VARIABILNOST NUKLEOTIDNIH ZAPOREDIJ DELA …v tektonskih procesih, v katerih so endogene sile, ki imajo svoj izvor v zemeljski notranjosti, odločale o zgradbi zemlje. Te enote predstavljajo

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ZOOTEHNIKO

Enver MELKIČ

VARIABILNOST NUKLEOTIDNIH ZAPOREDIJ

DELA KONTROLNE REGIJE MITOHONDRIJSKE DNA PRI

POSTRVEH Salmo trutta

DIPLOMSKA NALOGA

DNA SEQUENCE VARIABILITY OF THE MITOCHONDRIAL

CONTROL REGION IN BROWN TROUT Salmo trutta

GRADUATION THESIS

Domžale, 2000

Melkić. E. Variabilnost nukleotidnih zaporedij …regije mitohondrijske DNA pri postrveh Salmo trutta. Dipl. nal. Domžale , BF. Odd. za zootehniko, 2000

II

Diplomska naloga je zaključek univerzitetnega študija zootehnike. Opravljeno je bilo na

Katedri za genetiko Inštituta za živinorejo Oddelka za zootehniko Biotehniške fakultete

Univerze v Ljubljani. Vzorci krvi so bili odvzeti na terenu, lokacije so navedene v pregledu

literature.

Študijska komisija Oddelka za zootehniko je za mentorja diplomske naloge imenovala

prof. dr. Petra Dovča in za somentorja asist. dr. Aleša Snoja.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: prof. dr. Andrej OREŠNIK

Univerza v Ljubljani, biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko

Član: prof. dr. Jure POHAR


Član: prof. dr. Peter DOVČ


Član: asist. dr. Aleš SNOJ


Datum zagovora: 14. 07. 2000

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Enver Melkič


III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK UDK 577:575:597.5(043.2)=863

KG molekularna biologija / molekularna genetika / ribe / Salmo marmoratus / soška

postrv / Salmo trutta / potočna postrv / polimorfizem DNK / mitohondrijska DNK /

genetski markerji

KK AGRIS L05/8130

AV MELKIČ, Enver

SA DOVČ, Peter ment. /SNOJ, Aleš soment.

KZ 1230 Domžale, SLO, Groblje 3

ZA Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za zootehniko

LI 2000

IN VARIABILNOST NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA DELA KONTROLNE

REGIJE MITOHONDRIJSKE DNA PRI POSTRVEH Salmo trutta.

TD diplomska naloga

OP IX, 69 s., 11 tab., 24 sl., 1 pril.

IJ SL

JI sl / en

AI Preučevali smo variabilnost nukleotidnega zaporedja dela kontrolne regije mitohondrijske DNA (mtDNA) pri populacijah potočne postrvi (Salmo trutta f. fario) atlantskega in donavskega tipa ter pri soški postrvi (Salmo marmoratus). Mitohondrijsko DNA smo izolirali iz krvi ter željene fragmente dela kontrolne regije mtDNA pomnožili z verižno reakcijo s polimerazo. Variabilnost nukleotidnega zaporedja dela kontrolne regije mtDNA smo ugotavljali z restrikcijsko analizo, elektroforezo enojnih verig na poliakril amidnem gelu (PCR-SSCP) in s sekvenciranjem. Na DNA fragmentu prvega dela kontrolne regije mtDNA (426 bp) smo našli nukleotidne variante, na osnovi katerih smo lahko zanesljivo ločili atlantski tip potočne postrvi (haplotip C) od donavskega (haplotipa A in B) in od soškega tipa postrvi (haplotip D). Znotraj donavskega tipa potočne postrvi smo odkrili dve novi genetski varianti, ki označujeta haplotipa BA in BKr, ki pripadata donavskemu tipu potočnih postrvi in sta značilni za slovenske reke donavskega porečja. Na osnovi genetskih razlik smo ovrednotili filogenetske odnose med navedenimi tipi postrvi.


IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

ND Dn

DC UDC 577:575:597.5(043.2)=863

CX molecular biology / molecular genetics / fish / Salmo marmoratus / marble trout /

Salmo trutta / brown trout / DNA polymorphism / mitochondrial DNA / genetic

markers

CC AGRIS L05/8130

AU MELKIČ, Enver

AA DOVČ, Peter supervisor / SNOJ, Aleš co-adviser.

PP 1230 Domžale, SLO, Groblje 3

PB Univ. of Ljubljana, Biotechnical Fac., Zootechnical Dep.

TI DNA SEQUENCE VARIABILITY OF THE MITOCHONDRIAL CONTROL

REGION IN BROWN TROUT Salmo trutta.

DT graduation thesis

NO IX, 69 p., 11 tab., 24 fig., 1 app.

LA SL

AL sl / en

AB

A part of control region of mitochondrial DNA was analysed in different populations of Salmo trutta in Slovenia. Mitochondrial DNA was isolated from the blood. Using polymerase chain reaction the fragment was amplified and screened for nucleotide polymorphism using DNA sequencing, restriction analysis and single stranded DNA conformation polymorphism analysis. Based on differences found along the 426 bp long fragment analysed, seven haplotypes (B, A, BKr, BA, C, E and D) were recognised, allowing a differentiation between the Danubian, Atlantic, Adriatic and marmoratus type of brown trout. Two haplotypes (BKr and BA), belonging to the Danubian group, was newly discovered. According to the mtDNA analysis the taxonomic status of sea-trout, inhabiting the north Adriatic Sea, was clarified and determined as S. trutta. Additionally, phylogenetic relation-ship between geographically remote populations of brown trout in Slovenia was assessed, revealing their polyphyletic origin, dated in early Pleistocene.


V

KAZALO VSEBINE

str.

Ključna dokumentacijska informacija (KDI) z izvlečkom III

Key words documentation (KWD) including abstract IV

Kazalo tabel VI

Kazalo slik VI

Kazalo prilog VII

Okrajšave IX

1 UVOD 1

2 PREGLED LITERATURE 3

2.1 SPLOŠNO O SALMONIDIH 3

2.2 MITOHONDRIJSKA DNA (mtDNA) 8

2.2.1 Lastnosti mtDNA 9

2.2.2 MtDNA kot genetski marker 11

3 MATERIAL IN METODE 12

3.1 VZORCI 12

3.2 Izolacija mtDNA iz krvnega sedimenta 17

3.3 Polimerazna verižna reakcija 18

3.4 SEKVENCIRANJE mtDNA 20

3.4.1 Izolacija DNA iz agaroznega gela (preparativna elektroforeza) 21

3.4.2 Sekvenčna reakcija 22

3.4.3 Priprava DNA fragmenta za sekvenciranje 22

3.5 RESTRIKCIJSKA ANALIZA NAMNOŽENIH FRAGMENTOV mtDNA 23

3.5.1 Izvedba restrikcijske reakcije 23

3.6 Konformacijski polimorfizem enoverižnih DNA fragmentov-PCR-SSCP 24


VI

s.

3.7.1 Priprava poliakril amidnega (PAA) gela 25

3.7.2 Elektroforeza enoverižnih fragmentov DNA na PAA gelu 25

3.7.3 Vizualizacija SSCP vzorcev 26

3.7 Haplotipsko specifični oligonukleotidi- HSO-PCR 26

3.8 Agarozna gelska elektroforeza 27

4 REZULTATI 29

4.1 ANALIZA MITOHONDRIJSKE DNA 29

4.1.1 Izolacija mtDNA 29

4.1.2 Polimerazna verižna reakcija 30

4.1.3 Sekvenciranje mtDNA 31

4.1.3.1 Analiza sekvenc 32

4.1.4 Restrikcijska analiza 34

4.1.5 Analiza fragmentov s PCR-SSCP metodo 36

4.1.6 Haplotipsko specifični oligonukleotidi; HSO-PCR analiza 38

4.1.7 Molekularna ura 41

5 DISKUSIJA 43

6 POVZETEK 54

7 ZAHVALA 56

8 PRILOGE 57

9 REFERENCE 65


VII

KAZALO TABEL

s.

Tabela 1: Taksonomska razvrstitev postrvi in njenih bližnjih sorodnikov 4

Tabela 2: Haplotipi postrvi, ki so bili do sedaj objavljeni 6

Tabela 3: Lokacije vzorčenja 16

Tabela 4: Nukleotidno zaporedje uporabljenih začetnih oligonukleotidov 21

Tabela 5: Restrikcijski encimi, ki smo jih uporabljali pri svojih analizah 24

Tabela 6: Polimorfna mesta in različni haplotipi 34

Tabela 7: Diagnostični restrikcijski encimi za določanje posameznih haplotipov 35

Tabela 8: Haplotipi in nukleotidne varianti pri PCR-SSCP 37

Tabela 9: Matrika primarnih sekvenčnih divergenc izraženih v odstotkih 40

Tabela 10: Metode dela ter haplotipi, ki smo jih z njimi dokazali 40

Tabela 11: Variabilnost haplotipov pri različnih tipih postrvi 41

KAZALO SLIK

Slika 1: Elektronska mikrografija mitohondrijske DNA in kontrolne regije 9

Slika 2: Razporeditev genov na mtDNA genomu pri atlantskem lososu 10

Slika 3: Soška postrv iz Zadlaščice 13

Slika 4: Soška postrv iz Trebuščice 13

Slika 5: Potočna postrv 14

Slika 6: Atlantski tip potočne postrvi iz ribogojnice Povodje 14

Slika 7: Morska postrv 15

Slika 8: Lokacije rek in potokov v Sloveniji 15

Slika 9: Shematski prikaz poteka polimerazne verižne reakcije 20

Slika 10: Izolirana mitohondrijska DNA na agaroznem gelu 29

Slika 11 PCR produkt na agaroznem gelu 30

Slika 12 V pogled v sekvenco prvega dela kontrolne regije mtDNA 31


VIII

s.

Slika 13: Natančna sekvenca nukleotidnega zaporedja kontrolne regije z

variabilnimi mesti

31

Slika 14: Restrikcijska analiza z encimi SmaI, AvaI, AluI 35

Slika 15: Sekvenca dela kontrolne regije pri PCR-SSCP metodi 36

Slika 16: DNA fragmenti z različno mobilnostjo na PAA gelu pri SSCP analizi 37

Slika 17: Sekvenca DNA fragmenta z restrikcijskim mestom pri HSO-PCR metodi 38

Slika 18: Restrikcijska analiza z encimom DraI 39

Slika 19: Evolucijsko drevo različnih haplotipov postrvi in drugih predstavnikov

rodu Salmo

42

Slika 20: Paleogeografska karta Evrope za srednji miocen 48

Slika 21: Alpsko-dinarsko kopno in Jadransko ter Panonsko morje v starejšem

pilocenu

49

Slika 22: Jadransko morje v dobi pleistocenske poledenitve 50

Slika 23: Topografska karta meje večnega ledu v dobi tretjega würma (WIII) 51

Slika 24: Gibanje povprečnih letnih temperatur v dobi pleistocena 53

KAZALO PRILOG

Priloga 4.1.4 A: Skupno število vzorcev po populacijah ter pripadajoči haplotipi 57


IX

OKRAJŠAVE

A adenin

ABI Perkin Elmer Applied Biosystems

bp bazni par

C citozin

C/I mešanica kloroforma in izoaminalkohola

DNA desoksiriribonukleinska kislina

EDTA etilen diamin tetraacetat

G gvanin

kb kilobazni pari

mtDNA mitohondrijska DNA

PAA polyacril amid

P/C/I raztopina fenola, kloroforma in izoamil alkohola

PCR polimerazna verižna reakcija (polymerase chain reaction)

pH negativni logaritem koncentracije vodikovih ionov

RFLP restriction fragment lenght polymorphism

RNA ribonukleinska kislina

SDS sodium dodecil sulphate

SSCP Konformacijski polimorfizem enojnih verig (single strand conformation

polymorphism)

STE salt Tris-EDTA buffer

T timin

TBE Tris-borat-EDTA-kalijev pufer

TE Tris-EDTA pufer

TEMED N,N,N’,N’-tetrametil etilen diamin

Tris tris(hidroksimetil)aminometan (=2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-ropandiol

tRNA transfer RNA

Melkič, E. Variabilnost nukleotidnih zaporedij…kontrolne regije mitohondrijske DNA pri Salmo trutta. Dipl. nal., Domžale, BF, Odd. za zootehniko, 2000

1

1 UVOD

Slovenija leži v predelu Evrope, kjer je sestava zemeljske skorje zelo pestra. Tu so se tja do

najnovejših obdobij zemeljske zgodovine dogajale pogoste tektonske spremembe,

menjavalo se je tudi razmerje med kopnim in morjem. Vrh tega se na Slovenskem stikajo

štiri velike geografske enote, štirje veliki kosi zemeljske skorje, ki so se različno oblikovali

v tektonskih procesih, v katerih so endogene sile, ki imajo svoj izvor v zemeljski

notranjosti, odločale o zgradbi zemlje. Te enote predstavljajo Alpsko in Dinarsko gorovje,

Jadransko morje ter Panonska nižina. Površje slovenskega ozemlja so pomembno

oblikovale in nenehno spreminjale reke in potoki, ki so pripadali dvema velikima

porečjema; Donavskemu in Jadranskemu. Prav ta raznolikost površja na tako majhnem

ozemlju je zanimiva za preučevanje živalskih vrst, ki so življenjsko vezane na vodne

habitate. Sem prav gotovo sodijo vrste iz družine Salmonidov, ki so na tem območju našli

zase izredno ugodne življenjske pogoje. Geotektonska dogajanja pa so vplivala na to, da

danes na področju Slovenije živi veliko lokalno specifičnih populacij postrvi.

Predvidevamo, da zaradi dolgotrajnega ločenega razvoja vsaj nekatere izmed njih

predstavljajo sorazmerno samostojne evolucijske veje. Stalež postrvi se v Sloveniji

zmanjšuje predvsem zaradi športnega ribolova, kot tudi zaradi splošne degradacije okolja,

zaradi česar se stalno povečujejo potrebe po dodatnem vlaganju. Zaradi zahtevnosti vzreje

postrvi, uporabljajo za vlaganje predvsem komercialne linije, ki so prilagojene vzreji v

ribogojnicah in hitro priraščajo, zaradi česar so tudi z ekonomskega stališča zanimivejše.

Te linije so večinoma neavtohtonega izvora. Vnesene populacije se z avtohtonimi križajo, s

čimer ogrožajo njihovo genetsko identiteto in rušijo genetsko ravnotežje v izhodiščni

populaciji. Poleg tega vnesene populacije tekmujejo z avtohtonimi glede hrane in

življenjskega prostora in jih izpodrivajo iz njihovih naravnih habitatov. Postrvi so izredno

podvržene fenoplastičnosti in zaenkrat ni enotnega mnenja, kateri naj bi bili tisti fenotipski

znaki, s katerimi bi lahko ločevali vnesene od avtohtonih populacij. Zato je za ohranitev

naših avtohtonih populacij potrebno izdelati sistem, s katerim bo mogoče objektivno

oceniti razlike med tujimi vnesenimi in avtohtonimi populacijami kot tudi med

avtohtonimi populacijami, ki izvirajo iz različnih porečij. Predvidevamo, da na območjih,

kjer ni bilo vlaganja in kjer je bila zaradi naravnih barier migracija rib proti toku


2

onemogočena, še živijo čiste avtohtone populacije postrvi. Te bi lahko predstavljale

primeren vir za vlaganje ali za repopulacijo območij, kjer avtohtonih postrvi ne najdemo

več.

Znotraj kontrolne regije mitohondrijske DNA smo iskali polimorfna mesta, tipična za

posamezne tipe postrvi. Namen naloge je bil tudi poiskati različne metode s katerimi bi

lahko zanesljivo med seboj ločili znane haplotipe postrvi, ki se pojavljajo v Sloveniji.

V prvi vrsti smo želeli ugotoviti, ali morda obstajajo genetske razlike med tujimi

neavtohtonimi in domačimi avtohtonimi populacijami, kakor tudi razlike znotraj že znanih

tipov postrvi, ki so avtohtone in naseljujejo zanje specifična porečja in pritoke v jugo-

zahodnem delu Slovenije, in ocenili njihovo razširjenost. Kot objekt za preučevanje

genetske variabilnosti smo uporabili kontrolno regijo mitohondrijske DNA, ki je zaradi

svoje hipervariabilnosti primeren genetski marker za molekulsko genetske kot populacijske

študije rodov in vseh nižjih taksonomskih enot. Prav tako je mitohondrijska DNA zaradi

načina dedovanja primerna za ugotavljanje filogenetskih odnosov med vrstami. Vzorci, ki

smo jih zbrali, so bili iz geografsko ločenih populacij. V raziskavi so bili vključeni vsi do

sedaj že znani tipi postrvi, ki so zastopani v naših vodah.


3

2 PREGLED LITERATURE

2.1 SPLOŠNO O SALMONIDIH

Družina postrvi (Salmonidae) zajema po nekaterih evropskih avtorjih le 5 rodov s 24

vrstami. Za vse predstavnike te družine je značilna tolsta plavut ali tolščenka, ki leži med

hrbtno in repno plavutjo. Med predstavniki te družine so zastopani v naših vodah rodovi

Salmo, Hucho, Onchorhynchus in Salvelinus. Prva dva sta avtohtona, druga dva pa sta bila

zanesena v naše kraje ob koncu devetnajstega stoletja. Vse predstavnike te družine

uvrščamo med plenilce. Telo imajo podolgovato in vretenaste oblike, pokrito je z drobnimi

luskami. Imajo velik gobec in močne, koničaste in dobro razvite zobe, ki niso samo v

čeljustih, ampak tudi po jeziku, na nebnicah in na ralniku. Ker so plenilci, imajo krajši

prebavni trakt kot rastlinojede ribe. Vse vrste Salmonidov imajo pilorične izrastke po

predelu za želodcem, ki jih je od 2 do 200. Ti izrastki povečujejo resorbcijsko površino, po

številu le-teh pa lahko ločimo vrste med seboj. Odrasle samce lahko ločimo od samic po

tem, da imajo nekoliko daljšo in navzgor ukrivljeno spodnjo čeljust. Ribe te družine so

izredno spremenljive tako po videzu kot po načinu vedenja in razmnoževanja (Povž in

Sket, 1990). Razlike med vrstami povečuje še okolje, v katerem ribe živijo, saj le-to

pomembno vpliva na barvo telesa. Kljub temu ima vsaka vrsta zase značilne specifične

vzorce. Družina Salmonidae je avtohtona v vseh vodotokih severne zemeljske hemisfere

do povratnikov. V Sloveniji so najbolj pogosti predstavniki salmonidov postrvi (Salmo

trutta), ki naseljujejo zgornje vodotoke donavskega porečja. Postrvi naseljujejo habitate,

katerih temperatura vode običajno ne presega 15˚C in je bogata s kisikom. Ti habitati so

lahko reke, jezera ali morje. Obstaja več vrst postrvi, ki so se razvile glede na življenjski

prostor, kjer živijo: potočna postrv (Salmo trutta f. fario), jezerska postrv (Salmo trutta f.

lacustris) in morska postrv (Salmo trutta f. trutta). Vsi trije tipi postrvi se med seboj

uspešno križajo, njihovi potomci pa so plodni. Prav tako se vsi tipi potočnih postrvi

uspešno križajo s soško postrvjo(S. marmoratus) in dajejo plodne potomce. Takšna

medsebojna križanja med različnimi tipi potočnih postrvi in soško postrvjo še dodatno

povečujejo fenotipsko spremenljivost znotraj rodu Salmo.


4

Tabela 1: Taksonomska razvrstitev postrvi in njenih bližnjih sorodnikov po prevladujoči

klasifikaciji.

Razred: Osteichtyes (kostnice)

Red: Salmoniformes

Družina: Salmonidae (salmonidi)

● Rod: Salmo

○ Vrsta: S. salar (atlantski losos)

○ Vrsta: S. trutta (postrv)

▪ forma: trutta (morska postrv)

▪ forma: fario (potočna postrv)

▪ forma: lacustris (jezerska postrv)

▪ forma: letnica (ohridska postrv)

○.Vrsta: S. marmoratus (soška postrv)

● Rod: Hucho (sulci)

● Rod: Salmothymus (mehkouste postrvi)

● Rod: Oncorhynchus (pacifiški lososi)

● Rod: Salvelinus (zlatovčice)

● Rod: Coregonus (ozimice)

Družina: Thymallidae (lipani)

● Rod: Thymallus (lipani)

○.Vrsta: T. thymallus (donavski lipan)

○.Vrsta: T. arcticus (arktični lipan)


5

Postrvi so avtohtona salmonidna vrsta v porečjih Evrazije in severne Afrike. Naseljujejo

območja, ki se raztezajo od severne Norveške in severno-vzhodnega dela Rusije na severu

do pogorja Atlas v severni Afriki na jugu; od zahoda proti vzhodu pa od Islandije do

Aralskega morja (Behnke, 1996 ).

Salmo trutta je izjemno zanimiva vrsta rib; lahko se prilagodi življenju v sladki in prav

tako v slani vodi. Postrv se pojavlja v najrazličnejših geografsko pogojenih oblikah. Tudi

znotraj določenega geografsko ločenega območja prihaja med osebki do izrazitih

fenotipskih razlik in razhajanj glede na tip njihovega življenjskega vzorca. Ta se odraža v

eni od treh oblik (potočna, jezerska in anadromna), ki jih S. trutta razvije glede na danosti,

pogojene z njenim življenjskim okoljem (Bernatchez in sod., 1992). Na osnovi

elektroforetskih analiz aloencimskega polimorfizma in s preučevanjem kontrolne regije

(mtDNA) so opazili veliko genetsko raznolikost pri geografsko ločenih populacijah postrvi

( Krieg in Guyomard, 1985; Gracia Marin in sod., 1992; Giuffra in sod., 1996 ), ki so jih

glede na porečja, od koder izhajajo, v grobem lahko razvrstili v štiri osnovne tipe:

atlantski, donavski, sredozemski in tip marmoratus (porečje reke Pad). V splošnem kaže,

da je genetska raznolikost znotraj atlantskih populacij in populacij marmoratus relativno

majhna, medtem ko donavske in sredozemske populacije označuje večja genetska

intraspecifična variabilnost (Guyomard in Krieg, 1983; Krieg in Guyomard, 1983;

Bernatchez in sod., 1992; Apostolidis, 1996). Zanimivo je, da je vsem do sedaj

preučevanim ribogojniškim populacijam postrvi skupno atlantsko poreklo. Z vidika

ohranjanja biotske pestrosti je glavni problem kontinuiran vnos novih populacij postrvi v

nekatera naša porečja, za katera so značilne avtohtone populacije postrvi. Razvoj turizma

in s tem športnega ribolova zahteva čedalje večje poribljanje in s tem vnos tujih populacij

postrvi v naše vode. Posledice tega so neugodne za obstoj avtohtonih populacij postrvi, saj

se vnesene populacije lahko križajo z avtohtonimi; nimajo razvitega življenjskega vzorca

vedenja, ki bi jih vodil na mesta, kjer bi se drstile, ampak sledijo avtohtoni populaciji in se

tako često križajo z njimi, vsi njihovi potomci pa se lahko križajo z obema populacijama in

nadalje med seboj. Hkrati so te vnesene populacije pomembni konkurenti avtohtonim

populacijam, saj se prehranjujejo z enako vrsto hrane in naseljujejo isti življenjski prostor.

Takšen primer je vnos potočne postrvi po letu 1904 v reko Sočo, ki jo je do takrat


6

naseljevala le soška postrv. Ta problem se danes rešuje s “programom reintrodukcije”, ki

temelji na ribogojniški vzreji genetsko čistih plemenskih soških postrvi, katerih potomstvo

je namenjeno poribljanju soškega porečja (Povž in sod., 1996).

Tabela 2. Haplotipi, ki jih je leta 1992 opisal in objavil kanadski znanstvenik L.

Bernatchez. Oznake A, B, C, D in E so oznake haplotipov, povzete po Snoju (1997).

Haplotipi, ki jih je opisal Bernatchez (1992).

At. 1

At. 2

Atlantski tip postrvi pripada haplotipu C.

Da. 1

Da. 2

Donavski tip; Da1=B, Da2=A

Me. 1

Me. 2

Mediteranski tip; ni bil vključen v naši analizi.

Ad. 1

Ad. 2

Ad. 3

Jadranski tip; pripada haplotipu E. “Ohridska postrv”.

Ma. 1

Ma. 2

Ma. 3

Soški tip postrvi; pripada haplotipu D.

V dosedanjih raziskavah na področju mitohondrijske DNA so ugotovili, da je atlantski tip

potočne postrvi, ki ga prepoznamo po haplotipu C, značilen le za področje severne in

zahodne Evrope in je bil v naše vode vnesen iz nekaterih ribogojnic kot komrecialna linija

postrvi za povečanje števila rib v nekaterih rekah za potrebe športnega ribolova. Glede na

to, da se ta haplotip pojavlja tudi v rekah, kjer vlaganja ni bilo, obstaja možnost, da gre za

pleizomorfno lastnost, skupno atlantskemu in donavskemu tipu postrvi.

Fenotipsko je jadranskemu tipu postrvi zelo podobna jezerska postrv. V Sloveniji živi v

Bohinjskem in Blejskem jezeru, drsti pa se v njunih pritokih in iztokih. Jezerska postrv je

večja kot potočna, saj lahko zraste nad 1 m in tehta do 20 kg. “Čista” jezerska postrv, to je

tista, ki že dalj časa živi v jezeru brez vplivov križanja s potočno, nima rdečih peg po

telesu, ampak včasih le zabrisane bledo rjave (Miran Svetina, 1982 ).


7

Rečni del Slovenskega donavskega porečja v celoti naseljuje potočna postrv (Salmo trutta

f. fario), ki poleg omenjenega območja naseljuje tudi večino rek slovenskega Krasa.

Osnovna značilnost tega tipa so izrazito rdeče, svetlo obrobljene okrogle pege na bokih, ob

pobočnici in pod njo; rdeče toda nepravilne in ne obrobljene pege (ena ali več ) so opazne

tudi na tolščenki. Glava, hrbet in hrbtna plavut so posuti z manjšimi ali večjimi temnimi

pegami, ki se praviloma ujemajo z osnovno barvo hrbta. Tudi te pege so lahko svetlo

obrobljene. Osnovna barva hrbta je, odvisno od okolja, svetlo rjava do temno zelena; boki

so svetlejši, trebuh pa belkast, sivkast ali rumenkast. Mladice imajo ob bokih temnejše

pokončne lise, značilne za vse salmonide ( “mladostne pege” ).

Soška postrv (Salmo marmoratus), je endemit severno-jadranskega porečja, ki živi

predvsem v večjih vodah in zraste do 1 metra in teže do 20 kg. Ta riba se je kot prvinska

ohranila v gorskih tolmunih pritokov, drugod pa se je križala s potočno postrvjo, ki so jo

naselili leta 1904. Soška postrv ima veliko glavo in od tod izvira njeno drugo ime

glavatica. Po telesu je marmorirana (od tod latinsko ime; marmoratus) v dveh osnovnih

barvah: svetlejši, rumenkasti do sivkasti in temnejši, rjavi do olivni. Boki niso bistveno

svetlejši od hrbta, pač pa je trebuh belkast. Soška postrv ima dolgo, valjasto, bočno rahlo

stisnjeno telo z veliko glavo, ki zajema 22-25% celotne dolžine telesa. Na zgornji in

spodnji čeljusti ter na ralniku ima številne zobe. Spolno zreli samci imajo spodnjo čeljust

kavljasto zakrivljeno navzgor. Hrbtna plavut je temno pikasta, ostale so enobarvne,

sivkasto olivno zelene ali olivno rjave. Tolščenka je olivno rjavkasta in nemalokrat ima na

zgornjem robu veliko rdečo liso. Repna plavut je rahlo zarezana. Soška postrv naseljuje

vodotoke s poletno temperaturo do 15°C, pozimi pa je temperatura vode 2°-3°C. Večje ribe

se zadržujejo v globljih predelih, manjše pa v plitvejših.

O morski postrvi je malo znanega. Prvi je o njej poročal leta 1818 Chiereghini, ki jo je

odkril v beneških lagunah in jo poimenoval Salmo cenerinus. Leta 1879 pa je o njej

ponovno pisal Kolombatović in jo poimenoval Trutta adriatica. Fenotipsko je podobna

atlantskemu lososu, zaradi česar jo nekateri prepoznavajo kot atlantskega lososa oziroma

morski tip Šarenke.


8

Ohridska postrv pripada jezerskemu tipu postrvi in smo jo v naši raziskavi vključili za

razširitev drevesa filogenetskih odnosov med znanimi tipi postrvi.

2.2 MITOHONDRIJSKA DNA

Mitohondriji so edinstveni celični organeli, ki so zaradi vsebnosti lastnega genoma

(mitohondrijska DNA-mtDNA) sposobni avtonomnega podvojevanja DNA kakor tudi

prepisovanja in prevajanja genetske informacije v beljakovine (semiavtonomni organeli).

Dedovanje mitohondrijskega genoma pri sesalcih je nemendelsko, t.j. maternalno. Poteka

izključno od matere na potomce (Alberts, 1991). Mitohondriji so prisotni v vseh celicah

vretenčarjev, nimajo jih le eritrociti sesalcev. Ker so mitohondriji evolucijski potomci

nekdaj prosto živečih bakterij, ki so postali subcelularni organeli, imajo svoj lastni genom

in transkripsijsko “mašinerijo” za izražanje le-tega. V procesu integracije v celico so

izgubili mnoge svoje gene ali jih posredovali v jedrni genom. Preostanek nekdaj

obsežnejšega genoma predstavlja današnja mitohondrijska molekula DNA, katere geni so

zgoščeno razvrščeni drug ob drugem brez vmesnih intronov, razen pri kontrolni regiji, ki

predstavlja edino regulatorno sekvenco znotraj mtDNA. Ob oploditvi prispeva mtDNA v

citopazmo zigote le jajčna celica, zato je le dedovanje mtDNA striktno maternalno. Študije

mitohondrijske DNA različnih živalskih taksonov so pokazale variacije vzdolž sekvence

mitohondrijske DNA tako pri ureditvi kot pri velikosti genov (Harrison, 1989).


9

Slika 1: Elektronska mikrografja mtDNA. Označeno mesto predstavlja kontrolno regijo, ki

je tudi mesto začetka podvojevanja mtDNA (Alberts, 1994).

2.2.1 Lastnosti mitohondrijske DNA

Količina mtDNA znatno varira pri različnih tipih evkariontskih celic. Pri mnogih vrstah

živali je delež mtDNA okoli 0.1 do 1.0 % od volumna celice. Pri nekaterih evkariontskih

vrstah, kot so nekatere plesni, se ta delež lahko povzpne tudi do 15%. DNA, ki je

lokalizirana v mitohondrijih, se po nekaterih lastnostih razlikuje od jedrne DNA. Ena od

razlik je ta, da mtDNA ni asocirana s histoni, zaradi česar ni dodatno spiralizirana. Vsebuje

dva fizično ločena začetka podvojevanja. Pod elektronskim mikroskopom lahko vidimo, da

je živalska mitohondrijska DNA krožna molekula. Velikost mtDNA pri živalih varira od

14 Kb do čez 30 Kb (Harrison, 1989 ). Pri salmonidih so to velikost mtDNA ocenili na

16670 bp (Berg in Feris, 1984). Vsaka mtDNA molekula vsebuje kontrolno regijo s

sekvenco, ki pedstavlja mesto začetka replikacije in transkripcije. Mitohondrijska DNA je

izjemno kompaktna molekula, ki razen v kontrolni regiji ne vsebuje intronov, vsebuje pa

nekaj krajših medgenskih sekvenc in nekaj insercij in duplikacij (Harrison, 1989). Jajčna

celica v svoji veliki količini citoplazme skladišči mnogo mitohondrijev. Po oploditvi se, na

Kontrolna regija


10

še ne popolnoma pojasnjen način, sestavine citoplazme, ki jih v jajčno celico prinesejo

spermiji, razgradijo. Pri tem se razgradijo tudi mitohondriji iz spermijev, ki slučajno

zaidejo v citoplazmo. Tako je v razvijajočem se osebku mitohondrijska DNA, ki izvira od

očeta, izključena. Vse somatske celice, nastale iz oplojene jajčne celice, imajo glede na

izvor en sam tip mtDNA (Lodish, 1995 ). jedrni DNA. Večja frekvenca mutacij je delno

razložljiva s haploidnostjo genoma mtDNA. Funkcija mtDNA je sinteza beljakovin, ki so

potrebne za sestavo mitohondrijske respiratorne verige.

Slika 2: Razporeditev genov na mitohondrijskem genomu pri Atlantskem lososu (Salmo

salar). Prikazana so restrikcijska mesta za posamezne endonukleaze in dolžine fragmentov

mtDNA v bp.


11

2.2.2 Mitihondrijska DNA kot genetski marker

Mutacije v kontrolni regiji so večinoma točkovne in nastopajo kot substitucije, redkeje kot

delecije oziroma insercije. Te mutacije nastajajo kot posledica napačnega parjenja

nulkeotidov v procesu replikacije (angl. mismatch), ali kot posledica spontanih mutacij, ki

niso vezane na replikacijo in nastajajo v glavnem zaradi depurinizacije in/ali deaminacije

nukleotidov (Alberts in sod., 1994; Li in Grauer, 1991). Pomemben faktor za nastanek

mutacij je, visoka koncentracija mutagenih snovi (superoksidni radikali, O2¯ ), ki nastajajo

pri metaboličnih procesih mitohondrija (Li in Grauer, 1991), manjši selekcijski pritisk v

določenih regijah, pa skupaj s klonalno selekcijo, lahko hitro privede do fiksacije mutacij

(Cann in sod., 1984). Zaradi hitre evolucije nukleotidnih zaporedij v mtDNA je mogoče

preučevati evolucijo vrste tudi znotraj razmeroma kratkih časovnih intervalov.

Mitohondrijska DNA je kot genetski marker, primerna za študij majhnih populacij. Majhne

populacije so podvržene efektu ozkega grla in fiksaciji ene alelne variante, za katero lahko

rečemo, da je značilna za to populacijo. V velikih populacijah navadno obstaja več alelnih

variant in prav zaradi tega težko rečemo, da je ena izmed njih značilna za določeno

populacijo. Z novejšimi metodami molekulske hibridizacije so med sesalskimi mtDNA

odkrili razlike tudi v zaporedjih kodogenih regij, ki kodirajo dve rRNA mitohondrijskega

ribosoma, 22 tRNA molekul in 13 polipeptidov, ki skupaj z nuklearno kodiranimi proteini

tvorijo encimske komplekse mitohondrijske respiratorne verige. S primerjavo nukleotidnih

zaporedij na jedrni DNA sopokazali, da se mtDNA pri sesalcih spreminja 5-do-10 krat

hitreje kakor zaporedja jedrne DNA. Večji del teh sprememb gre na račun dejstva, da

mtDNA ni sposobna popravljalnih procesov (proof reading), kakor jih je jedrna DNA, pa

tudi frekvenca mutacij je v mtDNA večja, kakor v jedrni DNA. Večja frekvenca mutacij je

delno razložljiva s haploidnostjo genoma mtDNA.


12

3. MATRIAL IN METODE

3.1 VZORCI

V raziskavo smo vključili 216 vzorcev krvi rib iz enajstih slovenskih rek in Jadranskega

morja. Večina vzorcev je bila zbranih v letu 1998 in v začetnih mesecih leta 1999. Ribe

smo lovili s pomočjo električnega agregata, nakar smo jim odvzeli vzorec krvi in jih nato

spustili. Kri smo jemali iz lateralne vene anesteziranih rib. Iglo smo zabodli nad pobočnico

v predelu med tolsto plavutjo in zadnjično odprtino ter tako prešli ob hrbtenici do spleta

krvnih žil, ki se nahaja neposredno pod hrbtenico. Pri odvzemu krvi smo v skladu z

velikostjo ribe uporabljali dvo-ali trimililiterske vakuumske zbiralce (Becton Dickinson) z

EDTA ( K3 ) in igle 0.5 x 17 mm (Veneflex) ali 0.7 x 40 mm (Becton Dickinson).

Volumni krvnih vzorcev so se gibali med približno 50 µl in dvema mililitroma,

predstavljali pa so maksimalno 10 % celokupne mase krvi, kar je skrajna meja, ki še

zagotavlja preživetje ribe po odvzemu krvi. Zbrano kri smo hranili na ledu in jo najkasneje

v 12 urah centrifugirali (1300g, 30 min, 4°C ) in krvni sediment takoj uporabili za izolacijo

DNA ali pa ga shranili pri -25°C.

Vzorce smo zbrali iz štirih različnih med seboj geografsko ločenih porečij in sicer iz:

� Jadranskega porečja, ki obsega soški, tolminski, idrijski, goriški in ajdovski ribiški

okoliš in ga naseljuje soška postrv (Salmo marmoratus). Ta je v porečju reke Soče

razvila dve fenotipski različici. V zgornjih tokovih je čista soška postrv izrazito

marmorirana po celem telesu in nima rdečih pik. V Trebuščici pa ima soška postrv

poleg značilnega marmoriranega vzorca tudi rdeče pike.


13

Slika 3: Soška postrv iz Zadlaščice (foto: Andreja Ramšak). Osnovna barva telesa je

odvisna od okolja v katerem se riba zadržuje, značilen marmoriran vzorec pa se ne

spremeni.

Slika 4: Soška postrv iz Trebuščice (foto: Andreja Ramšak). Poleg izrazite marmoriranosti,

imajo soške postrvi iz Trebuščice tudi značilne rdeče pike.


14

� vodovja na kraškem ozemlju, kjer so posebnost kraške vode, ki poniknejo in se spet

pojavljajo na površju, v podzemlju pa se med seboj pretakajo. Značilna postrv za to

porečje je potočna postrv ali potočnica ( Salmo trutta f. fario ).

Slika 5: Potočna postrv (foto.Aleš Snoj). Tip postrvi, ki je značilen za donavsko porečje.

� porečja Save, ki odmaka dobro polovico Slovenije in pripada donavskemu porečju. To

porečje poleg potočne postrvi naseljuje še jezerska postrv (Salmo tutta lacustris).

Slika 6: Atlantski tip potočne postrvi iz ribogojnice Povodje.


15

Slika 7: Morska postrv (foto: Dušan Jesenšek).

Slika 8: Lokacije rek in potokov v Sloveniji, katerih populacije smo preučevali

Zadlaščica

Trebuščica

Predelica

Ribnica Blejsko j.

IškaMahnečica

Sovpot

Kozji jarek

Krka

Obrh

Tolminka

SočaBlanščica

Koprski z.

Piranski z.


16

Tabela 3: Lokacije vzorčenja in število vzorcev za posamezno lokacijo.

Lokacija Št. vzorcev

Iška 9

Mahnečica 15

Cerknišnica 1

Temenica 1

Stiški potok 1

Krka 36

Sovpot 22

Ribnica 21

Kozji jarek 7

Humski potok 1

Obrh 8

Povodje 11

Tolminka 11

Soča pri Bovcu 10

Trebuščica 19

Zadlaščica 45

Predilca 22

Jadransko morje (Piranski zaliv) 8

Blejsko jezero 3


17

3.2 IZOLACIJA mtDNA IZ KRVNEGA SEDIMENTA

Mitohondrijsko DNA smo izolirali po modificirani metodi White and Densmore (1992).

Protokol vključuje uporabo naslednjih sestavin:

-pufer STE: 10 mM NaCl; 10mM HCl, pH=8,0; 25 mM EDTA

-TE: Tris-HCl-1M, pH=8,0; 500 mM EDTA, pH=8,0

-1,5 M saharoza v TE

-20% SDS

-homogenizacijski pufer HB: 1,5 M saharoza v TE: STE, 1:5.

-96% etanol

-75% etanol

-C/I kloroform: izoamil alkohol, 24:1

Približno 40 do 50µl krvnega sedimenta smo resuspendirali v 10 ml ledeno mrzlega

homogenizacijskega pufra HB.

V 15ml plastičnih centrifugirkah smo krvni sediment resuspendirali in homogenizirali v 3

ml HB pufra, nato pa dodali še preostalih 7 ml pufra. Suspenzijo smo centrifugirali 5 min

pri 3000g in pri temperaturi 4°C (sediment, ki vsebuje jedra, je mogoče uporabiti za

izolacijo genomske DNA). Supernatant, ki je vseboval mitohondrije, smo pazljivo odlili v

drugo 15 ml plastično centrifugirko in ponovno centrifugirali pri 20 000g 20 minut in

temperaturi 4 °C. Po končanem centrifugiranju smo supernatant odlili, sediment pa smo

raztopili v 450 µl TE pufra, segretega na sobno temperaturo, približno 1 min dobro mešali

na Vortexu, nato smo raztopino prenesli v 1.5 ml reagenčne posodice (Eppendorf ). V vask

vzorec smo dodali 56 µl 20% SDS, rahlo premešali z obračanjem in pustili na sobni

temperaturi 10 min. Na ta način smo lizirali mitohondrijske membrane. Po končani 10 min

inkubaciji na sobni temperaturi smo dodali še 90µl 6M NaCl, s katerim smo precipitirali

proteine, lipide in SDS, nato smo mešanico ohladili na 4 °C za dve uri ali čez noč. Po

končani inkubaciji smo vzorce ponovno 20 min centrifugirali pri 20 000g pri temperaturi

4°C. Supernatant smo hitro in pazljivo prenesli v sveže reagenčne posodice. Sledila je

fenol kloroformska ekstrakcija. V reagenčno posodico smo nanesli enak volumen fenola,

kot je bil volumen raztopine v reagenčni posodici. Centrifugirali smo 10 min pri sobni


18

temperaturi in pri hitrosti 20 000g. Po končanem centrifugiranju smo zgornjo vodno fazo

pazljivo prenesli s 1000 µl pipeto v sveže reagenčne posodice, ponovno dodali enak

volumen C/I, nato še enkrat 10 min centrifugirali pri 20 000g pri sobni temperaturi.

Zgornjo vodno fazo smo prenesli v sveže reagenčne posodice, dodali 2x-ni volumen 96%

ledeno mrzlega etanola in dobro pretresli na Vortexu in pustili čez noč pri temperaturi -

20°C.

Naslednji dan smo raztopino centrifugirali pri 20000xg 15 min in pri sobni temperaturi. Po

končanem centrifugiranju smo na dnu reagenčne posodice lahko opazili droben pelet, ki

smo ga oprali v 100 µl 70% etanola, centrifugirali 10 min pri hitrosti 20 000g in pri sobni

temperaturi. Odlili smo supernatant in pelet posušil, nakar smo ga raztopili v 25 µl

bidestilirane vode.

3.3 POLIMERAZNA VERIŽNA REAKCIJA

Verižna reakcija sinteze DNA s pomočjo DNA polimeraze ali krajše polimerazna verižna

reakcija (ang. Polymerase Chain Reaction-PCR) je relativno nova metoda sinteze

nukleinskih kislin v in vitro pogojih, s pomočjo katere lahko specifičen odsek DNA

pomnožimo v velikem številu kopij. Reakcijo je leta 1985 odkril Karl Mullis (Saiki in sod.,

1988). Polimerazna verižna reakcija je tako občutljiva metoda, da se pomnoževanje lahko

začne z eno samo molekulo DNA. Na ta način iz ekstremno majhnih količin vzorca nekaj

celic) pomnožujemo gene, ki se v celici nahajajo v eni sami kopiji. Glavni predpogoj za

pomnoževanje DNA je poznavanje nukleotidnega zaporedja na začetku in koncu fragmenta

DNA, ki ga želimo pomnožiti. To omogoča izbiro začetnih oligonukleotidov (ang. primer),

ki so komplementarni z mejnimi deli DNA, ki jo želimo pomnožiti (ciljna DNA). Začetni

oligonukleotidi se prilegajo z nasprotnimi verigami ciljne DNA, orientirani pa so tako, da

se sinteza nove DNA odvija v regiji med njimi.

Pomnoževanje odsekov mtDNA smo izvedli na Gene Amp PCR System 2400

miroprocesorsko vodenem termostatu (Perkin Elmer).


19

V 200 µl mikrocentrifugirkah ( MicroAmp, N801-0540, Perkin Elmer ) smo pripravili

reakcijsko mešanico s končnim volumnom 20 µl, ki je vsebovala naslednje komponente:

-10X PCR pufer(Perkin Elmer) 2µl

-0.2 mM dNTP ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1.5µl

-25 mM MgCl2 (Perkin Elmer) 1.2µl

-0.5 enot/µl Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer) 0.2µl

-10 pmol/µl začetnih oligonukleotidov 0.5µl

-~ 20 ng mtDNA.

-do 20 µl H2O (milliQ ).

Uporabljali smo naslednje pare začetnih oligonukleotidov:

Prvi par:

- 28 RIBa, ki predstavlja skrajšano obliko oligonukleotidnega začetnika “28”(Dovč in

Hecht, 1994): 5’-CAC CCT TAA CTC CCA AAG CTA AG-3’

- HF (Heavy standard Forward), ki je bil na 5’-koncu označen z digoksigeninom:

5’-CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG-3

Drugi par:

- BA-F; 5’ATG TAT TAT CAA CAT TAG TGA ATT TAA ACC 3’

- BA-R; 5’TTA TTG ATA TAA CAA TTA CTC GGT TTA 3’

Temperaturni program za prvi par oligonukleotidnih začetnikov:

- začetna denaturacija DNA pri 94 °C/5min

- sledi ji 32 ciklov

-denaturacija pri 94°C/1min

-prileganje pri 46°C/1min

-sinteza pri 72°C/1 min

-podaljšana polimerizacija 3 min pri 72°C.

Temperaturni program za drugi par: glej. poglavje 3.7, s. 27.


20

■→ □→ -začetna oligonukleotida

Slika 9: Shematski prikaz poteka polimerazne verižne reakcije (PCR).

3.4 SEKVENCIRANJE MITOHONDRIJSKE DNA

Sekvenciranje je metoda, s katero ugotovimo nukleotidno zaporedje na določenem odseku

DNA. Za sekvenciranje mtDNA smo uporabljali sekvenčni aparat ABI PRISM™ 310,

napravo za avtomatsko sekvenciranje in analizo fragmentov nukleinskih kislin. Sekvenčno

reakcijsko zmes smo najprej denaturirali in nato vstavili v ABI PRISM™ 310 genetski

analizator, nakar se je začelo elektroforetsko ločevanje DNA fragmentov v 47 cm dolgi

kapilari z gelom POP-6 (Performance Optimized Polymer).


21

Pri sekvenciranju PCR produktov mtDNA smo uporabljali začetne oligonukleotide: 28R,

HF, VHF-F in CSB3-F oligonukleotidne začetnike (Tab. 4).

Tabela 4: Nukleotidna zaporedja začetnih oligonukleotidov za sekvenciranje dela

kontrolne regije.

28R 5’-CAC CCT TAA CTC CCA AAG CTA AG-3’

HF 5’-CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG-3’

VHF-F 5’-TCCGT CTTTACCCA CAACT-3’

CSB3-F 5’-CCTTATATTCC TGTCAAACC-3’

3.4.1 Izolacija DNA iz agaroznega gela (preparativna elektroforeza)

Izolacijo DNA iz agaroznega gela smo izvajali s kitom Qiaex II Agarose Gel Extraction

(QIAGEN).

Iz agaroznega gela smo s čistim in ostrim skalpelom izrezali košček gela, v katerem je bila

željena frakcija DNA (velikost izrezanega koščka gela naj bi bila minimalna). Izrezan

košček gela smo nato prenesli v sterilne 1,5 ml reagenčne posodice. Natančno smo

odtehtali maso izrezanega gela, v reagenčno posodico dodali trikratni volumen pufra QX 1,

ta volumen ustreza DNA fragmentom velikosti od 100 do 4000 bp. V odvisnosti od

koncentracije DNA v izrezanem koščku gela smo v reagenčne posodice dodali še ustrezen

volumen pufra Qiaex II in celotno vsebino reagenčne posodice resuspendirali s 30

sekundnim mešanjem na vortexu. Sledila je 10 min inkubacija, pri temperaturi 50 ˚C.

Med inkubacijo smo vsaki 2 min vsebino reagenčne posodice premešali na vortexu tako,

da smo Qiaex II ohranili v suspenziji. Rumena barva suspenzije nam je služila kot

indikator pH=7,5. Po 10 min inkubaciji smo vzorse centrifugirali pri maksimalni hitrosti in

sobni temperaturi 1 min, nakar smo supernatant pazljivo odlili. Pelet smo raztopili v 500 µl

pufra QX I, dobro premešali na vortexu in ponovno centrifugirali pri enakih pogojih, ter

odstranili supernatant s pipeto. Na ta način smo odstranili vso preostalo agarozo, ki je bila

prisotna v gelu. Preostalo sol smo odstranili tako, da smo pelet raztopili v 500 µl pufra PE,

dobro premešali na vortexu in centrifugirali 30 sekund pri maksimalni hitrosti in sobni


22

temperaturi. Supernatant smo nato pazljivo odstranili s pipeto ( ta postopek smo ponovili

dvakrat ).Pelet smo 10 do 15 min sušili v laminariju. Pri tem smo pazili, da ga nismo

preveč posušili. V eluat DNA smo dodali 20 µl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 ali enak volumen

milliQ in pustili nekaj sekund na Vorteksu, da se je pelet raztopil. Zatem smo 1min

centrifugirali pri maksimalni hitrosti in sobni temperaturi, ter supernatant s pipeto pazljivo

prenesli v sterilno reagenčno posodico.

Uspešnost izolacije DNA iz agaroznega gela po protokolu QIAEX II Agarose Gel

Extraction Kit smo ocenili s ponovnim nanosom približno 2µl izolirane DNA na agarozni

gel.

3.4.2 Sekvenčna reakcija

Sekvenčna reakcija je tekla v GeneAmp PCR sistemu Perkin Elmer 2400. PCR

amplifikate, ki smo jih nameravali uporabiti kot matrično DNA v sekvenčni reakciji, smo s

preparativno agarozno elektroforezo predhodno očistili preostanka začetnih prostih

nukleotidov in eventuelnih nespecifičnih PCR produktov (poglavje 3.4.1). Koncentracijo

očiščenih PCR produktov smo ocenili spektrofotometrično ali po jakosti signala na

agaroznem gelu. Za sekvenčno reakcijo enega vzorca smo uporabili približno 50 ng PCR

produkta. Sekvenčne reakcije smo pripravili po navodilih proizvajalca. Uporabljali smo

Big Dye™, DNA Seqencing kit (Perkin Elmer). Reakcija se je začela z začetno 5 min

denaturacijo pri 95˚C, ki ji je sledilo 30 ciklov z naslednjim temperaturnim profilom: 10 s

pri 96˚C, 5 s pri 50˚C in 4 min pri 60˚C.

3.4.3 Priprava DNA fragmenta za sekvenciranje

Za vsak vzorec sekvenčne reakcije smo v 1,5 ml reagenčnih posodicah Eppendorf zmešali

po 50 µl 96% etanola in 2 µl 3 M natrijevega acetata (CH3COONa x 3H2O), pH 4,6. Nato

smo reakcijsko mešanico iz 20 µl reagenčne posodice prenesli v 1,5 ml reagenčne

posodice, dodali 2,5 vol 96% etanola in NaOAc, do končne koncentracije 0,3M, jih

pretresli na Vortexu in pustili na ledu 10 minut. Po končani inkubaciji smo mešanico 25


23

min centrifugirali pri maksimalni hitrosti in sobni temperaturi. Supernatant smo pazljivo

odpietirali s pipeto. Pelet smo oprali v ledeno mrzlem 70% etanolu in ponovno 5 min

centrifugirali pri enakih pogojih, nakar smo ponovno odlili supernatant. Zatem smo pelet

posušili v vakumski centrifugi (1 do 3 min) in pazili, da ga ne presušimo. Posušen pelet

smo raztopili v 12 µl Template Supression Reagent (Perkin Elmer). Vsebino reaenčnih

posodic smo premešali na Vortexu inkratko centrifugirali. Sledila je 2 do 3 min

denaturacija pri temperaturi 95ºC ter takojšnja analiza.

3.5 Restrikcijska analiza namnoženih fragmentov mtDNA

3.5.1 Izvedba restrikcijske reakcije

Restrikcijo namnoženih odsekov mtDNA smo izvedli z restrikcijskimi encimi, navedenimi

v Tab 5. Z analizo restrikcijskih fragmentov smo določali posamezne haplotipe. V sterilne

500 µl centrifugirke smo pripravili 20 µl restrikcijske reakcije, ki so vsebovale:

- 2µl ustreznega reakcijskega pufra

- 0,5µl (5 enot) encima

- 5 µl mtDNA (300 ng mtDNA)

- 12,5µl H2O(milliQ)

Vzorce smo inkubirali pri 37°C v vodnem inkubatorju (Stovall; The Belly Dancer

Hybridization Water Bath, Model; BDHWB220), pri 37°C od ene do treh ur.

Po končani inkubaciji smo vzorce in velikostni standard (100 bp DNA ladder Gibco BRL)

nanesli na 1,5 do 2,5% agarozni gel. Koncentracija agaroze v gelu je bila odvisna od

velikosti fragmentov, ki smo jih pomnožili. Elektroforeza je potekala pri sobni temperaturi

najprej pet minut pri el. toku 50 mA, nato do konca pri el. toku 70 mA. Elektroforeza je

potekala v elektroforetskih kadičkah GNA-100 (Pharmacia). Gel smo osvetlili z UV

svetlobo (302 nm) in ga fotografirali s Polaroid instant kamero(film 665). Za

dokumentiranje gelov smo uporabljali Bio Rad Gel Doc 1000 dokumentacijski sistem.


24

Tabela 5: Restrikcijski encimi, ki smo jih uporabili pri naših analizah.

Restrikcijski encim Restrikcijsko

mesto

Namen uporabe

SmaI (Gibco BRL; 10 U/µl) CCC!GGG (9, 10)

AvaI (Gibco BRL) C!Y¹CGR²G(9, 10)

AluI (Gibco BRL; 10U/µl). AG!CT (12)

MunI (Boehringer Mannheim,Gmbh;

10U/ µl).

C!AATTG

za ločevanje haplotipov

DdeI (Pharmacia Biotech, 3 U/ µl). CTAAG Priprava DNA fragmenta za

PCR-SSCP

3.6 Konformacijski polimorfizem enoverižnih DNA fragmentov (Angl. Single Strand

Conformation Polymorphism, SSCP).

Enoverižna (denaturirana) DNA zavzame v nativnem gelu strukturo, ki je odvisna od

intramolekulskih interakcij oziroma od nukleotidnega zaporedja. Pri SSCP metodi pomeni

različna mobilnost na poliakrilamidnem gelu različno nukleotidno zaporedje (Hayashi, K.

1991).

S pomočjo PCR-SSCP metode smo testirali polimorfnost prvega dela kontrolne regije

mitohondrijske DNA pri 55 postrveh, ki so bile izbrane iz različnih geografsko ločenih

populacij. Pri tej metodi smo uporabljali restrikcijski encim DdeI (glej Tab. 11) za pripravo

DNA fragmentov, ki smo jih kasneje ločevali na poliakrilamidnem gelu. Glavni namen

PCR-SSCP metode je bil vpeljati hitro in zanesljivo metodo določanja haplotipov, da bi se


25

izognili sekvenciranju kot zamudni in dragi metodi, s katero smo dopolnjevali restrikcijsko

analizo.

3.6.1 Priprava poliakril amidnega (PAA) gela

Nativni 6% PAA gel smo pripravili na vertikalni (180 x 160x 1.5 mm) elektroforezni enoti

(Pharmacia Biotech, Hoefer, model #SE6119SM).

Za pripravo 40 ml PAA gela smo uporabili:

- 8 ml 30% raztopina Akrilamid/bisakrilamid (2.1g, N,N’-metilen-bis-

akrilamid;C7H10N2O2≥98%;Sigma, 20,79g akrilamid;C3H5NO≥99%;Sigma, 70 ml

deionizirane vode- milli Q)

- 4 ml 10X TBE pufra

- 4 ml glicerola (10%)

- 22,5 ml deionizirane vode (miliQ)

- 150 µl APS (amonijev persulfat)

- 30 µl TEMED

3.6.2 Elektroforeza na PAA gelu

10 µl izoliranega 220 bp fragmenta smo zmešali z 10 µl 95% formamida, ki je vseboval

ksilen cianol inbromfenol modro, denaturirali pri 95ºC/5 min, ohladili na ledu in nanesli na

gel. Elektroforeza je trajala 14 ur v elektroforezni enoti (Hoefer® SE 600 Series) 25 min pri

15°C in pri toku 6 mA, nato do konca pri toku 20 mA.


26

3.6.3 Vizualizacija SSCP vzorcev

Za barvanje gela smo uporabili Silver Stain Plus Kit (BioRoad). Gel smo barvali po

naslednjem vrstnem redu:

� gel smo pustili za 30 min (lahko tudi čez noč) v fiksativu (Fixative Enhncer Solution

Preparation;metanol 50%, ocetna kislina 10%, Fixative Enhancer Concentrate

10%,deionizirana voda 30%).

� pazljivo smo odlili fiksativ iz posode in gel potopili v 800 ml deionizirane vode za 20

minut pri rahlem mešanju. Pri tem in pri naslednjih korakih je zelo pomembno, da se

gela ne dotikamo, ker vsakršna poškodba gela povzroča nespecifično obarvanje gela.

� postopek smo ponovili s svežo deionizirano vodo.

� na magnetno mešalo smo postavili erlenmajerico, vlili 105 ml sveže deionizirane vode,

nato v naslednjem vrstnem redu dodajali:15 ml Silver Complex Solution, 15 ml

Reduktion Moderator Solution, 15 ml Image Development Reagent, k navedenim

reagentom smo na koncu dodali še 150 ml Development Accelerator Solution,

segretega na sobno temperaturo. Ta postopek naj bi trajal 20 min oz. do optimalne

vizualizacije.

� barvanje smo prekinili s fiksiranjem s 5% ocetno kislino za 15 min ob rahlem mešanju.

� gel smo pustili še 15 min v sveži deionizirani vodi.

3.7 Haplotipsko specifični oligonukleotidi HSO-PCR (Haplotip Specific

Oligonucleotide)

Par začetnih oligonukleotidov BA-F/BA-R smo spremenili na dveh mestih, tako da smo

umetno ustvarili dve restrikcijske mesti za encim DraI, ki prepozna nukleotidno zaporedje

TTTAAA. Za izvedbo PCR reakcije z oligonukleotidnim parom BA-F/BA-R smo

potrebovali 5 ng matrične DNA. Optimalno količino matrične DNA smo dosegli v prvih

osmih ciklih pomnoževanja z oligonukleotidnim parom 28R/HF.


27

Temperaturni program za BA-F/BA-R par oligonukleotidnih začetnikov:

(Prvih osem ciklov pomnoževanja je potekalo z oligonukleotidnim parom 28R-HF)

-začetna denaturacija DNA pri 94°C/5 min

-8 ciklov pomnoževanja;

- denaturacija pri 94°C/1 min

- prileganje pri 46°C/1 min

- sinteza pri 72°C/1 min

-podaljšana polimerizacija 3 min pri 72°C.

Med podaljšano polimerizacijo smo v reakcijsko mešanico dodali nukleotidna začetnika

BA-F in BA-R.

Sledilo je 30 ciklov pomnoževanja:

- denaturacija pri 94°C/1 min

- prileganje pri 55°C/30 sec

- sinteza 10 sec pri 72°C/10 sec

- podaljšana polimerizacija 3 min pri 72°C.

3.8 Agarozna gelska elekroforeza

Z agarozno gelsko elektroforezo smo ločevali fragmente DNA, večje od 50 bp. Uporabljali

smo jo v analitske in preparativne namene. Uporabljali smo horizontalno elektroforezno

enoto (Pharmacia;GNA 100) z dvema različno velikima kalupoma za gel z dimenzijami

5,5 x 7,5 cm in 7,5 x 10,5 cm in elektrodni pufer 1x TBE.

V 30 ml 0.5x TBE (0,045 M Tris borat/ 0,001 M EDTA) ali 0.5x TAE (0,04 M Tris acetat/

0,001 M EDTA) smo raztopili 0,36 do 0,6 g agaroze, kjer smo dobili od 1,2 do 2%

agarozne gele (za daljše 500 bp DNA fragmente smo uporabljali 1.2% gel, pri restrikcijski

analizi, kjer smo pričakovali krajše 30 bp DNA fragmente pa smo uporabljali 2% agarozne

gele). Na 100 ml agaroznega gela smo dodali 3 µl etidijevega bromida (10µg/ml), ki je

interkaliral v dvojnoverižne molekule DNA in omogočal detekcijo pod UV svetlobo.


28

Vzorcem smo pred nanosom na gel (5-30µl/žepek) dodali aplikacijski pufer za nanašanje

vzorcev (0,25% ksilen cianol in brom fenol v glicerolu). Poleg vzorcev smo na gel nanesli

še velikostni standard 100 bp (100bp DNA Ladder, Gibco BRL). Elektroforeza je potekala

pri sobni temperaturi najprej 10 min pri 50 mA, nato še 10 min pri 70 mA v

elektroforetskih kadeh GNA-100 (Pharmacia). Po končani elektroforezi smo vzorce

fotografirali na UV transiluminatorju pri 302 nm s sistemom Polaroid CU-5 (film 655).

S pomočjo agarozne gelske elektroforeze smo preverjali uspešnost izolacije mtDNA,

polimerazne verižne reakcije (PCR), restrikcijske analize in HSO-PCR metode.


29

4 REZULTATI

4.1 ANALIZA MITOHONDRIJSKE DNA

4.1.1 Izolacija mitohondrijske DNA

Koncentracija izolirane mitohondrijske DNA je bila od 100 do 200 ng/µl. Za nadaljnje

analize smo uporabljali 50 ng/µl mtDNA (delovna raztopina).

Slika 10: Izolirana mitohondrijska DNA na 1.2% agaroznem gelu. Proga M je 100 bp

velikostni standard, proge od 1 do 6 je izolirana mtDNA postrvi.

M 1 2 3 4 5 6


30

4.1.2 Polimerazna verižna reakcija

Polimerazna verižna reakcija je potekala specifično, brez pomnoževanja nespecifičnih

regij. Pri elektroforezi na agaroznem gelu smo uporabljali velikostna standarda 100 in 123

bp (Gibco BRL). Glede na velikostni standard (100 bp), ki je na sliki viden v progi 5, smo

ocenili velikost amplifikata na 550 bp. Regijo pomnoževanja sta omejevala začetna

oligonukleotida 28R/HF. Začetni oligonukleotid 28R-5’ se nahaja v genu za tRNAPro,

začetni oligonukleotid HF pa v centralnem delu kontrolne regije mtDNA.

Slika 11: Ločitev PCR fragmentov dela kontrolne reije mtDNA na 1.2% gelu. Proga 1:

negativna kontrola; 2-3: potočna postrv; 4: soška postrv; 5: velikostni standard 100 bp

(Gibco BRL); 6: ohridska postrv.

1 2 3 4 5 6

470 bp


31

4.1.3 Sekvenciranje mitohondrijske DNA

Večina PCR fragmentov je dala kvalitetne sekvence, zato smo jih sekvencirali samo

enkrat, tiste pa, ki so dali manj zanesljive rezultate, smo sekvencirali dvakrat.

28R MunI AAACTATCCTCTGATTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAA

TGTTATACTACATCTATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATA

BA-F Dra I GCATGATGAGTAGTACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACAT

DdeI DraI CAGCACTAACTCAAGGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCT

DraI BA-R VHF-F TAACCCGATTAATTGTTATATCAATAAAACTCCAACTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCA

VHF-F CCAACT-TTCAGCATCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTA

HF GGCATACTCTTATTGATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTAT

HF

TCCTGG

Slika 12: Sekvenca prvega dela kontrolne regije mtDNA z vsemi začetnimi oligonukleotidi

ter označenimi restrikcijskimi mesti s pripadajočimi encimi.

Soska p. AAACTATCCTCTGATTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAA DonB --------------C-----------------------A---------------------

DonA --------------C-----------------------A--------------------- DonBa --------------C-----------------------A---------------------

DonKr --------------C-----------------------A--------------------- Atl. --------------------------------------T---------------------

Oh ------------------------------------------------------------

Soska_p. TGTTATACTACATCTATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATA

DonB ------------------------------------------------------------ DonA ------------------------------------------------------------

DonBa ------------------------------------------------------------ DonKr ------------------------------------------------------------

Atl. -----------------------------------------------------------A Oh -----------------------------------------------------------A

BA-F Dra I

Soska_p. GCATGATGAGTAGTACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACAT

DonB ------------------------------------------------------------ DonA ------------------------------------------------------------

DonBa ------------------------------------------------------------ DonKr ------------------------------------------------------------

Atl. ------------------------------------------------------------ Oh ------------------------------------------------------------

DdeI DraI


32

Soska_p. CAGCACTAACTCAAGGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCT

DonB ------------------------------------------------------------

DonA ------------------------------------------------------------ DonBa ----------------------------------------------------------T-

DonKr ------------------------------------------------------------ Atl. ------------------------------------------------------------

Oh ------------------------------------------------------------

DraI BA-R VHF-F

Soska_p. TAACCCGATTAATTGTTATATCAATAAAACTCCAACTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCA

DonB --------G-------------------------G------------------------- DonA -------GG-------------------------G-------------------------

DonBa --------G-------------------------G------------------------- DonKr -------TG-------------------------G-------------------------

Atl. ----------------------------------G------------------------- Oh ---------------?------------------C-------------------------

VHF-F Soska_p. CCAACT-TTCAGCATCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTA

DonB ------------------------------------------------------------ DonA ------------------------------------------------------------

DonBa ------------------------------------------------------------ DonKr ------------------------------------------------------------

Atl. ------------------------------------------------------------ Oh ------------------------------------------------------------

HF Soska_p. GGCATACTCTTATTGATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTAT

DonB --------------------------------------------------------T---

DonA --------------------------------------------------------T--- DonBa --------------------------------------------------------T---

DonKr --------------------------------------------------------T--- Atl. ------------------------------------------CT------------T---

Oh ------------------------------------------------------------ HF

Soska_p. TCCTGG DonB ------

DonA ------ DonBa ------

DonKr ------ Atl. ------

Oh ------

Slika 13: Natančna sekvenca nukleotidnega zaporedja 426 bp lahke verige, ki smo jo

določili pri navedenih haplotipih postrvi. Črtice, ki so podpisane pod sekvenco soške

postrvi predstavljajo identično zaporedje. Mutacije so vnesene v sekvenco. Kratice

predstavljajo haplotipe različnih tipov postrvi:

Soska_p.- haplotip soške postrvi DonB - haplotip potočne postrvi donavskega tipa DonA - haplotip potočne postrvi donavskega tipa DonBa - haplotip potočne postrvi donavskega tipa DonKr - haplotip potočne postrvi donavskega tipa Atl. - haplotip potočne postrvi atlantskega tipa Oh - haplotip ohridskega tipa postrvi


33

Tabela 6: Polimorfna mesta in različni haplotipi, definirani na osnovi opaženih mutacij na

DNA fragmentu od 28R proti HF.

1 2 (3) 3a 4 4a (5) (6) (7) 7a (8) 9 10 11 11a 12 (13) 14 15 15a 16 17 18

D T C C A A C G T A C G A T T A A C A G T C C C

A C A C A - C G T A C G G G T A G C A G T C C T

B C A C A - C G T A C G A G T A G C A G T C C T

BKr C A C A - C G T A C G T G T A G C A G T C C T

BA C A C A - C G T A T G A G T A G C A G T C C T

C T T C A - C G T A C G A T T A G C A G C T C T

E T C C A - C G T A C G A T T A C C A G T C C T

GL T C C A - T G T A C G A T C A T C A G T C C C

MP T C C G - C G T A C G A T T C G C T C T - A C

Številke v oklepajih se nanašajo na mesta, kjer nismo našli nobenih razlik, ki pa glede na

rezultate drugih avtorjev veljajo za polimorfna. Številke z indeksom a pa so nukleotidne

variante, ki do sedaj niso bile opisane.

4.1.4 Restrikcijska analiza

Glede na različna restrikcijska mesta, značilna za posamezen haplotip, smo izbrali

restrikcijske encime s pomočjo katerih lahko zanesljivo ločimo med haplotipi na osnovi

restrikcijske analize. Za restrikcijsko analizo smo uporabljali naslednje encime: SmaI, AvaI

AluI in MunI. Restrikcijska mesta so navedena v tabeli 7.


34

Slika 14: Restrikcijska analiza pomnoženega dela kontrolne regije mtDNA z encimi SmaI,

AvaI in AluI. Vzorci od leve proti desni: haplotipi A, B, C, D in velikostni standard 100 bp.

Tabela 7: Diagnostični restrikcijski encimi za določanje posameznih haplotipov.

Številke v oklepajih se nanašajo na polimorfna mesta iz tabele 6.

Encim SmaI AvaI AluI MunI DraI

Restrikcijsko mesto CCC!GGG(8,9) C!Y1CGR2G(8,9) AG!CT C!AATTG TTT!AAA

A X X X

B X X

BA X X X

BKr X

C X X

Haplotipi:

D

Iz tabele 7 je razvidno, da encim SmaI reže le haplotip A, AvaI haplotip A, B, BA in BKr,

encim AluI pa vse haplotipe razen haplotipa D. V pirmerih, ko restrikcija z nobenim od

omenjenih encimov ne poteče, gre za haplotipa D ali E. Ker je haplotip E značilen za

ohridsko postrv in ker je njena prisotnost v naših vodah zelo malo verjetna, upravičeno

lahko sklepamo, da gre v tem primeru za haplotip D.

Sma Sma I I AvaAva II AluAlu II

A B C D A B C D A B C D


35

Restrikcijska analiza z encimi SmaI, AvaI in AluI ni pokazala nobene razlike med

haplotipoma C in BKr. S kasnejšo sekvenčno analizo smo našli polimorfna mesta, ki kažejo

razlike med tema dvema haplotipoma. Zato smo poiskali restrikcijski encim, ki prepoznava

nukleotidno zaporedje na enem od polimorfnih mest, na katerem se razlikujeta haplotipa C

in BKr. Vse vzorce, ki so verjetno pripadali C haplotipu, smo naknadno analizirali z

restrikcijskim encimom MunI, ki cepi fragment kadar gre za haplotip C, na dva različno

dolga fragmenta. Pri vzorcih haplotipa BKr, restrikcija z omenjenim encimom ne poteče.

Haplotipi A, B, BA in BKr so značilni za donavski tip potočne postrvi (Salmo trutta), pri

haplotipu D gre za soško postrv, haplotip C pa predstavlja atlantski tip postrvi.

4.1.5 Analiza fragmentov s PCR-SSCP metodo

Namen PCR-SSCP analize je bil ugotoviti različno mobilnost fragmentov različnih

haplotipov na PAA gelu. Ta metoda dopolnjuje restrikcijsko analizo z različnimi

restrikcijskimi encimi. Fragment, ki smo ga analizirali, je bil dolg 220 bp in je na 3’ koncu

vseboval sekvenco začetnega oligonukleotida HF. Na tem odseku 5’-konca kontrolne

regije mtDNA se nahaja večina polimorfnih mest z nukleotidnimi variantami, na osnovi

katerih je mogoče ločevati med haplotipi. Za uspešnost SSCP analiza je odločilno, da

analiziramo dovolj kratek fragment, ker je pri kratkih fragmentih razlika v mobilnosti, ki jo

povzročajo točkovne mutacije, bolj očitna.

DdeI 7a 8,9,10 11 11a 12,13

5’CTAAGTTGTTTTAACCCGAGTAATTGTTATATCAATAAAACTCCAGCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACTTTCAGCA

14 TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATTGATGGTCAGGGACAGATATCGTATTA

15,16 17 18

GTCGCATCTCGTGAATTATTCCTGG3’HF

Slika 15: DNA fragment (220 bp) z restrikcijskim mestom CTAAG ter oštevilčena

variabilna mesta z nukleotidnimi variantami, ki so značilne za posamezne haplotipe.


36

Tabela 8: Navedeni so haplotipi in nukleotidne variante, značilne za posamezen haplotip

na DNA fragmentu, ki smo ga uporabljali za SSCP analizo.

Polimofna mesta, ki jih vsebuje DNA fragment 5’- konca D-loop

regije.

Haplotip 7a 8 9 10 11 11a 12 13 14 15 15a 16 17 18

D C G A T T A A C A G T C C C

A C G G G T - G C A G T C C T

B C G A G T - G C A G T C C T

BKr C G T G T - G C A G T C C T

BA T G A G T - G C A G T C C T

C C G A T T - G C A G C T C T

BA * A,BKR D,C * D D * * * C C * D

Zvezdice označujejo homologijo pri haplotipih.

Slika 16: Prikaz fragmentov DNA z različno mobilnostjo na PAA gelu. Proga 1 in 2 sta

pozitivni kontroli, proga 3 je velikostni standard 100 bp, proga 4 haplotip B, proga 5

haplotip BA, proga 6 haplotip A, progi 7 in 8 haplotip BKr, proga 9 haplotip C in proga 10

haplotip D.

+ + M + + M B B B BAA A A B BKrKr BBKrKr C C D D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


37

S to metodo nam je uspelo dokazati različno mobilnost enako dolgih fragmentov DNA na

PAA gelu pri naslednjih haplotipih: D, C, A, BKr (glej sliko 18).

Med haplotipoma B in BA ni nobene razlike v mobilnosti fragmentov na PAA gelu.

4.1.6 HSO-PCR analiza

V polimerazni verižni reakciji je na začetku poleg specifičnega 130 bp fragmenta nastajal

še nespecifičen fragment velikosti 300 bp, katerega smo uspešno odstranili z različno

koncentracijo začetnih oligonukleotidov 28R in HF. Koncentracija začetnega

oligonukleotidnega HF je bila 20X manjša kot koncentracija začeznega oligonukleotidnega

28R. Velikost amplifikata smo ocenili na 130bp, kar je tudi razvidno iz eletroferograma.

↓Dra I (reže haplotip BA in B)

Oligonukleotid: BA-F 5’ATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAAACC-3’

Haplotip: B 5’ATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAAGCCCTCATACATCAGCACTA3’

Haplotip: BA 5’-----------------------------------------------3’

Haplotip: B 5’ACTCAAGGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGT3’

Haplotip: BA 5’-----------------------------------------------3’

↓Dra I (reže haplotip BA)

Haplotip: B 5’TGTTCTAACCCGAGTAATTGTTATATCAATAA3’

Haplotip: BA 5’----T---------------------------3’

Oligonukleotid: BA-R 3’----AATTTGGCTCATTAACAATATAGTTATT5’

Slika 17: Nukleotidno zaporedje pri haplotipu B in BA, ter začetna oligonukleotida z

modificiranim nukleotidnim mestom in mestom restrikcije z restrikcijskim encimom Dra I.

Črtice pomenijo indentičnost nukletidnega zaporedja obeh haplotipov.


38

S to analizo smo testirali vse vzorce haplotipa B. Za pozitivne in negativne kontrole smo

uporabljali PCR produkte vzorcev, katerih haplotipe smo poznali iz sekvenčne analize.

Restrikcijski encim DraI na mtDNA fragmentu (BA-F/BA-R) prepozna nukleotidno

zaporedje TTTAAA na dveh mestih, na prvem kontrolnem mestu reže DNA fragment pri

vseh haplotipih. Na drugem restrikcijskem mestu pa je encim DraI rezal le v primeru,

kadar je šlo za nukleotidno varianto, značilno za haplotip BA. Velikost rezanih fragmentov

pri haplotipu BA smo ocenili na 70 in 30bp, pri vseh ostalih haplotipih pa na 100 in 30bp.

Mutacijsko mesto pri haplotipu BA na 7a mestu odgovarja nukleotidnemu zaporedju, ki ga

prepozna encim DraI in na tem mestu reže fragment. V tem primeru reže encim DraI DNA

fragmente, ki pripadajo haplotipu BA, na dveh mestih, vse ostale pa samo na kontrolnem

mestu.

Slika 18: Restrikcijska analiza vzorcev haplotipa B in BA z restrikcijskim encimom DraI.

Proga 1 je velikostni standard 100 bp, progi 2 in 4 sta vzorca, ki pripadata haplotipu

B,vzorec na progi 3 pripada haplotipu BA, proga 5 je PCR produkt brez encima DraI.

M B M B B BAA B + B +

130 bp130 bp

100 bp100 bp

70 bp70 bp

30 bp30 bp

100 bp100 bp

1 2 3 4 5


39

Tabela 9: Matrika primarnih sekvenčnih divergenc, izraženih v odstotkih.

At.los Soš p DonB DonA DonBa DonKr Atl.p Oh

At.los

Soš p 0.638

DonB 0.664 0.119

DonA 0.693 0.144 0.024

DonBa 0.638 0.143 0.024 0.048

DonKr 0.692 0.144 0.024 0.024 0.048

Atl.p 0.691 0.119 0.119 0.144 0.143 0.144

Oh 0.677 0.033 0.132 0.165 0.165 0.165 0.065

Tabela 10: Različne metode dela in haplotipi, ki smo jih dokazali z navedenimi metodami

Metode Sekvenciranje Restrikcijska analiza SSCP-PCR HSO-PCR

Haplotipi SmaI, AvaI, AluI, MunI DdeI DraI

A X X X

B X X

BA X X

BKr X X X

C X X X

D X X X

Namen določanja haplotipov z različnimi metodami dela je bil predvsem ta, da smo se

izognili sekvenciranju kot dragi in zamudni metodi in da smo z različnimi metodami

potrdili dobljene rezultate.


40

Tabela 11: Variabilnost haplotipov pri različnih tipih postrvi

Haplotipi

Tip postrvi D A B BA BKr C E

Soška postrv X

Potočna postrv X X X X X

Morska postrv X

Jezerska postrv X X

Križanci X X X X

Haplotip D je značilen izključno za soško postrv. Najdemo ga pa tudi pri križancih s

potočno postrvjo. Haplotipi A, B, BA in BKr so značilni za donavski tip potočne postrvi,

haplotip C smo našli pri ribogojniškem tipu potočne postrvi, ki je v glavnem atlantskega

porekla. Morska postrv do sedaj ni bila taksonomsko opredeljena. Po naših analizah jo

lahko uvrstimo v vrsto Salmo trutta, za njo je značilen C haplotip. Za postrv iz Blejskega

jezera je značilen haplotip B, kar pomeni, da pripada donavskemu tipu potočnih postrvi in

je zaradi okolja, v katerem živi pridobila značilen fenotip jezerske postrvi. Haplotip E je

značilen za ohridrsko postrv, ki pripada jadranskemu tipu postrvi.

4.1.7 Molekularna ura

Na osnovi genetskih razdalj je po modelu molekularne ure mogoče med določenimi

populacijami računati čas njihove medsebojne divergence. To izračunavanje temelji na

Neievi formuli t = kD, kjer je t čas divergence, D je genetska razdalja in k je konstanta oz.

koeficient proporcionalnosti med t in D in pomeni hitrost nastajanja mutacij. Pri tem

izračunavanju je seveda najbolj problematična konstanta k, ki jo brez oprejemljivih opornih

točk iz preteklosti (organske izkopanine, fosili) zelo težko natančno določiti. V takih

primerih k ocenjujejo posredno preko literaturnih virov, ki so na voljo za podobne

organizme. Konstanta k pri ribah znaša od 2 do 6 107.


41

Sorodstvene odnose med sedmimi haplotipi smo predstavili z drevesom, narejenim po

metodi Maximum likelihood (Slika ), pri kareri smo za zunanjo skupino izbrali atlantskega

lososa (Salmo salar), ki se je izkazal kot filogenetsko dosti ločena linija.

Slika 19: Maximum likelihood kladogram prikazuje sorodstvene odnose med sedmimi

haplotipi kontrolne regije mtDNA pri postrveh. Številke ob vejitvah predstavljajo

procentne vrednosti pojavljanja vejitve od 10000 korakov.

Iz kladograma je razvidno, da se je soška postrv razvila drugje kot skupina potočnih

postrvi donavskega tipa kljub temu, da so geografsko blizu. Po drugi strani pa je razvidno,

da so se vsi osnovni haplotipi (D, A/B, C in E) razvili kot samostojne evolucijske veje

približno istočasno. Glede na molekularno uro se je to verjetno zgodilo v začetku

BB

AA

BBAA

BBKrKr

DD

CC

EE

0.1

S. salar


42

Pleistocena, približno dva milijona let nazaj, ko so se populacije med seboj ločevale zaradi

geografskih sprememb.

Melkič, E. Variabilnost nukleotidnih zaporedij kontrolne regije mitohondrijske DNA pri Salmo trutta. Dipl. nal., Domžale, BF, Odd. za zootehniko, 2000

43

5 DISKUSIJA

Osnovni namen opravljene raziskave je bil oceniti genetsko variabilnost postrvi v Sloveniji

in poiskati genetske označevalce, s katerimi bo mogoče razlikovati med avtohtonimi in

vnesenimi populacijami ter med domačimi populacijami iz različnih porečij. Na osnovi

zastopanosti haplotipov v severnem, srednjem in južnem delu Slovenije smo ocenili

populacijsko strukturo postrvi v Sloveniji. Na podlagi nukleotidnih razlik v kontrolni regiji

mtDNA smo pri preučevanih populacijah postrvi ovrednotili njihove medsebojne

filogenetske odnose. Temu cilju je bil podrejen tudi primarni koncept zbiranja vzorcev, ki

izvirajo iz geografsko ločenih populacij, tako da smo zajeli čim več notranjega

polimorfizma, ki ga sicer znotraj posamezne lokacije težko pričakujemo.

5.1 Mitohondrijska DNA

Pri sekvenciranju mtDNA smo našli osemnajst variabilnih nukleotidnih mest znotraj

prvega dela kontrolne regije, ki je bil dolg približno 500 bp. Haplotip D je genetski marker,

ki označuje populacijo soške postrvi v Sloveniji. Našli smo ga pri populacijah soške

postrvi, ki živijo v Tolminki, Soči, Trebuščici, Zadlaščici in Predilci. Izmed teh mest mest

sta dve, ki sta prav posebno značilni za haplotip D in sicer inverzija nukleotidnega para A-

T na četrtem variabilnem mestu in na dvanajstem mestu transverzija nukleotidnega para A-

T. Bernatchez in sod. (1992) so našli poleg omenjenega haplotipa še njegovo rahlo

spremenjeno različico v rekah severne Italije: Toce in Pellice. Ta genetska različica ima

dodatno tranzicijo na 6. mestu, ki je pri naših populacijah nismo odkrili. Kljub majhnim

razlikam v nukleotidnem zaporedju obstajajo skupne značilnosti za to skupino haplotipov,

kar kaže na to, da so današnje populacije soške postrvi nekoč imele skupnega prednika, ki

je verjetno živel že pred geološkimi spremembami, ki so geografsko ločile današnje

populacije soške postrvi. Glede na dokaj enostavno dokazovanje tega haplotipa bi lahko

naredili še več za samo vedenje o razširjenosti in obenem o eventuelni ogroženosti soške

postrvi pri nas v Sloveniji. Kljub temu, da imajo vse populacije soške postrvi v Sloveniji

enoten mtDNA haplotip, se znotraj soške postrvi pojavljata dve fenotipski različici. Za


44

populacije iz porečja Idrijce je značilna rdeča pigmentacija, po kateri se razlikujejo od

ostalih populacij soške postrvi iz Zadlaščice in drugih gornjih pritokov reke Soče. Glede na

to, da smo v reki Trebuščici (porečje Idrijce) našli le haplotip D, ki je značilen samo za

soško postrv, lahko predvidevamo, da ne gre za novodobne križance med soško in potočno

postrvjo, ampak za čisto soško postrv. Presenetljivo je odkritje haplotipa D pri dveh

vzorcih blizu izvira reke Krke s fenotipskimi značilnostmi potočne postrvi. Analiza

mikrosatelitne DNA je pokazala, da je pri 11 od skupno 36 vzorcev, ki smo jih analizirali

iz reke Krke, na mikrosatelitnih lokusih BFRO001, BFRO002 in BFRO003 alele 202/210

na BFRO001, 116/124 na BFRO002 in 124 na lokusu BFRO003, ki so značilne le za soško

postrv (Snoj, 1999). Z restrikcijsko analizo in sekvenciranjem dela kontrolne regije

mtDNA smo pri obeh najdenih vzorcih postrvi našli tudi haplotip D, ki je značilen za soško

postrv, kar pomeni, da sta bila vzorca najverjetneje križanca med soško in potočno

postrvjo. Na tem primeru vidimo, da z vnosom neavtohtonih linij povzročamo nastanek

križancev, ki jih je večinoma težko genetsko opredeliti. Eden od načinov, kako bi lahko

ohranili čisto soško postrv, je kontinuiran vnos čiste soške postrvi v pritoke rek, kjer so

soške postrvi živele od nekdaj in z izlovom potočne postrvi iz teh rek. Na takšen način bi

zmanjšali število križancev med potočno in soško postrvjo in povečali verjetnost, da bi se

soške postrvi parile le med seboj. Dosedanja vlaganja soške postrvi v reko Sočo so že

pokazala pozitivne rezultate. Očitno je zaradi boljšega razmerja v korist soške postrvi le-ta

začela izpodrivati potočno postrv, saj obstaja hipoteza, da se soške postrvi veliko bolje

počutijo v velikih vodah kot potočne postrvi.

Prav tako zanimiva oblika markerja je za haplotip C, ki je specifičen za populacije postrvi

atlantskega tipa in je v naših vodah značilen za vnešene populacije. Haplotip C se po svoji

sekvenci na navedenem fragmentu razlikuje od ostalih haplotipov po tem, da ima na mestu

15a nukleotidni par C-G, ostali haplotipi pa imajo na istem mestu tranzicijo in sicer

nukleotidni par T-A, na mestu 16 pa ima haplotip C nukleotidni par T-A, vsi ostali

haplotipi imajo tranzicijo v nukleotidni par C-G. Bernatchez in sod. (1992) so našli dve

rahlo spremenjeni obliki tega haplotipa, ki se razlikujeta po dveh tranzicijah na 8. in 9.

variabilnem mestu in so jih našli pri vzorcih iz atlantskega porečja na Poljskem,

Norveškem, Švedskem, Češkem, v Švici, Franciji in v Nemčiji.


45

Bernatchez in Osinov (1995) sta na območju Rusije in zahodne Azije našla še tretjo

varianto, značilno za atlantski tip potočne postrvi, ki se od prvih dveh razlikuje le po RFLP

vzorcu kaže pa enake lastnosti na petih diagnostičnih mestih, ki so sicer značilna le za

skupino postrvi atlantskega tipa. Zanimivo je, da sta sekvenčna in restrikcijska analiza treh

vzorcev iz potoka Blanščica, ki se izliva v reko Savo pri Sevnici, pokazali, da dva od treh

vzorcev pripadata haplotipu C (glej prilogo:4.1.4 A). To relativizira predpostavko, da je

haplotip C značilen le za atlantsko populacijo postrvi. Enak primer smo odkrili tudi v

potoku Iška in v reki Mahnečici. Da gre za haplotip C, ki ni atlantskega izvora, kaže

dejstvo, da v teh potokih ni bilo nikakršnih vlaganj s strani ribiških družin ali Zavoda za

ribištvo. Ribe, ki smo jih analizirali, smo ujeli v območju blizu izvirov, kjer je zaradi

številnih naravnih preprek migracija rib proti toku navzgor preprečena, na Blanščici celo

za ribogojnico. V pogovoru z lastnikom te ribogojnice smo, izvedeli, da na tem področju ni

bilo nikakršnih vlaganj, sam pa je začel z vzrejo postrvi iz populacije, ki izvira iz

Blanščice.

Zelo opazne so tudi fenotipske razlike med mladicami starimi eno leto, ki smo jih

primerjali med ribami haplotipa C iz Blanščice in ribami iz drugih rek, za katere smo

menili, da gre za atlantski tip potočne postrvi. Mladice iz ribogojnice “Pajk” na Blanščici

že pred starostjo enega leta dobijo izrazite rdeče in črne pike obrobljene s svetlimi robovi,

barva telesa pa je temno olivna s svetlim trebuhom. Ribje mladice iz ribogojnice Povodje

pa so precej svetlejše barve in fenotipsko spominjajo na jezerski tip potočne postrvi.

Haplotipa C nismo našli v rekah Predilica, Zadlaščica in Trebuščica, za katere je značilen

le haplotip D; prav tako haplotipa C nismo našli v rekah Kozji jarek, Ribnica in Sovpot,

kjer prevladujeta haplotipa B in BA, ki sta značilna za donavski tip potočne postrvi. V vseh

ostalih lokacijah, iz katerih smo zbrali vzorce, smo našli haplotip C. Iz zastopanosti

haplotipa C lahko približno ocenimo obseg vlaganja neavtohtonih populacij postrvi.

Zanimivo bi bilo pregledati tudi drugi del kontrolne regije mtDNA in ugotoviti, ali morda

obstajajo kakršne koli razlike v nukleotidnem zaporedju med atlantskim tipom potočne

postrvi in postrvmi, ki pripadajo istemu haplotipu, za katere menimo, da so avtohtonega

izvora. Haplotip C je prav tako značilen za morsko postrv. Njena homologijana na istem

delu kontrolne regije mtDNA, se je 100% ujemala s homologijo potočne postrvi


46

atlantskega porekla in je odstopala za približno 10% od homologije atlantskega lososa in

morskega tipa Šarenke, na tem delu kontrolne regije mtDNA.

Največji delež od vseh genetskih variant pripada donavskemu tipu postrvi, ki je v naših

vodah zastopan s štirimi genetskimi variantami. Do sedaj sta bili determinirani le dve

različici donavskega tipa, v zahodnem in srednjem delu Evrope in sicer haplotip B in

haplotip A. Oba haplotipa sta se razlikovala od ostalih po tranzicijah na nukleotidnih

mestih 1, 2 in 3 in sicer z nukleotidnimi pari; C-G, A-T in C-G, med seboj pa sta se

razlikovala po še eni tranziciji na 9. variabilnem mestu, tako da je genetski marker za

haplotip B imel na tem mestu nukleotidni par T-A, tako kot vsi ostali haplotipi, marker za

haplotip A pa nukleotidni par G-C. Haplotip B je bil zastopan v mnogih populacijah, ki

smo jih analizirali, nismo ga našli le v Predilci, Trebuščici in Zadlaščici, ki veljajo za reke,

v katerih živi le soška postrv. Haplotipa A prav tako nismo našli v navedenih rekah, kot

tudi ne v Ribnici, Sovpotu in Mahnečici. Možen razlog za odsotnost haplotipa A v teh

rekah je, da so bili ti potoki že od davne preteklosti izolirani od ostalih donavskih pritokov.

Poleg tega so to majhni pritoki z velikimi nihanji v vodostaju ter z naravnimi preprekami,

ki preprečujejo migracijo rib proti toku in kot taki predstavljajo biotop, ki je zelo podvržen

efektu ozkega grla (angl. bottleneck effect). Naključni tok alelov v takšnih majhnih

populacijah privede do fiksacije enega in izgube ostalih haplotipov. Haplotip B je značilen

za tri analizirana vzorca jezerske postrvi, katere na osnovi rezultatov kontrolne regije

mtDNA lahko uvrstimo v skupino potočnih postrvi donavskega tipa. Značilen fenotip pa je

jezerska postrv razvila glede na okolje v katerem živi.

Tretjo varianto donavskega tipa potočne postrvi označuje genetski marker, ki se od vseh

ostalih haplotipov, vključno z A in B, razlikuje z nukleotidno varianto T-A na devetem

variabilnem mestu in označuje novo varianto donavskega tipa, ki do sedaj še ni bila

opisana. Poimenovali smo jo po kraju, kjer smo našli vzorec s tem haplotipom (reka Krka

pri domačiji Javornik). Zato smo jo označili kot haplotip BKr, pri čemer se indeks “Kr”

nanaša na Krko. Frekvenca tega haplotipa je bila zelo majhna, saj smo od 36 vzorcev s tega

kraja odkrili le dva primerka s haplotipom BKr.


47

Četrta varianta donavskega tipa potočne postrvi je haplotip, ki prav tako še ni bil opisan.

Ima tranzicijo na mestu 7a in sicer nukleotidni par T-A. Vse ostale genetske variante imajo

na tem mestu nukleotidni par C-G. Na vseh ostalih nukleotidno-variabilnih mestih pa se

ujema z genetsko varianto B donavskega tipa potočne postrvi. Ta haplotip smo najprej

odkrili v potoku Sovpot, nato pa še v potokih Ribnica, Kozji jarek, v reki Soči in v Krki.

Označili smo ga kot haplotip BA, po adeninu, po katerem se ta haplotip loči od ostalih

donavskih skupin.

O veliki variabilnosti nukleotidnega zaporedja kontrolne regije mtDNA pri donavskemu

tipu potočne postrvi sta poročala v svojih raziskavah Bernatchez in Osinov (1995), ki sta

na področju nekaterih jezer v Rusiji in zahodni Aziji našla poleg do tedaj znanih dveh

haplotipov A in B, še devetnajst novih variant, ki so na mtDNA fragmentu dolgem 310 bp,

oziroma na dvanajstih variabilnih mestih znotraj tega fragmenta, kazali enako stanje na

vseh diagnostičnih mestih, ki so značilna za skupino haplotipa B. Nova haplotipa BA in

BKr, ki smo ju odkrili pri nas, se ne ujemata z nobenim od haplotipov, ki sta jih opisala

Bernatchez in Osinov, temveč predstavljata dva popolnoma nova genetska markerja,

značilna za populacije potočne postrvi v Sloveniji. Razlog za tako veliko variabilnost

nukleotidnega zaporedja kontrolne regije mtDNA pri donavskemu tipu potočne postrvi bi

bil lahko velika odprtost donavskega porečja in možnost velikega števila migracij. V

takšnih okoliščinah naključni tok genov, zaradi odsotnosti ozkega grla, ne pripelje do

fiksacije enega izmed alelov, ki naj bi bil značilen za takšno populacijo.

5.2 Paleontološke razprave o prihodu postrvi v naše kraje

Relief današnjega ozemlja Slovenije je začel nastajati šele takrat, ko je kopna zemlja v

našem predelu pogledala iz morja. Površje Slovenije je postalo kopno šele v najmlajšem

delu zemeljske zgodovine, v tako imenovanem zemeljskem novem veku, ki ga geologi

imenujejo terciar. Res je sicer, da so posamezni kosi našega ozemlja tudi že poprej večkrat

pogledali iz morja, o čemer pričajo suhozemske kamnine mezozojske in paleozojske

starosti. A vselej je znova prevladalo morje, ki je dasi s presledki, prevladovalo skozi ves


48

zemeljski srednji vek, kenozoik, ko je vso južno Evropo in južno Azijo prekrivalo morje

Tetys (Melik, 1963).

V mlajšem terciarju, predvsem v pliocenu, se je v glavnem izoblikoval naš dosedanji relief.

Takrat je vladalo povečini tudi pri nas toplejše podnebje, podobno, kot ga imajo danes v

tropskih ali vsaj v subtropskih predelih, kakor sklepajo paleontologi (Rakovec, 1975). Po

nekaterih fosilnih ostankih okostij postrvi, ki so jih našli na Sveti Nedjelji pri Samoboru na

Hrvaškem, so ugotovili, da je rod Salmo, živel v Paratetysu že v starejšem pliocenu

(Anđelković, 1989). S postopnim umikanjem Paratetysa proti jugo-vzhodu so verjetno

nekatere populacije postrvi ostale v večini tedanjih rek na področju današnje Slovenije.

Slika 20: Paleogeografska karta Evrope za srednji miocen.


49

Slika 21: Alpsko-dinarsko kopno in Jadransko ter Panonsko morje v starejšem pliocenu.

V tistem času so postrvi donavskega tipa predstavljale verjetno genetsko polimorfno

populacijo rib, ki je naseljevala takratno področje Slovenije in v tedanji populaciji ni

prihajalo do fiksacij genov, ki bi bili značilni za določeno populacijo. Z umikom

Panonskega morja se je ta ista populacija obdržala v rekah takratnega donavskega porečja

in nekateri deli populacije so zaradi pogostih sprememb v rečnih sistemih ostali geografsko

izolirani od glavnih tokov; posebno še takrat, ko so se v spodnjih tokovih rek izoblikovale

naravne bariere, ki so preprečevale migracije rib proti toku. Tako so populacije postrvi, ki

so bile omejene na majhne življenjske prostore, bile podvržene naključnemu toku genov, ki

slej ko prej pripelje do fiksacije enega izmed alelov. Posledica tega je haplotipsko enotna

populacija postrvi. Po drugi strani pa se veča variabilnost haplotipov med ločenimi

populacijami znotraj donavskega porečja.

Izvor soške postrvi v porečju severnega Jadrana naj bi bil precej drugačen. Ta populacija

postrvi naj bi prišla po Jadranskem morju v poznem pleistocenu po reki Pad, ki se je v

zadnji veliki ledeni dobi izlivala v Jadransko morje pri Zadru na Hrvaškem.


50

Slika 22: Jadransko morje v dobi pleistocenske poledenitve (Melik, 1963).

Prvotna domovina soške postrvi je vprašljiva, ker zaenkrat še nikjer niso našli nobene

populacije postrvi, ki bi bila filogenetsko najbližje soški postrvi. Obstaja možnost, da soška

postrv izvira z območja Balkana, ki v svojem jadranskemu porečju še dandanes predstavlja

naselitveno območje “Glavatice”, kot tam imenujejo soško postrv. Žal zaenkrat iz literature

še ni podatkov o filogeografskemu statusu tamkajšnjih populacij postrvi, naši prelinearni

rezultati pa kažejo na izrazito sorodnost soške postrvi in različnih populacij postrvi iz

Balkansko-Jadranskega področja. Na ta način bi lahko razložili zakaj je soška postrv

filogenetsko bližje jadranskemu tipu postrvi kot pa donavskemu. Genetska distanca med

soško postrvjo in donavskim tipom je 1.19-1.44%, med soško in ohridsko postrvjo, ki

pripada jadranskemu tipu, pa le 0.33%. Današnji izgled in značilnosti soške postrvi, kot so

velikost, hitra rast in napadalnost, kaže na to, da je bila ta vrsta verjetno sposobna življenja

v morju ter zaradi te sposobnosti tudi velikih migracij. Naselitev soške postrvi v severno

jadransko porečje je bila najbrž hitra in se je zgodila naenkrat. Zelo verjetno se je to

zgodilo v obdobju zadnjega würma oziroma takoj po tem obdobju, ko je bil del Slovenije

pokrit z večnim ledom (Melik, 1963). V obdobju zadnjega würma je južna meja večnega


51

ledu segala do Sv. Lucije oziroma do izliva reke Idrijce in Trebuščice v Sočo (Pohar,

1994). Večni led, ki se je zadrževal na tem področju, je “očistil” zgornji tok reke Soče in

vse njene pritoke vsakršnega vodnega življenja v njej. Tako je po otoplitvi in umiku meje

večnega ledu v višje predele Alp te reke naselila soška postrv in se kot genetsko homogena

populacija ohranila do začetka tega stoletja, nakar je prišlo do križanja s potočno postrvjo,

ki so jo v Sočo kontinuirano vlagali več kot pol stoletja.

Slika 23: Topografska karta, ki prikazuje mejo večnega ledu na področju Slovenije v

obdobju tretjega würma (WIII).

Tedanja meja večnega ledu, ki je segala do izliva Trebuščice in Idrijce v Sočo, je verjetno

pokazatelj, da se je naselitev soške postrvi v porečje reke Soče zgodila naenkrat. V prid tej

teoriji govori dejstvo, da se soška postrv iz Trebuščice fenotipsko razlikuje od soške

postrvi iz zgornjih tokov reke Soče po tem, da ima po telesu rdeče pike, ki so značilnost

potočne postrvi. Tudi analiza mikrosatelitne DNA (Snoj, 1997) je pokazala, da imajo soške

postrvi iz Trebuščice in potočne postrvi določene skupne značilnosti. Tako so na lokusu

BFRO003 pri postrvi iz Trebuščice poleg alelov značilnih za soško postrv, našli tudi alel

146, ki je sicer značilen za potočno postrv. Te alelne variante pa niso našli pri nobeni drugi

populaciji soških postrvi, ki so po analizi mtDNA kazale haplotip D.Ker pa so alel 146

našli tako pri potočni kot pri soški postrvi, lahko sklepamo, da nima neposrednega vpliva


52

Rdeče pike po telesu in alelna varianta, ki smo jo opisali na lokusu BFRO003, kažeta na

verjetnost, da sta bili reki Idrijca in Trebuščica ob prihodu soške postrvi v te kraje naseljeni

s potočno postrvjo, ki se je ob zaledenitvi zgornjih tokov reke Soče obdržala v Idrijci in

Trebuščici. Ob kolonizaciji tega območja s soško postrvjo je prišlo do izmenjave

genetskega materiala, ki ga je soška postrv prevzela od potočne. Soška postrv je verjetno

bila številčnejša in je postopno izpodrinila potočno, vendar je kot kaže, prevzela določen

genetski delež potočne postrvi, tako da se danes kaže kot starodaven križanec med soško in

potočno postrvjo. V zgornje tokove in pritoke reke Soče se je soška postrv naselila takoj po

zadnji največji zaledenitvi pred približno dvajseti tisoči leti, ko je bila tedanja povprečna

letna temperatura podobna današnjim arktičnim ali vsaj subarktičnim razmeram. Verjeten

dokaz za to, da se soška postrv ni zadrževala v spodnjih tokovih reke Soče je ta, da soške

postrvi v zgornjih pritokih reke Soče nimajo rdečih pik in pri tistih ribah, ki smo jih

analizirali nismo našli niti enega primera z alelno varianto 146 na opisanem lokusu, kar

pomeni, da se soška postrv ob svojem vdoru v porečje reke Soče ni zadrževala v spodnjih

pritokih, kjer se je obdržala potočna postrv, tako da ni prišlo do izmenjave genetskega

materiala med njima.


53

Slika 24: Gibanje povprečnih letnih temperatur v dobi pleistocena: A-višek glaciala, B-

subarktično podnebje, C-borealno podnebje, D-zmerno podnebje. Številke od 0 do 70, na

desni strani tabele pomenijo leta krat tisoč.

Vzorci morske postrvi, ki smo jih dobili, so bili ujeti v slovenskem delu Jadranskega

morja. Fenotipsko so se te postrvi precej razlikovale od ostalih tipov potočnih postrvi.

Osnovna barva telesa morske postrvi je bila srebrna s svetlejšim spodnjim delom trebuha,

brez rdečih pik in s črnimi lisami v obliki križcev. Nekateri so mnenja, da je Jadranska

postrv že izumrla in da so redki najdeni primerki ribe, ki so ušle iz ribogojnic in se po

naključju znašle v morju. Nekateri vzorci, ki smo jih dobili, so bili brez prsnih plavuti, kar

lahko nakazuje, da so te ribe pobegnile iz ribogojnice. Kot so pokazali rezultati mtDNA,

lahko to populacijo rib zagotovo uvrstimo v vrsto Salmo trutta.


54

6 POVZETEK

Področje Slovenije naseljuje več tipov postrvi, nekatere med njimi so endemiti tako

jadranskega oz. donavskega porečja, čigar del so reke v Sloveniji. Soška postrv živi v

jadranskem porečju in se je v porečju reke Soče razvila dve fenotipski obliki, ki sta danes

močno ogroženi zaradi načrtnega vlaganja potočne postrvi v reko Sočo od začetka

prejšnjega stoletja. Soška in potočna postrv se križata in njuni potomci so plodni. Zato

čisto soško postrv danes najdemo le v predelih nekaterih manjših pritokov, kjer ni bilo

vlaganja potočne postrvi in kjer so naravne bariere preprečevale migracijo rib proti toku. Ti

genetsko čisti primerki soške postrvi danes predstavljajo dragocen vir za program

repopulacije soške postrvi, ki temelji na ribogojniški vzreji genetsko čistih plemenskih rib

ter na postopnem vlaganjem njihovih potomcev v soško porečje. Drugi tip je potočna

postrv, ki je na tako majhnem področju v geografsko izoliranih okoljih razvila številne

genetske variante, med katerimi so nekatere značilne le za pritoke donavskega porečja

znotraj Slovenije.

Zaradi povečanja potreb športnega ribolova v večino naših rek vlagamo komercialne linije

potočne postrvi, ki so prirejene vzreji v ribogojnicah in so zaradi tega tudi zanimivejše z

ekonomskega stališča. Te komercialne linije atlantskega tipa potočne postrvi danes

predstavljajo resno grožnjo našim avtohtonim populacijam, saj jih uspešno izpodrivajo iz

njihovega življenjskega okolja in zaradi križanja med njimi resno ogrožajo genetsko

identiteto avtohtonih populacij. Zato je bil naš namen preučiti avtohtone populacije postrvi

z molekularno genetskega vidika in poiskati genetske označevalce, s katerimi bi uspešno

ločili med vnesenimi in avtohtonimi populacijami postrvi ter med avtohtonimi

populacijami, ki izvirajo iz geografsko ločenih okolij. V našo raziskavo smo vključili

primerke vseh tipov postrvi iz različnih geografsko ločenih porečij. Osredotočili smo se na

kontrolno regijo mtDNA, ki je hipervariabilna in predstavlja odličen objekt za preučevanje

filogenetskih odnosov med različnimi tipi postrvi. Znotraj kontrolne regije mtDNA smo

našli dve novi nukleotidni varianti, ki do sedaj nista bili opisani in sta značilni le za

populacije donavskega tipa potočnih postrvi v Sloveniji (haplotipa BA in BKr). Z ostalimi

nukleotidnimi variantami pa smo nedvoumno lahko opredelili soško postrv (genotp D),


55

atlantski tip potočne postrvi (haplotip C) ter ostale tipe donavske potočne postrvi

(haplotipa; A, B). V nekaterih primerih smo se oprli na rezultate analiz mikrosatelitne DNA

(A. Snoj, 1997), ki so nam prav tako pomagali pri interpretaciji rezultatov. Zaradi

enostavnih metod s katerimi smo delali, ocenjujemo, da je mtDNA kot genetski marker

primerna za spremljanje populacijske strukture in ugotavljanje filogenetskih odnosov med

vsemi populacijami postrvi, ki naseljujejo področje Slovenije ter verjetno tudi v ostalih

naselitvenih območjih potočnih in soških postrvi. Tehnična izvedba tipiziranja z omenjenim

markerjem je relativno preprosta, hitra ter omogoča testiranje velikega števila vzorcev.

Potreben material je sveža kri, ki jo potrebujemo vsaj 10 µl za uspešno izolacijo mtDNA,

riba pa po odvzemu krvi ostane nepoškodovana. V nekaterih primerih smo uspešno izolirali

mtDNA iz zamrznjenega tkiva poginulih rib, ki so bile shranjene pri temperaturi −20°C. S

tem markerjem smo ovrednotili filogenetske odnose med soško postrvjo ter med vsemi

ostalimi tipi potočnih postrvi, ki zastopajo trenutno prisotne populacije postrvi v Sloveniji.

Glede na geološka dogajanja v pliocenu in pleistoenu smo opisali razlago poselitve potočne

postrvi v Sloveniji ter prihod soške postrvi po zadnji veliki ledeni dobi (WIII), v

pleistocenu pred približno 20 000 leti. Genetska divergenca med soško postrvjo in ostalimi

tipi potočnih postrvi znaša od 1.2 do 1.4 %, kar pomeni, da so vsi ti tipi različne oblike

vrste Salmo trutta, ki izhajajo iz skupnega prednika pred približno enim milijonom let. V

tem obdobju pa vse do pred približno 250 000 leti so nastajale nove genetske variante

zaradi geografske izoliranosti in vpliva ozkega grla, ki je pri ribjih populacijah, živečih v

omejenem okolju, zelo verjeten.


56

7 ZAHVALA

Iskreno se zahvaljujem svojemu mentorju prof. dr. Petru Dovču za vsestransko pomoč in

koristne nasvete pri delu. Hvala vsem mojim sodelavkam Vidi, Tatjani, Maruši, Simoni,

Tamari M. B., Magdi, Tini in Tamari J za pomoč pri delu in za prijetna druženja. Prav

posebna zahvala gre mojemu somentorju asistentu dr. Alešu Snoju, ki je pokazal vse

lastnosti dobrega mentorja in prijatelja.

Najlepša hvala Špeli in Simonu z Zavoda za ribištvo Republike Slovenije za dobro voljo in

pomoč pri zbiranju vzorcev na terenu.

Mojim kolegicam in kolegom Patriciji, Mojci, Alešu in ostalim se zahvaljujem za

nepozabna študentska leta.

Hvala mojim staršem, sestri in bratu za ljubezen, potrpežljivost in vso pomoč.

Hvala tudi moji drugi družini teti Marijani in Uti za dom in prijateljstvo.

Enako hvala vsem mojim prijateljem in znancem, ki so me spodbujali pri delu.


57

8 PRILOGE

Priloga 4.1.4 A: Pregled vzorčenih populacij s številom vzorcev ter pripadajoči haplotip

Haplotipi Lokacija

A B BKr BA C D E Potočna p. Iška I1 X I3 X I4 X I5 X I6 X I7 X I8 X I13 X Mahnečica M1 X M2 X M3 X M4 X M5 X M11 X M12 X M13 X M14 X M15 - M16 X M17 X M18 X M19 ? Cerknišnica Cer 1 X Temenica Tem. X Stiški potok S X


58

nadaljevanje

Haplotipi Lokacija

A B BKr BA C D E Krka Javornikov j. J1 X J2 X J3 X J4 X J5 X J6 X J7 X J8 X J9 X J10 X J11 X J12 X K. P.(IZVIR) KP1 X KP2 X KP3 X KP4 X KP5 X KP6 X KP7 X KP8 X Podbukovje PB1 X PB2 X PB3 X PB4 X PB5 X PB6 X PB7 X PB8 X PB9 X PB10 X PB11 X PB12 X PB13 X PB14 X PB15 X

nadaljevanje


59

nadaljevanje

Haplotipi Lokacija

A B BKr BA C D E

Sovpot Sov. 1 X Sov. 2 X Sov. 3 X Sov. 4 X Sov. 5 X Sov. 6 X Sov. 7 X Sov. 8 X Sov. 9 X Sov. 10 X Sov. 11 X Sov. 12 X Sov. 13 X Sov. 14 X Sov. 15 X Sov. 16 X Sov. 17 X Sov. 18 X Sov. 19 X Sov. 20 X Sov. 21 X Sov. 22 Ribnica Rib. 1 X Rib. 2 X Rib. 3 X Rib. 4 X Rib. 5 X Rib. 6 X Rib. 7 X Rib. 8 X Rib. 9 X Rib. 10 X Rib. 11 X Rib. 12 X Rib. 13 X Rib. 14 X Rib. 15 X Rib. 16 X Rib. 17 X Rib. 18 X

nadaljevanje


60

nadaljevanje

Haplotip Lokacija

A B BKr BA C D E

Rib. 19 X Rib. 20 X Rib. 21 X Kozji j. K.J. 1 X K.J. 2 X K.J. 3 X K.J. 4 X K.J. 5 X K.J. 6 X K.J. 7 X Humski p. HP 1 X HP 2 X Obrh Ob1 X Ob2 X Ob3 X Ob4 X OB1 II X OB2 II ($) X OB3 II X OB4 II X OB5 II X OB6 II X OB7 II X OB8 II (@) X OB9 II X OB10 II morska S.t.t. M1 X S.t.t. B1 X S.t.t. B2 X S.t.t. B3 X S.t.t. B5 X S.t.t. B6 X S.t.t. B7 X S.t.t. B8 X

nadaljevanje


61

nadaljevanje

Haplotip Lokacija

A B BKr BA C D E

Povodje Pov 1 X Pov 2 X Pov 3 X 1 Pov X 2 Pov X 3 Pov X 4 Pov X 5 Pov X 6 Pov X 7 Pov X 8 Pov X 9 Pov X 10 Pov X 11 Pov X Pajk Pj1 X Pj2 X Pj3 X Križanci Tolmin. x1 X x2 X x3 X x4 X x5 X x6 X x7 X x8 X x9 X x10 X x11 X Soča y1 X y2 X y3 X y4 X y5 X y6 X y7 X y8 X y9 X y10 X

nadaljevanje


62

nadaljevanje

Haplotip Lokacija

A B BKr BA C D E

Soška p. Treb T1 X T2 X T6 X T9 X T10 X T20 X T21 X T22 X T23 X T24 X T25 X 2166 X 2003 X 2106 X 2164 X 2065 X 2174 X 2142 X 2031 X Zadl Z3 X Z4 X Z5 X Z7 X Z8 X Z11 X Z12 X Z13 X Z14 X Z15 X Z16 X Z17 X Z18 X Z19 X Z26 X Z27 X Z28 X 2126 X

nadaljevanje


63

nadaljevanje

Haplotipi Lokacija

A B BKr BA C D E

2006 X 2167 X 2028 X 2160 X 2096 X 2046 X 2027 X 2176 X 2122 X 2093 X 2158 X 2155 X 2123 X 2133 X 2001 X 2026 X 2089 X 2112 X 2141 X 2162 X 2072 X 2137 X 2049 X 2129 X 2048 X 2115 X 2033 X

nadaljevanje


64

nadaljevanje

Haplotipi Lokacija

A B BKr BA C D E

Predelica P1 X P2 X P3 X P4 X P5 X P6 X P7 X P8 X P9 X P10 X P11 X P12 X P13 X P14 X P15 X P16 X P17 X P18 X P19 X P20 X P21 X P22 X Ohrid F X ne F X


65

9 REFERENCE

Alberts, B./ Bray, D./ Lewis, J./ Raff, M./ Roberts, K./ Watson, J.D. Molecular biology of the cell. New York, Gerland Publishing, 1994, s. 704-716.

Anđelković, J.S. Tertiary fishes of Yugoslavia, a stratigraphic-paleontologic- paleoecological study. Zagreb, IRO Mladost,38(1989), s. 61-90.

Apostolidis, A./ Karakousis, Y./ Triantaphyllidis, C. Genetic divergence and phylogenetic relationships among Salmo trutta L. (brown trout) populations from Greece and other European countries. Heredity, 76(1996), s. 551-560.

Apostolidis, A./ Karakousis, Y./ Triantaphyllidis, C. Genetic differentiation and phyligenetic relationships among Greek Salmo trutta L. (brown trout) populations as revealed by RFLP analysis of PCR amplified mitohondrial DNA segments. Heredity, 77(1996), s. 608-618.

Apostolidis, A./ Triantaphyllidis, C./ Kouvatsi, A./ Economidis, P.S. Mitohondrial DNA sequence variation and phylogeograpfy among Salmo trutta L. (Greek brown trout) populations. Molecular Ecology, 6(1997), s. 531-542.

Bembo, D.G./ Weightman, A. J./ Beverton, R. H./ Cresswell, R.C. Mitohondrial DNA variation in River Usk brown trout, Salmo trutta. Journal of Fish Biology, 44(1994), s. 717-723.

Berg, W.J/ Ferris, S.D. Restriction Endonuclease Analysis of Salmonid Mitohondrial DNA. Canadian Journal of Fishes and Aquatic Sciences, 41(1984), s. 1041-1047.

Bernatchez, L./ Guyomard, R./ Bonhome, F. DNA sequnce variation of the

mitohondrial control region among geographically and morphologically remote European brown trout Salmo trutta populations. Molecular Ecology, 1(1992), s. 161-173.

Bernatchez, L./ Dodson, J.J./ Bovin, S. Population bottlenecks: influence on mitohondrial DNA diversity and its efect in coregonine stock discrimination. Journal of Fish Biology, 35(1989), s. 233-244.

Bernatchez, L./ Osinov, A. Genetic diversity of trout (genus Salmo) from its most eastern native range based on mitohondrial DNA and nuclear gene variation. Molecular Ecology, 4(1995), s. 285-297.

Billington, N./ Hebert, P.D.N. Mitohondrial DNA Diversity in Fishes and its Implacations for Introductions. Canadian Journal of Fishes and Aquatic Sciences, 48(1991), s. 80-94.


66

Chiereghini, Ab.S. Descrizoine de, crostacei de, testacei e de,pesci che abitano le lagune e golfo Vento. 1818, Op. ms. s. 128.

Digby, T.J./ Gray, M.W./ Lazier, C.B. Rainbow trout mitohondrial DNA:

sequnce and structural characteristics of the non-coding control region and flanking tRNA genes. Gene, 113(1992), s. 197-204.

Dovč, P./ Heht, W. Molecular analysis of the D-loop of Carpine mitohondrial DNA. V: XXIV International Conference on Animal Genetics, Prague, 1994-07-23/29, poster.

Ferguson, A./ Taggarat, J. B./ Prodöhl, P.A./ McMeel, O./ Thompson, C./

Stone, C./ McGinnity, P./ Hynes, R.A. Populaton and Conservation, Journal of Fish Biology, 47(1995), s. 103-126.

Ferris, S.D./ Sage, R.D./ Huang, C.M./ Nielsen, J.T./ Ritte, U./ Willson, A. C. Flow of mitohondrial DNA across a species boundary. Genetics, 80(1983), s. 2290-2294.

Giuffra, E./ Bernatchez, L./ Guyomard, R. Mitohondrial control region and

protein coding genes sequence variation among phenothipic forms of brown trout Salmo trutta from northern Italy, Molecular Ecology, 3(1994), s. 161-171.

Hall, H.L./ Nawrocki, L. W. A rapid method for detecting mitohondrial DNA

variation in the brown trout, Salmo trutta. Journal of Fish Biology, 46(1995), s. 360- 364.

Hamiton, K.E/ Ferguson, A./ Taggart, J.B./ Tomasson, T./ Walker, A./ Fahy, E. Post-glacial colonization of brown trout, Salmo trutta L.: Ldh-5 as a phylogeographic marker locus. Journal of Fish Biology, 35(1989), s. 651-664.

Hansen, M.M./ Loeschcke V. Effects of releasing hatchery-reared brown trout to wild trout populations. V: Conservation Genetics (eds. Loeschcke, V./ Tomiuk, J./ Jain, S.K.). Basel, Birkhäuser Verlag, 1994, s. 274- 289.

Harrison, R.G. Animal mitohondrial DNA as a Genetic Marker in Population and Evolutionary Biology. Tree, 4(1989), s. 6-11.

Hayashi, K. PCR-SSCP: A Simple and Sensitive Method for Detection of Mutations in the Genomic DNA. V: PCR Methods and Applications.Tokyo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1991 vol.1, s. 34- 38.

Horvat, S./ Bünger, L. polymerase chain reaction-restriction fragment lenght

polymorphism (PCR-RFLP) assay for the mouse leptin receptor (Leprdb) mutation. Edinburgh, Roslin Institute, Division of Molecular Biology, 33(1999), s. 380-384.


67

Hynes, R.A./ Duke, E.J./ Joyce, P. Mitohondrial DNA as a genetik marker for brown trout, Salmo trutta L., populations. Journal of Fish Biology, 35(1989), s. 687-701.

Kavar, T./ Habe, F./ Brem, G./ Dovč, P. Mitohondrial D-loop seqence variation among the 16 maternal lines of the Lipizzan horse breed. Animal Genetics, 30(1999), s. 1-8.

Larsson, N. G./ Wang, J./ Wilhelmsson, H./ Oldfors, A./ Rustin, P./

Lewandoski, M./ Barsh, G. S./ Clayton, D. A. Mitohondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryigenesis in mice. Nature genetics, 18(1998), s. 231-236.

Kottelat, M. European freshwater fishes, Bioligia, 52 (1997), s. 1-237. Lodish, H./ Baltimore, D./ Berk, A./ Zipursky, S. L./ Matsudaira, P./ Darnell, J. Molecularr cell biology. New York, Scientific American Books, 1995, s. 811-819.

Mcveigh, H.P./ Hynes, R.A./ Ferguson, A. Mitohondrial DNA differentiation of sympatric populations of brown trout, Salmo trutta L., from Lough Melvin, Ireland. Canadian Journal of Fishes and Aquatic Sciences, 52(1995), s. 1617-1622.

Melik, A. Površje Slovenije. Ljubljana, Slovenska matica, (1993) s. 19-203. Northcote, T.G. Migration and Residency in Stream Salmonids-some

Ecological Considerations and Evolutionary Consequences. Nordic Journal Freshwater Researchers, 67(1992), s. 5-17.

Ovenden, J.R./ Bywater, R./ white, W. G. Mitohondrial DNA nucleotide sequence variation in Atlantic salmon (Salmo Salar), brown trout (S. trutta), rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brook trout (Salvelinus fontinalis) from Tasmania, Australia. Aquaculture, 114(1993), s. 217-227.

Pohar, V. Veliki sesalci iz viška zadnjega glaciala v Sloveniji. Razprave IV reda Sazu. Great mammals descending from the culmination point of the last Glacial in Slovenia. 35(1994), s. 85-100.

Povž, M./ Sket, B. Naše sladkovodne ribe. Ljubljana, Mladinska knjiga, 1990, s. 84-101.

Saiki, R./ Scharf, S./ Faloona, F./ Mullis, K.B./ Horn, G.T./ Erlich, H.A./

Arnheim, N. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysia for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 4(1985), s.1350-1354.

Shedllock, A.M/ Parker, J.D/ Crispin, D.A/ Pietsch, T.W/ Burmer, G.B. Evolution of the Salmonid Mitohondrial Control Region. Molecular Phylogenetics and Evolution, 3(1993), s. 179-192.


68

Snoj, A. Molekularna karekterizacija soške postrvi (Salmo marmoratus, Cuvier 1817), Doktorska disertacija. Domžale, BF, Oddelek za zootehniko, 1997, s. 4-9.

Svetina, M. Sladkovodno ribištvo na Slovenskem. Ljubljana, Ribiška zveza Slovenije, 1982, s. 100- 110.

Šoljan, T. Pisces mari Adriatici. Beograd, Zavod za izdavanje udžbenika SR Srbija, 1965,

s. 196, 365.

Documents

VARIABILNOST NUKLEOTIDNIH ZAPOREDIJ DELA …v tektonskih procesih, v katerih so endogene sile, ki imajo svoj izvor v zemeljski notranjosti, odločale o zgradbi zemlje. Te enote predstavljajo