ΘΑΛΑΣΣΙΑ ΧΥΤΙΝΟΛΥΤΙΚΑ ΕΝΖΥΜΑ:Ο ΚΡΥΜΜΕΝΟΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟΣ

ΘΗΣΑΥΡΟΣ ΤΟΥ ΩΚΕΑΝΟΥ;Δάλλη Ελένη (1113201500022)

Τσεκουρά Ευσταθία (1113201500134)

Επιβλέπων Καθηγητής: Βοργιάς Κωνσταντίνος

Αθήνα, 2019

Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Τμήμα ΒιολογίαςΤομέας Βιοχημείας & Μοριακής Βιολογίας Ειδικά Κεφάλαια Βιοχημείας

ΠεριεχόμεναΑ. Περίληψη............................................................................................3

Β. Εισαγωγή……………………………………………………………….….4

Β.1 Χιτίνη-χιτοζάνη…………………………………………………………………….….. 4

Β.2 Χιτο-ολιγοσακχαρίτες……………………………………………………………….….5

Γ. Αποικοδόμηση χιτίνης-χιτοζάνης……………………………….…….6

Γ.1 Ένζυμα υδρόλησης χιτοζάνης……………………………………………..….………6

Γ.2 Ένζυμα αποικοδόμησης χιτίνης……………………………………………….…...…7

Δ. Παραγωγή και καθαρισμός των θαλάσσιων χιτινασών…….…….8

Δ.1 Πηγές χιτινολυτικών ενζύμων………………………………………………..……….8 Δ.1.1 Φυσικές πηγές…………………………………………………………….…...8 Δ.1.2 Τα καρκινοειδή ως κύρια πηγή χιτινολυτικών ενζύμων……………………9 Δ.1.3 Χιτινολυτικά ένζυμα από θαλάσσιους μικροοργανισμούς…………………9 Δ.1.4 Σπονδυλωτά και παραγωγή χιτίνης…………………………………………..9 Δ.1.5 Αλλομορφές χιτίνης…………………………………………………………...10

Δ.2 Παραγωγή θαλάσσιων χιτινολυτικών ενζύμων μέσω ανασυνδυασμού………...11

Δ.3 Αναστολείς των χιτινασών…………………………………………………………...11

Ε. Βελτίωση του βιοκαταλύτη…………………………………………....12

Ε.1 Πρωτεϊνική Mηχανική………………………………………………………………...12

Ε.2 Ακινητοποίηση Ενζύμου……………………………………………………………..12

ΣΤ. Εφαρμογές των χιτινολυτικών ενζύμων…………………………..13

ΣΤ.1 Εφαρμογή στην ιατρική……………………………………………………………..13

ΣΤ.2 Εφαρμογή στο φαγητό………………………………………………………………14

ΣΤ.3 Εφαρμογή στη γεωργία………………………………………………………….….14

Ζ. Συμπεράσματα…………………………………………………….…….14

Η. Βιβλιογραφία………………………………………………………….....15

Α. Περίληψη

Τα χιτινολυτικά ένζυμα είναι ικανά να καταλύουν την υδρόλυση της χιτίνης και έχουν προσελκύσει παγκόσμιο ενδιαφέρον, καθώς έχουν βιοϊατρικές και βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Ακόμα, συμβάλλουν στη δημιουργία χρήσιμων υλικών σε βιομηχανίες που αφορούν το φαγητό, την φαρμακευτική, την κοσμητολογία και την βιοϊατρική. Αυτό συμβαίνει γιατί τα θαλάσσια ένζυμα εμφανίζουν καλύτερες λειτουργικές ιδιότητες σε σχέση με τα ομόλογα των ζώων, των φυτών και των βακτηρίων. Σε αυτή την κριτική, θα περιγραφούν τα θαλάσσια χιτινολυτικά ένζυμα ως “ευέλικτα” σε διάφορα βιοτεχνολογικά πεδία και θα συζητηθούν ενδιαφέροντα σχόλια για τον βιολογικό τους ρόλο, τους μηχανισμούς αντίδρασης, την λειτουργικότητα και τον τρόπο δράσης τους.

Λέξεις κλειδιά: Θαλάσσια ένζυμα, χιτινολυτικά ένζυμα, βιοτεχνολογικές εφαρμογές, παραγωγή ενζύμων, ακινητοποίηση ενζύμου.

A. Abstract

Chitinolytic enzymes are capable to catalyze the chitin hydrolysis. Due to their biomedical and biotechnological applications, nowadays chitinolytic enzymes have attracted worldwide attention. Chitinolytic enzymes have provided numerous useful materials in many different industries, such as food, pharmaceutical, cosmetic, or biomedical industry. Marine enzymes are commonly employed in industry because they display better operational properties than animal, plant, or bacterial homologs. In this mini-review, we want to describe marine chitinolytic enzymes as versatile enzymes in different biotechnological fields. In this regard, interesting comments about their biological role, reaction mechanism, production, functional characterization, immobilization, and biotechnological application are shown in this work.

Keywords: Marine enzymes, Chitin hydrolysis, Biotechnological applications, Enzymatic production, Enzyme immobilization.

Β. Εισαγωγή

Οι υδατάνθρακες συμμετέχουν σε πολλές βιοχημικές διαδικασίες ως δομικά συστατικά, πηγή ενέργειας, αποθήκευσης κ.α. Για το λόγο αυτό, αποτελούν στοιχειώδη μόρια σε όλους τους ζώντες οργανισμούς και παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ζωής στη γη. Μπορούν να βρεθούν με τη μορφή μεγάλων δομικών πολυσακχαριτών (π.χ. κυτταρίνη στα φυτά ή χιτίνη στα αρθρόποδα) και να σχηματίζουν βιολογικά μόρια όπως το DNA, τα γλυκολιπίδια, οι γλυκοπρωτεινες, κλπ. Επίσης, οι υδατάνθρακες εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση και ανοσία ,στην κυτταρική αναγνώριση και σε άλλες βιολογικές λειτουργίες.

Β.1 Χιτίνη - Χιτοζάνη

Η χιτίνη είναι ένα γραμμικό πολυμερές της ακετυλο-γλυκοζαμίνης (πολύ-β-(1–4)- N-ακετυλο-D-γλυκοζαμίνη) και αποτελεί τον δεύτερο πιο άφθονο δομικό πολυσακχαρίτη στη φύση[2] (μετά από την κυτταρίνη)-υπολογίζεται ότι ετησίως βιοσυντίθενται στην βιόσφαιρα 109 τόνοι χιτίνης. Ο ρόλος της χιτίνης είναι μορφογενετικός και δομικός, καθώς είναι βασικό δομικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος των μυκήτων, ορισμένων φυκών και διατόμων και κύριο συστατικό του κελύφους των οστρακοειδών, του εξωσκελετού αρθροπόδων και εντόμων καθώς και του ενδοσκελετού των μαλακίων και των σκωλήκων. Επιπλέον, είναι σημαντική πηγή θρεπτικών συστατικών (άνθρακα και αζώτου) για τα βακτήρια.

Εικόνα 1. Ο δομικός ρόλος της χιτίνης. (α) Η χιτίνη αποτελεί βασικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος των μυκήτων, καθώς σχηματίζει μια λεπτή και άκαμπτη προστατευτική στιβάδα μεταξύ της κυτταρικής μεμβράνης και των γλυκανών και μαννοπρωτεϊνών που βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια της μεμβράνης (β) Η χιτίνη κατέχει και προστατευτικό ρόλο, καθώς αποτελεί κύριο συστατικό του εξωσκελετού αρθροπόδων και εντόμων.

Η μερική αποακετυλίωση της χιτίνης μας δίνει χιτοζάνη, πολύ(β-(1–4)-D-γλυκοζαμίνη), τον μοναδικό ψευδο-φυσικό, κατιονικό πολυσακχαρίτη που γνωρίζουμε. Όταν ο βαθμός αποακετυλίωσης της χιτίνης γίνει πάνω από 50% (ανάλογα με την προέλευση του αρχικού πολυσακχαρίτη), η χιτίνη ονομάζεται χιτοζάνη και καθίσταται περισσότερο διαλυτή σε όξινα υδατικά διαλύματα.

Η χιτοζάνη και η χιτίνη μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιμικροβιακά, αντιβακτηριδιακά, αντιικά, επουλωτικά πληγών, υποχολιστεροτικά, αιμοστατικά και αντιοξειδωτικά.

Εικόνα 2. Διαφορές στις χημικές δομές α) χιτίνης, b) πλήρους αποακετυλιωμένης χιτοζάνης,c) μερικώς αποακετυλιωμένης χιτοζάνης.

Β.2 Χιτο-ολιγοσακχαρίτες

Ωστόσο, επειδή εφαρμογή τους περιορίζεται, λόγω του μεγάλου ιξώδους και της μικρής διαλυτότητας, είναι απαραίτητη η παρουσία των χιτο-ολιγοσακχαριτών (Εικόνα 3), οι οποίοι αποκτώνται από χημική ή ενζυμική υδρόλυση της χιτίνης και της χιτοζάνης.

Εικόνα 3. Σύγκριση χημικών δομών χιτίνης-χιτοζάνης-χιτοολιγοσακχαριτών.[3]

Οι χιτο-ολιγοσακχαρίτες είναι υδατοδιαλυτοί, έχουν μικρότερο ιξώδες σε σχέση με την χιτίνη και την χιτοζάνη και εμφανίζουν πολλές βιολογικές δραστηριότητες π.χ. αντιβακτηριδιακά, αντιοξειδωτικά, αντι-υπερτασικά και πρεβιοτικά. Είναι αναγκαίο να αναφερθεί πως η χημική παραγωγή των χιτο-ολιγοσακχαριτών συχνά απαιτεί ακραίες συνθήκες αντιδράσεων και έτσι οδηγούμαστε σε ανεπιθύμητες παραγωγές προϊόντων. Από την άλλη πλευρά, οι ενζυμικές αντιδράσεις αντιπροσωπεύουν μια φιλική προς το περιβάλλον και αποτελεσματική λύση διότι οι αντιδράσεις που απαιτούνται είναι ήπιες, ελεγχόμενες και τοπικές.

c

Γ. Αποικοδόμηση χιτίνης-χιτοζάνης

Το θαλάσσιο περιβάλλον καλύπτει περισσότερο από το 70% της επιφάνειας της γης και έχει θεωρηθεί η πηγή ζωής για εκατομμύρια χρόνια. Εξαιτίας αυτών των ειδικών φυσικο-χημικών συνθηκών, το θαλάσσιο περιβάλλον ανάγκασε τους οργανισμούς να δημιουργήσουν μια ποικιλία ενζύμων προκειμένου να μπορέσουν να προσαρμοστούν στην πολυπλοκότητά του. Για το λόγο αυτό, τα θαλάσσια ένζυμα μπορούν να θεωρηθούν ως νέες πηγές βιοκαταλυτών με έναν αξιοσημείωτο χαρακτήρα. Με την ανάπτυξη της βιοτεχνολογίας τον τελευταίο αιώνα, η αναζήτηση ενζύμων με νέα χαρακτηριστικά έχει αυξηθεί σε πολύ σημαντικό βαθμό. Yπό αυτό το πρίσμα, τα θαλάσσια ένζυμα έχουν αποδειχθεί ότι αποτελούν μια καινοφανή πηγή για την απομόνωση βιομηχανικών ενζύμων εξαιτίας των μοναδικών ιδιοτήτων που αυτά διαθέτουν.

Στο συγκεκριμένο rewiew θα αναφερθούμε στην πρόοδο που έχει γίνει μέχρι σήμερα στην παραγωγή αλλά και στην εφαρμογή των θαλάσσιων χιτινασών, καθώς επίσης στον βιολογικό τους ρόλο, το λειτουργικό χαρακτηρισμό και τη βελτίωση των βιοκαταλυτών.

Γ.1 Ένζυμα υδρόλησης χιτοζάνης

Τόσο η χιτίνη όσο και η χιτοζάνη μπορούν να υδρολυθούν από έναν μεγάλο αριθμό ενζύμων. Ωστόσο, η χιτοζάνη δε βρίσκεται πάντα στη πλήρη αποακετυλιωμένη μορφή και εξαιτίας της ετερογένειας αυτής, πολλές φορές είναι δύσκολο να ξεχωρίσουμε τα ένζυμα που υδρολύουν την χιτίνη από αυτά που υδρολύουν την χιτοζάνη.

Η υδρόλυση της χιτοζάνης καταλύεται κυρίως από χιτοζανάσες, αλλά και από άλλα ένζυμα στα οποία περιλαμβάνονται εξω-β-γλυκοζαμινιδάσες, β-Ν-ακετυλοεξοσαμινιδάσες, χιτινάσες και χωρίς μεγάλη εξειδίκευση από πρωτεάσες, πηκτινάσες, κυτταρινάσες και λυσοζύμη.

Η χιτοζανάση (EC.3.2.1.132) είναι ένας τύπος γλυκοζιτικής υδρολάσης (GH - Glycoside Hydrolase family) που καταλύει την αντίδραση υδρόλυσης της χιτοζάνης κυρίως μέσω διάσπασης GlcN-GlcN (GlcN: glucosamine) δεσμών, και συγκεκριμένα ενός β-1,4-γλυκοζιτικού δεσμού, απελευθερώνοντας ως κύριο προϊόν τους χιτο-ολιγοσακχαρίτες [4]. Οι χιτοζανάσες χωρίζονται σε 3 υποκατηγορίες ανάλογα με το είδος δεσμού που υδρολύουν : i) GlcN-GlcN, ii) GlcNAc-GlcN (GlcNAc: N-acetyl-glucosamine) και, iii) GlcN-GlcNAc. Οι χιτινάσες υδρολύουν GlcNAc-GlcNAc ή GlcNAc-GlcN δεσμούς.

Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, η χιτοζάνη συνήθως δεν είναι 100% αποακετυλιωμένη, και το γεγονός αυτό εξηγεί γιατί κάποιες χιτινάσες επιδρούν σε χιτοζάνες. Οι εξω-β-γλυκοζαμινιδάσες και οι β-Ν-ακετυλοεξοσαμινιδάσες απελευθερώνουν τα μονομερή από το άκρο της χιτίνης/χιτοζάνης, αποδίδοντας σαν τελικό προϊόν μια μονάδα GlcN και GlcNAc αντίστοιχα (Εικόνα 4).

Εικόνα 4. Σχηματική απεικόνιση των σημείων δράσης των διαφορετικών ενζύμων που υδρολύουν χιτίνη και χιτοζάνη.

Γ.2 Ένζυμα αποικοδόμησης χιτίνης

Η αποικοδόμηση της χιτίνης επιτυγχάνεται από βακτηριακά χιτινολυτικά ένζυμα και είναι μια διεργασία σημαντική για τον κύκλο του άνθρακα και του αζώτου στη φύση.

Τα ένζυμα που αποικοδομούν τη χιτίνη είναι μία ετερογενή ομάδα ενζύμων που ανήκει στις γλυκοζιτικές υδρολάσες, οι οποίες είναι ικανές να καταλύουν τη διάσπαση του β-1,4-γλυκοζιτικού δεσμού της χιτίνης, με αποτέλεσμα την παραγωγή μιας σειράς μορίων με μικρότερο μοριακό βάρος, με κυριότερο προϊόν τους χιτο-ολιγοσακχαρίτες. Τα ένζυμα αυτά τα συναντάμε σε μεγάλο αριθμό οργανισμών στα οποία συμπεριλαμβάνονται φύκη, μύκητες, βακτήρια, αρθρόποδα, έντομα, ανώτερα φυτά και καρκινοειδή.

Εξαιτίας τη εξειδίκευσης του υποστρώματος, τα ένζυμα αποικοδόμησης της χιτίνης μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κύριες κατηγορίες: τα ένδο- και έξω-χιτινολυτικά ένζυμα.

Εικόνα 5. Εξειδίκευση χιτινασών ως προς τον τρόπο δράσης. Οι εξω-χιτινάσες δρουν στα άκρα της πολυσακχαρικής αλυσίδας, ενώ αντίθετα οι ενδο-χιτινάσες δρουν στο εσωτερικό της.

Τα ένδο-χιτινολυτικά ένζυμα, τα οποία ονομάζονται και χιτινάσες (EC 3.2.1.14), κόβουν τυχαία την αλυσίδα της χιτίνης σε εσωτερικές θέσεις. Αντίθετα, τα έξω-χιτινολυτικά ένζυμα απομακρύνουν σταδιακά δύο υπομονάδες είτε από το μειωτέο είτε από το μη μειωτέο άκρο της χιτινικής αλυσίδας. Τα ένζυμα αυτά, μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο υποκατηγορίες: τις χιτοβιάσες, οι οποίες τελειώνουν την υδρόλυση μετατρέποντας την χιτοβιόζη σε Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (GlcNAc), και τις 1-4-β-Ν-ακετυλογλυκοζαμινάσες (αποακετυλάσες). Ωστόσο, τα παραπάνω ένζυμα (EC 3.2.1.29) and (EC 3.2.1.30) μπήκαν σε μία κατηγορία και ονομάζονται β-Ν-ακετυλοεξοσαμινάσες (EC 3.2.1.52).

Οι χιτινάσες μπορούν να αποικοδομήσουν εύκολα την χιτίνη σε χιτοολιγοσακχαρίτες εφόσον η αλυσίδα αποτελείται το λιγότερο από n=2, ενώ οι β-Ν-ακετυλοεξοσαμινάσες μετατρέπουν χιτοβιόζη και μικρούς χιτοολιγοσακχαρίτες σε μονομερή Ν-ακετυλο-γλυκοζαμίνης.

Εικόνα 6. Δράση χιτινολυτικών ενζύμων στην αποικοδόμηση της χιτίνης. Η διάσπαση της χιτίνης περιλαμβάνει τρία στάδια: υδρόλυση της χιτίνης από χιτινάσες και παραγωγή ολιγοσακχαρίτων και δισακχαρίτων χιτίνης (diNAG, χιτοβιόζη), περαιτέρω υδρόλυση των ολιγοσακχαρίτων από χιτοβιάσες και παραγωγή GlcNAc και τέλος, μετατροπή αυτών σε γλυκοζαμίνες μέσω δράσης αποακετυλασών.

Σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης των Henrissat και Bairoch[5], το οποίο βασίζεται στην ομολογία της αμινοξικής τους αλληλουχίας, τα ένζυμα που αποικοδομούν τη χιτίνη μπορούν να χωριστούν στις οικογένειες 18,19 και 20 των γλυκοζυλοϋδρολασών. Οι χιτινάσες, ανήκουν στις οικογένειες 18 και 19 στις οποίες παρατηρούνται διαφορετικές δομές και καταλυτικοί μηχανισμοί. Συγκεκριμένα, τα μέλη της οικογένειας GH18 διαθέτουν δομή βαρελιού (α/β)8, όπου αποτελείται από οχτώ α-έλικες και οκτώ β-πτυχωτές επιφάνειες, ενώ τα μέλη της οικογένειας GH19 παρουσιάζουν μια πολύ διαφορετική αρχιτεκτονική, καθώς αποτελούνται α-έλικες που συνδέονται με θηλιές. Οι Ν-ακετυλοεξοζοαμινάσες ανήκουν στην 20 οικογένεια, τα μέλη της οποίας παρουσιάζουν επίσης δομή βαρελιού (α/β)8. Είναι σκόπιμο να αναφερθεί πως μια άλλη ταξινόμηση κατηγοριοποιεί τις χιτινάσες σε 6 τάξεις όπου οι τάξεις III και V βρίσκονται συνήθως στα βακτήρια (συμπεριλαμβάνει την οικογένεια 18) και οι τάξεις I, II, IV βρίσκονται κυρίως στα φυτά (συμπεριλαμβάνει την οικογένεια 19).

Δ. Παραγωγή και καθαρισμός των θαλάσσιων χιτινασών

Δ.1.1 Φυσικές πηγές

Ο εξωσκελετός των καρκινοειδών και των εντόμων κυρίως συντίθεται από χιτίνη, κάνοντάς την το πιο άφθονο πολυμερές στο θαλάσσιο οικοσύστημα. Τα χιτινολυτικά ένζυμα ειναι σημαντικά στην ανάπτυξη κάποιων οργανισμών μέσω πέψης και σχηματισμού νέου

εξωσκελετού και στην ανάπτυξη των υφών στους μύκητες. Η ετήσια παραγωγή της χιτίνης στα υδάτινα οικοσυστήματα είναι υψηλή (περίπου 1010 τόνοι), και με τη συσσώρευσή της μπορεί να προκαλέσει κινδύνους, όπως είναι η μόλυνση των υδάτων. Έτσι, με τη χρήση των θαλάσσιων χιτινασών όχι μόνο επιλύουμε το παραπάνω πρόβλημα αλλα ταυτόχρονα μπορούμε να επεκτείνουμε τη χρήση τους σε διάφορα βιοτεχνολογικά πεδία.

Δ.1.2 Τα καρκινοειδή ως κύρια πηγή χιτινολυτικών ενζύμων

Τα καρκινοειδή είναι μια αρκετά σημαντική ομάδα αρθροπόδων, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως σε βιοτεχνολογικές και μοριακές μελέτες. Στην ομάδα αυτή ανήκουν τα καβούρια, οι αστακοί, οι γαρίδες, ορισμένα μέλη του ζωοπλαγκτονικού πληθυσμού της τάξης Ευφαυσεώδη (Κρίλ) και μέλη της τάξης Θυσανόποδα. Τα χιτινολυτικά ένζυμα της ομάδας αυτής βρίσκονται στο ηπατοπάγκρεας και στην επιδερμίδα των καρκινοειδών και είναι δύο ειδών: η β-Ν-ακετυλοεξοσαμινάση και η χιτινάση, οι οποίες συμβάλουν στην πέψη των τροφών που περιέχουν χιτίνη και στην διαδικασία αλλαγής του εξωσκελετού, αντίστοιχα. Εν τέλει, η χιτινόλυση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον κύκλο ζωής των καρκινοειδών, καθώς βοηθά και στην άμυνα έναντι των παθογόνων ιών.

Δ.1.3 Χιτινολυτικά ένζυμα από θαλάσσιους μικροοργανισμούς

Ο όρος “θαλάσσια μικρόβια” καλύπτει μια ποικιλία μικροοργανισμών, στην οποία περιλαμβάνονται βακτήρια, αρχαία, κυανοβακτήρια, μύκητες, μικροφύκη και πρωτόζωα. Τα χιτινολυτικά μικρόβια μπορούν να βρεθούν στο νερό, σε ιζήματα και στο πεπτικό σύστημα των ψαριών. Λόγω της ετερογένειας του θαλάσσιου οικοσυστήματος μπορούν να βρεθούν διάφοροι μικροοργανισμοί που ζουν σε ακραίες συνθήκες (αλλόφιλα, ψυχρόφιλα, κλπ.), των οποίων τα ένζυμα αποτελούν σημαντικό κομμάτι για τις βιομηχανίες. Τέλος, όσον αφορά τις βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας για την παραγωγή χιτινολυτικών ενζύμων, ποικίλουν αρκετά. Για παράδειγμα, το είδος Beauveria bassiana (χιτινολυτικός μύκητας που απομονώθηκε από θαλάσσια ιζήματα) παρουσιάζει μέγιστη ενζυμική δραστηριότητα στο pH=9.2 ενώ το είδος Streptomyces champavatii AZ-1 παράγει χιτινολυτικά ένζυμα κάτω από ελαφρά όξινες συνθήκες, δηλαδή pH=5.0-5.5.Χιτινολυτικά ένζυμα έχουν απομονωθεί και από άλλα είδη θαλάσσιων μικροβίων. Ενδεικτικά θα αναφέρουμε ορισμένα από αυτά: στα βακτήρια τα γένη Bacillus, Vibrio, Paenibacillus, Pseudoalteromonas, Aeromonas, Micrococcus, Streptomyces, Alteromonas, Actinomyces, Chitiniphilus, and Achromobacter ενώ στους μύκητες τα είδη Aspergillus terreus και Aspergillus carneus.

Δ.1.4 Σπονδυλωτά και παραγωγή χιτίνης

Στο παρελθόν, υπήρχε μια μακροχρόνια πεποίθηση ότι τα ασπόνδυλα είναι οι μοναδικές πηγές χιτίνης και ότι η παραγωγή χιτίνης στα σπονδυλωτά ήταν μηδενική. Πλέον όμως, έχουμε αποκτήσει αδιάσειστα στοιχεία για το αντίθετο. Ορισμένα ψάρια και σαλαμάνδρες μπορούν να παράγουν ενδογενός χιτίνη[7]. Ωστόσο, οι ποσότητες που παράγονται είναι ελάχιστες και πολύ δύσκολο να απομονωθούν. Για το λόγο αυτό, τα σπονδυλωτά δεν θεωρούνται ως πηγή παραγωγής χιτίνης.

Εικόνα 9. Παραγωγή χιτίνης ενδογενώς στο zebrafish. Με πορτοκαλί χρώμα σημαίνεται η χιτίνη.

Δ.1.5 Αλλομορφές χιτίνης

Ανάλογα με την πηγή, η χιτίνη απαντάται σε δύο αλλομορφές την α και β, ενώ έχει αναφερθεί και μία τρίτη αλλομορφή, η γ-χιτίνη, αλλά με πιο εξεζητημένη ανάλυση φαίνεται ότι απλά πρόκειται για διαφοροποίηση της α αλλομορφής.

Η α-χιτίνη είναι με διαφορά η πιο άφθονη και βρίσκεται στον εξωσκελετό και τους τένοντες των καρκινοειδών, κυρίως στους αστακούς, στα καβούρια, στις γαρίδες και στο krill, στα κυτταρικά τοιχώματα μυκήτων και ζυμών, καθώς και στην επιδερμίδα των εντόμων. Ακόμα, απαντάται σε πληθώρα άλλων θαλάσσιων οργανισμών, όπως τα κωνικά σαλιγκάρια, το σκουλήκι βέλος (arrow worm), και το φύκι Phaeocystis. Οι εξωτικές τελευταίες τρείς α-χιτίνες παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον σε μελέτες κρυσταλλικής δομής, καθώς σε αντίθεση με τη χιτίνη των καρκινοειδών, παρουσιάζουν αξιοσημείωτα υψηλή κρυσταλλικότητα και καθαρότητα[6].

Εικόνα 7. Πηγές α-χιτίνης: α) αστακός, β) καβούρι, γ) γαρίδα, δ) krill, ε) κωνικό σαλιγκάρι,ζ) σκουλήκι βέλος και η) φύκι Phaeocystis.

Η σπανιότερη β-χιτίνη απαντάται, μαζί με πρωτεΐνες, στα καλαμάρια και στους σωλήνες που συντίθενται από τα θαλάσσια σκουλίκια Pogonophoran και Vestimentiferan.

Ακόμα, βρίσκεται στο σκουλήκι Chaetae, καθώς και σε προστατευτικές κατασκευές διαφόρων φυκών και πρωτοζώων. Μια ιδιαιτέρως καθαρή μορφή β-χιτίνης μπορεί να απομονωθεί από το διάτομο Thalassiosira fluviatilis.

Εικόνα 8. Πηγές β-χιτίνης: α) καλαμάρι, β) σκουλήκι Vestimentiferan, γ) σωλήνας κατασκευασμένος από σκουλήκια Vestimentiferan, δ) σκουλήκι Chaetae ε) διάτομο Thalassiosira

fluviatilis.

Δ.2. Παραγωγή θαλάσσιων χιτινολυτικών ενζύμων μέσω ανασυνδυασμού.

Η ετερογενής έκφραση των χιτινασών σε διαφορετικούς οργανισμούς επιτρέπει την παραγωγή τους σε μεγαλύτερη κλίμακα και επιπλέον αποτελεί μια πλατφόρμα για την βελτίωση της απόδοσης των ενζύμων μέσω της πρωτεϊνικής μηχανικής.

Ο Yang και οι συνεργάτες του, το 2016, κλωνοποίησαν ένα καινοφανή γονίδιο χιτινάσης (chi70) από ένα θερμόφιλο θαλάσσιο βακτήριο, Paenicibacillus barengoltzii CAU904, και το ενσωμάτωσαν λειτουργικά σε Escherichia coli. Ένα νέο ψυχοφιλικό βακτήριο γνωστό ως Pseudoalteromonas sp DL-6, απομονώθηκε από τους Wang et al (2014) από θαλάσσια ιζήματα και το γονίδιο που κωδικεύει το ένζυμο αποικοδόμησης της χιτίνης (CHIA) κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε επιτυχώς σε Ε. coli BL21. Το ένζυμο εμφάνισε τη μέγιστη καταλυτική δραστικότητα στους 20 °C και ρΗ 8.0. Ωστόσο, η δραστικότητα ήταν υψηλή μέχρι τους 4 °C.

Επιπρόσθετα, είναι ενδιαφέρον να αναφέρουμε ότι, ο Paulsen και οι συνεργάτες του (2016) κλωνοποιήσαν με επιτυχία και ενσωμάτωσαν αρκετές χιτινάσες από δύο θαλάσσια βακτήρια (Photobacterium galatheae και Pseudoalteromonas piscicida) σε Ε. coli. Τα ανασυνδυασμένα γονίδια chi περιείχαν την τυπική αλληλουχία του οδηγού πεπτιδίου των χιτινολυτικών ενζύμων. Ωστόσο, η παρουσία του πεπτιδίου αυτού δεν εγγυάται την έκκριση της πρωτεΐνης, και μόνο δύο από τις χιτινάσες εκκρίθηκαν και σε σχετικά μικρή ποσότητα.

Μια καλή στρατηγική για την επίτευξη μεγαλύτερης ποσότητας ενζύμου θα ήταν η κλωνοποίηση σε έναν οργανισμό όπως ο Pichia pastoris, ένας μύκητας που επιτρέπει υψηλότερες πυκνότητες κυττάρων. Αυτό έγινε με μία μυκητιακή χιτινάση (όχι θαλάσσιας προέλευσης) με τελική ποσότητα χιτινάσης 3 g /L.

Δ.3 Αναστολείς των χιτινασών

Τα θαλάσσια φυσικά προϊόντα έχουν προσελκύσει την προσοχή πολλών βιολόγων και χημικών ανά τον κόσμο. Αυτές οι βιοενεργές θαλάσσιες ενώσεις παράγονται από ένα ευρύ φάσμα θαλάσσιων οργανισμών όπως βακτήρια, μύκητες, σπόγγοι και φύκη. Μερικές από αυτές τις ενώσεις έχουν παρουσιάσει ανασταλτική δράση στις χιτινάσες, στις οποίες

συμπεριλαμβάνονται ψαμαπλίνη, αλοσαμιδίνη, αργαδίνη, αργιφίνη, στιλογουανιδίνη και το cyclo-L-Arg-D-Pro (Cl-4). Η αλκαλοειδής ψαμαπλίνη Α παράγεται από μια ποικιλία θαλάσσιων σφουγγάριων και παρουσιάζει ανασταλτική δραστικότητα στη χιτινάση (Folmer et al., 2009). Η αλοσαμιδίνη έχει χρησιμοποιηθεί για να εξεταστεί ο φυσιολογικός ρόλος των χιτινασών που εμπλέκονται σε μια ποικιλία οργανισμών. Η αργαδίνη και αργιφίνη, δύο κυκλικά πενταπεπτίδια, έχουν ερευνηθεί για την ικανότητά τους να είναι νανομοριακοί αναστολείς της οικογένειας 18 των χιτινασών. Η στιλογουανιδίνη εμφανίζει ανασταλτική δράση έναντι μιας βακτηριακής χιτινάσης και έχει αποδειχθεί ότι παρεμποδίζει την διαδικασία αλλαγής εξωσκελετού στα Θυσανοειδή (Hirose et al., 2009,Kato et al., 1995). Το Cl-4 απομονώθηκε από θαλάσσιο βακτήριο και παρουσίασε μέτρια αναστολή χιτινάσης (Hirose et al.,2010). Επειδή αυτές οι ενώσεις έχουν πολύτιμες ιδιότητες ως αντιμυκητιακά και αντικαρκινικά, αναμένεται να έχουν χρήσιμες εφαρμογές στην ιατρική και τη γεωργία.

Ε. Βελτίωση του βιοκαταλύτη

Ε.1 Πρωτεϊνική Mηχανική

Με την έλευση της μοριακής γενετικής και των τεχνικών για τον χειρισμό των γονιδίων έχει δοθεί πλέον η δυνατότητα της γενετικής εκμετάλλευσης οργανισμών. Έτσι, είναι δυνατόν να σχεδιαστούν γονίδια τα οποία θα παράγουν, σε οργανισμούς-ξενιστές, καινούρια γονιδιακά προϊόντα. Επίσης, είναι δυνατό με τη χρήση της πρωτεϊνικής μηχανικής και του πρωτεϊνικού σχεδιασμού να δημιουργηθούν, ύστερα από μελέτες σε ακραιόφιλους για 52 παράδειγμα οργανισμούς, πρωτεΐνες με συγκεκριμένα δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά. Σήμερα, ένας από τους στόχους της πρωτεϊνικής μηχανικής είναι η βελτίωση συγκεκριμένων ιδιοτήτων ενζύμων που χρησιμοποιούνται διαδεδομένα στη βιοτεχνολογία, όπως είναι η σταθερότητα και η θερμοσταθερότητα, η καταλυτική δραστικότητα και η εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα.

Προκειμένου να ερευνηθεί ο ρόλος ορισμένων αμινοξέων στον καταλυτικό μηχανισμό του ενζύμου ή τις ιδιότητες πρόσδεσής πραγματοποιήθηκε τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση σε θαλάσσιες χιτινάσες. Ωστόσο, μερικά από τα αποτελέσματα δείχνουν ένζυμα με αυξημένες καταλυτικές ιδιότητες ή μεταβαλλόμενη εκλεκτικότητα, γεγονός που υποδηλώνει ότι υπάρχει κάποια δυνατότητα για βελτίωση του βιοκαταλύτη. Επιπλέον, εκτός του θαλάσσιου περιβάλλοντος, ορισμένοι συγγραφείς πραγματοποίησαν γενετικές τροποποιήσεις με στόχο την ενίσχυση της απόδοσης του ενζύμου. Για παράδειγμα, οι Yu και Xu (2012) εφάρμοσαν την κατευθυνόμενη εξέλιξη στη χιτινάση από το Trichoderma viride και βρήκαν έναν κλώνο (Y185 / S226) με αυξημένη καταλυτική δραστικότητα και ειδικότητα, ευρύτερο ρΗ και σταθερότητα θερμοκρασίας. Αυτό αποδεικνύει ότι η κατευθυνόμενη εξέλιξη θα μπορούσε να εφαρμοστεί στα θαλάσσια χιτινολυτικά ένζυμα για να ενισχύσει μερικές από τις ιδιότητές τους.

Ε.2 Ακινητοποίηση Ενζύμου

Η ακινητοποίηση των ενζύμων γίνεται για τέσσερις βασικούς λόγους: α)Διευκολύνει την ανακύκλωση του ενζύμου χωρίς την ανάγκη διαχωρισμού από το διάλυμα της αντίδρασης, β) χρησιμεύει στον βιοχημικό σαν πρότυπο για ένζυμα που στην φυσική τους μορφή βρίσκονται προσκολλημένα σε μεμβράνες, γ) σε ορισμένες περιπτώσεις η ευστάθεια

και η ενεργότητα του ενζύμου επαυξάνονται με την ακινητοποίηση και δ) με την ακινητοποίηση του ενζύμου διευκολύνεται και ο διαχωρισμός του προϊόντος.

Όπως θα συζητηθεί παρακάτω, μια εφαρμογή των χιτινολυτικών ενζύμων είναι η παραγωγή διαλυτών, βιοενεργών, μικρών ολιγοσακχαριτών από χιτίνη. Υπό αυτό το πρίσμα, η ακινητοποίηση των ενζύμων αποτελεί βασική στρατηγική για την προώθηση της εφαρμογής των ενζύμων αυτών σε βιομηχανικό επίπεδο. Η ακινητοποίηση επιτρέπει την εύκολη ανάκτηση του βιοκαταλύτη από τον βιοαντιδραστήρα, διευκολύνοντας την επαναχρησιμοποίησή του σε διαδοχικές αντιδράσεις και, τελικά, μείωση του συνολικού κόστους της διαδικασίας. Επιπλέον, η ακινητοποίηση αυξάνει την σταθερότητα του ενζύμου όσον αφορά το ρΗ, τη θερμοκρασία και/ή τους οργανικούς διαλύτες. Από την άλλη πλευρά, η ακινητοποίηση μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της σταθερότητας ή σε αλλαγή στην εξειδίκευση ή στην επιλεκτικότητα του ενζύμου.

Υπάρχουν ελάχιστα παραδείγματα στη βιβλιογραφία σχετικά με την ακινητοποίηση των θαλάσσιων χιτινολυτικών ενζύμων: ομοιοπολική ακινητοποίηση σε σφαιρίδια χιτοζάνης και ομοιοπολική ακινητοποίηση σε σφαιρίδια άγαρ. Ωστόσο, η καλύτερη στρατηγική για την ακινητοποίηση αυτών των ενζύμων είναι η ακινητοποίηση επί της επιφάνειας στερεών υποστρωμάτων λόγω του υψηλού μοριακού βάρους του υποστρώματος. Επιπλέον, λαμβάνοντας υπόψη την παρουσία ενός τομέα δέσμευσης χιτινών με υψηλή συγγένεια για το υπόστρωμά τους, η ομοιοπολική ακινητοποίηση θα ήταν πιο βολική για να αποφευχθεί η διαρροή του ενζύμου από την υποστήριξη.

Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι οι στρατηγικές ακινητοποίησης μπορούν επίσης να εφαρμοστούν σε θαλάσσιους μικροοργανισμούς για τη βελτιστοποίηση τηςπαραγωγής χιτινολυτικού ενζύμου.

ΣΤ. Εφαρμογές των χιτινολυτικών ενζύμων

ΣΤ.1 Εφαρμογή στην ιατρική

Ως βοηθητικά μέσα, έχουμε την χιτίνη και τους χιτοολιγοσακχαρίτες οι οποίοι παρουσιάζουν υπολιπιδαιμική δραστικότητα με μείωση των επιπέδων λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LDL) -χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων στο πλάσμα του αίματος και αντιϋπερτασική δράση από αναστολέα του ενζύμου μετατροπής της αγγειοτενσίνης Ι (ACE). Επιπλέον, τόσο η χιτίνη όσο και τα παράγωγά της έχουν ικανότητα επουλώσεως των πληγών αυξάνοντας την παραγωγή μακροφάγων και στη συνέχεια απελευθερώνοντας κυτοκίνες. Επιπρόσθετα, η χιτινάση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αντιμυκητιακός παράγοντας σε συνδυασμό με αντιμυκητιακά φάρμακα κατά μυκητικών λοιμώξεων. Η χιτινάση και τα παράγωγά της έχουν επίσης επιδείξει αντιμικροβιακή δραστικότητα έναντι ιικών και μυκητιακών λοιμώξεων. Τα παράγωγα της χιτίνης έχουν άλλες εφαρμογές που περιλαμβάνουν μείωση της επίδρασης στα επίπεδα γλυκόζης στον ορό των διαβητικών, ως αντιφλεγμονώδες φάρμακο σε ασθενείς με άσθμα και να αυξήσουν την αντοχή των οστών αυξάνοντας τη διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων σε οστεοβλάστες. Κατά συνέπεια, διευκολύνει τη διαμόρφωση του ιστού και την παρεμπόδιση της μορφοποίησης αδιάλυτων αλάτων φωσφορικού ασβεστίου, αυξάνοντας τη βιοδιαθεσιμότητα του Ca2 +. Λόγω της θεραπευτικής εφαρμογής των χιτινολυτικών ενζύμων, μπορούν να θεωρηθούν κατάλληλοι υποψήφιοι φαρμάκων στις ιατρικές και φαρμακευτικές επιστήμες.

ΣΤ.2 Εφαρμογή στο φαγητό

Σήμερα, η χρήση των ενζύμων σε υποκατάστατα της βιομηχανίας τροφίμων επεκτείνεται, και οι χιτινάσες μπορούν να προκαλέσουν πιθανές εφαρμογές στον τομέα αυτό. Τα παράγωγα της χιτίνης εξαιτίας της αντιμικροβιακής δράσης τους, αναστέλλουν την ανάπτυξη των σπόρων στα τρόφιμα, κατά συνέπεια, εμποδίζοντας τις αλλοιώσεις των τροφίμων.

ΣΤ.3 Εφαρμογή στη γεωργία

Οι χιτινάσες είναι ενδιαφέροντα ένζυμα στη γεωργία. Το πιο αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό είναι η μετατροπή των χιτινικών αποβλήτων σε βιολογικά λιπάσματα. Η μόλυνση της γεωργικής γης από μυκητιακά παθογόνα και παρασίτων μπορει να μπορει αποτραπεί με τη χρήση βιολογικών φυτοφαρμάκων μεγάλης κλίμακας, τα οποία όμως απαιτούν μεγάλο κόστος. Ακόμα, ο βιολογικός έλεγχος είναι ένας καλός τρόπος για την αντιστάθμιση τέτοιων προβλημάτων. Οι χιτινάσες μπορούν να χρησιμοποιηθούν απευθείας ως αντιμυκητιακοί, εντομοκτόνοι ή αντιπαρασιτικοί παράγοντες έναντι ποικίλων λοιμώξεων όπως μυκητιακών παθογόνων, ιικών μολύνσεων και παρασιτικών εντόμων. Επομένως, αυτά τα ένζυμα μπορούν να θεωρηθούν κατάλληλα για την ανάπτυξη της ανθεκτικότητας των φυτών σε μυκητιακά παθογόνα. Τέλος, η ρύπανση των υδάτων μπορεί να μειωθεί χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένες χιτινάσες, λαμβάνοντας απολυμερισμένα συστατικά από τα χιτινώδη απόβλητα.

Ζ. Συμπεράσματα

Οι θαλάσσιοι οργανισμοί εμφανίστηκαν πρόσφατα ως νέα πηγή για την απομόνωση βιομηχανικών ενζύμων και για την παραγωγή ποικίλων νέων χρήσιμων ουσιών. Το θαλάσσιο περιβάλλον είναι πολύ ετερογενές, πράγμα που σημαίνει ότι θα μπορούσαμε να βρούμε μικροοργανισμούς προσαρμοσμένους σε διαφορετικές ακραίες συνθήκες (αλλόφυλα, ψυχρόφυλα, κλπ. ) οι οποίοι θα μπορούσαν να είναι πολύ χρήσιμοι σε πολλούς τομείς. Από την άποψη αυτή, τα θαλάσσια χιτινολυτικά ένζυμα αναμένεται να λειτουργούν σε ένα ευρύ φάσμα λειτουργικών συνθηκών.Η παρούσα μίνι-ανασκόπηση έχει στόχο στην ανάδειξη των θαλάσσιων δυνατοτήτων των χιτινολυτικών ενζύμων ως βιομηχανικών βιοκαταλυτών, δίνοντας έμφαση σε ορισμένα κρίσιμα βήματα σε βιομηχανικό επίπεδο, όπως η παραγωγή, η απομόνωση, οι συνθήκες λειτουργίας και η ακινητοποίηση.Λαμβάνοντας υπόψη όλους τους προαναφερθέντες παράγοντες, οι φαρμακευτικές, καλλυντικές, βιοϊατρικές βιομηχανίες και οι βιομηχανίες τροφίμων έχουν καταβάλει πολλές προσπάθειες για την εξεύρεση νέων θαλάσσιων χιτινολυτικών ενζύμων.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[1] Azadeh Beygmoradi, Ahmad Homaei, Roohullah Hemmati, Paloma Santos-Moriano, Daniel Hormigo and Jesús Fernández-Lucas Marine chitinolytic enzymes, a biotechnological treasure hidden in the ocean? 2018

[2] M. N. V. Ravi Kumar, R. A. A. Muzzarelli, C. Muzzarelli, H. Sashiwa, and A. J. DombChitosan Chemistry and Pharmaceutical Perspectives Chemical Reviews 2004, 104, 6017-6084

[3] Thanh-Sang, Dai-Hung Ngo, Kyong-Hwa Kang, Won-Kyo Jung and Se-Kwon Kim The beneficial properties of marine polysaccharides in alleviation of allergic responses, 2014, 59, 129-138

[4] Yu Zhou, Xuehong Chen, Xiao Li, Yantao Han, Yanan Wang, Ruyong Yao and Shangyong Li Purification and Characterization of A New Cold-Adapted and Thermo-Tolerant Chitosanase from Marine Bacterium Pseudoalteromonas sp. SY39, 2019

[5] Henrissat B. and Bairoch A., New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J, 1993, 293(Pt3), 781-8.

[6] Rinaudo M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Progress in Polymer Science 2006, 31, 603-632.

[7] W. Joyce Tang, Javier Fernandez, Joel J. Sohn and Chris T. Amemiya Chitin is endogenously produced in vertebrates, 2016

Εικόνα εξωφύλλου: http :// www . ecoscope . com / krill / index . htm