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Aplicación de la Microbiología Predictiva en la determinación de la vida útil de los alimentos Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. Profesor E-Mail: [email protected] [email protected] Departamento de Microbiología Facultad de Ciencias Básicas Universidad de Pamplona Campus Universitario, Km. 1, Vía Bucaramanga Pamplona, Colombia Telefax: 57-75685303 ext. 227 1. Introducción La preservación de los alimentos a través de los años ha sido necesaria para nuestra supervivencia. Las técnicas de preservación utilizadas en el pasado (salazón, secado, ahumado, calentamiento entendido como cocción, conservación a bajas temperaturas y la fermentación) siguen siendo empleadas en conjunto con otros métodos en la actualidad, apoyados en el conocimiento que diferentes disciplinas científicas han aportado al desarrollo en este campo (Gram et al., 2002). Actualmente y debido a la cada vez creciente exigencia de los consumidores por alimentos lo mas naturalmente posible, ha hecho que la industria agroalimentaria busque alternativas de tratamiento de alimentos conservando la seguridad y la calidad de los mismos. Tradicionalmente se han empleado métodos físicos de proceso como las tecnologías térmicas (pasteurización, esterilización, tindalización, refrigeración, congelación, etc.) y más recientemente el empleo de atmósferas controladas y/o modificadas; entre los métodos químicos destacan la acidificación, salazón y conservación en almíbar, mientras que la conservación biológica se ha encaminado hacia los procesos de fermentación. Sin embargo, nuevas formas de tratamiento y conservación de alimentos han ido apareciendo pudiendo distinguir dos tipos fundamentales: Nuevas tecnologías térmicas (Calentamiento con radiofrecuencias, procesado con microondas, calentamiento infra-rojo, infusión instantánea y de calor elevado, calentamiento óhmico) y Tecnologías no térmicas (Alta presión hidrostática, Campos eléctricos pulsados de alta intensidad, Campos magnéticos oscilatorios, pulsos lumínicos intensos, irradiación, preservación química y bioquímica, etc.) que aún continúan siendo foco de investigación. Por otra parte, el objetivo que persiguen todos estos métodos es el de rendir un producto nutricionalmente bueno, con un alto nivel de inocuidad y que su vida útil sea prolongada.

VU y Microbiología Predictiva

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VU y Microbiología Predictiva

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Aplicación de la Microbiología Predictiva en la determinación de la vida útil de los alimentos

Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D. Profesor E-Mail: [email protected] [email protected] Departamento de Microbiología Facultad de Ciencias Básicas Universidad de Pamplona Campus Universitario, Km. 1, Vía Bucaramanga Pamplona, Colombia Telefax: 57-75685303 ext. 227

1. Introducción La preservación de los alimentos a través de los años ha sido necesaria para nuestra

supervivencia. Las técnicas de preservación utilizadas en el pasado (salazón, secado, ahumado, calentamiento entendido como cocción, conservación a bajas temperaturas y la fermentación) siguen siendo empleadas en conjunto con otros métodos en la actualidad, apoyados en el conocimiento que diferentes disciplinas científicas han aportado al desarrollo en este campo (Gram et al., 2002). Actualmente y debido a la cada vez creciente exigencia de los consumidores por alimentos lo mas naturalmente posible, ha hecho que la industria agroalimentaria busque alternativas de tratamiento de alimentos conservando la seguridad y la calidad de los mismos. Tradicionalmente se han empleado métodos físicos de proceso como las tecnologías térmicas (pasteurización, esterilización, tindalización, refrigeración, congelación, etc.) y más recientemente el empleo de atmósferas controladas y/o modificadas; entre los métodos químicos destacan la acidificación, salazón y conservación en almíbar, mientras que la conservación biológica se ha encaminado hacia los procesos de fermentación. Sin embargo, nuevas formas de tratamiento y conservación de alimentos han ido apareciendo pudiendo distinguir dos tipos fundamentales: Nuevas tecnologías térmicas (Calentamiento con radiofrecuencias, procesado con microondas, calentamiento infra-rojo, infusión instantánea y de calor elevado, calentamiento óhmico) y Tecnologías no térmicas (Alta presión hidrostática, Campos eléctricos pulsados de alta intensidad, Campos magnéticos oscilatorios, pulsos lumínicos intensos, irradiación, preservación química y bioquímica, etc.) que aún continúan siendo foco de investigación.

Por otra parte, el objetivo que persiguen todos estos métodos es el de rendir un producto nutricionalmente bueno, con un alto nivel de inocuidad y que su vida útil sea prolongada.

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2. ¿Qué es la Vida Útil de un alimento? La vida útil o caducidad de un alimento puede definirse como “el periodo de tiempo,

después de la elaboración y/o envasado y bajo determinadas condiciones de almacenamiento, en el que el alimento sigue siendo seguro y apropiado para su consumo” (Labuza, 1994; Man, 2004), es decir, que durante ese tiempo debe conservar tanto sus características físico-químicas, microbiológicas y sensoriales, así como sus características nutricionales y funcionales. En palabras de Dominic (2004), todos los alimentos poseen una caducidad microbiológica, una caducidad química y/o físico-química y una caducidad sensorial; la cual depende de las condiciones de formulación, procesamiento, empacado, almacenamiento y manipulación.

Según el Codex Alimentarius (1998) los alimentos perecederos son aquellos de tipo o condición tales que pueden deteriorarse, entendiéndose aquellos como los alimentos compuestos total o parcialmente de leche, productos lácteos, huevos, carne, aves de corral, pescado o mariscos, o de ingredientes que permitan el crecimiento progresivo de microorganismos que puedan ocasionar envenenamiento u otras enfermedades transmitidas por alimentos; así aquellos alimentos que son considerados como perecederos generalmente poseen una vida útil de 7 días, y esta vida útil está limitada en la mayoría de los casos por el decaimiento bioquímico o microbiológico (Labuza, 1994), mientras que los alimentos semi- perecederos (conservas en general) la vida útil está limitada principalmente al deterioro fisicoquímico y/o sensorial antes que el microbiológico (McDonald y Sun, 1999; McMeekin y Ross, 2002).

El hecho que los alimentos son sistemas diversos, complejos y activos en que las reacciones microbiológicas, enzimáticas y físico-químicas están interactuando de forma simultánea, hace una tarea ardua el estudio de su vida útil. La preservación de los alimentos es dependiente de la combinación de múltiples factores y un sin fin de reacciones bio-físico-químicas, y si entendemos estas reacciones y sus mecanismos respectivos sería bastante exitosa la limitación de aquellos factores que tienen mayor influencia o responsables en la alteración o pérdidas de las características deseables en los alimentos, y a veces encauzar otras reacciones hacia cambios beneficiosos.

Esencialmente, la vida útil de un alimento depende de cuatro factores principales a saber: la formulación, procesado, empaque y condiciones del almacenamiento. Sin embargo, si las condiciones posteriores de manipulación no son las correctas, entonces la vida útil de los mismos puede limitarse a un periodo menor que del cual haya sido establecido. Todos los cuatro factores son críticos pero su importancia relativa depende de cuan perecedero es el alimento. Generalmente, un alimento perecedero (almacenado en condiciones apropiadas) tiene una vida

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útil media de 14 días siendo limitado en la mayoría de los casos por el decaimiento bioquímico (enzimático/senescencia) o el decaimiento microbiano. Con las nuevas tecnologías de empaque en atmósfera modificada/controlada (CAP/MAP) en condiciones asépticas, tales alimentos pueden durar hasta 90 días (3 meses). Un alimento semi-perecedero tiene una vida útil media de alrededor de 6 meses, tales como algunos quesos, mientras que los alimentos no perecederos tienen una vida útil superior a 6 meses y con una duración de hasta 3 años cuando son mantenidas bajo condiciones apropiadas de almacenamiento (p.ej., la mayoría de las conservas).

3. Métodos para prolongar la vida útil Desde antaño han sido diferentes los métodos que se han empleado para prolongar la

vida útil de los alimentos desde aquellos tales como la conservación en frío y/o la fermentación y que, con el paso del tiempo se han ido perfeccionando al tiempo que han emergido otros. Se sabe que en la antigüedad ya los romanos empleaban las bajas temperaturas “Congelación” para prolongar la vida útil de sus alimentos mediante la conservación en vasijas que eran o bien recubiertas en hielo o directamente vertido en el interior de las mismas con el alimento incluido. Ya hacia finales de 1850, Louis Pasteur demuestra que la contaminación de los vinos era asociada al desarrollo de cepas no aptas para su producción y mediante el tratamiento térmico del zumo de uvas a 62ºC por 30 minutos, para luego permitir que se llevara a cabo una fermentación natural y obteniendo así un vino con mejor calidad, luego si se inoculaba en condiciones asépticas el mosto (zumo de uvas) tratado térmicamente con un estárter proveniente de aquel vino “bueno”, se obtendría un nuevo vino de las mismas calidades. Bueno, esto en la teoría porque hoy día sabemos que la calidad del vino está ligado no solo a la cepa de levadura, sino al tipo de uva y algunas de sus propiedades como el grado o concentración de azúcar, actividad de agua, etc.

Así las cosas, desde el punto de vista del procesado de los alimentos, podemos encontrar diversos métodos que permiten obtener un producto final con unas cualidades nutricionales y de seguridad. Tradicionalmente se han distinguido dos tipos de procesamiento de alimentos: aquellos que involucran tecnologías térmicas y los que involucran tecnologías no térmicas (métodos más modernos para el procesamiento de alimentos o tecnologías emergentes), acompañados en todos los casos del empacado que buscan favorecer la calidad de los alimentos preservando su vida útil.

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4. Métodos para la estimación de la vida útil La estimación de la vida útil de un alimento es un requisito fundamental, y esta debe

figurar, salvo ciertas excepciones, en la etiqueta de los mismos. Es variada la metodología empleada para estimar la vida útil, algunos de estos métodos pueden parecer un tanto ortodoxos pero de acuerdo con Labuza (1994) suelen ser válidos. Algunos de estos métodos serán expuestos de forma breve, mientras nos centraremos en los métodos de determinación de la vida útil a tiempo real y determinación rápida de la caducidad “Test de vida útil acelerado” (Acelerated Shelf Life Determinaton, ASLD) por ser los más empleados (Labuza, 1994; Man, 2004).

4.1. Empleo de valores de referencia La vida útil de un nuevo producto puede estimarse basándose en los datos publicados

en diferentes bases de datos tales como las del ejército de los EE.UU. o por Labuza en: Shelf-life dating of foods (1982), pero el problema en este caso es que estos datos son muy limitados, por lo que no tienen información adicional salvo para productos similares, además, la mayoría de estos datos tienen derecho de autor y no pueden ser usados para la predicción de la vida útil, salvo dentro de la misma empresa para líneas similares sin necesidad de realizar pruebas experimentales.

4.2. Estimación mediante asignación de “Turn Over” Una segunda aproximación para estimar la vida útil es el uso de tiempos de distribución

conocidos para productos similares, mediante el análisis de la información de las etiquetas de los mismos. En este caso tampoco se requiere de comprobación previa si se está seguro de tomar este riesgo. Si se está empezando a desarrollar un nuevo producto, puede necesitarse en este caso datos para determinar el tiempo de almacenamiento en condiciones caseras reales para conseguir una buena estimación de la vida útil. Si no existe ningún producto similar en el mercado, este método no puede usarse.

4.3. Pruebas de abuso de distribuciones Este método de pruebas de abuso de distribuciones puede emplearse en el caso de

estar seguros de la vida útil de un producto o si este ya se encuentra en el mercado. En este caso, el producto es recogido del punto de venta y se mantiene en el laboratorio simulando las condiciones caseras. Este método ha sido usado por varios investigadores, sobre todo en aquellos casos cuando algunos estados o países cambian la legislación, pero a pesar de esto, no ha sido ampliamente reportado encontrándose según Labuza (1994), un solo estudio en la literatura reportado por Gacula y Kubala, en 1975. Este método reproduce la vida útil basado en la distribución y condiciones de almacenamiento caseras.

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4.4. Empleo de quejas o reclamos de los compradores Otro acercamiento para evaluar la vida útil que no requiere ningún estudio inicial es usar

las quejas o reclamos de los consumidores como una base para determinar cuál es el problema que está ocurriendo. En los EE.UU. la mayoría de las empresas manejan un número telefónico gratuito de atención al consumidor en los empaques, y la información recogida a través de este, se carga a una base de datos sistematizada que incluye el tipo de queja, localización, etc. A partir de estos datos, el departamento de I&D puede obtener una idea sobre el problema que está ocurriendo y el modo en que se presenta. Normalmente se acepta que por cada queja o reclamo reportado, entre 50–60 casos no son reportados. Estos clientes representan una proyección de tres años de pérdida de volumen de venta. A partir de estos datos, pueden calcularse los costos en ingredientes, proceso, empacado o si los cambios de la distribución serían económicamente factibles para mejorar la vida útil. Este acercamiento global puede usarse en conjunto con cualquiera de los tres métodos descritos anteriormente.

4.5. Pruebas de vida útil a tiempo real Este tipo de pruebas evalúa el efecto de la temperatura “normal” de conservación sobre

las propiedades microbiológicas, físico-químicas y sensoriales de un alimento durante un periodo de tiempo, entendiéndose como temperatura normal aquella que será empleada durante la conservación comercial del producto, p.ej., en la evaluación de la vida útil de un yogurt se emplearía una temperatura de 4ºC, la cual es la temperatura a la que se conservará el producto comercialmente.

Para la determinación de la vida útil de un alimento deberán considerarse las variables microbiológicas, físico-químicas y sensoriales que mayor influencia tendrán sobre la calidad del producto.

En torno a la evaluación microbiológica se ha planteado toda una discusión sobre qué grupo de microorganismos deberían considerarse para la determinación de la vida útil, por un lado encontramos el empleo de los recuentos viables totales (aerobios o anaerobios mesófilos, psicrótrofos o psicrófilos) ya que este grupo se considera en microbiología de alimentos como un indicador del nivel de contaminación de un producto, sin embargo surge el planteamiento de la diversidad de especies que podrían en un momento puntual integrar este grupo y de cómo podrían cambiar de lote a lote, de un periodo de tiempo a otro, o dentro de un mismo proceso. Entonces, ¿es seguro emplear este grupo como indicador de vida útil?......... Si se emplea este recuento podríamos establecer que el valor máximo permitido oscilaría en torno a 106 ufc/ g o mL, es decir, que la vida útil microbiológica caducaría en cuanto se alcance este nivel de crecimiento en el producto final.

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Desde mi punto de vista particular resulta más conveniente establecer la vida útil microbiológica de un alimento cuantificando el crecimiento de microorganismos alterantes, y dentro de este grupo establecer cuál de las especies es la que mayor incidencia va a tener sobre la calidad final del producto. Por ejemplo, volvemos al caso del yogurt, en este producto la vida útil podría evaluarse empleando el recuento de bacterias ácido-lácticas (BAL). De todas formas tampoco resultaría lógico emplear el recuento total de viables si sabemos que este producto ha sido preparado empleando un cultivo iniciador o estárter.

4.6. Pruebas de aceleración de la vida útil (ASLT) Las pruebas de aceleración de la vida útil es quizá la metodología más empleada hoy

día para calcular la vida útil de un alimento no perecedero o estable (alimentos esterilizados como por ejemplo los enlatados). En esta técnica, se pretende estudiar varias combinaciones de producto/empaque acabados bajo diferentes condiciones de abuso de temperatura, examinando el producto periódicamente hasta el fin de la vida útil; los resultados obtenidos se usan para proyectar la vida útil del producto bajo las verdaderas condiciones de almacenamiento. Algunas empresas manejan base de datos de multiplicación microbiana obtenidos del trabajo y la experiencia previa, los cuales emplean para obtener la vida útil real a partir de los resultados encontrados en estas condiciones de abuso de temperatura. Esta técnica se basa en la aplicación de la cinética de la velocidad de Arrhenius, el cual establece que la velocidad de las reacciones químicas se duplica aproximadamente por cada 10ºC de aumento de la temperatura. Sin embargo, antes de establecer una sentencia final sobre la validez o exactitud de predicción para una aplicación particular, es necesario examinar una serie general de factores que influyen sobre la vida útil del producto. Estos incluyen (1) propiedades estructurales / mecánicas de los alimentos, (2) propiedades extrínsecas tales como la temperatura, Humedad relativa, atmósfera gaseosa, etc., (3) características intrínsecas como el pH, aw, disponibilidad de nutrientes, potencial redox (Eh), presencia de antimicrobianos, etc., (4) la interacciones microbianas y (5) factores relativos al proceso de elaboración, mantenimiento y manipulación final.

Este método no está exento de problemas. Debe tenerse cautela en la interpretación de los resultados obtenidos y su extrapolación a otras condiciones. Por ejemplo cuando se prueba una relación producto/empaque, este empaque también tiene influencia sobre la vida útil y por tanto si se modifica el empaque con permeabilidades diferentes al oxígeno, agua, anhídrido carbónico durante el almacenamiento verdadero (almacenamiento comercial), la vida útil del producto se tornara desconocida; y los resultados anteriores no pueden ser aplicables. Si las condiciones de ASLT son escogidas de forma apropiada, y se usan los algoritmos adecuados para la extrapolación, entonces la vida útil bajo cualquier distribución conocida puede ser

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predecible. Estas predicciones son basadas en los principios fundamentales de pérdida de calidad del alimento que se han descrito antes.

5. Estimación de la vida útil microbiológica: uso de herramientas predictivas.

Como ha sido comentado en muchas revisiones, la microbiología predictiva de alimentos se constituye hoy por hoy en una herramienta valiosa para el sector agroindustrial, ya que permite obtener resultados en menor tiempo minimizando el uso de materiales de laboratorio, mano de obra, y reduciendo por tanto costos económico. Sin embargo, la microbiología tradicional aún sirve de apoyo a la microbiología predictiva.

El modelamiento predictivo que integra el comportamiento microbiano con otras variables del proceso ha empezado a ganar interés en la industria agroalimentaria para predecir la vida útil (Banks, 1994). Sin embargo, la determinación de la vida útil es un tema complejo como es difícil predecir los efectos de las variables de almacenamiento y las condiciones de abuso que un producto puede experimentar (Williams, 1992).

La gran variedad y número de microorganismos alterantes encontrados en los productos alimenticios significa que los modelos de predicción de alteración son menos fáciles de desarrollar que los modelos de microorganismos patógenos y su aplicación es mucho más limitada (Pin y Baranyi, 1998). Al igual que ocurre con el análisis de riesgos y el HACCP, la predicción de la vida útil debe considerar todas las etapas en la producción de un alimento. Deben obtenerse datos exactos acerca de las materias primas utilizadas, la formulación de productos, montaje de productos, técnicas de procesamiento, condiciones de higiene, tipo de empacado empleado, almacenamiento y procesos de distribución y el manejo final del consumidor. Sólo cuando todas estas áreas están representadas puede hacerse posible una predicción fiable de la vida útil (Dalgaard, 1995; McMeekin y Ross, 1996b).

El realizar un estudio de vida útil puede implicar una amplia utilización tanto de recursos tecnológicos como financieros. Sin embargo, el desarrollo de modelos de predicción podrían en un plazo prudencial reducir el uso de estos recursos y mejorar el tiempo de utilización (Neumeyer y col., 1997a). Los estudios se han llevado a cabo sobre una gran variedad de alimentos para determinar la vida útil (por ejemplo en productos cárnicos: Vankerschaver y col., 1996; Kant-Muermans y col., 1997; Neumeyer y col., 1997a, b; Devlieghere y col., 1999). Sin embargo, estos estudios no han utilizado un modelo capaz de incorporar todas las variables que puedan tener un impacto sobre el crecimiento microbiano. Los principales factores que influyen en la estabilidad

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microbiana en los alimentos son la temperatura, pH y actividad de agua. La temperatura en particular puede variar significativamente a través de la producción y distribución (Geeraerd y col., 1998).

La mayoría de los estudios han utilizado modelos dependientes de la temperatura, tales como el modelo de la raíz cuadrada (Ratwkosky y col., 1983) o el modelo de Arhenius, y si bien es cierto que con la mayoría de los alimentos la temperatura es el principal factor que afecta la vida útil, no es la única variable (Einarsson y Ericksson, 1986; Gill y col., 1988; Gill y Jones, 1992a; Einarsson, 1994). La mayoría de los modelos dinámicos propuestos (Van Impe y col., 1992, 1995; Baranyi y col., 1993a, 1996b) es necesario el empleo de más de una variable fluctuante para predecir con precisión la vida útil de los productos alimenticios. Los métodos prácticos utilizados en la elaboración de modelos predictivos de vida útil necesitan avanzar más (McDonald y Sun, 1999). Los métodos estándares de análisis microbiológicos aunque son eficaces aún son lentos. Las investigaciones futuras deberían tener en cuenta el corto período de vida de gran parte de alimentos refrigerados y el hecho de que los resultados son necesarios rápidamente (Gibbs y Williams, 1990). El uso de técnicas microbiológicas más rápidas que las actuales será necesario en el futuro.

Vamos a explicar dos métodos clásicos para la determinación de la vida útil de alimentos, un primer modelo desarrollado por Monod-Hinshelwood para la estimación de la caducidad microbiológica y en segundo lugar, el modelo de Arrhenius empleado fundamentalmente en la estimación de la caducidad físico-química, aunque puede emplearse en la estimación microbiológica como veremos en el ejercicio descrito en el numeral 6.

De todas formas cabe recordar que los modelos de predicción microbiológica son en muchos casos generales y variados y por tanto pueden extrapolarse para la estimación microbiológica de la vida útil de diversos alimentos (p.ej. entre los más conocidos tenemos la función logística, el modelo modificado de Gompertz, el modelo de Baranyi, los modelos tipo Belehradek -raíz cuadrada-, los modelos polinomiales y de respuesta superficial, modelos tipo Arrhenius, etc.).

El modelo de Monod-Hinshelwood (descrito por McMeekin y Ross, 2002) Esta aproximación puede ser usada para el cálculo de la vida útil microbiológica. En

palabras de McMeekin y Ross (2002) “la experiencia ha mostrado que para la mayoría de los casos donde están implicadas asociaciones de microorganismos alterantes, el tiempo en el cual ocurre o se desarrolla la alteración de los alimentos está directamente relacionada con el tiempo de generación de aquel microorganismo que juega el papel predominante en dicha asociación”.

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Esto es, que si conocemos la microbiota alterante predominante en los alimentos perecederos y sabemos cómo cambia su población en el tiempo (si asumimos que la ocurrencia de alteraciones específicas se da después de la fase de latencia), puede establecerse la vida útil del mismo mediante la siguiente relación (aproximación de Monod-Hinshelwood):

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Donde ts es el tiempo necesario para que se desarrolle la alteración bajo las mismas condiciones extrínsecas e intrínsecas medidas; Ns (ufc/g o cm2) es el valor correspondiente a la población de seguridad (valor máximo permisible antes de considerarse alterado el producto); N0 (ufc/g o cm2) es el valor correspondiente a la población inicial presente en el producto; Tg es el tiempo de generación de la población alterante específica. Así una vez Ns y Tg han sido determinados para esas condiciones de almacenamiento, es muy fácil determinar el tiempo de vida útil reemplazando en la fórmula anterior, y por tanto, puede establecerse el mantenimiento de la calidad de estos productos bajo estas condiciones. Por lo tanto, todo lo que se requiere para estimar la vida útil de ese alimento es conocer la población inicial (N0).

Si la anterior aproximación se aplica a diferentes temperaturas, entonces puede evaluarse el efecto de la temperatura sobre el crecimiento bacteriano, transformando los datos de velocidad de crecimiento o tiempo de generación en una gráfica de dependencia de la temperatura (como ha sido usada por Mossel e Ingram, 1955), y obtener una constante que indique como cambia la velocidad de crecimiento con el cambio de la temperatura. En este caso debería considerarse calcular k a diferentes intervalos de temperatura constantes (por ejemplo el modelo de Q10; el cual muestra como varía k cada vez que se incrementa o disminuye en 10ºC la temperatura de almacenamiento.

Un modelo similar había sido establecido por Svante August Arrhenius (Sueco, 1859-1927) en 1889, cuando descubrió que la velocidad de las reacciones químicas aumenta con la temperatura, en una relación proporcional a la concentración de moléculas existentes.

El modelo de Arrhenius (efecto de la temperatura sobre la velocidad de alteración) Las aproximaciones modernas de la Microbiología Predictiva de Alimentos han tratado

de entender y establecer un vínculo entre el crecimiento de microorganismos y los factores que regulan el crecimiento tales como la temperatura, pH, actividad de agua, potencial redox, etc. La gran mayoría de los modelos secundarios son modelos de tipo cinético (Labuza y Fu, 1993;

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McDonald y Sun, 1999), de los cuales el más comúnmente usado ha sido el modelo de Arrhenius. Los modelos cinéticos para la determinación de la vida útil en alimentos son generalmente basados en la ocurrencia de fenómenos y estos no han sido desarrollados para un alimento en particular. Sin embargo, los parámetros experimentales y ambientales de un modelo pueden aplicarse para un producto en especial. De estos, la temperatura es normalmente considerada como el factor más importante en las reacciones de deterioro de los alimentos, especialmente, para la alteración microbiana donde la velocidad de crecimiento específico y la fase de latencia son altamente dependientes de la temperatura (Giannuzzi y col., 1998). La ecuación de Arrhenius fue derivada empíricamente basada en consideraciones termodinámicas (Labuza y Riboh, 1982), y describe la velocidad con que una reacción cambia cuando se emplean diferentes temperaturas conocidas (Ross y McMeekin, 1994). La forma más simple de esta ecuación es:

k A o

ln ln  

Donde, k es la velocidad de reacción; A {(ufc/ml, g o cm2)/tiempo} es un factor pre-exponencial –parámetro a ser determinado (intercepto de “y” en una gráfica de Lnk vs 1/T) –, R es la constante de los gases ideales (8.314 KJ/KgºK o 1,987 cal/ºKmol), T es la temperatura absoluta (ºK), y Ea (KJ/Kg) es denominada como la energía de activación de la reacción límite de velocidad-crecimiento (Ross y McMeekin, 1994). Si en la ecuación anterior los valores de k son calculados a diferentes temperaturas y si el lnk es graficado contra 1/T, puede obtenerse una línea recta en la cual la pendiente (m) es igual –Ea/R (Labuza y Riboh, 1982; Labuza y col., 1992; McDonald y Sun, 1999). Así el modelo de Arrhenius puede catalogarse en la clasificación de Whiting y Buchanan (1993) como un modelo secundario.

Cuando el modelo de Arrhenius es empleado para evaluar el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano, entonces k se transforma en la velocidad de crecimiento específico (Ross y McMeekin, 1994; Giannuzzi y col., 1998), y la ecuación de Arrhenius puede escribirse como:

µ A

Sin embargo, el crecimiento bacteriano es complejo y las extrapolaciones de las gráficas pueden no mostrar linealidad, por lo tanto, la ecuación anterior no puede encajar muy bien por debajo de los datos óptimos o por encima de las temperaturas mínimas para el crecimiento.

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Entonces, las gráficas obtenidas solo sirven para predecir el crecimiento microbiano en un limitado rango de temperatura (Labuza y Fu, 1993; McDonald y Sun, 1999). Así la ecuación que ha sido utilizada mayoritariamente para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano es el modelo de la raíz cuadrara propuesto por Ratkowsky y col., en 1982 (Adair y col., 1989; Willocx y col., 1993; Neumeyer y col., 1997; Giannuzzi y col., 1998).

 

6. Ejercicio de estimación de la vida útil empleando modelos predictivos y test acelerados de tiempo.

En el desarrollo de un nuevo producto lácteo se estima que la variable microbiológica a controlar es el crecimiento de S. aureus. El nuevo producto está pensado para ser mantenido en condiciones de refrigeración (4ºC). El límite máximo de crecimiento permitido para este organismo es de 1,5x107 ufc/g. Finalizado el producto se detecta que la población final remanente es de 103 ufc/g.

Para determinar la vida útil a 4ºC se empleó un test acelerado de tiempo a tres temperaturas diferentes (10ºC, 20ºC y 30ºC) durante 12 horas aproximadamente.

Tiempo (h) 10ºC 20ºC 30ºC

ufc/g

0,00 1000 1000 1000

0,96 1047 1479 3162

1,92 1096 2188 9772

2,88 1148 3236 30903

3,84 1202 4786 95499

4,80 1259 7079 295121

5,76 1318 10471 912011

6,72 1380 15488 2818383

7,68 1445 23442 8128305

8,64 1514 34674 21379621

9,60 1585 51286 45708819

10,56 1660 75858 75857758

11,52 1738 112202 100000000

12,48 1820 165959 112201845

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Para el cálculo de la vida útil pueden emplearse varios modelos predictivos, pero vamos a comenzar con la aproximación de Arrhenius. 1. El primer paso una vez obtenida la población en unidades logarítmicas (ln ufc/g) es

calcular la velocidad de crecimiento específica (µ) para cada temperatura en el intervalo de crecimiento exponencial. Esta puede obtenerse de diversas maneras, una es graficando en las ordenadas el Lnufc/g en fase exponencial y en las abscisas el tiempo (h), y a partir de esta gráfica obtener la ecuación de la recta en cuyo caso la pendiente es igual a la velocidad de crecimiento específica (µ ufc h–1g). Otra forma es calculando µ a partir de la siguiente ecuación:

   

Tiempo (h) 10ºC – (283ºK)

ufc/g Lnufc/g Log ufc/g µ (–h)

0,00 1000 6,91 3,00 0,04784

0,96 1047 6,95 3,02 0,04764

1,92 1096 7,00 3,04 0,04829

2,88 1148 7,05 3,06 0,04788

3,84 1202 7,09 3,08 0,04826

4,80 1259 7,14 3,10 0,04771

5,76 1318 7,18 3,12 0,04788

6,72 1380 7,23 3,14 0,04794

7,68 1445 7,28 3,16 0,04859

8,64 1514 7,32 3,18 0,04774

9,60 1585 7,37 3,20 0,04816

10,56 1660 7,41 3,22 0,04783

11,52 1738 7,46 3,24 0,04802

12,48 1820 7,51 3,26 ---

µ media 0,04798

Tiempo (h) 20ºC (293ºK)

ufc/g Lnufc/g Log ufc/g µ (–h)

0,00 1000 6,91 3,00 0,40767

victor
Resaltado

0,96 1479 7,30 3,17 0,40794

1,92 2188 7,69 3,34 0,40766

2,88 3236 8,08 3,51 0,40766

3,84 4786 8,47 3,68 0,40775

4,80 7079 8,86 3,85 0,40779

5,76 10471 9,26 4,02 0,40777

6,72 15488 9,65 4,19 0,43173

7,68 23442 10,06 4,37 0,40777

8,64 34674 10,45 4,54 0,40774

9,60 51286 10,85 4,71 0,40776

10,56 75858 11,24 4,88 0,40775

11,52 112202 11,63 5,05 0,40775

12,48 165959 12,02 5,22 ---

µ media 0,40959

Tiempo (h) 30ºC (303ºK)

ufc/g Lnufc/g Log ufc/g µ (–h)

0,00 1000 6,91 3,00 1,19917

0,96 3162 8,06 3,50 1,17533

1,92 9772 9,19 3,99 1,19930

2,88 30903 10,34 4,49 1,17527

3,84 95499 11,47 4,98 1,17528

4,80 295121 12,60 5,47 1,17528

5,76 912011 13,72 5,96 1,17528

6,72 2818383 14,85 6,45 1,10332

7,68 8128305 15,91 6,91 1,00738

8,64 21379621 16,88 7,33 0,79151

9,60 45708819 17,64 7,66 0,52768

10,56 75857758 18,14 7,88 0,28782

11,52 100000000 18,42 8,00 0,11993

12,48 112201845 18,54 8,05 ---

µ media 0,93174

2. Con constexpontempRecose obserá en log

De laEa = R = 8Ea = Ea = LnA =

3. Una reem

Lnµ(ufc

‐1h°K)

los resultadtantes del mnencial A. Peratura y en

ordemos que btiene es igupositiva); y egaritmo (LnA

a gráfica pode – (m*R) 8,314472 KJ/ – (–13054 uf 108537,12 K= 43,27 ufc/h

vez obtenidplazando en

ln 4

‐3,5

‐3

‐2,5

‐2

‐1,5

‐1

‐0,5

0

0,5

0,0032

Ln µ (u

fchK)

dos de µ pmodelo de APara este cn las abscis cuando se g

ual a: –Ea/R el intercepto

A).

emos inferir q

/KgºK fc/hºK * 8,31

KJ/hKgºK. hºK

dos los par la ecuación

3,27 ufc/h

0,0033 0,

1/T

Grá

para cada Arrhenius: encaso graficaras el recíprgrafica de es (y que por en el eje “y

que:

4472 KJ/Kgº

rámetros pro de Arrhenius

ln ln

h°K  1088,31

0034 0,003

T (‐1°K)

fica de 

temperatura ergía de acremos en laroco de cadasta forma, la tanto Ea = –” cuando X=

ºK)

ocedemos as.

 

8537,12 14472  /

35 0,0036

lnµ vs 1

procedemotivación (Ea)as ordenadaa temperatu pendiente d–m*R, que e=0 es el facto

a calcular µ

  // ° 2

y = ‐13R²

1/T

Gráfica

Lineal vs 1/T)

os a calcula) y el Facto

as el lnµ a ra absoluta e la recta (m

en todos los or pre-expon

µ a 4ºC (2

°77°

054x + 43,27² = 0,954

a de lnµ vs 1/T

(Gráfica de ln)

ar las or pre- cada (1/T).

m) que casos

nencial

277ºK)

T

µ 

ln 43,27 ufc/h°K  47,13  / °

ln 3,856  / °

µ 0,021 / °

Por tanto, la velocidad de crecimiento específico a 4ºC es de 0,021 ufc/hºK.

4. Procedemos a estimar entonces la vida útil a 4ºC. Si nuestro valor límite es 1,5x107

ufc/g (16,524 lnufc/g). Si tenemos que por cada hora se incrementa 0,021 lnufc/g {recordemos que µ se obtiene del lnufc/g vs tiempo (h)}, en cuanto tiempo se alcanzarán las 16,524 lnufc/g que es nuestro valor límite?

5. Podemos usar una sencilla regla de tres: 1 h 0,021 lnufc/g X? 16,524 lnufc/g

 1 16,524  /

0,021  /

X = 786,86 horas.

Si usamos la aproximación de Monod-Hinshelwood, debemos conocer el tiempo de

generación a la temperatura problema, en este caso a 4ºC. 1. El primer paso y para este caso, debemos calcular k para cada temperatura,

tenemos dos opciones: a partir de la siguiente fórmula:

  

0,301

Una vez obtenido k, calculamos el tiempo de duplicación para cada temperatura mediante la siguiente fórmula:

 1

victor
Resaltado
victor
Rectángulo
victor
Resaltado
victor
Resaltado
victor
Resaltado
victor
Resaltado
victor
Resaltado
victor
Cuadro de texto
32.8 días

Tiempo (h) 10ºC – (283ºK)

ufc/g Lnufc/g Log ufc/g k (–h)

0,00 1000 6,91 3,00 0,06903

0,96 1047 6,95 3,02 0,06874

1,92 1096 7,00 3,04 0,06967

2,88 1148 7,05 3,06 0,06908

3,84 1202 7,09 3,08 0,06963

4,80 1259 7,14 3,10 0,06883

5,76 1318 7,18 3,12 0,06909

6,72 1380 7,23 3,14 0,06917

7,68 1445 7,28 3,16 0,07011

8,64 1514 7,32 3,18 0,06888

9,60 1585 7,37 3,20 0,06949

10,56 1660 7,41 3,22 0,06901

11,52 1738 7,46 3,24 0,06929

12,48 1820 7,51 3,26 ---

k media 0,06923

Tiempo (h) 20ºC (293ºK)

ufc/g Lnufc/g Log ufc/g k (–h)

0,00 1000 6,91 3,00 0,58821

0,96 1479 7,30 3,17 0,58859

1,92 2188 7,69 3,34 0,58818

2,88 3236 8,08 3,51 0,58819

3,84 4786 8,47 3,68 0,58831

4,80 7079 8,86 3,85 0,58837

5,76 10471 9,26 4,02 0,58834

6,72 15488 9,65 4,19 0,62292

7,68 23442 10,06 4,37 0,58835

8,64 34674 10,45 4,54 0,58830

9,60 51286 10,85 4,71 0,58833

10,56 75858 11,24 4,88 0,58831

11,52 112202 11,63 5,05 0,58832

12,48 165959 12,02 5,22 ---

k media 0,59098

Tiempo (h) 30ºC (303ºK)

ufc/g Lnufc/g Log ufc/g k (–h)

0,00 1000 6,91 3,00 1,73021

0,96 3162 8,06 3,50 1,69581

1,92 9772 9,19 3,99 1,73040

2,88 30903 10,34 4,49 1,69573

3,84 95499 11,47 4,98 1,69574

4,80 295121 12,60 5,47 1,69574

5,76 912011 13,72 5,96 1,69574

6,72 2818383 14,85 6,45 1,59192

7,68 8128305 15,91 6,91 1,45349

8,64 21379621 16,88 7,33 1,14203

9,60 45708819 17,64 7,66 0,76135

10,56 75857758 18,14 7,88 0,41528

11,52 100000000 18,42 8,00 0,17303

12,48 112201845 18,54 8,05 ---

k media 1,34434

O como ya conocemos µ, calculamos el Tg para cada temperatura a partir de la formula:

 2

2. El segundo paso es graficar el Log10Tg para cada temperatura experimental en las

ordenadas y la Temperatura en las abscisas. A partir de la ecuación de la recta calculamos el log10Tg a 4ºC.

Temperatura (ºC) µ (h) k (h) Tg (h)

10 0,04798 0,06923 14,4435 h

20 0,40959 0,59098 1,6919 h

30 0,93174 1,34434 0,7438 h

Si y = Log10

Log10

Log10

Tg = Tg =

3. Con lla ecu

L10

Td(h)

= –0,064x + 1

0Tg = –0,064

0Tg = –0,256

0Tg = 1,456

101,456

28,57 h; (k =

os datos antuación:

‐0,4000

‐0,2000

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1,4000

0

Log10 Td

 (h)

Lo

1,712, proced

*4ºC + 1,712

+ 1,712

= 0,035)

teriores de T

 lo

 

0 10

T

og10Td vs T

demos a calc

2

Tg a 4ºC, pro

g  2

7,18 30,301

 396,76

16,5 

20

Temperatura 

Temp. paraur

cular Log10k a

cedemos a e

28,57

30

(ºC)

a el crecimreus

a 4ºC (x).

establecer la

y = ‐

40

miento de

vida útil med

‐0,064x + 1,71R² = 0,939

e S. 

Series1

Lineal (Ser

diante

12

ies1)

7. Conclusión. Si nos La vida útil estimada para este producto a 4ºC es de 786,86 horas o 32,78 días con el modelo de Arrhenius. Como margen de seguridad puede establecerse una vida útil de 30 días a 4ºC. Sin embargo, con la aproximación de Monod-Hinshelwood la vida útil se ve limitada a 396,76 h o 16,5 días. En este caso como margen de seguridad podríamos establecer una vida útil de 14 a 15 días. Tal y como explica Labuza y Fu (1993) o McDonald y Sun (1999), cuando se emplea el modelo de Arrhenius para el crecimiento bacteriano, las extrapolaciones de las gráficas pueden no mostrar linealidad, y por lo tanto, el modelo anterior no puede encajar muy bien por debajo de los datos óptimos o por encima de las temperaturas mínimas para el crecimiento.

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victor
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Anexo 1. Diversos valores de R (Constante de los gases ideales).

Valor de R Unidades (V·P·T-1·n-1)

8.314472 J·K-1·mol-1 0.0820574587 L·atm·K-1·mol-1

83.14472 cm3·bar·mol-1·K-1 8.20574587 × 10-5 m3·atm·K-1·mol-1

8.314472 cm3·MPa·K-1·mol-1 8.314472 L·kPa·K-1·mol-1 8.314472 m3·Pa·K-1·mol-1 62.36367 L·mmHg·K-1·mol-1 62.36367 L·Torr·K-1·mol-1 83.14472 L·mbar·K-1·mol-1

0.08314472 L·bar·K-1·mol-1 1.987 cal·K-1·mol-1

6.132440 lbf·ft·K-1·g-mol-1 10.73159 ft3·psi·°R-1·lb-mol-1

0.7302413 ft3·atm·°R-1·lb-mol-1 998.9701 ft3·mmHg·K-1·lb-mol-1

8.314472 × 107 erg·K-1·mol-1 8.314472 KJ·Kg-1·K-1