Le nuove frontiere della diagnosi genetica ed il sequenziamento

esonico: il punto sulla situazione italiana e sui centri di riferimento

Valeria Tiranti

3° Convegno Nazionale sulle Malattie MitocondrialiTivoli

1-2 giugno 2013

Le malattie mitocondriali sono difetti multisistemici causati da alterazioni della OXPHOS

Analisi biochimica della catena respiratoria, PDH, ciclo di Krebs

PCR quantitativa per delezione o deplezione del mtDNA

Ricerca di mutazioni frequenti del mtDNA

Sequenza dell'intero mtDNA

Analisi HRM e sequenza di geni nucleariEXOME SEQUENCING

Diagnostica avanzata =Diagnostica integrata

biopsia muscolare

Valutazione clinica, MRI

1918 – Edmund Cowdry descrive i mitocondri come corpi granulari presenti nel citoplasma

1981 – Anderson e colleghi pubblicano su Nature la sequenza e organizzazione genomica del mtDNA

1988 – Holt, Harding e Morgan-Hughes pubblicano su Nature la prima alterazione strutturale del mtDNA associata a miopatia

1988 – Zeviani e colleghi pubblicano su Neurology la presenza di delezioni del mtDNA nella sindrome KSS

1988 – Wallace e colleghi pubblicano su Science la prima mutazione puntiforme del mtDNA associata ad atrofia ottica di Leber

1988/2000 – Le patologie mitocondriali diventano una entità clinica rilevante

1990/2000 – Vengono identificate mutazioni in tutti i 37 geni codificati dal mtDNA. Per diagnostica viene analizzato un pannello di circa 12 mutazioni note che causano malattie

2002 – mtDNA viene sequenziato interamente per diagnostica

2010 – I geni nucleari diventano 100

2009/2010 – Next Generation Sequencing-EXOME

Le tappe fondamentali per la medicina mitocondriale

1995 – Bourgeron e colleghi identificano la prima mutazione in un gene nucleare SDH

2007 – Identificate mutazioni in 80 geni nucleari che codificano per proteine mitocondriali

2006 – Pubblicato il primo catalogo di proteine che formano il Proteoma Mitocondriale (MAESTRO)

2000 – Analisi di linkage in famiglie, mappaggio per omozigosi e analisi per gene candidato consentono di identificare nuovi geni nucleari

2008 – Aggiornato il catalogo di proteine che formano il Proteoma Mitocondriale (MitoCarta)

2013 – Identificate mutazioni in 43 geni responsabili di malattie mitocondriali

1910

1920

1980

1990

2000

2010

2020

2000/2003 – Completato il sequenziamento del Genoma Umano

Analisi di linkage e mappaggio per omozigosi

Identificazione geni candidati

Identificazione di geni-malattia: il vecchio metodo

Famiglie con malattie mitocondriali autosomiche recessive

Screening mutazionale

La ricerca di geni malattia: il nuovo approccio

EXOME SEQUENCING

Filtraggio e selezione dei geni candidati+ validazione patogenicità delle mutazioni

Pazienti singoli e piccole famiglie

EXOME SEQUENCINGStrategia per sequenziare selettivamente le regioni codificanti del genoma:

ESOMA

L’esoma rappresenta l’insieme di tutte le sequenze esoniche del genoma umano

L’esoma costituisce circa 1% del genoma (30 MB) e dovrebbe contenere circa l’85% delle mutazioni associate a patologia

Consente di identificare le variazioni di sequenza a carico di potenziali geni-malattia

Il DNA genomico viene frammentato

DNA genomicoIntroni Esoni

Vengono attaccati degli oligo specifici per gli esoni e sequenziamento successivo

Eluizione, sequenziamentoanalisi bioinformatica

Exome sequencing: come funziona

Michael J. Bamshad, Nature Reviews Genetics 12, 745-755, 2011

DNA genomico

costruzione di una libreria di frammenti

frammenti

ibridazione

sonde esone-specifichebiotinilate arancione

precipitazione+

lavaggio

cattura del DNAsequenziamento DNAmappaggio, allineamento, identificazione delle varianti

Exome sequencing: come funziona

Filtraggio varianti identificate

Pannelli di riferimento1000 Genomes Project

Conservazione e patogenicità del cambio aa

Geni codificanti per proteine mitocondriali

Validazione patogenicità delle varianti

L’exome sequencing di un singolo campione di DNA produce circa 25000 varianti

Come fare per identificare la specifica mutazione responsabile della patologia??

EXOME SEQUENCING

Caratterizzare le varianti sulla base dell’impatto predetto sulla funzione del gene

Ghezzi et al, AJHG, 2012

VantaggiApplicazioni su casi singoli o su piccole famiglie

Mantiene una buona copertura delle sequenze di interesse

Costi più contenuti rispetto all’analisi dell’intero genoma

Tecnica di screening molto efficiente che consente di identificare geni responsabili di malattia

LimitiRileva solo le varianti presenti nella regione codificante dei geni

Non rileva le varianti strutturali e non codificanti associate a patologia (99% del genoma non è analizzato)

Delezioni/duplicazioni di interi esoni non vengono identificate

L’analisi statistica di un’ampia mole di dati può essere difficoltosa

Ci sono criticità legate alla presenza di falsi positivi e falsi negativi

EXOME SEQUENCING

EXOME SEQUENCING n. pubblicazioni

EXOME SEQUENCING & MITO n. pubblicazioni

2008 2009 2010 2011 2012 2013 2010 2011 2012 2013

Il fenotipo clinico o la storia familiare indicano fortemente una causa genetica, ma il fenotipo non corrisponde ad una malattia in cui esiste già un gene responsabile

Un paziente affetto da una malattia genetica estremamente eterogenea che richiede l’analisi simultanea di più geni

Un paziente con una probabile malattia genetica è già stato analizzato per tutti i geni noti ma non si è giunti ad una diagnosi

American College of Medical Genetics (http://www.acmg.net/StaticContent/PPG Clinical_Application_of_Genomic_Sequencing.pdf), March 2012

Quando effettuare exome sequencing ?

L’esperienza della UO Neurogenetica Molecolare IRCCS C. Besta 2011-2013

Esomi analizzati 21

Casi risolti 15 Casi non risolti 6

71%casi risolti

29%casi non risolti

1. Inserzioni/delezioni non vengono identificate2. L’analisi statistica dei dati può essere stata troppo stringente3. La copertura dell’esoma non è completa e alcune regioni restano non analizzate

Quali pazienti?-pazienti con difetto biochimico-analisi del mtDNA negativa-analisi di numerosi geni noti negativa

4 pazienti diagnosticati

3 pazienti diagnosticati

EXOME SEQUENCING

12 pazienti diagnosticati

4 pazienti diagnosticati

Studio su una grossa famiglia americana (già descritta nel 1985); l’exome seq ha permesso di identificare il gene malattia, AIFM1

Analisi su sorelle italiane; l’exome seq ha permesso di identificare il gene malattia, SUCLA2

Quale approccio seguire nella diagnostica???

Mito-esoma+mtDNA Esoma completo

McCormick E, Neurotherapeutics, 2013

Lieber et al, Neurology 2013

L’esperienza americana-australiana di target resequencing con Mito-exome (1598 geni) + mtDNA

1) Targeted exome sequencing è una alternativa rapida e relativamente meno costosa rispetto al sequenziamento tradizionale del mtDNA e di numerosi singoli geni nucleari.

Considerazioni generali

2) Esistono dei fenotipi clinici sovrapposti tra malattie mitocondriali e altre malattie genetiche. Se i costi dovessero scendere è ipotizzabile applicare exome sequencing e poi filtrare i dati concentrandosi su un numero più ristretto di geni.Questo avrebbe il vantaggio di poter effettuare una seconda analisi di dati “già disponibili” nel caso il primo screening fosse negativo.

3) Ove possibile sarebbe auspicabile sequenziare anche i genitori per determinare la fase degli aplotipi, identificare mutazioni de-novo e filtrare per le varianti candidate.

4) E’ necessario definire delle linee guida per l’interpretazione dei dati di NGS nelle malattie mitocondriali. L’interpretazione può essere aiutata dalla disponibilità di database di soggetti controllo e malati. Problematiche legate alla privacy

5) E’ estremamente importante che i dati di NGS siano interpretati nel contesto del quadro clinico, biochimico del paziente e quindi in centri specializzati nella diagnosi e terapia delle malattie mitocondriali.

Come procedere

Malattia genetica eterogenea

Exome sequencing

Sanger sequencing

Tutti gli esoni!!!!!

gene 1

gene 2

gene 3

gene 4gene 5

gene 6

gene n.

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Piattaforme NGS disponibili in Italia-Strutture Ospedaliere di

Genetica Medica

-Istituti Ricovero e Cura a

Carattere Scientifico (IRCCS)

-Parchi Tecnologici

-Piccole-Medie Imprese

Roche 454

LifeTechIon e Proton Torrent

Illumina HiSeq

Le collaborazioni della UO Neurogenetica Molecolare-IRCCS C. Besta

UO Neurogenetica Molecolare(D.ssa Garavaglia)

MBU-Mitochondrial Biology Unit Cambridge (Dr. Zeviani)

MiSeq- Illumina

Il futuro…… prossimo

Next Generation Sequencing: le nostre collaborazioni