V12 Bioinformatik-Tools für HT Proteinanalyse

12. Vorlesung WS 2005/06

Softwarewerkzeuge der Bioinformatik 1

V12 Bioinformatik-Tools für HT Proteinanalyse

traditionelle Ansätze: reduktionistisch; finde einzelne Gene und die kodierten Proteinprodukte, die einen beobachteten Phänotyp definieren.Oft werden hierdurch komplexe Systeme zu stark vereinfacht.

Hoch-Durchsatzmethoden: parallele Untersuchung vieler gleichzeitiger Vorgänge

omics-Welt: Genomics, Proteomics, Metabolomics, Transcriptomics ...



Wie soll man das Proteom untersuchen?

Proteomics zerfälltderzeit in 2 Bereiche

Expression Proteomics- katalogisiere alle Proteine in einer Probe- differentielle Expression:Unterschied zwischen mehreren Proben

Cell-map Proteomics- Protein-Protein Wechselwirkung- Protein-Liganden Wechselwirkung- zelluläre Lokalisation



Expressions-Proteomik

Das zelluläre Proteom enthält 10.000ende von Proteinen,deren Konzentrationen mehr als 106 fach verschieden sind.

Prof. Walter (UdS)



Technologien in Proteomics

Separation von Proteinen- 2-D gel Elektrophorese- Flüssig-Chromatographie- Affinitäts-Chromatographie

Annotation einzelner Proteine- Massenspektroskopie- kombinierte HPLC und MS- Protein-Quantifizierung mit MS

Protein-Chips



Proteinanalyse auf einer proteomischen Skala

Phizicky et al. Nature 422, 208 (200)



Analytische versus funktionelle Protein-Microarrays

(a) analytische Microarrays:beobachte Proteinexpression und klinische Diagnostik. Vergleiche Proteinproben zweier biologischer Zustände, wobei die Protein entweder mit einem grünen oder mit einem roten Farbstoff gelabelt werden. Wenn eine Farbe überwiegt, liegt das Protein vornehmlich in dem entsprechenden Zustand vor.


(b) funktionelle Microarrays: visualisieren Proteinaktivität, -bindung oder posttranslationelle Modifikationen. Auch geeignet um Substrat- oder Inhibitor-bindung an Enzyme zu messen und zur Konstruktion biologischer Netzwerke.




Yeast Two-Hybrid Methoden

(a) die DNA-bindende und dieAktivierungsdomänen (Kreise)sind an die Protein X und Yfusioniert. Genexpression des Reporters beginnt.

(b) Standard-2YH-Suche von X gegen eine komplexe Bibliothek von zufälligen, mit Y fusionierten Peptid-Schnipseln.

(c) 2YH-Array. Screene X gegen komplette Satz von ORFs.




Fluoreszenz entdeckt posttranslationelle Modifikationen

(c) Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen grünem GFP und Farb-stoffmolekül nur wenn gelbes Protein – ein Antikörper gegen phosphorylierte Tyrosin-reste - an rotes Protein gebunden ist. FRET ist stark distanzabhängig, Detektion bis 6 nm Abstand. Bindung (rechts) führt zu schnellerem Abfall der Fluoreszenz (unten).

(b) In vivo Beispiel. Farbkodierung des Gewebes gemäss Fluoreszenzdauer des GFP-Signals wieviel phosphoryliertes Tyrosin besitzt rotes Protein?

(a) cDNA-Scan. Jeder Punkt enthält Zellen, bei denen GFP an unterschiedliche (rote) Proteine fusioniert ist.



Disease Proteomics

Hanash, Nature 422, 226

- entdecke veränderte Proteinexpression nicht nur in Zellen bzw. Geweben,sondern auch in Subzellulären Strukturen, in Proteinkomplexen und in biologischen Flüssigkeiten

- entwickle neue Biomarker für Diagnose und Früherkennung von Krankheiten

- identifiziere neue Targets für Therapieansätze

- beschleunige die Entwicklung von Medikamenten



Zweidimensionale Gelelektrophorese (2D PAGE)

2D Polyacrylamid-Gel für ein Biopsie-Probe mit menschlicher Leber.

In x-Richtung – nichtlinearer pH-Gradient - geschieht eine Auftrennung nach dem isoelektrischen Punkt (bei welchem pH ist die Ladung des Proteins neutral?).

In y-Richtung geschieht durch Variation des Anteils an Polyacrylamid eine Trennung nach der molekularen Masse.

Problem: man kann nur Proteine visualisieren, die relativ häufig vorkommen. Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)



Annotation von 2D-Gelen: mühsam

Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)



Fallstudie: Expressions-Proteomik

Die Balken 1-6 stammen von Kardiomyopathie-diagnostizierten Rindern, 7-12 von gesunden Rindern. 13-16 sind Rinder, die selbst klinisch normal sind, aber von kranken Rindern abstammen (nur SPP 943 ist deutlich abgesenkt).

Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)

Proteine des Rinderherzen: welche Proteine sind im Herzen von Rindern mit einer vererbten Kardiomyopathie reduziert?



(Bio)informatische Aufgaben bei Analyse von 2D-Gelen

Zwei Gele stimmen oft in Grösse,Kontrast, Auftrennung in x- undy-Richtung nicht überein.Darüberhinaus treten Unterschiedals Folge der experimentellenBedingungen auf.

Der Vergleich zweier Gele erfordertdaher oft Methoden der Bildbearbeitung,z.B. mit dem Programm Flicker http://www-lecb.ncifcrf.gov/flicker/

Eine Laplace-Transformation verbessert die Übereinstimmungzwischen dem linken und rechtenGel erheblich in (b) gegenüber (a). Lemkin PF, Electrophoresis, 18, 461-470 (1997)



Fraktionierung der Probe vor 2D PAGE-Analyse

Hanash, Nature 422, 226 (2003)

Oft gibt es das Problem, dass die Proteineigen-schaften über einen sehr grossen Bereich variieren. Lösung: konzentriere auf Teil der Proteine.

z.B. (a) versehe die ansonsten schwer detek-tierbaren Proteine an der Membranoberfläche mit einem Biotin ‚Anker‘ (tag).Auftrennung in 2D-Gel. Erkenne die markierten Proteine mit Avidin. Identifikation mit MS.

(b) Getrennte Visualisierung der markiertenProteine (oben) gegenüber der Darstellungdes gesamten Zell-Lysats (unten).Dies erlaubte die Identifikation neuer Proteine auf der Oberfläche von Krebszellen.



Einsatz von 2D PAGE-Analyse in medizinischer Diagnose


Die Probleme von 2D Gelen sind,

dass die Methode nicht für grosse Mengen an Proben (HTS) geeignet istund relative grosse Probenmengen benötigt.

Die Analyse von klinischen Proben wird durch die Heterogenität des Gewebes kompliziert.



Direkte Visualisierung der Protein-Verteilung mit MS

Ein gefrorener Schnitt durch ein Rattengehirn wird mit einem MALDI MS-Gerät abgetastet.Hier: je 15 Spektren für 74 75 Punkte, gleichzeitige Aufnahme aller Massen.

Visualisiere den Schnitt getrennt für verschiedene Verhältnisse von Masse und Ladung (jeweils oben rechts gezeigt).z.B. ist die Proteindichte für m/z=6844 recht gering.


Ziel: vergleiche gesundes und krankes Gewebe.

Aufgabe: Bildverarbeitung



Functional Proteomics

Konstruktion eines fluoreszenten Liganden für Serin-Hydrolasen.

(b) Messe die Fluoreszenz in gesunden und Krebszellen.Identifiziere einen Cluster von Protease-Lipasen und Esterasen, derenAnteil in Krebslinien aus verschiedenen Geweben unterschiedlich ist.




Proteomik mit MS

Aebersold, Mann, Nature 422, 198 (200)



Proteomics mit Massenspektroskopie (MS)

(1) Aufreinigung (SDS-PAGE).Banden ausschneiden.(2) Problem: Gesamtmasse eines Proteins ist nicht aussagekräftig. Daher Trypsin (Protease)-Verdau Peptidschnipsel unterschiedlicher Länge,diese sind charakteristisch für Protein.(3) MS-Analyse in Vakuum(4) Detektion der Massenintensität bei vorgegebenem Verhältnis von Masse m und Ladung z.(5) Weitere Auftrennung der einzelnen Peptidschnipsel in zweitem MS-Schritt. Teilweise Sequenzierung möglich.Aufgabe: Annotation des Proteins aus Sequenz-Datenbank. Tyers, Mann, Nature 422, 193 (2003)



Sequenzdiversität in der Zelle: Analyse mit MS

Organismus kodiert über das Genom viele Isoformen.

Identifikation der Proteine durchDatenbanksuche um die Lückender exp. Daten zu füllen.

Sequenz-Datenbanken enthaltenjedoch keine komplette Information über die natürlich auftretende Sequenzdiversität.

Rappsilber, Mann, TIBS, 27, 74 (2002)



Iterativer Zyklus in Systems Biology

Tyers, Mann, Nature 422, 193 (2003)



Structural Proteomics

Sali, Glaeser, Earnest, Baumeister, Nature 422, 216 (2003)

Ungerichtete Diffusion aller Proteine ist keine geeignete Organisationsform von biologischen Zellen.

Stattdessen übernehmen stabile oder transient gebildete Proteinkomplexe viele wichtige zelluläre Funktionen.



bekannte Proteinstrukturen

Sali et al. Nature 422, 216 (2003)

PDZ Domäne CheA Aquaporin

Ribosom

Grosse Proteine und Proteinkomplexe sind in der PDB-Datenbank unterrepräsentiert.Es wird geschätzt, dass jeder Proteinkomplex für Hefe ca. 7.5 Proteine enthält.



Struktur grosser Komplexe: Kombination von EM + X-ray

Bioinformatik: docke atomare X-ray Struktur von Tubulin (3.5 Å Auflösung)in 8Å-EM-Struktur eines Microtubulis.




Einzel-Partikel-Analyse mit EM

(a) Komplexe von ca. 44 Tripeptidyl-Peptidase II Molekülen auf einerOberfläche. Das Bild zeigt verschiedene gemittelte Ansichten von Komplexen, die jeweils die gleiche Orientierung haben ( Bildverarbeitung).

(b) 3D-Rekonstruktion des TPP II-Komplexes bei 3.3 nm Auflösung.Verschiedene Blickrichtungen.




Information über Makromolekülkomplexe

‚Subunit structure‘ : atomare Auflösung < 3 Å‘Subunit shape’ : mittlere Auflösung > 3 Å‘Subunit contact’: Kenntnis über direkte Kontakte zwischen Unter-einheiten‘Subunit proximity’: Untereinheiten müssen nicht in direktem Kontakt stehen.

graue Boxen kennzeichnet grosseexperimentelle Schwierigkeiten.




Hybrid-Methoden für Makromolekulare Komplexe

Structural Bioinformatics(a) Integration verschiedener Protein- Elemente zu einem Komplex.

(b) Teilweise atomares Modell des gesamten Hefe-Ribosoms durch Fits von atomaren Modellen für rRNA und Proteinmodellen in eine EM-Elektronen-dichte-Mappe des 80S Ribosoms.




Elektronen-Tomographie

(a) Vom Objekt (Mitte) gestreute Elektronen werden in einem Halbkreis aufgefangen. Ausserdem wird das Objekt in kleinen Schritten gedreht.

(b) Rekonstruktion (Mathematik):Rück-Projektion der bei verschiedenen Drehwinkeln aufgenommenen Streuinfor-mationen.Die Überlagerung ergibt ein Tomogramm.




Science Fiction: “Interaktom” einer Zelle

links: ein Tomogramm einer Zelle stellt im Prinzip ein räumliches Bild desgesamten Proteoms einer Zelle dar. Allerdings ist die Auflösung begrenzt.Versuche dann, die „Templates“ einzelner Proteine so anzuordnen, dass sich eine optimale Übereinstimmung mit dem linken Bild ergibt.




Software-Tools der Systems Biology:werden natürlich derzeit intensiv entwickelt



GeneMAPP

Fettsäure-Abbau-Pfad.Jede Box stellt ein Gen dar.

Farbkodierung analog zu Genexpressionsdaten.

Rot bedeutet > 1.2 fachgrössere Expression inMäusen mit Kardio-myopathie.

Blau bedeutet > 1.2 fachgeringere Expression.



Visualisierung von Protein-Wechselwirkungen

Darstellung von 14.000 Wechselwirkungen.Stark vernetzte Komplexe sind am Rand gezeigt.




Fazit: Bioinformatik verbindet Genomics und Proteomics

Bioinformatik bzw. Computational Biology wird ultimativ ein integriertes Bilddes biologischen Systems erlauben.


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