Vergleich der Sensibilisierungskinetik von Effektorzellen ... · PDF fileZiege-anti-Acylhistamin von Ziegen stammende Antikörper mit Spezifität gegen Acylhistamin . ... Ctenocephalides

Tierärztliche Hochschule Hannover

Vergleich der Sensibilisierungskinetik von Effektorzellen der

Typ I-Allergie bei der Katze während wiederholter Exposition

mit Ctenocephalides felis in hoher und geringer Intensität

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin

-Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Matthias Sydow

Berlin

Hannover 2009

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Georg von Samson-Himmelstjerna

Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover

Prof. Dr. med. vet., Dr. h.c. Wolfgang Leibold

Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen

Hochschule Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Georg von Samson-Himmelstjerna

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Reinhard Mischke

Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2009

Für meine Mutter

Inhalt

1 Einleitung und Zielsetzung......................... .................................................... 13

2 Literaturübersicht................................. ........................................................... 16

2.1 Allergie ....................................................................................................... 16

2.1.1 Übersicht über die verschiedenen Allergietypen ............................................17

2.1.2 Mechanismus der Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I............................25

2.1.3 Arthropoden als Auslöser von Typ I-Immunantworten....................................28

2.2 Allergiediagnostik ....................................................................................... 30

2.2.1 In vivo-Verfahren ...........................................................................................31

2.2.2 In vitro-Verfahren...........................................................................................32

2.3 Flohallergie-Dermatitis ............................................................................... 36

2.3.1 Allgemeines...................................................................................................36

2.3.2 Biologie des Katzenflohs, Ctenocephalides felis felis.....................................37

2.3.3 Ätiologie und Pathogenese der FAD..............................................................38

2.3.4 Diagnostik......................................................................................................39

2.3.5 Therapie und Parasitenbekämpfung ..............................................................40

3 Geräte, Material und Methoden ...................... ................................................ 49

3.1 Geräte ........................................................................................................ 49

3.2 Material ...................................................................................................... 51

3.2.1 Klinikbedarf....................................................................................................51

3.2.2 Laborbedarf und Verbrauchsmaterial.............................................................52

3.2.3 Reagenzien ...................................................................................................54

3.2.4 Puffer und Lösungen .....................................................................................55

3.2.5 Antikörper und Sera.......................................................................................57

3.2.6 Antigene ........................................................................................................57

3.2.7 Software ........................................................................................................57

3.3 Versuchstiere ............................................................................................. 58

3.3.1 Katzen ...........................................................................................................58

3.3.2 Katzenflöhe ...................................................................................................59

3.4 Methoden ................................................................................................... 59

3.4.1 Verlaufsuntersuchung....................................................................................59

3.4.2 Blutentnahme ................................................................................................60

3.4.3 Herstellung und Aufbereitung der Antigene ...................................................61

3.4.4 Funktioneller in vitro Test (FIT) zum Nachweis Typ I-allergischer Effektorzellen.................................................................................................63

3.4.5 Intrakutantest (IKT)........................................................................................67

3.4.6 Radio Immuno Assay (RIA) ...........................................................................69

3.4.7 Parasitologische Untersuchungen .................................................................73

3.4.8 Statistik..........................................................................................................74

4 Ergebnisse ......................................... .............................................................. 77

4.1 Optimierung des FIT für die Allergiediagnostik bei der Katze..................... 77

4.1.1 Verdünnung der Blutproben...........................................................................78

4.1.2 Optimierung der Ca-Konzentration im Freisetzungspuffer..............................80

4.1.3 Lagerung und Transport von Blutproben........................................................82

4.1.4 Titration der Antikörperkonzentration .............................................................84

4.2 Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung ....................................................... 86

4.2.1 Flohinfestation ...............................................................................................86

4.2.2 Koproskopische Untersuchung ......................................................................92

4.2.3 Funktioneller in vitro-Test (FIT)......................................................................92

4.2.4 Intrakutantest...............................................................................................125

4.2.5 Übereinstimmung der Ergebnisse aus FIT und IKT .....................................134

5 Diskussion ......................................... ............................................................ 137

5.1 Methodik des FIT...................................................................................... 137

5.1.1 Modulation der Spontanfreisetzung von Basophilen der Katze ....................137

5.1.2 Reaktionsbereitschaft von Basophilen im Hinblick auf Lagerungsdauer und Temperatur..................................................................................................139

5.2 Sensibilisierungskinetik von Basophilen und Mastzellen auf C. felis- Antigen ..................................................................................................... 141

5.2.1 Zusammenhang zwischen Intensität der Flohinfestation und Antigenexposition ........................................................................................145

5.2.2 Einfluss der Expositionsintensität auf die Sensibilisierungskinetik................146

5.3 Beurteilung der Reaktion der Basophilen im FIT auf die verwendeten Flohantigen-Präparationen....................................................................... 149

5.4 Vergleich des Reaktionsverhaltens von Basophilen und Mastzellen........ 151

6 Zusammenfassung.................................... .................................................... 154

7 Summary............................................ ............................................................ 156

8 Literaturverzeichnis ............................... ....................................................... 158

Verzeichnis der Abkürzungen und Glossar der Fachtermini ad. us. vet. ad usum veterinarium, (Arzneimittel) zum

veterinärmedizinischen Gebrauch

ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity, antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität

Advantage® Handelsname für ein �spot-on Präparat mit dem Wirkstoff Imidacloprid zur Flohbekämpfung

Ag Antigen

Ag-Freisetzung Antigeninduzierte Histaminfreisetzung durch basophile Granulozyten

Ak Antikörper

Ak-Freisetzung Antikörperinduzierte Histaminfreisetzung durch basophile Granulozyten

Aliquot Teilprobe

APC Antigen presenting cells, antigenpräsentierende Zellen

arithm. arithmetisch(er)

ATP Adenosintriphosphat

Ausgangsquaddel Quaddel, die beim Intrakutantest an der Injektionsstelle allein durch das injizierte Volumen der Antigenlösung hervorgerufen wird

A. dest. Aqua destillata, destilliertes Wasser

A. tridest. Aqua tridestillata, dreifach destilliertes Wasser

B Probe im �RIA, deren Histamingehalt bestimmt werden soll

B0 Vergleichsprobe im �RIA ohne zugesetzten �Histaminstandard, die ausschließlich �125I-Histamintracer enthält

B / B0 Quotient, der die Höhe der Aktivität des �125I-Histamintracer in der zu untersuchenden Probe �B im Verhältnis zur Kontrollprobe �B0 angibt

BCA™ Bicinchoninic Acid, 2,2'-Bichinolin-4,4'-dicarbonsäure

Boxplot Diagrammform zur Darstellung der Verteilung numerischer Daten

BSA Bovines Serumalbumin

Bq Becquerel, Einheit für radioaktive Zerfälle pro Sekunde

CaCl2 Calciumchlorid

CDC complement dependent cytotoxicity, komplementabhängige Zytotoxizität

Cf Ctenocephalides felis-Antigen

C. felis Ctenocephalides felis, Katzenfloh

cpm counts per minute, Zählimpulse pro Minute

Da Dalton

DαG Donkey-anti-goat, Esel-anti-Ziege-Ig-Antikörper

DMSO Dimethylsulfoxid

Donkey anti goat Serum Esel-anti-Ziege Ig-Immunserum

early onset Kinetik Sensibilisierungsmuster, bei dem bereits in der Frühphase der Antigenexposition eine funktionelle Sensibilisierung im FIT nachweisbar wird

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay, enzymgekoppelter Immunadsorptionstest

EDTA Ethylendiamintetraacetat

Fc Fragment crystallizable, kristallinisierbares Fragment eines Antikörpers

FcR Fc-Rezeptor, Molekül auf der Zelloberfläche von Immunzellen, welches Antikörper über deren Fc-Teil binden kann.

FIT Funktioneller in vitro-Test zum Nachweis der Sensibilisierung von Typ I Effektorzellen

Flohinfestation Besiedlung eines Wirtes mit Flöhen

flohnaiv Zustand, wenn ein Tier bisher keiner Flohinfestation ausgesetzt war

Freis. Freisetzung

GABA γ-Amino-Buttersäure

Gαh Goat anti histamine, Ziege-anti-Acylhistamin-Antikörper

generelle Sensibilisierung Fähigkeit der basophilen Granulozyten, durch Vermittlung ihrer membranständigen Antikörper auf eine Antikörperstimulation zu reagieren. Die generelle Sensibilisierung kann mit Hilfe der �Ak-Freisetzung überprüft werden.

geringe Exposition Belastung mit einer geringen Flohantigenmenge

gesaugte Flöhe Flöhe, die eine Blutmahlzeit aufgenommen haben, was sich im Stereomikroskop durch den Nachweis von Erythrozytenhämoglobin im Verdauungstrakt bestimmen lässt

HCl Salzsäure

Histaminstandard Lösung mit definierter Histaminkonzentration zur Anwendung im �RIA

hohe Exposition Belastung mit einer hohen Flohantigenmenge

Ig Immunglobulin

IgG (H+L) Immunglobulin G (heavy + light, schwere und leichte Kette)

125I-Histamintracer 125I-konjugiertes Histamin, welches im �RIA zur kompetitiven Bestimmung des Histamingehaltes einer Probe verwendet wird

IKT Intrakutantest

K Kalium

KCl Kaliumchlorid

KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat

Kodan® Desinfektionsspray zur Hautdesinfektion

late onset Kinetik Sensibilisierungsmuster, bei dem erst in einer späteren Phase der Antigenexposition eine funktionelle Sensibilisierung im �FIT nachweisbar wird

MAC Membrane attacking complex, Membran attackierender Komplex

Max Maximalfreisetzung: gesamte zur Verfügung stehende Histaminmenge, die durch basophile Granulozyten freigesetzt und nachgewiesen werden kann

MFO mixed function oxidase, Oxidasen, die unter Bildung von H2O 2 Substrate gleichzeitig oxidieren: AH2 + BH + O2 werden unter der Wirkung solcher Oxidasen zu A + BOH + H2O

MgCl2 Magnesiumchlorid

MHC Major Histocompatibility Complex, Haupthistokompatibilitätskomplex

MW Mittelwert

n.a. nicht auswertbar

NaCl Natriumchlorid

Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat

(NH4)HCO3 Ammoniumbikarbonat

NaN3 Natriumazid

NaOH Natriumhydroxyd (Natronlauge)

NSB nichtspezifische Bindung: Kontrollansatz für nicht antikörpergebundenes Histamin im �RIA

NHS-Biotin N-Hydroxysuccinimido-Biotin

PBS Phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PEG Polyethylenglykol

Pipes Piperazine-N,N’-bis[2-ethanesulfonic]acid

pH potentia Hydrogenii, negativer dekadischer Logarithmus der H+-Ionenkonzentration einer Lösung

rF relative Feuchte

RαC Rabbit anti Cat, Kaninchen-anti-Katzen-IgG Antikörper

Reaktionsquaddel Quaddel, die sich beim Intrakutantest infolge der Reaktion auf die injizierten Substanzen / Antigene bildet

ROS Reactive oxygen species, freie Sauerstoffradikale

SD standard deviation, Standardabweichung

spezifische Sensibilisierung Vorhandensein von Antikörpern einer bestimmten Spezifität auf der Oberfläche von basophilen Granulozyten oder Mastzellen, die ein Antigen spezifische erkennen und nach ausreichender Bindung (bridging) eine � Ag-induzierte Freisetzung vermitteln können.

Spon Spontane Histaminfreisetzung durch basophile Granulozyten, die ohne eine stimulierende Substanz (wie Antigen oder Antikörper) unter schonenden Inkubationsbedingungen auftritt.

spot on Präparat bzw. Applikationsverfahren, bei dem der Wirkstoff durch Auftropfen auf die Haut angewendet wird

Stamm „G“ Laborstamm von �C. felis, der bei Greer Labs zur Herstellung des Antigenextrakts �WBE-G verwendet wurde

Stamm „H“ Laborstamm von �C. felis, der im Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Herstellung des Antigenextrakts �WBE-H verwendet wurde

T Tracer:�hier 125Iod-Histamin-Tracer

t0 Zeitpunkt 0, zu dem im Intrakutantest der Durchmesser der �Ausgangsquaddel ermittelt wird

TiHo Tierärztliche Hochschule Hannover

Triton X 100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol

Trizma® Base Tris[hydroxymethyl]aminomethan

Tween 20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

verd. verdünnt

WBE-G Whole Body Extract-Greer (Ganzkörperextrakt von Flöhen des �“Stammes G” von Greer Laboratories, USA)

WBE-H Whole Body Extract-Hannover (selbsthergestellter Ganzkörperextrakt von Flöhen des �“Stammes H”)

Whisker vertikale Linie in einem �Boxplot

w/v weight per volume, Gewicht pro Volumen

Ziege-anti-Acylhistamin von Ziegen stammende Antikörper mit Spezifität gegen Acylhistamin

E I N L E I T U N G U N D Z I E L S E T Z U N G

___________________________________________________________________________

13

1 Einleitung und Zielsetzung

Das Auftreten von Allergien ist ein Phänomen, welches mit zunehmender Häufigkeit

nicht nur beim Menschen, sondern auch bei Tieren zu beobachten ist. Trotz der

steigenden Relevanz dieses vielfältigen Krankheitsbildes ist eine ursächliche

Therapie bislang nicht gefunden.

Zwar sind wichtige Immunmechanismen bekannt, die zu der klinischen Symptomatik

führen, was aber die über eine schützende Immunantwort hinausgehende Reaktion

eines Individuums gegen ein oder mehrere Antigene auslöst und wie diese

beeinflusst werden kann, ist Gegenstand der Forschung. Die am häufigsten

auftretende Form der Allergie ist die Typ I-Allergie, welche auch als

Überempfindlichkeitsreaktion vom Soforttyp bezeichnet wird.

Grundvoraussetzung für die Ausprägung einer Typ I-Allergie ist eine ausreichende

Sensibilisierung von Typ I Effektorzellen (basophilen Granulozyten und Mastzellen)

mit geeigneten Antikörpern gegen eine bestimmte Substanz (Antigen). Um dies zu

erreichen, muss ein Individuum zuerst spezifische Antikörper gegen antigene

Teilstrukturen (Epitope) von Antigenen bilden, die zudem auf Grund ihres konstanten

Teiles (Isotyp) geeignet sind, an membranständige Fc-Rezeptoren von Typ I-

Effektorzellen in ausreichender Dichte zu binden. Derart sensibilisierte Basophile

(vorwiegend im Blut) oder Mastzellen (vorwiegend in Haut und Schleimhaut) können

nun von einem Antigen aktiviert werden, indem dieses gleichzeitig von mindestens

zwei sensibilisierenden Antikörpern, somit an mindestens zwei Epitopen, gebunden

wird und dadurch zur Vernetzung (bridging) von mindestens zwei Fc-Rezeptoren

führt (KNOL 2006). Vernetzte Fc-Rezeptoren lösen in den Zellen Signalkaskaden

aus, die zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren führen können. Abhängig von

der Art und Stärke der Mediatorausschüttung werden von subjektiv nicht spürbaren,

lokalen Entzündungsreaktionen, über deutlich spürbare, meist heftig juckende lokal

überschießende allergische Reaktionen bis hin zu systemisch wirksamen

Symptomen wie dem lebensbedrohlichen anaphylaktischen Schock, verschiedene

Ausprägungen beobachtet. Die Regulationsmechanismen, die entscheiden, ob aus


___________________________________________________________________________

14

der Sensibilisierung gegen ein spezifisches Antigen eine klinisch manifeste Typ I-

Allergie entsteht, sind komplex und bis dato nicht geklärt.

Eine Typ I-Allergie kann zum Beispiel neben Pollen und Futtermittelinhaltsstoffen

auch gegen Antigene von Arthropoden gerichtet sein. Im Bereich der Kleintiermedizin

ist hier vor allem der Katzenfloh, Ctenocephalides felis, als häufigster Ektoparasit von

Hund und Katze zu nennen (REEDY et al. 1997). Neben der direkten Schädigung

des Wirts durch Juckreiz, Verletzung der Haut und Blutverlust wird beim Saugakt

Speichel in die Wunde injiziert, dessen Proteinkomponenten beim Wirt eine Typ I-

Allergie auslösen und die Symptome einer Flohallergie-Dermatitis (FAD), wie

Pruritus, Alopezie, Erytheme, Papeln und Exkoriationen hervorrufen können. Diese

gehen oft mit einer miliaren Dermatitis einher. Die FAD ist eine der häufigsten

dermatologischen Erkrankungen beim Kleintier (DRYDEN u. BLAKEMORE 1989).

Ein Verfahren zur Diagnostik der Flohallergie-Dermatitis ist der Intrakutantest (IKT),

bei dem nach intradermaler Applikation des Antigens die Ödematisierung des

Gewebes als lokale Reaktion der Mastzellen an der Applikationsstelle abgelesen und

hieraus eine Aussage über den Sensibilisierungsstatus abgeleitet wird. Wegen des

erhöhten Aufwands und gelegentlichen Schwierigkeiten bei der Interpretation der

Ergebnisse (VROOM 2000) werden in der Praxis auch serologische Verfahren

eingesetzt, die auf dem Nachweis von spezifischen Antikörpern im Patientenserum

mittels eines ELISA beruhen. Diese sind jedoch klinisch weit weniger relevant als der

Intrakutantest, da nur die auf den Mastzellen (wie auch den Basophilen) gebundenen

sensibilisierenden Antikörper eine Zellaktivierung vermitteln und dadurch eine

klinische Symptomatik auslösen können.

Als weiteres Testverfahren steht seit einigen Jahren der funktionelle in vitro-Test

(FIT) zum Nachweis der Sensibilisierung von Typ I Effektorzellen zur Verfügung, der

im Gegensatz zu serologischen Tests darauf beruht, die Sensibilisierung der

basophilen Granulozyten aus dem Blut des Patienten generell und gegen spezifische

Antigene zu untersuchen (KAUL 1998; STUKE 2005).

Da das Verständnis über die Regulation der Typ I-Immunantwort noch unzureichend

und der Nutzen einer spezifischen Immuntherapie zur Behandlung der FAD fraglich


___________________________________________________________________________

15

ist (PATERSON 2000; LAFFORT-DASSOT et al. 2004), zielt die gängige

Behandlungsstrategie auf die Eradikation des Flohbefalls und somit auf die

Verminderung oder Vermeidung einer Exposition von Flohantigenen ab (DRYDEN u.

BLAKEMORE 1989; REEDY et al. 1997; CARLOTTI u. JACOBS 2000; RUST 2005).

Hierzu steht ein breites Spektrum an Substanzen mit unterschiedlichem

Wirkmechanismus und Applikationsart zur Verfügung.

Über den Einfluss der Antigenmenge auf das Sensibilisierungsverhalten von

Effektorzellen der Typ I-Allergie bei der Katze ist bisher nichts bekannt. Daher sollte

in dieser Arbeit die Entwicklung der spezifischen Sensibilisierung von nicht

sensibilisierten und vorsensibilisierten Katzen gegen Antigene des Flohspeichels von

Ctenocephalides felis mit Hilfe des funktionellen in vitro-Tests (FIT) untersucht

werden, welcher unabhängig von einer klinischen Symptomatik anhand der

membranständigen Antikörper eine funktionelle Sensibilisierung der Basophilen

gegen Flohantigene nachweisen kann.

Dabei standen insbesondere folgende Fragestellungen im Vordergrund:

1. Wie kann der FIT für die Katze methodisch optimiert werden?

2. Welchen Einfluss hat die mehrmonatige, wöchentliche Applikation einer hohen

bzw. einer deutlich geringeren Antigenmenge durch Exposition mit C. felis auf

den Grad und die Kinetik der Sensibilisierung von Basophilen und Mastzellen?

3. Welche Aussagen können anhand des FIT hinsichtlich der benötigten

Antigenmenge zur Induktion einer Sensibilisierung gegen C. felis gemacht

werden?

4. Wie korrelieren die Resultate des funktionellen in vitro-Tests (FIT) mit dem

Intrakutantest (IKT) als in vivo-Testverfahren?

5. Wie unterscheiden sich verschiedene Antigenpräparationen von Ctenocephalides

felis in der Reaktionsbereitschaft der Basophilen im FIT bzw. der Mastzellen im

IKT?

L I T E R A T U R Ü B E R S I C H T

___________________________________________________________________________

16

2 Literaturübersicht

2.1 Allergie

Bei der Interaktion des Organismus mit seiner Umwelt wird dieser mit biotischen und

abiotischen Faktoren konfrontiert. Vom Immunsystem eines Individuums werden von

all diesen Faktoren nur diejenige mit einer Immunreaktion beantwortet, die die vom

Immunsystem zu überwachende genetisch vorgegebene „innere Ordnung“ stören.

Geschieht diese „Störung“ durch körpereigene Strukturen, die der Organismus

eliminieren möchte (falsch ausdifferenzierte, geschädigte oder funktionsgestörte

Zellen bzw. Tumorzellen), so setzt das Immunsystem dazu ein breites Spektrum an

Immunmechanismen ein. Diese wünschenswerten Immunreaktionen werden als

„Autoimmunität“ bezeichnet. Autoimmunität ist somit nicht schädlich, sondern sogar

lebensnotwendig. Sollten jedoch dieselben Immunmechanismen statt unerwünschter

funktionsfähige und deshalb erhaltenswerte Zellen angreifen und zerstören, so wird

diese immunologische Selbstzerstörung als „Autoaggression“ bezeichnet. Es können

klinische Symptome entstehen, die dann als „Autoaggressionserkrankung“ oder

synonym als „Autoimmunerkrankung“ bezeichnet werden. Vergleichbar ist es bei

Störung der inneren Ordnung durch von außen kommende (exogene) Strukturen.

Prinzipiell die gleichen Immunmechanismen, die eine schützende Autoimmunität

oder eine pathogene Autoaggression bewerkstelligen, können gegen störende

exogene Strukturen einerseits schützende Immunantworten („Immunität“) oder

andererseits überschießende pathogene Immunreaktionen entwickeln. Diese können

zu klinischen Symptomen führen, die als „Allergie“ bezeichnet werden. Warum es im

Einzelfall statt einer Autoimmunität zu einer unerwünschten Autoaggression gegen

körpereigene Strukturen kommt, ist ebenso unbekannt wie die Ursachen der

Entstehung einer pathogenen Allergie statt einer schützenden Immunität gegen

körperfremde Strukturen.


___________________________________________________________________________

17

Strukturen, die vom Immunsystem erkannt werden, nennt man „Antigen“. Reagiert

ein Individuum auf ein körperfremdes Antigen mit einer überschießenden

Immunreaktion, die zu klinischen allergischen Symptomen führt, so stellt dieses

Antigen für dieses Individuum ein „Allergen“ dar. Somit macht erst die

überschießende Immunreaktion eines Individuums ein Antigen zum „Allergen“. Es ist

jedoch nicht zu übersehen, dass einige Antigene häufiger und andere seltener mit

überschießenden Immunreaktionen beantwortet werden, also häufiger bzw. seltener

als „Allergene“ in Erscheinung treten. (JANEWAY et al. 2002).

2.1.1 Übersicht über die verschiedenen Allergietype n

Bei schützenden wie überschießenden Immunantworten ist prinzipiell das gleiche

Spektrum an Immunreaktionen beteiligt. Abhängig von der Art der Störung der

„inneren Ordnung“ werden jedoch unterschiedliche Komponenten und Mechanismen

des Immunsystems eingesetzt, was zu sehr verschiedenen Abläufen und klinischen

Symptombildern führen kann.

GELL und COOMBS versuchten im Jahr 1968 unterschiedliche Formen von

allergischen Immunreaktionen mit den beteiligten Komponenten und Mechanismen

zu „ordnen“, indem sie sie in „Reaktionstypen“ einteilten. Da die gleiche Einteilung

sich auch für schützende Immunreaktionen eignete, spricht man heute generell von

Immunreaktionstypen und nicht mehr nur von „Allergietypen“.

Die Immunreaktionstypen I, II und III beschreiben unterschiedliche zelluläre

Immunreaktionen in Interaktion mit Antikörpern und/oder Komplementkomponenten.

Der Immunreaktionstyp IV wird allein von Immunzellen ohne Beteiligung von

Antikörpern oder Komplement durchgeführt. Der nachträglich hinzugekommene

Immunreaktionstyp V wird allein von Antikörpern ohne Beteiligung von Zellen oder

Komplement bewerkstelligt.

Die Typ I-Allergie , die auch als Überempfindlichkeitsreaktion vom Soforttyp

bezeichnet wird, kann binnen Minuten bis Stunden nach Antigenkontakt zu einer

klinischen Reaktion führen. Diese geht mit Vasodilatation, erhöhter


___________________________________________________________________________

18

Gefäßpermeabilität, und Juckreiz einher und kann bis zum allergischen Schock

führen. Ausgelöst wird dies von Mediatorsubstanzen (Entzündungsmediatoren,

Zytokinen und Chemokinen) aus aktivierten Effektorzellen der Typ I-Immunreaktion,

basophilen Granulozyten und Mastzellen. Diese „Typ I-Effektorzellen“ haben selbst

keine spezifischen Erkennungsmöglichkeiten wie B-Lymphozyten (selbst gebildete

membranständige Antikörper) oder T-Lymphozyten (selbst gebildete

membranständige Antigenrezeptoren). und können deshalb alleine auch keine

Antigenstrukturen spezifisch erkennen. Werden die Typ I-Effektorzellen unspezifisch

aktiviert, z. B. durch die Komplementkomponenten C3a, C5a (auch als

Anaphylatoxine bezeichnet) oder durch eine Reihe von Medikamenten, so spricht

man von einer „allergoiden“ oder pseudoallergischen Reaktion.

Sollen die Typ I-Effektorzellen spezifisch gegen Antigenstrukturen (Epitope)

reagieren können, müssen sie zuvor mit Antikörpern ausgestattet werden, die diese

Epitope mit ausreichender Bindungsstärke (Affinität) erkennen. Um solche Antikörper

wirkungsvoll aufzunehmen, sind Mastzellen und Basophile mit Fc-Rezeptoren

ausgestattet, die besonders stark IgE-Ak (Fcε-Rezeptor I: FcεRI) aber auch

bestimmte IgG-Ak (Fcγ-Rezeptor II und III: FcγRII, FcγRIII) binden können. Unter

immunologischer „Sensibilisierung“ ist die Bindung geeigneter Ak-Isotypen an Fc-

Rezeptoren von Typ I-Effektorzellen zu verstehen. Erst dadurch werden diese Zellen

in die Lage versetzt, eine spezifische Typ I Immunreaktion auszulösen, die im

überschießenden Falle zu den Symptomen einer Typ I-„Allergie“ führt.

Werden beim Erstkontakt mit einem Antigen spezifische Antikörper dagegen

gebildet, so sind es stets zuerst Antikörper vom IgM Isotyp. Da die Typ I-

Effektorzellen keine geeigneten Fc-Rezeptoren für IgM ausbilden, eignen sich IgM-

Ak nicht als sensibilisierende Antikörper für Typ I-Immunreaktionen. Entwickelt ein

Individuum Antikörper mit gleicher Spezifität, jedoch anderen Isotypen als IgM, so hat

es zu diesem Isotypwechsel die Zytokinhilfe von T-Helferzellen in Anspruch

genommen. Wirken dabei überwiegend Zytokine (bevorzugt IL-4) von T-Helferzellen

2 (Th2) auf die Ak-produzierenden B-Lymphozyten ein, so werden sie vom nicht

sensibilisierenden IgM zu den sensibilisierenden Ig-Isotypen IgG4 (beim Menschen)

und IgE wechseln. Dominiert hingegen der Einfluss der T-Helferzelle 1 (Th1) mit


___________________________________________________________________________

19

ihrem Zytokin IFN-γ, so wird ein Wechsel zu sensibilisierenden Isotypen gehemmt,

aber dafür andere, nicht sensibilisierende Isotypen wie IgG1, 2 oder 3 (beim

Menschen) ausgebildet. Somit kann es gegen ein Antigen Antikörper mit gleicher

Epitopspezifität, jedoch unterschiedlichen, sensibilisierenden und nicht

sensibilisierenden Isotypen geben. Dies ist eine Ebene, die darüber entscheidet, ob

ein Individuum gegen ein bestimmtes Antigen Typ I allergisch wird oder nicht, denn

ohne eine ausreichende Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen kann sich keine

Typ I-Allergie entwickeln. Zu weiteren Mechanismen von Typ I-Immunreaktionen und

ihrer Regulation s. 2.1.2.

Es gibt Individuen, die gegen eine Reihe von Antigenen sensibilisiert sind und auf

diese vermehrt mit Typ I-Allergien reagieren. Dieses als Atopie bezeichnete

Krankheitsbild kann bei Hunden bestimmter Rassen häufiger auftreten (TIZARD

2004).

Verbreitete Beispiele für Typ I-Allergien sind die Flohallergie-Dermatitis bei Hund und

Katze, das Sommerekzem (Insektendermatitis) sowie die Pollenallergie bei Pferden

(eine Ursache des Headshakings) und bei Menschen (Heuschnupfen). Insgesamt

sind Typ I-Allergien gegen ein wachsendes Spektrum an Antigenen an einer

zunehmenden Zahl sehr unterschiedlicher Erkrankungen beteiligt.

An Typ II-Immunreaktionen sind als Effektorzellen Natürliche Killerzellen (NK-

Zellen) und Phagozyten (Makrophagen, Monozyten, neutrophile und eosinophile

Granulozyten) beteiligt. Sie sind sowohl mit Fc-Rezeptoren (FcγR I, II, III) für

aktivierte Fc-Teile mehrerer IgG-Isotypen als auch mit Rezeptoren (die

Komplementrezeptoren: CR1, CR3 & CR4) für die aktivierten bzw. inaktivierten C3

Komplementkomponenten C3b bzw. iC3b ausgestattet.

Sobald ein Antikörper, der durch seine spezifische Bindung an ein Epitop auf einer

Zelle, einem Gewebe oder einem Partikel (Zell- oder Gewebsfragment, Virus,

Bakterium, Parasit) seinen Fc-Teil „aktiviert“, d.h. so umstrukturiert, dass er nun

direkt und ausreichend stark an einen der Fc-Rezeptoren dieser Effektorzellen

binden kann, wird er zum „opsonisierenden“ Antikörper: Er markiert seine partikuläre

Zielstruktur für die Typ II Effektorzellen. Binden mindestens zwei opsonisierende


___________________________________________________________________________

20

Antikörper auf einem Partikel an zwei FcR einer Effektorzelle („bridging“), so kann

diese aktiviert werden. Dies führt entweder zur Phagozytose des opsonisierten

Partikels (durch Makro- oder Mikro-Phagen) oder zum Abtöten (zytotoxische

Aktivität) durch NK-Zellen in Form der ADCC (antibody dependent cellular

cytotoxicity = Ak-abhängige zelluläre Zytotoxizität) z. B. von opsonisierten

Tumorzellen. Sehr effizient tragen zu Typ II-Immunreaktionen auch IgM-Ak bei,

obwohl kaum eine dieser Effektorzellen dafür einen Fc-Rezeptor (FcµR) besitzt.

Bindet das meist als Pentamer im Serum vorkommende IgM spezifisch an ein

partikuläres Epitop, aktiviert es seine Fc-Teile und kann nun auf Grund seiner

Pentamerstruktur sehr effizient die Komplementkaskade klassisch aktivieren

(beginnend mit C1q), so dass seine aktivierten Fc-Teile sehr schnell mit C3b-

Molekülen umgeben sind. Damit wird IgM samt C3b zum „opsonisierenden“ Komplex

für das Partikel, auf dem das IgM ein oder mehrere Epitope spezifisch erkannt hat. Er

kann nun an Komplementrezeptoren auf den Typ II-Effektorzellen binden und sie -

bei ausreichendem „bridging“ - zur Phagozytose oder zur zytotoxischen Wirkung

aktivieren.

Sind keine Effektorzellen rechtzeitig am Ort der Opsonisierung (obwohl sie durch

Komplementspaltprodukte, insbesondere C5a, chemotaktisch herangelockt werden),

kann eine Komplementkaskade, ausgelöst durch die primäre spezifische Bindung

eines IgM oder eines komplementbindenden IgG-Isotyps, über C3 hinaus bis zum

Membran-attackierenden Komplex (MAC: C5b-C6-C7-C8-C9) ablaufen und intakte

Partikel (Zellen, Bakterien, Parasiten) dadurch so weit schädigen, dass sie inaktiviert

bzw. abgetötet werden (CDC: complement dependent cytotoxicity =

komplementabhängige Zytotoxizität). In der Frühphase einer Immunreaktion gegen

ein partikuläres Epitop, zu der noch keine oder zu wenige Antikörper gebildet

wurden, kann eine Typ II-Reaktion auch direkt von Komplementkomponenten

ausgelöst werden: Über den „Lektinweg“ oder den „alternativen“

Komplementaktivierungsweg können unspezifische Strukturen auf (meist

körperfremden) Partikel die Komplementkaskade auch ohne initiale Antikörper

auslösen und zu einer C3b- und C5a-vermittelten Aktivierung von Typ II

Effektorzellen oder zur CDC führen (JANEWAY et al. 2002; TIZARD 2004).


___________________________________________________________________________

21

Somit stehen dem Immunsystem mit den Mechanismen der Typ II-Reaktionen

flexible und vielseitige Möglichkeiten zur Kontrolle unerwünschter Zellen und

Gewebe, samt ihrer partikulären Fragmente und Eindringlinge von außen

(Fremdkörper, Viren, Bakterien, Parasiten) für eine permanente und

lebensnotwendige Immunüberwachung seines Organismus (Autoimmunität) zur

Verfügung.

Werden diese Typ II-Mechanismen vom Immunsystem zu nicht erwünschten

„überschießenden“ Reaktionen gegen intakte Zellen und deren Zerstörung

eingesetzt, z. B. gegen autologe Epitope auf intakte Erythrozyten oder intakten

Thrombozyten, so führt diese Autoaggression zur autoimmunhämolytischen Anämie

(AIHA, „primäre“ Anämie) oder autoimmunen Thrombopenie (AITP, „primäre“

Thrombopenie). Setzen sich jedoch auf den Erythrozyten bzw. Thrombozyten

körperfremde (xenogene) Strukturen wie Medikamente (z. B. Penicillin, Sulfonamide,

Chinine) oder Komponenten von Erregern (z. B. Bakterien) ab, gegen die das

Immunsystem Antikörper gebildet hat, so werden diese Zellen über art- und

körperfremde (xenogene) Epitope durch Antikörper und / oder Komplement zur

Phagozytose oder ADCC opsonisiert bzw. durch CDC zerstört. Dies sind Beispiele

einer Typ II-Allergie, die hier zur immunbedingten hämolytischen Anämie (IMHA,

„sekundäre“ Anämie) oder immunbedingten Thrombopenie (ITP, „sekundäre“

Thrombopenie) führen können. Abhängig davon, auf welchen Zellen oder Geweben

autologe Strukturen zu überschießenden Typ II-Autoaggressionsreaktionen oder

abgelagerte xenogene Strukturen zu überschießenden Typ II allergischen

Reaktionen führen, können sehr unterschiedliche Erkrankungsbilder entstehen.

Unter Typ III-Immunreaktionen werden Komponenten und Mechanismen

zusammengefasst, die in vielen Aspekten Typ II-Reaktionen entsprechen: Typ III-

Effektorzellen sind ebenfalls gekennzeichnet durch die konstitutive Expression von

Fcγ- bzw. Fcε-Rezeptoren und / oder Rezeptoren für die Komplementkomponenten

C3b bzw. C3a, C4a, C5a. Somit umfassen sie alle Typ II-Effektorzellen, erweitert um

Basophile, Thrombozyten, dendritische Zellen und B-Lymphozyten. Beteiligt können

alle Ak-Isotypen sein, für die entweder FcR vorhanden sind und / oder die nach


___________________________________________________________________________

22

Aktivierung durch Ag-Bindung Komplement aktivieren können. D. h. alle Ig-Isotypen,

mit Ausnahme des IgA, können sich wirkungsvoll an Typ III Immunreaktionen

beteiligen.

Diese bestehen darin, dass – im Gegensatz zu Typ II – nicht partikulär gebundene

Epitope, sondern Epitope auf löslichen Strukturen im Körper durch freie Antikörper

spezifisch gebunden werden. Diese primär löslichen Immunkomplexe können

sekundär mit den aktivierten Fc-Teilen ihrer Antikörper direkt an Typ III-Effektorzellen

mit geeigneten FcR andocken und diese zu einer Eliminationsreaktion, Auslösung

einer Entzündungsreaktion bzw. Induktion einer spezifischen Immunantwort

aktivieren. Teilweise ist das auch indirekt möglich, indem aktivierte Fc-Teile

komplementbindender Ak-Isotypen in solchen Immunkomplexen die klassische

Komplementkaskade aktivieren und so Zellen mit C3b-Rezeptoren aktivieren. Zum

Repertoire von Typ III-Immunreaktionen gehört zusätzlich, dass - meist xenogene -

lösliche Substanzen auch ohne vorherige Bindung durch Antikörper über den Lektin-

oder alternativen Weg das Komplementsystem aktivieren und so über Zellen mit

geeigneten Komplementrezeptoren eine Eliminations- oder Entzündungsreaktion

auslösen (JANEWAY et al. 2002; TIZARD 2004).

Treten „überschießende“ Typ III-Reaktionen gegen körpereigene lösliche Strukturen

auf, so kommt es zu Typ III-Autoaggressionsreaktionen wie beim Lupus

erythematodes oder bei rheumatoiden Erkrankungen mit Bildung von

Rheumafaktoren und vermehrt Immunkomplexen. Werden „überschießende“ Typ III-

Immunreaktionen gegen körperfremde lösliche Strukturen von physiologischer,

prophylaktischer oder therapeutischer Bedeutung entwickelt (z. B. schützende

allogene oder xenogene Antikörper in Form einer passiven Immunisierung), so

können diese eine Typ III Allergie bedingen. Sie kann nur lokal ausgeprägt sein

(Arthus-Reaktion) oder systemisch (Serumkrankheit). Bevor geeignete Antibiotika zur

Verfügung standen, wurde zur Therapie von lebensbedrohlichen bakteriellen

Infektionen des Menschen Antiserum von zuvor immunisierten Pferden eingesetzt,

welche gegen die Erreger Antikörper gebildet hatten. Dabei trat als Komplikation

sieben bis zehn Tage nach Behandlung mit dem Antiserum eine


___________________________________________________________________________

23

immunkomplexbedingte Überempfindlichkeitsreaktion mit Fieber, Vaskulitis,

Glomerulonephritis und Arthritis auf.

Während bei Immunreaktionen der Typen I, II und III eine spezifische

Epitoperkennung durch den Fab-Teil des Antikörpers erfolgt und alle nachfolgenden

Funktionen durch den Fc-Teil der Antikörper vermittelt werden, ist dies bei

Immunreaktionen der Typen IV oder V nicht der Fall: Bei Typ IV Immunreaktionen

sind Antikörper nicht beteiligt und bei Typ V spielt allein der Fab-Teil des Antikörpers

die funktionelle Rolle.

Obwohl bei den Typ IV-Immunreaktionen nur Zellen beteiligt sind, wird auch hier

ein Spektrum unterschiedlicher Immunmechanismen zusammengefasst. Ihnen ist

gemeinsam, dass sie lokal reagieren, mit begrenzter systemischer Auswirkung.

Abhängig vom Auslöser und den beteiligten Zellen können sich Typ IV-

Immunreaktionen innerhalb von 24 Stunden oder später entwickeln und über

mehrere Wochen anhalten. Zur Kontrolle bestimmter löslicher Substanzen, die selbst

chemotaktisch wirken oder die Freisetzung chemotaktischer Substanzen induzieren

(z. B. Hautdesinfektionsmittel, Pilz- oder Insektengifte) wandern lokal primär

basophile Granulozyten ein, bald gefolgt von Lymphozyten und Monozyten. Diese

Typ IV-Form wird auch als „Jones-Motes-Reaktion“ bezeichnet.

Bestimmte Antigene (wie Komponenten von Mykobakterien oder metallische

Haptene wie Nickel und Chrom auf körpereigenen oder körperfremden Proteinen als

Träger) werden von dendritischen Zellen aufgenommen und MHC-präsentiert.

Vorwiegend MHC-restringierte T-Helferzellen (CD4+), aber auch zytotoxische T-

Zellen (CD8+) werden dadurch aktiviert und so die Proliferation epitop- bzw.

haptenspezifischer Zellen ausgelöst. Diese Gedächtniszellen können bei erneutem

Auftreten „ihrer“ Epitope innerhalb von 24-72 h lokale Schwellungen in Form von

zellulären Papeln durch Einwanderung, Proliferation sowie mittels Chemokinen

angelockten Lymphozyten und Monozyten ausprägen. Diese Typ IV-Form wird als

Tuberkulin- bzw. Kontaktreaktion bezeichnet.


___________________________________________________________________________

24

Dauert die lokale „Reizung“ der T-Lymphozyten über längere Zeit an, so kann sich

eine als Granulomreaktion bezeichnete Typ IV-Form entwickeln. Sie hält über

Wochen an und ist durch Hinzukommen von Makrophagen, Riesenzellen sowie

Epithelzellen mit anschließender Fibrosierung gekennzeichnet.

Beispiele für Autoaggressionsreaktionen durch „überschießende“ Typ IV-

Mechanismen gegen autologe Epitope sind der insulinabhängige Diabetes mellitus

(zytotoxische T-Zellen gegen ß-Zellen des Pankreas), multiple Sklerose (CD4+ T-

Zellen gegen basisches Myelinprotein) sowie CD4+ T-Zellen gegen Autoantigene die

zur Progression der rheumatoiden Arthritis beitragen. „Überschießende“ Typ IV-

Mechanismen gegen ein weites Spektrum an körperfremden Strukturen wie

Bakterien, Pilze, Parasiten, Pflanzen und als Haptene wirksame chemische

Substanzen (Farbstoffe, Reinigungs- bzw. Desinfektionsmittel, Medikamente und

Repellentien) können zu Typ IV-Allergien führen. Überschießende Typ IV-Reaktionen

können auch bei der Spätform der FAD des Hundes von Bedeutung sein (TIZARD

2004).

Während bei Typ IV-Immunreaktionen die Zerstörung und Elimination von Zellen und

Substanzen im Vordergrund stehen, dominiert bei Typ V-Immunmechanismen die

regulative Wirkung im Sinne einer Ak-bedingten Stimulation oder Hemmung. Bildet

das Immunsystem Antikörper gegen Zelloberflächenrezeptoren, so können diese den

natürlichen Liganden imitieren. Sie aktivieren somit den Rezeptor, unterliegen jedoch

nicht der Feedback-Kontrolle wie der Ligand. So kann es zu einer überschießenden

Ak-bedingten Aktivierung der Rezeptoren für das Thyreoidea stimulierende Hormon

(TSH-R) der Schilddrüsenepithelzellen kommen. Diese produzieren daraufhin

überschießend viel Schilddrüsenhormone (T3, T4), was zur Hyperthyreose (Morbus

Basedow oder Grave´s disease) führen kann. Ein Beispiel für eine hemmende Typ V

Reaktion ist die Myasthenia gravis. Werden Antikörper gegen den

Acetylcholinrezeptor auf Muskelzellen gebildet, die die Anlagerung neurogenen

Acetylcholins blockieren, so kommt es zur schlaffen Muskellähmung, da eine

ausreichende neuromuskuläre Erregung unterbleibt. Am selben Rezeptor kann es

sogar zur Ak-bedingten Hemmung und Stimulation kommen, abhängig von der


___________________________________________________________________________

25

Bindungsstelle (Epitop) des Ak am Rezeptor: So können Antikörper gegen den

Insulinrezeptor derart binden, dass sie die Anlagerung von Insulin blockieren. In

Folge dessen wird keine Glucose in die Zellen aufgenommen und es entwickelt sich

das Bild eines insulinresistenten Diabetes mit Hyperglykämie und Ketoazidose.

Bindet der Antikörper jedoch an einem anderen Epitop desselben Rezeptors, so

imitiert er eine permanente Bindung von Insulin, stimuliert damit eine gesteigerte

Aufnahme von Glucose in die Zelle, was zu einer Hypoglykämie führt. (JANEWAY et

al. 2002)

Werden diese Antikörper direkt gegen autologe funktionsfähige Strukturen gebildet,

so wirken sie mit ihrer Hemmung oder Stimulation autoaggressiv. Sie stellen jedoch

eine Typ V-Allergie dar, wenn sie gegen körperfremde Strukturen (z. B. Epitope auf

Tollwutviren) induziert werden und anschließend gegen autologe Epitope

kreuzreagieren (z. B. mit dem Acteylcholinrezeptor) (JANEWAY et al. 2002).

2.1.2 Mechanismus der Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I

Die Effektorzellen der Typ I-Allergie, Basophile und Mastzellen, entwickeln sich aus

Knochenmarksstammzellen. Während Basophile bereits ausdifferenziert sind, wenn

sie das Knochenmark verlassen, treten Mastzellen im Blutkreislauf nur als

Vorläuferzellen auf, jedoch bereits mit zelltypischen Charakteristika (RODEWALD et

al. 1996). Die endgültige Differenzierung geschieht in der Peripherie (ENERBACK

1997). Basophile und Mastzellen binden freies IgE hochaffin an den Fcε-Rezeptor I

(FcεRI) (ISHIZAKA u. ISHIZAKA 1977). Frei im Serum befindliches IgE hat mit bis zu

zwei Tagen die kürzeste Halbwertszeit aller Antikörper-Isotypen. Das an FcεRI von

Basophilen und Mastzellen gebundene IgE ist über mehrere Wochen bis Monate

stabil. Die Anwesenheit von IgE im Serum fördert zusätzlich die Expression von

FcεRI auf Basophilen und Mastzellen und übt einen stabilisierenden Effekt auf den

Rezeptor aus (SAINI u. MACGLASHAN 2002; KITAURA et al. 2003; KUBO et al.

2003). Zudem konnte gezeigt werden, dass die Immunglobulin-Rezeptor-Komplexe

die Zelle in vitro vor Apoptose schützen (KAWAKAMI u. GALLI 2002). Werden


___________________________________________________________________________

26

mehrere membranständig gebundene spezifische IgE durch das entsprechende

Antigen quervernetzt (bridging), kommt es zu einer Zusammenlagerung der FcεRI

der Zelle. Dies ermöglicht die Phosphorylierung der in den γ-Ketten des FcεRI

befindlichen Immunorezeptor assoziierten tyrosinbasierten Aktivierungsmotive

(ITAMs) durch Protein-Tyrosinkinasen. Diese katalysieren die Phosphorylierung der

Phospholipase C-γ, die durch hydrolytische Spaltung die beiden second messenger

Inositoltrisphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) bildet, was zur Freisetzung von

intrazellulärem Ca2+ und der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) und schließlich

zur Degranulation der Mastzelle oder des Basophilen führt (KNOL 2006). Neben der

Aktivierung der Zelle induziert das bridging bei Mastzellen des Menschen auch die

Expression von Bfl-1, einem Survival-Gen, das die Lebensdauer der sensibilisierten

Zelle erhöht und somit zur Aufrechterhaltung der allergischen Reaktionsbereitschaft

beiträgt (XIANG et al. 2006).

Neben aktivierenden Fc-Rezeptoren (FcεRI, FcγR I, IIA & III) spielen inhibierende

FcR, wie die FcγRII-B1 und B2, wichtige regulatorische Rollen: Statt einer ITAM-

Sequenz ist ihr zytoplasmatischer Teil mit einem Immunorezeptor-assoziierten

tyrosinbasierten Inhibierungsmotiv an Aminosäuren (ITIM) ausgestattet. Findet eine

antigenbedingte Quervernetzung von einem aktivierenden FcεRI (vermittelt durch

membranständiges IgE) mit einem inhibierenden FcγRII-B (vermittelt durch ein IgG)

statt, so kommt es nicht zu einer Aktivierung der Typ I Effektorzellen, keiner

Mediatorfreisetzung und somit auch nicht zu einer Typ I Immun- oder

Allergiereaktion, obwohl die Zelle mit antigenspezifischem IgE sensibilisiert ist. Dies

könnte einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Zukunft darstellen (GALLI et

al. 2005).

Neben dem auf Basophilen und Mastzellen exprimierten, hochaffinen Fcε-Rezeptor I

existiert auf B-Zellen ein weiterer, als CD23 oder Fcε-Rezeptor II bezeichneter

Ligand für IgE, der regulatorisch auf die IgE-Produktion wirkt, indem er IgE mit

niedriger Affinität bindet. Es konnte gezeigt werden, dass Mäuse, denen CD23 fehlt,

deutlich höhere IgE-Titer gegen ein spezifisches Antigen bilden als solche mit

normaler CD23-Expression (YU et al. 1994).


___________________________________________________________________________

27

Das Vorhandensein von freiem IgE, einem der sensibilisierenden Ak-Isotypen, im

Serum ist bei weitem nicht ausreichend für eine Aussage, ob das von dem IgE-Ak

erkannte Antigen (z. B. in einem diagnostischen ELISA-Verfahren) zu einer Allergie

gegen dieses Antigen führt. Dazu sind eine Reihe weiterer Voraussetzungen

erforderlich:

• Eine ausreichende Anzahl an Basophilen und / oder Mastzellen, die mit

spezifischen Antikörpern gegen ein Antigen sensibilisiert sind;

• Eine ausreichende Dichte an sensibilisierenden Antikörpern pro Typ I

Effektorzelle, damit ein „bridging“ durch ein Antigen erfolgen kann;

• Eine überwiegende Sensibilisierung von aktivierenden Fc-Rezeptoren mit

spezifischen Antikörpern gegen ein Antigen pro Effektorzelle.

Erst wenn diese Voraussetzungen in Form einer „funktionellen Sensibilisierung“

gegeben sind, kann es zu einer wirkungsvollen Aktivierung von Typ I-Effektorzellen

kommen. Erst dann werden bei Antigenkontakt präformierte und in Granula

gespeicherte Entzündungsmediatoren (Histamin, Heparin, Serotonin, TNF-α) und

Enzyme (Chymase, Tryptase, Carboxypeptidase und Cathepsin) kurzfristig

freigesetzt. Gleichzeitig wird die Neubildung wichtiger Mediatoren induziert. Hierzu

zählen Arachidonsäuremetaboliten, vor allem die Leukotriene B4 und C4 sowie

Prostaglandine D2 und E2, aber auch Chemokine wie CCL3 und Cytokine wie TNF-α,

GM-CSF, IL-3, IL-5 sowie insbesondere IL-4 und IL-13. Letztere wirken verzögert, so

dass sich eine Typ I Immunreaktion von wenigen Minuten (Sofortreaktion) bis zu 24 h

hinziehen kann (Spätreaktionen), abhängig von den beteiligten Mediatoren. Eine

funktionelle Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen ist eine unabdingbare

Voraussetzung zur Entwicklung einer Typ I-Allergie. Sie allein löst jedoch nicht

zwingend – auch in Anwesenheit des „passenden“ Antigens - eine klinische

Symptomatik aus. Ohne funktionelle Sensibilisierung gegen ein spezifisches Antigen

ist die Auslösung Typ I allergischer Symptome durch dieses Antigen sicher

auszuschließen.


___________________________________________________________________________

28

2.1.3 Arthropoden als Auslöser von Typ I-Immunantwo rten

Hämatophagen Insekten kommt in der Veterinärmedizin eine große Bedeutung als

Verursacher von Typ I-Allergien zu. Bei der Blutmahlzeit werden

Speichelkomponenten injiziert, gegen die der Wirt sensibilisierende Antikörper

entwickeln kann.

Flöhe

Von den mehr als 2000 Arten der Ordnung Siphonaptera ist der Katzenfloh

(Ctenocephalides felis felis, Bouché 1835) bei Hund und Katze am weitesten

verbreitet. In mehreren Studien (REEDY et al. 1997) wurde gezeigt, dass im Speichel

des Katzenflohs Antigene Komponenten enthalten sind, die bei befallenen Tieren

eine Sensibilisierung auslösen können. Sensibilisierte Tiere können eine

Flohallergie-Dermatitis (FAD) entwickeln, die durch Juckreiz, Alopezie und

papulokrustöse Hautveränderungen gekennzeichnet ist. Im Intrakutantest kann die

Injektion eines Antigenextraktes aus ganzen Flöhen oder deren Speicheldrüsen bei

sensibilisierten Tieren eine Typ I-Reaktion der Haut auslösen (2.3) .

Milben

Die Ohrmilbe Otodectes cynotis verursacht bei der Katze und seltener auch beim

Hund die sogenannte Ohrräude. Sie ernährt sich von Lymphe und Blut ihres Wirtes.

Ein Otodectes-Befall kann symptomlos bleiben, in einigen Fällen aber auch zu einer

pruriginösen Otitis mit Exsudatbildung führen. Bei Katzen, die von O. cynotis

parasitiert wurden, konnten spezifische Antikörper nachgewiesen und im

Intrakutantest eine Typ I-Reaktion auf einen Otodectes-Extrakt gezeigt werden

(POWELL et al. 1980).


___________________________________________________________________________

29

Mücken

Mücken verursachen bei Pferden eine weltweit verbreitete, saisonal auftretende

Dermatitis, die als Sommerekzem, Queensland itch, sweet itch oder kasen bekannt

ist. Sie ist durch intensiven Juckreiz charakterisiert, in dessen Folge es zu

selbstinduzierten Hautläsionen kommt, die primär an der ventralen Körperseite,

Mähne und Schweif auftreten (ANDERSON et al. 1988). Mithilfe von Intrakutan- und

in vitro-Tests konnten neben anderen saugenden Insekten oft verschiedene

Culicoides-Arten als Hauptverursacher des Sommerekzems identifiziert werden,

deren Antigene zu Typ I-Reaktionen bei betroffenen Tieren führten (FADOK u.

GREINER 1990; ANDERSON et al. 1993; KAUL 1998) Inwieweit Mücken an der

Genese von Typ I-Allergien bei Hund und Katze beteiligt sind, ist wenig erforscht.

MASON und EVANS (1991) berichten über Katzen, die Symptome einer saisonalen

Form des eosinophilen Granuloms zeigten. Zwei von vier untersuchten Tieren

reagierten im Intrakutantest auf Antigene aus einem Mückenextrakt positiv.

Zecken

Bei Hunden und Meerschweinchen sind Typ I- Überempfindlichkeitsreaktionen gegen

einen Antigenextrakt der braunen Hundezecke Rhipicephalus sanguineus (Latreille,

1806) bekannt (SZABO et al. 1995). Anders als die Hunde entwickelten die

Meerschweinchen nach 24 Stunden zusätzlich eine deutliche Reaktion vom

verzögerten Typ, was bei der Immunantwort auf Zeckenbefall der entscheidende

Mechanismus der Resistenzentwicklung ist. Auch bei Rindern sind Typ I-Reaktionen

gegen Zecken nachgewiesen worden. Vorsensibilisierte Tiere zeigten eine Typ I-

Reaktion der Haut nach intrakutaner Applikation eines Extraktes von Rhipicephalus

appendiculatus (BINTA u. CUNNINGHAM 1984).


___________________________________________________________________________

30

2.2 Allergiediagnostik

Die Bezeichnung „Allergietest“ im Sinne des Wortes ist mit Ausnahme des in vivo

Provokationstests für alle heute verfügbaren Testverfahren irreführend, da sie

bestenfalls eine Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen erfassen oder freie

Antikörper gegen verdächtige Antigene oder Epitope nachweisen. Allergietests

sollten aus diesem Grund nicht als Screeningmethode an einem an Pruritus

leidenden Patienten eingesetzt werden (DEBOER u. HILLIER 2001a). Eine Allergie

als Ursache bestimmter klinischer Symptome wird häufig im Ausschlussverfahren

und unter Einbeziehung eines „Allergietests“ diagnostiziert. Falls Antigene als

Ursache für ein Krankheitsbild im Verdacht sind, sollte zunächst gegen bakterielle

Sekundärinfektionen und Parasitenbefall behandelt werden. Ein weiteres

Ausschlusskriterium ist das Füttern einer Eliminationsdiät über mindestens zwei

Monate. Bei Besserung der Symptome kann die verdächtige Futterkomponente

erneut angeboten werden (Provokationstest), um die Diagnose abzusichern (NOLI

2006).

Die zur Diagnostik der Typ I-Allergie zur Verfügung stehenden Testverfahren können

grob unterteilt werden in in vivo und in vitro-Methoden.

In vivo durchgeführte Tests basieren auf der Exposition des Patienten mit dem

verdächtigen Antigen und erfordern in der Veterinärmedizin oft eine Sedierung oder

Narkose des zu untersuchenden Tieres. Zur Diagnosestellung ist die Auslösung

allergischer Symptome am Patienten erforderlich, weshalb diese Verfahren eine

größere Belastung darstellen als in vitro Tests, für deren Durchführung nur eine

Blutprobe benötigt wird.


___________________________________________________________________________

31

2.2.1 In vivo-Verfahren

2.2.1.1 Intrakutantest

Beim Intrakutantest wird eine definierte Menge Antigen intradermal appliziert und zu

unterschiedlichen Zeiten danach die Reaktion der Mastzellen der Haut anhand des

Durchmessers der sich bildenden Quaddel abgelesen.

Wichtig für die diagnostische Aussage des Intrakutantests ist die Verwendung von

Antigenen und Kontrollsubstanzen (Lösungsmittel, Histamin) in

Konzentrationsstufen, in denen eine Hautreaktion auf eine Testsubstanz eindeutig

als Typ I-Reaktion erkannt werden kann. Liegt die Konzentration der Testsubstanz

über dieser sogenannten Schwellenkonzentration, ist eine positive Reaktion auf eine

unspezifische Irritation an der Injektionsstelle zurückzuführen. AUSTEL et al. (2006)

definierten Schwellenkonzentrationen für 48 verschiedene Antigenpräparationen und

Histamin, wobei jedes Antigen in vier Konzentrationsstufen an gesunden Katzen

getestet wurde. Die diagnostische Aussagekraft einer positiven Reaktion auf ein

Arthropodenantigen in einer definierten Konzentrationsstufe kann nach WILLIS et al.

(1996) nur bestimmt werden, wenn die Prävalenz positiver Reagenten bei gesunden

Tieren bekannt ist.

Sowohl in der Veterinär- wie in der Humanmedizin werden Fälle beschrieben, in

denen klinisch unauffällige Probanden auf das entsprechende Antigen eine positive

Reaktion im Intrakutantest zeigten (LINDBLAD u. FARR 1961; CODNER u.

LESSARD 1993). In einer Untersuchung an 65 Hunden, die an Atopie litten,

reagierten 58 positiv auf Antigene von Dermatophagoides farinae, wobei jedoch in

der Kontrollgruppe 22 von 24 Tieren ebenfalls ein positives Ergebnis zeigten (LIAN u.

HALLIWELL 1998).

KRISTENSEN und KIEFFER (1978) verglichen klinische und histologische Befunde

sowie das Vorhandensein von Flohbefall und Eosinophilie bei 143 Hunden und

Katzen, die an pruriginöser Dermatitis litten und testeten die Tiere im Intrakutantest

auf Flohantigen. Sie folgerten, dass die Spezifität des Intrakutantests dessen Einsatz


___________________________________________________________________________

32

bei Verdacht auf Flohallergie rechtfertigt. COLOMBINI et al. (2001) konnten

unterdessen keine Korrelation zwischen klinischer Symptomatik und

Intrakutantestergebnissen feststellen.

Weitere Studien verschiedener Arbeitsgruppen an atopischen Hunden, deren

Reaktionsverhalten auf Pollenextrakte und andere Umweltallergene von

Schimmelpilzen und Hausstaubmilben im Intrakutantest ermittelt wurde, erbrachten

sehr unterschiedliche Ergebnisse in der Prävalenz positiver Reaktionen, die nicht

ausschließlich durch biologische Variation erklärbar sind (HILL u. DEBOER 2001).

Obwohl dies teilweise auf geographische Besonderheiten im Antigenspektrum

zurückzuführen ist, fehlen dennoch standardisierte Verfahren und entsprechende

Antigenextrakte, welche zur Verbesserung von Sensitivität und Spezifität des

Intrakutantests beitragen könnten (DEBOER u. HILLIER 2001b). Ein entsprechender

Grad an Standardisierung könnte den Nutzen des Intrakutantests als quantitatives

Verfahren deutlich erhöhen (NORMAN et al. 1973).

2.2.2 In vitro-Verfahren

2.2.2.1 Serologische Tests (ELISA)

Diese Methoden basieren auf der Detektion von allergenspezifischen freien IgE-

Antikörpern im Serum. Dabei wird Patientenserum mit an eine feste Phase

gebundenem Testantigen inkubiert, so dass sich gebundene Antigen-Antikörper-

Komplexe bilden. Nicht reagierende Antikörper werden weggewaschen und die

Menge an Antigen-Antikörper-Komplexen mithilfe eines möglichst für IgE

spezifischen Bindungspartners (Anti-IgE-Antikörper oder FcεRIα-Kette) quantifiziert,

an den je nach Testverfahren fluoreszierende Farbstoffe, radioaktive Substanzen

oder Enzyme gekoppelt sind. Die Höhe der Farbintensität, Radioaktivität oder die

Menge an enzymatisch umgesetztem Substrat entspricht der Serumkonzentration

der antigenspezifischen Antikörper. Werden für die Detektion dieser Antikörper Anti-


___________________________________________________________________________

33

IgE-Ak verwendet, kann es zu Kreuzkompetition mit Antikörpern anderen Isotyps

ohne klinische Relevanz kommen, wenn die Spezifität dieser Antikörper

unzureichend ist, weil Kreuzreaktionen gegen andere Isotypen ggf. über leichte Ig-

Ketten vorkommen können. LORCH et al. (2001) zeigten in einer Untersuchung an

Pferden, dass die Befunde eines ELISA, der sensibilisierende Antikörper mit Hilfe der

α-Untereinheit des Fcε-Rezeptor I detektiert, eine höhere Übereinstimmung mit den

klinischen Befunden aufwies als ein ELISA auf Basis von Anti-IgE-Antikörpern.

Insgesamt waren jedoch die serologischen Untersuchungsverfahren einem simultan

durchgeführten Intrakutantest unterlegen.

Die erste beschriebene Anwendung in der Kleintiermedizin diente der

Immundiagnostik der atopischen Dermatitis des Hundes (HALLIWELL u. KUNKLE

1978). Eine vergleichende Untersuchung mit drei ELISA-basierten Tests an

gesunden und atopischen Hunden ergab eine sehr geringe Spezifität dieser

Verfahren. Die Autoren zweifelten deren Nutzen für die Diagnostik der Atopie beim

Hund daher an (BOND et al. 1994). Auch bei Hunden mit Flohallergie war der

Median der im ELISA gemessenen spezifischen IgE-Antikörper gegen Flohantigen

nicht signifikant höher als bei nicht allergischen Tieren. Verglichen mit gleichzeitig

durchgeführten Intrakutantests zeigte sich keine signifikante Übereinstimmung

(CODNER u. LESSARD 1993). Die Serumspiegel von allergenspezifischem IgE bei

Katzen korrelierten ebenfalls nicht mit einem Intrakutantest (GILBERT u.

HALLIWELL 1998). In einer Verlaufsstudie zur Flohallergie bei Katzen war zwischen

klinischen Symptomen und den Ergebnissen eines Fcε-Rezeptor-basierten Assays

statistisch kein Zusammenhang erkennbar (COLOMBINI et al. 2001).


___________________________________________________________________________

34

2.2.2.2 Zellbasierte Tests

Während die vorher beschriebenen in vitro Verfahren frei im Serum befindliche

Antikörper detektieren, werden bei zellbasierten Tests Mediatoren bestimmt, die von

Zellen durch Stimulation mit dem Testantigen freigesetzt werden. Im Gegensatz zu

serologischen Tests berücksichtigen zellbasierte Tests nur Antikörper, die auf den

Effektorzellen gebunden und an der Freisetzung der Mediatoren beteiligt sind.

Funktioneller in vitro Test zum Nachweis der Typ I-Sensibilisierung von

Basophilen (FIT)

Der von KAUL (1998) zur Diagnostik von Typ I Allergien beim Pferd entwickelte FIT

basiert auf der Messung von Histamin, welches im Blut unter den hier gewählten

Bedingungen nur von Basophilen freigesetzt wird. Der Test wird mit gewaschenem

Vollblut durchgeführt, so dass freie Antikörper weitgehend entfernt sind und nur auf

den Effektorzellen gebundene, sensibilisierende Antikörper an der Reaktion

teilnehmen. Anschließend erfolgt eine Provokation der mit spezifischen Antikörpern

besetzten Effektorzellen mit Testantigenen über 60 Minuten. Liegt eine funktionelle

Sensibilisierung gegen ein Testantigen vor, kann dies anhand der Höhe der

Histaminfreisetzung festgestellt werden. Setzt man das Antigen in mehreren

Konzentrationsstufen ein, kann die funktionelle Sensibilisierung zudem graduell

quantitativ bewertet werden. Das Verfahren wurde inzwischen auch für die Katze

etabliert (STUKE 2005). Die Befunde des FIT korrelierten in der Untersuchung von

STUKE (2005) weitgehend mit einem Intrakutantest jedoch nicht mit einem FcεRIα-

ELISA.


___________________________________________________________________________

35

Indirekter Histaminfreisetzungstest

Der indirekte Histaminfreisetzungstest ist eine Kombination aus serologischem und

zellbasiertem Test. Dabei werden humane oder equine, nicht vom Patienten

stammende Basophile mit Antikörpern aus dem Patientenserum inkubiert und mit

Antigen stimuliert. Anschließend wird, analog zum Prinzip der direkten Tests wie dem

FIT, die freigesetzte Histaminmenge gemessen. Die diagnostische Relevanz dieses

Tests ist ähnlich wie bei den serologischen Tests fraglich (PRÉLAUD u. GILBERT

2000), da er keine Aussage über die individuelle Reaktionsbereitschaft der

Effektorzellen des zu untersuchenden Probanden erlaubt.

Cellular Allergen Stimulation Test (CAST)

Der CAST wurde von DE WECK et al. (1993) eingeführt. Anders als beim FIT, bei

dem selektiv der gespeicherte Basophilenmediator Histamin als Reaktionsparameter

dient, wird beim CAST die Freisetzung von Sulphidoleukotrienen (sLT) gemessen.

Vor der eigentlichen Antigenprovokation erfolgt eine Vorstimulation der Zellen mit IL-

3. Sulphidoleukotriene sind im Gegensatz zu Histamin, das in präformierten,

intrazellulären Granula gespeichert vorliegt, neu synthetisierte Mediatoren. Die

Korrelation von CAST und klinischer Symptomatik unterscheidet sich je nach

Allergieform und Antigen. Die Ergebnisse von Histamin Release Tests und CAST

korrelieren relativ gut, während Intrakutantest und CAST eine geringere Korrelation

aufweisen (r=0,4-0,6) (DE WECK u. SANZ 2004). Allerdings ist zu beachten, dass

Sulphidoleukotriene außer von Typ I-Effektorzellen auch von anderen Immunzellen

des Blutes wie Monozyten, eosinophilen und neutrophilen Granulozyten freigesetzt

werden können, die mit einer Typ I-Allergie wenig zu tun haben. Im Gegensatz dazu

stellt Histamin einen für die Effektorzellen der Typ I Immunreaktionen (Basophile und

Mastzellen) spezifischen Mediator dar (TIZARD 2004).


___________________________________________________________________________

36

2.3 Flohallergie-Dermatitis

2.3.1 Allgemeines

Zur Ordnung der Flöhe (Siphonaptera) gehören mehr als 2000 weltweit verbreitete

Arten und Unterarten (REEDY et al. 1997). Die am häufigsten bei Hund und Katze

gefundene Spezies ist der Katzenfloh, Ctenocephalides felis felis (C. felis) (Bouché

1835), wie Studien in Europa und Nordamerika zeigten (HARMAN et al. 1987;

VISSER et al. 2001; AKUCEWICH et al. 2002; RINALDI et al. 2007). In Neuseeland

war der Hundefloh, C. canis bei Hunden häufiger anzutreffen als C. felis (GUZMAN

1984). Neben C. felis als Hauptverursacher der Flohallergie-Dermatitis (FAD) werden

gelegentlich auch C. canis, Archaeopsylla erinacei, Xenopsylla cheopsis, Pulex

irritans sowie Echidnophaga gallinacea auf Hunden und Katzen gefunden.

Obwohl von Juni bis September auf der nördlichen Hemisphäre höhere Prävalenzen

an Flohbefall beobachtet werden, sind jahreszeitliche Schwankungen ansonsten

wenig ausgeprägt vorhanden (AKUCEWICH et al. 2002; BECK et al. 2006; RINALDI

et al. 2007). Dies ist in gemäßigten Klimazonen auf die eng mit dem Menschen

verbundene Lebensweise von als Haustier gehaltenen Hunden und Katzen

zurückzuführen. BECK et al. (2006) konnten auch bei Hunden und Katzen aus

ländlichen oder städtischen Umgebungen in Deutschland keine regionalen

Unterschiede in den Befallsprävalenzen feststellen.


___________________________________________________________________________

37

2.3.2 Biologie des Katzenflohs, Ctenocephalides felis felis

Der Katzenfloh (C. felis) zeigt keine Wirtsspezifität und wird auf vielen Wild- und

Haustierspezies gefunden. Adulte Katzenflöhe haben eine permanente Lebensweise

auf ihrem Wirt entwickelt. Die Lebensdauer auf dem Wirt beträgt mindestens 113

Tage (DRYDEN 1989), wobei diese durch Elimination der Flöhe bei der Fellpflege

eingeschränkt wird. Die im Fell der Tiere präsenten Flöhe stellen etwa ein Prozent

der gesamten Flohpopulation aus Eiern, Larven und Puppen in der Umgebung sowie

Adulten auf dem Tier dar. Die Bedeutung der Wirt-zu-Wirt-Übertragung von adulten

Katzenflöhen ist geringer als die Neu- oder Reinfestation aus der Umgebung durch

frisch aus Puppen geschlüpfte Exemplare. In einer von BECK (2007) durchgeführten

Studie, in der die Übertragung von mit durchschnittlich 43 Flöhen infestierten Katzen

auf nicht infestierte Tiere untersucht wurde, konnten auf den nicht befallenen Tieren

nach drei bis neun Tagen durchschnittlich zwei Flöhe gefunden werden. Als

hämatophage Insekten sind die Weibchen im adulten Stadium auf Blutmahlzeiten zur

Fortpflanzung angewiesen (REEDY et al. 1997; HSU u. WU 2001). Nach

CADIERGUES (2000) saugen nahezu alle Flöhe innerhalb der ersten Stunde nach

Wirtsfindung Blut. Die Eiablage erfolgt ca. 24-48 h nach der Blutmahlzeit auf dem

Wirt, wobei ein Weibchen täglich im Durchschnitt ca. 27 und maximal bis ca. 50 Eier

legt. Nachdem die Eier vom Wirt abfallen, entwickeln sich die Larven in der

Umgebung. Ruhe- und Schlafplätze des Tieres sind dabei besonders betroffen,

Teppiche stellen ebenfalls ein geeignetes Mikrohabitat dar. Die Entwicklungsdauer

der Eier wird maßgeblich durch die klimatischen Bedingungen beeinflusst. Bei einer

relativen Feuchte von über 50% und 16 bis 27 °C Umg ebungstemperatur entwickeln

sich ca. 70-100% der Eier in ein bis sechs Tagen zu Larven (SILVERMAN et al.

1981).

Die larvale Entwicklung verläuft über drei Stadien, die Nahrung in Form von den

Adulten ausgeschiedenem Kot (verdautes Blut) benötigen. Die Dauer der

Entwicklung beträgt abhängig von Umgebungstemperatur, Luftfeuchtigkeit und

Nahrungsangebot acht bis 34 Tage (SILVERMAN et al. 1981). Nach der Verpuppung


___________________________________________________________________________

38

verlassen die Imagines nach fünf Tagen den Kokon, können unter ungünstigen

Umweltbedingungen jedoch bis zu 140 Tage überdauern (REEDY et al. 1997).

2.3.3 Ätiologie und Pathogenese der FAD

Die Flohallergie-Dermatitis ist die klinische Manifestation einer

Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I gegen den Speichel, den der Floh beim

Saugakt in die Wunde injiziert. Flohspeichel ist ein Gemisch aus Peptiden,

Aminosäuren, aromatischen Verbindungen, Phosphor und fluoreszierenden Stoffen

(YOUNG et al. 1963) und besitzt gerinnungshemmende Eigenschaften. Während

Experimente der Arbeitsgruppe um MICHAELI (1966) an Meerschweinchen ein an

Kollagen gebundenes Hapten als Antigen identifizierten, ergaben neuere Versuche,

dass der Flohspeichel komplette Antigene in Form von Proteinen enthält (GREENE

et al. 1993). In Untersuchungen mit aus dem Speichel chromatographisch

aufgetrennten Proteinfraktionen konnte nach intrakutaner Injektion bei Hunden, die

vorher mit Flöhen infestiert wurden, eine Überempfindlichkeitsreaktion ausgelöst

werden (LEE et al. 1999). Dabei reagierten die Hunde auf Proteine mit

Molekülmassen von 12 bzw. 40 kDa besonders empfindlich. MCDERMOTT et al.

(2000) identifizierten, klonierten und charakterisierten mit dem 18 kDa großen Cte f 1

Protein ein Flohspeichelantigen, welches bei flohallergischen Hunden eine

Überempfindlichkeitsreaktion auslöste.

Mithilfe einer zweidimensionalen gelelektrophoretischen Auftrennung von

Flohspeichel und anschließendem Immunoblot konnte NADLER (2001) 38

unterschiedliche Proteinfraktionen mit Molekulargewichten zwischen 21,5 und 95

kDa identifizieren, gegen die an FAD erkrankte Katzen Antikörper gebildet hatten.


___________________________________________________________________________

39

2.3.4 Diagnostik

Eine gründliche Anamnese ist für die Diagnosestellung der FAD außerordentlich

wichtig. Tiere, die mit der betroffenen Katze Kontakt haben, können zu einer

Reinfestation des allergischen Tieres führen und somit den Krankheitsverlauf negativ

beeinflussen. Die klinischen Symptome einer Flohallergie-Dermatitis bei der Katze

richten sich nach dem Grad der Sensibilisierung, der Befallsintensität und

möglicherweise vorhandenen sekundären Hauterkrankungen (DRYDEN u.

BLAKEMORE 1989). Sie reichen von geringgradigem bis schwerem Juckreiz über

Erytheme, Haarausfall bis zu papulokrustösen Veränderungen. Darüber hinaus wird

bei der Katze im Zusammenhang mit FAD häufig eine miliare Dermatitis beobachtet,

die mit eosinophilen Plaques einhergehen kann (GROSS et al. 1986). Hautbioptate,

die histologisch eine perivaskuläre Dermatitis und Infiltrationen von eosinophilen

Granulozyten zeigen, sind weitere Hinweise auf FAD. Obwohl FAD bei der Katze die

häufigste Ursache für eine miliare Dermatitis ist, sind differentialdiagnostisch auch

ein Befall mit Raubmilben (Cheyletiella), durch Notoedres cati verursachte Kopfräude

der Katze, Arzneimittelallergie, Futtermittelallergie und Dermatophytose zu beachten

(DRYDEN u. BLAKEMORE 1989; REEDY et al. 1997).

Die größte Wahrscheinlichkeit, Flöhe auf dem betroffenen Tier zu finden, ist im Kopf-

und Nackenbereich sowie entlang der Rückenlinie (HSU et al. 2002). An Schwanz

und Extremitäten sowie am ventralen Rumpf konnten deutlich weniger Flöhe

gefunden werden. Bei einem hochgradig sensibilisierten Tier sind aufgrund

vermehrter Fellpflege jedoch oftmals keine adulten Flöhe auffindbar, so dass nach

schwarzem Flohkot gesucht werden sollte, der auf einem feuchten Papier verteilt,

rote bis bräunliche Flecken hinterlässt (REEDY et al. 1997).

Zur Sicherung der Diagnose kann die funktionelle Sensibilisierung eines Tieres

gegen Antigene von C. felis mithilfe eines Allergietests wie Intrakutantest (2.2.1.1)

(REEDY et al. 1997) oder funktionellem in vitro-Test (2.2.2.2) (STUKE et al. 2003)

ermittelt werden. Im Intrakutantest wird die Reaktionsbereitschaft von Mastzellen in

der Haut geprüft, während der FIT prüft, ob eine funktionelle Sensibilisierung der

Basophilen vorliegt. Mehrere Autoren weisen darauf hin, dass ein positiver


___________________________________________________________________________

40

Intrakutantest nicht in direktem Zusammenhang mit den klinischen Symptomen

stehen muss und ein negatives Testergebnis eine FAD nicht ausschließt (DRYDEN

u. BLAKEMORE 1989; REEDY et al. 1997; HILLIER u. DEBOER 2001). Die

Aussagekraft von Allergietests alleine ist nicht ausreichend, um eine Flohallergie-

Dermatitis zu diagnostizieren, da z.B. der Intrakutantest eine eventuell bestehende

Sensibilisierung, nicht aber eine Allergie nachweist (2.2). Außerdem bestehen teils

erhebliche Unterschiede in den Testverfahren hinsichtlich der Korrelation von

klinischen Symptomen und Testbefund. Eine Untersuchung von LAFFORT-DASSOT

et al. (2004) zeigte eine insgesamt höhere Sensitivität und Spezifität des

Intrakutantests gegenüber einem FcεRI-basierten serologischen Testverfahren.

Allerdings variierten Sensitivität und Spezifität des Intrakutantest je nach Art und

Herkunft der eingesetzten Antigenpräparation. Neben zwei Ganzflohextrakten

wurden Flohspeichel und das rekombinante Speichelallergen Cte f 1 miteinander

verglichen, wobei Cte f 1 die niedrigste und die Flohspeichelpräparation die höchste

Sensitivität aufwies.

2.3.5 Therapie und Parasitenbekämpfung

Die Behandlung einer allergisch bedingten Hauterkrankung wie FAD kann auf

verschiedene Arten erfolgen. Der symptomatische Ansatz verfolgt die Linderung von

allergischem Juckreiz und Entzündungserscheinungen. Hierfür sind Kortikosteroide

indiziert, deren Wirkung auf die Dauer der Behandlung beschränkt ist, da sie nicht

die Ursache der Erkrankung bekämpfen, sondern nur die symptomauslösende

Reaktionen abschwächen oder unterdrücken. Eine Kurzzeitbehandlung kann nützlich

sein, sofern keine bakteriellen Sekundärinfektionen vorliegen (CARLOTTI u.

JACOBS 2000; UNGEMACH 2002b). Der ätiologische oder kausale Therapieansatz

hat die Beseitigung der Ursache zum Ziel. Dies kann bei der FAD durch

Immuntherapie oder Elimination des Flohbefalls geschehen. In doppelt blinden

Studien an Hunden (HALLIWELL 1993) und Katzen (KUNKLE u. MILCARSKY 1985)

konnte durch intra- oder subkutane Injektion von Flohantigen keine


___________________________________________________________________________

41

Desensibilisierung induziert werden. PATERSON (2000) hält den Nutzen einer

„spezifischen Immuntherapie“ (SIT) im Sinne einer Hypo- oder Desensibilisierung bei

FAD für fraglich. Die wichtigste Behandlungsstrategie bleibt daher vorerst die

Flohbekämpfung (DRYDEN u. BLAKEMORE 1989; REEDY et al. 1997; CARLOTTI

u. JACOBS 2000; RUST 2005).

2.3.5.1 Antiparasitäre Behandlung der Umgebung

Neben auf dem Wirt anzutreffenden, adulten Katzenflöhen repräsentieren die

Entwicklungsstadien von C. felis den Großteil der Flohpopulation (2.3.2). Da die

Entwicklung des Katzenflohs in der Umgebung des Wirts stattfindet, kann es sinnvoll

sein, dies bei der Bekämpfung der Infestation zu berücksichtigen. Zur

Umgebungsbehandlung stehen sowohl Wirkstoffe zur Verfügung, die auch zur

Anwendung auf dem Tier zugelassen sind, als auch solche, mit denen das Tier nicht

in Kontakt kommen darf.

Für einige der unter 2.3.5.2 genannten Wirkstoffe konnte jedoch gezeigt werden,

dass auch eine alleinige topische Applikation ausreichend ist, um Flohstadien, die

sich in der Umgebung des Tieres befinden, zu eliminieren (DRYDEN et al. 1999;

BENCHAOUI et al. 2000; JACOBS et al. 2001b)

2.3.5.2 Antiparasitäre Behandlung des Tieres

Zur Bekämpfung des Flohbefalls bei Hund und Katze steht eine sehr große Auswahl

an Präparaten mit unterschiedlichen Wirkmechanismen zur Verfügung. Die Vielzahl

der Anwendungsformen reicht von Injektionslösungen und oralen

Darreichungsformen wie Tabletten oder Suspensionen über Spot-ons und Sprays bis

hin zu Shampoos, Lotions und Halsbändern. Der jeweilige Einzelfall sollte im

Gespräch mit dem Besitzer genau analysiert werden, bevor das geeignete


___________________________________________________________________________

42

Antiparasitikum ausgewählt wird. Ein entscheidender Faktor für den

Behandlungserfolg ist hierbei, dass die Behandlungsstrategie vom Besitzer

verstanden und gemäß den Vorgaben des Tierarztes ausgeführt wird. Dies setzt eine

gewisse Anwenderfreundlichkeit des Produkts voraus, die nicht zuletzt von der

Akzeptanz des zu behandelnden Tieres abhängt (CARLOTTI u. JACOBS 2000).

2.3.5.2.1 Wirkstoffe mit Kontaktwirkung

Adultizide

Imidacloprid

Der Wirkstoff gehört zur Gruppe der Nitromethylene (ARTHER et al. 1997) und ist ein

chloriertes Nikotinderivat. Er wurde in den USA erstmals 1994 als Insektizid in der

Landwirtschaft eingesetzt (RUST 2005). Der Wirkmechanismus beruht auf einer

Aktivierung von nikotinergen postsynaptischen Acetylcholin-Rezeptoren. Dies führt

zu einer Dauerdepolarisation der Neurone und Paralyse der Insekten (UNGEMACH

2002a). Die Acetylcholin-Rezeptoren von Insekten weisen eine deutliche höhere

Empfindlichkeit gegenüber Imidacloprid auf als die Rezeptoren von Säugetieren

(NARAHASHI 1996). Imidacloprid reichert sich nach spot-on Applikation in der

Lipidschicht der Haut sowie in den Haaren an und wird vom Floh über

intersegmentale Membranen aufgenommen (MEHLHORN et al. 1999). Durch die

Dauerdepolarisation kommt es zu einer Schädigung von Ganglien und Muskelzellen

und schließlich zum Tod des Parasiten. Darüber hinaus besitzt Imidacloprid einen

larviziden Effekt, der auf dem gleichen Wirkmechanismus beruht. Imidacloprid wirkt

nicht repellierend (MEHLHORN et al. 2001), ein Residualeffekt besteht noch vier

Wochen nach Behandlung (ARTHER et al. 1997; JACOBS et al. 1997). Außerdem

besteht ein Effekt auf Stadien von C. felis in der unmittelbaren Umgebung des

behandelten Tieres (JACOBS et al. 2000). Von behandelten Katzen benutzte Decken

enthielten 18 Wochen nach dem letzten Kontakt mit dem behandelten Tier noch


___________________________________________________________________________

43

ausreichend Wirkstoff, um den Schlupf von mindestens 94,7% der Flöhe zu

verhindern (JACOBS et al. 2001b).

Fipronil

Fipronil gehört zur Gruppe der Phenylpyrazole und besitzt eine insektizide und

akarizide Wirkung (UNGEMACH 2002a). Der Wirkstoff wird nach spot-on Applikation

kaum resorbiert und reichert sich in der Haut und den Talgdrüsen an, wo COCHET et

al. (1997) ihn noch nach 56 Tagen autoradiographisch nachweisen konnten. Der

Wirkmechanismus von Fipronil beruht auf einer Blockierung von GABA (γ-Amino-

Buttersäure)-gesteuerten sowie bei Säugetieren fehlenden, inhibitorischen Glutamat-

aktivierten Chloridkanälen im Nervensystem der Parasiten (ZHAO et al. 2005). Die

selektive Wirkung auf Arthropoden ist ferner auf die höhere Affinität des Wirkstoffs zu

den GABA-gesteuerten Chloridkanälen zurückzuführen (HAINZL u. CASIDA 1996).

Die Blockade der GABA-gesteuerten Chloridkanäle führt zu Hyperexzitationen,

Konvulsionen und Tod (BLOOMQUIST 2003). Fipronil bewirkte bei monatlicher spot-

on Applikation an Katzen über drei Monate eine Reduktion der Flöhe von bis zu 94%

(MEDLEAU et al. 2002). Die Effektivität einer Behandlung mit Fipronil Spray bei

Katzen lag in den ersten zwei Wochen nach Behandlung bei mindestens 98,2%

(PAYNE et al. 2001). Die spot-on Applikation weist jedoch eine höhere

Verträglichkeit als das Spray auf (UNGEMACH 2002a).

Permethrin

Permethrin gehört zu den Pyrethroiden, die sich von den Pyrethrinen ableiten,

gegenüber diesen aber eine größere Stabilität und Wirksamkeit aufweisen

(UNGEMACH 2002a). Permethrin verteilt sich nach Penetration der Kutikula im

gesamten Insekt. Die Wirkung beruht auf der Bindung an spannungsabhängige

Natriumkanäle der Zellmembran von zentralen und peripheren Neuronen (ZERBA

1988). Die Kanäle sind dadurch länger geöffnet und durch die


___________________________________________________________________________

44

Membrandepolarisation entsteht ein Zustand der Übererregung (NARAHASHI 1996).

Bei ausreichender Wirkdauer tritt der Tod ein. Die Wirkdauer wird durch die Fähigkeit

der Arthropoden beeinflusst, Pyrethroide zu metabolisieren. Dies geschieht durch

Oxidation und Hydrolyse sowie durch das System der mixed function oxidase (MFO)

(ZERBA 1988). Für Hunde erhältliche spot-on Präparate, die den Wirkstoff in hoher

Konzentration enthalten, sind für Katzen aufgrund der hohen Empfindlichkeit dieser

Spezies gegenüber Pyrethroiden toxisch. Vergiftungssymptome sind vor allem

neurologische Störungen (VALENTINE 1990; SUTTON et al. 2007). Katzen, die mit

Permethrin behandelten Hunden im selben Haushalt lebten, zeigten keine Symptome

(HELLMANN et al. 2003). Für Permethrin wurde ein antifeeding effect nachgewiesen,

der innerhalb der ersten Stunde nach Infestation die Blutmahlzeit der Flöhe um mehr

als 80% verminderte (FRANC u. CADIERGUES 1998). Pyrethroide haben zusätzlich

eine repellierende Wirkung gegen Arthropoden (UNGEMACH 2002a; MEYER et al.

2003). In Untersuchungen aus den USA zeigten sich einige C. felis-Stämme als

unempfindlich gegen Pyrethroide (LEMKE et al. 1989; BOSSARD et al. 2002).

Metaflumizon

Metaflumizon gehört zur Klasse der Semicarbazone und wurde nach seiner

Entdeckung in den 1990er Jahren zunächst als Insektizid für die Landwirtschaft

entwickelt (TAKAGI et al. 2007). Metaflumizon ist ein Natriumkanalblocker, der bei

Insekten die Erregungsleitung unterbindet und zu einer schlaffen Paralyse führt

(SALGADO u. HAYASHI 2007). Die Substanz verteilt sich bei Katzen nach topischer

Applikation in Haut und Haaren und ist im Blut kaum nachweisbar. Dies deutet darauf

hin, dass zur Aufnahme des Wirkstoffs durch die Parasiten keine Blutmahlzeit

erforderlich ist (DELAY et al. 2007). In einer Studie von DRYDEN et al. (2007) wurde

die Wirksamkeit von Metaflumizon gegen C. felis untersucht. Nach einmaliger spot-

on Applikation reduzierte die Substanz die Anzahl adulter Katzenflöhe von Tag 3 bis

45 nach Behandlung um mindestens 99,6%. Die Eizahlen waren in gleichem Maße

vermindert, es konnte aber keine Wirkung auf Schlupf und larvale Entwicklung


___________________________________________________________________________

45

nachgewiesen werden. In einer weiteren Untersuchung der selben Arbeitsgruppe

wies Metaflumizon gegen den Flohstamm Kansas 1, welcher gegen eine Reihe von

Substanzen unempfindlich ist, in den ersten fünf Wochen nach Behandlung eine

Wirksamkeit von mindestens 90% auf (DRYDEN et al. 2008).

Pyriprol

Pyriprol ist wie Fipronil (siehe dort) ein Phenylpyrazol-Derivat, dessen

Wirkungsspektrum neben Flöhen auch Zecken umfasst. Phenylpyrazole wirken über

eine Blockade von GABA-gesteuerten Chloridkanälen im Nervensystem der

Parasiten (UNGEMACH 2002a). Bei topischer Applikation verteilt sich der Wirkstoff

innerhalb von 24 h in der Fettschicht der Haut. Er reichert sich in den Talgdrüsen an

und wird von dort aus langsam freigesetzt. Pyriprol ist im Blutkreislauf nicht

nachweisbar, so dass die Arthropoden eher durch direkten Kontakt eliminiert werden

(EMEA 2006). Flöhe werden ca. 24 h, Zecken 36 h nach Infestation abgetötet. Das

Waschen eines Tieres 24 h nach Behandlung mit Pyriprol verminderte die

Wirksamkeit nicht. Insgesamt schützt eine Behandlung mindestens 30 Tage vor

Flohbefall (SCHUELE et al. 2008).

Wachstumsregulatoren

Pyriproxyfen

Pyriproxyfen ist ein Fenoxycarb-Derivat und zählt wie Lufenuron (2.3.5.1.2) zu den

Wachstumsregulatoren. Es entspricht in seiner Wirkung dem Juvenilhormon der

Insekten, welches einen regulierenden Einfluss auf die Individualentwicklung nimmt.

Um eine physiologische Entwicklung der Larven zu ermöglichen, muss der

Juvenilhormonspiegel in späteren Entwicklungsschritten abnehmen. Durch

Pyriproxyfen wird die Entwicklung der Insekten im Larvenstadium beendet


___________________________________________________________________________

46

(UNGEMACH 2002a), da die Juvenilhormonwirkung aufrechterhalten wird. Die

Substanz wird vom adulten Floh nach topischer Applikation durch Kontakt mit Haut

und Haaren aufgenommen (STANNECK et al. 2003). Eine Behandlung von Katzen

mit Pyriproxyfen unterbricht den Reproduktionszyklus von C. felis für sieben Wochen.

Außerdem wird die Flohentwicklung in der mit dem behandelten Tier in Kontakt

stehenden Umgebung gehemmt (JACOBS et al. 1996). Pyriproxyfen besitzt auch

eine ovizide Wirkung, wie PALMA et al. (1993) zeigten. Eier von Flöhen, die mit

Pyriproxyfen in Kontakt gebracht wurden, zeigten morphologische Veränderungen

und kollabierten häufig nach Eiablage.

2.3.5.2.2 Wirkstoffe mit systemischem Wirkmechanism us

Adultizide

Selamectin

Selamectin gehört zur Klasse der makrozyklischen Laktone bzw. Avermectine, die

Fermentationsprodukte des in Japan im Boden lebenden Strahlenpilzes

Streptomyces avermitilis darstellen (UNGEMACH 2002a). Der Wirkstoff ist ein

teilsynthetisches Monosaccharidderivat von Doramectin und wird von den adulten

Flöhen bei der Blutmahlzeit aufgenommen. Selamectin wirkt über die Bindung an

Glutamat-aktivierte Chloridkanäle und führt über eine beschleunigte oder vermehrte

Öffnung zu einer Hyperpolarisation der Nervenzellen und verhindert so die

Erregungsleitung. Die Folge sind Ataxie, Paralyse und Tod der Arthropoden

(BLOOMQUIST 2003). Nach topischer Applikation auf die Haut wird der Wirkstoff

über die Haut resorbiert. Bei der Katze sind maximale Plasmaspiegel nach etwa 15 h

erreicht, beim Hund nach etwa 72 h (SARASOLA et al. 2002). Selamectin ist neben

adulten auch gegen Larvenstadien und Eier von C. felis wirksam (MCTIER et al.

2000). Das Wirkungsspektrum umfasst neben Ektoparasiten auch Nematoden,

weshalb Avermectine auch als Endektozide bezeichnet werden. Eine Behandlung mit


___________________________________________________________________________

47

Selamectin führte bei Collies, die sehr sensibel auf Avermectine reagieren, nicht zu

Nebenwirkungen (BISHOP et al. 2000; BOY et al. 2000; NOVOTNY et al. 2000).

Nitenpyram

Nitenpyram ist wie Imidacloprid ein chloriertes Nikotinderivat und gehört zur Klasse

der Nitromethylene. Nach oraler Applikation verteilt sich der Wirkstoff und wird von

den Flöhen mit der Blutmahlzeit aufgenommen. Der Wirkmechanismus beruht auf

einer Blockierung von nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren (2.3.5.1.1). Bis 24 h

nach Applikation war die Wirkung auf adulte Flöhe zu 100% gegeben. Insgesamt

besteht die adultizide Wirkung 48 h (RUST et al. 2003). Im Zusammenhang mit der

Behandlung mit Nitenpyram wird von vermehrtem Juckreiz und Komfortverhalten der

behandelten Tiere berichtet, was auf die Wirkung von Nitenpyram auf die Parasiten

zurückzuführen ist.

Wachstumsregulatoren

Lufenuron

Lufenuron ist ein Benzoylharnstoff-Derivat, welches als Inhibitor der Chitinsynthese

wirkt und seine systemische Wirkung nach oraler Applikation oder Injektion entfaltet

(UNGEMACH 2002a). Der Wirkstoff wird von den adulten Flöhen bei der

Blutmahlzeit aufgenommen und schädigt Eier und Larven (HINK et al. 1991). Die

larvale Entwicklung wird gehemmt, da die Epidermiszellen geschädigt und so die

Häutung nicht vollzogen werden kann (DEAN et al. 1998). Die Kombination mit

einem Adultizid kann die Behandlung unterstützen (FISHER et al. 1996; DRYDEN et

al. 1999; JACOBS et al. 2001a). Die nach Behandlung mit Lufenuron benötigte Zeit,

bis der Flohbefall unter Kontrolle ist, variiert je nach klimatischen Bedingungen und

Länge des Entwicklungszyklus der Flohpopulation (SMITH et al. 1996). Eine


___________________________________________________________________________

48

subkutane Injektion von Lufenuron (10 mg/kg) an Katzen reduzierte die Anzahl

schlüpfender Flöhe über mindestens sechs Monate um 90% (BLAGBURN et al.

1999).

M A T E R I A L U N D M E T H O D E N

___________________________________________________________________________

49

3 Geräte, Material und Methoden

3.1 Geräte

Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehrosmose-Anlage, Typ RO 50/14SMB Typ I

Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel

Aqua tridest. Aufbereitungsanlage, SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF

Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel

Autoklav GE406

Getinge AB, Getinge / Schweden

Eismaschine UBE 30-10 Ziegra, Isernhagen

Gamma-Counter 1272 Clinigamma

Wallac Oy, Kontakt: PerkinElmer LAS, Rodgau

Kühlzentrifuge Varifuge K

Heraeus Instruments, Kontakt: Thermo Electron, Dreieich

Laborfeinwaage B6

Mettler, Zürich / CH

Laborwaage BL310

Sartorius, Göttingen

Magnetrührer mit Heizplatte IKAMAG RH Kontakt: IKA Werke, Staufen

Mikrotiterplatten-Filterphotometer für ELISA-Reader Dynatech 5000

Dynatech, Kontakt: Dynex Technologies, Berlin

Mörser mit Ausguss, 70 ml Haldenwanger, Berlin


___________________________________________________________________________

50

pH-Meter 766 Calimatic Knick, Berlin

Pipetten einstellbar von bis (µl): 1-20, 10-100, 20-200, 100-1000, 1000-5000

Gilson International B.V., Bad Camberg

Pistill Länge 115 mm

Haldenwanger, Berlin

Reinwerkbank Laminair HL2448


Röhrchen-Schüttler IKA MS1 IKA Werke, Staufen

Rüttler für Mikrotiterplatten AM69 Microshaker

Dynatech, Kontakt: Dynex Technologies, Berlin

Rundsieb (Maschengröße 3mm)

Roth, Karlsruhe

Schieblehre, digital Westfalia, Hagen

Stereo-Mikroskop Vergrößerungsbereich 1x – 4x

Olympus, Hamburg

Transportbox für Kleintiere Zoofachhandel

Zentrifuge Megafuge 1.0R


Zählkammer nach McMaster FiBL Österreich, Wien


___________________________________________________________________________

51

3.2 Material

3.2.1 Klinikbedarf

Advantage® Spot-on, Wirkstoff: Imidacloprid Bayer Vital, Leverkusen

Capstar® S ad. us. vet., Tabletten, Wirkstoff: Nitenpyram

Novartis, Eschborn

Einmalkanülen, steril, Fine-ject, 20G, 0,9x25mm

Henke, Sass, Wolf (4710009025), Tuttlingen

Einmalkanülen, steril, Neolus, 26G, 0,45x12mm

Terumo (NN-2613R), Eschborn

Einmalspritzen, steril TBC, 1ml, mit Spardorn

Dispomed (22027), Gelnhausen

Einmalspritzen, steril, 2ml

Henke, Sass, Wolf (4020.000V0), Tuttlingen

Ethanol, 96%, unvergällt, Aqua dest. ad 70% Merck (1.00971.2500), Darmstadt

Flohkamm Zoofachhandel

Ketamin 10% Injektionslösung

Riemser Arzneimittel, Greifswald – Insel Riems

Kodan Tinktur Forte 250 ml

Schülke& Mayr, Norderstedt

Mikro-Probengefäße, K-EDTA, 1,3ml Nennvolumen

Sarstedt (41.1504.005), Nümbrecht

Posifenicol C 1% Augensalbe, Wirkstoff: Chloramphenicol Ursapharm, Saarbrücken


___________________________________________________________________________

52

3.2.2 Laborbedarf und Verbrauchsmaterial

Combitips, 1,25 ml Eppendorf (0030069.420), Hamburg

Combitips 2,5 ml Eppendorf (0030069.447), Hamburg

Einmal-Filter, 0,2 µm Renner (26146040), Dannstadt

Einmal-Pasteurpipetten Merck (612F1767), Darmstadt

Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 96 Vertiefungen Biochrom (P92960), Berlin

Kühlpack, 17x10x2,5 cm Neolab (1-1400), Heidelberg

Laborflaschen mit Gewinde und Deckel, 500 ml VWR International (215-1594), Darmstadt

Universalstift, Lumocolor permanent Staedtler Mars (318-3), Nürnberg

Parafilm M Brand (701605), Wertheim

Schermaschine Moser Arco Harotec (1854-0061), Berlin

Universalstift, Lumocolor permanent Staedtler Mars (318-3), Nürnberg

Xylazin 2% Injektionslösung CP Pharma, Burgdorf

Zellstofftupfer, Pur-Zellin

Paul Hartmann, Heidenheim


___________________________________________________________________________

53

PD-10 Säule (Sephadex G-25) GE Healthcare (17-0851-01), München

Pipettenspitzen, gelb, 2-100 µl Sarstedt (70.760.002), Nümbrecht

Pipettenspitzen, blau, 200-1000 µl Sarstedt (70.762), Nümbrecht

Reaktionsgefäß, 1,5 ml Nerbe plus (04-212-1000), Winsen/Luhe

Rinderblut, getrocknet Institut für Parasitologie, TiHo Hannover

Röhre, 5 ml, 13x75 mm Nerbe plus (02-161-0000), Winsen/Luhe

Röhre, 15 ml, 120x17 mm Sarstedt (62.554.002), Nümbrecht

Röhre, 50 ml, 28x114 mm Sarstedt (62.547.004), Nümbrecht

Quarzsand Baustoffhandel


___________________________________________________________________________

54

3.2.3 Reagenzien

Albumin, bovin, Fraktion V, 98%, pulverisiert (BSA, bovines Serumalbumin)

PAA Laboratories GmbH (K41-001- 100), Linz / A

Ammoniumbikarbonat ((NH4)HCO3) Roth (T8711.), Karlsruhe

BCATM Protein Assay Kit (Bicinchoninic Acid) Perbio Science Deutschland (23225), Bonn

Dimethylsufoxid (DMSO) Mallinckrodt Baker B. V. (7033), Deventer, NL

Ethylendiamin-Tetraacetat (EDTA) Sigma-Aldrich (ED2SS), Taufkirchen

Histamin, freie Base, 97% Sigma-Aldrich (H-7125), Taufkirchen

125Jod-Histamin-Tracer, 1 Flasche Lyophilisat in 5,5ml A. dest. gelöst, Aktivität <130 kBq

LDN, Nordhorn

Kaliumchlorid (KCl), kristallin Biochrom (T046-10), Berlin

Natriumazid (NaN3), 1,85 g/ml; als 10%ige Lösung in A. dest. eingesetzt

Sigma-Aldrich (S- 2002), Taufkirchen

Natriumchlorid (NaCl) Roth (9265.2), Karlsruhe

N-Hydroxysuccinimido-Biotin (NHS-Biotin)

LDN, Nordhorn

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Dulbecco, ohne Ca2+/Mg2+, (Trockensubstanz)

Biochrom (L18210), Berlin

Piperazine-N,N’-bis[2-ethanesulfonic]acid (Pipes) Sigma-Aldrich (P6757), Taufkirchen


___________________________________________________________________________

55

Polyethylenglycol (PEG) 8000 Sigma (P-2139) Taufkirchen

Salzsäure (HCl), konzentriert (37 %) J.T. Baker (6081), Deventer, NL

Triton X 100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) Sigma-Aldrich (X100), Taufkirchen

Trizma® Base (Tris[hydroxymethyl]aminomethan) Sigma-Aldrich (T-1503), Taufkirchen

Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) Sigma-Aldrich (P-1379), Taufkirchen

3.2.4 Puffer und Lösungen

3.2.4.1 Puffer und Lösungen für den Einsatz im FIT

PBS (aus Dulbecco PBS-Trockensubstanz hergestellt)

NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 HCl / NaOH Aqua tridest.

ad ad

8 g 0,2 g

1,24 g 0,2 g

pH 7,4 1000 ml

Pipes A 10x (Puffer-Konzentrat, Lagerung als Stammlösung bei -20°C)

NaCl KCl Pipes NaOH Aqua tridest.

ad

6,42 g 0,373 g

7,56 g 1,6 g

100 ml

Pipes B (Histaminfreisetzungs- puffer)

Pipes A (10x) CaCl2 1mol/l MgCl2 2mol/l HCl / NaOH Aqua tridest.

ad ad

5 ml 100 µl 50 µl

pH 7,4 50 ml


___________________________________________________________________________

56

Abweichend vom oben aufgeführten Pipes B kamen Pipes B-Puffer mit veränderten

CaCl2-Stoffmengen zum Einsatz:

Pipes B0,5 CaCl2 1 mol/l 50 µl

Pipes B2,0 CaCl2 1 mol/l 200 µl

3.2.4.2 Puffer und Lösungen für den Einsatz im RIA

Pipes A Pipes A 10x PBS

ad

5 ml 45 ml

Präzipitationsserum

Donkey-anti-goat Ig-Serum PEG 8000 Triton X 100 (25%) Natriumazid (10%) PBS

6,6 ml 50 g 2 ml 2 ml

1000 ml

Salzsäure 0,1N konz. HCl (37%) Aqua tridest.

ad

3,8 ml 1000 ml

Tris 0,5M

Tris Tween 20 Aqua tridest. HCl Aqua tridest.

ad ad

30 g 0,1 ml

380 ml pH 8,5 500 ml

Ziege-anti-Acylhistamin-Serum

Ziege-anti-Acylhistamin Immunserum (1:100) Ziegenserum, normal Natriumazid, 10% PBS

ad

0,4 ml

1 ml 0,2 ml

100 ml


___________________________________________________________________________

57

3.2.5 Antikörper und Sera

Donkey-anti-goat (Esel-anti-Ziege)-IgG, Antiserum (DαG)

Immundiagnostik (G4002), Bensheim

Rabbit-anti-cat (Kaninchen-anti-Katze)-IgG (H+L), (RαC)

Acris Antibodies (R1307P), Hiddenhausen

Goat-anti-Acylhistamin-Serum, Ziege-anti-Acylhistamin (Gαh)

AG Immunologie, TiHo Hannover, verd. Hyperimmunserum

Ziegenserum, normal AG Immunologie, TiHo Hannover

3.2.6 Antigene

C. felis-Ganzflohextrakt WBE-G

Greer Laboratories, Lenoir (USA) 1:100 w/v, Konservierungsstoff Phenol 0,4 %, Proteingehalt: 50 µg/ml

C. felis-Ganzflohextrakt WBE-H Institut für Parasitologie, TiHo Hannover, Proteingehalt: 1160 µg/ml

3.2.7 Software

Die Auswertung der im Rahmen dieser Arbeit generierten Daten erfolgte mit SAS 9.1

(SAS Institute Inc.), OriginPro 7.5 (OriginLab), Prism 4 (GraphPad Software) sowie

Excel 2003 (Microsoft).


___________________________________________________________________________

58

3.3 Versuchstiere

3.3.1 Katzen

Die zur Untersuchung der Sensibilisierungskinetik gegen Antigene des Katzenflohs,

C. felis, eingesetzten Katzen stammten aus der Tierhaltung des Instituts für

Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Alle Tiere mit Ausnahme der

Katze S (HZT 807) wurden vor Beginn der Verlaufsuntersuchung keiner bekannten

Flohexposition unterzogen. Die Katzen E, G und N stammten aus einer Zucht und

Haltung, bei der eine Flohexposition sicher ausgeschlossen werden konnte.

Die nachstehende Tabelle enthält eine Aufstellung der in der Verlaufsuntersuchung

verwendeten Katzen:

Tab. 1: Verzeichnis der in der Untersuchung verwend eten Katzen.

Studien-ID Täto-Nr. Gruppe Geschlecht Alter bei Versuchseintritt

A HZT 512 w 1 J. 10 M.

B HZT 513 w 1 J. 10 M.

C HZT 516 w 1 J. 9 M.

D 3058C mk 4 J. 4 M.

E 1022F w 1 J. 1 M. F HZT 401

hohe Ag-Exposition

mk 2 J. 11 M.

G 1031F w 1 J. 1 M.

H HZT 344 mk 3 J. 2 M.

I HZT 345 mk 3 J. 2 M.

K HZT 424 w 2 J. 5 M.

L 2906 w 4 J. 5 M.

M 3075C mk 4 J. 4 M.

N 1032F w 1 J. 1 M.

O HZT 517 w 1 J. 4 M.

P HZT 518 w 3 J. 2 M.

Q 4E380 mk 2 J. 6 M.

R 4E436 mk 2 J. 6 M.

S HZT 807

geringe Ag-Exposition

mk 8 J. 3 M.

w = weiblich; mk = männlich kastriert; J = Jahre, M = Monate


___________________________________________________________________________

59

3.3.2 Katzenflöhe

Für die wöchentlichen Infestationen wurden adulte C. felis aus der Stammhaltung

des Instituts für Parasitologie, TiHo Hannover, verwendet. Zur Aufrechterhaltung der

Flohpopulation wurden zwei bis vier Katzen, die nicht zu den hier geprüften

Versuchkatzen gehörten, zwei Mal pro Woche mit Flöhen infestiert und die Floheier

von Einrichtungsgegenständen und Ruheplätzen der Katzen abgesammelt und mit

einem Rundsieb (3.1) von Schmutzpartikeln getrennt. Die Eier wurden anschließend

bei 27°C und 80% rF auf einem Brutsubstrat aus Quar zsand und getrocknetem

Rinderblut (3.2.2) als Nahrungsquelle für die Larven inkubiert. Nach ca. 14 Tagen

wurden die Puppenstadien zu je 1 g in Plastikdosen abgefüllt, was etwa 100 adulten

Flöhen entsprach. Auf diese Weise erfolgte die erste Blutmahlzeit zum Zeitpunkt der

Infestation der Versuchstiere.

3.4 Methoden

3.4.1 Verlaufsuntersuchung

Die Verlaufsuntersuchung zur Kinetik der Sensibilisierung von basophilen

Granulozyten der Katze gegen Antigene des Katzenflohs wurde mit 18 Katzen über

eine Dauer von 40 Wochen von Dezember 2006 bis September 2007 durchgeführt.

Die unbehandelte, hoch mit C. felis-Antigenen exponierte Gruppe bestand aus sechs

Tieren, während die gering exponierte Gruppe zwölf Tiere umfasste (3.3.1).

Die Katzen wurden während der Untersuchung in Gruppenhaltung untergebracht und

hatten Zugang zu abgetrennten Außengehegen, sofern keine Flohexposition

stattfand. Sie wurden sicher getrennt von den zur Flohzucht eingesetzten Katzen

gehalten.

Über den gesamten Zeitraum wurde wöchentlich eine Infestation mit ca. 100 adulten

Flöhen der Spezies Ctenocephalides felis (3.3.2) durchgeführt. Hierzu wurde die


___________________________________________________________________________

60

jeweilige Katze in eine Transportbox für Kleintiere mit nach oben zu öffnender Klappe

(3.1) gesetzt und die Flöhe in der Nackenregion auf das Fell aufgebracht. Um einen

ausreichenden Flohbesatz sicherzustellen, wurde die Katze nach dem Aufbringen

der Flöhe noch einige Minuten in der Transportbox belassen.

Nach 24-stündiger Exposition wurden die Flöhe mittels eines Flohkamms (3.2.1)

entfernt. Hierzu wurden systematisch Hals, Ohren, Brust, Vordergliedmaßen, dorsale

Rückenlinie, seitliche Brustwand und Bauchwand, Hintergliedmaßen,

Schwanzansatz und Bauchunterseite der Katze gekämmt, bis über einen Zeitraum

von drei Minuten keine Flöhe mehr im Kamm gefunden wurden.

Zur Reduktion der Exposition mit Flohspeichel wurden die Katzen der gering

exponierten Gruppe in 14-tägigem Abstand mit dem spot-on-Präparat Advantage®

(3.2.1) behandelt, welches den Wirkstoff Imidacloprid in einer Konzentration von 100

mg/ml enthält. Tiere bis zu einem Körpergewicht von 4 kg erhielten eine Dosis von

40 mg Imidacloprid und Katzen mit einem Körpergewicht von >4 und bis zu 8 kg

erhielten pro Behandlung 80 mg Imidacloprid. Die Applikation erfolgte nach Scheiteln

der Haare in der dorsalen Nackenregion auf die Haut. Die Flohexposition erfolgte

frühestens 24 Stunden nach einer Behandlung, um eine möglichst gleichmäßige

Verteilung des Wirkstoffes über die Körperoberfläche des Tieres zu gewährleisten.

3.4.2 Blutentnahme

Die Blutentnahme zur Gewinnung der Basophilen erfolgte aus der V. cephalica

antebrachii. Dazu wurde die Katze von einer Hilfsperson fixiert, die entsprechende

Stelle am Unterarm mithilfe einer Schermaschine (3.2.1) geschoren, anschließend

mit Kodan® (3.2.1) desinfiziert und das Blutgefäß gestaut. Die Punktion erfolgte mit

einer sterilen 20 G-Kanüle (0,8*25mm; 3.2.1). Das heraustropfende Blut wurde in ein

Probengefäß (3.2.1) aufgefangen, das als Gerinnungshemmer EDTA enthielt. Nach

Entnahme wurde die Blutung an der Punktionsstelle gestoppt und das Probengefäß

geschwenkt. Es wurden pro Tier und Entnahmezeitpunkt etwa 2-3 ml Blut

entnommen.


___________________________________________________________________________

61

3.4.3 Herstellung und Aufbereitung der Antigene

3.4.3.1 Extraktion von Antigen aus C. felis

Zusätzlich zu einem kommerziell erhältlichen Ganzflohextrakt von Ctenocephalides

felis (3.2.6) wurde aus dem Flohstamm des Instituts für Parasitologie ein eigener

Antigenextrakt (3.2.6) für den Einsatz im FIT und Intrakutantest (IKT) hergestellt.

Hierzu wurden ca. 1000 junge adulte Katzenflöhe vor ihrer ersten Blutmahlzeit durch

Einfrieren bei -18 °C abgetötet, manuell von ihrem Brutsubstrat befreit und in einer

Reibschale mittels Pistill (3.1) fein zermahlen. Die zerkleinerten Flöhe wurden

anschließend mit 10 ml 0,01 M Ammoniumbikarbonat ((NH4)HCO3; 3.2.3) in ein 15

ml-Röhrchen (3.2.2) überführt. Zur Extraktion des Proteins wurde die wässrige

Lösung ca. 20 Stunden bei Raumtemperatur mithilfe einer Rotationsbank (3.1)

geschwenkt und danach 20 Minuten bei 5000x g zentrifugiert. Der Überstand enthielt

die Proteine, welche nun in gelöster Form vorlagen. Das bei der Zentrifugation

entstandene Pellet wurde bei -18 °C aufbewahrt, um bei Bedarf eine weitere

Extraktion durchführen zu können.

3.4.3.2 Aufreinigung des Antigens

Das für FIT und Intrakutantest benötigte Antigen lag in Form von Ganzflohextrakten

von C. felis vor und musste vor der Verwendung zunächst mittels

Gelfiltrationschromatographie von Histamin und im Fall des Extraktes WBE-G (3.2.6)

vom Konservierungsstoff Phenol befreit werden.

Hierfür wurden PD-10-Säulen (3.2.2) verwendet, die mit Sephadex G-25-Granulat

beladen waren, einem synthetischen Polymer, welches aus porösen Polydextran-

Kügelchen besteht und die höhermolekularen Proteine von kleineren Molekülen wie

Phenol oder Histamin trennt. Dabei durchläuft die Phase der größeren Komponenten

die Säule schneller, da Makromoleküle um das Granulat herumwandern, während


___________________________________________________________________________

62

kleinere Moleküle mit einem Molekulargewicht unter fünf kDa durch die Polydextran-

Kügelchen hindurchwandern und sich deren Verweilzeit folglich vergrößert.

Zur Aequilibrierung der Säule wurde diese zunächst mit 25 ml PBS (3.2.4) gespült

und das Eluat verworfen. Nach Aufbringen von 2,5 ml des Antigens wurden 3,5 ml

PBS auf die Säule gegeben. Nun konnte der gereinigte, in PBS verdünnte

Antigenextrakt aufgefangen werden. Falls unmittelbar danach eine weitere

Aufreinigung durchgeführt werden sollte, wurde die Säule mit 15 ml PBS gespült.

Andernfalls wurde sie bis zur weiteren Verwendung mit 15 ml einer 0,02%igen

Natriumazid-Lösung (3.2.3) beschickt und bei 4 °C g elagert. Eine Säule wurde für

maximal fünf Aufreinigungsschritte verwendet.

Um die gleich bleibende Beschaffenheit der Antigenlösung zu gewährleisten, wurde

sie nach der Aufreinigung mittels RIA auf den eigenen Histamingehalt geprüft und

nach Bestimmung der Proteinkonzentration aliquotiert bei -18 °C gelagert.

3.4.3.3 Bestimmung der Antigen-Konzentration

Vor Einsatz des jeweiligen Antigens im funktionellen in vitro-Test sowie im

Intrakutantest musste zunächst dessen Proteinkonzentration bestimmt werden, um

es auf die gewünschten Konzentrationsstufen verdünnen zu können. Dies erfolgte

mit Hilfe des BCA-Kits (3.2.3), wobei Cu2+-Ionen mit Protein zu einwertigen

Kupferionen reagieren und mit 2,2'-Bichinolin-4,4'-dicarbonsäure einen violett

erscheinenden Komplex bilden. Durch Messung der Lichtabsorption bei 562 nm ließ

sich somit indirekt die Proteinkonzentration photometrisch quantifizieren. Neben

verschiedenen Verdünnungsstufen der Antigenlösung wurde eine BSA-

Verdünnungsreihe (3.2.3) als Standard eingesetzt. Aus diesen Messwerten wurde

eine Standardkurve errechnet, anhand derer die Proteinkonzentrationen der

Antigenverdünnungsstufen ermittelt wurden. Bereinigt um den Verdünnungsfaktor


___________________________________________________________________________

63

konnte nun aus diesen Daten die Proteinkonzentration des Antigenextrakts errechnet

werden.

Die BCA-Reaktion wurde auch bei Verwendung der gleichen Antigenlösung nach

jeder Aufreinigung durchgeführt, so dass gleich bleibende Endkonzentrationen des in

den Testverfahren eingesetzten Antigens gesichert waren.

3.4.4 Funktioneller in vitro Test (FIT) zum Nachweis Typ I-allergischer

Effektorzellen

3.4.4.1 Prinzip

Im FIT wurden die im Vollblut enthaltenen basophilen Granulozyten in vitro mit zu

prüfendem Antigen konfrontiert. Im Falle einer bereits vorhandenen, funktionellen

Sensibilisierung auf das Antigen induzieren membranständig überwiegend an

aktivierende Fc-Rezeptoren (FcR) gebundene Antikörper durch Kreuzvernetzung

durch das Antigen eine Freisetzung des in intrazellulären Granula der Basophilen

vorliegenden Histamins sowie weiterer Entzündungsmediatoren (antigeninduzierte

Freisetzung: Ag-Freisetzung, zur Ermittlung der spezifischen Sensibilisierung).

Für eine graduelle Einstufung dieser Reaktion und damit der Stärke der vorliegenden

Sensibilisierung der Basophilen, wurden Aliquots der Blutprobe auf Ansätze mit

verschiedenen Konzentrationsstufen des Antigens verteilt und die Menge des

freigesetzten Histamins für jede Antigenkonzentration mithilfe eines Radio Immuno

Assay (RIA, 3.4.6) bestimmt.

Um die antigeninduzierte Freisetzung für eine Blutprobe richtig bewerten zu können,

musste zusätzlich eine Voraktivierung bzw. Vorschädigung der Basophilen, welche

durch in vivo Maßnahmen bzw. Blutabnahme, Transport und Lagerung der Probe

bedingt sein kann, ermittelt werden.


___________________________________________________________________________

64

Dazu wurde ein Teil der Blutprobe ohne Antigen inkubiert. Die in diesem Ansatz

enthaltene Menge Histamin, die ohne Provokation durch ein Antigen oder eine

andere zugesetzte Substanz oder Maßnahme freigesetzt wurde, wurde als

Spontanfreisetzung bezeichnet und stellt die minimal freisetzbare Histaminmenge

dar. Außerdem wurde die in den intrazellulären Granula der Basophilen gespeicherte

Gesamtmenge an Histamin bestimmt, in dem ein Ansatz der Blutprobe gekocht

wurde. Durch die Hitzeeinwirkung kam es zu einer Denaturierung der zellulären

Proteine und Zerstörung der Zellmembran, was zu einer Freisetzung des gesamten

intrazellulären Histamins führte. Dies wurde als Maximalfreisetzung (Max) bezeichnet

und als für die Reaktion im FIT zur Verfügung stehende Höchstmenge angenommen.

In einem weiteren Ansatz wurden die Zellen mit Kaninchenantikörpern gegen

schwere und leichte Ketten von Katzen-Immunglobulinen G (Rabbit-α-Cat-IgG (H+L))

inkubiert, welche auf den Basophilen der Katze an aktivierende Fc-Rezeptoren

gebundene IgG-Antikörper bzw. über die leichten Ketten auch IgE-Antikörper binden

und miteinander vernetzen (antikörperinduzierte Freisetzung: Ak-Freisetzung). Die

dadurch freigesetzte Histaminmenge war ein Kriterium für die Fähigkeit der

basophilen Granulozyten, auf eine Fc-Rezeptor-gebundene Antikörpervermittlung mit

einer Degranulation und Ausschüttung von Mediatoren, insbesondere Histamin, zu

reagieren, unabhängig von der Spezifität der membranständigen sensibilisierenden

Antikörper (Ermittlung der generellen Sensibilisierung).

3.4.4.2 Vorbereitung

Zur Durchführung des funktionellen in vitro-Tests wurde Vollblut benötigt. Da im FIT

nur die von membranständig gebundenen Antikörpern vermittelte Reaktion der

Basophilen gemessen werden sollte, wurde das Vollblut zunächst gründlich

gewaschen, um die Zellsuspension von im Serum enthaltenen freien Antikörpern,

bereits freigesetztem Histamin sowie vom Gerinnungshemmer EDTA, der die

Reaktion im FIT beeinflusste, zu befreien. Die gesamte Blutprobe wurde hierzu über


___________________________________________________________________________

65

10 Minuten bei 700x g zentrifugiert, um die Zellen vom Plasma zu trennen. Dieses

wurde abgenommen und bis zum Originalvolumen der Blutprobe durch PBS ersetzt.

Anschließend wurde die Probe sorgfältig geschwenkt, ein weiteres Mal zentrifugiert

und der zellfreie Überstand durch PBS ersetzt, bevor sie im FIT verwendet wurde.

Außerdem wurden verschiedene Reaktionsansätze vorbereitet, die eine auf Pipes A

basierende Pufferlösung enthielten (Pipes B; 3.2.4), die die zur Degranulation und

somit Freisetzung des Histamins aus den intrazellulären Granula der basophilen

Granulozyten nötigen Ca2+-Ionen enthielt.

3.4.4.3 Durchführung

Zur Feststellung der spontanen Histaminfreisetzung wurden 250 µl gewaschenes

Vollblut mit 250 µl Pipes B-Puffer versetzt.

Die durch Antikörper induzierte Freisetzung wurde mit in PBS gelösten Rabbit-α-Cat-

IgG (3.2.5) meist in einer Endkonzentration von 30 µg/ml durchgeführt. Für diesen

Ansatz wurden 200 µl Blut, 50 µl Antikörperpräparation sowie 250 µl

Freisetzungspuffer verwendet.

Für die antigeninduzierte Freisetzung wurde ebenfalls in PBS gelöster, aufgereinigter

Ganzflohextrakt von C. felis (3.2.6) eingesetzt. Es wurden pro Ansatz 50 µl der

Antigenpräparation in Konzentrationen von 50, 10, 1, 0,1 und 0,01 µg/ml sowie 250

µl Pipes B und 200 µl gewaschenes Vollblut pipettiert, so dass der Extrakt im

Reaktionsansatz in einer Endkonzentration von 5, 1, 0,1, 0,01 und 0,001 µg/ml zum

Einsatz kam.

Die Reaktionsgefäße wurden anschließend gemischt, eine Stunde lang bei 37 °C

inkubiert und danach für 20 Minuten auf Brucheis (4°C) gestellt, um die

Histaminfreisetzung zu stoppen. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation bei 700x g

für 10 Minuten.


___________________________________________________________________________

66

Abweichend hiervon wurde der Ansatz zur Ermittlung der maximalen Freisetzung wie

folgt bearbeitet:

200 µl Blut wurden mit 800 µl Freisetzungspuffer vermischt, 10 Minuten im

Wasserbad gekocht und mittels Zentrifugation vom Zelldetritus getrennt.

Die so gewonnenen zell- und partikelfreien Überstände wurden schließlich

abgenommen und bei -20 °C bis zur Auswertung im RIA (3.4.6) gelagert.


___________________________________________________________________________

67

3.4.5 Intrakutantest (IKT)

3.4.5.1 Prinzip

Der Intrakutantest beruht auf der Provokation von Hautmastzellen mittels

intradermaler Injektion eines gelösten Antigens, welches in der Lage ist, durch

Quervernetzung von sensibilisierenden, überwiegend an Fc-Rezeptoren gebundenen

Antikörpern eine Degranulation von Mastzellen auszulösen. Da dies hauptsächlich

dann ausgelöst wird, wenn die Mastzelle in ausreichender Dichte spezifische, gegen

das Antigen gerichtete Antikörper gebunden hat, ist das Verfahren geeignet, eine

Sensibilisierung der Mastzellen auf ein Antigen nachzuweisen. Durch die bei der

Degranulation freigesetzten Entzündungsmediatoren erhöht sich die

Gefäßpermeabilität. Dies äußert sich als sichtbare Hautreaktion in Form einer

Quaddel, welche sich meist nach 10 bis 60 Minuten ausbildet.

3.4.5.2 Vorbereitung

Im Intrakutantest wurden die gleichen Testsubstanzen, d.h. Rabbit-α-Cat-IgG (3.2.5.)

sowie Flohantigen-Extrakt (3.2.6), in den gleichen Konzentrationen wie im

funktionellen in vitro-Test (3.4.4) angewandt. Zusätzlich wurden die Substanzen mit

einem 0,2 µm-Filter steril filtriert, um eine bakterielle Kontamination mit Sicherheit

ausschließen zu können.

Es wurde außerdem PBS als Negativkontrolle verwendet, da dies als Lösungsmittel

für alle Testsubstanzen diente. Die Positivkontrolle bildete Histamin (3.2.3) in einer

Konzentration von 50 bzw. 100 µg/ml, welches als Entzündungsmediator direkt sowie

indirekt zur Bildung einer Quaddel führt.

Die Substanzen wurden in 1 ml-Tuberkulinspritzen mit Spardorn (3.2.1) zu je 50 µl

für die Injektion vorbereitet.


___________________________________________________________________________

68

Die Katzen wurden nach einer Untersuchung auf klinische Allgemeingesundheit

mittels einer intramuskulären Injektion von 10-15 mg Ketamin (3.2.1) und 2 mg

Xylazin (3.2.1) pro kg Körpergewicht in Narkose gelegt.

Das für die Injektion vorgesehene Areal wurde gründlich geschoren, gereinigt und mit

unvergälltem Ethanol (3.2.3) desinfiziert, so dass adverse Hautreaktionen durch im

Alkohol enthaltene Sulfide weitgehend ausgeschlossen werden konnten. Der

Intrakutantest wurde in einer Körperregion stets nur einmal ausgeführt, um das

Auftreten von falsch positiven Ergebnissen durch eine lokale Mastzellsensibilisierung

zu vermeiden.


Die intrakutane Injektion der Testsubstanzen erfolgte an vorher markierten Stellen im

Abstand von ca. 2,5 cm. Es wurde eine Hautfalte aufgezogen und die 26G-Kanüle

(3.2.1) nahezu parallel zur Körperoberfläche geführt. Der korrekte, intradermale Sitz

der Kanüle wurde vor der Injektion überprüft und zusätzlich durch Aspiration mit der

Spritze eine subkutane oder intravaskuläre Injektion ausgeschlossen.

Unmittelbar nach der Injektion (t0) erfolgte die Messung des Durchmessers der allein

durch das Injektionsvolumen entstehenden Ausgangsquaddel mit Hilfe einer digitalen

Schieblehre (3.1). Die weitere Vermessung der Quaddeln, die infolge der lokalen

Reaktion auf die injizierten Substanzen bzw. Flüssigkeiten entstanden

(Reaktionsquaddeln), wurde 15, 30 und 60 Minuten nach der Injektion durchgeführt.


___________________________________________________________________________

69

3.4.5.4 Auswertung

Die Reaktion auf eine Substanz wurde als positiv eingestuft, wenn der Durchmesser

einer Reaktionsquaddel zu einem der Messzeitpunkte größer als der Durchmesser

der Ausgangsquaddel plus 0,8 mm war (vgl. 4.2.4). Da die gleichen

Konzentrationsstufen der Testsubstanzen wie im FIT verwendet wurden, war auch

hier eine graduelle Einstufung und so ein direkter Vergleich der Daten zur

Sensibilisierung von Basophilen im FIT und Mastzellen im IKT möglich.

3.4.6 Radio Immuno Assay (RIA)

3.4.6.1 Prinzip

Der RIA ist ein immundiagnostisches Verfahren, welches mittels radioaktivem Marker

geringste Substanzmengen in einer Probe quantitativ nachweisen kann. Zur

Bestimmung der Histaminfreisetzungen aus den Basophilen wurde acyliertes, mit 125Iod markiertes Histamin (3.2.3) verwendet, welches im RIA mit dem

Probenhistamin um eine limitierte Anzahl von Bindungsstellen von Anti-Acylhistamin-

Antikörpern (3.2.5) konkurriert.

Da Histamin als ubiquitärer Mediator im Tierreich vorkommt, ist ein

antikörperbasiertes immunologisches Verfahren zu seiner Detektion per se nicht

geeignet, da es unmöglich ist, gegen Histamin gerichtete Antikörper zu generieren.

Somit musste die Konformation des nativen Histamins zunächst durch Acylierung der

Aminogruppe geändert werden, um es mithilfe eines Anti-Acylhistamin-Antiserums

(3.2.4.2) nachweisbar zu machen.


___________________________________________________________________________

70


Zur Ermittlung der Histaminkonzentrationen in den Überständen aus dem FIT wurde

ein Histaminstandard in Form einer Verdünnungsreihe im Doppelansatz erstellt

(3.2.3; 3.2.4.2):

Zur Durchführung des Assays musste zusätzlich zu dem bereits acylierten Tracer-

Histamin das im FIT freigesetzte Probenhistamin acyliert werden.

Hierzu wurden den in Doppelansätzen zu je 100µl vorliegenden Proben folgende

Reagenzien (3.2.4.2) hinzugefügt:

Anschließend wurden die Proben gut gemischt und bei Raumtemperatur über 30

Minuten inkubiert.

Histaminstandards in den Konzentrationsstufen:

100ng/ml, 30ng/ml, 10ng/ml, 3ng/ml,

1ng/ml, 0,3ng/ml 0,1 N HCl

je 50µl

Probe ohne zugesetzten Histaminstandard (B0) 50µl

0,1 N HCl

Probe für nichtspezifische Bindung (NSB) 50µl

0,1 N HCl

+ 50µl

Pipes B

Kontrollansatz zur Bestimmung der Traceraktivität (T) 25µl

125I-Histamintracer

Tris-Puffer 50µl

NHS-Biotin (1:25 verd. in Pipes A) 50µl


___________________________________________________________________________

71

Allen acylierten Proben wurde nun 25 µl 125I-Histamintracer hinzugefügt. Außer in

den Ansatz für nichtspezifische Bindung (NSB) und die Tracerkontrolle (T) wurden je

50 µl des Ziege-α-Acylhistamin-Antikörpers in einer Endverdünnung von 1: 25.000

pipettiert.

Der Inhalt der Röhrchen wurde gut vermischt und für 20 h bei 4 °C inkubiert. Die in

dieser Zeit gebildeten Histamin-Antikörper-Komplexe wurden daraufhin mithilfe eines

Esel-α-Ziege-Antikörpers (3.2.5) präzipitiert. Hierzu wurde allen Proben außer der

Tracerkontrolle 1 ml eines 1:200 verdünnten Präzipitationsserums (3.2.4.2)

hinzugefügt. Mithilfe der in der NSB-Probe ausfallenden Präzipitate konnte die

Menge des unspezifisch gebundenen 125I-Histamin bestimmt werden, da in diesem

Reaktionsansatz der Bindungspartner fehlte. Nach 15 Minuten Inkubation bei 4 °C

wurden die entstandenen Präzipitate für weitere 15 min bei 2000x g abzentrifugiert.

Zur Entfernung von nicht gebundenem Tracer und Probenhistamin wurden die

Probenröhrchen sorgfältig dekantiert.

3.4.6.3 Messung und Auswertung

Die Radioaktivität der Präzipitate wurde in einem Gammacounter (3.1) ermittelt. Das

Messergebnis wurde in Zählimpulsen pro Minute (counts per minute, cpm)

ausgegeben, wobei die Messdauer einer Probe 60 s betrug. Zur Auswertung wurde

der Aktivitätsmittelwert des Doppelansatzes der jeweiligen Probe herangezogen. Von

allen Proben wurde außerdem die in der Probe für nichtspezifische Bindung (NSB)

(3.4.6.2) gemessene Aktivität subtrahiert.

Zur Ermittlung der Histamingehalte wurde die Aktivität der Proben der

Histaminstandardverdünnungsreihe gemessen. Anhand der Aktivität der

Standardproben wurde mithilfe einer sigmoidalen Anpassungsfunktion ein Graph

erstellt, wobei die Histaminkonzentration des Standards logarithmisch gegen den

Quotient aus der Aktivität der gemessenen Probe (B) und der lediglich

Tracerhistamin enthaltenden Probe (B0) in Prozent aufgetragen wurde (B/B0 [%]).


___________________________________________________________________________

72

Die Histaminkonzentration in den Proben aus dem FIT konnte so aus folgender

Funktion errechnet werden:

f(x) = [(A1-A2) / (1+(x/x0)p)] + A2

mit: A1 untere Asymptote A2 obere Asymptote x Histaminkonzentration x0 Wendepunkt p Ordnungsgrad f(x) B/B0

Abbildung 1 zeigt den Graphen dieser Funktion.

1 10 1000

20

40

60

80

100

B / B

0 (%

)

Histaminkonzentration (ng/ml)

Abb. 1 Graph der sigmoidalen Anpassungsfunktion des Histaminstandards im RIA. Die logarithmisch dargestellten Werte der Konzentration des Histaminstandards (•) sind gegen den linearen Quotienten aus der Aktivität der zu messenden Probe (B) zur ausschließlich Tracerhistamin enthaltenden Probe (B0) aufgetragen, der den Anteil des Tracerhistamins am Gesamthistamin der Probe angibt.


___________________________________________________________________________

73

Da die Blutproben im FIT teilweise in unterschiedlichen Verdünnungen im

Freisetzungspuffer gelöst waren, wurde dies durch Anwendung entsprechender

Korrekturfaktoren berücksichtigt.

3.4.7 Parasitologische Untersuchungen

3.4.7.1 Auswertung der Flohinfestationen

Die nach 24 Stunden Exposition auf den Katzen gefundenen Flöhe wurden zunächst

pro Tier gezählt und anschließend mit Hilfe eines Stereo-Mikroskops (3.1) auf die

Aufnahme einer Blutmahlzeit untersucht. Dazu wurde jeder Floh gequetscht, wobei

eine rote Verfärbung des Magen-Darm-Inhalts als positiv für den Saugakt gewertet

wurde.

3.4.7.2 Kotuntersuchung

Während der Verlaufsuntersuchung wurden in Woche 16 und 41 Sammelkotproben

auf Entwicklungsstadien von Endoparasiten mit Hilfe des Flotationsverfahrens

untersucht. Dabei wurden vier Gramm Kot mit gesättigter Kochsalzlösung (3.2.3) in

eine Mörserschale überführt und gut durchmischt. Die Kotsuspension wurde über ein

Teesieb (3.1) gegossen, um grobe Bestandteile herauszufiltern und anschließend mit

gesättigter NaCl-Lösung bis auf 60 ml Endvolumen aufgefüllt. Anschließend wurde

eine Zählkammer nach McMaster (3.2.2) mit der Suspension befüllt und diese

mikroskopisch auf Helmintheneier untersucht.


___________________________________________________________________________

74

3.4.8 Statistik

Zur Darstellung der Daten der Flohinfestationen wurde der Boxplot gewählt (Abb. 2).

Abb. 2: Aufbau eines Boxplots

Der Boxplot visualisiert die Verteilung von Daten auf einem Zahlenstrahl. Die Box

enthält 50% der Werte, die sog. Whisker schließen 90% der Messwerte ein. Je nach

Lage des Medians in der Box sowie zum arithmetischen Mittelwert lässt sich

abschätzen, ob eine symmetrische Verteilung der Daten vorliegt oder eine Schiefe zu

erwarten ist. Außerdem lässt sich anhand der Größe der Box die Streuung der Werte

erkennen. Die Box wird begrenzt durch das untere bzw. obere Quartil, welches 25%

bzw. 75% der Daten einschließt. Extremwerte werden, wie aus Abb. 2 ersichtlich,

ober- und unterhalb der Whisker eingetragen.


___________________________________________________________________________

75

Zur Beurteilung der Lage der in dieser Arbeit gesammelten Daten wurden das

arithmetische Mittel, der Median sowie die Standardabweichung berechnet. Die

Standardabweichung ergibt sich als Quadratwurzel aus der Varianz und ist ein Maß

für die Streuung der Messwerte um das arithmetische Mittel (SACHS 2004).

Mithilfe des Shapiro-Wilk-Test (SACHS 2004) wurden die während der

Flohinfestationen gesammelten Daten auf Normalverteilung geprüft.

Der Wilcoxon-Test wurde angewendet, um zu prüfen, ob die Anzahl Flöhe, welche in

der hoch exponierten Gruppe gefunden wurde, signifikant von der Zahl abweicht, die

in der gering exponierten Gruppe zu finden war. Er dient dem Vergleich der

Differenzen gepaarter Beobachtungen, die nicht normalverteilt sind. Dabei wird die

Nullhypothese getestet, dass zwischen den Beobachtungen kein Unterschied besteht

(SACHS 2004).

Der exakte Test nach Fisher wurde benutzt, um das Verhältnis positiver zu negativen

Reagenten im FIT und im IKT zwischen den Gruppen nach Zeitpunkten zu

analysieren. Sein Anwendungsgebiet entspricht dem Chi-Quadrat-Test. Er kommt bei

Beobachtungen zum Einsatz, die eine geringe Häufigkeit aufweisen (SACHS 2004).

Der McNemar-Test zur Prüfung von verbundenen Stichproben mit dichotomen

Merkmalen wurde verwendet, um die beiden Untersuchungsverfahren Intrakutantest

und funktioneller in vitro Test sowie die beiden eingesetzten Flohantigen-Extrakte

hinsichtlich ihrer Testbefunde zu vergleichen. Die Daten werden auf die

Nullhypothese geprüft, dass zwischen den beiden Stichproben kein Unterschied

besteht (SACHS 2004).


___________________________________________________________________________

76

Zusätzlich zum McNemar-Test wurde mithilfe des Kappa-Index (SACHS 2004) das

Maß der Übereinstimmung in folgenden Stufen ermittelt:

Kappa Übereinstimmung

< 0,10

0,10 – 0,40

0,41 – 0,60

0,61 – 0,80

0,81 – 1,00

keine

schwach

deutlich

stark

fast vollständig

Die Regressionsanalyse (SACHS 2004) wurde angewendet, um eine differenziertere

Betrachtung der Freisetzungskinetik der Basophilen zu ermöglichen. Mithilfe dieses

Testverfahrens wurde geprüft, ob im Verlauf eine signifikante Zunahme oder

Abnahme der antigenspezifischen Histaminfreisetzung im Zeitverlauf zu verzeichnen

ist, oder ob die Schwankungen in der Freisetzung zufällig sind (Null-Hypothese).

Veränderungen in der Histaminfreisetzung im Zeitverlauf lassen sich am

Regressionskoeffizienten, welcher der Steigung der Regressionsgeraden entspricht,

ablesen. Ist p < 0,05, liegt eine signifikante Änderung vor. Das Bestimmtheitsmaß (r2)

ist das Quadrat des Korrelationskoeffizienten und gibt den Anteil der Variation der y-

Werte, der durch x erklärbar ist, an. Der Achsenabschnitt liefert den genäherten

Ausgangswert, welcher der Histaminfreisetzung zu Beginn der Untersuchung

entspricht.

Die zur Auswertung verwendeten Signifikanzstufen und ihre Bezeichnungen lauten

wie folgt:

p < 0,05

p < 0,01

p < 0,001

signifikant

hochsignifikant

höchstsignifikant

*

**

***

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

77

4 Ergebnisse

In der vorliegenden Arbeit wurde die Kinetik der funktionellen Sensibilisierung von

basophilen Granulozyten und Mastzellen der Katze mit Antikörpern gegen Antigene

des Katzenflohs, C. felis, untersucht. Es sollte mit Hilfe eines funktionellen in vitro

Test zum Nachweis der Sensibilisierung Typ I allergischer Effektorzellen (FIT) und

eines Intrakutantest (IKT) überprüft werden, ob die Antigenmenge, mit denen die

Effektorzellen der Typ I-Allergie konfrontiert wurden, einen Einfluss auf die

Sensibilisierung hat. Außerdem sollte der von KAUL (1998) entwickelte und von

STUKE (2005) für die Katze adaptierte funktionelle in vitro-Test (FIT) weiter optimiert

und die Korrelation von FIT-Ergebnissen mit IKT-Reaktionen und der Stärke des

Flohbefall untersucht werden.

4.1 Optimierung des FIT für die Allergiediagnostik bei der Katze

Die entscheidende Voraussetzung für die Auswertbarkeit des FIT sind intakte

Basophile, die an membranständige Fc-Rezeptoren gebundene Antikörper in

ausreichender Dichte besitzen. Nur dann kann ein spezifisch erkanntes Antigen zwei

oder mehrere membranständige Antikörper quervernetzen. Dieses als bridging

bezeichnete Phänomen führt zur Aktivierung von Signalschritten, die eine

Freisetzung von Histamin und anderen Mediatoren bewirken können.

Zur sicheren Beurteilung einer durch Antigen induzierten spezifischen Freisetzung

sind für jede Blutprobe eines Individuums geeignete Kontrollen erforderlich: Werden

die zu prüfenden Zellen unter schonenden Bedingungen ohne irgend eine

Stimulation in vitro kultiviert und setzen dabei Histamin frei (Spontanfreisetzung von

Histamin), so erhält man ein geeignetes Maß für eine Vorschädigung bzw. eine

Voraktivierung der Basophilen. Die Spontanfreisetzung stellt ein wichtiges Kriterium

für die Auswertbarkeit des FIT dar. Die Höhe der Spontanfreisetzung wird von

äußeren Faktoren wie Temperatur und Lagerungsdauer der Blutprobe beeinflusst

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

78

(STUKE 2005). Da die Blutentnahme für Katzen oftmals Stress verursacht, kann

auch dies zu einer Aktivierung der Basophilen und damit erhöhten

Spontanfreisetzung führen. Daher wurde zunächst versucht, die spontane

Histaminfreisetzung durch Basophile der Katze zu optimieren, um die Auswertbarkeit

von FIT-Ergebnissen zu verbessern.

Aufgrund des bei Katzen nur in geringem Umfang abnehmbaren Blutvolumens und

aus technischen Gründen konnten bei diesen Versuchen neben den Messreplikaten

im Radio Immuno Assay (RIA) keine weiteren Replikate angefertigt werden.

4.1.1 Verdünnung der Blutproben

Da Basophile durch Kontakt mit Fremdoberflächen, wie Plastikwandungen, aktiviert

werden können, sollte untersucht werden, ob durch den Transport der Blutprobe in

einem Medium der Oberflächenkontakt der Basophilen vermindert und somit die

spontane Histaminfreisetzung der voraktivierten Zellen herabgesetzt werden kann.

Es wurde eine mit 0,002% EDTA versetzte PBS-Lösung als Verdünnungsmedium

verwendet. Die Endverdünnung der Blutprobe betrug 1:3,5. Verglichen wurden

Spontan- und Maximalfreisetzung der Basophilen ohne und mit Verdünnung der

Blutprobe. Die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

79

Abb. 3 : Einfluss der Verdünnung von Blutproben der Katze au f die Spontanfreisetzung von Histamin im FIT. Bei der Blutentnahme (3.4.2) von drei Katzen (3.3.1) wurde das tropfende Blut entweder in EDTA-beschichteten Röhrchen (3.2.1) aufgefangen (unverdünntes Blut) oder in einer vorgelegten EDTA-Lösung (3.4.2) 1:3,5 verdünnt (verdünntes Blut). Diese Blutproben wurden innerhalb von 2 h nach Entnahme im FIT auf ihre spontane Histaminfreisetzung untersucht (3.4.4.1). Dargestellt ist die mittlere spontane Histaminfreisetzung und Standardabweichung als Prozentwert der jeweiligen maximalen Freisetzung (3.4.4.1).

Die mittlere Spontanfreisetzung der unverdünnten und verdünnten Blutproben betrug

8,9% bzw. 6,2%. Ein Transport der Blutproben in PBS-EDTA-Medium hat bei den

untersuchten Tieren somit eine Absenkung der Spontanfreisetzung um ca. 30%

gegenüber den aus unverdünnten Blutproben gemessenen Freisetzungswerten

bewirkt. Dies resultierte aus einer verbesserten Messbarkeit der

Gesamthistaminmenge, welche durch Verdünnung der Probe weniger durch

Zelldetritus maskiert wurde und/oder einer verminderten Spontanfreisetzung, was auf

eine geringere Voraktivierung bzw. Schädigung der Basophilen schließen ließ.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

80

4.1.2 Optimierung der Ca-Konzentration im Freisetzu ngspuffer

Basophile benötigen für die Degranulation und Histaminfreisetzung extrazellulär

vorhandenes Kalzium. Da dieses durch den im Probengefäß enthaltenen Chelator

EDTA entzogen wurde, musste es für die Reaktion im FIT wieder zur Verfügung

gestellt werden. Dies geschah mit Hilfe des Freisetzungspuffers Pipes B. Die Ca2+-

Konzentration der Pufferlösung nach KAUL (1998) betrug effektiv 1 mmol/l.

Es sollte untersucht werden, wie sich eine erhöhte oder verminderte Ca2+-

Konzentration auf das Degranulationsverhalten der Basophilen auswirkt. Hierfür

wurden Pipes B-Lösungen mit Ca2+-Endkonzentrationen von 0,5 mmol/l (Pipes B0,5)

und 2 mmol/l (Pipes B2,0) sowie der Standardpuffer mit 1 mmol/l Ca2+ (Pipes B)

eingesetzt. Für den Versuch stand Vollblut von drei Katzen (3.3.1) zur Verfügung.

Neben den jeweiligen Spontanfreisetzungen wurde die durch den RaC-Antikörper

induzierte Histaminfreisetzung in den unterschiedlichen Ca2+-Milieus verglichen.

Während in Pipes B0,5 die Spontanfreisetzung zwischen 2,5% und 3,9% der

maximalen Freisetzung betrug, lag er in Pipes B2,0 zwischen 4,6% und 6,2%. In

Pipes B mit 1 mmol/l Ca2+ setzten die Basophilen zwischen 4,2% und 5,6% der

Gesamtmenge Histamin frei.

Die antikörperinduzierte Freisetzung betrug in Pipes B0,5 zwischen 17,8% und 48,7%,

in Standard-Pipes B zwischen 29,1% und 64,2% und in Pipes B2,0 zwischen 32,3%

und 60,6%.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

81

Abb. 4: Mittlere spontane und antikörperinduzierte Histaminfreisetzung in Pipes B-Lösungen unterschiedlicher Ca-Konzentration . Dargestellt sind die Mittelwerte der antikörperinduzierten Histaminfreisetzung sowie Standardfehler in Prozent der maximalen Freisetzung von drei Katzen (3.3.1). Für die antikörperinduzierte Reaktion wurde RaC-IgG 30 µg/ml (3.2.5) eingesetzt. Für die Freisetzungsbehandlung kamen drei Pipes B-Lösungen mit Ca2+-Endkonzentrationen von 0,5, 1,0 und 2,0 mmol/l zum Einsatz (3.2.4.1). Die gestrichelte Linie bezeichnet den Grenzwert für eine akzeptable spontane Freisetzung bei Katzen (4.2.3.1).

Wie aus Abb. 4 ersichtlich ist, lag die Spontanfreisetzung und die durch RaC-

Antikörper induzierte mittlere Histaminfreisetzung der drei Katzen in Pipes B0,5 etwa

ein Drittel unter der Freisetzung in Pipes B mit 1 mmol/l Ca2+-Konzentration bzw.

Pipes B2,0, während sich die Freisetzungswerte in Pipes B und Pipes B2,0 kaum

unterschieden.

Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass bei einer Ca2+-Konzentration von 0,5

mmol/l nur eine suboptimale Degranulation der Basophilen möglich war, während

eine erhöhte Konzentration von 2,0 mmol/l gegenüber einer Konzentration von 1,0

mmol Ca2+/l zu keiner Verbesserung des Freisetzungsverhaltens der Basophilen

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

82

führte. Daher wurden alle weiteren FITs mit Katzenblut mit einer Ca2+-

Endkonzentration von 1,0 mmol/l in Pipes B durchgeführt.

4.1.3 Lagerung und Transport von Blutproben

Aus früheren Untersuchungen (STUKE 2005) ist bekannt, dass die

Spontanfreisetzung der Basophilen der Katze mit zunehmender Lagerungsdauer

ansteigt. Außerdem konnte eine Abhängigkeit zur Umgebungstemperatur festgestellt

werden. Aus diesem Grund wurden FITs mit Basophilen der Katze stets

schnellstmöglich nach Blutentnahme durchgeführt. Um Lagerung und Transport der

Blutproben über einen längeren Zeitraum zu ermöglichen, wurde der Einfluss

verschiedener Lagerungsbedingungen untersucht. Da für eine Bewertung des FIT

neben einer ausreichend niedrigen Spontanfreisetzung bei einer vorhandenen

Sensibilisierung auch eine entsprechend hohe spezifische Histaminfreisetzung

erfolgen muss, wurden für diese Versuche sowohl Blutproben von Katzen verwendet,

die bei sofortiger Untersuchung im FIT positiv reagierten, als auch solche von FIT-

negativen Reagenten.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

83

Abb. 5 A und B: Zeit- und temperaturabhängige Hist aminfreisetzungen von zwei FIT-positiven (A) und zwei FIT-negativen Katzen (B). Dargestellt sind die Spontanfreisetzung, die antikörperinduzierte Freisetzung (RaC-IgG 30 µg/ml) sowie die antigeninduzierte Freisetzung (Floh-Ganzkörperextrakt = WBE: 5 µg/ml) in Prozent der maximalen Freisetzung von zwei FIT-positiven (A) und zwei FIT-negativen Katzen (B) bei FIT-Untersuchung 2 h nach Blutentnahme sowie nach 24 h Lagerung bei Raumtemperatur oder bei 4 °C. Die x-parallele Linie bezeichnet den Grenzwert für die antigeninduzierte Freisetzung (4.2.3.1).

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

84

Die Ergebnisse sind in Abb. 5 dargestellt. Bei sofortiger Untersuchung im FIT zeigten

alle Tiere eine deutliche antikörperinduzierte Freisetzung (RaC 30), die etwa der

physikalischen Freisetzung (100%) entsprach oder diese übertraf. Nach 24 Stunden

Lagerung bei Raumtemperatur war die antikörperinduzierte Freisetzung bei allen

Tieren auf das Niveau der Spontanfreisetzung abgefallen, somit vollständig

verschwunden. Auch die Flohantigen-induzierte Histaminfreisetzung der im Sofort-

Test positiven Katzen (A) war nach 24 h bei Raumtemperatur nicht mehr vorhanden.

Dagegen zeigten die Basophilen aller Tiere nach 24 h Lagerung bei 4 °C eine

deutlich über die Spontanfreisetzung hinausgehende antikörperinduzierte

Histaminfreisetzung. Auch die im Sofort-Test positiven Katzen reagierten nach

Kühlung der Proben mit einer deutlichen Histaminfreisetzung, während bei den

negativen Katzen nach 24 h Lagerung bei 4° C keine falsch-positive Reaktion zu

beobachten war.

Zusätzlich wurde der Einfluss von möglichen transportbedingten Bewegungen der

Blutprobe während der Lagerung untersucht. Blutproben von vier Katzen wurden

hierzu für 24 h bei +4 °C gekühlt auf einen Miktrot iterplattenrüttler gelegt und die FIT-

Ergebnisse mit denen für 24 h unbewegt, gekühlt gelagerter sowie sofort

untersuchter Proben der selben Tiere verglichen. Bei den auf dem Rüttler gelagerten

Proben ergab sich, verglichen mit den unbewegt gelagerten und sofort untersuchten

Proben, durch die permanente Bewegung kein nachteiliger Effekt auf die

antigenvermittelte Reaktion der Basophilen. Es traten im Vergleich zur Sofort-

Reaktion keine falsch-negativen oder falsch-positiven Resultate auf.

4.1.4 Titration der Antikörperkonzentration

Zur Überprüfung der prinzipiellen Reaktionsfähigkeit der Basophilen eines Tieres

kam ein Antiserum aus dem Kaninchen gegen IgG der Katze (RaC-IgG, 3.2.5) zum

Einsatz. Die Konzentration sollte so gewählt werden, dass eine ausreichend hohe

und individuell differenzierbare Freisetzung auf die Provokation mit dem Antikörper

erfolgt. Wie aus Abb. 6 ersichtlich, wurde der Antikörper in den Konzentrationen 100,

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

85

30, 10, 3, und 1 µg/ml an Blutproben von drei Tieren geprüft und die

Histaminfreisetzung in Prozent der physikalischen Freisetzung ausgedrückt. Dabei

fiel auf, dass durch RaC in der Konzentration 100 µg/ml die Freisetzung bei allen

Tieren höher war als die nach Hitzedenaturierung der Zellen gemessene

Histaminmenge. Wie KAUL (1998) zeigte, ist dieser Verlust beim Verkochen durch

an Zellproteine gebundenes Histamin bedingt, welches durch Zentrifugation aus dem

Überstand entfernt wird (3.4.4).

Abb. 6: Antikörperinduzierte Histaminfreisetzung. Dargestellt ist die antikörperinduzierte Histaminfreisetzung (3.4.4.1) in Prozent der physikalischen Freisetzung von drei Katzen (3.3.1). Gemessen wurde die auf Stimulation mit Kaninchen-anti-Katze (RaC)-Antikörper (3.2.5) in fünf Konzentrationsstufen freigesetzte Histaminmenge. Die Reaktionen von zwei Katzen auf 30 und 100 µg/ml Antikörperkonzentration

unterschieden sich nur gering, während ein weiteres Tier auf RaC in der

Konzentration 30 µg/ml deutlich schwächer reagierte. Bei Verwendung einer

Antikörperkonzentration von 10 µg/ml war die Histaminfreisetzung bei einer Katze so

stark vermindert, dass eine zuverlässige Überprüfung der generellen Sensibilisierung

nicht mehr gewährleistet war.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

86

Um für die folgenden Untersuchungen eine differenzierte Beurteilung der generellen

Sensibilisierung der Basophilen mit Hilfe des RaC-IgG zu erzielen, wurde 30 µg/ml

als Standardkonzentration festgelegt.

4.2 Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung

Im Rahmen der Untersuchung der Sensibilisierungskinetik auf Antigene von C. felis

sollte der Einfluss der Antigenmenge auf den Verlauf der Sensibilisierung von

Basophilen der Katze unter dem Einfluss kontrollierter Flohexpositionen geprüft

werden. Dazu wurde eine Gruppe von Katzen (n=12: gering exponierte Tiere) mit

dem Kontaktinsektizid Imidacloprid (3.2.1) behandelt. Die hoch exponierte Gruppe

ohne eine medikamentelle Behandlung umfasste sechs Tiere (3.3.1). Alle 18 Katzen

wurden wöchentlich mit der gleichen Anzahl Katzenflöhe infestiert. Der

Sensibilisierungsstatus der Basophilen wurde mit Hilfe des funktionellen in vitro Tests

(FIT) ermittelt, die Sensibilisierung der Mastzellen mit dem Intrakutantest (IKT)

untersucht.

4.2.1 Flohinfestation

Zur Untersuchung der Sensibilisierungskinetik von basophilen Granulozyten bei hoch

und gering mit Flohantigen exponierten Katzen wurden alle Versuchstiere im

wöchentlichen Abstand mit jeweils ca. 100 adulten C. felis infestiert, um eine

regelmäßige Exposition der Katzen mit Ctenocephalides-Antigenen zu

gewährleisten. Nach Infestation wurden die Flöhe für 24 Stunden auf den Katzen

belassen und anschließend mit einem Flohkamm entfernt. Bereits beim Absammeln

wurden tote von lebenden Flöhen differenziert. Bei der folgenden

lichtmikroskopischen Untersuchung wurde kontrolliert, ob und wie viele der Flöhe

während der Exposition eine Blutmahlzeit aufgenommen hatten. Da bei der

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

87

Blutmahlzeit Speichelantigene injiziert werden, sollte dadurch die Antigenexposition

kontrolliert, aber auch eine Schätzung über die Antigenmenge ermöglicht werden, mit

der jede einzelne Katze konfrontiert wurde. Um bei gleicher Anzahl infestierter Flöhe

(100 pro Katze) unterschiedliche Antigenexpositionen zu erreichen, wurde das

hochwirksame Kontaktinsektizid Imidacloprid (Advantage®; Bayer Animal Health) im

2-wöchigen Rhythmus jeweils einen Tag vor der Infestation bei den 12 Tieren der

schwach exponierten Gruppe per „spot on“ appliziert, wobei Katzen mit einem

Körpergewicht bis zu 4 kg mit einer Dosis von 40 mg und >4-8 kg schwere Tiere mit

80 mg Imidacloprid behandelt wurden. Die nachfolgenden Daten stammen aus 40

Infestationen, die im Tierhaus des Instituts für Parasitologie im Zeitraum von 40

Wochen (Dezember 2006 bis September 2007) durchgeführt wurden.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

88

4.2.1.1 Infestationsdaten der hoch exponierten Grup pe

Die Anzahl aller in der Gruppe der unbehandelten, hoch exponierten Tiere nach 24

Stunden wieder gefundenen Flöhe betrug im Gesamtmittel 52 ± 23 (Median: 50,5).

Der Anteil lebender Flöhe über den gesamten Zeitraum betrug 99,8%. Von den

insgesamt wieder gefundenen Flöhen konnte bei 39 ± 17 Flöhen die Aufnahme einer

Blutmahlzeit festgestellt werden, was einem Anteil von 75% entsprach (Abb. 7). Es

konnte daher davon ausgegangen werden, dass die Katzen in der Gruppe mit hoher

C. felis-Ag-Exposition während der Verlaufsuntersuchung wöchentlich innerhalb von

24 Stunden mit einer Menge von etwa 390 ng Ctenocephalides-Speichelprotein

(vergleiche 5.2.1) samt dem darin enthaltenen Antigen konfrontiert wurden.

Abb. 7: Wieder gefundene Flöhe in der Gruppe mit ho her Ag-Exposition. Dargestellt ist die Gesamtzahl, die Zahl lebender und gesaugter Flöhe, die nach 24 h Exposition in der unbehandelten, hoch exponierten Gruppe auf den Katzen wieder gefunden wurden. Die Daten stammen aus 40 Infestationen während der Verlaufsuntersuchung von Dezember 2006 bis September 2007. Pro Tier wurden wöchentlich ca. 100 adulte C. felis eingesetzt.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

89

4.2.1.2 Infestationsdaten der gering exponierten Gr uppe

Auch die Gruppe der mit Advantage® spot-on (Wirkstoff: Imidacloprid, 3.2.1)

behandelten Tiere (n=12) wurde wöchentlich mit ca. 100 Flöhen infestiert. Sie sind

jedoch als gering exponierte Tiere zu betrachten, da aufgrund der adultiziden

Wirkung von Imidacloprid nach 24 Stunden insgesamt nur 3,8 ± 4,6 Flöhe (Median:

2,5) wieder gefunden werden konnten. Die Anzahl lebender Flöhe betrug

durchschnittlich 0,3 ± 0,7. Von allen wieder gefundenen Flöhen hatten 0,4 ± 0,9

Flöhe Blut gesaugt. Dass dieser Wert höher lag als die Anzahl lebender Flöhe, lässt

sich dadurch erklären, dass auf den Katzen tote Flöhe gefunden wurden, welche vor

Wirkungseintritt eine Blutmahlzeit aufgenommen hatten (Abb. 8).

Abb. 8: Wieder gefundene Flöhe in der Gruppe mit ge ringer Ag-Exposition. Die Boxplots (3.4.8) zeigen die Gesamtzahl sowie die Anzahl lebender und gesaugter Flöhe, die nach 24 h im Fell der mit Imidacloprid (3.2.1) behandelten, gering exponierten Katzen (3.3.1) gefunden wurden. Die Daten stammen aus 40 wöchentlichen Infestationen (3.4.1). Pro Tier wurden wöchentlich ca. 100 adulte C. felis eingesetzt.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

90

Abb. 9 zeigt für jedes Tier der gering exponierten Gruppe die Menge der wieder

gefundenen Flöhe, die eine Blutmahlzeit aufgenommen hatten. Nur bei einer Katze

(G) lag der Mittelwert der gesaugten Flöhe bei 1,2, während er bei den anderen

Tieren der Gruppe kleiner als 1 war.

Abb. 9: Anzahl der wieder gefundenen Flöhe mit Blut mahlzeit je Tier der gering exponierten Gruppe. Dargestellt ist die Anzahl der Flöhe, die nach 24 h mittels Flohkamm im Fell der mit Imidacloprid behandelten, gering exponierten Katzen (3.3.1) wieder gefunden werden konnten und bei denen die Aufnahme einer Blutmahlzeit lichtmikroskopisch bestätigt wurde (3.4.7.1). Die Daten wurden in 40 Infestationen gesammelt (3.4.1.).

Der Mittelwert der Anzahl lebender Flöhe bei allen zwölf behandelten Tieren lag

zwischen 0,05 und 0,56. Ausgehend von ca. 100 infestierten Flöhen bedeutet dies im

Mittel eine Reduktion der Befallsintensität nach 24 h von mehr als 99%.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

91

4.2.1.3 Vergleich der Infestationsdaten zwischen de n Gruppen

Es fällt auf, dass auf den gering exponierten Tieren, die mit Imidacloprid behandelt

wurden, nach 24 Stunden gegenüber den Tieren mit hoher Ag-Exposition deutlich

weniger Flöhe gefunden wurden. Einer Gesamtzahl von im Mittel 52 Flöhen auf den

hoch exponierten Tieren stehen in der Gruppe der gering exponierten Tiere

durchschnittlich ca. 4 Flöhe gegenüber (p<0,001).

Vergleicht man die durchschnittliche Anzahl lebender Flöhe zwischen den Gruppen,

wird der Unterschied noch deutlicher. Während in der unbehandelten Gruppe in 40

Infestationen im Mittel ca. 52 Flöhe auf jedem Tier gefunden wurden, war bei den

behandelten Tieren im Gruppenmittel weniger als ein lebender Floh zu finden

(p<0,001).

Tab. 2: Übersicht der Infestationsdaten aus beiden Gruppen.

Die Tabelle enthält nach Gruppen die mittlere Gesamtzahl sowie die mittlere Anzahl lebender und gesaugter C. felis, die nach 24 h Infestation mittels Flohkamm auf den Katzen wieder gefunden wurden, sowie das Verhältnis der Anzahl (hoch exponierte Gruppe : gering exponierte Gruppe).

Das unterschiedliche Verhältnis in der Höhe der C. felis-Ag-Exposition zwischen den

Gruppen ist aus Tab. 2 ersichtlich. Der Mittelwert Flöhe mit Blutmahlzeit der hoch

exponierten Gruppe betrug 39 Flöhe pro Tier und Infestation, bei den durch

Behandlung mit Imidacloprid gering exponierten Tieren saugte im Mittel weniger als

Anzahl Flöhe (ø)

Gruppe

gesamt lebende mit Blutmahlzeit

hoch exponierte

Gruppe 52,29 52,21 38,88

gering exponierte

Gruppe 3,77 0,26 0,42

Verhältnis

hoch : gering ≈ 14 : 1 200 : 1 93 : 1

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

92

ein Floh Blut. Im Verhältnis zu einem auf den gering exponierten Katzen wieder

gefundenen Floh stehen 93 gesaugte Flöhe in der hoch exponierten Kontrollgruppe

(p<0,001). Somit hat die regelmäßige, 14-tägige Behandlung mit Imidacloprid eine

deutliche Reduktion der injizierten Antigenmenge (auf ca. 1 %) auf Grund der

entsprechenden Verminderung des Flohbefalls insgesamt bewirkt (vgl. 4.2.1.1 und

4.2.1.2).

4.2.2 Koproskopische Untersuchung

Während der Verlaufsuntersuchung wurden in Woche 16 und 41 Sammelkotproben

mit Hilfe des Flotationsverfahrens auf Entwicklungsstadien von Helminthen

untersucht. Es konnte zu keinem Zeitpunkt ein Wurmbefall nachgewiesen werden.

4.2.3 Funktioneller in vitro-Test (FIT)

Die Sensibilisierungskinetik der Basophilen gegen Antigene des Katzenflohs

während wiederholter, kontrollierter Flohexpositionen sollte mit Hilfe des FIT (3.4.4)

an Katzen untersucht werden. Dazu wurden zwei verschiedene Ctenocephalides

felis-Ganzkörperextrakte (3.2.6) eingesetzt, mit denen die Basophilen aus dem

Vollblut während einer 60 Minuten dauernden Inkubation konfrontiert wurden. Eine

auf den Stimulus erfolgende spezifische Histaminfreisetzung wurde mit Hilfe des RIA

(3.4.6) quantifiziert. Zur Feststellung des Ausgangsstatus wurden vor Beginn der

Untersuchung bei allen Tieren zwei FITs durchgeführt. Im Verlauf der über 47

Wochen dauernden Untersuchung erfolgten weitere FITs im monatlichen Abstand.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

93

4.2.3.1 Grundlagen der Auswertung

Um spezifisch freigesetztes Histamin von einer unspezifischen Freisetzung

unterscheiden zu können, mussten geeignete Grenzwerte definiert werden. In

Anlehnung an die Arbeiten von KAUL (1998) und STUKE (2005) wurde zunächst aus

allen auswertbaren FITs auf Basis des 85%-Quantils (250 durchgeführte Tests) die

mittlere Spontanfreisetzung (5,6%) bezogen auf die maximal freisetzbare Menge

Histamin sowie die Standardabweichung (3,7%) berechnet. Die maximal zulässige

Spontanfreisetzung wurde als Summe aus Mittelwert und dreifacher

Standardabweichung festgelegt. Lag die spontane Histaminfreisetzung über dem so

errechneten Wert von 16,7%, wurde der jeweilige Test nicht zur weiteren Auswertung

herangezogen. Als positive Reaktion auf eine Antigenprovokation wurden Werte

klassifiziert, die über 27,8% der maximalen Freisetzung lagen. Dieser Grenzwert

errechnete sich aus der Summe aus dem Mittelwert und der sechsfachen

Standardabweichung aller gemessenen Spontanfreisetzungen (Tab. 3).

Tab. 3: Berechnung der Grenzwerte zur Auswertung de s FIT.

Anzahl ausgewerteter FITs (n) 250

Mittelwert der Spontanfreisetzung [% der maximalen Freisetzung] 5,6 %

Standardabweichung 3,7 %

Grenzwert für Spontanfreisetzung (MW + 3x SD) 16,7 %

Grenzwert für Ag-induzierte Freisetzung (MW + 6x SD) 27,8 %

Spontanfreisetzungen, die über dem Grenzwert lagen, wurden nicht zur Auswertung herangezogen, eine positive FIT-Reaktion im Sinne einer funktionellen Sensibilisierung gegen C. felis-Antigene war bei einer spezifischen Histaminfreisetzung von mindestens 27,8% gegeben. Alle Prozentwerte beziehen sich auf die jeweilige maximale Histaminfreisetzung.

Die im FIT verwendeten Antigenextrakte wurden in mehreren Verdünnungsstufen

eingesetzt. So konnte eine positive Reaktion graduell bewertet werden. In Tab. 4

sind exemplarisch mögliche FIT-Reaktionen sowie deren Interpretation erläutert.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

94

Tab. 4: Auswertung möglicher FIT-Reaktionstypen.

FIT

Ansatz # 1 # 2 # 3 # 4

Spon 3,2% 10,6% 7,7% 18,7%

Cf 5 16,5% 86,9% 67,4% 30,8%

Cf 1 10,7% 21,3% 32,1% 17,6%

Cf 0,1 4,3% 11,7% 11,3% 15,7%

FIT # 1 FIT # 2 FIT # 3 FIT # 4

Spon erlaubt,

da unterhalb des Grenzwerts von 16,7 % zu hoch

Cf 5 neg. pos. pos. n.a.

Cf 1 neg. neg. pos. n.a.

Cf 0,1 neg. neg. neg. n.a.

Gesamt-

bewertung

(Sensibilisierungs-

grad)

0 1 2 n.a.

Kommentar

Kein Wert über

Positiv-

Grenzwert von

27,8%

Antigeninduzierte

Freisetzung nur

bei 5 µg/ml über

Grenzwert von

27,8%

Antigeninduzierte

Freisetzung bei 5

und 1 µg/ml über

Grenzwert von

27,8%

Auswertung nicht

erfolgt, da

Spontan-

freisetzung über

16,7%

Die Tabelle enthält Daten vier verschiedener FITs unterschiedlicher Tiere, in denen eine C. felis-Antigenpräparation (Cf) in den Endkonzentrationsstufen 5, 1 und 0,1 µg/ml zum Einsatz kam. Der Grenzwert für die zulässige Spontanfreisetzung (Spon) liegt bei 16,7%, der Grenzwert für eine positive antigeninduzierte Reaktion bei 27,8% der maximalen Freisetzung (Tab. 3). Bei einer positiven Reaktion auf eine Konzentrationsstufe der Antigenpräparation liegt ein Sensibilisierungsgrad von 1 vor (FIT #2), eine positive Reaktion in zwei Konzentrationsstufen entspricht dem Sensibilisierungsgrad 2 (FIT #3).

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

95

4.2.3.2 Sensibilisierungskinetik der hoch exponiert en Kontrollgruppe im FIT

Die Sensibilisierung der Basophilen der hoch exponierten Katzen gegen in

Ganzkörperextrakten (3.2.6) von C. felis enthaltene Antigene wurde im monatlichen

Abstand überprüft. Eine Woche vor Beginn der Verlaufsuntersuchung wurde der

Ausgangsstatus der Tiere ermittelt. Danach wiesen zwei der sechs Tiere (C und D)

bereits eine im FIT nachweisbare Vorsensibilisierung der Basophilen auf (Tab. 5).

Die Katzen A, B, E und F reagierten vor der ersten experimentellen Flohexposition im

FIT nicht auf den verwendeten Flohextrakt WBE-G (Greer).

Tab. 5: FIT-Reaktion der unbehandelten, hoch expon ierten Katzen auf WBE-G in Sensibilisierungsgraden.

Woche Tier

- 1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47

A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

C 1 1 1 0 1 n.a. 0 0 0 0 0 n.a. 0

D 1 2 2 2 2 1 n.a. 1 2 1 2 2 1

E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1

F 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

Der Grad der im FIT ermittelten funktionellen Sensibilisierung der Basophilen der Tiere A-F (3.3.1) gegen im Flohextrakt WBE-G (3.2.6) enthaltene Antigene ist chronologisch aufgelistet. Ein Sensibilisierungsgrad von ≥ 1 (fett gedruckt) bedeutet eine über dem Grenzwert (4.2.3.1) liegende Histaminfreisetzung der Basophilen, Freisetzungen unter dem Grenzwert für eine positive Reaktion (4.2.3.1) sind mit 0 bezeichnet. In Woche – 1 wurde der Status der Katzen vor Infestationsbeginn ermittelt. n.a. bedeutet, dass der jeweilige FIT nicht auswertbar war. Im Laufe der Untersuchung waren bei den einzelnen Tieren sehr unterschiedliche

Sensibilisierungskinetiken zu beobachten: Während die Katze D über den gesamten

Zeitraum der Untersuchung im FIT positiv reagierte, war die Sensibilisierung der

anderen vorsensibilisierten Katze C nur bis Woche 14 nachweisbar. Die Katzen A, B

und F, die anfangs nicht sensibilisiert waren, reagierten trotz wöchentlicher

Flohexpositionen im gesamten Verlauf der Untersuchung mit ihren Basophilen nicht

auf Antigene von C. felis. Katze A und B zeigten zu keinem Zeitpunkt eine

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

96

funktionelle Sensibilisierung, nur Katze F wies in Woche 38 einmalig einen

Sensibilisierungsgrad von 1 auf, blieb ansonsten aber ebenfalls FIT-negativ.

Im Gegensatz dazu stand Katze E, die ab Woche 38 eine bleibende Sensibilisierung

gegen den Antigenextrakt zeigte.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

-1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47

Woche

Mitt

lere

r S

ensi

bilis

ieru

ngsg

rad

late onset, n=1 (E)

konstant neg., n=3 (A, B, F)

konstant pos., n=1 (D)

inhibiert, n=1 (C)

Abb. 10: Sensibilisierungsmuster der unbehandelten, hoch exponierten Katzen. Die Abbildung zeigt den Verlauf der Sensibilisierung der hoch exponierten Tiere (3.3.1) von ihrem Ausgangsstatus vor Infestationsbeginn (Woche – 1) bis Woche 47 (nach insgesamt 40 wöchentlichen Flohinfestationen), zusammengefasst nach Sensibilisierungsmustern. Die horizontale gestrichelte Linie markiert den Sensibilisierungsgrad 1 (FIT-positiv).

Abb. 10 gibt einen Überblick über die in der Gruppe der stark mit C. felis-Antigenen

exponierten Tiere aufgetretenen Sensibilisierungsmuster.

Zusammenfassend waren in der hoch exponierten Kontrollgruppe vier verschiedene

Verlaufsmuster im FIT zu beobachten. Neben drei konstant negativen Tieren (A, B

und F) und der konstant positiven Katze D, trat auch ein Fall einer Gegenregulation

(Katze C) auf. Eine vorhandene funktionelle Sensibilisierung verschwand im Laufe

der wiederholten Flohexpositionen. Außerdem entwickelte die Katze E in den letzten

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

97

Wochen der Untersuchung eine Sensibilisierung gegen im Extrakt WBE-G enthaltene

Antigene von C. felis. Diese Spätsensibilisierung wird im Folgenden auch als late

onset Kinetik bezeichnet.

4.2.3.3 Sensibilisierungskinetik der gering exponie rten Katzen im FIT

Die Überprüfung des Sensibilisierungsstatus der Basophilen erfolgte in der Gruppe

der gering exponierten, mit Imidacloprid behandelten Katzen nach dem gleichen

Protokoll wie bei den hoch exponierten Tieren. Auch hier wurde zunächst der

Ausgangsstatus der Katzen ermittelt. Dabei zeigten zwei Tiere bereits vor Beginn der

Untersuchung eine Sensibilisierung der Basophilen gegen Antigene von C. felis

(Katzen L und M), während die zehn anderen Tiere vor der kontrollierten

Flohexposition im FIT negativ waren. Wie aus Tab. 6 hervorgeht, blieben die beiden

vorsensibilisierten Katzen L und M zu allen auswertbaren Zeitpunkten positiv. Die

Basophilen der Katze M reagierten im Vergleich zu den anderen Tieren am

empfindlichsten auf den Flohantigen-Extrakt. Sie zeigten mehrmals schon bei einer

Konzentrationsstufe von 0,1 µg/ml eine deutliche spezifische Histaminfreisetzung.

Dagegen blieben vier der behandelten Katzen (H, I, O, Q) während des gesamten

Untersuchungszeitraums negativ.

Sechs Katzen (G, K, N, P, R und S) zeigten zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach

Beginn der kontrollierten Flohexpositionen eine Sensibilisierung.

Bei den Tiere K, R und S lag schon früh eine Sensibilisierung vor (early onset), die

bereits drei Wochen nach Beginn der Flohexposition im FIT nachweisbar war.

Während diese bei der Katze K bestehen blieb, waren bei den Katzen R und S, die

zunächst ebenfalls eine early onset Kinetik zeigten, im weiteren Verlauf variable

Sensibilisierungsmuster zu beobachten (Tab. 6, Abb. 11).

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

98

Tab. 6: FIT-Reaktion der gering exponierten Tiere a uf den Flohextrakt WBE-G in Sensibilisierungsgraden.

Woche Tier

- 1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47

G 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 2 2 2

H 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

K 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1

L 2 2 n.a. 2 n.a. n.a. 2 2 2 2 n.a. n.a. n.a.

M 3 3 3 2 3 3 2 2 2 2 2 2 2

N 0 0 0 0 0 1 1 1 2 2 2 2 n.a.

O 0 0 0 0 0 0 0 n.a. 0 0 n.a. n.a. n.a.

P 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 n.a.

Q 0 0 n.a. n.a. 0 0 0 0 0 0 0 0 n.a.

R 0 1 n.a. 0 0 1 2 1 1 0 n.a. 0 n.a.

S 0 1 n.a. 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0

Der Grad der im FIT ermittelten funktionellen Sensibilisierung der Basophilen der Tiere G-S (3.3.1) gegen im Flohextrakt WBE-G (3.2.6) enthaltene Antigene ist chronologisch aufgelistet. Ein Sensibilisierungsgrad von ≥ 1 (fett gedruckt) bedeutet eine über dem Grenzwert (4.2.3.1) liegende Histaminfreisetzung der Basophilen, Freisetzungen unter dem Grenzwert für eine positive Reaktion (4.2.3.1) sind mit 0 bezeichnet. In Woche – 1 wurde der Ausgangsstatus der Katzen vor Infestationsbeginn ermittelt. n.a. bedeutet, dass der jeweilige FIT nicht auswertbar war. Nach anfänglich positiver FIT-Reaktion der Katze R war über ca. 15 Wochen keine

positiv zu bewertende Histaminfreisetzung auf C. felis-Antigene zu beobachten.

Darauf folgte eine Phase von gut 12 Wochen, in der die flohspezifische

Sensibilisierung wieder deutlich nachweisbar war, ab der 34. Woche für die

restlichen drei Monate Untersuchungszeit jedoch wieder unter dem positiven

Grenzwert blieb. Die Katze S zeigte ebenfalls drei Wochen nach Beginn der

Flohexpositionen eine flohspezifische Sensibilisierung ihrer Basophilen, war dann

aber die folgenden drei Monate FIT negativ. Interessant ist, dass dieses Tier erst in

Woche 22 wieder eine positive FIT-Reaktion zeigte, die für die folgenden knapp vier

Monate wieder verschwand, bis sie in der 38. und 43. Woche wieder nachweisbar

war. Wie aus Abb. 11 hervorgeht, liegt bei den Tieren R und S ein zyklisches

Sensibilisierungsmuster vor, welches durch mehrmalig ansteigende und wieder

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

99

abfallende antigeninduzierte Histaminfreisetzungen der Basophilen gekennzeichnet

ist.

0,0%

15,0%

30,0%

45,0%

60,0%

75,0%

90,0%

-1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47

Woche

His

tam

infr

eise

tzun

g (%

von

Max

.)

R S

Abb. 11: Histaminfreisetzung der Katzen R und S auf den Flohextrakt WBE-G (5 µg/ml) im zeitlichen Verlauf der Untersuchung Die im Verhältnis zur maximalen Freisetzung ausgedrückte antigeninduzierte Histaminfreisetzung (3.4.4) der Katzen R und S (3.3.1) ist vom Ausgangsstatus bis zum Abschluss der Untersuchung chronologisch dargestellt. Unterbrechungen im Kurvenverlauf sind auf nicht auswertbare FITs zurückzuführen. Auf oder oberhalb der roten Linie (27,8%) liegende Werte gelten als positive Reaktion (4.2.3.1).

Wie bereits in der Gruppe mit hoher Ag-Exposition beobachtet, entwickelten auch

drei mit Imidacloprid behandelte, gering exponierte Tiere (Tab. 6: G, N, P) im

späteren Verlauf der kontrollierten Flohexpositionen eine funktionelle Sensibilisierung

(late onset Kinetik).

Die Katzen G und N zeigten erst nach 30 bzw. 18 Wochen wiederholter

Flohexpositionen eine Sensibilisierung ihrer Basophilen, die bis zum Ende der

Untersuchung erhalten blieb. Beide Tiere reagierten zunächst nur auf die höchste

Antigenkonzentration von 5 µg/ml (Sensibilisierungsgrad 1), zeigten im weiteren

Verlauf aber auch auf die nächsthöhere Verdünnungsstufe (1 µg/ml) eine deutliche

Histaminfreisetzung der Basophilen. Ein weiteres Tier (P) zeigte in den Wochen 30,

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

100

38 und 43 eine positive FIT-Reaktion (Grad 1), wobei die Sensibilisierung in diesem

Fall nicht ganz kontinuierlich nachzuweisen war.

Insgesamt waren in der Gruppe der gering exponierten Tiere folgende

Sensibilisierungskinetiken gegen C. felis-Antigene festzustellen: vier Katzen (H, I, O,

Q) waren zu keinem Zeitpunkt sensibilisiert (konstant negativ), drei Katzen (K, R, S),

die vor Beginn der Untersuchung im FIT negativ reagiert hatten, zeigten bei der

ersten FIT-Untersuchung drei Wochen nach Beginn der Flohexpositionen eine

positive Reaktion (early onset), drei Katzen (G, N und P) entwickelten im späteren

Verlauf durch die wiederholten Expositionen mit C. felis eine vorher nicht bestehende

Sensibilisierung (late onset) und zwei weitere Katzen (L, M) waren durchgehend

sensibilisiert (konstant positiv). Von den drei Tieren mit early onset Kinetik blieb

jedoch nur eines (K) konstant positiv, während bei den Katzen R und S eine

differenzierte Betrachtung der individuellen Histaminfreisetzungen (Abb. 11) ein

undulierendes Verlaufsmuster offenbart, was zu wechselnden Bewertungen der FIT-

Reaktionen dieser Tiere führt.

Abb. 12 veranschaulicht die in der gering exponierten Gruppe vorkommenden

Sensibilisierungsmuster.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

-1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47

Woche

Mitt

lere

r S

ensi

bilis

ieru

ngsg

rad

early onset, n=3 (K, R, S)

late onset, n=3 (G, N, P)

konstant neg., n=4 (H, I, O, Q)

konstant pos., n=2 (L, M)

Abb. 12: Überblick über die Sensibilisierungsmuster der behandelten, gering exponierten Katzen im zeitlichen Verlauf. Dargestellt ist der Verlauf der Sensibilisierung in der Gruppe mit geringer Ag-Exposition (3.3.1) in Sensibilisierungsgraden. Tiere mit ähnlicher Kinetik sind in Gruppen zusammengefasst und mit ihrem mittleren Sensibilisierungsgrad zum jeweiligen Zeitpunkt dargestellt. Ein Sensibilisierungsgrad ≥ 1 gilt als positiv (auf und oberhalb der horizontalen gestrichelten Linie liegende Werte, 4.2.3.1)

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

101

4.2.3.4 Vergleich der Sensibilisierungskinetik im F IT zwischen Katzen mit

geringer und hoher C. felis - Antigenexposition

Wie in den beiden vorausgehenden Abschnitten beschrieben, traten während der

Verlaufsuntersuchung über 47 Wochen unter dem Einfluss kontrollierter

Flohexpositionen sowohl bei mit Imidacloprid behandelten, dadurch gering mit

Flohspeichel exponierten Tieren als auch bei unbehandelten, hoch exponierten

Tieren vergleichbare Sensibilisierungsmuster auf. In beiden Gruppen entwickelten

einige Tiere nach unterschiedlich langer Zeit eine Sensibilisierung durch die

regelmäßigen Flohexpositionen. Andererseits waren in beiden Gruppen ebenso Tiere

zu finden, die trotz unterschiedlich intensiven Antigenkontakts zu keinem Zeitpunkt

eine Sensibilisierung ihrer Basophilen aufwiesen. Abb. 13 zeigt die mittlere

Sensibilisierung beider Gruppen im Vergleich. Auffällig ist, dass der

Sensibilisierungsstatus der hoch und der gering exponierten Gruppe vor Beginn der

Verlaufsuntersuchung sehr ähnlich und auf einem niedrigen Niveau war. Die mittlere

Sensibilisierung der hoch exponierten Gruppe lag zu Beginn der Untersuchung bei

0,3 und erreichte zu keinem der gemessenen Zeitpunkte einen positiven Wert. Der

Ausgangsstatus der behandelten, gering exponierten Tiere lag bei einem mittleren

Sensibilisierungsgrad von 0,4 und erreichte gegen Ende des untersuchten Zeitraums

den Sensibilisierungsgrad 1. Die scheinbaren Unterschiede ab Woche 22 entstanden

durch die geringen n-Zahlen (insbesondere der hoch exponierten Gruppe: n=6), die

einen starken Einfluss einzelner nicht auswertbarer FIT-Untersuchungen bedingten.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

102

0

0,5

1

1,5

2

-1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47

Woche

Mitt

lere

r Sen

sibi

lisie

rung

sgra

d hohe Exposition

geringe Exposition

Abb. 13: Kinetik der Sensibilisierung der Gruppe mi t hoher und geringer C. felis-Ag-Exposition. Dargestellt ist der mittlere Sensibilisierungsgrad der hoch exponierten Katzen (n=6) und der gering exponieren Tiere (n=12) über einen Zeitraum von 48 Wochen. Die gestrichelte Linie markiert den Sensibilisierungsgrad 1 (4.2.3.1).

Tab. 7: Ergebnisse des Fisher-Test auf Unterschiede in der FIT-Reaktion zwischen den Gruppen.

Angegeben sind die p-Werte, die der Fisher-Test auf Signifikanz liefert (3.4.8). Fettgedruckte Werte bezeichnen Wochen, in denen ein signifikanter Unterschied im Verhältnis von positiven zu negativen FIT-Reagenten zwischen den Gruppen bestand. Für die Berechnung der p-Werte wurden die mit dem WBE-G-Extrakt (3.2.6) erzielten Befunde zugrunde gelegt.

Mit Hilfe des Fisher-Tests wurde überprüft, ob es zu einem Zeitpunkt einen

Unterschied zwischen den Gruppen im Verhältnis von positiven und negativen FIT-

Reagenten gibt. Aus Tab. 7 geht hervor, dass nur in Woche 22 ein signifikanter

Unterschied bestand, möglicherweise bedingt durch eine nicht auswertbare FIT-

Untersuchung eines sonst durchgehend positiven Tieres (D).

Woche

- 1 3 6 10 14 18 22 26 30 34 38 43 47

p-Wert 0,57 1,00 1,00 1,00 0,51 1,00 0,04 0,60 0,15 0,60 0,62 0,61 1,00

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

103

Zu allen anderen Zeitpunkten bestand zwischen den Gruppen statistisch Gleichheit

hinsichtlich der FIT-Reaktion. Somit hatte bei ausschließlichem Vergleich der

Entwicklung der Sensibilisierungsgrade die Verminderung der Ag-Exposition

statistisch keinen Einfluss auf die im FIT dokumentierte Entwicklung der

Sensibilisierung gegen C. felis-Antigene in der Ag-Präparation WBE-G.

0

0,5

1

1,5

2

34 38 43 47

Woche

Mitt

lere

r Sen

sibi

lisie

rung

sgra

d hohe Exposition

geringe Exposition

Abb. 14: Kinetik der Sensibilisierung gegen Antigen e der Präparation WBE-H der Gruppe mit hoher und geringer C. felis-Ag-Exposition. Dargestellt ist der mittlere Sensibilisierungsgrad der hoch exponierten Katzen (n=6) und der gering exponieren Tiere (n=12) über einen Zeitraum von 13 Wochen. Die gestrichelte Linie markiert den Sensibilisierungsgrad 1 (4.2.3.1). Die Daten beziehen sich auf Ergebnisse, die mit dem Ag-Extrakt WBE-H erzielt wurden.

Der von der 34. bis zur 47. Woche gleichzeitig eingesetzte, selbst hergestellte

Extrakt WBE-H zeigte ebenfalls keinen signifikanten Unterschied zwischen den

Gruppen hinsichtlich der FIT-Reaktion (Abb. 14).

Im Gegensatz zu dieser schematischen Klassifizierung der Reaktionsmuster nach

Sensibilisierungsgraden erlaubt die Betrachtung der tatsächlichen,

antigenspezifischen Histaminfreisetzungen genauere Einblicke in die

Sensibilisierungskinetik der Katzen gegen Antigene von C. felis. Im folgenden

Abschnitt sollte mit Hilfe der Regressionsanalyse untersucht werden, ob die

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

104

bisherigen Beobachtungen bestätigt und ggf. um zusätzliche Informationen erweitert

werden können.

4.2.3.5 Regressionsanalyse der im FIT beobachteten

Sensibilisierungskinetiken

Die bereits erfolgten Betrachtungen zur Sensibilisierungskinetik der Katzen basierten

auf der graduellen Einstufung der FIT-Reaktion auf den C. felis-Antigenextrakt WBE-

G (3.2.6). Antigeninduzierte Freisetzungen, die über 27,8% der maximalen

Freisetzung lagen, wurden dabei als positiv eingestuft (4.2.3.1). Die absolute

Histaminfreisetzung auf eine Ag-Konzentrationsstufe wurde nur hinsichtlich dieses

Grenzwerts berücksichtigt und die Sensibilisierung eines Tieres zu einem Zeitpunkt

in Stufen ausgedrückt. Katzen, die im Verlauf der Untersuchung eine ähnliche Kinetik

zeigten, wurden zu entsprechenden Gruppen zusammengefasst.

Um eine differenziertere Betrachtung der absoluten Histaminfreisetzungen einzelner

Tiere sowie nach Sensibilisierungsmustern gruppierter Katzen im Zeitverlauf zu

ermöglichen, wurden Regressionsanalysen durchgeführt. Es sollte insbesondere

geprüft werden, inwieweit die Dauer der Untersuchung und die damit verbundene

Anzahl an Flohexpositionen eine Veränderung in der Höhe der spezifischen

Histaminfreisetzungen bewirkt hat.

Tab. 8 enthält die Ergebnisse der Regressionsanalyse für die nicht sensibilisierten

Katzen der hoch exponierten (Tab. 8A) und der gering exponierten Gruppe (Tab.

8B). Der genäherte Wert für die Histaminfreisetzung in Woche 0 (Achsenabschnitt)

lag bei den drei Katzen mit hoher Ag-Exposition etwa zwischen 4 und 8% (Tab. 8A).

Die geschätzte, statistisch nicht signifikante wöchentliche Zunahme in der

Histaminfreisetzung (Regressionskoeffizient) lag bei ca. 0,1%. Eine signifikante,

durch den Faktor Zeit erklärbare Änderung in der Höhe der antigeninduzierten

Freisetzung war weder für ein einzelnes Tier noch für das Gesamtmodell erkennbar.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

105

Tab. 8A: Antigeninduzierte Sensibilisierungskinetik bei konstant FIT-negativen Katzen mit hoher Ag-Exposition als Regressionsmodell.

Tab. 8B: Antigeninduzierte Sensibilisierungskinetik bei konstant FIT-negativen Katzen mit geringer Flohantigen-Exposition als Regressionsmode ll.

Tier ID Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert

H -0,02 ± 0,18 9,37 ± 4,84 0,001 0,93

I -0,04 ± 0,10 7,02 ± 2,68 0,01 0,72

O -0,30 ± 0,16 11,79 ± 3,03 0,34 0,10

Q 0,15 ± 0,17 6,44 ± 4,54 0,09 0,40

Gesamt -0,02 ± 0,08 8,39 ± 1,91 0,001 0,83

Erläuterung zu Tabelle 8: Dargestellt sind für die hoch exponierten, nicht sensibilisierten Katzen A, B und F (Tab. 8A, 3.3.1) sowie die gering exponierten Katzen H, I, O und Q (Tab. 8B) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0) und das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch die Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8).

Bei den gering exponierten, nicht sensibilisierten Tieren (Tab. 8B) lag die geschätzte,

durch Flohantigen induzierte Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0 zwischen 6 und

12% und damit auf einem ähnlich niedrigen Niveau wie bei den hoch exponierten

Katzen (Tab. 8A). Für das Gesamtmodell lag die Änderung in der

Histaminfreisetzung nahezu bei null und war ebenfalls nicht durch die fortschreitende

Zeit zu begründen.


A 0,11 ± 0,14 3,82 ± 3,63 0,05 0,45

B 0,17 ± 0,18 4,06 ± 4,78 0,08 0,35

F 0,12 ± 0,15 7,83 ± 4,08 0,06 0,43

Gesamt 0,13 ± 0,09 5,24 ± 2,35 0,06 0,14

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

106

Abb. 15: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der konstant FIT-negativen Katzen nach Gruppen. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der im Zeitverlauf nicht sensibilisierten, hoch exponierten Katzen A, B und F (durchgezogene Linie) sowie der gering exponierten Tiere H, I, O und Q (gestrichelte Linie) als Regressionsmodell (3.4.8). Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (x-parallele Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).

Die Daten der dauerhaft nicht sensibilisierten Katzen sind in Abb. 15 dargestellt. Es

fällt auf, dass die Regressionsgeraden der hoch exponierten (durchgezogene Linie)

und der gering exponierten Tiere (gestrichelte Linie) einen ähnlichen Verlauf

nehmen. Bei den hoch exponierten Katzen ist ein leichter Anstieg der

Regressionsgerade (durchgezogene Linie) erkennbar, der jedoch nicht signifikant ist.

Demnach zeigten diese sieben Tiere auch nach 40 wöchentlichen, kontrollierten

Flohexpositionen und einem zusätzlichen Nachbeobachtungszeitraum von sechs

Wochen keine Tendenz zu einer funktionellen Sensibilisierung ihrer Basophilen

gegen Flohantigene.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

107

Die Daten der Katzen, die vor Beginn der Flohexpositionen im FIT nicht auf

Flohantigen reagierten, aber bereits in den ersten Wochen nach kontrolliertem

Flohkontakt eine Sensibilisierung zeigten (K, R und S), sind in Tab. 9 dargestellt. Für

Katze K, die im weiteren Untersuchungszeitraum konstant FIT-positiv war, besteht

eine signifikante Steigerung der auf Flohantigen spezifisch freigesetzten

Histaminmenge um ca. 0,8% pro Woche. Aufgrund der großen, durch die

Flohexpositionen über die Zeit nicht erklärbare Varianz in den Messwerten war eine

Änderung in der Histaminfreisetzung für die Katzen R und S im Regressionsmodell

für den gesamten Zeitraum nicht nachweisbar. Ein frühes Einsetzen der funktionellen

Sensibilisierung wie bei den gering exponierten Katzen K, R und S wurde in der

Gruppe mit hoher Ag-Exposition nicht beobachtet.

Tab. 9: Antigeninduzierte Sensibilisierungskinetik der früh sensibilisierten Katzen als Regressionsmodell (Woche -1 bis 22).


K 0,79 ± 0,35 27,51 ± 9,52 0,31 0,05

R 0,11 ± 0,66 29,51 ± 15,71 0,004 0,87

S 0,23 ± 0,32 14,58 ± 9,00 0,05 0,49

Gesamt 0,40 ± 0,27 23,93 ± 7,10 0,06 0,15

Dargestellt sind für die frühsensibilisierten Katzen K, R und S (early onset) (3.3.1) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0), das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch den Faktor Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8)

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

108

Abb. 16: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der frühsensibilisierten Katzen. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der frühsensibilisierten Katzen K, R und S (gering exponierte Gruppe) als Funktion der Zeit in Form einer Regressionsgeraden (y=0,40x + 23,93; r2=0,06, p=0,15). Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (x-parallele Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).

Abb. 16 zeigt die Regressionsgerade für das Gesamtmodell der frühsensibilisierten

Katzen K, R und S. Der geschätzte Ausgangswert für die spezifische

Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0 betrug ca. 24%. Die wöchentliche Zunahme der

auf Stimulation mit dem Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) freigesetzten Histaminmenge

war nicht signifikant und lag bei ca. 0,4%.

An der gemeinsamen Regressionsgeraden lässt sich ablesen, dass die

frühsensibilisierten Katzen im Modell etwa in der 10. Woche eine im FIT

nachweisbare funktionelle Sensibilisierung aufgebaut haben.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

109

Abb. 17: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der frühsensibilisierten Katzen R und S in drei Phasen der Verlaufsuntersuchung. Der Verlauf der antigeninduzierten Histaminfreisetzung der frühsensibilisierten Katzen R und S ist in Phasen von Woche 2 bis 14, 14 bis 22 sowie 22 bis 34 dargestellt.

Wie bereits an anderer Stelle erläutert (vergleiche 4.2.2.3, Abb. 11), zeichnete sich

das Reaktionsmuster der frühsensibilisierten Katzen R und S im Gegensatz zum

ebenfalls frühsensibilisierten Tier K durch einen wechselnden Verlauf aus, der auf

eine Modulation der Immunantwort hindeutet. Die antigeninduzierte

Histaminfreisetzung dieser Tiere war zumeist in vergleichbarer Weise von

abwechselnd höheren und niedrigeren Werten geprägt. Dies wird auch bei

Betrachtung der Regressionsgeraden für die Zeiträume von Woche 2 bis 14, Woche

14 bis 22 sowie 22 bis 34 deutlich (Abb. 17).

Bei den spätsensibilisierten Katzen E, G, N und P (late onset) war eine erhöhte

Histaminfreisetzung erst nach mehreren wöchentlichen Flohexpositionen feststellbar.

Vor Beginn der Verlaufsuntersuchung lag die im Regressionsmodell geschätzte

Histaminfreisetzung zwischen 0 (-3) und 4 %. Für die einzelnen Katzen war bis auf

Katze P ebenfalls eine signifikante Steigerung zu verzeichnen (Tab. 10,

Regressionskoeffizient). Auffällig ist, dass die drei Katzen (E, G, N), die eine

signifikante Steigerung zeigten, alle aus einer flohfreien Aufzucht kamen, somit ihre

erste Flohexposition im Rahmen dieser Untersuchungen erlebten.

Katze P hatte mit 0,45 % pro Woche die geringste Änderung zu verzeichnen,

während bei Katze N die Menge des antigenspezifisch freigesetzten Histamins

wöchentlich um ca. 2% zunahm.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

110

Tab. 10: Antigeninduzierte Sensibilisierungskinetik der spätsensibilisierten ( late onset) Katzen als Regressionsmodell.


E 0,70 ± 0,24 2,44 ± 6,51 0,43 0,02 G 1,18 ± 0,31 -3,47 ± 8,34 0,57 0,003 N 2,07 ± 0,44 0,10 ± 10,85 0,68 0,001 P 0,45 ± 0,30 4,19 ± 7,50 0,18 0,17

Gesamt 1,06 ± 0,21 1,40 ± 5,31 0,35 < 0,001

Dargestellt sind für die spätsensibilisierten Katzen mit hoher Antigenexposition (E) sowie mit geringer Antigenexposition (G, N, P) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0), das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch den Faktor Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8)

Abb. 18: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der spätsensibilisierten Katzen. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der spätsensibilisierten Katzen (late onset) E, G, N und P als Funktion der Zeit in Form einer Regressionsgeraden. Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (x-parallele Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

111

Im Gesamtmodell der spätsensibilisierten Katzen (Abb. 18) ist am Verlauf der

Regressionsgeraden zu erkennen, dass die funktionelle Sensibilisierung statistisch

etwa ab der 25. Woche vorhanden war (Schnittpunkt der Regressionsgeraden mit

der x-parallelen positiven Grenzlinie) und somit deutlich später als bei den

frühsensibilisierten Katzen, die bereits in Woche 10 funktionell sensibilisiert waren.

Betrachtet man die Entwicklung der antigeninduzierten Histaminfreisetzung der

Katzen mit late onset Kinetik genauer, so fallen zwei Phasen auf: In den ersten

Wochen der Untersuchung (Woche -1 bis 18) fand bei keinem der vier Tiere eine

signifikante Veränderung im Zeitverlauf stattfand. Das Regressionsmodell für die

zweite Hälfte der Untersuchung (Woche 22 bis 47) zeigt dagegen eine signifikante

Zunahme der Flohantigen-induzierten Freisetzung um ca. 2 % pro Woche (Abb. 19,

Tab. 11).

Abb. 19: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der spätsensibilisierten Katzen. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der spätsensibilisierten Katzen E, G, N und P (late onset) als Funktion der Zeit in Form von Regressionsgeraden für den Zeitraum von Woche -1 bis 18 (y=-0,04x + 10,84; r2=0,001, p=0,87) und Woche 22 bis 47 (y=1,86x – 25,8; r2=0,24, p=0,01). Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (gepunktete horizontale Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

112

Tab. 11A: Antigeninduzierte Sensibilisierungskineti k der spätsensibilisierten Katzen in Woche -1 - 18.

Woche

-1 - 18 Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert

hohe Exposition

(n=1) 0,28 ± 0,37 9,18 ± 3,88 0,13 0,49

geringe

Exposition

(n=3) -0,14 ± 0,26 11,40 ± 2,79 0,02 0,60

Gesamt -0,04 ± 0,22 10,84 ± 2,27 0,001 0,87

Tab. 11B: Antigeninduzierte Sensibilisierungskineti k der spätsensibilisierten Katzen in Woche 22 – 47.

Woche

22 - 47 Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert

hohe Exposition

(n=1) 1,95 ± 0,58 -43,31 ± 20,42 0,69 0,02

geringe

Exposition

(n=3) 1,95 ± 0,89 -23,21 ± 30,27 0,22 0,04

Gesamt 1,86 ± 0,68 -25,80 ± 23,34 0,24 0,01

Erläuterung zu Tabelle 11: Dargestellt nach Antigenexposition sind für die spätsensibilisierten Katzen (3.3.1) in Woche -1 bis 18 (Tab. 11A) sowie in Woche 22 – 47 (Tab. 11B) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0), das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch den Faktor Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8)

Die im Gesamtmodell (Tab. 10) angenommene Zunahme von ca. 1% in der Woche

ergab sich also hauptsächlich aus der Zunahme der Freisetzung im späteren Verlauf

der Untersuchung, während in den ersten 18 Wochen die Höhe der

Histaminfreisetzung nahezu gleich blieb. Die Zerlegung des Gesamtmodells in zwei

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

113

Zeitabschnitte bestätigte somit, dass bei den Katzen E, G, N und P die funktionelle

Sensibilisierung gegen C. felis-Ag erst zu einem späteren Zeitpunkt eingetreten ist.

Bei den auf Dauer sensibilisierten Katzen D, L und M lag die genäherte

Histaminfreisetzung vor Beginn der Untersuchung zwischen 84 und 98%

(Achsenabschnitt, Tab. 12). Interessanterweise war bei zwei konstant positiven

Tieren sogar eine im Zeitverlauf abnehmende Histaminfreisetzung (negativer

Regressionskoeffizient) zu beobachten. Bei der Katze D (hohe Ag-Exposition) war

diese Abnahme um ca. 1% pro Woche unter dem Einfluss wöchentlicher

Flohexpositionen hochsignifikant.

Tab. 12: Antigeninduzierte Sensibilisierungskinetik der konstant FIT-positiven Katzen als Regressionsmodell.


D -0,94± 0,29 98,09 ± 7,86 0,51 0,01

L 0,52 ± 0,45 84,08 ± 9,77 0,21 0,30

M -0,33 ± 0,29 96,66 ± 7,86 0,11 0,28

Gesamt -0,48 ± 0,21 95,73 ± 5,45 0,15 0,03

Dargestellt sind für die durchgehend sensibilisierten Katzen D, L und M (3.3.1) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0), das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch den Faktor Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8)

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

114

Abb. 20: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der konstant FIT-positiven Katzen. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der dauerhaft sensibilisierten Katzen D, L und M als Funktion der Zeit in Form einer Regressionsgeraden. Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (x-parallele Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1). Insgesamt wurde im Regressionsmodell bei den konstant positiven Katzen eine

signifikante Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung um ca. 0,5% pro

Woche ermittelt (Abb. 20, Tab. 12). Da dieser Verlauf aber nur bei dem hoch

exponierten Tier D signifikant von der Zeit abhängig war, ist eine nach Gruppen

getrennte Betrachtung interessant.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

115

Abb. 21: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der konstant FIT-positiven Katzen nach Gruppen Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der dauerhaft sensibilisierten, hoch exponierten Katzen D (durchgezogene Linie) sowie der gering exponierten Katzen L und M (gestrichelte Linie) als Funktion der Zeit in Form von Regressionsgeraden. Über dem Grenzwert liegende Freisetzungen (x-parallele Linie bei 27,8%) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1). Wenn das Gesamtmodell um den Einfluss der Katze D bereinigt wird, verdeutlicht

sich die nach Höhe der Ag-Exposition unterschiedliche Kinetik innerhalb des

Reaktionsmusters der dauerhaft sensibilisierten Katzen. Während die gering

exponierten Katzen über den gesamten Zeitraum nahezu gleich hohe

Histaminfreisetzungen zeigten, fand eine tatsächliche Abnahme der Freisetzung nur

bei der Katze mit hoher Ag-Exposition statt (Abb. 21).

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

116

Ein weiteres Beispiel für eine abnehmende Histaminfreisetzung unter hoher Ag-

Exposition lieferte die Katze C (Abb. 22). Wie Katze D zeigte dieses Tier im Verlauf

der Untersuchung in der Tendenz abnehmende spezifische Histaminfreisetzungen

auf Antigene im Extrakt WBE-G in einer Konzentration von 5 µg/ml.

Bei Katze C führte die um ca. 0,8 % pro Woche sinkende Freisetzung schließlich zu

einer Negativ-Bewertung ihrer FIT-Reaktion ab der 22. Woche. Rechnerisch lag die

geschätzte Histaminfreisetzung bereits ab Woche 18 unter dem Grenzwert von

27,8% (4.2.3.1). Da die antigeninduzierte Freisetzung von Katze D schon vor Beginn

der Untersuchung auf einem hohen Niveau lag (Achsenabschnitt 98,1%, Abb. 21,

Tab. 12), war sie in ihrer FIT-Reaktion konstant positiv, obwohl sich die

antigeninduziert freigesetzte Histaminmenge mit ca. 1% pro Woche stärker

verminderte als bei Katze C.

Abb. 22: Entwicklung der antigeninduzierten Histami nfreisetzung der hoch exponierten Katze C. Dargestellt sind die prozentualen Flohantigen-induzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der Katze C als Funktion der Zeit in Form einer Regressionsgeraden (y= -0,76x + 40,8; r2=0,51, p=0,01, 3.4.8). Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (gestrichelte Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

117

Da bei verschiedenen Reaktionsmustern abhängig von der Ag-Exposition

unterschiedliche Kinetiken aufgetreten sind, wurde ein Regressionsmodell errechnet,

welches nicht auf Reaktionstypen sondern auf Gruppenzugehörigkeit basiert, um den

Einfluss der Antigenmenge auf das Sensibilisierungsverhalten noch genauer zu

beleuchten.

Tab. 13: Regressionsmodell der antigeninduzierten S ensibilisierungskinetik nach Gruppen.

Gruppe Regressionskoeff. Achsenabschnitt r2 p-Wert

hohe Ag-Exposition -0,08 ± 0,22 25,22 ± 5,76 0,002 0,71

geringe Ag-

Exposition 0,39 ± 0,19 22,92 ± 5,01 0,03 0,047

Gesamt 0,07 ± 0,15 27,17 ± 3,85 0,001 0,63

Dargestellt sind für die unbehandelten, hoch exponierten Katzen (n=6) sowie die behandelten, gering exponierten Katzen (n=12) die Steigung der Regressionsgeraden (Regressionskoeff.) (3.4.8), der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse (Achsenabschnitt, entspricht der antigeninduzierten Histaminfreisetzung zum Zeitpunkt 0), das Bestimmtheitsmaß (r2), welches ausdrückt, welcher Anteil der Variation der Freisetzungswerte sich durch den Faktor Zeit erklärt. Ist p<0,05, so ist die Zunahme bzw. Abnahme der antigeninduzierten Histaminfreisetzung (y) signifikant (3.4.8)

Die antigeninduzierte Histaminfreisetzung der gering exponierten Katzen lag zu

Beginn der Verlaufsuntersuchung bei ca. 23% und damit etwa auf dem gleichen

Niveau wie in der Gruppe mit hoher Ag-Exposition (Tab. 13). Ausgehend von diesen

ähnlichen Werten, haben die unterschiedlich hoch exponierten Gruppen im

Zeitverlauf differierende Entwicklungen ihrer funktionellen Sensibilisierung

genommen.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

118

Abb. 23: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der hoch exponierten Katzen . Dargestellt ist das Regressionsmodell der antigeninduzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der hoch exponierten Tiere (n=6) als Funktion der Zeit. Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (gepunktete Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).

Abb. 23 zeigt die Regressionsgerade sowie die individuellen spezifischen

Histaminfreisetzungen aller sechs Katzen mit hoher Ag-Exposition. Wie bereits

erläutert, zeigten einige Katzen eine deutliche funktionelle Sensibilisierung gegen

Antigene von C. felis. Dennoch liegt das Gesamtmodell zu jeder Zeit unterhalb des

Grenzwerts. Betrachtete man die Kinetiken der einzelnen Tiere gemeinsam, ließ sich

für die Gruppe insgesamt keine Tendenz erkennen. Die Veränderung der

Histaminfreisetzung der hoch exponierten Tiere war nicht signifikant (p>0,05, Tab.

13).

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

119

Das Gesamtmodell der zwölf gering exponierten Katzen (Abb. 24) wies dagegen eine

signifikante Steigerung der Histaminfreisetzung um ca. 0,4% pro Woche auf (p<0,05,

Tab. 13). Der Anteil der durch die Zeit erklärbaren Schwankungen der

Freisetzungswerte (r2=0,03) war gegenüber der Gruppe mit hoher Exposition

(r2=0,002) gut zehnfach erhöht. Das Regressionsmodell zeigt für die gering

exponierten Tiere insgesamt ab ca. Woche 12 statistisch eine funktionelle

Sensibilisierung (Schnittpunkt der Regressionsgeraden mit der x-parallelen Linie).

Abb. 24: Zeitliche Entwicklung der antigeninduziert en Histaminfreisetzung der gering exponierten Katzen. Dargestellt ist das Regressionsmodell der antigeninduzierten Histaminfreisetzungen (3.4.4) der Basophilen auf den Ag-Extrakt WBE-G (5 µg/ml, 3.2.6) der gering exponierten Tiere (n=12) als Funktion der Zeit. Über dem Grenzwert von 27,8% liegende Freisetzungen (x-parallele Linie) wurden als FIT-positiv eingestuft (4.2.3.1).

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

120

Zusammenfassend ließ sich feststellen, dass die Regressionsanalyse die

Klassifizierung der Tiere nach FIT-Sensibilisierungsgraden einerseits bestätigt, aber

auch neue Erkenntnisse hinsichtlich des Einflusses der Expositionsintensität auf die

Sensibilisierungskinetik lieferte. Mit Hilfe der Regressionsanalyse konnte gezeigt

werden, dass

1. die Kinetik der durchgehend nicht sensibilisierten Katzen in der gering und in

der hoch exponierten Gruppe sehr ähnlich verliefen, indem sie über einen

Beobachtungszeitraum von insgesamt 47 Wochen keine Tendenz zu einer

sich entwickelnden funktionellen Sensibilisierung zeigten.

2. die Kinetik der frühsensibilisierten (early onset) Katzen im Gesamtmodell

aufgrund sehr unterschiedlicher individueller Reaktionsmuster nur

unzureichend darstellbar war.

3. die spätsensibilisierten (late onset) Katzen im Gesamtmodell erst ab der 26.

Woche eine funktionelle Sensibilisierung zeigten.

4. bei den spätsensibilisierten Katzen sich in den ersten 18 Wochen keine, aber

ab der 22. Woche eine signifikante antigenspezifische funktionelle

Sensibilisierungstendenz mit einer Steigerung um etwa 2 % pro Woche

entwickelte.

5. bei vorsensibilisierten Katzen sich die Reaktionsstärke der Effektorzellen

(Basophilen) unter dem Einfluss einer hohen Antigenexposition signifikant

verminderte, während sie unter geringerer Antigenexposition eher gleich blieb.

Die Gesamtmodelle für die beiden verschieden hoch exponierten Gruppen zeigten,

dass unter dem Einfluss regelmäßiger Flohexpositionen bei einigen Tieren mit

geringer Flohantigenexposition in dieser Untersuchung eine durch die Expositionszeit

erklärbare, signifikante Zunahme der antigenspezifischen Histaminfreisetzung zu

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

121

verzeichnen war, während die Gesamtheit der hoch exponierten Katzen im Rahmen

dieser Arbeit überraschender Weise keine signifikante Veränderung im

Reaktionsverhalten ihrer Basophilen aufwiesen.

4.2.3.6 Untersuchung der Basophilen-Sensibilisierun g mit einem selbst

hergestellten C. felis-Antigenextrakt

Da die Sensibilisierungskinetik im FIT mit einem in den USA kommerziell erhältlichen

Ganzflohextrakt untersucht wurde, stellte sich die Frage, ob ein im FIT angewandter

Extrakt aus dem Flohstamm, der für die wöchentlichen Expositionen verwendet

wurde (3.2.6), ein identisches oder unterschiedliches Abbild der tatsächlichen

Sensibilisierung lieferte. Er kam ab der 34. Woche der Verlaufsuntersuchung zum

Einsatz. Die Anwendung war somit auf die letzten 13 Wochen beschränkt, so dass

vergleichende Befunde zu den beiden Antigenextrakten von vier Zeitpunkten

vorliegen.

Übereinstimmende Reaktionen der Basophilen auf zwei verschiedene C. felis-

Antigen-Extrakte

Drei (A, C, D) der sechs hoch exponierten Tiere zeigten zu allen vier Zeitpunkten ein

übereinstimmendes Ergebnis. Die Katzen A und C reagierten zu keinem der

Vergleichszeitpunkte ab Woche 34 auf einen der beiden Extrakte, Katze D hatte

immer übereinstimmend positive Befunde, wobei in Woche 34 eine etwas stärkere

Reaktion (Sensibilisierungsgrad 2) auf den Extrakt aus dem hauseigenen Flohstamm

zu verzeichnen war.

Katze B, die während des gesamten Untersuchungszeitraums nicht auf im Extrakt

WBE-G enthaltene Antigene reagierte, zeigte zu drei Zeitpunkten eine positive

Reaktion auf den Extrakt WBE-H (3.2.6). Auch bei Katze E war in Woche 43 und 47,

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

122

bei Katze F zu allen Zeitpunkten eine stärkere Reaktion auf die Antigene des

hauseigenen Flohstamms zu beobachten (Tab. 14).

Tab. 14: Vergleich der FIT-Befunde von zwei C. felis-Ag-Präparationen der hoch exponierten Gruppe in Sensibilisierungsgraden.

Woche

34 38 43 47 Tier

WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H

A 0 0 0 0 0 0 0 0

B 0 1 0 1 0 1 0 0

C 0 0 0 0 n.a. n.a. 0 0

D 1 2 2 2 2 2 1 1

E 0 2 1 0 1 2 1 2

F 0 2 1 2 0 2 0 2

Die Ag-Extrakte WBE-G und WBE-H (3.2.6) wurden in den Wochen 34 bis 47 an vier Zeitpunkten gleichzeitig eingesetzt. Die mit diesen Präparationen erzielten FIT-Ergebnisse sind in Sensibilisierungsgraden (4.2.3.1) für jedes hoch exponierte Tier vergleichend dargestellt. Nicht auswertbare FITs sind mit n.a. bezeichnet.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

123

Tab. 15: Vergleich der FIT-Befunde von zwei C. felis-Ag-Präparationen der gering exponierten Gruppe in Sensibilisierungsgraden.

Woche

34 38 43 47 Tier

WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H WBE-G WBE-H

G 2 2 2 2 2 2 2 2

H 0 1 0 1 0 1 0 0

I 0 0 0 0 0 0 0 0

K 1 2 1 2 1 2 1 2

L 2 2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

M 2 3 2 3 2 3 2 3

N 2 2 2 2 2 2 n.a. n.a.

O 0 0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

P 0 0 1 1 1 2 n.a. n.a.

Q 0 0 0 1 0 0 n.a. n.a.

R 0 0 n.a. n.a. 0 0 n.a. n.a.

S 0 0 1 2 1 0 0 0

Die Ag-Extrakte WBE-G und WBE-H (3.2.6) wurden in den Wochen 34 bis 47 an vier Zeitpunkten gleichzeitig eingesetzt. Die mit diesen Präparationen erzielten FIT-Ergebnisse sind in Sensibilisierungsgraden (4.2.3.1) für jedes gering exponierte Tier vergleichend dargestellt. Nicht auswertbare FITs sind mit n.a. bezeichnet.

In der Gruppe der gering exponierten Katzen waren die FIT-Reaktionen auf die

beiden Flohantigenpräparationen bei acht von zwölf Tieren gleichartig (Tab. 15). Fünf

Katzen (G, K, L, M, N) reagierten konkordant positiv, wobei bei den Tieren K und M

eine stärkere Reaktion auf den hauseigenen Flohantigenextrakt WBE-H vorhanden

war. Die Katzen H und Q, die zu allen Vergleichszeitpunkten FIT-negativ auf den

Extrakt WBE-G getestet wurden, zeigten dagegen eine positive Reaktion auf den

Extrakt WBE-H.

In den Wochen 34, 38 und 43 reagierten mehr Tiere positiv auf WBE-H als auf den

Extrakt WBE-G.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

124

Die statistische Übereinstimmung der mit den beiden Flohantigenpräparationen

erhobenen FIT-Befunde wurde mit Hilfe des McNemar-Tests ermittelt (3.4.8). Der

Test überprüft, ob Unterschiede in den diskordanten Häufigkeiten zufällig sind oder

tatsächlich ein signifikanter Unterschied in der Reaktion auf die beiden Extrakte

besteht. Außerdem wurde der Kappa-Index berechnet, der hilfreich in der Beurteilung

der Übereinstimmung der Befunde ist.

Die Ergebnisse der Berechnungen für jeden Zeitpunkt sind in Tabelle 16 dargestellt.

Tab. 16: Vierfeldertafel der FIT-Befunde mit den Ag -Extrakten WBE-G und WBE-H.

Woche

34 38 43 47

WBE-H

WBE-G negativ positiv negativ positiv negativ positiv negativ positiv

negativ 8 4 3 3 4 3 6 1

positiv 0 6 1 8 1 7 0 5

Σ 8 10 4 11 5 10 6 6

p-Wert > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Kappa 0,57 0,41 0,45 0,83

Dargestellt sind FIT-Befunde von vier Zeitpunkten, zu denen gleichzeitig beide Antigenextrakte (kommerzieller externer Flohantigen-Extrakt: WBE-G; und hauseigener Flohantigen-Extrakt: WBE-H) getestet wurden. Mit Hilfe des McNemar-Tests wurde geprüft, ob beide Extrakte eine gleiche FIT-Reaktion hervorrufen (Nullhypothese). Der Kappa-Index dient zusätzlich dazu, das Maß der Übereinstimmung darzustellen (3.4.8).

Es existierte zu keinem der Testzeitpunkte ein signifikanter Unterschied hinsichtlich

der FIT-Reaktion auf die verschiedenen C. felis-Antigenpräparationen. Nach dem

Kappa-Index bestand in den getesteten Wochen 34 bis 47 eine deutliche bis nahezu

vollständige Übereinstimmung in der Reaktion der Basophilen auf die beiden

Extrakte (3.4.8). Dennoch waren bei einzelnen Tieren unterschiedliche FIT-

Reaktionen zu beobachten, deren Bedeutung zu diskutieren ist.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

125

4.2.4 Intrakutantest

Die funktionelle Reaktionsbereitschaft der Mastzellen der 18 Katzen wurde mithilfe

des Intrakutantest (IKT) untersucht. Zwei Wochen vor Beginn der

Verlaufsuntersuchung wurde bei allen Katzen ein Hauttest durchgeführt. Weitere

Tests während der Untersuchung erfolgten in Woche 8 und in Woche 24. Sie fanden

in größeren zeitlichen Abständen statt als der FIT, um die Sensibilisierungskinetik der

Mastzellen durch inokuliertes Antigen möglichst wenig zu beeinflussen. Deshalb

wurden bei dem IKT in Woche 8 nur Tiere untersucht, die eine positive FIT-Reaktion

zeigten. Nach Beendigung der Infestationen erfolgte in Woche 46 eine

Abschlussuntersuchung.

Bewertungsverfahren

Traditionell wurde zur Bewertung des Intrakutantest die Reaktion der Mastzellen auf

die Kontrollsubstanzen Histamin (Positivkontrolle) und PBS (Negativkontrolle) mit der

Reaktion auf das Testantigen verglichen. Danach wurde eine Reaktion als positiv

bewertet, wenn der Durchmesser der entstehenden Antigenquaddel zu einem

Ablesezeitpunkt mindestens dem Mittelwert der Summe aus den Durchmessern

beider Kontrollquaddeln entspricht (Referenzverfahren). Daraus ergaben sich einige

Probleme, da die Mastzellreaktion auf ein Testantigen an einer Lokalisation in

Beziehung gesetzt wurde zu einer davon unabhängigen Reaktion auf Histamin und

PBS an zwei anderen Lokalisationen. Aus den Erfahrungen, die HAMPEL (2007) mit

dem Referenzverfahren bei der Auswertung des IKT bei Pferden sammelte, wurde

ein als Kinetikverfahren bezeichnetes Bewertungsschema erarbeitet, welches die

lokale Mastzellreaktion auf ein Antigen unabhängig von Reaktionen auf

Kontrollsubstanzen betrachtet. Dabei wurde unmittelbar nach Injektion der

Antigenlösung (Zeitpunkt t0) der allein durch das Injektionsvolumen verursachte

Quaddeldurchmesser ermittelt (Ausgangsquaddel = Volumenquaddel). Die durch die

Hautreaktion auf das injizierte Antigen an dieser Stelle bedingte Veränderung des

ursprünglichen Durchmessers wurde als Reaktionsquaddel bezeichnet und zu

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

126

mehreren Zeitpunkten nach Injektion erfasst. Die anschließende Auswertung erfolgte

unabhängig von der Reaktion auf die Kontrollsubstanzen. Da sich die

Interpretationsschwierigkeiten mit dem Referenzverfahren im Rahmen dieser

Untersuchung bei der Katze bestätigten, wurde zur Auswertung der

Intrakutantestbefunde ein basierend auf dem Kinetikverfahren nach HAMPEL

modifiziertes Schema angewendet. Eine Reaktion wurde als positiv gewertet, wenn

zu einem Ablesezeitpunkt der Quaddeldurchmesser größer als der Durchmesser der

Ursprungsquaddel zuzüglich der Standardabweichung reiner Volumenquaddeln war.

Mittlerer Durchmesser und Standardabweichung wurden aus 470 Messwerten von

Ausgangsquaddeln zum Zeitpunkt t0 berechnet und betrugen 6,7 ± 0,8 mm.

Anhand von Messbeispielen soll im Folgenden dokumentiert werden, wie sich die

beiden Auswertungsverfahren auf die Interpretation von Intrakutantestbefunden

auswirken. Aus Tab. 17 geht hervor, dass die Katze L bereits nach 15 Minuten eine

Hautreaktion an der Injektionsstelle des Flohextrakts zeigte. Diese wurde jedoch

nach den Kriterien des Referenzverfahrens zunächst als negativ bewertet, da der

mittlere Durchmesser der durch die Kontrollsubstanzen hervorgerufenen Quaddeln

(13,5 mm + 6,3 mm = 9,9 mm) über dem Durchmesser der Testquaddel (7,3 mm) lag

und somit eine andere Einstufung verhinderte. Da nach 30 Minuten die Reaktion auf

PBS nicht mehr nachweisbar war (Mittelwert 6,35 mm), wurde die Reaktion als

positiv bewertet, obwohl schon zum Zeitpunkt von 15 Minuten nach Injektion eine

deutliche Zunahme des Quaddeldurchmessers infolge einer Hautreaktion auf die

Testsubstanz zu verzeichnen war.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

127

Tab. 17: IKT-Befund der Katze L und vergleichende B ewertung nach Referenzverfahren und mod. Kinetikverfahren.

Zeit [min]

Tier Substanz (Konz.)

0 15 30 60

Histamin

(100 µg/ml)

Ø [mm] 6,8 13,5 12,7 15,6

PBS

Ø [mm] 6,8 6,3 0 0 L

C. felis-Ag-

Extr. (5 µg/ml)

Ø [mm]

6,4 7,3 7,1 0

Referenz-

verfahren - neg. pos . neg.

Bewertung

nach: Kinetik-

verfahren - pos . neg. neg.

Dargestellt sind die Quaddeldurchmesser (mm) der Injektionslösungen Histamin, PBS und Flohantigen (C. felis-Ag) zu den Ablesezeitpunkten 0, 15, 30 und 60 Minuten p.i. Quaddeldurchmesser, die größer als der Ausgangswert sind, sowie positive Bewertungen sind fett markiert.

Dies veranschaulicht, dass deutliche Hautreaktionen auf eine Testsubstanz teilweise

zu falsch-negativen Bewertungen führen können, wenn sie nach dem

Referenzverfahren ausschließlich im Hinblick auf die Reaktion auf

Kontrollsubstanzen (PBS und Histamin) ausgewertet werden (Tab. 17, Zeitpunkt 15

min.). Umgekehrt können falsch-positive Resultate vermieden werden, indem eine

Bewertung unabhängig von Kontrollsubstanzen nach dem Kinetikverfahren erfolgt

(Tab. 17, Zeitpunkt 30 min.).

Während die Interpretation der Messwerte in diesem Fall nach beiden Verfahren zu

einer positiven Endbewertung führte, dokumentiert Tab. 18 die Abhängigkeit des

Referenzverfahrens von der Reaktion auf die Kontrollsubstanzen noch deutlicher.

Die Histaminquaddel vergrößert sich über den betrachteten Zeitraum nur gering,

während die PBS-Quaddel nach 30 Minuten nicht mehr vorhanden ist. Dies führt

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

128

nach dem Referenzverfahren zu einer falsch-positiven Bewertung, obwohl der

Durchmesser der Flohantigen-Quaddel bereits unter dem Wert des durch das

Injektionsvolumen bedingten Durchmessers lag.

Tab. 18: IKT-Befund der Katze B und vergleichende B ewertung nach Referenzverfahren und mod. Kinetikverfahren.

Zeit [min]

Tier Substanz (Konz.)

0 15 30 60

Histamin

(100 µg/ml)

Ø [mm] 6,5 8,0 6,9 6,7

PBS

Ø [mm] 7,3 5,7 0 0 B

C. felis-Ag-

Extr. (5 µg/ml)

Ø [mm] 8,2 5,9 5,9 0

Referenz-

verfahren - neg. pos . neg.

Bewertung

nach: Kinetik-

verfahren - neg. neg. neg.

Dargestellt sind die Quaddeldurchmesser (mm) der Injektionslösungen Histamin, PBS und Flohantigen (C. felis-Ag) zu den Ablesezeitpunkten 0, 15, 30 und 60 Minuten p.i. Quaddeldurchmesser, die größer als der Ausgangswert sind, sowie positive Bewertungen sind fett markiert.

4.2.4.1 Ergebnisse des IKT in der Gruppe mit hoher C. felis-Antigenexposition

Die Reaktionsbereitschaft der Mastzellen wurde zwei Wochen vor Beginn der

Verlaufsuntersuchung getestet. Keines der hoch exponierten Tiere zeigte eine

funktionelle Sensibilisierung auf Antigene in der Präparation von Greer (WBE-G,

3.2.6). Erstaunlich ist, dass auch in den folgenden Untersuchungen in Woche 8, 24

und 46 bei keinem der sechs Tiere eine Reaktion auf diesen Ganzflohextrakt

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

129

nachgewiesen werden konnte, obwohl die Mastzellen dieser Katzen über den

gesamten Zeitraum mit großen Mengen Flohantigen konfrontiert wurden (4.2.1.1).

Tab. 19: Übersicht der IKT-Befunde der hoch exponie rten Gruppe in Sensibilisierungsgraden.

Woche

- 2 8 24 46 Tier

WBE-G WBE-G WBE-G WBE-G WBE-H

A 0 - 0 0 0

B 0 - 0 0 0

C 0 0 0 0 0

D 0 0 0 0 2

E 0 - 0 0 2

F 0 - 0 0 2

Für jedes Tier der hoch exponierten Gruppe ist der im IKT ermittelte Sensibilisierungsgrad der Mastzellen dargestellt. Ein Sensibilisierungsgrad von 2 bedeutet eine nach dem Kinetikverfahren (4.2.4) positive Reaktion der Mastzellen auf den Flohantigenextrakt in den Konzentrationsstufen 5 und 1 µg/ml, 0 entspricht einem negativen Testergebnis. Die gestrichelte Linie trennt die in Woche 47 erhobenen Befunde des kommerziellen Extraktes (WBE-G) von den mit dem hauseigenen Extrakt (WBE-H) erzielten Ergebnissen. In Woche 8 nicht getestete Tiere (Vermeidung der Induktion einer Sensibilisierung bei zu diesem Zeitpunkt FIT-negativen Tieren) sind mit (-) bezeichnet.

Wie in Tab. 19 dargestellt, unterschieden sich die Reaktion auf den Extrakt WBE-G

und die in Woche 47 simultan eingesetzte Präparation WBE-H aus dem

institutseigenen Flohstamm deutlich. Drei der sechs Tiere (D, E, F) reagierten in zwei

Konzentrationsstufen (5 und 1 µg/ml) positiv auf WBE-H, jedoch nicht auf WBE-G.

Der IKT in der 46. Woche erfolgte sechs Wochen nach der letzten Flohexposition.

Trotz längerer Antigenkarenz war durch Antigene der für die Expositionen

verwendeten Flöhe eine Mastzellreaktion auslösbar, die nach Konfrontation mit dem

Extrakt WBE-G nicht zu beobachten war.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

130

4.2.4.2 Ergebnisse des IKT in der Gruppe mit gering er C. felis-Antigen-

exposition

Aus Tabelle 20 geht hervor, dass zwei gering exponierte, mit Imidacloprid behandelte

Katzen (L und M) bereits vor Beginn der Untersuchung eine Sensibilisierung

aufwiesen. Bei Tier M war lediglich bei der Abschlussuntersuchung in Woche 46

keine Mastzellreaktion mehr zu beobachten, weder bei dem von extern bezogenen

Extrakt WBE-G, noch beim aus dem institutseigenen Flohstamm hergestellten

Extrakt WBE-H.

Tab. 20: Übersicht der IKT-Befunde der gering expon ierten Gruppe in Sensibilisierungsgraden.

Woche

- 2 8 24 46 Tier

WBE-G WBE-G WBE-G WBE-G WBE-H

G 0 - 0 0 0

H 0 - 0 0 0

I 0 - 0 0 0

K 0 0 0 0 0

L 1 2 1 2 0

M 1 1 2 0 0

N 0 - 0 1 2

O 0 - 0 0 0

P 0 - 1 1 2

Q 0 - 0 0 0

R 0 0 0 0 0

S 0 0 0 0 0

Für jedes Tier der gering exponierten Gruppe ist der im IKT ermittelte Sensibilisierungsgrad der Mastzellen dargestellt. Ein Sensibilisierungsgrad von 1 bedeutet eine nach dem Kinetikverfahren (4.2.4) positive Reaktion der Mastzellen auf den Flohantigenextrakt in einer Konzentration von 5 µg/ml; bei einem Sensibilisierungsgrad von 2 lag zusätzlich eine positive Reaktion auf die Konzentrationsstufe 1 µg/ml vor, 0 entspricht einem negativen Testergebnis. Die gestrichelte Linie trennt die in Woche 46 erhobenen Befunde des kommerziellen Extraktes (WBE-G) von den mit dem hauseigenen Extrakt (WBE-H) erzielten Ergebnissen. In Woche 8 nicht getestete Tiere (Vermeidung der Induktion einer Sensibilisierung bei zu diesem Zeitpunkt FIT-negativen Tieren) sind mit (-) bezeichnet.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

131

Bei acht der übrigen zehn Tiere war eine Mastzellsensibilisierung mit beiden

Antigenpräparationen zu keinem Zeitpunkt nachweisbar.

Zwei anfänglich negative Tiere (N, P) entwickelten unter dem Einfluss der

wöchentlichen Flohexpositionen sowohl eine Sensibilisierung im FIT (Tab. 6) als

auch im IKT (Tab. 20): Sie zeigten in Woche 46 bzw. 24 eine Hautreaktion auf die

injizierten Antigenpräparationen. Beide Tiere reagierten konkordant positiv auf die

zwei eingesetzten Ganzflohextrakte.

Insgesamt waren diese beiden Katzen die einzigen Tiere mit geringer Ag-Exposition,

welche durch die über 40 Wochen andauernden, wöchentlichen Flohexpositionen

eine im Intrakutantest nachweisbare Sensibilisierung ihrer Mastzellen auf

Flohantigen erfahren haben. Bei den übrigen Tieren war eine Beeinflussung der

Mastzellen durch wiederholte Infestationen mit C. felis im IKT nicht erkennbar.

4.2.4.3 Vergleich der Sensibilisierungskinetik der Mastzellen im Hinblick auf

die Intensität der Antigen-Exposition

Der Sensibilisierungsstatus der Mastzellen wurde zu vier Zeitpunkten mit Hilfe des

Intrakutantests untersucht. In Tab. 21 sind die IKT-Befunde nach Gruppen in Form

von Vierfeldertafeln aufgeführt. Eine Reaktion wurde als positiv bewertet, wenn eine

Zunahme des Quaddeldurchmessers nach dem Kinetikverfahren zu verzeichnen

war. Wie bereits dargestellt, reagierte die Mehrzahl der Tiere im betrachteten

Zeitraum nicht auf die in den beiden Präparationen enthaltenen Flohantigene. Ein

Tier zeigte eine konstant positive Reaktion und zwei weitere Katzen aus der gering

exponierten Gruppe entwickelten im Verlauf der Untersuchung eine funktionelle

Sensibilisierung der Mastzellen, die im Intrakutantest nachgewiesen wurde.

Mit dem Fisher-Test sollte ermittelt werden, ob sich das Verhältnis von positiven zu

negativen Befunden in der hoch exponierten Gruppe zu einem der

Erhebungszeitpunkte statistisch von der Gruppe mit geringer C. felis-

Antigenexposition unterschied. Zugrunde gelegt wurden die Hautreaktionen, die nach

Inokulation des Extraktes WBE-G beobachtet wurden.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

132

Tab. 21: Kontingenztafeln der Befunde des IKT

Woche

-2 8 24 46

Befund

Gruppe negativ positiv negativ positiv negativ positiv negativ positiv

Hohe Ag-

Exposition 6 0 2 0 6 0 6 0

Geringe

Ag-Exp- 10 2 3 2 9 3 9 3

Σ 16 2 5 2 15 3 15 3

p-Wert 0,53 1,00 0,51 0,51

Dargestellt sind die Befunde des Intrakutantests zwei Wochen vor Beginn der Verlaufsuntersuchung (-2), sowie in Woche 8, 24 und 46, die nach Injektion des Extrakts WBE-G dokumentiert wurden. Mit dem Fisher-Test wurde geprüft, ob ein signifikanter Unterschied in den Befundhäufigkeiten zwischen den Gruppen vorliegt.

Die in Tab. 21 aufgelisteten p-Werte zeigen, dass sich das Verhältnis der

sensibilisierten zu den nicht sensibilisierten Katzen zwischen den verschieden stark

exponierten Gruppen im Intrakutantest zu keinem Zeitpunkt signifikant unterscheidet.

Für den selbst hergestellten Extrakt WBE-H konnte ebenfalls kein statistischer

Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden, da er nur zur

Abschlussuntersuchung in Woche 46 zum Einsatz kam: Hier waren drei von sechs

hoch exponierten sowie zwei von 12 schwach exponierten Katzen im IKT positiv.

Somit ließ sich mit Hilfe des IKT kein von der Expositionsintensität abhängiger

statistischer Unterschied in der Sensibilisierungskinetik der Mastzellen feststellen.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

133

4.2.4.4 Übereinstimmung der Mastzellreaktion auf zw ei verschiedene Antigen-

Extrakte

Ein Vergleich der beiden C. felis-Extrakte im IKT war nur in der

Abschlussuntersuchung in der 46. Woche durchführbar. Wie aus Tabelle 22

hervorgeht, waren im Vergleich der beiden Antigenextrakte WBE-G und WBE-H 14

von 18 Befunden konkordant. Auf die im Extrakt WBE-H enthaltenen Antigene

zeigten zwei zusätzliche Tiere eine Mastzellsensibilisierung. Nach der Auswertung

mit dem Kinetikverfahren galt eine Reaktion als positiv, wenn eine deutliche

Vergrößerung des Durchmessers der Ausgangsquaddel zu einem der

Messzeitpunkte bestand und diese Reaktion mindestens auf die höchste

Konzentrationsstufe des jeweiligen Antigenextraktes zu beobachten war. Mit Hilfe

des McNemar-Tests sollte festgestellt werden, ob zwischen der Mastzellreaktion auf

die beiden in dieser Arbeit verwendeten Antigenextrakte ein statistischer

Unterschied besteht.

Tab. 22: Vergleich der mit zwei C. felis-Ag-Extrakten im IKT ermittelten Befunde.

WBE-H

WBE-G negativ positiv

negativ 12 3

positiv 1 2

Σ 13 5

p-Wert > 0,05

Kappa 0,37

Konkordant positive bzw. negative Befunde sind fett gedruckt. Der Koinzidenzindex Kappa gibt die Übereinstimmung der mit den beiden Extrakten erhobenen Befunde an, der p-Wert ist ein Maß für das Verhältnis der Unterschiede zwischen den beiden Extrakten. Die Daten wurden in Woche 46 der Verlaufsuntersuchung erhoben.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

134

Die auf Gleichheit lautende Nullhypothese konnte nicht verworfen werden (p>0,05),

d.h., es bestand kein signifikanter Unterschied in der Reaktion der im IKT

untersuchten Katzen auf die beiden Antigenpräparationen. Die durch den

Koinzidenzindex Kappa ausgedrückte Übereinstimmung war als schwach zu

bezeichnen (κ=0,37).

Der prozentuale Anteil positiver Reaktionen der Mastzellen auf den selbst

hergestellten Extrakt WBE-H in Woche 46 der Verlaufsuntersuchung lag mit 38%

höher als dies bei Verwendung des externen Extraktes WBE-G der Fall war (20%).

4.2.5 Übereinstimmung der Ergebnisse aus FIT und IK T

Die im FIT erhobenen Befunde zur Sensibilisierung der Basophilen sollten mit der im

IKT ermittelten Mastzellsensibilisierung verglichen werden. Hierzu wurden alle FIT-

Ergebnisse als positiv klassifiziert, die mindestens einen Sensibilisierungsgrad von 1,

d.h. eine positive Reaktion auf die verwendeten C. felis-Extrakte WBE-G (Greer,

3.2.6) und WBE-H (eigene Herstellung, 3.2.6) in der Konzentrationsstufe 5 µg/ml

zeigten. Ein Intrakutantest wurde als positiv gewertet, wenn nach dem unter 4.2.4

beschriebenen Kinetikverfahren eine entsprechende Vergrößerung des

Durchmessers der Ausgangsquaddel zu einem der drei Messzeitpunkte von 15, 30

und 60 Minuten nach Injektion festzustellen war.

Aus Tab. 23 ist ersichtlich, dass die Unterschiede in den Ergebnissen der beiden

Testverfahren nach dem McNemar-Test nicht signifikant waren. Der Kappa-Test

lieferte für die Voruntersuchung eine deutliche Übereinstimmung, im weiteren Verlauf

wurde diese jedoch zunehmend schwächer.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

135

Tab. 23: Kontingenztafeln von IKT im Vergleich zum FIT über vier Zeitpunkte.

Woche

- 2 8 24 46

FIT

IKT negativ positiv negativ positiv negativ positiv negativ positiv

negativ 14 2 3 2 11 3 7 (5) 6 (5)

positiv 0 2 0 2 1 2 0 (0) 2 (5)

Σ 14 4 3 4 12 5 7 (5) 8 (10)

p-Wert > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Kappa 0,61 0,46 0,36 0,24 (0,40)

Dargestellt sind FIT- und IKT-Befunde aus vier Zeitpunkten der Verlaufsuntersuchung. Der p-Wert gibt an, ob ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Testverfahren vorliegt. Der Kappa-Index dient der Beurteilung der Übereinstimmung zwischen den beiden Tests. Die Daten wurden mit dem Ag-Extrakt WBE-G erhoben, zusätzlich kam in Woche 46 der Extrakt WBE-H zum Einsatz (Werte in Klammern).

Die kleinere Zahl untersuchter Tiere in Woche 8 ist darauf zurückzuführen, dass zu

diesem Zeitpunkt nur die Katzen im Intrakutantest untersucht wurden, die bereits

eine positive FIT-Reaktion gezeigt hatten, um eine Sensibilisierung der Mastzellen

nicht ungewollt durch Injektion von Antigen zu induzieren. In Woche 24 und 46 waren

aus technischen Gründen 17 bzw. 15 von 18 Tests für diesen Vergleich auswertbar.

E R G E B N I S S E

___________________________________________________________________________

136

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

FIT IKT FIT IKT FIT FIT (WBE-H)

IKT IKT (WBE-H)

Woche - 2 Woche 24 Woche 46

negativ positiv

Abb. 25: Vergleich von FIT- und IKT-Befunden währen d der Verlaufsuntersuchung. Der Sensibilisierungsstatus der Mastzellen wurde in den Wochen -2, 24 und 46 bei allen Tieren mit Hilfe des IKT erhoben und mit den entsprechenden, auswertbaren FITs verglichen. Die Darstellung zeigt den prozentualen Anteil positiver und negativer Befunde (Tab. 23). Soweit nicht anders bezeichnet, beziehen sich die Daten auf den Extrakt WBE-G. Zusätzlich wurde in Woche 46 der selbst hergestellte Extrakt WBE-H getestet.

Das Verhältnis positiver zu negativen FIT-Befunden (Abb. 25) änderte sich im Verlauf

der Untersuchung zugunsten der positiven Reaktionen, d. h., dass mehrere Katzen

eine funktionelle Sensibilisierung gegen Flohantigene entwickelt haben (4.2.3).

Dagegen war der Anteil positiver IKT-Befunde gleich bleibend niedrig. Zusätzlich fiel

auf, dass der Anteil positiv getesteter Katzen bei der eigenen Ag-Präparation (WBE-

H) aus dem Flohstamm, mit dem die Infestationen durchgeführt wurden, höher lag

als bei WBE-G.

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

137

5 Diskussion

Die funktionelle Sensibilisierung von Typ I-Effektorzellen (basophile Granulozyten

und/oder Mastzellen) gegen ein Antigen ist eine unabdingbare Voraussetzung zur

Entwicklung einer Typ I-Allergie gegen dieses Antigen. Über die Kinetik dieser

Sensibilisierung, insbesondere unter dem Einfluss unterschiedlicher Antigenmengen

ist sowohl beim Haustier als auch beim Menschen wenig bekannt. Im Rahmen dieser

Arbeit sollte mit Hilfe von funktionellem in vitro Test (FIT) und Intrakutantest (IKT) der

Einfluss unterschiedlicher Flohspeichelmengen auf die Kinetik der funktionellen

Sensibilisierung von Basophilen und Mastzellen bei Katzen während mehrfach

durchgeführter, kontrollierter Flohexpositionen geprüft werden.

Darüber hinaus wurde nach Möglichkeiten der methodischen Optimierung des

funktionellen in vitro Test (FIT) zur Anwendung bei der Katze gesucht.

5.1 Methodik des FIT

5.1.1 Modulation der Spontanfreisetzung von Basophi len der Katze

Eine wichtige Voraussetzung für die Bewertung der Reaktionsbereitschaft der

Basophilen auf ein Antigen ist eine möglichst geringe Spontanfreisetzung, so dass

unspezifisch freigesetztes Histamin zuverlässig von einer antigenspezifischen

Freisetzung differenzierbar ist. Die mittlere Spontanfreisetzung der felinen

Basophilen, die in dieser Untersuchung mithilfe des FIT ermittelt wurde, betrug 5,4 ±

3,7% (4.2.3.1). Sie lag damit auf einem ähnlichen Niveau wie die

Spontanfreisetzung, die STUKE (2005) im Rahmen der Etablierung des

Testverfahrens für die Katze gemessen hatte (4,2 ± 2,7%). Basophile der Katze

setzen spontan aber deutlich mehr Histamin frei als dies beim Pferd der Fall ist. In

der Untersuchung von KAUL (1998) lag die Spontanfreisetzung bei sofortiger

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

138

Durchführung des FIT nach Blutentnahme bei keinem Tier über 5% der maximalen

Freisetzung.

Um die Testsicherheit des FIT zu erhöhen, wurden Handhabung und Bearbeitung

der Blutproben modifiziert und der Einfluss auf spontane und antigenvermittelte

Histaminfreisetzung untersucht. Es wurde zunächst vermutet, dass eine technisch

bedingte Voraktivierung der Basophilen bei der Blutentnahme ursächlich für erhöhte

Freisetzungswerte war. Ein Problem stellte das geringe entnehmbare Blutvolumen

bei der Katze dar, das einer vergleichsweise großen Fläche des Probengefäßes

gegenüberstand. Dadurch war ein intensiver Kontakt der Basophilen mit

Fremdoberflächen gegeben, was zu einer Voraktivierung führen könnte. Durch

direktes Eintropfen des Blutes in eine PBS-Lösung sollte daher versucht werden, den

Kontakt der Basophilen mit dem Probengefäß und damit die Spontanfreisetzung zu

minimieren. Durch diese Maßnahme konnte jedoch keine deutliche Verminderung

der Spontanfreisetzung erzielt werden (4.1.1).

Es ist vorstellbar, dass der geringe Durchmesser der für die Punktion in Frage

kommenden Blutgefäße und der dadurch verlangsamte Blutfluss bei schlechtem Sitz

der Kanüle im Gefäß bereits zu einer Schädigung und/oder Voraktivierung der

Basophilen führen.

Ein weiterer Optimierungsansatz bestand darin, die Histaminfreisetzung bei der

Inkubation der Zellen zu verbessern. Es ist bekannt, dass Basophile für eine effektive

Degranulation auf extrazellulär vorhandene Kationen wie Ca2+ und Mg2+ angewiesen

sind. Ausgehend von dem von STUKE (2005) und KAUL (1998) verwendeten

Freisetzungspuffer mit einer Ca2+-Endkonzentration von 1 mmol/l, wurden die

Auswirkungen eines veränderten Ca2+-Milieus auf das Freisetzungsverhalten der

Basophilen untersucht (4.1.2). Eine Ca2+-Konzentration von 0,5 mmol/l verminderte

sowohl die spontane wie die antigenvermittelte Histaminfreisetzung der Basophilen

erkennbar. Eine Erhöhung der Ca2+-Endkonzentration auf 2 mmol/l verstärkte

spontane wie antigenvermittelte Freisetzung gegenüber der Histaminfreisetzung in

einer Ca2+-Konzentration von 1 mmol/l dagegen nur geringfügig. Die

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

139

Histaminfreisetzung humaner Basophiler ist ebenso abhängig von Kationen und

reagiert empfindlich auf Änderungen der Osmolarität im extrazellulären Raum

(RIMMER u. BRYANT 1986; AKAGI u. TOWNLEY 1989). Neben einer starken

Abhängigkeit von der Ca2+-Konzentration konnten TEDESCHI et al. (1994)

nachweisen, dass eine erhöhte Na+-Konzentration die Histaminfreisetzung aus

Basophilen des Menschen inhibiert. Ob und inwiefern andere Kationen als Ca2+ das

Freisetzungsverhalten feliner Basophiler beeinflussen, müsste in weiterführenden

Untersuchungen geklärt werden. Dies könnte einen zusätzlichen Ansatzpunkt liefern,

um das Freisetzungsverhalten feliner Basophiler in einem Testverfahren wie dem

funktionellen in vitro-Test zu optimieren.

Inwieweit allergische Vorerkrankungen Einfluss auf die spontane Histaminfreisetzung

bei der Katze nehmen, ist nicht bekannt. Es ist denkbar, dass ein entsprechendes

Zytokinmilieu, das aufgrund einer Sensibilisierung besteht oder tierartlich bedingt ist,

zu einer individuell oder generell erhöhten Reaktionsbereitschaft der Basophilen bei

der Katze beiträgt. Beim Menschen konnte ein Zusammenhang zwischen der Höhe

der Spontanfreisetzung und einer allergischen Erkrankung festgestellt werden.

Basophile von Patienten mit Asthma oder allergischen Symptomen wiesen eine

höhere spontane Freisetzung auf als gesunde Probanden (KAZIMIERCZAK et al.

1980; AKAGI u. TOWNLEY 1989). Aus Mangel an klinischen Fällen konnten in der

vorliegenden Untersuchung keine weiteren Erkenntnisse über die Modulation der

Spontanfreisetzung durch Allergien bei der Katze gewonnen werden.

5.1.2 Reaktionsbereitschaft von Basophilen im Hinbl ick auf Lagerungsdauer

und Temperatur

Zur Erweiterung der diagnostischen Einsatzmöglichkeiten des FIT bei der Katze ist

eine ausreichende Stabilität der Basophilen von der Blutentnahme bis zur

Durchführung des FIT erforderlich. Bei Raumtemperatur gelagerte Blutproben von

Katzen zeigten bereits nach 24 h stark erhöhte Spontanfreisetzungen der

Basophilen, was eine Auswertung der Proben verhinderte. Die Lagerung der Proben

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

140

bei 4° C führte zu einer deutlich verminderten Spon tanfreisetzung gegenüber bei

Raumtemperatur gelagerten Proben. Gleichzeitig blieb die generelle

Reaktionsbereitschaft der Basophilen, gemessen an dem Wert nach sofortiger FIT-

Durchführung, erhalten. Die antigenvermittelte Histaminfreisetzung von FIT-positiven

Katzen war bei gekühlter Lagerung nach 24 h in nahezu gleicher Höhe

reproduzierbar, ohne dass FIT-negative Tiere nach Lagerung der Proben eine falsch-

positive Reaktion zeigten. Eine deutliche Erhöhung der Spontanfreisetzung bei

gekühlter Lagerung konnte im Gegensatz zu den Untersuchungen von STUKE

(2005) nicht festgestellt werden. Ebenso war keine relevante Verminderung der Ak-

und Ag-vermittelten Freisetzung zu beobachten. Nach den vorliegenden

Erkenntnissen muss daher von einer höheren Stabilität der Zellen bei gekühlter

Lagerung ausgegangen werden.

Das temperaturabhängige Freisetzungsverhalten der Basophilen lässt sich

möglicherweise durch intrazelluläre Mechanismen erklären. Voraussetzung für die

Degranulation bei Aktivierung der Zelle über FcεRI ist ein Anstieg der intrazellulären

Ca2+-Konzentration in den Basophilen sowie genügend vorhandenes ATP (BEAVEN

et al. 1984). Bei Raumtemperatur gelagerte Zellen könnten aufgrund eines

gegenüber gekühlt aufbewahrten Zellen beschleunigten Zellstoffwechsels während

der Lagerungsdauer so viel ATP verbraucht haben, dass es für die Degranulation

und Histaminfreisetzung nicht mehr in ausreichender Menge zur Verfügung stand.

Neuere Forschungen haben gezeigt, dass Sauerstoffradikale (ROS) unter anderem

bei der Aktivierung von Mastzellen und Basophilen eine Rolle spielen (YOSHIMARU

et al. 2002; SUZUKI et al. 2005). Superoxide müssen bei der Degranulation neu

synthetisiert werden. Es wäre denkbar, dass Änderungen im Zellstoffwechsel

während der Lagerzeit eine Neusynthese der ROS und anderer, an der

Signaltransduktionskaskade beteiligter Komponenten, die für die Degranulation

essentiell sind, verhinderten.

Alternativ wäre es möglich, dass die spezifischen Antikörper von den Fc-Rezeptoren

bei höheren Temperaturen abdissoziierten und somit keine Kreuzvernetzung mehr

stattfinden konnte. Dies ist jedoch eher unwahrscheinlich, da IgE an FcεRI hochaffin

über mehrere Tage stabil gebunden ist (TIZARD 2004). Um membranständig

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

141

gebundene Antikörper für bestimmte Fragestellungen von Basophilen abzulösen

(stripping), sind saure Pufferlösungen nötig (KLEINE BUDDE et al. 2001), die Zellen

wurden in der vorliegenden Untersuchung jedoch bei physiologischem pH gelagert.

5.2 Sensibilisierungskinetik von Basophilen und Mas tzellen auf C.

felis-Antigen

Bei den für die Verlaufsuntersuchung verwendeten Katzen traten verschiedene

Sensibilisierungsmuster auf: Tiere, die vor Beginn der Untersuchung keine

nachweisbare funktionelle Sensibilisierung zeigten, entwickelten zu einem frühen

Zeitpunkt (innerhalb von drei Wochen nach erster Flohexposition) oder im späteren

Verlauf (frühestens 18 Wochen nach erster Flohexposition) eine Sensibilisierung

oder zeigten während der kontrollierten Flohexpositionen keine qualitative

Veränderung im Reaktionsverhalten ihrer Basophilen.

Andere Katzen waren bereits zu einem bestimmten Grad gegen Flohantigene

sensibilisiert und behielten die Sensibilisierung über den gesamten Zeitraum. Weitere

vorsensibilisierte Katzen verminderten ihre Flohantigen-induzierte

Histaminfreisetzung im Zeitverlauf unter dem Einfluss wiederholter Flohexpositionen

oder zeigten ein zyklisches Verlaufsmuster. Im Gegensatz zu der Untersuchung von

STUKE (2005) trat bei vorsensibilisierten Katzen keine wesentliche Verstärkung der

Reaktionsbereitschaft unter dem Einfluss regelmäßiger Flohexpositionen auf.

Die funktionelle Sensibilisierung der Basophilen einiger Katzen könnte durch die

kontrollierten Flohexpositionen induziert worden sein, indem antigenpräsentierende

Zellen (APC) durch den wiederholten Kontakt CD4+ T-Zellen kontinuierlich

Flohantigen präsentiert haben. Diese aktivieren B-Zellen, die große Mengen

Flohantigen-spezifische Antikörper, vornehmlich IgE, bilden können. Sind große

Mengen IgE vorhanden, wird dieses von FcεRI auf Basophilen und Mastzellen

gebunden und führt zur verstärkten Expression des Rezeptors auf der Zelloberfläche

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

142

(SAINI u. MACGLASHAN 2002). Dies wiederum vergrößert die Bindungskapazität

freier IgE und erhöht die Dichte spezifischer Antikörper. Sind ausreichend viele

Antikörper gleicher Spezifität an FcεRI gebunden, kann das entsprechende Antigen

eine Zusammenlagerung der Rezeptoren und Aktivierung der Zelle auslösen. Eine

Konfrontation der gegen Flohantigen sensibilisierten Basophilen führt so zu einer

Freisetzung von Histamin und weiterer Mediatoren.

Neben neu sensibilisierten Tieren zeigten die wiederholten, über 40 Wochen

durchgeführten Flohexpositionen bei einigen Katzen keine Anzeichen einer

funktionellen Sensibilisierung ihrer Basophilen und Mastzellen. Dies könnte

einerseits dadurch bedingt sein, dass es bei diesen Tieren nicht zu einer T2-

dominierten Immunantwort gegen Flohantigen kam. Bei einer T2-Dominanz werden

überwiegend Zytokine wie IL-4 und IL-10 von Th2-Zellen und auch von Basophilen

selbst (OH et al. 2007) produziert. Besonders IL-4 regt B-Zellen zur Produktion

sensibilisierender Antikörper an, indem es einen Isotypenswitch zu IgE fördert,

welches von den Effektorzellen der Typ I-Allergie, Basophilen und Mastzellen,

gebunden werden kann. Es wäre auch möglich, dass aufgrund unterschiedlich stark

auf den Effektorzellen exprimierter Fc-Rezeptortypen eine Aktivierung der

Basophilen trotz vorhandener sensibilisierender IgE-Antikörper nicht stattgefunden

hat. Neben den aktivierenden, IgE-bindenden FcεRI könnte auch eine überwiegende

Anzahl IgG-bindender Rezeptoren vom Typ FcγRIIB vorhanden gewesen sein, die

durch Zusammenlagerung mit FcεRI einen inhibierenden Effekt auf die Zelle

ausüben (KEPLEY et al. 2004; GALLI et al. 2005). Es ist nicht auszuschließen, dass

durch die periodische Konfrontation mit Flohantigen auch vermehrt

antigenspezifisches IgG gebildet und von Basophilen und Mastzellen an FcγRIIB

gebunden wurde. Dies musste im Rahmen dieser Arbeit jedoch ungeklärt bleiben, da

das Verhältnis von auf Basophilen gebundenem IgG zu IgE mangels nicht

verfügbarer Anti-Katze-IgE-Antikörper nicht bestimmt werden konnte.

Ausreichende Mengen IgG könnten auch als blocking antibodies gewirkt haben und

freies Antigen bereits im Serum neutralisiert haben, bevor dieses an sensibilisierende

IgE-Antikörper auf Basophilen und/oder Mastzellen binden konnte (STRAIT et al.

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

143

2006). FOSTER et al. (1997) wiesen nach, dass Katzen, die allergische Symptome

u.a. gegen Hausstaub und Flohantigene zeigten, neben IgE auch erhöhte IgG-Titer

im Serum hatten. Außer durch IgG-abhängige Reaktionen können IgE-vermittelte

Immunantworten auch auf andere Weise abgeschwächt werden. CD23 wird auf B-

Zellen exprimiert und bindet IgE mit niedrigerer Affinität. Dies vermindert die

Produktion von sensibilisierendem IgE und somit die Dichte von antigenspezifischen

Antikörpern auf den Typ I-Effektorzellen (YU et al. 1994). Möglicherweise wurde

durch diese Art der Feedback-Hemmung bei einigen Tieren eine ausreichende

Sensibilisierung der Effektorzellen auf Flohantigen verhindert.

Ein weiterer Grund für eine verminderte Reagibilität der Basophilen könnte in der

Expression verschiedener Phänotypen dieser Zellen liegen. Aus der Forschung an

menschlichen Zellen ist bekannt, dass neben Basophilen, die auf einen Stimulus

Histamin freisetzen, auch nonreleaser basophils existieren (KEPLEY et al. 1999). Die

bei diesem Typ ausbleibende Histaminfreisetzung ist auf einen Defekt in der

Signaltransduktionskaskade zurückzuführen. Nonreleaser basophils fehlen die

Tyrosinkinasen Lyn und Syk, die an der Degranulation beteiligt sind (KUMAR et al.

2007). Ob dieser Phänotyp bei Katzen ebenfalls eine Rolle spielt oder in einem

Individuum neben intakten Basophilen gleichzeitig exprimiert werden kann, ist nicht

bekannt. Beim Menschen ist der nonreleaser Phänotyp kein permanenter Defekt,

sondern es ist beobachtet worden, dass nonreleaser basophils einiger Probanden

langfristig wieder eine normale Reagibilität aufbauen können. Diese als cycler

bezeichneten Zellen könnten in vivo einen großen Einfluss auf den Verlauf

allergischer Erkrankungen haben (KEPLEY et al. 2000; YOUSSEF et al. 2007).

Nonreleaser basophils sind bei der vorliegenden Untersuchung weitgehend

auszuschließen, da die stets durchgeführte Prüfung der generellen Sensibilisierung

durch Anti-Katzen-IgG-Antikörper auch bei den Tieren meist positive Zellreaktionen

hervorriefen, die auf Flohantigen stets negativ reagierten.

In dieser Studie sind auch Sensibilisierungsmuster aufgetreten, die durch einen

wechselnden Verlauf geprägt waren. Tiere, die bereits eine funktionelle

Sensibilisierung gegen Antigene von C. felis entwickelt hatten, zeigten nach

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

144

anfänglich positiven FIT-Resultaten zwischenzeitlich keine Reaktion ihrer

Basophilen, um danach erneut positiv zu reagieren.

Eine mögliche Erklärung hierfür wäre, dass phasenweise keine sensibilisierenden

Antikörper auf den Basophilen gebunden oder aber deren Dichte auf der Einzelzelle

zu gering war, um eine Aktivierung der Zelle zu bewirken. Bezogen auf die

Zellpopulation wäre es auch möglich, dass zwar ausreichend sensibilisierte

Basophile vorhanden waren, deren Zahl aber insgesamt zu gering war, um eine über

der positiven Nachweisgrenze liegende Menge Histamin freizusetzen. Außerdem

könnten inhibierende Fc-Rezeptoren auf den Basophilen trotz in ausreichender Zahl

vorhandener, membranständiger sensibilisierender Antikörper eine Zellaktivierung

und somit Histaminfreisetzung verhindert haben, was ebenfalls zu einem negativen

FIT-Befund geführt haben könnte.

In einer weiteren Untersuchung zum Sensibilisierungsverhalten von Basophilen bei

der Katze (STUKE 2005) reagierte eine Katze bei der Eingangsuntersuchung im FIT

zunächst negativ, jedoch schon kurz nach der ersten Flohexposition eindeutig

positiv. Dieses Reaktionsmuster hat sich bei drei Katzen in der vorliegenden

Untersuchung wiederholt. Diese frühsensibilisierten Katzen waren zwar im FIT vor

der ersten Flohexposition negativ, jedoch bereits vermutlich vorsensibilisiert. Sie

zeigten vermutlich aus regulativen Gründen keine messbare Reaktion in der

Vorprüfung. Während Katze K von nun an fast durchgehend im FIT positiv reagierte,

zeigten die Katzen R und S gegenläufige Schwankungen zwischen positiven und

negativen FIT-Reaktionen.

Diese Modulation der funktionellen Sensibilisierung ist am ehesten durch regulative

Mechanismen erklärbar, die im Laufe wiederholter Antigenexpositionen zum Tragen

kommen. Besonders effizient könnte dabei die Modulation der FcγRIIB-Expression

durch Immunkomplexe zwischen Flohantigen und IgG sein (SAMUELSSON et al.

2001).

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

145

5.2.1 Zusammenhang zwischen Intensität der Flohinfe station und

Antigenexposition

Ziel dieser Untersuchung war es, die Sensibilisierungskinetik der Basophilen von

Katzen, die während regelmäßiger Flohexpositionen durch das Kontaktinsektizid

Imidacloprid geschützt waren, mit der Kinetik von unbehandelten Katzen zu

vergleichen. Es wurden 24 h andauernde Infestationen im wöchentlichen Rhythmus

durchgeführt, die Behandlung mit Imidacloprid erfolgte im Abstand von 14 d.

Das Absammeln der Flöhe vom Wirt nach 24 oder 48 h ist eine gängige Praxis, um

die Wirksamkeit einer Flohbehandlung zu ermitteln (ARTHER et al. 1997;

CADIERGUES et al. 2001). Im Rahmen der Verlaufsuntersuchung von STUKE

(2005) wurden ebenfalls 24 h dauernde Expositionen durchgeführt.

Ctenocephalides felis beginnt unmittelbar nach Wirtsfindung mit der Blutmahlzeit

(DRYDEN u. RUST 1994). CADIERGUES et al. (2000) zeigten, dass nahezu alle frei

auf dem Wirt beweglichen Flöhe innerhalb der ersten Stunde der Exposition eine

Blutmahlzeit aufnehmen. Daher entscheidet die Geschwindigkeit, mit der

Imidacloprid die Flöhe abtötet (antifeeding effect) darüber, ob ein Floh Gelegenheit

zu einer Blutmahlzeit und somit die APC des Wirts Antigenkontakt haben. DRYDEN

et al. (2005) zeigten, dass sich der Wirkungseintritt von spot-on Präparaten wie

Imidacloprid 21 d nach Behandlung deutlich verlangsamt. Das Behandlungsintervall

in der vorliegenden Untersuchung betrug 14 d, um einen maximalen Schutz der

Katzen während der Infestationen mit C. felis zu gewährleisten.

Die mit Imidacloprid behandelten Katzen (n=12) waren, gemessen an den nach 24 h

Exposition wieder gefundenen Flöhen, mit einer signifikant geringeren Anzahl C. felis

belastet als die unbehandelten Tiere (4.2.1.3). Die Anzahl lebender Flöhe war in der

unbehandelten, hoch exponierten Gruppe im Mittel aller Infestationen 200fach höher

als in der gering exponierten Gruppe (p<0,001). Dies entspricht bei einem

Ausgangswert von 100 lebenden Flöhen, die pro Tier infestiert wurden, einer

Reduktion von > 99%. Dieser Wert liegt geringfügig über dem Prozentsatz der

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

146

maximalen Reduktion, die in Wirksamkeitsstudien nach Einmalbehandlung erreicht

wurde (RUST 2005).

Die für die Intensität der Antigenexposition entscheidende Größe, nämlich die Anzahl

Flöhe, die eine Blutmahlzeit aufgenommen hatten, war in der hoch exponierten

gegenüber der behandelten, gering exponierten Gruppe 93-mal so hoch. Basierend

auf den Ergebnissen der Arbeitsgruppe von FRANK (1996) kann davon

ausgegangen werden, dass ein Floh beim Saugakt über den Speichel eine Menge

von ca. 10 ng Protein während der Expositionsdauer von 24 h in den Wirt inokuliert.

Dies bedeutet, dass die hoch exponierten Katzen während der wöchentlich

durchgeführten Flohexposition einer Antigenmenge von ca. 390 ng (arithm.

Mittelwert) und die gering exponierten Tiere ca. 4 ng (arithm. Mittelwert) ausgesetzt

waren.

5.2.2 Einfluss der Expositionsintensität auf die Se nsibilisierungskinetik

Die mit Imidacloprid behandelten Katzen wiesen eine signifikant geringere Anzahl

Flöhe mit Blutmahlzeit auf als die nicht behandelten Tiere (p<0,001). Analog hierzu

lässt dies auf einen deutlichen Unterschied in der Antigenmenge schließen, der die

beiden Gruppen ausgesetzt waren (5.2.1). Einige der während der

Verlaufsuntersuchung beobachteten Reaktionsmuster sind ungeachtet der Höhe der

Antigenexposition dennoch in beiden Gruppen aufgetreten. Andererseits unterschied

sich die Reaktion der spätsensibilisierten sowie der dauerhaft sensibilisierten Katzen

nach der Antigenmenge, der die Tiere ausgesetzt waren. Es ist nicht bekannt,

welche Antigenmenge zur Ausprägung einer Sensibilisierung oder klinisch

manifesten Allergie erforderlich ist. DRYDEN und BLAKEMORE (1989) weisen

darauf hin, dass der Schweregrad einer FAD u.a. von der Häufigkeit des

Antigenkontakts abhängt, Angaben über den Einfluss der Expositionsintensität gibt

es nach derzeitigem Kenntnisstand nicht. Während in der Veterinärmedizin derartige

Untersuchungen bis dato nicht durchgeführt wurden, existieren einzelne Berichte aus

der Humanmedizin. CUSTOVIC et al. (2001) verglichen die Sensibilisierung von

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

147

Mastzellen auf Katzenantigene von Personen mit der Antigenmenge, der diese

ausgesetzt waren. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass Probanden mit einer mittleren

Antigenbelastung öfter eine Sensibilisierung aufwiesen als solche Personen, die mit

extrem geringen oder hohen Mengen Antigen konfrontiert waren. Die gleiche

Schlussfolgerung zogen auch SCHRAM-BIJKERK et al. (2006), die die Höhe der

Milben-Antigenexposition im Hausstaub mit dem Auftreten einer Sensibilisierung

verglichen. Eine weitere Studie zeigte, dass Kinder, die mit Katzen in einem Haushalt

lebten, ein vermindertes Risiko aufwiesen, an Asthma zu erkranken (HESSELMAR et

al. 2003). Die Kinder reagierten mit deutlich erhöhten IgG-Titern auf die

Antigenexposition, ohne jedoch allergische Symptome oder Asthma zu entwickeln.

Eine Modifikation der bei Asthma und Typ I-Allergien vorliegenden Th2-

Immunantwort, durch die während des kontinuierlichen Antigenkontakts nicht wie

normalerweise IgE- sondern vornehmlich IgG-Antikörper gebildet werden (PLATTS-

MILLS et al. 2001), könnte in ähnlicher Weise auch die Sensibilisierungskinetik der

hoch exponierten Katzen beeinflusst haben. FOSTER et al. (1997) fanden, dass

Katzen, die mit Flöhen infestiert wurden, neben IgE auch antigenspezifische IgG

bildeten. Unterdessen konnte die Arbeitsgruppe nicht klären, wie das Vorhandensein

von IgG bei Katzen die klinische Symptomatik beeinflusst.

Wenn die Flohexpositionen bei den Tieren in der vorliegenden Untersuchung eine

Th2-Immunantwort induziert hätten, bei der statt IgE IgG der vorherrschende Ak-

Isotyp war, so wäre dies im FIT eventuell nicht nachweisbar gewesen, da aufgrund

überwiegender IgG-Bindung an FcγRIIB eine Histaminfreisetzung ausblieb.

Ferner ist nicht auszuschließen, dass die im Serum der Katzen zirkulierende

Antigenmenge von im Zeitverlauf ansteigenden Mengen IgG-Antikörpern zu größer

werdenden Teilen neutralisiert wurde oder eine zu geringe Dichte sensibilisierender

IgE-Antikörper bestand. Somit könnten Basophile und Mastzellen nicht mehr aktiviert

worden sein (STRAIT et al. 2006).

Bei zwei mit einer hohen Antigenexposition belasteten Tieren verminderte sich die

bereits vor Untersuchungsbeginn bestehende Sensibilisierung während der

Expositionen signifikant (p=0,01, 4.2.2.5). Ausgehend von den genannten

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

148

Erkenntnissen aus der Humanmedizin wäre es denkbar, dass eine Gegenregulation

auch noch bei einer bereits bestehenden Sensibilisierung erfolgen kann. KOMIYA

und Mitarbeiter (2003) demonstrierten, dass Basophile, die mit Antigen oder Anti-IgE

in unterschwelligen Konzentrationen in physiologischem, Ca2+-haltigem Medium

inkubiert wurden, ihre Reagibilität verloren. Nach 24 h Inkubation war, trotz gleich

bleibender Rezeptor- und Antikörperdichte auf den Basophilen, durch Stimulation mit

Antigen oder Anti-IgE keine Histaminfreisetzung zu induzieren. In der vorliegenden

Untersuchung hat sich die Reaktionsbereitschaft in erster Linie bei hoch exponierten

Tieren verringert. Die bei diesen Katzen beobachtete abnehmende Sensibilisierung

könnte im Hinblick auf die Ergebnisse dieser Arbeitsgruppe dadurch bedingt sein,

dass die in vivo effektiv wirksame Flohantigen-Konzentration die

Reaktionsbereitschaft der Basophilen herunterreguliert hat. Verantwortliche

Mechanismen hierfür könnten in einer Umverteilung an sensibilisierenden

Antikörpern auf den Basophilen oder einer vermehrten Expression inhibitorischer

FcγRIIB zu suchen sein. Letzteres könnte durch vermehrt vorhandene

Immunkomplexe aus Flohantigen und spezifischem IgG dagegen ausgelöst werden.

Ebenso traten neu induzierte Sensibilisierungen („late onset“) häufiger in der gering

mit C. felis-Antigenen belasteten Gruppe auf. Dies wirft wiederum die Frage auf, ob

eine intensive Flohinfestation mit ca. 52 Flöhen pro Woche (4.2.1.3), wie sie bei gut

gepflegten Katzen aus privater Haltung eher selten auftreten dürfte, bei einigen der

Versuchskatzen durch die gleich bleibend hohe Antigenmenge sogar in Richtung

einer Toleranz gegenüber Flohantigenen führte.

Unabhängig von der Expositionsintensität waren bestimmte Sensibilisierungsmuster

in beiden Gruppen zu beobachten. Sowohl drei von sechs hoch exponierten Tieren

als auch vier von zwölf gering exponierten Katzen entwickelten im Verlauf keine

beständig nachweisbare funktionelle Sensibilisierung gegen Antigene von C. felis

(4.2.3). Der höhere Prozentsatz nicht sensibilisierter Tiere in der hoch exponierten

Gruppe könnte ein weiterer Hinweis darauf sein, dass es durch höhere

Antigenmengen zur Induktion einer Toleranz kommen kann. Der Einfluss der

Antigenexposition auf eine Sensibilisierung und das Auftreten allergischer Symptome

wurde in der Humanmedizin intensiv - meist epidemiologisch - erforscht. Aus

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

149

mehreren europäischen Studien (BRAUN-FAHRLANDER 2000; KILPELAINEN et al.

2000) ist bekannt, dass Kinder, die auf Bauernhöfen aufwachsen, ein vermindertes

Risiko haben, an allergischer Rhinitis (Heuschnupfen) zu erkranken. Es ist daher

denkbar, dass der intensive Antigenkontakt, dem einige Katzen im Rahmen dieser

Arbeit ausgesetzt waren, einen ähnlichen Einfluss auf deren

Sensibilisierungsverhalten hatte, wie dies beim Menschen gezeigt wurde.

Die in dieser Untersuchung gemachten Beobachtungen zeigen Zusammenhänge

zwischen Expositionsintensität und Sensibilisierung, die von Arbeitsgruppen aus der

Humanmedizin in ähnlicher Form bestätigt werden. Letztlich muss die

Übertragbarkeit der Ergebnisse dieser Studien auf die vorliegende Arbeit unter

Vorbehalt betrachtet werden, da unbekannt ist, inwieweit unterschiedliche

Eintrittswege der Antigene in den Organismus die Entwicklung einer Sensibilisierung

beeinflussen.

Ob eine Toleranzbildung durch eine hohe Antigenexposition im Rahmen dieser

Arbeit von Bedeutung war, konnte nicht abschließend geklärt werden. Zukünftige

Studien könnten darauf abzielen, die Rolle unterschiedlicher Ak-Isotypen,

insbesondere IgG-Isotypen für die Sensibilisierung bei der Katze zu klären. Zudem

sind die Mechanismen der Toleranzinduktion bei der Katze noch weitgehend

unerforscht. Eine wichtige Aufgabe künftiger Untersuchungen wird es zudem sein,

individuelle Variabilitäten im Sensibilisierungsmuster mithilfe größerer Tierzahlen zu

überprüfen.

5.3 Beurteilung der Reaktion der Basophilen im FIT auf die

verwendeten Flohantigen-Präparationen

Zur Untersuchung der Reaktionsbereitschaft der Basophilen auf Antigene von C. felis

wurden zwei verschiedene Antigenextrakte eingesetzt. Zum einen wurde die

funktionelle Sensibilisierung mithilfe eines Floh-Ganzkörperextraktes von Greer

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

150

getestet, zum anderen wurde aus dem für die Flohexpositionen verwendeten

Flohstamm eine eigene Ganzkörperpräparation zum Einsatz im FIT hergestellt. Die

aus ganzen Flöhen hergestellten Extrakte enthalten die vornehmlich im Flohspeichel

vorkommenden Antigene in deutlich geringerem Ausmaß als eine

Speichelpräparation. Zwar liegt die Spezifität von Ganzflohextrakten unter der von

Flohspeichel, aus früheren Untersuchungen ist jedoch bekannt, dass deren Spezifität

ausreicht, um eine Sensibilisierung von Mastzellen festzustellen (KRISTENSEN u.

KIEFFER 1978; LAFFORT-DASSOT et al. 2004). Die Ergebnisse von STOLPER und

OPDEBEECK (1994) zeigten, dass einzelne Fraktionen eines von ihnen getesteten

Ganzflohextrakts eine geringere Spezifität hatten als der gesamte Extrakt. Auch

STUKE (2005) konnte mit dem Ganzflohextrakt von Greer deutliche Reaktionen der

Basophilen auf im Extrakt enthaltene Antigene provozieren und unterschiedliche

Reaktionsmuster identifizieren, was im Rahmen der selbst durchgeführten

Experimente bestätigt wurde.

Die eigenen Ergebnisse haben darüber hinaus Unterschiede in der Reaktion der

Basophilen auf zwei verschiedene Flohantigenextrakte gezeigt. Dass sich mit

Antigenpräparationen verschiedener Herkunft sehr unterschiedliche Testergebnisse

erzielen lassen, beobachteten auch LAFFORT-DASSOT et al. (2004). Obwohl die

Provokation mit den beiden Extrakten statistisch deutlich bis fast vollständig

übereinstimmte, rief der selbst hergestellte Ganzflohextrakt (WBE-H) dennoch mehr

positive Reaktionen im FIT hervor als der Greer-Extrakt WBE-G (4.2.3.6). Da der

Extrakt WBE-G im Gegensatz zur eigenen Präparation vor der Verwendung mittels

Gelfiltration aufgereinigt werden musste, ist eine methodisch bedingte Retention

bestimmter Komponenten denkbar, die dann bei der Provokation der Basophilen

fehlten. Eine weitere Ursache könnte in der unterschiedlichen geographischen

Herkunft der Präparationen liegen, wobei die genaue Identität der bei der Herstellung

verwendeten Flohstämme nicht geklärt werden konnte. Die mit WBE-H beobachtete

höhere Prävalenz positiv getesteter Katzen könnte ferner dadurch erklärbar sein,

dass durch die Flohexpositionen sensibilisierende Antikörper gegen Antigene

gebildet wurden, die nur der institutseigene Flohstamm besitzt. Des Weiteren wäre

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

151

es auch denkbar, dass bei gleicher Antigenzusammensetzung in den beiden

Präparationen unterschiedlich hohe Konzentrationen bestimmter Proteine vorhanden

waren, gegen die die exponierten Katzen spezifische Antikörper gebildet hatten. Von

den Flöhen beim Saugakt inokuliertes Antigen könnte zu einer funktionellen

Sensibilisierung gegen Proteine geführt haben, die im Extrakt WBE-G im Vergleich

zu WBE-H nur in geringer Menge vorhanden waren, was folglich bei der Provokation

der Basophilen im FIT mit WBE-G keine bzw. mit WBE-H deutliche Reaktionen

auslöste.

5.4 Vergleich des Reaktionsverhaltens von Basophile n und

Mastzellen

In der vorliegenden Arbeit wurde neben der Sensibilisierungskinetik der Basophilen

im FIT im gleichen Zeitraum auch die funktionelle Sensibilisierung der Mastzellen im

IKT untersucht. Vor Beginn der Flohexpositionen zeigten die beobachteten Tiere eine

stark übereinstimmende Reaktion von Basophilen und Mastzellen (4.2.5). Während

der regelmäßig durchgeführten Infestationen nahm die Übereinstimmung deutlich ab.

Diese Beobachtung bestätigt die Ergebnisse von STUKE (2005). Im Gegensatz zu

der Arbeit von STUKE wurden in der eigenen Untersuchung jedoch mehr Tiere FIT-

positiv getestet als IKT-positiv. In beiden Untersuchungen kam der Extrakt WBE-G

zum Einsatz, jedoch wurde er in der vorliegenden Arbeit zusätzlich in einer höheren

Konzentrationsstufe eingesetzt (5 µg/ml), was möglicherweise durch stärkere

Stimulation der Effektorzellen vermehrt zu positiven Resultaten, insbesondere im

FIT, geführt haben könnte.

Eine weitere mögliche Erklärung wäre eine unterschiedliche Sensitivität der beiden

Testverfahren. In einer kürzlich publizierten Studie über das Verhalten von

Basophilen und Mastzellen bei Pferden mit Sommerekzem erbrachte der FIT eine

höhere Sensitivität als der IKT (LANGNER et al. 2007). Pferde mit klinisch

diagnostiziertem Sommerekzem, die nur sehr milde Symptome zeigten, reagierten im

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

152

IKT teilweise negativ, im FIT jedoch positiv. Dies deutet darauf hin, dass eine nur

schwach ausgeprägte allergische Symptomatik, wie sie in der hier untersuchten

Katzenpopulation generell zu beobachten war, im IKT zu falsch-negativen Resultaten

führen kann.

Ob die ausbleibende Hautreaktion einiger FIT-positiver Katzen in ähnlicher Weise auf

ein falsch-negatives Ergebnis des IKT zurückzuführen ist, lässt sich nur schwer

beurteilen, da keine der untersuchten Katzen deutliche Symptome einer Flohallergie

aufwies. Es liegen ferner Hinweise vor, dass die Verteilung der Mastzellen in der

Haut nicht homogen ist und/oder deren Histamingehalt variiert (HAMPEL et al. 2008).

Die Ergebnisse von an Pferden durchgeführten, vergleichenden Hauttests fielen

daher je nach verwendetem Hautareal sehr unterschiedlich aus. Falls dies auch bei

der Katze zutreffend ist, würde es die ohnehin diffizile Interpretation von

Hautreaktionen bei dieser Tierart (VROOM 2000) noch zusätzlich erschweren.

Einen weiteren, möglichen Einflussfaktor auf die IKT-Befunde könnten die für die

Narkose verwendeten Wirkstoffe Ketamin und Xylazin darstellen. Deren Bedeutung

ist jedoch nur schwer abzuschätzen, da entsprechende Untersuchungen an Katzen

bis dato nicht durchgeführt wurden. BEALE et al. (1990) empfehlen Xylazin als

Sedativum für den Intrakutantest bei Hunden, da es die Reaktionsfähigkeit der

Mastzellen nicht herabsetzte. In einer Studie von MORIELLO u. EICKER (1991) an

Hunden beeinflusste eine Kombination aus Ketamin und Diazepam die objektiven

Messwerte des Intrakutantest nicht. Da es im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich

war, Vergleichsmessungen in Narkose und im Wachzustand durchzuführen, kann

eine Beeinflussung der Messwerte durch die Ketamin/Xylazin-Narkose nicht gänzlich

ausgeschlossen werden.

Dass bei fehlender Klinik eine funktionelle Sensibilisierung nachweisbar ist, wurde

bereits von anderen Autoren bei Katzen (MORIELLO u. MCMURDY 1989; STUKE

2005), Hunden (KUNKLE et al. 2000; LAFFORT-DASSOT et al. 2004) und Pferden

(LANGNER et al. 2007) beschrieben und stellt ein häufiges Phänomen dar. Ein

weiterer Aspekt, der bereits diskutiert wurde, ist die Induktion einer Toleranz gegen

die verwendeten Antigene (5.2.2).

D I S K U S S I O N

___________________________________________________________________________

153

Dass auf den Typ I-Effektorzellen vorhandene, sensibilisierende Antikörper nicht

zwingend mit einer klinisch ausgeprägten Allergie einhergehen müssen, wirft die

Frage nach den Regulationsmechanismen auf, die die klinisch manifeste Erkrankung

verhindern. In den letzten Jahren hat sich das Bild der basophilen Granulozyten als

reine Effektorzellen gewandelt. Neuere Forschungen zeigen, dass Basophile IL-4

produzieren und so naive CD4+ T-Zellen zu Th2 Zellen differenzieren können (OH et

al. 2007). Weiterhin wies die Arbeitsgruppe um OH nach, dass Basophile über

direkten Kontakt mit T-Zellen die Ausprägung des Th1-Phänotyps inhibieren. MIN et

al. (2004) konnten zeigen, dass Basophile bei Mäusen, die mit Nippostrongylus

brasiliensis infiziert waren, die wichtigste Quelle von IL-4 zur Induktion der Th2-

Antwort waren. Außerdem fanden sie Basophile vornehmlich in peripheren und nicht

in lymphatischen Geweben. Diese Ergebnisse weisen den Basophilen eine

entscheidende Rolle bei der Modulation der Immunantwort zu und liefern einen

möglichen Erklärungsansatz für die in dieser Arbeit beschriebene Diskrepanz

zwischen der Sensibilisierung von Mastzellen und Basophilen. So könnten Basophile

zwar sensibilisierende Antikörper tragen, deren Produktion von Th2-Zellen induziert

wurde, aber in vivo nicht aktiviert werden, weil das korrespondierende Antigen nicht

in ausreichenden Mengen vorhanden ist. Die Konsequenz wäre eine möglicherweise

unzureichende IL-4-Produktion, wodurch Mastzellen nicht genügend FcεRI

exprimierten (PRUSSIN u. METCALFE 2006). Dies könnte eine

Mastzellsensibilisierung, die der Sensibilisierung der Basophilen eventuell

nachgeordnet ist, verzögert eintreten lassen oder sogar verhindern.

Basophile Granulozyten und Mastzellen differenzieren aus CD34+ Vorläuferzellen.

Während Basophile bereits im Knochenmark reifen und erst dann auswandern,

vollenden Mastzellen ihre Differenzierung in der Peripherie (ENERBACK 1997;

PRUSSIN u. METCALFE 2006). Menschliche Basophile und Mastzellen verhalten

sich klinisch als unabhängige Zelllinien. Trotz dieser Unterschiede wird ihr Verhalten

als Effektorzellen der Typ I-Allergie in der Forschung oft gleichgesetzt. Die

Ergebnisse der vorliegenden Arbeit über das unterschiedliche Reaktionsverhalten

von Basophilen und Mastzellen könnten nicht zuletzt auf der Heterogenität dieser

beiden Zellpopulationen beruhen:

Z U S A M M E N F A S S U N G

___________________________________________________________________________

154

6 Zusammenfassung

Matthias Sydow: Vergleich der Sensibilisierungskine tik von Effektorzellen der

Typ I-Allergie bei der Katze während periodischer E xposition mit

Ctenocephalides felis in hoher und geringer Intensität

Eine Überempfindlichkeit gegen Speichelproteine des Katzenflohs, C. felis, und die

daraus resultierende Flohallergie-Dermatitis ist bei der Katze ein häufiges

dermatologisches Krankheitsbild. Ausgelöst wird es von Mastzellen und basophilen

Granulozyten, die an ihren membranständigen aktivierenden Fc-Rezeptoren (FcR)

ausreichend mit sensibilisierenden Antikörpern gegen Flohantigene besetzt sind, so

dass sie bei genügend Antigenkontakt zur Freisetzung ihrer Mediatoren angeregt

werden. Eine derartige funktionelle Sensibilisierung lässt sich nicht durch

serologische, sondern nur durch geeignete zelluläre Testverfahren nachweisen. Für

die Mastzellen ist dies der Intrakutantest (IKT), für die Basophilen der funktionelle in

vitro Test (FIT).

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss einer hohen und einer sehr geringen C. felis-

Antigenexposition auf das Sensibilisierungsverhalten von felinen Basophilen und

Mastzellen mithilfe des FIT und des IKT zu untersuchen. Hierzu wurden 18 Katzen

über einen Zeitraum von 10 Monaten wöchentlich für 24 h mit ca. 100 Flöhen

infestiert, wobei eine Gruppe von Katzen (n=12) zur Verminderung der

Antigenexposition gleichzeitig mit dem Kontaktinsektizid Imidacloprid behandelt

wurde. Eine weitere Gruppe (n=6) blieb unbehandelt (hoch exponiert). Die mittlere

Anzahl Flöhe mit Blutmahlzeit betrug in der hoch exponierten Gruppe 39 ± 17, in der

gering exponierten Gruppe 0,4 ± 0,9. Über insgesamt 47 Wochen wurde die

funktionelle Sensibilisierung der Basophilen und Mastzellen vor, während und nach

der Flohexpositionsphase mittels FIT und IKT geprüft. Dazu wurde ein kommerzieller

Flohantigen-Ganzkörperextrakt und in der Schlussphase der Untersuchung

zusätzlich ein selbst hergestellter Extrakt aus dem gleichen Flohstamm benutzt, mit

dem die Katzen infestiert wurden.

Z U S A M M E N F A S S U N G

___________________________________________________________________________

155

Neben einer technischen Verbesserung des FIT für die Katze wurden folgende

wesentliche Ergebnisse erzielt:

In der hoch und in der gering exponierten Gruppe zeigten sich je drei Katzen als

„resistent“ gegenüber einer Sensibilisierung gegen Flohantigene. Weder vor noch

während oder nach der 40-wöchigen Expositionsphase war eine Tendenz zur

funktionellen Sensibilisierung ihrer Basophilen oder Mastzellen erkennbar.

In der hoch und in der gering exponierten Gruppe zeigten je zwei Tiere bereits vor

dem Beginn der Flohexposition eine funktionelle Sensibilisierung ihrer Basophilen

gegen Flohantigen. Während die beiden Katzen in der gering exponierten Gruppe

über die gesamte Untersuchungszeit etwa gleichbleibend sensibilisiert blieben, nahm

die Stärke der Basophilensensibilisierung bei den beiden hoch exponierten Katzen

mit fortschreitender Zeit signifikant ab. Nur in der gering exponierten Gruppe zeigten

drei zuvor FIT-negative Katzen kurz nach Beginn der Flohexpositionen eine deutliche

funktionelle Sensibilisierung im FIT („early onset“ Reaktion). Diese Tiere waren

vermutlich bereits vorsensibilisiert, reagierten jedoch aus regulativen Gründen im

Vortest negativ und wurden durch Flohantigenexposition bald positiv. Eine dieser

Katzen blieb auch weiterhin positiv, während die beiden anderen in ihrer

Basophilensensibilisierung schwankten. Ihre Verlaufskinetik liefert Hinweise auf

Regulationsmechanismen auf der Ebene der Basophilen. Ein weiteres, bisher für

Haustiere noch nicht dokumentiertes Sensibilisierungsmuster zeigten vier Katzen aus

beiden Gruppen: eine „late onset“ Reaktion. Vor und während der ersten 18 Wochen

wiederholter Flohexpositionen zeigten sie keine Anzeichen einer Sensibilisierung

ihrer Basophilen. Ab der 22. Expositionswoche entwickelten sie eine von nun an

deutlich zunehmende und bleibende Sensibilisierung ihrer Basophilen.

Desweiteren konnten sowohl im FIT als auch im IKT grundsätzlich übereinstimmende

Befunde auf die beiden Extrakte dokumentiert werden, wobei die selbst hergestellte

Präparation mehr positive Reaktionen hervorrief. Zu Beginn der Untersuchungen

bestand eine Übereinstimmung von Basophilen- (FIT) und Mastzellsensibilisierung

(IKT) (kappa 0,61), die durch die zunehmende Sensibilisierung der Basophilen im

weiteren Verlauf geringer wurde (kappa 0,24). Das stimmt damit überein, dass die

Basophilensensiblisierung vor der Mastzellsensibilisierung stattfindet.

S U M M A R Y

___________________________________________________________________________

156

7 Summary Matthias Sydow: Sensitization kinetics of type I hy persensitivity effector cells

in the cat during periodical exposure to Ctenocephalides felis in high and low

intensity

Hypersensitivity to saliva components of the cat flea, C. felis, and the resulting flea

allergic dermatitis (FAD) is a commonly seen dermatologic disorder in the cat. It is

caused by mast cells and basophils with sufficient amounts of sensitizing antibodies

bound to their Fc receptors (FcR), communicating the release of inflammatory

mediators upon bridging by a recognized antigen. Such a functional sensitization

cannot be comprised by any serological testing. It requires complex cellular reactions

such as those of mast cells via intradermal test (IDT) or of basophils monitored by

the functional in vitro test for basophil sensitisation (FIT).

The objective of this study was to investigate the influence of controlled high and low

exposure of cats to C. felis by monitoring the sensitization kinetics of their basophils

and mast cells using FIT and IDT, respectively. Over a period of 10 months, a 24h

infestation with 100 fleas per cat was repeated weekly on 18 cats. One group (n=12)

was treated with the insecticide imidacloprid to reduce the number of blood sucking

fleas and, thus, the antigen exposure (low exposure group). The other group (n=6)

remained untreated (high exposure group). Mean count of fleas with bloodmeal was

39 ± 17 in the high exposure group and 0.4 ± 0.9 in the low exposure group. During a

time span of 47 weeks, functional sensitization of basophils and mast cells was

monitored by using a commercially available whole body extract of C. felis. Moreover,

a self-made extract of the flea strain used for infestation was tested in the final stage

of investigation.

In addition to technical improvements of the FIT for cats, the following major results

were achieved:

Three cats in each of the high and low exposure group proved to be “resistant” to

sensitization to flea antigens. No tendency of sensitization was observed neither

before nor during and after the 40-week exposure period.

S U M M A R Y

___________________________________________________________________________

157

The basophils of two cats in each of the high and low exposure group, were

functionally sensitized to flea antigen already before the experimental exposure

started. While the two cats in the low exposure group remained constantly sensitized

throughout the investigation period, the degree of basophil sensitization in the two

highly exposed cats decreased significantly with time. Exclusively in the low

exposure group, three previously FIT-negative cats clearly displayed a functional

sensitization soon after initial flea infestations (“early onset” reaction). These animals

were presumably pre-sensitized but reacted negative before flea exposure probably

for regulatory reasons and became positive due to a boost with flea antigen. One of

these cats remained positive further on while basophil sensitization of the two others

went subsequently up and down. Their sensitization kinetics points towards

regulatory mechanisms on the basophil level.

One more yet undescribed sensitization pattern in domestic animals was seen in four

cats in both groups: a “late onset” reaction. Before and during the first 18 weeks of

repeated flea infestation they showed no sign of basophil sensitization. From week

22 on, however, they developed a functional sensitization of their basophils with a

remarkable increase.

Furthermore, in both FIT and intradermal test (IDT), results were basically consistent,

though more positive reactions were seen with the self-made antigen preparation.

Before exposure there was a correlation between FIT and IDT (kappa 0.61). With

increasing sensitization of basophils during the exposure period, however, the

correlation lowered (kappa 0.24). These results are in agreement with previous

findings that functional basophil sensitization occurs before mast cell sensitization.

L I T E R A T U R V E R Z E I C H N I S

___________________________________________________________________________

158

8 Literaturverzeichnis

AKAGI, K. u. R. G. TOWNLEY (1989): Spontaneous histamine release and histamine content in normal subjects and subjects with asthma. J Allergy Clin Immunol 83, 742-749

AKUCEWICH, L. H., K. PHILMAN, A. CLARK, J. GILLESPIE, G. KUNKLE, C. F. NICKLIN u. E. C. GREINER (2002): Prevalence of ectoparasites in a population of feral cats from north central Florida during the summer. Vet Parasitol 109, 129-139

ANDERSON, G. S., P. BELTON u. N. KLEIDER (1988): The Hypersensitivity of Horses to Culicoides Bites in British Columbia. Can Vet J 29, 718-723

ANDERSON, G. S., P. BELTON u. N. KLEIDER (1993): Hypersensitivity of horses in British Columbia to extracts of native and exotic species of Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae). J Med Entomol 30, 657-663

ARTHER, R. G., J. CUNNINGHAM, H. DORN, R. EVERETT, L. G. HERR u. T. HOPKINS (1997): Efficacy of imidacloprid for removal and control of fleas (Ctenocephalides felis) on dogs. Am J Vet Res 58, 848-850

AUSTEL, M., P. HENSEL, D. JACKSON, A. VIDYASHANKAR, Y. ZHAO u. L. MEDLEAU (2006): Evaluation of three different histamine concentrations in intradermal testing of normal cats and attempted determination of 'irritant' threshold concentrations for 48 allergens. Vet Dermatol 17, 189-194


___________________________________________________________________________

159

BEALE, K. M., G. A. KUNKLE, L. CHALKER u. R. CANNON (1990): Effects of sedation on intradermal skin testing in flea-allergic dogs. J.Am.Vet.Med.Assoc. 197, 861-864

BEAVEN, M. A., J. ROGERS, J. P. MOORE, T. R. HESKETH, G. A. SMITH u. J. C. METCALFE (1984): The mechanism of the calcium signal and correlation with histamine release in 2H3 cells. J Biol Chem 259, 7129-7136

BECK, W. (2007): Migrationsverhalten von Ctenocephalides felis auf Katzen und in deren Lagerstätten. In: Tagung der DVG Fachgruppe Parasitologie und parasitäre Krankheiten, 2007, Celle,

BECK, W., K. BOCH, H. MACKENSEN, B. WIEGAND u. K. PFISTER (2006): Qualitative and quantitative observations on the flea population dynamics of dogs and cats in several areas of Germany. Vet Parasitol 137, 130-136

BENCHAOUI, H. A., R. G. CLEMENCE, P. J. CLEMENTS, R. L. JONES, P. WATSON, D. J. SHANKS, D. G. SMITH, G. H. STURE, A. D. JERNIGAN u. T. G. ROWAN (2000): Efficacy and safety of selamectin against fleas on dogs and cats presented as veterinary patients in Europe. Vet Parasitol 91, 223-232

BINTA, M. G. u. M. P. CUNNINGHAM (1984): Cutaneous responses of cattle to extracts from Rhipicephalus appendiculatus larvae. Vet Parasitol 15, 67-73

BISHOP, B. F., C. I. BRUCE, N. A. EVANS, A. C. GOUDIE, K. A. GRATION, S. P. GIBSON, M. S. PACEY, D. A. PERRY, N. D. WALSHE u. M. J. WITTY (2000): Selamectin: a novel broad-spectrum endectocide for dogs and cats. Vet Parasitol 91, 163-176


___________________________________________________________________________

160

BLAGBURN, B. L., J. L. VAUGHAN, J. M. BUTLER u. S. C. PARKS (1999): Dose titration of an injectable formulation of lufenuron in cats experimentally infested with fleas. Am J Vet Res 60, 1513-1515

BLOOMQUIST, J. R. (2003): Chloride channels as tools for developing selective insecticides. Arch Insect Biochem Physiol 54, 145-156

BOND, R., S. C. THOROGOOD u. D. H. LLOYD (1994): Evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays for the diagnosis of canine atopy. Vet Rec 135, 130-133

BOSSARD, R. L., M. W. DRYDEN u. A. B. BROCE (2002): Insecticide susceptibilities of cat fleas (Siphonaptera: Pulicidae) from several regions of the United States. J Med Entomol 39, 742-746

BOY, M. G., R. H. SIX, C. A. THOMAS, M. J. NOVOTNY, C. D. SMOTHERS, T. G. ROWAN u. A. D. JERNIGAN (2000): Efficacy and safety of selamectin against fleas and heartworms in dogs and cats presented as veterinary patients in North America. Vet Parasitol 91, 233-250

BRAUN-FAHRLANDER, C. (2000): Allergic diseases in farmers' children. Pediatr Allergy Immunol 11 Suppl 13, 19-22

CADIERGUES, M. C., C. CAUBET u. M. FRANC (2001): Comparison of the activity of selamectin, imidacloprid and fipronil for the treatment of dogs infested experimentally with Ctenocephalides canis and Ctenocephalides felis felis. Vet Rec. 149, 704-706


___________________________________________________________________________

161

CADIERGUES, M. C., P. HOURCQ, B. CANTALOUBE u. M. FRANC (2000): First bloodmeal of Ctenocephalides felis felis (Siphonaptera: Pulicidae) on cats: time to initiation and duration of feeding. J Med Entomol 37, 634-636

CARLOTTI, D. N. u. D. E. JACOBS (2000): Therapy, control and prevention of flea allergy dermatitis in dogs and cats. Vet Dermatol 11, 83-98

COCHET, P., P. BIRCKEL, M. BROMET-PETIT, N. BROMET u. A. WEIL (1997): Skin distribution of fipronil by microautoradiography following topical administration to the beagle dog. Eur J Drug Metab Pharmacokinet 22, 211-216

CODNER, E. C. u. P. LESSARD (1993): Comparison of intradermal allergy test and enzyme-linked immunosorbent assay in dogs with allergic skin disease. J Am Vet Med Assoc 202, 739-743

COLOMBINI, S., E. C. HODGIN, C. S. FOIL, G. HOSGOOD u. L. D. FOIL (2001): Induction of feline flea allergy dermatitis and the incidence and histopathological characteristics of concurrent indolent lip ulcers. Vet Dermatol 12, 155-161

CUSTOVIC, A., C. L. HALLAM, B. M. SIMPSON, M. CRAVEN, A. SIMPSON u. A. WOODCOCK (2001): Decreased prevalence of sensitization to cats with high exposure to cat allergen. J Allergy Clin Immunol 108, 537-539

DE WECK, A. L. u. M. L. SANZ (2004): Cellular allergen stimulation test (CAST) 2003, a review. J Investig Allergol Clin Immunol 14, 253-273


___________________________________________________________________________

162

DE WECK, A. L., B. M. STADLER, A. URWYLER, W. H. U. u. R. P. BÜHLMANN (1993): Cellular allergen stimulation test (CAST) - a new dimension in allergy diagnostics. Allergy Clin Immunol News 9-14

DEAN, S. R., R. W. MEOLA, S. M. MEOLA, H. SITTERTZ-BHATKAR u. R. SCHENKER (1998): Mode of action of lufenuron on larval cat fleas (Siphonaptera: Pulicidae). J Med Entomol 35, 720-724

DEBOER, D. J. u. A. HILLIER (2001a): The ACVD task force on canine atopic dermatitis (XV): fundamental concepts in clinical diagnosis. Vet Immunol Immunopathol 81, 271-276

DEBOER, D. J. u. A. HILLIER (2001b): The ACVD task force on canine atopic dermatitis (XVI): laboratory evaluation of dogs with atopic dermatitis with serum-based "allergy" tests. Vet Immunol Immunopathol 81, 277-287

DELAY, R. L., E. LACOSTE, S. DELPRAT u. F. BLOND-RIOU (2007): Pharmacokinetics of metaflumizone in the plasma and hair of cats following topical application. Vet Parasitol 150, 258-262

DRYDEN, M., P. PAYNE, A. LOWE, S. MAILEN, V. SMITH u. D. RUGG (2007): Efficacy of a topically applied formulation of metaflumizone on cats against the adult cat flea, flea egg production and hatch, and adult flea emergence. Vet Parasitol 150, 263-267

DRYDEN, M., P. PAYNE, A. LOWE, S. MAILEN, V. SMITH u. D. RUGG (2008): Efficacy of a topically applied spot-on formulation of a novel insecticide, metaflumizone, applied to cats against a flea strain (KS1) with documented reduced susceptibility to various insecticides. Vet Parasitol 151, 74-79


___________________________________________________________________________

163

DRYDEN, M. W. (1989): Host association, on-host longevity and egg production of Ctenocephalides felis felis. Vet Parasitol 34, 117-122

DRYDEN, M. W. u. J. C. BLAKEMORE (1989): A Review of Flea Allergy Dermatitis in the Dog and Cat. Comp Anim Pract 19, 10-17

DRYDEN, M. W., H. R. PEREZ u. D. M. ULITCHNY (1999): Control of fleas on pets and in homes by use of imidacloprid or lufenuron and a pyrethrin spray. J Am Vet Med Assoc 215, 36-39

DRYDEN, M. W. u. M. K. RUST (1994): The cat flea: biology, ecology and control. Vet Parasitol 52, 1-19

DRYDEN, M. W., V. SMITH, P. A. PAYNE u. T. L. MCTIER (2005): Comparative speed of kill of selamectin, imidacloprid, and fipronil-(S)-methoprene spot-on formulations against fleas on cats. Vet.Ther. 6, 228-236

ENERBACK, L. (1997): The differentiation and maturation of inflammatory cells involved in the allergic response: mast cells and basophils. Allergy 52, 4-10

FADOK, V. A. u. E. C. GREINER (1990): Equine insect hypersensitivity: skin test and biopsy results correlated with clinical data. Equine Vet J 22, 236-240

FISHER, M. A., D. E. JACOBS, M. J. HUTCHINSON u. I. G. DICK (1996): Evaluation of flea control programmes for cats using fenthion and lufenuron. Vet Rec 138, 79-81


___________________________________________________________________________

164

FOSTER, A. P., H. A. O'DAIR u. D. J. DEBOER (1997): Allergen-specific IgG antibodies in cats with allergic skin disease. Res vet Sci 63, 239-243

FRANC, M. u. M. C. CADIERGUES (1998): Antifeeding effect of several insecticidal formulations against Ctenocephalides felis on cats. Parasite 5, 83-86

FRANK, G. R., S. W. HUNTER, G. L. STIEGLER, L. J. WALLENFELS u. K. W. KWOCHKA (1996): Salivary allergens of Ctenocephalides felis: collection, purification and evaluation by intradermal skin testing in dogs. In: 3rd World Conference in Veterinary Dermatology, 11-14 September 1996, Edinburgh, Scotland,

GALLI, S. J., J. KALESNIKOFF, M. A. GRIMBALDESTON, A. M. PILIPONSKY, C. M. WILLIAMS u. M. TSAI (2005): Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol 23, 749-786

GILBERT, S. u. R. E. HALLIWELL (1998): Feline immunoglobulin E: induction of antigen-specific antibody in normal cats and levels in spontaneously allergic cats. Vet Immunol Immunopathol 63, 235-252

GREENE, W. K., R. L. CARNEGIE, S. E. SHAW, R. C. THOMPSON u. W. J. PENHALE (1993): Characterization of allergens of the cat flea, Ctenocephalides felis: detection and frequency of IgE antibodies in canine sera. Parasite Immunol 15, 69-74

GROSS, T. L., K. W. KWOCHKA u. G. A. KUNKLE (1986): Correlation of histologic and immunologic findings in cats with miliary dermatitis. J Am Vet Med Assoc 189, 1322-1325


___________________________________________________________________________

165

GUZMAN, R. F. (1984): A survey of cats and dogs for fleas: with particular reference to their role as intermediate hosts of Dipylidium caninum. N Z Vet J 32, 71-73

HAINZL, D. u. J. E. CASIDA (1996): Fipronil insecticide: novel photochemical desulfinylation with retention of neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 12764-12767

HALLIWELL, R. E. (1993): Clinical and immunological response to alum-precipitated flea antigen in immunotherapy of flea-allergic dogs: results of a double-blind study. J Am Vet Hosp Assoc 17, 249-253

HALLIWELL, R. E. u. G. A. KUNKLE (1978): The radioallergosorbent test in the diagnosis of canine atopic disease. J Allergy Clin Immunol 62, 236-242

HAMPEL, S. (2007) Prüfung und Modulation der Typ-I Reaktionsbereitschaft von Pferden im funktionellen in vitro Test (FIT) sowie im Intrakutantest (IKT). Hannover, Tierärztliche Hochschule, AG Immunologie, Diss.

HAMPEL, S., J. ROHWER, H. LEINEMANN, C. SCHROP, R. E. ESCH u. W. LEIBOLD (2008): Der Intrakutantest beim Pferd: Relaistsichere Betrachtung zur Anwendung - Wissenschaftliche Grundlagen und praktische Durchführung. Pferdeheilk 24, 381-396

HARMAN, D. W., R. E. HALLIWELL u. E. C. GREINER (1987): Flea species from dogs and cats in north-central Florida. Vet Parasitol 23, 135-140


___________________________________________________________________________

166

HELLMANN, K., T. KNOPPE, K. KRIEGER u. D. STANNECK (2003): European multicenter field trial on the efficacy and safety of a topical formulation of imidacloprid and permethrin (Advantix) in dogs naturally infested with ticks and/or fleas. Parasitol Res 90 Suppl 3, S125-126

HESSELMAR, B., B. ABERG, B. ERIKSSON, B. BJORKSTEN u. N. ABERG (2003): High-dose exposure to cat is associated with clinical tolerance--a modified Th2 immune response? Clin Exp Allergy 33, 1681-1685

HILL, P. B. u. D. J. DEBOER (2001): The ACVD task force on canine atopic dermatitis (IV): environmental allergens. Vet Immunol Immunopathol 81, 169-186

HILLIER, A. u. D. J. DEBOER (2001): The ACVD task force on canine atopic dermatitis (XVII): intradermal testing. Vet Immunol Immunopathol 81, 289-304

HINK, W. F., D. C. DROUGHT u. S. BARNETT (1991): Effect of an experimental systemic compound, CGA-184699, on life stages of the cat flea (Siphonaptera: Pulicidae). J Med Entomol 28, 424-427

HSU, M. H., T. C. HSU u. W. J. WU (2002): Distribution of cat fleas (Siphonaptera : Pulicidae) on the cat. J Med Entomol 39, 685-688

HSU, M. H. u. W. J. WU (2001): Off-host observations of mating and postmating behaviors in the cat flea (Siphonaptera: Pulicidae). J Med Entomol 38, 352-360


___________________________________________________________________________

167

ISHIZAKA, T. u. K. ISHIZAKA (1977): Immunological events at the surface of basophil granulocytes and mast cells which induce degranulation. Scand J Respir Dis Suppl 98, 13-22

JACOBS, D. E., M. J. HUTCHINSON u. D. EWALD-HAMM (2000): Inhibition of immature Ctenocephalides felis felis (Siphonaptera: Pulicidae) development in the immediate environment of cats treated with imidacloprid. J Med Entomol 37, 228-230

JACOBS, D. E., M. J. HUTCHINSON u. K. J. KRIEGER (1997): Duration of activity of imidacloprid, a novel adulticide for flea control, against Ctenocephalides felis on cats. Vet Rec 140, 259-260

JACOBS, D. E., M. J. HUTCHINSON, K. J. KRIEGER u. D. BARDT (1996): A novel approach to flea control on cats, using pyriproxyfen. Vet Rec 139, 559-561

JACOBS, D. E., M. J. HUTCHINSON u. W. G. RYAN (2001a): Control of flea populations in a simulated home environment model using lufenuron, imidacloprid or fipronil. Med Vet Entomol 15, 73-77

JACOBS, D. E., M. J. HUTCHINSON, D. STANNECK u. N. MENCKE (2001b): Accumulation and persistence of flea larvicidal activity in the immediate environment of cats treated with imidacloprid. Med Vet Entomol 15, 342-345

JANEWAY, C. A., P. TRAVERS, M. WALPORT u. M. SHLOMCHIK (2002): Immunologie. 5. Aufl., Spektrum Verlag, Heidelberg Berlin


___________________________________________________________________________

168

KAUL, S. (1998) Typ I Allergien beim Pferd: Prinzipielle Entwicklung eines funktionellen in vitro Nachweises. Hannover, Arbeitsgruppe Immunologie, Diss.

KAWAKAMI, T. u. S. J. GALLI (2002): Regulation of mast-cell and basophil function and survival by IgE. Nat Rev Immunol 2, 773-786

KAZIMIERCZAK, W., A. ZIELINSKI u. D. SZABELSKA (1980): A comparative study on basophil histamine release and skin testing in children with allergic rhinitis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 28, 935-939

KEPLEY, C. L., S. TAGHAVI, G. MACKAY, D. ZHU, P. A. MOREL, K. ZHANG, J. J. RYAN, L. S. SATIN, M. ZHANG, P. P. PANDOLFI u. A. SAXON (2004): Co-aggregation of FcgammaRII with FcepsilonRI on human mast cells inhibits antigen-induced secretion and involves SHIP-Grb2-Dok complexes. J Biol Chem 279, 35139-35149

KEPLEY, C. L., L. YOUSSEF, R. P. ANDREWS, B. S. WILSON u. J. M. OLIVER (1999): Syk deficiency in nonreleaser basophils. J Allergy Clin Immunol 104, 279-284

KEPLEY, C. L., L. YOUSSEF, R. P. ANDREWS, B. S. WILSON u. J. M. OLIVER (2000): Multiple defects in Fc epsilon RI signaling in Syk-deficient nonreleaser basophils and IL-3-induced recovery of Syk expression and secretion. J Immunol 165, 5913-5920

KILPELAINEN, M., E. O. TERHO, H. HELENIUS u. M. KOSKENVUO (2000): Farm environment in childhood prevents the development of allergies. Clin Exp Allergy 30, 201-208


___________________________________________________________________________

169

KITAURA, J., J. SONG, M. TSAI, K. ASAI, M. MAEDA-YAMAMOTO, A. MOCSAI, Y. KAWAKAMI, F. T. LIU, C. A. LOWELL, B. G. BARISAS, S. J. GALLI u. T. KAWAKAMI (2003): Evidence that IgE molecules mediate a spectrum of effects on mast cell survival and activation via aggregation of the FcepsilonRI. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 12911-12916

KLEINE BUDDE, I., P. G. DE HEER, J. S. VAN DER ZEE u. R. C. AALBERSE (2001): The stripped basophil histamine release bioassay as a tool for the detection of allergen-specific IgE in serum. Int Arch Allergy Immunol 126, 277-285

KNOL, E. F. (2006): Requirements for effective IgE cross-linking on mast cells and basophils. Mol Nutr Food Res 50, 620-624

KOMIYA, A., K. HIRAI, M. IIKURA, H. NAGASE, H. YAMADA, M. MIYAMASU, K. OHTA, Y. MORITA, C. RA, K. YAMAMOTO u. M. YAMAGUCHI (2003): Induction of basophil desensitization in physiological medium: enhancement after IgE-dependent upregulation of surface IgE binding on basophils. Int Arch Allergy Immunol 130, 40-50

KRISTENSEN, S. u. M. KIEFFER (1978): A study of skin diseases in dogs and cats. V. The intradermal test in the diagnosis of flea allergy in dogs and cats. Nord Vet Med 30, 414-423

KUBO, S., T. NAKAYAMA, K. MATSUOKA, H. YONEKAWA u. H. KARASUYAMA (2003): Long term maintenance of IgE-mediated memory in mast cells in the absence of detectable serum IgE. J Immunol 170, 775-780


___________________________________________________________________________

170

KUMAR, P., B. SINGH, R. LAL, G. W. REMBHOTKAR u. A. B. SINGH (2007): Histamine releasibility and expression of Lyn and Syk kinases in Indian subjects and role of less potent IL-3 in non-releaser basophils. Cytokine 37, 200-205

KUNKLE, G. A., L. JONES u. P. PETTY (2000): Immediate intradermal flea antigen reactivity in clinically normal adult dogs from south Florida, USA. Veterinary Dermatology 11, 9-12

KUNKLE, G. A. u. J. MILCARSKY (1985): Double-blind flea hyposensitization trial in cats. J Am Vet Med Assoc 186, 677-680

LAFFORT-DASSOT, C., D. N. CARLOTTI, D. PIN u. P. JASMIN (2004): Diagnosis of flea allergy dermatitis: comparison of intradermal testing with flea allergens and a FcepsilonRI alpha-based IgE assay in response to flea control. Vet Dermatol 15, 321-330

LANGNER, K. F., K. E. DARPEL, B. S. DROLET, A. FISCHER, S. HAMPEL, J. E. HESELHAUS, P. S. MELLOR, P. P. MERTENS u. W. LEIBOLD (2007): Comparison of cellular and humoral immunoassays for the assessment of summer eczema in horses. Vet Immunol Immunopathol 122, 126-137

LEE, S. E., I. P. JOHNSTONE, R. P. LEE u. J. P. OPDEBEECK (1999): Putative salivary allergens of the cat flea, Ctenocephalides felis felis. Vet Immunol Immunopathol 69, 229-237

LEMKE, L. A., P. G. KOEHLER u. R. S. PATTERSON (1989): Susceptibility of the cat flea (Siphonaptera: Pulicidae) to pyrethroids. J Econ Entomol 82, 839-841


___________________________________________________________________________

171

LIAN, T. M. u. R. E. HALLIWELL (1998): Allergen-specific IgE and IgGd antibodies in atopic and normal dogs. Vet Immunol Immunopathol 66, 203-223

LINDBLAD, J. H. u. R. S. FARR (1961): The incidence of positive intradermal reactions and the demonstration of skin sensitizing antibody to extracts of ragweed and dust in humans without history of rhinitis or asthma. J Allergy 32, 392-401

LORCH, G., A. HILLIER, K. W. KWOCHKA, W. J. SAVILLE, C. W. KOHN u. B. E. LEROY (2001): Comparison of immediate intradermal test reactivity with serum IgE quantitation by use of a radioallergosorbent test and two ELISA in horses with and without atopy. J Am Vet Med Assoc 218, 1314-1322

MASON, K. V. u. A. G. EVANS (1991): Mosquito bite-caused eosinophilic dermatitis in cats. J Am Vet Med Assoc 198, 2086-2088

MCDERMOTT, M. J., E. WEBER, S. HUNTER, K. E. STEDMAN, E. BEST, G. R. FRANK, R. WANG, J. ESCUDERO, J. KUNER u. C. MCCALL (2000): Identification, cloning, and characterization of a major cat flea salivary allergen (Cte f 1). Mol Immunol 37, 361-375

MCTIER, T. L., D. J. SHANKS, A. D. JERNIGAN, T. G. ROWAN, R. L. JONES, M. G. MURPHY, C. WANG, D. G. SMITH, M. S. HOLBERT u. B. L. BLAGBURN (2000): Evaluation of the effects of selamectin against adult and immature stages of fleas (Ctenocephalides felis felis) on dogs and cats. Vet Parasitol 91, 201-212

MEDLEAU, L., K. A. HNILICA, K. LOWER, R. ALVA, T. CLEKIS, J. CASE, T. R. MCARTHUR, R. A. BARRICK, P. JEANNIN u. J. IRWIN (2002): Effect of topical application of fipronil in cats with flea allergic dermatitis. J Am Vet Med Assoc 221, 254-257


___________________________________________________________________________

172

MEHLHORN, H., O. HANSEN u. N. MENCKE (2001): Comparative study on the effects of three insecticides (fipronil, imidacloprid, selamectin) on developmental stages of the cat flea (Ctenocephalides felis Bouche 1835): a light and electron microscopic analysis of in vivo and in vitro experiments. Parasitol Res 87, 198-207

MEHLHORN, H., N. MENCKE u. O. HANSEN (1999): Effects of imidacloprid on adult and larval stages of the flea Ctenocephalides felis after in vivo and in vitro application: a light- and electron-microscopy study. Parasitol Res 85, 625-637

MEYER, J. A., D. DISCH, L. R. CRUTHERS, R. L. SLONE u. R. G. ENDRIS (2003): Repellency and efficacy of a 65% permethrin spot-on formulation for dogs against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquitoes. Vet Ther 4, 135-144

MICHAELI, D., E. BENJAMINI, R. C. MINER u. B. F. FEINGOLD (1966): In vitro studies on the role of collagen in the induction of hypersensitivity to flea bites. J Immunol 97, 402-406

MIN, B., M. PROUT, J. HU-LI, J. ZHU, D. JANKOVIC, E. S. MORGAN, J. F. URBAN, JR., A. M. DVORAK, F. D. FINKELMAN, G. LEGROS u. W. E. PAUL (2004): Basophils produce IL-4 and accumulate in tissues after infection with a Th2-inducing parasite. J Exp Med 200, 507-517

MORIELLO, K. A. u. S. W. EICKER (1991): Influence of sedative and anesthetic agents on intradermal skin test reactions in dogs. Am J Vet Res 52, 1484-1488

MORIELLO, K. A. u. M. A. MCMURDY (1989): The Prevalence of Positive Intradermal Skin Test Reactions to Flea Extract in Clinically Normal Cats. Comp Anim Pract 19, 28-30


___________________________________________________________________________

173

NADLER, A. (2001) Untersuchungen zur Charakterisierung der allergischen Komponenten des Katzenflohs Ctenocephalides felis felis. Berlin, Fachbereich Veterinärmedizin, Diss.

NARAHASHI, T. (1996): Neuronal ion channels as the target sites of insecticides. Pharmacol Toxicol 79, 1-14

NOLI, C. (2006): Feline Allergic Skin Disease: Pathogenesis and Differential Diagnosis. In: 2. Nordrhein-Westfälischer Tierärztetag, 1.09.-2.09.2006, Essen,

NORMAN, P. S., L. M. LICHTENSTEIN u. K. ISHIZAKA (1973): Diagnostic tests in ragweed hay fever. A comparison of direct skin tests, IgE antibody measurements, and basophil histamine release. J Allergy Clin Immunol 52, 210-224

NOVOTNY, M. J., M. J. KRAUTMANN, J. C. EHRHART, C. S. GODIN, E. I. EVANS, J. W. MCCALL, F. SUN, T. G. ROWAN u. A. D. JERNIGAN (2000): Safety of selamectin in dogs. Vet Parasitol 91, 377-391

OH, K., T. SHEN, G. LE GROS u. B. MIN (2007): Induction of Th2 type immunity in a mouse system reveals a novel immunoregulatory role of basophils. Blood 109, 2921-2927

PALMA, K. G., S. M. MEOLA u. R. W. MEOLA (1993): Mode of action of pyriproxyfen and methoprene on eggs of Ctenocephalides felis (Siphonaptera: Pulicidae). J Med Entomol 30, 421-426

PATERSON, S. (2000): Skin diseases of the cat. Blackwell, Berlin


___________________________________________________________________________

174

PAYNE, P. A., M. W. DRYDEN, V. SMITH u. R. K. RIDLEY (2001): Effect of 0.29% w/w fipronil spray on adult flea mortality and egg production of three different cat flea, Ctenocephalides felis (Bouche), strains infesting cats. Vet Parasitol 102, 331-340

PLATTS-MILLS, T., J. VAUGHAN, S. SQUILLACE, J. WOODFOLK u. R. SPORIK (2001): Sensitisation, asthma, and a modified Th2 response in children exposed to cat allergen: a population-based cross-sectional study. Lancet 357, 752-756

POWELL, M. B., S. H. WEISBROTH, L. ROTH u. C. WILHELMSEN (1980): Reaginic hypersensitivity in Otodectes cynotis infestation of cats and mode of mite feeding. Am J Vet Res 41, 877-882

PRÉLAUD, P. u. S. GILBERT (2000): Atopic dermatitis. In: A Practical Guide to Feline Dermatology Merial, S. 10.01-10.08

PRUSSIN, C. u. D. D. METCALFE (2006): 5. IgE, mast cells, basophils, and eosinophils. J Allergy Clin Immunol 117, S450-456

REEDY, L. M., W. H. MILLER u. T. WILLEMSE (1997): Allergic Skin Diseases Of Dogs And Cats. 2. Aufl., Saunders, Philadelphia

RIMMER, J. u. D. H. BRYANT (1986): Effect of hypo- and hyper-osmolarity on basophil histamine release. Clin Allergy 16, 221-230


___________________________________________________________________________

175

RINALDI, L., G. SPERA, V. MUSELLA, S. CARBONE, V. VENEZIANO, A. IORI u. G. CRINGOLI (2007): A survey of fleas on dogs in southern Italy. Vet Parasitol 148, 375-378

RODEWALD, H. R., M. DESSING, A. M. DVORAK u. S. J. GALLI (1996): Identification of a committed precursor of the mast cell lineage. Science 271, 818-822

RUST, M. K. (2005): Advances in the control of Ctenocephalides felis (cat flea) on cats and dogs. Trends Parasitol 21, 232-236

RUST, M. K., M. M. WAGGONER, N. C. HINKLE, D. STANSFIELD u. S. BARNETT (2003): Efficacy and longevity of nitenpyram against adult cat fleas (Siphonaptera: Pulicidae). J Med Entomol 40, 678-681

SACHS, L. (2004): Angewandte Statistik. 11. Auflage, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York

SAINI, S. S. u. D. MACGLASHAN (2002): How IgE upregulates the allergic response. Curr Opin Immunol 14, 694-697

SALGADO, V. L. u. J. H. HAYASHI (2007): Metaflumizone is a novel sodium channel blocker insecticide. Vet Parasitol 150, 182-189

SAMUELSSON, A., T. L. TOWERS u. J. V. RAVETCH (2001): Anti-inflammatory Activity of IVIG Mediated Through the Inhibitory Fc Receptor. Science 291, 484-486


___________________________________________________________________________

176

SARASOLA, P., A. D. JERNIGAN, D. K. WALKER, J. CASTLEDINE, D. G. SMITH u. T. G. ROWAN (2002): Pharmacokinetics of selamectin following intravenous, oral and topical administration in cats and dogs. J Vet Pharmacol Ther 25, 265-272

SCHRAM-BIJKERK, D., G. DOEKES, M. BOEVE, J. DOUWES, J. RIEDLER, E. UBLAGGER, E. VON MUTIUS, J. BUDDE, G. PERSHAGEN, M. VAN HAGE, M. WICKMAN, C. BRAUN-FAHRLANDER, M. WASER u. B. BRUNEKREEF (2006): Nonlinear relations between house dust mite allergen levels and mite sensitization in farm and nonfarm children. Allergy 61, 640-647

SCHUELE, G., S. BARNETT, B. BAPST, T. CAVALIERO, L. LUEMPERT, G. STREHLAU, D. R. YOUNG, C. MORAN u. P. JUNQUERA (2008): The effect of water and shampooing on the efficacy of a pyriprole 12.5% topical solution against brown dog tick (Rhipicephalus sanguineus) and cat flea (Ctenocephalides felis) infestations on dogs. Vet Parasitol 151, 300-311

SILVERMAN, J., M. K. RUST u. D. A. REIERSON (1981): Influence of temperature and humidity on survival and development of the cat flea, Ctenocephalides felis (Siphonaptera: Pulicidae). J Med Entomol 18, 78-83

SMITH, R. D., A. J. PAUL, U. D. KITRON, J. R. PHILIP, S. BARNETT, M. J. PIEL, R. W. NESS u. M. EVILSIZER (1996): Impact of an orally administered insect growth regulator (lufenuron) on flea infestations of dogs in a controlled simulated home environment. Am J Vet Res 57, 502-504

STANNECK, D., K. S. LARSEN u. N. MENCKE (2003): Pyriproxyfen concentration in the coat of cats and dogs after topical treatment with a 1.0% w/v spot-on formulation. J Vet Pharmacol Ther 26, 233-235


___________________________________________________________________________

177

STOLPER, R. u. J. P. OPDEBEECK (1994): Flea allergy dermatitis in dogs diagnosed by intradermal skin tests. Res.Vet.Sci 57, 21-27

STRAIT, R. T., S. C. MORRIS u. F. D. FINKELMAN (2006): IgG-blocking antibodies inhibit IgE-mediated anaphylaxis in vivo through both antigen interception and Fc gamma RIIb cross-linking. J Clin Invest 116, 833-841

STUKE, K. (2005) Entwicklung eines funktionellen in vitro Test (FIT) zur Prüfung der Sensibilisierung feliner basophiler Granulozyten von Katzen mit kontrollierter Flohexposition. Hannover, Tierärztliche Hochschule Hannover, Diss.

STUKE, K., G. VON SAMSON-HIMMELSTJERNA, N. MENCKE, O. HANSEN, T. SCHNIEDER u. W. LEIBOLD (2003): Flea allergy dermatitis in the cat: establishment of a functional in vitro test. Parasitol Res 90 Suppl 3, S129-S131

SUTTON, N. M., N. BATES u. A. CAMPBELL (2007): Clinical effects and outcome of feline permethrin spot-on poisonings reported to the Veterinary Poisons Information Service (VPIS), London. J Feline Med Surg 9, 335-339

SUZUKI, Y., T. YOSHIMARU, T. INOUE, O. NIIDE u. C. RA (2005): Role of oxidants in mast cell activation. Chem Immunol Allergy 87, 32-42

SZABO, M. P., J. MORELLI, JR. u. G. H. BECHARA (1995): Cutaneous hypersensitivity induced in dogs and guinea-pigs by extracts of the tick Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae). Exp Appl Acarol 19, 723-730


___________________________________________________________________________

178

TAKAGI, K., H. HAMAGUCHI, T. NISHIMATSU u. T. KONNO (2007): Discovery of metaflumizone, a novel semicarbazone insecticide. Vet Parasitol 150, 177-181

TEDESCHI, A., M. ARQUATI, M. PALELLA, N. MILAZZO u. A. MIADONNA (1994): Ionic regulation of human basophil releasability. II. Non-releasing basophils are converted into releasing basophils in a low-Na+ medium. Clin Exp Allergy 24, 66-72

TIZARD, I. R. (2004): Veterinary Immunology: An Introduction. 4. Aufl., Saunders, Philadelphia

UNGEMACH, F. R. (2002a): Antiparasitika. In: Pharmakotherapie bei Haus- und Nutztieren 5. Aufl., Parey, Berlin, S. 245-289

UNGEMACH, F. R. (2002b): Pharmaka zur Beeinflussung von Entzündungen. In: Pharmakotherapie bei Haus- und Nutztieren 5. Aufl., Parey, Berlin, S. 320-354

VALENTINE, W. M. (1990): Toxicology of selected pesticides, drugs, and chemicals. Pyrethrin and pyrethroid insecticides. Vet Clin North Am Small Anim Pract 20, 375-382

VISSER, M., S. REHBEIN u. C. WIEDEMANN (2001): Species of flea (siphonaptera) infesting pets and hedgehogs in Germany. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 48, 197-202


___________________________________________________________________________

179

VROOM, M. W. (2000): Flea allergy dermatitis. In: A Practical Guide to Feline Dermatology Merial, S. 9.01-09.06

WILLIS, E. L., G. A. KUNKLE, R. E. ESCH, T. J. GRIER u. P. S. KUBILIS (1996): Intradermal reactivity to various insect and arachnid allergens among dogs from the southeastern United States. J Am Vet Med Assoc 209, 1431-1434

XIANG, Z., C. MOLLER u. G. NILSSON (2006): IgE-receptor activation induces survival and Bfl-1 expression in human mast cells but not basophils. Allergy 61, 1040-1046

YOSHIMARU, T., Y. SUZUKI, T. MATSUI, K. YAMASHITA, T. OCHIAI, M. YAMAKI u. K. SHIMIZU (2002): Blockade of superoxide generation prevents high-affinity immunoglobulin E receptor-mediated release of allergic mediators by rat mast cell line and human basophils. Clin Exp Allergy 32, 612-618

YOUNG, J. D., E. BENJAMINI, B. F. FEINGOLD u. H. NOLLER (1963): Allergy to Flea Bites. V. Preliminary Results of Fractionation, Characterization, and Assay for Allergenic Activity of Material Derived from the Oral Secretion of the Cat Flea, Ctenocephalides felis felis. Exp Parasitol 13, 155-166

YOUSSEF, L. A., M. SCHUYLER, L. GILMARTIN, G. PICKETT, J. D. BARD, C. A. TARLETON, T. ARCHIBEQUE, C. QUALLS, B. S. WILSON u. J. M. OLIVER (2007): Histamine release from the basophils of control and asthmatic subjects and a comparison of gene expression between "releaser" and "nonreleaser" basophils. J Immunol 178, 4584-4594


___________________________________________________________________________

180

YU, P., M. KOSCO-VILBOIS, M. RICHARDS, G. KOHLER u. M. C. LAMERS (1994): Negative feedback regulation of IgE synthesis by murine CD23. Nature 369, 753-756

ZERBA, E. (1988): Insecticidal activity of pyrethroids on insects of medical importance. Parasitol Today 4, S3-7

ZHAO, X., J. Z. YEH, V. L. SALGADO u. T. NARAHASHI (2005): Sulfone metabolite of fipronil blocks gamma-aminobutyric acid- and glutamate-activated chloride channels in mammalian and insect neurons. J Pharmacol Exp Ther 314, 363-373

Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. vet. G. von Samson-Himmelstjerna möchte ich danken für die

Überlassung des interessanten Themas und die wissenschaftliche Betreuung sowie die

Bereitstellung des Arbeitsplatzes und der für die Durchführung der Studie benötigten

Materialien.

Herrn Prof. Dr. med. vet. Dr. h.c. W. Leibold gilt mein besonderer Dank für die

wissenschaftliche Betreuung und ausführliche Beratung bei der Auswertung des

umfangreichen Datenmaterials sowie die freundliche Bereitstellung eines Arbeitsplatzes in

der Arbeitsgruppe Immunologie.

Herrn Dr. med. vet. N. Mencke (Bayer Animal Health) danke ich für die finanzielle

Unterstützung.

Herrn Udo Rabe, Frau Silke Schöneberg und Frau Sonja Kordex danke ich sehr für die

Hilfestellungen im Laboralltag und die nette Zusammenarbeit in angenehmer Atmosphäre.

Den Tierpflegern am Institut für Parasitologie danke ich für die gute Zusammenarbeit und

Rücksicht auf die besonderen Anforderungen während der Durchführung der

Verlaufsuntersuchung.

Außerdem danke ich allen Doktoranden und Mitarbeitern, die mich bei der praktischen

Durchführung der Arbeit, insbesondere der Blutentnahmen, tatkräftig unterstützt haben, ganz

besonders denen, die immer ein offenes Ohr und ein aufmunterndes Wort hatten.

Meiner Mutter danke ich von Herzen für unendlichen Rückhalt, Verständnis und

Unterstützung, die Grundpfeiler, auf denen diese Arbeit steht und die mich dahin haben

kommen lassen, wo ich heute bin.

Tomoyo, die immer für mich da war und ohne die diese Arbeit so nicht denkbar gewesen

wäre - ich danke dir.

Documents

Vergleich der Sensibilisierungskinetik von Effektorzellen ... · PDF fileZiege-anti-Acylhistamin von Ziegen stammende Antikörper mit Spezifität gegen Acylhistamin . ... Ctenocephalides