Click here to load reader

UV- und Transposon-vermittelte Mutagenese mariner und ... · PDF fileUV- und Transposon-vermittelte Mutagenese mariner und terrestrischer Ascomyceten Dissertation zur Erlangung des

  • View
    6

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of UV- und Transposon-vermittelte Mutagenese mariner und ... · PDF fileUV- und...

  • UV- und Transposon-vermittelte Mutagenese

    mariner und terrestrischer Ascomyceten

    Dissertation

    zur Erlangung des Doktorgrades

    der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

    der Christian-Albrechts-Universität

    zu Kiel

    vorgelegt von

    Linda Paun

    Kiel, 2015

  • Erster Gutachter: Prof. Dr. Frank Kempken

    Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Rüdiger Schulz

    Tag der mündlichen Prüfung: 08.02.2016

    Zum Druck genehmigt: Kiel, den 10.02.2016

    gez. Prof. Dr. Wolfgang J. Duschl, Dekan

  • Abkürzungsverzeichnis

    A Adenin

    AnM Aspergillus niger Mutante

    AnT Aspergillus niger Transformante

    bp Basenpaare

    C Cytosin

    DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

    DOX Doxycyclin

    dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

    EDTA Ethylendiamin-Tetraessigsäure

    G Guanin

    HygB HygromycinB

    kb Kilobasenpaare

    LINE long interspersed nuclear element

    M molar

    Mb Megabasenpaare

    MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure

    NcM Neurospora crassa Mutante

    NcT Neurospora crassa Transformante

    ORF open reading frame (offener Leserahmen)

    PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

    RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)

    RNase Ribonuklease

    rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)

    SDS sodium dodecyl sulfate (Natrium-Dodecylsulfat)

    SINE short interspersed nuclear element

    SNP single nucleotide polymorphism

    T Thymin

    TIR terminal inverted repeat

    TSD target site duplication

    Tris Tri(hydroxymethyl)-Aminomethan

    UV Ultraviolett

    v/v volume per volume (Volumen pro Volumen)

    w/v weight per volume (Masse pro Volumen)

    Allgemein gebräuchliche Maßeinheiten und Abkürzungen sind nicht gesondert aufgeführt.

  • i

    Inhaltsverzeichnis 1  EINLEITUNG ..................................................................................................... 1 

    1.1  Ascomyceten – häufigste Vertreter der höheren Pilze ........................................... 1 

    1.1.1  Aspergillus niger und Neurospora crassa: Ascomyceten terrestrischen Ursprungs ..... 3 

    1.1.2  Scopulariopsis brevicaulis und Calcarisporium spec.: Ascomyceten marinen

    Ursprungs ................................................................................................................................. 4 

    1.2  Sekundärmetabolismus ............................................................................................. 5 

    1.2.1  Potential mariner Sekundärmetabolite .......................................................................... 7 

    1.2.2  Scopulariopsis brevicaulis als Produzent anticancerogener Sekundärmetabolite ........ 8 

    1.2.3  Calcarisporium spec. als Produzent antibakterieller Sekundärmetabolite .................. 10 

    1.3  Zufallsmutagenese und Stammoptimierung .......................................................... 12 

    1.3.1  UV-Mutagenese .......................................................................................................... 13 

    1.3.2  Transposon-vermittelte Mutagenese .......................................................................... 14 

    1.3.3  Das Vader-Transposon ............................................................................................... 17 

    1.4  Das Tet-On-System ................................................................................................... 18 

    1.5  Zielsetzung der Arbeit .............................................................................................. 20 

    2  MATERIAL UND METHODEN ........................................................................ 22 

    2.1  Material ...................................................................................................................... 22 

    2.1.1  Organismen ................................................................................................................ 22 

    2.1.2  Oligonukleotide ........................................................................................................... 23 

    2.1.3  Plasmide ..................................................................................................................... 25 

    2.1.4  Chemikalien ................................................................................................................ 26 

    2.1.5  Enzyme ....................................................................................................................... 26 

    2.1.6  Stammlösungen .......................................................................................................... 27 

    2.2  Molekularbiologische Methoden ............................................................................. 28 

    2.2.1  Anzucht der Organismen ............................................................................................ 28 

    2.2.2  Herstellung elektrokompetenter Escherichia-coli-Zellen ............................................. 30 

    2.2.3  Isolierung der Konidiosporen ...................................................................................... 30 

    2.2.4  Transformation ............................................................................................................ 31 

  • ii

    2.2.5  Nukleinsäureisolierung ............................................................................................... 32 

    2.2.6  Mikrokonidienpassage ................................................................................................ 33 

    2.2.7  Hydrolyse von DNA .................................................................................................... 33 

    2.2.8  Ligation von DNA ........................................................................................................ 33 

    2.2.9  Gelelektrophorese ...................................................................................................... 33 

    2.2.10  Southern Hybridisierung ............................................................................................. 34 

    2.2.11  Selektion HygromycinB-resistenter Kolonien .............................................................. 35 

    2.2.12  UV-Mutagenese .......................................................................................................... 35 

    2.2.13  Extraktion von Sekundärmetaboliten .......................................................................... 36 

    2.2.14  Hemmhofversuch ........................................................................................................ 36 

    2.2.15  Polymerase-Ketten-Reaktion ...................................................................................... 37 

    2.2.16  DNA-PCR-Reinigung und Gelelution .......................................................................... 38 

    2.2.17  Sequenzierungen ........................................................................................................ 39 

    2.2.18  Sequenzauswertung der Genomsequenz von LF580-M26 ........................................ 39 

    2.3  Bioinformatische Materialien ................................................................................... 40 

    2.3.1  Clone Manager ........................................................................................................... 40 

    2.3.2  Ensemble Fungi und Joint Genome Database ........................................................... 40 

    2.3.3  NCBI ........................................................................................................................... 41 

    2.3.4  Weitere Bioinformatische Werkzeuge ......................................................................... 41 

    3  ERGEBNISSE .................................................................................................. 42 

    3.1  UV-Mutagenese mariner Ascomyceten .................................................................. 42 

    3.1.1  Optimierung der UV-Mutagenese zur Anwendung bei den marinen Ascomyceten .... 42 

    3.1.2  Selektion und Analyse der UV-Mutanten .................................................................... 45 

    3.1.3  Genom-Vergleich des Wildtyps LF580 und der Mutante LF580-M26 ......................... 53 

    3.2  Induzierbare Transposon-vermittelte Mutagenese in Aspergillus niger ............. 57 

    3.2.1  Analyse der tan1-Sequenz des Aspergillus-niger-Laborstamms AB4.1 ..................... 59 

    3.2.2  Bestätigung der Genotypen der Vader- und Tet-On-Transformanten ........................ 62 

    3.2.3  Transposon-vermittelte Mutanten durch Doxycyclin-abhängige Transposition .......... 64 

    3.2.4  Analyse der Vader-vermittelten Mutanten .................................................................. 71

  • iii

    3.3  Transposon-vermittelte Mutagenese in Neurospora crassa ................................ 77 

    3.3.1  Vektorkonstruktion für die Etablierung von Vader im heterologen Wirt ...................... 77 

    3.3.2  Erstellung der Transformanten NcT460 und NcT461 .....

Search related