermelde problematiek rond de AKR stam waarbij bleek dat het continu over uitsluitend- 3de -nesten kweken een

43

sub stam oplevert met zeer slechte reproductie-eigenschappen, zal nader worden ingegaan. Het is nog niet bekend of deze fokmethode tevens leidt tot verhoogde tumorincidentie, eventueel in combinatie met verandering van type en verspreiding in het organisme. De eventuele mogelijkheid van hernieuwde "infectie" van embryonale germinale cellen door MuLV is van ' belang als mogelijke etiologische factor in de tumorigenese bij de mens.

Naast bovengenoemde werkzaamheden zal, waar daar behoefte aan bestaat, steun worden verleend - pathologie, histologie - aan diverse andere pro­jecten, wa~ronder die van Dr. Ph. Hageman (Xl, Drs. A. Sonnenberg (VIl, Ir. J. Hilkens (VIl, Drs. L. Oomen (VIl en Dr. P. de Graaf (Xl, Dr. ~iJ. Misdorp (Xl, en worden deelgenomen aan andere werkverbanden.

VI.5 Proefdierkunde

R.J. Nikkels, W.F. de Jong, U. Peter, J. Hilgers, G. R6pcke, P.J. Hand­graaf, M.J.A.M. van den Bersselaar, B. de Graaf, E. van Gelderop, 'R. Beurs en F. Klein '

oPreser'vering van muizen- en rattenstammen door invriezen van bevruchte eicellen, Eind 1984 zal naar verwachting ongeveer 80% van het totale stammenbe­stand van het Antoni van Leeuwenhoekhuis zijn ingevroren. De techniek van implantatie van in diepgevroren staat bewaarde eicellen in uteri van pleegmoeders is reeds meermalen geslaagd en zal als routine handeling toegepast blijven worden om in voorkomende gevallen zo snel mogelijk een stam 'uit de diepvries terug te kunnen halen. '

.Planning proefdiergebruik en vlotte levering van bestelde dieren De in 1981 gestarte planning van de 'voor experimenten benodigde proef­dieren wordt sindsdien tweemaal per jaar herhaald. Aan de hand van de geplande aantallen per stam wordt de 'vermeerdering en zonodig o'ok dOe stamlijnfok bijgestuurd. Als de planning in vergelijking met de voor­gaande periode aanzienlijk is. ,,\:oegenomen kan het wel eens zeer ,lang du­ren voordat,de gewel1s-Ee äanpassing is :bereikt. Om deze aanpassing zo snel mogelijk te bereiken is het wel eens nodig in het, begin van de pe­riode diere'ri voor' vermeerdering in te zet'ten die in de voorgaande periO­de beschikbaar zouden zijn gekomen voor levering aan de gebruiker. Hoe­wel men in de afdeling proefdieren zeer wel beseft dat plannen van toe­komstig proefdierg'ebruik voor experimenten een zeer moeilijke en soms onmogelijke zaak is, moet de onderzoeker evenzo beseff~n dät de afdeling proefdieren niet van alle aanwezige 108 stammen (145 stammen gewenstl on­beperkte hoeveelheden op a'froep kan leveren.

Zeer onbevredigend is hèt feit dat de onderzoekers van het Centraal La­boratorium van de Bloedtransfusiedienst, die ook regelmatig dieren bij het Antoni van Leeuwenhoekhuis bestellen, ondanks herhaaldelijk aan­dringen, zowel door het Antoni van Leeuwenhoekhuis als door het hoofd van de afdeling proefdieren van het Centraal Laboratorium van'de Bloed­transfusiedienst, nimmer hun planning hebben opgegeven.

De wekelijkse computerlijsten met beschikbare dieren blijken in de prak­tijk nog niet volledig bevredigend te functioneren. Door tussentijdse leveranties is het aantal opgevoerde dieren vaak al niet meer aanwezig. Veel onderzoekers zijn daarom overgegaan tot telefonische informatie alvorens te bestel,len. In de praktijk leidt dit tot een onacceptabele verstoring van de werkzaamheden op de, afdelingen vermeerdering en stam­lijnfok. Om deze problemen te ondervangen wordt gewerkt aan een systeem waarbij op de bedrijfsleiding continu bekend is welke dieren beschikbaar zijn. Voorlopig gebeurt dit op basis van de wekelijkse computerst'aten aangevuld met persoonlijk handwerk van de bedrijfsleiding. In de to'ekomst zal een'en ander volledig geèomputeriseerd gaan plaatsvinden.

44

.Uitbreiding diagnostiek De besmettingsdruk op de experimentele afdelingen in het G-gebouw begint sterk toe te nemen doordat velen het nodig achten levend materiaal (tu­moren, cellijnen, hybridoma's) in de experimentele afdelingen in G in dieren te brengen. Hierbij wordt zoveel mogelijk gebruik gemaakt van de tussenstap in een quarantaine-isolator en uitgebreide microbiologische controle.-Helaas is dit niet altijd mogelijk. Om snel te kunnen reageren is het noodzakelijk dat de virologische diagnostiek, die tot nu toe wordt uitbesteed, in het eigen laboratorium wordt verricht. Daarnaast is invoering van de diagnostiek van strikt anaerobe bacteriën noodzakelijk. De hiervoor benodigde apparatuur is nog niet in huis. Een en ander vraagt wel om uitbreiding van de ruimtelijke faciliteiten voor het labo­ratorium.

45

46

SEKTIE VII. HORMONALE FACTOREN BIJ HET ONSTAAN EN DE GROEI VAN TUMOREN

VII ,1 DE INVLOED VAN PROLACTINE EN STEROID HORMONEN OP HET ONTSTAlI..N EN DE GRC C:IVAN MAMlI[ATUi'10REN BIJ MUIS EN RAT

A.A.van der Gugten, H.G.Kwa, G.Röpcke, A.A.Verstraeten, P.van Balen, E.M. Groeneveld, T.M.Luub, F.Verhofstad.

De invloed van hormonen, en in het bijzonder die van het hypofyse hormoon prolactine, op het ontstaan van mammaturnoren vormt een belangrijk onder­werp binnen de sectie endocrinologie. De turnorigene werking van prolac­tine is in het proefdier model met zekerheid aangetoond. Oestrogenen (voor het onderhouden van de prolactine secretie) en progesteron (als co-carcinogene factor) spelen tevens een rol. Het ontbreekt nog aan in­zichten in de mechanismen die de resistentie tegen het ons taan van mam­matumoren veroorzaken. Een verband met verschillen in hormoon regulatie is niet uitgesloten te achten. De projecten die vallen onder bovenstaand hoofd zijn te verdelen over de volgende typen vraagstellingen:

ea De stamverschillen in het ontstaan van mammaturnoren bij muizen en hun eventuele hormonale achtergrond. Het bijbehorend onderzoek kan worden verdeeld in onderzoek bij de congene stammen GR-Mtv-2- en 020-Mtv-2+ welke met hun oorspronkelijke stammen GR en 020 worden vergeleken (hier­bij treedt tevens het virale aspect van de mammacarcinogenese op de voor­grond) en onderzoek bij de recombinant ingeteelde stammen tussen BALB/c en STS (waarbij geen viraal aspect is betrokken).

eb Het meten van prolactine en zijn structurele varianten bij de rat. Tot op heden zijn de plasma prolactine spiegels bepaald met conventionele antisera opgewekt in het konijn. Gezien het bestaan van structurele vari­anten van prolactine (het intakt hormoon met M=24000, en de fragmenten met H=16000 en 1-1=8000, waarvan het 16 K fragment de hoogste biologische activiteit bezit) dienen ook bepalingen in het plasma te geschieden met monoklonale antilichamen tegen deze fragmenten. Ook zijn wij in het be­zit van een ratte lymphoma cellijn (welke voor groei van lactogene hor­monen afhankelijk is waarmee wij in principe in staat zijn de mitogene activiteit van de prolactine varianten te meten.

ec De regulatie van de prolactine receptoren. Naast de regulatie van de prolactine secretie speelt de regulatie van de prolactine receptoren op de celmembranen van de doelwitorgaan waarschijnlijk een even belangrijke rol. De concentraties ervan te meten m.b.v. de radioreceptorassay, waar­bij gebruik gemaakt wordt van de competitie om binding aan de receptor tussen gelabeld en ongelabeld prolactine, is hierbij niet alleen voldoen de, daar beide hormonen in affiniteit voor de receptor kunnen verschil­len. Een isolatie methode voor de PRL receptor is thans beschikbaar,zo­dat isolatie en antiserum productie (conventioneel zowel als monoclonaal) alsmede de ontwikkeling van een radioimmunoassay tot de mogelijkheden be­horen.

47

VII.2 ONDERZOEK NAAR DE BIJDRAGE VAN PROLACTINE AAN HET ONTSTAAN EN DE GROEI VAN BORSTKANKER BIJ DE MENS

H.G.Kwa, A.A.Verstraeten, E.M.Groeneveld, A.M.A.Sanders, F.Verhofstad

OIn samenwerking met het New York University Medical Center en het ICRF (London) zal een onderzoek gestart worden waarin prospectief gekeken zal worden naar de relatie tussen risico factoren voor borstkanker en para­meters van de endocriene functie (e.g.E2, progesteron en prolactine me­tingen in het bloed). Van circa 30.000 vrijwilligsters zal in een perio­de van 3 jaar een aantal bloedmonsters genomen worden (pre-menopausale: 3 maal per jaar, post-menopausale: 1 maal per jaar). Om te verifiëren of de bloedafname in de luteale fase valt zullen progesteron bepalingen gedaan worden in saliva monsters die 4, 2 en 0 dagen v66r en 3 en 6 da­gen na de bloedafname verkregen zijn. De eerste dag van de volgende men­struele bloeding zal dienen als bevestiging van de fase van de menstrue­le cyclus. Het is te verwachten dat er binnen 5 jaar genoeg "early stages of cancer" gevallen zijn voor een retrospectieve analyse van de relatie tussen de verschillende hormoonspiegels en het optreden van borstkanker.

oOm na te gaan of humaan groeihormoon (HGH) dan wel HGH varianten (i.s.m. Dr U.J.Lewis, USA) een rol spelen bij de fysiologische en/of pathofysiologische regulering van de mamma zullen deze stoffen, speciaal degene met een verhoogde duivendrop activiteit, in een radioimmunoassay gebruikt worden om patienten materiaal (zie werkplannen VII.5.c) te on­derzoeken. Verder zal de mitogene werking van deze stoffen nader onder­zocht worden in kortdurende kweken van melkklieren van GR muizen.

VII.3 ONDERZOEK VAN STEROIDHORMOON RECEPTOREN IN RELATIE MET HET ONTSTAAN EN DE GROEI VAN MAMMATUMOREN

M.Sluyser, C.C.J.de Goeij en S.G.Evers

oHormoongevoelige mamma tumoren van GR muizen zullen gebruikt worden voor onderzoek naar de beste combinatie van hormonale en chemotherapie van borstkanker. Bestudeerd zal worden welke sequentie van behandeling de beste resultaten oplevert, en welke hormonale antagonisten en cytosta­tica het beste gebruikt kunnen worden in de combinatietherapie. Ook het effect van alternerende behandelingen zal getoetst worden.

eDe zUivering van de glucocorticoid receptor (GluR) uit muizelever en mammatumoren van de GR muis zal worden voortgezet. De gezuiverde prepa­raten zullen gebruikt worden voor studie van de interactie van het GluR molecuul met MMTV provirale sequenties, m.n. hét long terminal repeat (LTR). Monoclonale antilichamen zullen bereid worden tegen GluR.

oChromosoom abnormaliteiten die optreden tijdens de progressie van GR mammatumoren zullen nader worden onderzocht. Bestudeerd zal worden of bepaalde veranderingen in karyotype samenhangen met het verlies aan hor­moongevoèligheid.

oIn samenwerking met andere laboratoria zullen enzymbepalingen in GR mam­matumoren worden voortgezet teneinde mogelijke correlaties met hormoon­gevoeligheid of-ongevoeligheid te ontdekken. Indien dergelijke correla­ties worden waargenomen zouden deze enzymen eventueel gebruikt kunnen worden als (extra) markers voor hormoongevoeligheid of -ongevoeligheid van borstkanker.

oBestudering van het effect van'hormonen en tumor promotoren (TPA) op DNA synthese in muize-melkklieren in de kweek. Wij zullen nagaan of er verschillen in gevoeligheid best'aan tussen mamma I s afkomstig van mui ze­'stammen met een hoge en lage gevoeligheid voor mammatumorontwikkeling.

48

VII.4 MODELONDERZOEK OVER COMBINEREN VAN HORMONALE EN CYTOSTATISCHE BEHANDELING VAN M&~TUMOREN

A.Timmermans, C.Benckhuijsen

Tijdens de eerste fase van hGrmonale regressie van hormoon-gevoelige mamma tumoren , wordt het intracellulaire gehalte aan S-glucuronidase ver­hoogd. Er vindt verhoogde synthese van enzym plaats. In projekt VIII.2 is aangetoond dat er in het cytosol van chemisch geïndiceerde rattemamma tumoren een 5-voudige toename van enzym optreedt die zich onafhankelijk gedraagt van een 2-voudige verhoging van lysosoom-gebonden zure hydrola­sen. Aniline mosterd wordt in de lever gehydroxyleerd en omgezet in het glu­curonide van p-hydroxyaniline mosterd. Deze metaboliet is cytostatisch inaktief, maar wordt door S-glucuronidase omgezet in het zeer reaktieve p-hydroxyaniline mosterd. Ons onderzoek is erop gericht om eventueel gebruik te maken van het ver­hoogde gehalte aan S-glucuronidase tijdens hormonale regressie voor ak­tivering in de tumor zelf van p-hydroxyaniline mosterd. Er werd in vivo een synergisme aangetoond tussen ovariectomie en behandeling met aniline mosterd, 8 weken eenmaal per week gegeven, of in een korte kuur op dag 3-7 na ovariectomie, gevolgd door 6 weken een wekelijkse dosis. Melpha­lan, dat nietgemetaboliseerd wordt, bleek in het eerst genoemde schema van behandeling niet synergistisch te werken. In het tweede geval leek wel een versterking van het effekt van ovariectomie te kunnen optreden. De mogelijke overeenstemming tussen het effekt van anilie mosterd, dat geaktiveerd moet worden, en melphalandat direkt werkzaam is wordt ver­der bestudeerd. Uit de literatuur is bekend dat alkylerende middelen meer aan chromatine gebonden worden ten tijde van verhoogde RNA synthese in de kern. Het is bekend dat bij hormonale regressie van mamma tumoren verhoogde synthese van RNA en eiwit een belangrijke funktie heeft. Er zou zodoende ook een verhoogde gevoeligheid kunnen optreden voor het effekt van alkylerende middelen in het algemeen.

Plannen:

.Nader onderzoek over het synergisme van melphalan en ovariectomie ver­geleken met dat van aniline mosterd. Het is inmiddels aangetoond (an­nual Report 1982) dat de mediane waarde voor de tijd die nodig is om complete remissies te bereiken voor melphalan na ovariectomie aanmerke­lijk hoger is (1.4 en 1.9 maal, 2 exp.) dan voor de combinatie met ani­line mosterd. Nagegaan zal worden of de voortgezette behandeling met een wekelijkse dosis na de 5-daagse behandelingskuur de vergelijking van beide cytostatica vertroebeld kan hebben. Tevens dient de toepassing van de tCR(=de tijd tot aan complete remissie) als parameter voor cytosta­tische effektiviteit nader geëvalueerd te worden. Ook de waarde van berekeningen van remissieduur zal worden geanalyseerd. Intercurrente tumoren maken helaas in een deel van de gevallen langduri­ge observatie onmogelijk. Er blijft gezocht worden naar een tumorsysteem dat minder sterk hormoon­gevoelige tumoren geeft die meer met het karakter van menselijke mam­macarcinomen overeenstemmen .

• Vanwege het mogelijke praktische klinische belang van een synergisme tussen hornomale behandeling en alkylerend agens zal voorrang gegeven worden aan een experiment met tamoxifen, ter vergelijking met synergisme bij ovariectomie. .

.Medroxyprogesterone acetaat (MPA) kan regressie veroorzaken van DMBA rattemamma tumoren. Het wordt klinisch onderzocht, o.a. bij mammacar­cinoom. Het hormonale effekt is meervoudig; in normaal mammaweefsel wordt een beeld van hypersecretie opgewekt. Behandeling met MPA, in combinatie met alkylerend middel komt in aanmerking om bestudeerd te worden, op grond van het specifieke hornomale principe van· remissie-inductie.

49

VII.5 HORNONALE RISIKOFAKTOREN EN NAMMACARCINOON BIJ DE HENS

P.F.Bruning, H.Bonfrèr, E.Groeneveld, A.A.N.Hart, N.de Jong-Bakker, J.C.G.N.Kager, H.G.Kwa, D.Linders, J.J.M.van Loon, W.Nooyen, F.Verhof­stad, R.Verstraeten

Ga Horrnones and breast cancer. Het doel van projekt KWF-NKI 80-1 is de bestudering van hormonale factoren die verband houden met mammacarcinoom, met speciale aandacht voor de rol van afwijkingen in het diurnale ritme van de prolactine plasmaconcentratie bij vrouwen "at risk". Meer speci­fiek betekent dit: eVerder longitudinaal onderzoek van diurnale plasma prolactine patronen bij pre~menopausale vrouwen met een bekend verhoogd risico voor het krij­gen van manunacarcinoon, in vergelijking tot normale "matched controls" en vrouwen behandeld voor mammacarcinoom of benigne proliferatieve lesies als middel om te komen tot selectie voor verdere screening van vrouwen "at risk". oOnderzoek van de plasmaconcentratie patronen van progesteron en oestro­genen (totale en "available" fracties), i.v.m. hun potentiële relatie tot prolactine spiegels en van cortisol i.v.m. de belangrijke invloed van "stress" op plasma prolactine. oDe resultaten van dit onderzoek kunnen de basis vormen voor een prospec­tief onderzoek waar vrouwen "at risk" profylactisch worden behandeld met medicamenten, die onvoldoende corpus luteumfunctie ondervangen of sub­tiele diurnale prolactine-afwijkingen tegengaan. Het belangrijkste doel van het onderzoek is de bevestiging en uitbrei­ding van Kwa's gegevens over de "vroege avondpiek" van het plasma pro­lactine (gevonden bij vrouwen "at risk" in een "cross-sectional" onder­zoek op Guernsey) bij de volgende groepen pre-menopausale vrouwen gedu­rende de luteale fase vande menstruele cyclus: 1. Vrouwen "at risk" vanwege hun familiaire belasting (n=20): om repro­duceerbaarheid en mogelijke seizoensinvloed beter te leren kennen wordt het onderzoek bij deze groep binnen 6-9 maanden herhaald. 2. Normale controles "gematched" met groep 1 (n=20) 3. Vrouwen met histologisch bewezen benigne proliferatieve mammaafwij­kingen (n=20) 4. Vrouwen minstens 6 maanden tevoren curatief behandeld voor mammacar­cinoom TINONO (n=20)

ob Prolactine "varianten" en mammacarcinoom bij de mens Vanwege de grote betekenis van prolactine voor het ontstaan van mamma tu­moren bij rat en muis en de fysiologische rol van prolactine bij de ont­wikkeling en funktie van de humane melkklier is veel onderzoek gedaan naar de mogelijke betekenis van prolactine voor het ontstaan van mamma­carcinoom bij de mens. _Behalve de observatie van Kwa et al (Int.J.Cancer 20:12,1977) betreffende het v66rkomen van een subtiele voorbijgaande ver­hoging van de prolactine concentratie in het serum van pre-menopausale zusters van mammacarcinoompatiënten en adipeuze post-menopausale nul­liparae (de "early evening peak") in een cross-sectional beVOlkingsonder­zoek op Guernsey, heeft dit onderzoek geen duidelijke aanwij2ingen opge­leverd voor een rol van prolactine bij het ontstaan van humaan mammacar­cinoom-. Tot dusver werd prolactine steeds bepaald met behulp van conven­tioneel verkregen antiserum. Net het ter beschikking krijgen van monoclo­nale antistoffen willen wij de mogelijkheid onderzoeken of er sprake is van prolactine-varianten met betekenis voor het ontstaan van humaan mam­macarcinoom. Hiertoe zal het plasma verkregen van vrouwen "at risk", "matched controls" en vrouwen met mammacarcinoom worden onderzocht. Om onafhankelijk te Zijn van snelle fluctuaties van de peptide hornoom-con­éentraties in plasma zal materiaal worden gebruikt dat verkregen is uit kontinue veneuze bloedafname gedurende tenminste 7 uur onder standaard­condities, zodat een concentratie x tijdprodukt of "oppervlak onder de kurve" kan worden beschouwd. Dit in 1983 aan te vangen onderzoek zal wor­den begonnen met drie monoclonale antistoffen gericht tegen epi topen ge-

50

legen op verschillende delen van het prolactine molecuul. Hiervoor zal ongeveer een jaar nodig zijn.

Oc Groeihormoon-varianten en mammacarcinoom bij de mens Van humaan groeihormoon (GH) chorionic somatomammotropine (CS) en pro­lactine (PRL) zijn groeibevorderende en lactogene effekten bekend. GE en CS zijn structureel voor 85% homoloog. De strukturele overeenkomst van GH en PRL is slechts zeer gedeeltelijk (26%). Uit recent onderzoek is gebleken dat menselijk GH, net als b.v. globines en immuunglobulines uit een multigene familie van GH-varianten bestaat. (U.J.Lewis et al. Rec.Progress in Hormone Research 36: 477-504, 1980, D.D.Moore et al., Cell 29: 285-286, 1982). Om na te gaan of GH zelf, dan wel structurele varianten van GH betekenis hebben ten aarzien van het ontstaan van mammacarcinoom zal hetzelfde patientenmateriaal als vermeld onder VII.5,b worden onderzocht op het v66rkomen van o.a. 22 K GH, 20 Kd GH en subtilisin cleavage products GH-S. Hiertoe wordt gebruik gemaakt van gezuiverde hormoonpreparaten ter beschikking gesteld door U.J.Lewis en conventioneel antiserum ge­richt tegen "crude" hypofyse-extract (NKI). Dit in 1983 aan te vangen projekt zal ook in 1984 naar verwachting veel aandacht vragen.

Gd Oestradiol-plasma eiwit-binding en mammacarcinoom bij de mens P.K.Siiteri et al. heeft waargenomen dat het totaal plasma oestradiol (E2) bij vrouwen met mammacarcinoom binnen normale grenzen ligt, maar dat de fraktie niet aan eiwit gebonden El statistisch signifikant ver­hoogd was vergeleken met een kontrole'groep' (P. K. Sii teri in Banbury Re­port, 8, Hormones and breast cancer, M.C.Pike et al. eds. Cold Spring Harbor Laboratory 1980, p. 87-101). Deze waarneming werd recent bevestigd door J.W.Moore, G.M.G.Clark, R.D. Bulbrook, J.L~Hayward, J.T.Murai, G.L.Hammond and P.K.Siiteri (Int.J. Cancer 29: 18-21, 1982). De "sex hormone binding globulin (SHBG) binding capacities" voor dihy­drotesteron (DH T) waren normaal. Wij zullen, bij bevestiging van deze waarneming in ons materiaal van VII.5 a,b en c, de E2- en El-bindingskarakteristieken van SHBG en albu­mine nader onderzoeken bij dezelfde groepen vrouwen aan de hand van Scatchard-analyse en patienten met mammacarcinoom.

51

52

SEKTIE VIII. EXPERIMENTELE CHEMOTHERAPIE EN RADIOTHERAPIE

VIII.2 Hormonale regressie en gevoeligheid voor cytostatische therapie

C. Benckhuijsen, M. Hillebrand

Recent is in het K.W.F. project NKI 80-3: uA study of lysosomal enzymes sensitizing hormone-responsive mammary tumors to treatment with aniline mustard during hormone-induced regression u door E.P. Beem et al. aange­toond dat tijdens regressie van MNU (methylnitrosoureum)-geïnduceerde hormoon-gevoelige mamma-tumoren bij de rat na ovariectomie in het cyto­sol een stijging optreedt van een S-glucuronidase activiteit die een ander tijdsbeloop en een grotere omvang heeft dan die welke aangetoond werd voor het overeenkomstige enzym in de lysosomen. Lysosomen die uit tumoren in regressie geïsoleerd werden bleken niet labieler te zijn dan die uit groeiende tumoren en bevatten slechts 1,2% vrij S-glucuronidase.

Intere~se in vrij oplosbaar S-glucuronidase berust op de vraagstelling of d{tenzym een onwerkzaam geglucuronideerd cytostaticum zoals p-hydro­xyaniline mosterd glucuronide in de tumor zelf zou kunnen omzetten in het zeer actieve p~hydroxyaniline mosterd. In biologische experimenten met PMBA- of MNU-geïnduceerde mamma tumoren bij SD ratten is aangetoond dat er een synergisme bestaat bij ovariectomie gecombineerd met aniline mosterd. De specificiteit van dit synergisme voor cytostatica die door glucuronidering geïnactiveerd worden staat evenwel tot nu toe niet vast. Melfalan dat geen metabolisme ondergaat, wordt onderzocht om na te gaan of er ee~zelfde synergisme met ovariectomie op kan treden (project VII. 4). Het lijkt interessantom een vergelijking te trekken met de inter­actie tussen glucocorticoid hormoon en melfalan bij humane melanoom­cellen in vitro (zie project VIII.4a). Men kan veronderstellen dat de synergistische werking tussen hormonale regressie en alkylerend middel zich op meer dan één niveau zou voltrekken, te weten in de stofwisseling van het aniline mosterd en/of in de interactie ervan met doelwitten in de kern. De aanwijzingen in het melanoom onderzoek dat glucocorticoid hormoon een groeiremming geeft door ophoping van de cellen in de Gl fase van de celcyclus, zoals ook van lymfoide cellen bekend is, en daarbij een verhoogde gevoeligheid van chromatine voor een alkylerend middel veroorzaakt, doet de vraag rijzen of een mechanisme zou kunnen bestaan waarbij in het chromatine ten tijde van een enzym-inductie ten gevolge van ovariectomie een verhoogde gevoeligheid voor alkylerende middelen optreedt.

Het lijkt van belang te zoeken naar aanw~Jz~ngen of het cytosol S-glucu­ronidase,. zoals steroid sulfatase, een endocrinologische functiè vervult, en of deze eventueel van belang kan zijn in verband met hormoon-gebonden cytostatica. Daarnaas~ zal een parallel onderzoek aan menselijk tumor­materiaal wenselijk zijn. Daartoe zullen de fractioneringsmethoden die voor de tot nu toe bestudeerde experimentele tumoren ontwikkeld werden, aangepast moeten worden aan kleine monsters tumorweefsel. Mogelijk kan S-glucuronidase activiteit, en andere verwante enzymactiviteit(en) bij menselijk materiaal additionele informatie geven over een betekenis van

53,

een onafhankelijk gereguleerde S-glucuronidase in het cytosol.

Het zal ervan afhangen of externe financiering verworven kan worden in hoeverre onderzoek gedaan kan worden naar een eventuele endocrinolo­gische functie van de veranderde enzymspiegel in het cytosol en/of naar de invloed van hormonaal-opgewekte activiteitsveranderingen in het chromatine op de effectiviteit van alkylerende middelen, waaronder aniline mosterd. .

VIII.3 Verbetering van regionale perfusie chemotherapie door onderzoek in een rattemodel voor geïsoleerde perfusie in vivo

c. Benckhuijsen, W.J. van Dijk

Perfusie chemotherapie van de ledematen voor melanoom of voor sarcoma­teuze aandoeningen kan goede therapeutische resultaten geven. Voor melfalan-behandeling voor melanoom aan de extremiteiten kan met de huidige kennis van perfusie omstandigheden een maximaal 15x hogere dosis worden toegepast dan bij IV therapie, gerekend in het oppervlak onder de verdwijningscurve (Annual Report 1982, project VIII.4). Het gevaar van lokaal versterf van weefsel, waarvoor waarschijnlijk de oor­zaken verschillend zijn bij verschillende cytostatica, is echter de dosis-beperkende factor. In het kader van een KWF project: "Possible role of oxygen radicals in adriamycin toxicity in regional perfusion chemotherapy" (NKI 80-5) is hierover door S.C. van 't Hoff et al. experimenteel onderzoek verricht.

Een rattemodel voor regionale perfusie in vivo (Benckhuijsen et al., J. Surg. Oncol., 21, 1982, In press) wordt toegepast om de juiste voor­waarden voor regionale perfusie te onderzoeken. Er is in de recente literatuur veel informatie beschikbaar over de kenmerkende stofwisse­lingsprocessen in geïsoleerd doorstroomd spierweefsel en andere perifere weefsels. De vereisten die voortvloeien uit de kunstmatige perfusie omstandigheden per se, en uit de mogelijke specifieke int~racties van cytostaticum met perifeer weefsel lijken in geval van adriamycine van vierderlei aard te zijn: a) de "bufferende werking" van erythrocyten, die adriamycine reversibel ophopen, te benutten door langzame toediening of door pre-equilibratie van middel in perfusaat, zodat hoge initiële plasma spiegels vermeden worden; b) vermijden van een hoge zuurstof­spanning in de weefsels: c) onderdrukken van een catalyserende werking die ijzer lijkt te hebben bij een door adriamycine te induceren vorming van hydroxyl radicalen: d) door metabole beïnvloeding een direct schadelijke werking van bepaalde voor spier kenmerkende stofwisselings­processen op de lokaal-toxische werking van adriamycine voork6men.

Afhankelijk of er externe financiering kan worden verworven zullen de model studies, die steeds in nauw overleg met de chirurgische afdeling zijn verricht en die op directe klinische toepassi·ng zijn gericht, in 1984 gecontinueerd worden. Hierbij zal dan het onderzoek vooral gewijd zijn aan. punt d), waaraan zoals nu te· verwachten is een groot belang valt toe te schrijven zowel in verband met regionale toepassing als wel waarschijnlijk met systemische toediening van adriamycine.

VIII.4 Regionale perfusie van ledematen met cytostatica

J. Wieberdink, C. Benckhuijsen, R.P. Braat, B.B.R. Kroon, in samenwerking met E.A. van Slooten, Ph. Rümke, H.R. Marcuse, E.P. van der Esch, F.J. Varossieau en S.C. van 't ijoff (Antoni van Leeuwenhoekhuis, Amsterdam) en G.A.A. Olthuis, J.G. van Andel, J.J.A.M. Handels en J.H. Mulder (Dr. Daniel den Hoed Kliniek, Rotterdam)

"De reeds enkele jaren bestaande nauwe samenwerking tussen het NKI en de

54

Dr. Daniel den Hoed Kliniek te Rotterdam, over de regionale perfusie voor tumoren aan de ledematen wordt voortgezet. Volgens een gezamenlijk aanvaard protocol wordt perfusie behandeling bestudeerd en verder ont­wikkeld. De in beide instituten gevolgde chirurgisch-farmacologische benadering is gericht op optimale fysiologische, biochemische en farma­cologische omstandigheden in de doorstroomde regio tijdens perfusie. Er is inmiddels een samenwerking tot' stand gekomen met twee klinieken in Israel, en met het Oncologisch Centrum van de Universiteit van Djakarta. Prospectief onderzoek naar de waarde van regionale perfusie als adju­vant behandeling zou brede internationa~cooperatie vereisen. Er is een begin gemaakt met overleg over een internationaal te aanvaarden techniek voor de regionale chemotherapie. Hopelijk zullen de chirurgische en farmacologische principes die in ons onderzoek ontwikkeld zijn, hierdoor brede toepassing kunnen vinden. Punten van verder onderzoek betreffen:

1. Een studie van het principe van triple perfusies waarbij driemaal geperfundeerd wordt met optimale dosis en naar optimaal tijdschema. Samenwerking met Dr. E.D. Poetiray in Djakarta, waarvoor triple per­fusies een ruimere indicatie lijkt te bestaan dan hier te lande, vormt hierin een belangrijke schakel. Dit project wordt met financiële steun van twee Nederlandse Stichtingen "De Drie Lichten" en "WOTRO" (Weten­schappelijk Onderzoek van de Tropen) ter hand genomen.

2. Farmacokinetisch onderzoek Op grond van de resultaten van het voorgaande onderzoek over de melfalan spiegels bij perfusie van regio's van uiteenlopend volume, is besloten dat in geval van de kleinste volumina een verhoging van de dosis ge­wettigd is. Met een geringe toename in de hoeveelheid weefsel die door­stroomd wordt zal de relatieve dosis (in mg/L weefsel) echter snel moeten worden verminderd. Een te verwachten vrij sterke toename in de melfalan concentraties die het gevolg zullen zijn van verhogen van de dosis zal met de beschikbare methode voor HPLC worden gecontroleerd.

3. Voor een juiste ontwikkeling van het dosimetrische principe is het nodig om de hoeveelheid extra-cellular vocht in de doorstroomde weefsels te kennen. Hiertoe zullen metingen gedaan worden met 14C-inuline. Daar­naast zal het volume plasma in het perfusaat gemeten worden. De nood­zaak van deze metingen is gebleken uit analyse van de tot nu toe ver­kregen farmacokinetische gegevens (zie Annual Report 1982) .

4. Indien daartoe de financiële middelen worden gevonden zullen waar­nemingen over metabole processen in de doorstroomde extremiteit ter hand genomen worden omdat deze ten dele rechtstreeks betrokken lijken bij toxische schade aan het spierweefsel.

5. Klinische waarnemingen bij perfusie met adriamycine voor sarcomateuze aandoeningen in de ledematen zullen worden uitgebreid.

VIII.4a Dosis-effect relaties voor cytostatische behandeling van humane melanoomcellen in vitro

A.M. Osman*, P.J. Jansen**, C. Benckhuijsen

In dit project wordt het effect bestudeerd dat glucocorticoid hormoon bij humane melanoom cellijnen in vitro heeft op de gevoeligheid voor het alkyle'rend middel melfalan (fenylalanine mosterd). Tevens wordt verge­lijkend bestudeerd hoe de relatie is tussen de melfalan concentraties

*Uitgezonden door de Universiteit van Cairo **Met financiele steun van de Nijbakker-Morra Stichting

55

die bij klinische regionale perfusie worden bereikt (zie projectVIII.4) en de voor celdood bij enkele melanoomlijnen benodigde melfalan concen­traties. Mede hierdoor dient de nog steeds niet duidelijke waarde van perfusie behandel~ng toegelicht te worden. Gevoeligheid voor melfalan wordt gekwantificeerd door bepalen van DO en D 7 waarden. In aanwezig­heid van glucocorticoid hormoon plus alkyleren~ middel moet echter in D10 waarden gerekend worden of met een nog geringere celover~eving.

Een 1 uur durende behandeling met hydrocortison, prednisolon of dexa­methason blijkt bij M5 melanoomcellen het effect van melfalan te ver­hogen. Indien een bepaalde tussentijd tussen hormoon- en cytostatische behandeling wordt toegepast is er een onmiskenbaar synergisme. Eerste impuls-cytofotometrische analyses toonden aan dat sommige melanoomcellen na 1 uur behandeling met glucocorticoid hormoon in de Gl en in de G2+M fase opgehoopt kunnen worden, en per cellijn variërend, 1 tot 5 dagen in deze toestand worden vastgehouden. Het % S-fase cellen daalt daarbij sterk.

1. Nadat een verder overzicht verkregen zal zijn in hoeverre het genoem­de effect van glucocorticoid hormoon bij verschillende cellijnen wordt waargenomen zal worden nagegaan of en op welke wijze de verdeling over de celcyclus fasen samenhangt met de verhoogde gevoeligheid voor melfa­lan. Hiervoor zal in geschikte cellijnen de correlatie tussen synergi~e en celcyclus verdeling nagegaan worden.

2. Het is onbekend hoe bij humane melanoomcellen de gevoeligheid voor melfalan in de verschillende fasen van de celcyclus wisselt. Synchroni­satie door celscheiding, of door verzamelen van mitotische cellen zal worden toegepast om de helling van de melfalan dosis-overlevingscurve voor cellen in verschillende celcyclus fasen te vergelijken met die welke na voorbehandeling met glucocorticoid hormoon wordt gemeten.

3. De lange arretering in Glopent de mogelijkheid om een eventuele over­gang naar de GO toestand te bestuderen. Ook de mogelijkheid om een meer gedifferentieerde celvorm te induceren, zal nagegaan kunnen worden. Dit zal getoetst worden met bv. melanocyten stimulerend hormoon en retinoi­den. Het is in dit verband een voordeel dat melanoomcellen uitgesproken kenmerken van differentiatie bezitten zoals de aanwezigheid van pre­melanosomen, pigmentvorming en tyrosinase activiteit.

4. Arrest in G2+M na glucocorticoid hormoon is een nog niet bekend ver­schijnsel. Wij zullen ernaar streven na te gaan of de ophoping in Gl en die in G2+M al dan niet onafhankelijk van elkaar tot stand komen.

Geschatte duur tot medio 1984

VIII.5 Celkinetische factoren bij diagnose en behandeling van acute leukemie

L.A. Sme~s, J. Homan-Blok

De achtergrond van dit project is het bestuderen van celkinetische para­meters met behulp van o.m. flow cytofotometrie van acute leukemie voor en tijdens chemotherapie. Bij de acute lymfatische leukemie van kinde­ren is het doel het definiëren van diagnostische subcategoriën met ver­hoogd dan wel verlaagd risico bij standaard behandelingen (zie hiervoor: L.W. Dow et al., Blood, 59, 1197, 1982). Daarnaast worden celkinetische parameters gebruikt voor het vervolgen van de effecten van hoog­gedoseerd Ara-C bij kinderen met ANLL. Deze studie vormt een onderdeel van een voorgesteld protocol ANLL-(82-51) van de Stichting Nederlandse Werkgroep Leukemie bij Kinderen (SNWLK). Deze metingen worden ook ver­richt als onderdeel van een Phase 1 studie in het NKI naar de effecten 'van Ara-C - thymidine voor de behandeling van refractaire leukemieën en

56

lymfomen. Tenslotte worden laboratoriumstudies uitgevoerd aan model­systemen voor verdere analyse van klinische waarnemingen.

A. Klinische studies a.l Prognostische celkinetische factoren bij ALL van kinderen Het onderzoek naar de relatie tussen verhoogde delingsactiviteit en slechte prognose zal worden voortgezet. Ca.' 30 nieuwe patienten zullen dit jaar in de studie worden opgenomen. Met name zal worden onderzocht of de voorlopige conclusie juist is dat de experimentele celkinetische parameters voor verhoogd risico een onafhankelijke bijdrage leveren aan een verbeterde classificatie voor verhoogd risico.

De tegenpool van de hoge-risico groep wordt volgens eerdere ervaringen en recente publicaties gevormd door de hyperqiploide leukemie. Deze categorie omvat ca. 30% van alle patienten en wordt gekenmerkt door een constante verandering in het modale DNA gehalte van 20% of veelvouden daarvan. De prognose lijkt zeer gunstig. Naast het identificeren van deze patienten bij diagnose en het vervolgen van het klinisch verloop, willen wij een begin maken met.een studie naar mogelijke epidemiologische factoren uit een analyse van ca. 150 diepgevroren samples. Deze studie wordt verricht in samenwerkinq met het Emma Kinderziekenhuis, Amsterdam (Dr. H. Behrendt) en het Sophia Kinderziekenhuis, Rotterdam .(Dr. K. Hählen) .

2. Geindividualiseerde behandeling van ANLL bij kinderen Bij invoering van het SNWLK protocol ANLL-(82-51) zullen wij celkine­tisch onderzoek verrichten aan beenmergaspiraten van alle.kinderen met ANLL in de aangesloten centra (Groningen, Amsterdam, Rotterdam, Leiden, Utrecht, Nijmeqen). Als uitkomst van deze metingen volgt een patient­individueel tijdsinterval voor de toediening van Ara-C injecties (zie hiervoor: Smets et al., Blood, januari 1983, in druk). Bij enkele patienten met extreem hoge of lage delingsactiviteit zullen aanvullende aspiraten gemeten worden voor een preciese bepaling van de relatie delingsactiviteit- recruteringstijd. Van alle patienten worden echter controles gemeten vóór de tweede injectie met Ara-C. Per jaar zullen ca. 20 patienten in de studie worden opgenomen. Daarnaast bestuderen wij de proliferatie-status in het beenmerg van een aantal kinderen voor­af aan de onderhoudskuren.

3. Experimentele behandeling met Ara-C ~ thymidine In dit protocol worden refractaire leukemieën en lymfomen behandeld met alternerend hoog-gedoseerd Ara-C en infusen van thymidine. Het bege­leidend celkinetische onderzoek heeft tot doel vroegtijdige vaststelling van eventuele resistentie (zie hiervoor: Smets et al., Br. J. Cancer, 36,157, 1977), controle op de beoogde synchronisatie door thymidine en vastleggen van de tijdsduur van het infuus op basis van individuele delings-eigenschappen. Daarnaast wordt in patienten die daarvoor geschikt zijn (lymfomen) het effect van de behandeling op het normale beenmerg geevalueerd.

B. Laboratorium studies 1. Celcyclus-afhankelijkheid van corticosteroiden Corticosteroiden hebben een geringe cytostatische en cytolytische wer­king op snelgroeiende lymfoide cellijnen. High-risk ALL wordt geken­merkt door relatief grote groeifracties in beenmerg en perifeer bloed. Celproliferatie kan dus de gevoeligheid voor corticosteroiden negatief beïnvloeden. Deze mogelijkheid zal worden bestudeerd met behulp van scheidingstechnieken waarmee cellen uit subfases van de celcyclus kunnen worden geïsoleerd. In de geïsoleerde fracties wordt vervolgens de spe­cifieke binding en de biologische effecten onderzocht. In het bijzonder zullen wij bestuderen of manipulatie van de celcyclus m.b.v. zg. "bio­logical response modifiers" zoals dibutyryl cyclisch AMP, phorbolesters en prostaglandines kan leiden tot potentiëring voor het cytostaticum. Positieve in vitro resultaten zullen worden toegepast in experimentele

57

schemata voor de behandeling van tumoren in proefdieren.

2. Biologische eigenschappen van hyperdiploide leukemie Bij honorering vap een desbetreffende projectaanvraag, zal een onderzoek gestart worden naar de biologische eigenschappen van hyperdiploide ALL. Dit project beoogt in klinisch materiaal en in gekweekte cellijnen eigen­schappen van deze bijzondere subcategorie te bestuderen zoals differen­tiatie-capaciteit, proliferatiekenmerken en gevoeligheid voor' cytosta­tica.

Geschatte tijdsduur: 2 jaren voor de klinische studies (A); 3-4 jaren voor de laboratorium studies (B).

VIII.6 Celkinetische parameters

A.P.M. Jongsma, A.M. Duijvestijn, S. BOhlken, P.J. v.d. Kolk- Schaap, Y.G. Köhler

1. Ontwikkeling van een testsysteem Voor radio- en chemotherapeutische doeleinden is een in vitro test­systeem in ontwikkeling waarmee de prognostische waarde van (nieuwe) celparameters ten aanzien van de therapeutische respons kan worden ge­toetst. Hiervoor zijn goed gekarakteriseerde cellijnen nodig die in zo weinig mogelijk eigenschappen van elkaar verschillen, behalve die eigen­schap waarvoor men een discriminerende parameter wil zoeken (zie 2: Onderzoek naar de prognostische waarde van kerngrootte en micronuclei voor stralingsgevoeligheid) . Ook experimenteel onderzoek om behandelingsschema's en gecombineerde therapieën beter te onderbouwen kan binnen dit testsysteem worden uitge­voerd. Bepalingen waaraan gedacht wordt zijn: 1. Het testen van agentia (inclusief straling) wat betreft hun toxici­

teit. 2. Het bepalen van potentiërende effecten indien agentia qecombineerd

worden toegepast. 3. Het optimaliseren van gecombineerde (gefractioneerde) behandelingen

door de tijdsduur van de respons te meten en de meest geschikte tijd als interval te kiezen.

Een diermodel zal aan dit systeem moeten worden toegevoegd om de in vitro verkregen resultaten liefst op dezelfde celpopulatie in vivo te verifiëren. In 1984 wordt verwacht het totale systeem routinematig in werking te hebben. De parameters waarnaar gezocht wordt met behulp van dit systeem, worden zoveel mogelijk bruikbaar gemaakt voor eventuele geautomatiseerde analyse.

De kerngrootte en de micronuclei zijn parameters waarvan de waarde in een dergelijk testsysteem in het afgelopen jaar al eerder aangetoond kon worden

2. Onder~oek naar prognostische parameters in kweekmodellen • Kerngrootte Voor het onderzoek naar prognostische morfologische parameters werd uit­gegaan van 4 paar cellijnen (zg. tweeling cellijnen) die ten aanzien van zoveel mogelijk eigenschappen, behalve in stralingsgevoeligheid, op elkaar lijken. Morfometrie van de projectie van de kern op het subst~at (glas) toonde aan dat er een positieve correlatie bestaat tussen "kern-, grootte" en stralingsgevoeligheid in gekweekte cellen. Een groter aan­tal experimenten zal deze observatie nog moeten bevestigen. Voor het ophelderen van het mechanisme dat hieraan ten grondslag ligt (dosis modificerende factoren of verschil in repair processen) zullen deze tweeling-cellijnen verder bestudeerd worden. Inmiddels wordt deze morfometrische parameter in ons patiënten~ateriaal bepaald en gecorre­'leerd aan de klinische respons na radiotherapie om te zien of de waarde

58

van de gemiddelde kerngrootte van tumoren, gemeten in coupes, bruikbaar is om de respons te voorspellen zodat "slechte responders" niet hoeven te worden blootgesteld aan een belastende therapie.

e Micronuclei Sinds 1975 wordt regelmatig het ontstaan van micronuclei in cytoplasma tijdens de eerste delingen na lethaal toegebrachte kernschade aan cellen beschreven (Schmid, Mutat. Res. 31: 5, 1975; Hiddle, Mutat. Res. 18: 187, 1973). De vorming van deze micronuclei t.g.v. cytostatica (Wild, Mutat. Res. 56: 319, 1978) en straling blijkt dosis-afhankelijk te zijn (Mill et al., Int. J. Radiat. Biol. 39: 307, 1981). Bovendien kan de hoeveelheid gevormde micronuclei gerelateerd worden aan het percentage lethaal bestraalde cellen (Midander et al., Int. J. Radiat. Biol. 38: 237 , 1980). In ons testsysteem werd in een voorlopige studie de cor­relatie tussen het percentage cellen met micronuclei na behandeling en de relatieve stralingsgevoeligheid van de betreffende cellijnen en ook de dosisafhankelijkheid van deze parameter bevestigd. De voordelen van dit systeem boven de celoverlevingscurven zijn het snelle resultaat ende kans dat deze parameter in het begin van de behandeling bij patiënten al informatie geeft. Een groot probleem is de absolute kwantificeer­baarheid van deze parameters qls men met onbekend tumo~materiaal van patienten werkt waarvan de celcyclustijd noch de proliferatieve fractie bekend is. Dit probleem zal in dit jaar dienen te worden uitgezocht om de prog­nostische betekenis van het optreden van micronuclei te evalueren.

Geschatte duur: tot eind 1984

VIII.6a Meting van reqressie en celkinetische parameters aan tumoren tijdens radiotherapie*

A.M. Duijvestijn, S. Bohlken, A.P.M. Jongsma, P.J. v.d. Kolk-Schaap, Y.G. Köhler

Dit project omvat een studie naar de prognostische waarden van klinische en morfologische parameters voor chemo- en radiotherapeutische behande­lingen. Hiertoe wordt van patienten met cervix en mamma tumoren twee biopten afgenomen; een vóór de behandeling en één in het begin van de therapie. De gemeten parameters in deze biopten worden gecorreleerd aan de directe klinische respons (regressie snelheid van de tumor, zie het klinische deel in sectie IX), aan het effect op kortere termijn (maxi­male regressie of groeistilstand) en aan het effect op langere termijn (overleving van de patient) . In dit type onderzoek zal alleen het vinden van ongunstige parameters tot een uitspraak over de prognose kunnen leiden. Een gunstig beeld kan ten gevolge van de heterogeniteit in tumoren nooit een uitspraak rechtvaardigen ten aanzien van de afwezigheid van minder gunstige factoren in de tumor en derhalve geen garantie bieden voor een goede respons van de tumor op de therapie.

Evaluatie van het verzamelde materiaal Van een groot aantal patienten zullen de parameters in het begin van 1984 geëvalueerd kunnen zijn wat betreft hun voorspelbaarheid van de klinische respons op korte termijn. Parameters met discriminerende waarden zullen gecorreleerd worden aan de directe klinische respons. Bij gevonden correlatie zal getracht worden de grenswaarde tussen "gunstig" en ongunstig" vast te stellen. Het klinisch verloop dat bij een "ongunstig" beeld te verwachten zou zijn zal altijd zodanig slecht

"KWF project 81-13

59

moeten z~Jn dat stoppen en eventueel veranderen van de therapie gerecht­vaardigd is. Parameters die niet discriminerend blijken te zijn of totaal geen relatie vertonen met het klinisch verloop zullen niet meer gevolgd worden. 'Bruikbare parameters, alsmede parameters waarvan de waarde twijfelachtig genoemd kan worden zullen aan het eind van dit jaar opnieuw gecorreleerd worden aan de therapeutische effec~en die dan bekend zullen zijn.

Toetsen van nieuwe parameters De mogelijk bruikbare parameters die uit het fundamentele onderzoek in VIII.6 voortvloeien zullen niet alleen gaan meedraaien in de nieuw in te voeren patienten, maar er zal tevens getracht worden deze parameters te testen in het patientenmateriaal dat reeds vanaf 1980 verzameld werd en waarvan het klinisch verloop in onze administratie is opgenomen.

Geschatte duur: tot 1 september 1985

60

IX RADIOTHERAPIE

Voor de komende jaren zullen de volgende thema's centraal staan in het wetenschappelijk onderzoek uitgevoerd op de afdeling radiotherapie: .Optimalisatie van de dosis applikatie in de patiënt; .Groei en regressie karakteristieken van menselijke tumoren vóor, tij­

dens en na de radiotherapie; .Onderzoek naar de effekten van fraktionering en "radiosensitizers" zo­als Cisplatinum op lokale tumor kontrole en schade aan normale weef~ sels;

.Klinische proefonderzoeken.

Onder het eerste punt valt ondermeer de ontwikkeling van computerpro­grammatuur voor bestralingsplanningen-, verbetering in de stralingsdosi­metrie en ontwikkeling van nieuwe apparatuur, teneinde bestralingsappli­katies beter te laten geschieden. De fysische en technische inbreng zal hier belangrijk zijn. In samenwerking met de klinici zullen de verkregen resultaten getoetst worden op hun klinisch belang. Bij de volgende twee thema's bestaat een sterke wisselwerking tussen de radiobiologie en ra­diotherapie. Het hiervoor noodzakelijke meer fundamentele onderzoek op het gebied van de celkinetische parameters wordt uitgevoerd in Sektie VIII.6. Het laatste onderdeel zal gedeeltelijk worden besproken in de werkplannen van Sektie X.

De werkplannen zullen projektsgewijs worden toegelicht. Om verwarring te voorkomen, is de nummering der projekten, zoals gebruikt in de vorige jaarverslagen gehandhaafd, waardoor de projekten IX.1 en IX.3, die be­eindigd zijn, ontbreken.

IX.2 COMPUTER PROGRAMMATUUR VOOR DE BEREKENING EN BEOORDELING VAN DOSIS­VERDELINGEN AFGEGEVEN DOOR FOTONEN- EN ELEKTRONENBUNDELS.

R. van der Laarse, J.A. Bangert, J.J. Battermann, I.A.D. Bruinvis, A. Hegeman, H. Meertens en J. Strackee (Universiteit van -Amsterdam)

De onderzoeken die in dit projekt beschreven worden, betreffen de ont­wikkeling van nieuwe computer programmatuur en de verbetering van be­staande programma's. De meeste projekten op computer planning gebied hebben computer programma's opgeleverd die ook buiten het Antoni van Leeuwenhoekhuis worden gebruikt of binnenkort zullen worden gebruikt. Ook de komende jaren zal een deel van de tijd worden besteed aan het uitdragen van de programmatuur naar buiten toe. Dit betreft zowel de samenwerking met andere instituten als kornmersiële firma's. Mogelijkhe­den om met de industrie samen te werken zijn belangrijk bij het ontwik­kelen van gebruikersvriendelijke, goed gedokumenteerde programmatuur. Verschillende kontakten met de industrie zijn gerealiseerd: 1. Philips:

Een uitgebreid samenwerkingsverband met Philips Medical Systems maakt het mogelijk onze bestralingsplanningsprogramma's aan het Philips Oncology Support System (0SS) toe -tevoegen.-

61

2. Siemens: Met Siemens wordt sinds medio 1981 samengewerkt op het gebied van evaluatie van CT beelden met het "independent viewing system", de Evaluskop.

3. Nucletron: Met Nucletron loopt de samenwerking al meer dan 4 jaar. Het Selectron Planning Systeem, een geheel door het Antoni van Leeuwenhoekhuis ont­wikkeld systeem op hardware van Nucletron, zal aangepast worden voor gebruik op PDP 11 computers.

De onderzoeken zullen nu per computer programma worden toegelicht.

MFEXT: ?ROGRAMMATUUR VOOR PLANNING MET UITWENDIGE FOTONENBUNDELS.

Met de komst van het Philips OSS computer systeem, voorjaar 1983, wordt het mogelijk om bestralingsplanningen ter verrichten met korrektie voor onregelmatige velden en inhomogeniteiten. Hiermee kunnen ook driedimen­sionale planningen verkregen worden. Voor ondersteuning van eigen onder­zoek naar inhomogeniteitskorrekties e.d. lijkt het desondanks toch van belang om de Evaluskop aan MFEXT te koppelen en dus een eigen inter­aktief planningsysteem te handhaven op onze PDP 11 computer.

MFEXT wordt gebruikt in Leuven, in het Wilhelmina Gasthuis en in Delft. Ook bij deze gebruikers zal de uitbreiding van het programma worden aan­gebracht. In 1984 zullen de verbeteringen en uitbreidingen in MFEXT vol­tooid zijn.

MFOPT: PROGRAMMATUUR VOOR OPTIMALISATIE VAN BESTRALINGSPLANNING

In het samenwerkingsverband met Philips is overeengekomen de mogelijkhe­den te onderzoeken tot inbouw van het bestaande A.v.L. programma, MFOPT, in het Philips OSS systeem. MFOPT zal dan worden gebruikt om aan de planningoperator van het OSS systeem een voorstel te doen voor de plan­ning van de ingevoerde patiënt. Deze voorgestelde planning kan dan door de operateur interaktief op het OSS verbeterd worden. Aangezien het OSS voorjaar 1983 wordt geleverd, waarna de linac- en cobalt bundels moeten worden ingevoerd, zal medio 1983 met de aanpassing van MFOPT begonnen worden. De door ons uit te voeren programmeringen aan het OSS maakt dat dit systeem niet permanent voor de kliniek beschikbaar zal zijn. Mede hierom blijft een eigen systeem met MFEXT en de Evaluskop van essentieel belang. Geschat wordt dat medio 1984 MFOPT in het OSS opgenomen zal zijn.

EVA-M: PROGRAMMATUUR VOOR CT BEELDVERWERKING

Het A.v.L. programma EVA-M loopt via het independent viewing console, Evaluskop , op onze PDP "11 computer onder het "mul ti-user operating sys­tem". Alle Siemens programmatuur loopt onder het "single-user operating system", en is dus niet compatibel met al onze eigen programmatuur. In een samenwerkingsverband met Siemens is ons echter een "software library" voor het aansturen van de Evaluskop ter beschikking ~esteld. Met deze library kunnen beelden van diskettes gelezen worden en kunnen lijnen "e.d. in het CT beeld getekend worden. Met gebruikmaking van deze user library is in het A.v.L. een uitgebreid programma pakket in ont­wikkeling, geheel aangepast aan de eisen van de verschillende gebrui­kers. Dit betreft zowel de analyse van CT data voor het regressieme­tingen projekt (zie Sektie IX.6) als het verkrijg"en van patiënt informa­tie zoals kontouren van lichaam, doelgebied, kritieke organen e.d. t.b.v. MFEXT. Het is de verwachting dat in 1984 dit programma voltooid zal zijn.

SPS: SELEC'I'RON PLANNING" SYSTEEM VOOR INTRACAVITAIRE APPLIKATIES

Het Selectron Planning Systeem bevalt in de kliniek erg goed. Mede door

62

de komst van dit microcomputer systeem heeft onze microprocessor kennis een hoge vlucht genomen. Om de rekensnelheid met een faktor 3 te verho­gen, wordt momenteel een mathematisch rekenbord ontwikkeld. Een verdere verhoging van de verwerkingssnelheid kan worden verkregen door het plot­ten van dosisverdelingen apart te laten gebeuren. Het aanbrengen van de­ze versnellingen zal in 1984 voltooid moeten zijn:

MPS: MICRO-SELECTRON PLANNING SYSTEEM VOOR INTERSTITIëLE APPLIKATIES

MPS loopt op de SPS configuratie. De plottertijd voor een komplete do­sisverdeling is nu ca. 20 minuten. Met bovenstaande wijzigingen zal de plottertijd ca. 5 minuten gaan bedragen. Dan zal dit systeem ook voor de vele dosisverdelingen bij radiumimplantaties gebruikt kunnen worden. Een verdere verkorting· van de rekentijd is mogelijk door- een snel algorithme voor de Sievert integraal, ter berekening van de verzwakking door de om­hulling van een naald, te ontwikkelen. Dit zal in 1984 gereed kunnen zijn.

PPS: POINT SOURCE PLANNING SYSTEEM VOOR GEïMPLANTEERDE PUNTBRONNEN

Voor de tijdsduur voor het plotten van een dosisverdeling geldt hetzelf­de als bij het MPS.

MFELC: COMPUTER PROGRAMMA VOOR HET BEREKENEN VAN ELEKTRONEN DOSISVERDE­LINGEN

Het doel van dit onderzoek is het verkrijgen van een klinisch gemak~e­lijk bruikbare versie van een computer programma voor het berekenen van elektronen dosisverdelingen, waarin korrekties voor schuine inval en in­homogeniteiten zijn verwerkt. In samenwerking met Philips zal getracht worden een nieuwe versie van MFELC in het Philips OSS systeem in te bou­wen.

Het ontwikkelde programma zal verder getest worden op z'n klinische bruikbaarheid. Dit betreft zowel het "gebruikers-vriendelijk" maken van het programma als het evalueren van de nauwkeurigheid van de berekende dbsisverdelingen in een aantal klinisch voorkomende situaties. Ook zal worden nagegaan in hoeverre een verdere fysisch/mathematische verfijning van het rekenmodel voor de kliniek zinvol is. Daarnaast zal een serie metingen worden uitgevoerd voor verschillende .elektronenenergieën, kol­limatoren en onregelmatige veldvormen om de invloed van de luchtafstand tussen het kollimatoruiteinde en het fantoomoppervlak op de dosisverde­ling te kunnen kwantificeren. Op basis hiervan zal een algorithme ont­wikkeld worden om voor deze invloed te korrigeren. Dit is van klinisch belang bij elektronenbestralingen van die gedeelten van een patiënt met een sterk gekromd huidoppervlak (bijv. in het hoofd-halsgebied). Ook zullen metingen aan inhomogeniteiten in. onze elektronenbundels moeten worden gedaan. Aan de hand van een literatuurstudie zal dan worden beke­ken welke korrektieprocedure voor inhomogeniteiten op de standaard dosisverdelingen het meest geschikt is om in het computer programma te worden ingebouwd. De elektronen dosisverdelingen die met de huidige strooifolie/kollimator kombinaties verkregen zijn, zijn voor de hogere elektronenenergieën niet optimaal. Indien in de toekomst andere strooi­folie/kollimator kombinaties beschikbaar zouden komen voor de kliniek, dan zullen hiervan ook dosisverdelingen moeten worden gemeten en verge­leken met de berekende waarden.

De geschatte duur van dit projekt bedraagt 4 jaar. In 1984 zal speciaal aandacht worden geschonken aan de klinische bruikbaarheid van het pro­grarr~a in zijn eenvoudigste vorm en een begin worden gemaakt met de kor-rektieprocedures. .

63

IX.4 INWENDIGE BEHANDELING VAN TUMOREN MET RADIOAKTlEVE BRONNEN

J.M.V. Burgers, H. Bartelink, J.J. Battermann, B.N.F.M. van Bunningen, R. van der Laarse, H. Meertens en T.C.M. Wilmering

In de komende periode zullen de verdere mogelijkheden van implantaties met gesloten bronnen a1s jodium-125 zaadjes en iridium-192 draden onder­zocht worden. Gedacht wordt hierbij aan implantaties bij patiënten in het hoofdhalsgebied, galwegtumoren, blaastumoren, prostaattumoren en weke delen tumoren. De nieuwe afterIoader voor iridium-192 implantaten zal worden getest op z'n klinische bruikbaarheid, vooral voor implanta­ten bij mammacarcinomen. Voor de implantaties met jodium-125 zullen de dosis gradiënten binnen het geïmplanteerde gebied, "te berekenen met het implantatie computer programma IPS (zie IX.2) bestudeerd worden met het oog op mogelijke verschillen in dosisverdeling ten opzichte van implan­taten met radium- of iridiumbronnen.

IX.5 FYSISCHE ASPEKTEN VAN DE RADIOTHERAPIE

I.A.D. Bruinvis, R. van der Laarse, H. Meertens en B.J. Mijnheer

In dit onderdeel van de sektie zijn een aantal fysische onderzoeken ver­enigd die gericht zijn op een aantal specifieke radiotherapeutische pro­blemen, zoals de verifikatie van veldlokaties, de stralingsdosimetrie bij bepaalde behandelingswijzen en de ontwikkeling van nieuwe appara­tuur t.b.v." radiotherapie. Het is de verwachting dat de genoemde pro­jekten binnen 4 jaar beëindigd zullen zijn.

MEGAVOLT BEELDDETEKTIE

Het reproduceerbaar bestralen van het doelgebied gedurende een groot aantal zittingen is een vereiste voor een adekwate behandeling. Verifi­katie van de veldlokalisaties m.b.v. röntgenfilm (megavolt radiografie) wordt in een beperkt aantal situaties toegepast in ons instituut gedu­rende een enkele zitting. Andere detektiesystemen, welke gedigitaliseer­de beeldinformatie rechtstreeks naar de computer kunnen zenden, zouden het routinematig gebruik tijdens patiëntenbestralingen vergemakkelijken. Beeldrekonstruktie en bewerking van beelden m.b.v. de computer zijn technieken die bij röntgen CT scans al in gebruik of ontwikkeling zijn (zie IX.2). Aanpassing van deze technieken aan de situatie bij megavolt beelddetektoren zou een verhoogde kwaliteit in de presentatie van de beeldinformatie kunnen geven. Op korte termijn wordt gèwerkt aan het be­palen van de karakteristieken van de verschillende detektie systemen, waaronder een "veel-draden ionisatiekamer". De invloed van het foton­elektron conversie materiaal, de dikte ervan en de afstand tot de draden op het signaal worden onderzocht, teneinde kleine verschillen in ionisa­tie stroom te kunnen meten. Daarna zal een geschikt type beelddetektor worden getest in een fotonenbundel achter fantomen. De signalen zullen via een snel elektrisch data acquisitie systeem in de c'omputer worden ingevoerd, waarna de algorithmes voor beeld rekonstruktie zu~len worden getest.

DOSIMETRIE

Onderzoek zal worden verricht op het gebied van de standaard dosimetrie, de kombinatie van standaard dosisverdelingen en patiëntengegevens en de in-vivo dosimetrie. Op korte termijn zal de toepassing van het nieuwe Nordic protokol voor elektronen dosimetrie worden vergeleken met de re­sultaten van het bestaande absolute elektronen dosimetrie systeem. De nieuwe sekundaire standaard voor orthovolt röntgenstraling zal worden vergeleken met de huidige in gebruik zijnde dosimeter. Korrektiefaktoren zullen, indien nodig, bepaald worden. Een aantal fysisische parameters in de omrekening van gemeten ionisatiestroom naar geabsorbeerde dosis,

64

wordt op dit moment opnieuw geëvalueerd en blijkt enigszins (maksimaal enkele procenten) af te wijken van de tot nu toe gehanteerde waarden. Invoering van een nieuw protokol voor megavolt fotonen- en elektronen­dosimetrie waarin nieuwe waarden voor deze parameters verwerkt zijn, zal na nationaal overleg pàs plaatsvinden. De konsekwenties van de invoering van een dergelijk protokol zullen worden bestudeerd. Fysische metingen zullen worden uitgevoerd om bestaande algorithmes voor schuine inval, wigvelden, schampende velden en inhomogeniteiten te evalueren op hun nauwkeurigheid. Speciale aandacht zal worden geschonken aan driedimen­sionale dosisverdelingen.

Nauwkeurige bepalingen van de dosisafgifte in de patiënt (in-vivo doses) zullen worden uitgevoerd in een aantal bestralingssituaties (o.a. behan­deling van blaas- en rectumtumoren) . De "gemeten dosi p zal worden verge­leken met de berekende waarde en een schatting zal worden gemaakt van de pijdrage van de verschillende foutenbronnen aan een mogelijke diskrepan­tie tussen gemeten en berekende waarde. Gemeten en berekende dosiswaar­den zullen worden gebruikt voor het vaststellen van dosis-effekt re­laties, waarbij ook het volume in rekening zal worden gebracht.

ONTWIKKELING APPARATUUR T.B.V. RADIOTHERAPIE

Voor het verkrijgen van een betrouwbare dosisverdeling rond radioaktieve Ir-192 draden en 1-125 zaadjes, is het van bela"ng dat de draden en de zaadjes binnen een bepaalde marge een uniforme aktiviteit bezitten. Ap­paratuur zal worden ontwikkeld om snel en met een minimum aan stralenbe­lasting van het bedienend personeel, een kontrole uit te voeren op de aktiviteitswaarden door de fabrikant vertrekt. ,

Tesamen met Nucletron zal een microprocessor gestuurde isodosisvolger/ ~sozwartingsvolger ontwikkeld worden, gebaseerd op het volgprogramma dat in de huidige isozwartingsvolger gebruikt wordt.

Beide projekten kunnen in 1984 gereed komen.

IX.6 BEPALING VAN TUMOR REGRESSIE EN CELKINETISCHE PARAMETERS MET BE­TREKKING TOT RADIOTHERAPIE

H. Bartelink, B.N.F.M. van Bunningen," S. Bohlken", A. Duyvestijn, A.P.M. Jongsma, Y.G. Köhler, P.J. v.d. Kolk-Schaap, R. Kröger, A. van Leeuwen, H. Meertens, T. Minderhoud, C.C.E. Schaake-Koning en R. Veen

Een langzame tumor regressie en de aanwezigheid van een palpabel tumor residu 6 weken na beëindiging van de radiotherapie zijn gekorreleerd aan een hoog percentage recidieven in patiënten behandeld voor plaveiselcel­carcinoom in het hoofd-hals- en cervixgebied. Het doel van het projekt i's vergelijkbare prognostische informatie op een eerder tijdstip te vin­den bij patiënten behandeld voor mammacarcinoom, cervixcarcinoom en ma­ligne lymfomen. Verschillende objektieve methoden voor het verkrijgen van prognostische informatiefaktoren worden gekorreleerd aan de klini­sche resultaten. Patiënten met deze tumoren worden regelmatig gevolgd voor, tijdens en na de radiotherapie. Tumor volumina worden bepaald met behulp van een schuifmaat, röntgen CT scan, mammogram en misschien in de toekomst m.b.v. kern spin resonantie (NMR) CT scan. Biopten van deze tumoren uit dezelfde patiënten worden "tegelijkertijd onderzocht op biologische parameters met een vroege prognostische waarde voor het resultaat van de radiotherapeutische behandeling. Het projekt zal in z'n huidige vorm eindigen in 1985, maar de korrelatie met de klini~che gegevens zal een langere tijdsduur vergen.

De veranderingen in tumor volumina bepaald m.b.v. diverse methoden wor­den vergeleken. De röntgen CT beelden worden ook geanalyseerd op veran­deringen in CT waarden in het" bestraalde gebied; bijv. duidend op wij-

65

ziging in dichtheid, vetgehalte e.d., en gekorreleerd met tumor regres­sie en klinische resultaten. In samenwerking met de T.H. in Delft zal de studie naar de mogelijkheden van NMR in dit onderzoek worden voortgezet. Gezocht zal worden of de NMR parameters relateren aan de intrinsieke stralengevoeligheid van de tumorcel. Zowel de waterstofspin- als de fosfor-spin resonantie zullen in het onderzoek worden betrokken. Naast de afbeeldende techniek (volume bepaling) zal dus ook de spektrometrie (relaxatietijden) worden gebruikt voor dit onderzoek. Naast de reeds aangevangen studie van bestraalde tumoren in muizen uitgevoerd met een klein NMR apparaat, zal er wellicht in 1984 ook een klinisch apparaat te Delft beschikbaar komen, waarmee NMR CT scans van patiënten uit dit pro­jekt verkregen kunnen worden. De tumor biopten worden onderzocht op celkinetische-, histologische en morfologische parameters, die gekorreleerd worden aan de klinische re­sultaten. De korrelatie tussen de celkinetische parameters (labeling index e.a.) en het klinisch resultaat zal in 1984 verder worden geëvalu­eerd. Hierna zal een uitspraak worden gedaan of het zin heeft deze tech­niek routinematig toe te passen. In 1984 zal speciale aandacht worden geschonken aan parameters als de kerngrootte en de vorming van micro­nuclei na bestraling, die in-vitro systemen geassocieerd lijken te zijn aan de stralingsgevoeligheid van cellen. Het is de bedoeling om de­ze parameters ook in ons verzameld patiëntenmateriaal te bepalen en te korreleren aan de klinische resultaten.

IX.7 ONDERZOEK NAAR DE EFFEKTEN VAN FRAKTIONERING VAN DE BESTRALING IN KOMBINATIE MET RADIOSENSITIZERS MET NAME CISPLATINUM EN ANALOGEN

H. Bartelink, J.J. Battermann, P.F. Bruning, L.G.H. Dewit, B.J. Mijnheer en C.C.E. Schaake-Koning

Na afronding van het neutronen therapie projekt (projekt IX.3) wordt als nieuw hoofdonderwerp aangevat onderzoek naar bestraling met gewijzigde fraktioneringsschema's in kombinatie met een radiosensitizer. Van meer­dere frakties per dag wordt vooral voor snel groeiende tumoren in een langzaam profilerende omgeving zoals blaas, cervix en sommige hoofd­halstumoren verwacht dat de tolerantie van het normale weefsel beter kan worden uitgebuit. Daarnaast zijn er situaties met grote tumoren, waar palliatie van klachten mogelijk is met enkele grote, niet dagelijks ge­geven frakties.

Beide onkonventionele bestralingsschema's kunnen met vrucht gekombineerd worden met radiosensitizers, waarbij de toxiciteit van 'de sensitizer be­perkt wordt door de kombinatie met hetzij meerdere frakties op één dag, of met relatief grote frakties. Veel studie is gedaan naar de mogelijk­heden van de anoxic sensitizers, zoals Misonidazole. Van Cisplatinum is echter aangetoond dat het niet alleen werkt als een anoxic sensitizer, maar ook als een remmer van herstel van sublethale en potentieel lethale schade. Daardoor wordt verwacht dat Cisplatinum in bescheiden doseringen in de mens al radiosensitiserend werkt. In grotere doseringen wordt dit middel als chemotherapeuticum gebruikt.

Verkennende studies van de kombinatie van bestraling met Cisplatinum werden in Stanford verricht door H. Bartelink, in weefselkweek en dier­model.Daarbij werd gevonden dat één dosis Cisplatinum voorafgaand aan 5 dagelijkse bestralingen àf binnen 5 dagen met 3 bestralingen per dag, een duidelijke toeneming in uitstel van tumoruitgroei gaf in vergelij­king met bestraling alleen; dit effekt lijkt supra-additief te zijn. Met een dagelijkse gift Cisplatinum gevolgd door dagelijkse bestraling werd een vergelijkbaar tumoruitstel verkregen, maar een onderzoek naar darm­toxiciteit (crypt cell assay) liet een grotere darmbeschadiging zien bij dit laatste schema. De sensitizer Cisplatinum en analogen zullen nu na­der klinisch worden onderzocht, waarbij op grond van het bovenstaande vooral aandacht aan multifraktionering zal worden geschonken.

66

Multifraktionering op zichzelf zal waarschijnlijk bij sommige tumoren een vergroting van de therapeutische breedte kunnen opleveren. In ons instituut zal met dit soort fraktioneringsschema's ervaring moeten wor­den opgedaan. Voor bestudering van blaas- en hoofd-halstumoren zal aan­sluiting worden gezocht bij internationale studies, bijv. in E.O.R.T.C. verband. Ook voor rectUmtumoren en mogelijk slokdarmtumoren zullen mul­·tifraktioneringsprotokollen worden gemaakt. Verder zal het palliatieve schema van 3 x 800 cGy in 3 weken nader prospektief worden geëvalueerd bij grote inoperabele bekkenprocessen. Subjektief is hiermee een waarde­volle verbetering te verkrijgen. Bij melanomen zal ook een studie met grotere fraktie doses worden opgezet. Cisplatinum met konventionele be­straling wordt voorbereid voor longtumoren.

De kombinatie bestraling plus Cisplatinum of analogen zal zowel in het diermodel als bij de mens worden onderzocht. Als model zullen gebruikt worden transplanteerbare muizentumoren, het implanteren van menselijke tumoren onder de nierkapsel of in speciaal daartoe voorbehandelde mui­zen. Er zal aandacht worden geschonken aan verschillende doseringssche­ma's van Cisplatinum met wisselende tijdsintervallen ten opzichte van de bestralingsdosis. Het tumorgedrag zal worden vergeleken met de effek­ten op de normale weefsels om de therapeutische breedte te kwantifice­ren. De behandelingsschema's bij patiënten zullen zoveel mogelijk worden gebaseerd op de uitkomsten van het eksperimentele werk. Ook daar zal de therapeutische breedte zo goed mogelijk worden geëvalueerd. De diereks­perimentele en klinische resultaten zullen worden .bewerkt onder gebruik­making van het L.Q. konsept zoals ontwikkeld door Barendsen. Dit mode: doet voorspellingen over de verandering van dosis-effekt relaties bij

·wijziging van de dosis per fraktie. De waarden voor de parameters gevon­den uit de dierproeven en de klîniek voor overeenkomstige effekten, zul­len worden vergeleken. Getracht zal worden met de verkregen resultaten optimale doseringsschema's te vinden.

Verwacht wordt dat dit projekt in 1987 afgesloten kan worden.

IX.8 PROSPEKTIEF NIERFUNKTIE ONDERZOEK BIJ PATIëNTEN

L.G.H. Dewit, H. Bartelink, B.N.F.M. van Bunningen, C.A. Hoefnagel, H.R. Marcuse en W.J. Nooijen

Doelstelling is bij patiënten met M. Hodgkin, abdominale lymfomen, ova­riumtumoren en testistumoren, waarbij (een deel van) een of beide nieren bestraald worden, "vroegtijdige" nierbeschadiging door radiotherapie kwantitatief uit te drukken. Stoornissen in GFR, ERPF en tubulaire funk­tie zullen door middel van scintigrafische methoden 99Tcm-DTPA, 99Tc­DMSA) over tenminste 1 jaar gevolgd worden. Daarnaast worden het concen­trerend vermogen en bufferwerking gevolgd. Er wordt naar gestreefd ten­minste 100 patiënten in deze studie te brengen. De periode van intake zal over 3 tot 4 jaar verlopen.

Gezocht wordt naar een dosis-volume-effekt relatie. De mogelijke poten­tiëring van cytostatica zal worden nagegaan. Bij die patiënten waar een belangrijke graad van irreversibele schade wordt vastgesteld, zal met extra aandacht de mogelijke repercussie op de homeostase worden gevolgd over tenminste 10 jaar.

67

68

SEKTIE X. KLINISCHE ONCOLOGIE

X.la maligne lymfomen; karakterisering van mononucleaire cellen in lymfoomweefsel en perifeer bloed van patiënten met een non-Hodgkin lymfoom

T.A.A. Dellemijn, C.A. Feltkamp, P. van Heerde, M.A. Koolman-Schellekens, E.M. Rankin, R. Somers, H. Spiele, J.E. de Vries, Th.M. Vroom en F.A. Vyth-Dreese

Op het inmiddels van 350 patiënten verkregen vers biopsie materiaal (meestal lymfklieren) werd naast het routine lichtmicroscopisch onder­zoek tevens electronenmicroscopie, immunohistochemie en immunologisch onderzoek van celsuspensies verricht. Dit multidisciplinaire onderzoek wordt voortgezet en uitgebreid met een serie monoclonale antisera waardoor een verfijning van de diagnostiek en een verbeterd inzicht 'in de lymfoomgenese ontstaat. Een retrospectieve bewerking van de tot dusverre verzamelde T-cel lymfomen en de tumoren uitgaande van echte hiSiocyten is in voorbereiding. Het blijkt dat met deze markerstudies méér echte histiocytaire tumoren voorkomen dan aanvankelijk werd gedachL De waarde van muramidase, cXt-antichymotrypsine en o(i-antitrypsine, bepaald met behulp van de peroxidasetechniek, wordt onderzocht. Ook binnen deze groep tumoren is, evenals bij de non-Hodgkin lymfomen, een spectrum van verschillende histiocytafgeleide cellen aanwezig, het­geen verder zal worden onderzocht. In vrijwel alle gevallen van maligne lymfomen geven cytologische uitstrijkpreparaten een goed inzicht in het celtype. Multiparameter analyse van 280 gevallen in samenhang met histologie en voor zover aanwezig electronenmicroscopie en immunochemie is in bewerking.

Het onderzoek naar de mitogene reaktiviteit van maligne T cel populaties bij leukemie en lymfoom patiënten heeft laten zien dat een tekort aan bilogische faktoren zoals Interleukine-2 (IL-2) één van de oorzaken is van de in vitro reakties die vaak bij deze patiënten gezien worden. Toevoeging van IL-2 of aktivatie van de endogene IL-2 produktie in de maligne T cel kweken door stimulatie met behulp van de tumor promotor 12-0-tetracecanoyl phorbol-l3-acetate (TPA) , bleek in de meeste ge­vallen effektief om de celproliferatie te kunnen herstellen. Resterende vraagstellingen in dit onderzoek naar de in vitro proliferatie/ differentiatie van maligne T cel populaties, die naar verwacht in 1984 afgesloten zullen worden, zijn de volgende:

G De IL-2 geïnduceerde in vitro proliferatie van T cellen van een patie~t met T-cel chronische lymfatische leukemie (T-CLL) bleek gepaard te gaan met verhoogde expressie van HTLV p19, een struktureel eiwit van het recent ontdekte humane T-cel leukemia virus en met de generatie van complete type C virus partikels. In samenwerking met de groep van Dr. Robert Gallo (NCI/NIH, USA) zullen de T-CLL cellen verder onderzocht worden op de aanwezigheid van reverse transcriptase en provirale DNA­sequenties. Hieruit zal blijken of het virus in onze T-CLL patient van hetzelfde type is als het HTLV dar geassocieerd is met T-cel leukemie

69

bij volwassenen in het Caraïbisch gebied en in Japan.

• De proliferatie en IL-2 produktie capaciteit van non B - non T cel tumoren bleek in ,een aantal gevallen sterk verhoogd na stimulatie met de phorbol ester TPA. Nagegaan zal worden of de leukemie cellen o.i.v. TPA zelf uitrijpen tot IL-2 producerende cellen of differentiëren tot helper cellen effektief in stimulatie van de IL-2 produktie uoor reste­rende normale T cellen.

• Het differentiële effekt van TPA en IL-I op de induktie van IL-2 produktie bij cellen van een patiënt met T-cel prolymfocyten leukemie zal nader onderzocht worden. Met name zal gekeken worden naar een mogelijke correlatie tussen de gevoeligheid van de leukemische T cel voor deze aktivatie signalen en de aanwezigheid van receptoren ervoor.

Om beter inzicht te krijgen in differentiatie stadia van maligne B cel lymfomen zal het onderzoek zich verder richten op het ontwikkelen van monoclonaleantistoffen tegen B cel differentiatie antigenen (in samen­werking met projekt IV.2). Deze reagentia zullen toegepast worden bij die diagnose op histologische coupes van lyrnfoomweefsel en tevens bij funktionele studies naar de in vitro differentiatie capaciteit van maligne B cellen. Tevens zullen zij gebruikt kunnen worden bij scree­ningsonderzoek in patiënten. De geschatte duur van dit projekt is 3 à 4 jaar. In 1984 zal met name gekeken worden naar:

., Karakteriseren van reeds geproduceerde monoclonale antistoffen ver­kregen na immunisatie van Balbic muizen, en volaens de eerste gegevens specifiek reagerend met, maligne B cellen van een nodulair non-Hodgkin lymfoom. Onderzocht zal worden of de antistoffen gericht zijn tegen idiotypische determinanten op de lymfoomcel, en zo ja, of klinische toepassing mogelijk is (o.a. testen van selectieve toxi­citeit voor de tumorcel , eventueel effekt op modulatie van het be­treffende antigeen op de tumorcel membraan, mogelijkheid van radio­labeling) .

• Bij de produktie van de monoclonale antistoffen tegen B cel lymfomen zal nauw samengewerkt worden met Ir. H. IJssel, die in het kader van een KWF fellowship de mogelijkheid zal onderzoeken om specifieke cyto­toxische T cellen te genereren tegen autologe tumor B cellen. Voor dit doel zullen speciale hybridomas geselecteerd worden die antistoffen produceren die gericht zijn tegen bij de lysis betrokken determinanten.

• Er zal gestart worden met het onderzoek naar de mogelijkheid maligne B cellen te differentiëren in vitro. Onderzocht zal worden wat het effekt is van stimulatie met (anti-idiotypische) monoclonale anti­stoffen, oplosbare B cel groeifaktoren, en Cow'an I preparaten op de B cel proliferatie en immunoglobuline produktie in vitro.

X. Ib M.Hodgkin: EORTC trial H I

Voortgaan met verzamelen van gegevens van deze patiënten betreffende overleving en complicaties.

X. Ic M. Hodgkin: EORTC trial H 11

Voortgaan met verzamelen van gegevens van deze patiënten betreffende overleving, verschijningsvorm van recidief, late complicaties en secundaire ziekten.

X. Ig M. Hodgkin: EORTC trial H V

De .registratie van patiënten werd afgesloten in oktober 1982. De eerste patiënt werd in 1978 ingebracht. Deze patiëntengroep zal nauwkeurig moeten worden vervolgd i.v.m. het recidiefpatroon en eventuele behande-

70

lingscomplicaties. In 1984 zal een meer uitgebreide analyse van dit materiaal aan de orde zijn. Stafleden van het N.K.I. zullen daarin participeren tesamen met de Parijse groep.

X. Ik en X. 11 M. Hodgkin 111 B en IV. EORTC trial 20811

Voor patiënten met M. Hodgkin stadium IIIB'en IV wordt nu een studie in É.O.R.T.C. verband gedaan. Twee vormen van chemotherapie worden verge­leken. In het bijzonder wordt bestudeerd of de kans op complete remissie kan worden voorspeld op grond van de reactie op de eerste twee kuren. "IJsberg" radiotherapie is een onderdeel van het behandelprogramma.·Deze studie werd door Nederlandse centra voorbereid. Het N.K.I. gaat voort met verzamelen van patiënten in deze studie.

x .2 MeI anoom

Ph. Rümke, J.M.V. Burgers, L. Dewit, E.P. van der Esch, P.W. de Graaf, A.A.M. Hart, S.P. Israels, B.B~R. Kroon, H. Neering, E.A. Slooten, J. Wieberdink

(Zie ook werkplannen sekties IV en VIII)

IDAdjuvant trials in "high risk" stadium I en stadium 11 patiënten en phase 11 chemotherapie trials in WHO en EORTC verband worden voortge­zet, evenals een eigen phase 11 studie waarin bij gemetastaseerde patiënten nagegaan wordt of lokale behandeling met DNCB op cutane metastasen het effect van een maand later te geven DTIC verbetert . • Gekoppeld aan een adjuvant phase 111 studie met poly A - poly U voor stadium IIb patiënten zal worden nagegaan wat de prognostische waarde is van een verhoogde concentratie Technetium-99m-Sn-colloid, zoals bij lever/milt scintigrafie juist bij l1)elanoom patiënten gevonden wordt (samen met C.A. Hoefnagel). GEen "feasibility" studie betreffende bestraling (6 x 600 rad) plus cisplatin als mogelijke radiosensitizer zal verricht worden om tot ver­betering van bestralingsresultaten van melanoom metastasen te komen. Eveneens zal samenwerking met Dr. G. Gonzales, radiotherapeut, Wilhelmina Gasthuis, Amsterdam, worden voorgezet om na te gaan of loka~ hyperthermie van oppervlakkige metastasen na bestraling, bestralings­resultaten verbetert. GEen retrospectief follow-up en histologisch onderzoek zal verricht worden bij stadium 11 patiënten die meer dan 10 jaar geleden werden ge­opereerd, om na te gaan welke parameters van belang zijn voor de prog­nose van deze patiënten van wie slechts ongeveer 15% een ziekte-vrije 10 jaars overleving heeft. GIn het kader van samenwerking in de lKA Melanoom Werkgroep wordt het enquête onderzoek naar patiënten en dokters "delay" voortgezet. Dit

. onderzoek wordt uitgevoerd door Dr. F. Rampen van de afdeling Dermato­logie van het Amsterdams Medisch Centrum.

X.3 klinische research unit

In de nabije toekomst zal de nadruk op de clinical research unit meer en meer komen te liggen op fase I studies. Mogelijke kandidaten om nader te bestuderen in 1984 zijn liposomal doxorubicin, BZQ (een deri­vaat van aziridinylbenzoquinone), azolastone, 4 hydroxy androstenodione en een nieuwe radiosensitizer (SG 347503).

Al naar gelang de resultaten van de lopende fase I trials, is het mogelijk dat TN06, CBDCA (beide cisplatina-analogen) en n-methylforma­mide verder ontwikkeld zullen worden in brede fase 11 trials.

71

X.3.1 klinische farmacologie en toxicologie van anthracycline

J.G. McVie, W.W. ten Bokkel Huinink, C.A. Hoefnagel, M.M. de Planque, T.J. Schoemaker" G.P.C. Simonetti

Met als uiteindelijk doel het vinden van een optimale. vervanger van doxorubine alsmede de optimale toedieningswijze worden diverse anthra­cycline analogen en anthraceen derivaten in phase 11 klinisch onderzoek bestudeerd. Naast de beoordeling van de anti tumor werking van deze middelen wordt binnen het kader van KWF projekt NKI 81-3 onderzoek ge­daan naar pharmacokinetiek en metabolisme als ook naar de toxiciteit. In 1981 en 1982 werd een begin gemaakt met de anthracyclines carmino­mycine en 4'-epidoxorubicine en de anthracenen bisantrene en mito­xantrone. In 1983 en 1984 zullen hieraan worden toegevoegd deoxy­doxorubicine en marcellomycine als anthracyclines en ametantrone als anthraceen. Waarschijnlijk zal ook demethoxydaunorubicine en mogelijk aclacino­mycine in studie genomen worden. Eind 1983/ begin 1984 hopen we tevens een anthracycline analoog in phase I onderzoek te krijgen.

Patiënten die in aanmerking komen voor behandeling met anthracyclines binnen het kader van phase 11 (of I) onderzoek, krijgen het betreffende middel na klinische evaluatie volgens de richtlijnen van het betreffen­de protocol toegediend. Nauwkeurig pharmacokinetisch onderzoek vindt plaats middels het regelmatig nemen van monsters bloed en urine en waar mogelijk gal, ascites en/of pleuravocht. Voor de bepalingen van deze monsters hopen wij te kunnen blijven rekenen op de hulp van de afdeling Biochemie 11 van het NKI (bepalingen van anthracycline analogen), de afdeling klinische Pharmacie van het Radboud Ziekenhuis te Nijmegen (Drs. M. Oosterbaan - doxorubicine bepalingen) en de apotheek van het Slotervaart Ziekenhuis te Amsterdam (Drs. T.J. Schoemaker - anthraceenbepalingen). Tijdens, direct na toediening van het cytostaticum en vervolgens tenmin­ste wekelijks wordt de toxiciteit geëvalueerd volgens het WHO grade~ ringssysteem. Naast anamnese en lichamelijk onderzoek wordt bloed­onderzoek gedaan en met name onderzoek naar de hartfunctie. Gezien de potentiële cardiotoxiciteit van deze groep middelen heeft dit laatste de speciale aandacht. Ten aanzien van hartritme stoornissen wordt nauwkeurig geobserveerd en worden ECG's gemaakt voor en na toediening. Binnenkort hopen we de beschikking te hebben over 24-uurs registratie van hartritme waarmee de detectiegraad in de komende jaren aanzienlijk zal worden verbeterd. Functieonderzoek van het hart middels "gated equilibrium bloodpool"scintigrafie wordt toegepast om acute en chroni­sche effecten van deze middelen op het hart vast te stellen. Een posi­tief isótrope werking mogelijk t.g.v. het vrijkomen van vasoactieve stoffen na toediening van anthracyclines is waargenomen en wordt bestudeerd.

Zodra hierin beter inzicht is verkregen, zal word~n bekeken in hoeverre verandering van toedieningswijze, dan wel voorafgaande blokkering het vrijkomen van vasoactieve stoffen kan beïnvloeden en wat hiervan de invloed'is of de acute en chronische effecten op het hart.

Bekend zijn de morphologische afwijkingen die op lange termijn ontstaan in de hartspier t.g.v. doxorubicine therapie. Waar mogelijk zal bij' vergelijkbare cumulatieve doseringen van nieuwe anthracyclines naar deze afwijkingen worden gekeken en zal dit worden vergeleken met afwijkingen in de skeletspier.

In 1983 hopen wij gezien de goède resultaten met 4'-epidoxorubicine dit middel op grotere schaal te gebruiken, zodat in 1984 met name t.a.v. de chronische toxiciteit meer onderzoek mogelijk zal zijn met de reeds genoemde methodes.

72

X.3.2 tumor targeting van cytotoxische verbindingen met behulp van arterieel bioafbreekbare microsferen (KWF project ANKC 82-8)

E.T. TomIinson; P. de Graaf, C. Hoefnagel, J.G. McVie

Het doel van dit in samenwerkingsverband verricht onderzoek is om bioafbreekbare microsferen te benutten als aragers van cytostatische preparaten, zodat verbeterd eerste en tweede graads targeting op tumor­cellen verkregen wordt, gepaard aan een afname van systemische toxici­teit. Intra-arteriële toediening van preparaten, verpakt in micro­sferen van een van tevoren bepaalde grootte en stabiliteit, kan in principe zorgen voor een homogene verbreding in de arteriële capillairen in hettumorbed en voor secundair, continu afgeven van de preparaten in een hoge plaatselijke dosis. Omdat dit bereikt zou kunnen worden met lage totale doses van het cytostaticum, zou systemische toxiciteit vermeden kunnen worden.

De opzet van het onderzoek bestaat uit drie delen: 1) Vaststellen van de fabricage variabelen die het fysisch-chemisch

karakter van albumine en koolhydraat microsferen bepalen, en het afgeven (in vitro) van werkzame cytostatica, zoals methotrexaat, doxorubicine, mitomycine, cisplatin en 5-fluorouracil.

2) Het toepassen van niet-invasieve externe gamma kamera scintigrafie op in vivo farmacokinetisch onderzoek van op verschillende manieren radioactief gelabelde microsferen en preparaten, intra-arterieel in konijnen gelnjiceerd.

3) Klinische farmacologie van de gekozen combinaties, bepaald m.b.v. 1 + 2, van de preparaten, zowel intra-arteri,eel toegediend in microsferen van een gegeven diameter en stabiliteit als zonder, in het kader van een fase 1/11 trial. De geschikte patiënten groepen worden in principe gevormd door hen die momenteel met intra­arteriële therapie behandeld worden voor hoofd en hals tumoren, hypernephroma, melanoma en sarcbma van de extremiteiten en lever tumoren (primair of secundair) .

Het onderzoek bevindt zich momenteel nog geheel in het preklinische stadium.

X.3.3 beoordeling van de toxiciteit van cytotoxische platinum verbin­dingen met nucleaire analisatie technieken (KWF project NKI 82-5)

W.W. ten BokkeI Huinink, J.A. van der Heide~*J.G. McVie, M. prins~* L.N. Vernie

Tegenover het klinisch sukses van cisplatin bij de behandeling van kanker staat een acute toxiciteit die soms zo sterk was dat met de toe­diening van het middel gestopt werd. Daarom worden momenteel een serie nieuwe platinum analogen getest. Cisplatin geeft klinische verschijnselen van vergiftiging met zware metalen, maar de mechanismen van deze toxociteit op weefselniveau zijn nog duister bij gebrek aan een geschikte analyse techniek in het ver­leden. Er zijn momenteel twee pas ontwikkelde multi-elementaire nucleaire analyse technieken beschikbaar die een dergelijk toxicologisch onderzoek mogelijk meken. PIXE (proton induced X-ray emission) is een snell non­destructieve methode voor het opsporen van elementen in onbewerkte weef~el coupes, wat het in kaart brengen in weefsel mogelijk maakt (tissue mapping) . NAA (neutron activation analysis) is daarentegen langzamer, nauwkeurig-

*Universiteit van Amsterdam **Technische Hogeschool Eindhoven

73

er en kan niet gebruikt.worden op onvoorbewerkt weefsel. Het doel van dit project is daarom het gebruiken van PIXE en NAAom: a) platina concentraties te meten in speciaal uitgezocht plasma en

weefsel monst~rs van patiënten behandeld met cisplatin, en om daarna de resultaten te correleren met de veroorzaakte toxiciteit;

b) om verschillende concentraties van spore metalen te meten (b.v. Cu, Zn, Fe, Cd, Se) in dezelfde monsters en om deze te correleren met de gevonden toxiciteit;

c) om concentraties spore metalen te meten in speciaal uitgezochte monsters van patiënten behandeld met nieuwe platina analogen (b.v. TN06, JM40 en PHIC) waarvan men veronderstelt dat ze minder toxisch zijn;

d) om vast te stellen hoe de biotransformatie en verdeling van de nieuwe analogen in knaagdieren plaatsvindt, waaronder ook het toepassen van via een cyclotron verkregen Pt-193 voor nieuw onderzoek van met radioactiviteit gelabelde drugs.

Opzet van het onderzoek • Meten van klinische toxiciteit (hematologisch, biochemisch, histo­

pathologisch en nierfunctie onderzoek) . • Testen van methodieken voor het analyseren van spore metalen

(nucleaire activatie en X-ray emissie technieken). • Het gebruiken van voormelde technieken voor het analyseren van

monsters (plasma, weefse, etc.) van patiënten behandeld met platinum verbindingen in een serie verschillende doseringen.

X.4 mammacarcinoom

H. Bartelink, R. Bergman, P.F. Bruning, P. Cohen, F.S.A.M. van Dam, J.F.M. Delemarre, J.A. van Dongen, E. Engelsman, E. Hamersma, A.A.M. Hart, C.A. Hoefnagel, C. Schaake-Koning, R. Veen

Nieuwe prospectieve studies t.a.v variaties van mammasparende therapie bij stadium I patiënten zullen worden uitgevoerd. De verschillende trials (voor het grootste gedeelte in EORTC verband) ter beoordeling van optimale therapiekeuze zullen worden voortgezet. De computer regis­tratie van gegevens van vroeger behandelde patiënten wordt verder afge­rond, terwijl het gebruik van continue computer registratie van data van nieuwe patiënten verder zal worden getoetst. De data verkregen van het retrospectie onderzoek zullen worden gebruikt o.a. voor de studie van factoren die de locale recidiefkans belnvloeden. De gegevens ver­kregen bij de uitgebreide retrospectieve computer registratie, zullen ook worden gebruikt voor het opbouwen van "matched historical control" groepen voor die patiënten bij wie nieuwe therapieën worden getoetst, maar die niet in een prospectief onderzoek vallen. Een methodologisch onderzoek zal worden uitgevoerd, waarbij de waarde van "matched historical control" uit het computer data bestand vergele­ken zal worden met die van de gerandomiseerde controles.

Het onderzoek naar de waarde van verschillende technieken om de tumor­grootte te beoordelen zal worden afgerond.

Verdere ervaring met progesteron receptor bepalingen zal worden opge­bouwd.

H~t onderzoek naar het belang van de morphometrische bestudering van prognostische kenmerken (methode Baak) zal worden voortgezet.

Studies gericht op de herkennin"g van risico-factoren voor het ons taan van mammacarcinoom bij benigne proliferatieve laesies zullen in de komende jaren worden gecontinueerd. Ook andere risico-factoren zullen

. onderwerp van studie worden. Tn dit verband zal het onderzoek bij

74

families waar mammacarcinoom frequent voorkomt worden geïntensiveerd (verg. VII.5). De methode ter beoordeling van de quality of life, die van groot belang is o.a. bij de evaluatie van nieuwe, minder mutilerende mamma­carcinoom behandelingen zal worden gestandaardiseerd, waarna de methode bij alle therapie effect beoordelingen zal kunnen worden gebruikt.

X.5 kindertumoren, osteosarcoom

J.M.V. Burgers, P. Cohen, E.A. van Slooten, R. Somers en P.A. Voûte

5 Stafleden van het NKI zijn betrokken bij de voorbereiding van de nieuwe osteosarcoma trial, die de EORTC/SIOP trial 20781 met 3 typen adjuvante behandeling na amputatie, moet opvolgen. De samenwerking met Engelsecentra zal toenemen. Eerst zal een pilot study worden verricht om van verschillende typen pre-operatieve chemotherapie de toxiciteit na te gaan. Zoveel mogelijk zal lidmaat sparende chirurgie worden uit­gevoerd. Vervolgens zal een trial worden gedaan, waarin verschillende typen pre-operatieve chemotherapie worden vergeleken, en tevens zal onderhoudsbehandeling slechts bij een deel van de patiënten worden toegepast. De resultaten zullen op gelijke wijze worden vastgelegd als die van andere centra,. die volgens de principes van Rosen behandelen met zeer hoge doses methotrexaat in de pre-operatieve fase, en een aan het histologisch onderzoek van het resectiepreparaat aangepast schema van nabehandeling. Er is nog gèen communis opinio of aan dit histologisch onderzoek een dergelijke waarde kan worden toegekend. Dit is één van de studie doeleinden van de op te zetten trial.

x.7 TUMOREN VAN BOT- EN WEKE DELEN.

P.Cohen, C.E.Albus-Lutter, H.Bartelink, C.Benckhuijsen, J.M.V.Burgers, C.A.Feltkamp, P.de Graaf, W.Misdorp, E.A.van Slooten, R.Somers, J.Wieberdink.

Deelname aan klinische trials bij de behandeling van weke delen tumoren en osteosarcomen zal worden voortgezet. Het ziet er naar uit dat de EORTC protocollen nrs. 20781 en 62794 afgesloten en definitief bewerkt zullen worden. Beide trials betreffen de behandeling van het osteosar­coom. De eerste omvat drie electieve modaliteiten na behandeling van de primaire tumor en de tweede trial heeft betrekking op de behandeling van het gemetastaseerde osteosarcoom met cis-platinum. Gezien de snelle ontwikkeling van de chemotherapie is het te verwachten dat nieuwe phase II onderzoeken zowel bij de behandeling van het ge­metastaseerde weke delen sarcoom als van het osteosarcoom hun intrede zullen doen. Voorbereiding van een nieuwe trial voor de behandeling van het extre­miteiten osteosarcoom is zover voortgeschreden, dat in 1984 hiermee be­gonnen zal zijn. In deze trial komen een aantal nieuwe facetten naar voren. In de eerste plaats zal in geselecteerde gevallen na voorafgegane chemotherapie een locale tumorresectie met reconstructie worden ver­richt. Voor de adjuvant behandeling met chemotherapie zullen nieuwe pro­tocollen gevolgd worden. De patholoog-anatomen zullen zich bezig houden met de histologische veranderingen in het tumorweefsel onder invloed van chemotherapie en met histologische gradering in relatie tot de prognose. Het ligt tevens in de bedoeling "computerized tomography" (CT-onderzoek) systematisch toe te passen voor de quantitatieve bepaling van veranderingen in het tumorvolume tijdens chemotherapie.

Door problemen met het verkrijgen van gegevens die nodig zijn om de groeisnelheid van longmetastasen van osteosarcomen te berekenen, is er onvoldoende voortgang geboekt met deze metingen. Getracht zal worden om door middel van speciale vragen1iisten hier verbetering in te

75

brengen. Indien het aldus gelukt voldoende gegevens te krijgen zal een aanvang worden gemaakt met het samenstellen van regressiecurven van deze metastasen onder invloed van chemo- of radiotherapie. Het betreft hier patienten uit de 03-trial van de EORTC. Bovendien zullen gegevens ver­zameld en uitgewerkt worden aangaande mastectomieën in dezelfde trial.

Gezien recente ervaringen zal in daartoe geselecteerde gevallen worden doorgegaan met regionale perfusie van extremiteiten met weke delen sar­comen. De afdeling Pathologie zal zich verder bezig houden met toepassen van electronen microscopie bij geselecteerde gevallen van weke delen sarco­men.

Wat de identificatie van spiertumoren (rhabdomyosarcomen) betreft (KWF project N.K.I.8l-5) zal aandacht worden besteed aan de volgende onder­werpen: el. Het optimaliseren van een ontwikkelde diagnostische methode voor het aantonen van skeletspier componenten in weke delen sarcomen met behulp van immunocytochemische technieken (antisera tegen myosine en myeglobine) e2. Ontwikkeling van een enzymcytochemische methode (ATPase en/of NADH tetrazolium reductase) ten behoeve van de diagnostiek. e3. Retrospectief onderzoek van beschikbaar tumormateriaal en onderzoek aan embryo's/foeten met behulp van antisera tegen langzaam en snel ske­letspier myosine en tegen myoglobine ten einde een beter inzicht te krijgen in de ontwikkeling van rhabdomyosarcomen, zonodig in combinatie met een diermodel. e4. Opwekking van polyclonale en monoclonale antisera tegen menselijk volwassen en foetaal myosine.

X.8 HETINGEN VAN REGRESSIE EN CELKINETISCHE PARAHETERS AAN TUMOREN TIJDENS RADIOTHERAPIE.

H.Bartelink, B.van Bunningen, A.Duyvestijn, A.P.M.Jongsma, P.J.v.d.Kolk­Schaap, R.Kröger, A.van Leeuwen, H.Meertens, C.Schaake-Koning,R.Veen.

Tijdens de bestralingsperiode zullen metingen worden verricht aan tu­moren om de regressie snelheden te bepalen. De metingen met mammografie en de CT-scan zullen op diezelfde dagen verricht worden. Klinisch zal de regressie worden gemeten met een schuifmaat, of bij patienten met een cervix- of rectum carcinoom, door middel van vaginaal- en rectaal toucher. Eind 1982 en in 1983 zullen de mogelijkheden van nuclear magnetic resonance onderzocht worden met proefdieronderzoek. Afhankelijk van de bevindingen zal dit onderzoek zich uii:breiden p.aar de eerder genoemde groep patienten. Deze klinische regressiemetingen zullen tijdens de bestraling wekelijks geschieden. Gelijktijdig worden op de dag voorafgaand aan de radiothera­pie en ook 7 da~en na het begin van de bestraling, indien mogelijk en toelaatbaar, proefexcisies verricht voor bepaling van celkinetische paramet~rs.

In aanmerking komen patienten met: ea mammatumoren,met tumor nog in situ, eb cervixcarcinomen stadium IIB t/m IV (c rectumcarcinomen)

Het materiaal van de puncties en proefexcisies wordt in het laboratoriu~ in kortdurende kweek gezet teneinde celkinetische parameters zoals DNA en RNA synthese te meten. Uit deze en morfologische gegev~ns zal retrospectief de prognostische waarde van deze parameters voor de regressiesnelheid van de tumor tij­dens de bestraling en het al dan niet recidiveren van de tumor worden bepaald.

-Geschatte duur van dit project: tot medio 1985.

76

X.9 PALLIATIEVE ENDOSCOPISCHE PLAATSING VAN'EEN PROTHESE BIJ PATIENTEN MET OBSTRUEREND MAAGCARCINOOM.

F.C.A.den Hartog Jager, G.N.Tij

In samenwerking met de afdeling gastroenterologie en de medische instrumentmakerij van het AMC wordt een nieuw instrumentarium ontworpen en uitgetest dat endoscopische plaatsing van een tygonbuis bij het sterk geanguleerd carcinoom en het obstruerende distale maagcarcinoom sterk vergemakkelijkt. Een nieuw instrument, de AMI (Amsterdam Metal Introducer), werd uitgetest en bleek intubatie zeer te vergemakkelijken. Dit instrument voldeed echter niet voor distale dilatatie. Een geheel -ander systeem is in de maag en zal in de kliniek worden uitgetest. Deze ontwikkeling is het logische gevolg van" de techniek. die in 1975 ontwik­keld werd, waarmee tot nu toe 500 patienten werden behandeld. Met de techniek die in 1981 werd ontwikkeld, werden + 50 patienten behandeld. Verwacht wordt dat eind 1984 de resultaten beschreven kunnen worden,

X.9 c VERGELIJKEND ONDERZOEK NAAR DE RESULTATEN VAN PALLIATIEVE BE -HANDELING VAN INOPERABEL OESOFAGUSCARCINOOM DOOR RADIOTHERAPIE OF HET INBRENGEN VAN EEN TYGONBUIS.

F.A.M.van Dam, F.C.A.den Hartog Jager, R.van Hoesel, H.Masselink, B.Taal.

Daar weinig verschil verwacht wordt in de duur van de overleving van patienten bij wie inoperabel oesofagus carcinoom behandeld wordt met radiotherapie, en van patienten bij wie alleen een tygonbuis wordt inge­bracht, ligt de nadruk van dit onderzoek op de kwaliteit van de over­leving. Hiervoor wordt een uitvoerig studieprotocol opgesteld. Gekeken wordt naar el fysieke klachten, zoals passage klachten en pijnklachten, e2 algemene conditie (voedingstoestand) e3 psychologische conditie (angst, spanning, relatie met partner, vrienden en familie, werk, etc.). Na een pilot studie zal het project in lKA verband uitgevoerd worden. Geschatte duur 3 jaar.

X.10 GYNAECOLOGISCHE TUMOREN

E.J.Aartsen, Ch.Albus-Lutter, W.W.ten Bokkel Huinink, B.van Bunningen, J.M.V.Burgers, J.F.M.Delemarre, E.Hamersma, J.V.Th.H.Hamerlynck.

In hoofdzaak zal de aandacht blijven gaan naar onderzoek gericht op betere en minder belastende behandeling van het epitheliale ovarium­carcinoom. De lopende trials voor de behandeling van het "ovarium­carcinoom in een vergevorderd stadium (stadium IIB, lIl, IV) opgesteld en uitgevoerd in het kader van een Nederlandse multicentrische werk­groep zullen worden afgerond. Nieuwe trials worden thans geconcipieerd. Veel aandacht zal worden besteed aan de waarde van de zg. "debulking" operaties en de zg. "second look"operaties. In het bijzonder zal het wenselijke tijdstip van debulking-operatie voor het bereiken van een optimaal chemotherapie-effec1 nader bepaald worden.

Tevens zal onderzocht "worden of de second" look laparotomie vervangen kan worden door minder belastende second look laparoscopieën. De waarde van de radiotherapie bij het ovariumcarcinoom zal bijzondere

*Amsterdams Hedisch Centrum

77

aandacht krijgen. Niet alleen zal een studie voortgang vinden waarin T.A.I. (Total Abdomen Irradiation) toegepast wordt bij matig en slecht gedifferentieerde tumoren in een vroeg stadium (stadium IA, IB, IIA), ook zal bij patienten met een ovariumcarcinoom in een vergevorderd sta­dium met microscopische tumorrest na opèratie enjof maximale chemothe­rapie, T.A.I. behandeling worden toegepast. Tevens zal een gerandomi­seerde studie worden opgezet bij patienten met een complete remissie na chemotherapie met T.A.I. in één van beide armen.

Een begin is gemaakt met intraperitoneale chemotherapie. Deze behande­ling zal mogelijk haar toepassingsgebied vinden bij patienten met meer dan microscopische tumorrest na conventionele behandeling.

Tenslotte zal in I.K.A. verband onderzoek verricht worden naar het voor­komen van oestrogeen- en progesteronreceptor in het ovariumcarcinoom (J.G.Stolk en J.F.M.Delemarre).

Voor de behandeling van het gevorderde cervixcarcinoom zal verder ge­participeerd worden in E.O.R.T.C.verband waar nieuwe chemotherapie schemata worden uitgetest.

Verschillende combinatievormen radiotherapie-chemotherapie zullen wor­den onderzocht. Mogelijk zal radiotherapie voorafgegaan en gevolgd door chemotherapie een efficiëntere behandeling blijken te zijn dan radio­therapie alleen.

X.13 PSYCHOLOGISCHE ZORG

F.S.A.M.van Dam, A.C.G.Linssen, G.J.P.F.Hanewald*

el. Meten van psychosociale consequenties van kankertherapieën. (Geschatte duur 5 jaar)

Voortbouwend op het werk dat de afgelopen jaren verricht is met betrek­king tot het meetbaar maken van psychosociale consequenties van kanker­therapieën zal in 1984 getracht worden de bestaande meetinstrumenten te vereenvoudigen en daarnaast deze· meetinstrumenten uitte breiden met een gedeelte waarin vastgelegd wordt hoe de patienten met hun klachten en symptomen omgaan ("Coping behavior") . Tenslotte zullen de meetinstrumenten getest worden op hun trans-culture­le bruikbaarheid. Dit zal geschieden in overleg met de W.H.O. en de E.O.R.T.C.

e2. Evaluatie Pijnbestrijdingsprogramma's (Geschatte duur 3 jaar)

In overleg met de werkgroep pijnbestrijding zal via een descriptief onderzoek getracht worden inzicht te krijgen in de waarde van de vige­rende regels voor pijnbestrijding in het Antoni van Leeuwenhoek Zieken­huis. Dit is nu vooral van belang, omdat deze regels grotendeèls over­genomen zijn door de Nederlandse Vereniging ter Bestudering van Pijn en op landelijke schaal zijn gepubliceerd.

Psychologisch Laboratorium, Universiteit van Amstprdam

78

X.14 KLINISCH-CHEMISCH LABORATORIUM ONDERZOÉK

X.14 a Een combinatie van (tumor)markers bij de behandeling van patienten met kleincellig anaplastisch lonqcarcinooF. (S.C.L.C.)

W.J.Nooyen, N.van Zandwijk, J.G.McVie.

Deze studie is bedoeld als een vooronderzoek in het kader van de trial voor kleincellig longcarcinoom (EORTC S.C.L.C.0882S).

Bij een zich de laatste jaren verbeterde therapeutische behandeling van S.C.L.C. bestaat steeds sterker de beho'efte om het klinische beloop te kunnen volgen m.b.v. gevoelige markerstoffen. Voor deze studie is gekozen voor een combinatie van in de literatuur reeds solitair gememoreerde markerstoffen m.b.t. longcarcinoom, m.n. C.E.A., calcitonine, ceruloplasmine en ferritine.

Voor de bepaling van calcitonine is het van belang dat vooral de hoog moleculaire componenten van calcitonine bepaald kunnen worden. Daarvoor bestaat reeds een commerciële bepaling van Immuno Nuclear Cooperation. Voor de bepaling van ferritine zijn het vooral de zure isoferritines die door tumoren gesecreteerd worden. Daar is op dit moment nog geen bepaling voor'. Deze zal in de loop van 1984 opgezet moeten worden.

Deze studie is vooral van nut omdat in de literatuur noch van de cpmbinatie noch van de juiste typering van al deze markers voor S.C.L.C. gebruik gemaakt is.

X.14 b Cytosine arabinoside (Ara-C)

W. J . Hooyen, B. ~'J • Onqerboer de Visser.

Ara-C wordt met succes toegepast bij de behandeling van lymphomen en acute leukemieën. Ten behoeve van de bestudering van de farmacokinetiek van Ara-C en de belangrijkste metaboliet Ara-C-trifosfaat wordt een radio-immuno assay ontwikkeld. Deze bepaling zal tevens worden aangepast voor liquor, aangezien dit betekenis lijkt te hebben voor de behandeling van me­ningeale metastasering.

X .14 c Steroid hormonen

W.J.Nooyen, J.G.M.Bonfrèr, P.F.Bruning

In het kader van het onderzoeksproject NKI 80-1 (projectleider P.F. Bruning) worden momenteel bepalingen uitgevoerd van progesteron,estro­genen, androgenen en SHBG. Er bestaat nu reeds een ruime ervaring op het gebied van de praktische uitvoering van deze bepalingen. Wij hebben nu het plan opgevat om van deze "researchbepalingen" routinebepalingen te maken.

Daarvoor zullen we de nu in ons bezit zijnde antisera (kleine giften) moeten vervangen door bulk antisera, te verkrijgen uit eigen immunisa­ties. Daarbij staat ons ook voor ogen om de specificiteit voor de verschillende steroid hormonen te vergroten door uit te gaan van spe­cifiek geconjugeerde steroiden aan BSA of aan BTG. Deze conjugaten zullen of gekocht worden of indien dat niet mogelijk is, zelf gesyrithe­tiseerd worden.

79

X.17 VOEDING VAN DE KANKERPATIENT

P.F.Bruning, J.M.V.Burgers, F.S.A.M.van Dam, A.Gooskens, A.Halling, E.Klein Poelhuis, A.Schoot, M.Taks (Nederlands Kanker Instituut), R.Egger, R.J.Hermus, K.Hulshof, W.Schreurs (CIVO-TNO, Zeist)

In het projekt - Nutrition of the Cancer patient - (KWF-NKI 81-4) dat begonnen werd in oktober 1981 en zal eindigen 1 januari 1984 worden prospectieve gegevens verzameld bij 90 - 100 patienten over el de kwantitatieve voedselinname (naar nutriënten en voedingsmiddelen; dietary record methode) , 02 de voedingstoestand (naar anthropometrische en laboratoriurnkriteria) , 63 de lichamelijke en geestelijke fitheid (aan de hand van performance score en vragenlijsten) . Het onderzoek strekt zich uit over 5 maanden per patient en betreft patienten die behandeld worden met uitwendige radiotherapie wegens blaas- of prostaatcarcinoom (overwegend oudere mannen), uterus- of cervixcarcinoom (overwegend oudere vrouwen) of met chemotherapie wegens maligne lymphoom (een groep mannen en vrouwen van diverse leeftijden die gedurende de 5 maanden observatie kontinue intensieve behandeling ondergaat). Laboratoriumonderzoek en dataverwerking gebeurt in nauwe samenwerking met CIVO-TNO, Zeist).

Afhankelijk van de begin 1983 te verwachten eerste uitkomsten zal voor 1984 - 1985 een interventie-onderzoek worden ontworpen om op grond van de verkregen resultaten te bezien of verbetering mogelijk is van de voedingskondities van omschreven patienten populaties tijdens kanker­behandeling. Daarbij zal in principe eenzelfde onderzoek-methodolo­gische aanpak worden gevolgd.

X.18 IMMUUNHISTOCHEMIE EN VERWANTE TECHNIEKEN.

Ph.Hageman, D.Atsma, P.F.Bruning, J.Calafat, J.F.M.Delemarre, G.v.Doornewaard, E.v.d.Esch, H.Janssen, W.Misdorp, M.v.d.Valk, J.Verrijk en P.Wisman.

0l. Testistumoren De resultaten van de routinematige enzymhistochemische bepaling van aFP en SHCG zal worden gecorreleerd met de waarden die klinisch chemisch voor deze verbindingen in het serum van patienten worden aangetoond. Getracht zal worden te komen tot een verbeterde klassificatie mede naar cel functie van de testistumoren, gerelateerd aan het klinische beloop. Ongeveer begin 1984 zal worden nagegaan of de resultaten voldoende veelbelovend zijn om de serie uit te breiden met materiaal van andere ziekenhuizen, dat door de Commissie Testistumoren is verzameld. Verschillende monoclonale antistoffen tegen SHCG zullen worden ge­toetst op testistumoren en \andere weefsels om een indruk te krijgen of deze antistoffen in de toekomst geschikt zullen zijn voor werk in vivo: imaging van tumor en metastasen met behulp van radioactief gemerkte antistoffen en therapie. Deze methode kan ook in aanmerking komen voor sommige ovariumtumoren.

02. Mammatumoren. Het is duidelijk uit de resultaten die in het jaarverslag voor dit pro­ject zijn vermeld, de reeds beschikbare monoclonale antistoffen die met mammatumoren reageren geen voldoende specificiteit vertonen om een duidelijk onderscheid te maken tussen mammatumoren en andere tumor­typen of tussen benigne en maligne lesies van de mamma. Het zal daarom noodzakelijk zijn monoclonale antistoffen te bereiden tegen membranen van verse mammatumorcellen, zoals beschreven door D.Colcher et al. Proc.Natl.Acad.Sc.78(198l)3l99-3203. De antilichamen die door deze groep zlJn gemaakt zijn vooralsnog niet te koop of door ruiling ver­krijgbaar. Het is te verwachten dat de eerste sets van deze nieuw te

80

bereiden antilichamen in de loop van 1984 voor practisch gebruik ge­reed zijn. Om een duidelijker onderscheid te kunnen maken tussen benigne en ma­ligne lesies van de mamma en eventuele overgangen tussen beide condi­ties te kunnen bestuderen zal ook gebruik worden gemaakt van anti­lichamen die door andere groepen zijn ontwikkeld, b.v. het antilichaam Cal (J.O.'D.McGee et al. The Lancet 2 (1982) 7-10). Dit antilichaam zou reageren met mamma tumoren maar niet met normaal mammaweefsel of met benigne lesies. Het antilichaam zou niet alleen met mammatumoren maar ook met andere tumortypen reageren, hoewel niet met melanoma, lymfoma of seminoma. De bestudering van de reeds tegen humane melkvetmembranen opgewekte monoclonale antilichamen wordt voortgezet, waarbij meer dan voorheen aandacht zal worden besteed aan de reactie op coupes van be­vroren weefsel teneinde meer gegevens te verkrijgen.ten behoeve van het werk in vivo. Dit werk zal worden verricht in overleg met H.Haisma, J.Hilgers en J.Hilkens (Sektie VI). Er zal tevens aandacht worden besteed aan de reactie van mammatumorcel­len met monoclonale antistoffen tegen componenten van het cytoskelet. Lectines. P. Klein en medewerkers melden herhaaldelijk, dat reactie van mamma tumoren met peanut agglutinine (PNA) gecorreleerd is met de aanwezigheid van oestrogeen en progesteron-receptoren en met een gunsti­ge reactie van de patient op hormonale therapie(P.J.Klein et al., Br.J.Cancer 44(1981)746-748 en P.J.Klein et al. The lectins 4, Ül press) . Omdat de resultaten van dit onderzoek elders niet geheel her­haalbaar zijn, zal de waarde van de reactie van de tumor met PNA worden getest aan ons eigen tumormateriaal, dit in samenwerking met de afde­ling klinische chemie. Dit voorlopige onderzoek zal in de loop van 1984 afgerond zijn. Met behulp van verschillende lectines zal worden onderzocht of er in bindweefsel van proliferatieve lesies van de mamma veranderingen zijn aan te tonen die duiden op een verhoogde kans op mamma tumor of die anderszins van belang kunnen zijn voor de klassificatie van proli­feratieve lesies en mammatumoren. Dit werk zal worden gecorreleerd met de resultaten die met monoclonale antistoffen tegen differentiatie­antigenen van de mamma worden behaald. Indien noodzakelijk zal dit werk met lectines ook op electronenmicrosco­pisch niveau worden uitgevoerd.

03. Melanomen De monoclonale antistoffen die tegen verse melanoomcellen (in tegenstel­ling tot het vroegere werk met cellen uit weefselkweek) zijn en worden gemaakt zullen immuunhistochemisch worden gekarakteriseerd. Gestreefd wordt naar antistoffen die beter dan de reeds aanwezige NKIjC-3 ge­schikt zijn voor gebruik in vivo. NKIjC-3 vertoont immers het duide­lijkst een specificiteit voor melanoom wanneer het op formaline­gefixeerd weefsel wordt gebruikt en dit antilichaam reageert zowel op melanomen als nevi. Er zal daarom tevens worden getracht antilichamen te selecteren die een verschil in reactiepatroon op melanomen en nevi vertonen en die het onderscheid zouden kunnen vergemakkelijken tussen primaire melanomen met verschillend metastaserend vermogen. Voor ver­dere onderdelen van het werkplan wordt verwezen naar VI.I.e.

04 Weefselbank Het verzamelen van snel diepgevroren en van gefixeerd weefsel, zowel van normaal weefsel als tumoren en cellen uit pleura en ascites vloei­stof zal worden voortgezet, zowel ten behoeve van immuunhistochemisch werk als van andere onderzoekingen in het NKI.

oS Diagnostiek van tumoren en van metastasen van onbekende primaire tumoren. Immuunhistochemisch werk ten behoeve van de diagnostiek zal ook in 1984 worden voortgezet, waarbij ook gebruik gemaakt zal worden van de mono­clonale antistoffen tegen met longtumoren geassocieerde antigenen die in ontwikkeling zijn.

81

Wanneer de onzekere elementen uit het screenings systeem ter herkenning van metastasen zijn weggewerkt·, zal deze screening routinematig op de afdeling pathologie kunnen worden uitgevoerd.

06 Electronenmicroscopie Teneinde de distributie· van antigenen binnen de structuur van de cel te kunnen bestuderen, ook op EM niveau, wordt de techniek van de irnrnunocyto­chemie op ultradunne vriescoupes ingevoerd. Hier is reeds enige maanden geleden een aanvang mee gemaakt. Als een van de eerste onderwerpen zal de reactie worden bestudeerd van het antilichaam NKIjC-3 op cellen van melanoom en van andere tumoren die onder bepaalde condities kruisreage­ren zoals marnrnatumoren en clear cell sarcomen. Uit lichtmicroscopische waarnemingen zijn aanwijzingen verkregen dat het desbetreffende anti­geen in melanoomcellen en ander verdelingspatroon zou bezitten als in andere tumoren. Het werk met NKIjC-3 zal in 1984 worden afgerond, zodat er daarna tijd is om de distributie van andere relevante antigenen te bestuderen.

X.19 ISOTOPEN ONDERZOEK

H.R.Marcuse, M.A.Bakker-Tervoort, C.A.Hoefnagel.

Het is te verwachten dat het projekt dat de kwantitatieve meting van regionaire longfunktie beoogt door middel van emissie tomografie zijn eerste fase (fantoom onderzoek, software) zal hebben doorgemaakt tegen 1984 en dat de eerste patienten onderzoeken zullen zijn uitgevoerd.

In het projekt AVKC 81-8 Tumortargeting of cytotoxic compounds using intra-arterial biodegradable microspheres, zal de verdeling van micro­sferen en geïncorporeerde farmaca in de lever van ingespoten dieren worden bestudeerd.

Het is de bedoeling in 1984 een nieuw projekt te beginnen betreffende de dosimetrie bij l3l-J behandeling van schildkliercarcinoom. Verder zal worden bijgedragen aan in vivo onderzoek van gelabelde monuclonale antistoffen en farmaca bij dier. en mens.

X.20 LONGCARCINOOM

J.A.Bangert, J.G.Mcvie, G.Schaake-Koning, N.van Zandwijk.

Een samenwerkingsverband van deze groep met de afdelingen Longziekten, Radiotherapie (L.Schuster-Uitterhoeve) en Inwendige Geneeskunde (C. Veenhof) van het A.Z.U.A.(AMC) heeft zich in de afgelopen jaren gevormd. Dankzij een nauwe relatie met de E.O.R.T.C. "Lung Cancer Cooperative Group" betreft het veelal onderzoek, dat binnen deze laatste groep werd geactiveerd.

• Induction versus induction plus maintenance chemotherapy in'small cell lung cancer (SCLC). Phase 111, E.O.R.T.C.08825.

• Phase 11 Study of ametrantrone (SCLC en non-small cell lung cancer (NSCLCY, E.O.R.T.C. 08812.

• Phase 11 Study of ellipticinium (SCLC en NSCLC), E.O.R.T.C.08822.

Het protocol gebr.uikt voor de fase 2 studies is zo ontworpen, dat steeds nieuwe E.O.R.T.C. drugs kunnen worden ingevoerd. Het (fase 3) onderzoek naar de duur van onderhoudsbehandeling bij SCLC zal in samen­werking met W.Nooyen worden aangevuld met een onderzoek naar tumor­markers. Serum concentraties van calcitoninè, ferritine, CEA, cerulo­plasmine,zullen alleen en in combinatie worden gecorreleerd aan tumor response (duur). Dankzij een serUmbi'lf'k zal het mogelijk zijn nieuw te

82

ontwikkelen marker assays zonder tijdverli~s te testen. Voorbereidingen zullen worden getroffen om waarschijnlijk in E.O.R.T.C.verband tot een (fase 3) onderzoek te komen naar de waarde van gecombineerde chemothe­rapie in hoge dosis (met gebruik van autoloog beenmerg) bij SCLC. Naast aandacht voor het optimale tijdstip van radiotherapie bij NSCLC patienten met weinig of geen symptomen (Imrnediate vs delayed RT in non-operable, non-syrnptomatic NSCLC, E.O.R.T.C.8824, phase III) zal in samenwerking met H.Bartelink onderzocht worden of cisplatinum - zoals recent uit proefdierenonderzoek bleek - een radiosensiterend vermogen bezit. Ook zal worden geparticipeerd in de voorbereiding van een studie waarbij aan niet-operabele patienten met NSCLC sequentieel radiotherapie en cisplatinum plus vindesine zal worden toegediend. Voor operabele patienten met slechte prognostische factoren is in samenwerktng met P.Goldstraw (Brompton Hospital) een soortgelijk beleid in voorbereiding. Psychometrische evaluatie van patienten met een bronchuscarcinoom, onderdeel van beide fase 3 studies, zal veelal binnen het kader van de E.O.R.T.C. "Quality of Life" Group en in samenwerking met F.S.A.M.van Dam en A.Stewart geschieden.

X;22 DIEPVRIES BEENMERG PRESERVATIE EN RE IMPLANTATIE BIJ CHEMOTHERAPIE

W.W.ten BokkeI Huinink, S.P.Israëls.

De belangrijkste dosisbeperkende bijwerking van chemotherapie wordt gevormd door beenmerg suppressie. Het lijkt aantrekkelijk om door diep­vries preservatie en eventuele reïmpl·antatie van tevoren onder algemene anaesthesie afgenomen beenmerg deze dosisbeperkende factor te voorkomen. Dit is in de praktijk goed uitvoerbaar gebleken.

Een protocol voor deze vorm van behandeling bij patienten met gemetasta­seerd testiscarcinoom en placentair choriocarcinoom resistent tegen conventionele chemotherapie werd in 1982 opgesteld: bij gebleken resistentie of bij sombere prognostische kenmerken bij het begin van de behandeling wordt beenmerg afgenomen en ingevoren.

Na preservatie van beenmerg wordt een zo hoog gedoseerde chemotherapie met cyclophosphamide en etoposide toegepast dat lethale beenmerg be­schadiging waarschijnlijk is. Daarom wordt na enkele dagen (etoposide in hoge dosis wordt in enkele dagen pas uitgescheiden) het beenmerg gereïmplanteerd. Dit protocol van behandeling zal worden voortgezet. Het onderzoek zal worden uitgebreid met pogingen het beenmerg te zuiveren van eventuele tumorcellen in samenwerking met Dr.W.Bont.

Indien het mogelijk blijkt bij aangetoonde metastasering in het bot, beenmergstarncellen te scheiden van tumorcellen met grote mate van zeker­heid, kan van beenmerg preservatie en reïmplantatie bij ook andere tumorsoorten worden overwogen (kleincellig longcarcinoom).

83

!I