254
Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH ENZIMSKIH BIOMARKERA U MIŠA Zagreb, 2006.

UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

  • Upload
    others

  • View
    2

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Domagoj Đikić

UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH ENZIMSKIH

BIOMARKERA U MIŠA

Zagreb, 2006.

Page 2: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Domagoj Đikić

UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH ENZIMSKIH

BIOMARKERA U MIŠA

Doktorska disertacija predložena

Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu Radi stjecanja akademskog stupnja

doktora prirodnih znanosti

Zagreb, 2006.

Page 3: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Ova disertacija izrađena je u Zavodu za animalnu fiziologiju, Biološkog odsjeka,

Prirodoslovno matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom

Prof.dr.sc. Oskara P. Springera u sklopu Sveučilišnog poslijediplomskog studija

pri Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u

Zagrebu.

Page 4: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Zahvaljujem voditelju i svima koji su pomogli u izvedbi disertacije.

Page 5: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište u Zagrebu Doktorska disertacija Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek

UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE

SERUMSKIH I TKIVNIH ENZIMSKIH BIOMARKERA U MIŠA

Domagoj Đikić

Zavod za animalnu fiziologiju Biološki odsjek PMF

Rooseveltov trg 6 10 000 Zagreb

Sažetak: S-Triazinski herbicid prometrin relativno je postojan u okolišu i ljudskoj hrani u kojeg dolazi nakon zaštite nasada. Cilj disertacije je utvrditi toksikološko-patofiziološko djelovanje prometrina na fiziologiju odabranih vitalnih organskih sustava na mišjem modelu (in vivo) mjereći najsuptilnije pokazatelje oštećenja stanica, te odrediti najranije pokazatelje smrti, dinamiku, jačinu i način smrti (apoptotičnu ili nekrotičnu) pojedinih stanica u vitalnim organima, nakon subkronične izloženosti različitim dozama. Proporcionalno s dozom povećava se serumska aktivnost LDH, y-GT, AlP, smanjuje se koncentracija kreatinina, a vrlo blago ali značajno raste aktivnost AST i nešto manje aktivnost ALT. De Ritiusov se koeficijent s dozom ne mijenja bitno. Rezultati analize komet testa pokazuju oštećenja integriteta stanične DNA, karakterizirane povećanom lomljivošću molekule sa porastom doze. Do hiperplazije i infiltracije imunokompetentnih stanica dolazi u tankom crijevu, poprečno-prugastom mišićju i slezeni. Protočna citometrija pokazuje da najmanje doze više podstiću apoptozu a najveće doze nekrozu u stanica limfnog čvora i u timocita. Zaključno moglo bi se govoriti o prometrinu kao o otrovu koji ima imunotoksični, hematotoksični, hepatotoksični, nefrotoksični, genotoksični i nadasve miotoksični učinak i mjenja metaboličnu ravnotežu u animalnom organizmu.

Stranica: 240, slika: 119, tablica 41 , literaturnih navoda: 160 , jezik izvornika: hrvatski Rad je pohranjen u Nacionalnoj sveučilišnoj biblioteci Mentor: Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Ocjenjivači: Prof. dr. sc. Franjo Plavšić

Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Prof. dr. sc. Marija Heffer-Lauc

Ključne riječi: prometrin, LDH, AlP, kreatinin, AST, ALT, klinička kemija, protočna citometrija, annexinV-FITC, komet-tehnika, enzimatska histopatologija, toksikologija. Tema prihvaćena;08. 02. 2006.

Page 6: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zagreb Doctoral thesis Faculty of Science Department of Biology

THE EFFECT OF PROMETRINE ON SERUM AND

TISSUE ENZYME BIOMARCERS IN MICE

Domagoj Đikić Zavod za animalnu fiziologiju

Biološki odsjek PMF Rooseveltov trg 6

10 000 Zagreb

Abstract: Prometryn, an S-Triazine herbicide is relativly persistent in human food and enviroment after crop protection use. Thesis aim to demonstrate what toxic and pathophysiologic effects prometryn has on physiology of vital organ functions (in vivo) by mesurng the suptile changes of cell dammage and first signs of apoptotic and necrotic death. We demonstrated dynamic and strength of dammage after subchronic exposure to various doses of prometrye. LDH, y-GT, AlP activity rises in a dose dependent manner, creatinine contcentration lowers, AST and ALT rises rather slowly. De Ritis ratio is slaightly changed. Comet-assay analysis shows DNA dammage in peripheral blood cells. DNA is fragile as the doses are higher. Immune response is noted in gut, sceletal muscle and spleen. Flow cytometry shows that lower doses induce apoptotic changes and higher doses necrotic changes in lymph nodes and thymus. Prometryn could be characterized as a potentialy immunotoxic, haematotoxic, hepatotoxic, nephrotoxic, genotoxic and especially myotoxic pesticide that can change metabolic homeostasis in an animal organism.

Pages: 240, figures: 119 , tables 41 , references: 160, original in Croatian Thesis deposited in National University library Supervisor: Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Reviewers: Prof. dr. sc. Franjo Plavšić

Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Prof. dr. sc. Marija Heffer-Lauc

Key words: prometrine, LDH, AlP, creatinin, AST, ALT, clinical chemistry, flow cytometry, annexinV-FITC, comet assay, enzymatic histopathology, toxicology. Thesis accepted; 08. 02. 2006.

Page 7: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

POPIS KRATICA: ADI – engl. Aceptable Daily Intake, dnevno prihvatljiva doza unosa tvari u organizam Alp – Alkalna fosfataza ALT – Alanil aminotransferaza AST – Aspartat aminotransferaza B6C3F1 - soj laboratorijskih miševa BALB/C – soj laboratorijskih miševa BSA – engl. Bovine Serum Albumin, Albumin iz goveđeg seruma C57BL - soj laboratorijskih miševa CBA T6T6 - soj laboratorijskih miševa CD1 - soj laboratorijskih miševa CNS – engl. Central Nervous System CK – Kreatinin fosfokinaza CRP – C reaktivni protein CYP450 – citokrom P 450 enzimi DAPI – fluorescencijska boja za mikroskopiju i protočnu citometriju DKS – diferencijalna krvna slika DMF – dimetil formaldehid DNA – DNK EDTA – etilene diamin tetraoctena kiselina ELISA- engl. Enzyme-linked Immunoasorbent Assay EPA – engl. Enviromental Protection Agency EST – esteraza FDA – engl. Food and Drug Administration FITC – fluorokromska boja u protočnoj citometriji FMO – flavin monooksigenaze GALT- engl. Gut Assotiated Lymphatic Tissue GGT – gama glutamil transferaza yGT – isto kao GGT GOT – sinonim za AST HE – hemalaun eozinsko bojenje HMGCoA – hidroksi-metil-glutaril-koenzim A, jako hipolipidemičko sredstvo HPLC – visokotlačna kromatografija ICR - soj laboratorijskih miševa kD – kilo Daltona KF- kisela fosfataza

Page 8: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

LD 50 –doza otrova koja usmrćuje 50% ispitivne populacije LDH – laktat-dehidrogenaza LH – luteinizirajući hormon LOEL – engl. Lowest Observable Efecte Level MALT – engl. Mucose Assotiated Lymphatic Tissue NOAEL – engl. No Observed Effect Level OTM – engl. Olive Tail Moment P-450 – citokromatski enzim monooksigenaza u biotransformaciji otrova PAI-B3AG8I – soj stanica mišjeg mijeloma PAS – engl. Periodic Acid Schiff, bojenje PBS – engl. Phosphate Buffer Saline PI – propidij jodid ppm – engl. Parts Per Million RfD – engl. Reference Dose SD – standardna devijacija ScDH- Sukcinat dehidrogenaza Swiss – soj laboratorijskih miševa T3 – trijodtironin T4 – tiroksin TLC – tankoslojana kromatografija U/L – internacionalna jedinica aktivnosti enzima po litri Y59 – rijedak, gotovo izumrli laboratorijski soj štakora WHO – engl. World Health Organization

Page 9: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA
Page 10: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

SADRŽAJ

1 UVOD.......................................................................................................1

2 LITERATURNI PREGLED....................................................................4

2.1 HERBICIDI...............................................................................................................5

2.2 TRIAZINSKI HERBICIDI...............................................................................................................6

2.3 OPĆA SVOJSTVA PROMERINA............................................................................................................8

2.3.1 PRISUTNOST PROMETRINA U OKOLIŠU...............................................................................................................10

2.3.1.1 Prometrin u sedimentu vodenih ekosustava i pitkoj vodi......................................................................................................................10

2.3.1.2 Mikrobiološka biorazgradnja prometrina i toksičnost za mikroorganizme...................................................................................................10

2.3.2 NAKUPLJANJE PROMETRINA U BILJKAMA LJUDSKE PREHRANE...........................................................................................................11

2.4 TOKSIČNI UČINCI PROMETRINA NA FIZIOLOŠKE SUSTAVE ŽIVOTINJA.............................................................................................................14

2.4.1 UČINAK PROMETRINA U NIŽIH KRALJEŠNJAKA I BESKRALJEŠNJAKA…………………………………………………………..…..……14

2.4.2 OPĆA I SISTEMSKA TOKSIČNOST PROMETRINA.......................................................................................................15

2.4.3 IMUNOHEMATOTOKSIČNOST PROMETRINA……………………………..…… 16

2.4.4 UČINAK PROMETRINA NA ENDOKRINI I REPRODUKTIVNI SUSTAV ŽIVOTINJA............................................................................................................17

2.4.5 UČINAK PROMETRINA NA NUKLEINSKE KISELINE MUTAGENOST I GENOTOKSIČNOST…………………………………………………………………....18

2.4.6 METABOLIČNA RAZGRADNJA PROMETRINA U ORGANIZMU (PREDLOŽENI MODEL NA ŠTAKORU)...........................................................................................................19

Page 11: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

2.4.7 ENZIMI KAO DIJAGNOSTIČKI BIOMARKERI OŠTEĆENJA POJEDINIH ORGANSKIH SUSTAVA...............................................................................................................22

2.4.7.1 Laktat dehidrogenaza (LDH)..................................................................................................................22

2.4.7.2 Gama glutamil transferaza (GGT)......................................................................35

2.4.7.3 Alkalna fosfataza (ALP)......................................................................................40

2.4.7.4 Kreatinin i kreatinin fosfokinaza (CK).....................................................................................................................45

2.4.7.5 Alanin aminotransferaza (ALT)...........................................................................49

2.4.7.6 Aspartat aminotransferaza (AST)........................................................................53

2.4.8 METODA KOMET TESTA U PROCJENI TOKSIČNOSTI NOKSI....................................................................................................................56

2.4.8.1 Apoptoza i nekroza..............................................................................................58

3 MATERIJALI I METODE

3.1 POKUSNE ŽIVOTINJE..........................................................................................62

3.2 PLAN POKUSA I NAČIN APLIKACIJE POJEDINIH DOZA PROMETRINA........................................................................................................64

3.3 ODREĐIVANJE TJELESNE TEŽINE POKUSNIH ŽIVOTINJA ..................................................................................................................................66

3.4 ANALIZA SERUMSKIH ENZIMA SPEKTROFOTOMETRIJOM.................................................................................66

3.5 ANALIZA PERIFERNE KRVI..............................................................................70

3.5.1 ODREĐIVANJE BROJA ERITROCITA I LEUKOCITA.........................................................................................................70

3.5.2 DIFERENCIJALNA KRVNA SLIKA (DKS)……………………………………………………………………….…….……....70

3.6 ANALIZA LIMFOHEMATOPOETSKIH ORGANA...........................................71

3.7 KOMET TEHNIKA LEUKOCITA PERIFERNE KRVI......................................71

3.8 METODA PROTOČNE CITOMETRIJE..............................................................73

Page 12: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3.9 STATISTIČKA OBRADA PODATAKA............................................................................................................74

3.10 HISTOPATOLOGIJA..............................................................................................75

3.11 ENZIMATSKOHISTOKEMIJSKE REAKCIJE NA TKIVA.....................................................................................................................80

3.12 GLICERIN ŽELATINA I UKLOP PREPARATA.................................................82

4 REZULTATI

4.1 PREŽIVLJAVANJE................................................................................................84

4.2 REZULTATI MJERENJA AKTIVNOSTI SERUMSKIH ENZIMA ..................................................................................................................................86

4.3 KORELACIJE I REGRESIJE ENZIMA...............................................................102

4.4 REZULTATI KOMET TEHNIKE........................................................................130

4.4.1 REZULTATI KOMET TESTA NAKON 14. DANA IZLOŽENOSTI PROMETRINU…………………………………………………………………….…...130

4.4.2 REZULTATI KOMET TESTA NAKON 28. DANA IZLOŽENOSTI PROMETRINU………………………….………………………………………….......140

4.5 UČINAK PROMETRINA NA BROJ ERITROCITA I LEUKOCITA U PERIFERNOJ KRVI..............................................................................................150

4.6 UČINAK PROMETRINA NA DIFERENCIJALNU KRVNU SLIKU (DKS).....................................................................................................................153

4.7 UČINAK PROMETRINA NA STANIČNOST KOŠTANE MOŽDINE.............................................................................................................156

4.8 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I STANIČNOST TIMUSA.................................................................................................................156

4.8.1 UČINAK PROMETRINA NA APOPTOZU, NEKROZU I VITALNOST TIMOCITA ISPITIVAN PROTOČNOM CITOMETRIJOM.................................................................................................156

4.9 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU, BROJ STANICA I HISTOLOŠKE PROMJENE SLEZENE...............................................................................................................157

Page 13: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

4.9.1 UČINAK PROMETRINA APOPTOZU, NEKROZU I VITALNOST SPLENOCITA ISPITIVAN PROTOČNOM CITOMETRIJOM................................................................................................161

4.10 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I STANIČNOST LIMFNOG ČVORA (BRAHIJALNOG).................................................................................................161

4.11 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I HISTOPATOLOŠKE PROMJENE JETRE....................................................................................................................177

4.12 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I HISTOPATOLOŠKU SLIKU BUBREGA............................................................................................................186

4.13 UČINAK PROMETRINA NA PROBAVNI SUSTAV................................................................................................................187

4.14 UČINAK PROMETRINA NA MOZAK..............................................................190

4.15 UČINAK PROMETRINA NA POPREČNOPRUGASTO MIŠIĆNO TKIVO...................................................................................................................194

5 RASPRAVA..........................................................................................199

6 ZAKLJUČAK.......................................................................................219

7 CITIRANA LITERATURA......................................................................................222

8 ŽIVOTOPIS..........................................................................................237

Page 14: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

1. UVOD

Page 15: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

1. UVOD

Porast broja svjetskog stanovništva zahtjeva i razmjerno veću proizvodnju hrane stoga

se u modernoj poljoprivredi i dalje nužno koriste kemijska sredstva za zaštitu bilja nakon

čega mnogi njihovi ostaci završavaju u okolišu i hrani, štetno djelujući na ne ciljne vrste pa

i čovjeka (Beard 2005, Glavač 1999, Walker 2001, Wallace-Hayes i sur. 2000). Velika

skupina okolišnih kemikalija za zaštitu bilja su herbicidi. To su spojevi organskog ili

anorganskog porijekla koji služe za uništenje biljaka (lat. herba = biljka, caedere = uništiti).

S obzirom da je prometrin relativno postojan (sedamdeset i dva dana ali ponekad i do tri

godine ovisno o uvjetima okoliša), i može se detektirati u značajnijim koncentracijama u

okolišu i hrani, ovisno o postupku detekcije a kako se upotrebljava za suzbijanje

jednogodišnjih trava i širokoslisnog korovnog bilja u nasadima pamuka, lana ali i celera,

graška, kukuruza, soje, krumpira, suncokreta i mrkve, biljaka čiji je primarni i/ili sekundarni

konzument čovjek, smatrali smo potrebnim provesti toksikološki pokus s prometrinom na

animalnom modelu (Bardalaye i sur., 1985, Berg i Müller, 1995, Böcher i sur., 1992,

Böcher i Sorensen 1994, Gabrilevskaia i sur., 1972, Kamrin i sur., 2000, Raszyk 1986,

Svobodova i sur., 1995.).

Pregledom do danas nama dostupne literature, uočeno je da je publicirano relativno malo

toksikoloških i ekotoksikoloških radova o prometrinu vjerojatno stoga jer je većina

znanstvenika godinama naglasak u istraživanjima davala atrazinu i kloriranim triazinima

pretpostavljajući njihovu veću toksičnost u odnosu na tio-S-triazine. Također je objavljeno

samo nekoliko radova o utjecaju prometrina na imunološki sustav štakora (Giurgea i sur.,

1981, 1979, Messow i sur. 1990).Većina radova istražuje učinkovitost prometrina kao

herbicida u sklopu ispitivanja agrotehničkih postupaka,

Cilj rada je utvrditi toksikološko-patofiziološko djelovanje prometrina na fiziologiju

odabranih vitalnih organskih sustava na mišjem modelu (in vivo). Odabir metoda

istraživanja ukazuje kako je cilj ponajprije bio utvrditi najsuptilnije pokazatelje oštećenja

stanica i odrediti najranije pokazatelje smrti pojedinih stanica u vitalnim organima, te

dinamiku, jačinu i način smrti (apoptotičnu ili nekrotičnu) kao posljedicu djelovanja

prometrina.

Obrazloženje teme: dobar pokazatelj ranog toksičnog stresa na pojedine organe predstavlja

mjerenje aktivnosti serumskih enzima; naime, kao proteinske makromolekule, enzimi u

normalnoj fiziologiji ne mogu prolaziti kroz stanične membrane. Oštečuje li toksikant na

2

Page 16: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

bilo koji način stanicu, u izvanstaničnoj tekućini i krvi nalazit će se male količine pojedinih

enzima koji potječu od stanica pod toksičnim stresom. Budući da razina aktivnosti enzima

ovisi o ulasku enzima iz stanica u krv, funkcija i stupanj razvoja stanica u kojima se neki

enzim eksprimira kao i intenzitet ekspresije određuje koliko će enzima odumiranjem tkivnih

stanica dospjeti u cirkulaciju. S obzirom na tkivnu specifičnost enzima moguće je

lokalizirati ranu pojavu patološkog procesa i stupanj oštećenja. Nadopunu ovih rezultata

izvršilo se uporabom metoda histopatološke i enzimskohistopatološke analize. Metode

protočne citometrije i komet tehnika također imaju za cilj pokazati rane apoptotične

(annexinV-FITC) i nekrotične (propidij jodid) smrti na membranama stanica imunološkog

sustava i organa. Nadopuna ovim dvjema tehnikama su određivanja celulariteta

imunohematopoetskih organa.

Svrha rada je, s obzirom na naprijed obrazloženo, nadopuna dosadašnjih spoznaja o

toksičnom djelovanju prometrina kao induktora oksidativnog stresa na ne ciljne organizme

što predstavlja novi doprinos u procjeni rizika njegove potencijalne opasnosti po dobrobit i

zdravlje čovjeka i drugih sisavaca. Očekujemo da će rezultati dati osnovnu sliku o

interferenciji u metabolizmu organizma sisavaca te procjenu kojom jačinom prometrin kao

herbicid oštećuje vitalne sustave životinja. Analizom dobivenih rezultata pokušat će se

utvrditi postoje li naročito osjetljiva tkiva ili fiziološki sustavi koji mogu potencijalno

uzrokovati opadanje vitalnosti životinja i/ili smrt, također u razmatranje će se uzeti postoje

li spolno uvjetovane razlike u toksičnosti izazvane prometrinom, te postoji li međuovisnost

doze i vremena tijekom kontakta s prometrinom. Usporedbom dobivenih rezultata s

podacima u literaturi pokušat će se zaključiti postoje li razlike ili sličnosti u toksičnim

učincima između vrsta, poglavito u usporedbi dvaju najčešćih laboratorijskih životinja

(usporedba štakor <=> miš), što predstavlja korak za ekstrapolaciju procjene rizika za

čovjeka. Također smatramo da bi dobiveni rezultati predstavljali početnu točku za daljnje

pokuse međudjelovanja prometrina u smjesama toksikanata koje nalazimo zaostale u

okolišu (toksični sinergizam, antagonizam, adicija i dr.).

3

Page 17: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

2. LITERATURNI PREGLED

Page 18: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

5

2. LITERATURNI PREGLED

2.1. HERBICIDI

U užem smislu pod pojmom herbicidi podrazumjevaju se spojevi namjenjeni uništenju

korovnih biljaka. Poznate su brojne podijele herbicida, a ovdje su navedene s obzirom na

kemijske, fizikalne i biološko-fiziološke osobine i svojstva (Janjić 1985):

Prema učinku najčešće se dijele na:

- totalne (uništavaju sve biljne vrste) i

- selektivne (uništavaju samo određene biljne vrste)

Prema načinu i mjestu djelovanja mogu biti:

- kontaktnog djelovanja (djeluju u neposrednom kontaktu s biljkom i uništavaju biljne

dijelove s kojima su u dodiru)

- translokacijskog djelovanja (apsorbiraju se i prenose u razne biljne organe dalje od mjesta

ulaska i izazivaju njihovo odumiranje)

Prema toksičnosti za životinje i čovjeka (testirano na standardnim laboratorijskim životinjama)

najčešće se dijele na:

- skupina I – LD 50 < 50 mg/kg

- skupina II – LD 50 50-250 mg/kg

- skupina III – LD 50 250-1000 mg/kg

- skupina IV – LD 50 > 1000-5000 mg/kg

S obzirom na njihovu stabilnost u okolišu možemo ih označiti kao:

- vrlo stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja duže od 2 godine)

- stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja od 6 mjeseci do 2 godine)

- umjereno stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja 1 do 6 mjeseci) i

- slabo stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja kraće od 1 mjeseca)

Page 19: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

6

S obzirom na kemijsku strukturu dijelimo ih na:

- karbonske kiseline i njene derivate

- ariloksialilkarbonske kiseline i njene derivate

- derivate karbaminske kiseline

- derivati tio i ditiokarbaminske kiseline

- derivate karbamida

- derivati dipiridila

- nitrofenoli, nitroanilini i njihovi derivati

- heterociklički spojevi s dva atoma dušika u prstenu (diazini)

- heterociklički spojevi s tri atoma dušika u prstenu (triazini) 2.2. TRIAZINSKI HERBICIDI

Triazini su heterociklički spojevi s tri atoma dušika i tri atoma ugljika u šesteročlanom

prstenu. Triazinima pripadaju spojevi poput atrazina, simazina, terbutilazina, cijanazina i

prometrina. Triazini su još uvijek najčešće korišteni herbicidi u svijetu (Berg i sur. 1995,

Böcher i sur. 1994, Wallace-Hayes i sur. 2001).

Unutar ove skupine razlikujemo (sl. 1.) :

a) 1,2,3-triazin

b) 1,2,4-triazin

c) 1,3,5-triazin

NN

N

N

NN

N N

N

1,2,3-triazin 1,2,4-triazin 1,3,5-triazin

Slika 1.: Strukturalna građa molekula različitih tipova triazinskih spojeva

Page 20: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

7

Posljednji se još naziva i simetrični triazin i pridružuju mu se oznake sym-triazin ili S-

triazin. Svaki od ova tri oblika ima brojne derivate. Daleko najvažniji su derivati 1,3,5-triazina

(Falbe i Regitz 1995) Imaju široku primjenu kao pesticidi, zatim u industriji boja i u

proizvodnji eksploziva (Falbe i Regitz 1995, Wackett i sur. 2001).

Triazini su kao organski herbicidi vrlo efikasni u različitim biljnim kulturama.

Selektivno djelovanje rezultira vrlo uspješnim suzbijanjem sjemenskih širokolisnih i nekih

uskolisnih korova. U nižim dozama nedovoljno djeluju na višegodišnje korove (Glasnik zaštite

bilja 2000).

U većim dozama djeluju kao totalni herbicidi pa se primjenjuju za uništavanje biljnog pokrova

na željezničkim nasipima, putovima, u industrijskim objektima.

Simetrični triazini mogu se podijeliti u tri skupine:

kloro-triazini

metoksi-triazini

metiltio-triazini

Kao herbicidi počeli su se intenzivno primjenjivati prije 40 godina za uništavanje korova kod

različitih usjeva i za kontrolu rasta korova na nepoljoprivrednom zemljištu (Kniewald 2001).

Triazini pripadaju malo otrovnim pesticidima (Srebočan 1992). Vrijednosti LD50 oralno

za štakora za neke od triazina su prikazani u tablici 1.

Tablica 1: Relativna toksičnost nekih triazina za šakora prikazana kao LD50

triazin LD50 oralno štakor (mg/kg)

ametrin 964

atrazin 3080

cijanazin 334

prometrin 3750

simazin 5000

propazin > 5000

Page 21: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

8

2.3. OPĆA SVOJSTVA PROMETRINA

Metil-tio-S-triazinski spoj, molekulske formule: C10H19N5S, prometrin (N,N´-Bis (1-metiletil)-6-(metiltio)-1,3,5-triazine-2,4-diamine, sinonim: 2,4-bis (izopropilamino)-6-(metiltio)-S-triazin), malo je do umjereno toksičan spoj i seletivni pesticid opće namjene. Prometrin je aktivna tvar nekoliko herbicida u Republici Hrvatskoj (Glasnik zaštite bilja 2000) registriranih pod komercijalnim nazivima:

• Prometrex 50 SC, • Prohelan-T, • Gesagard 50 WP, • Gesagard 500 Fl.

U svijetu je registriran pod komercijalnim nazivima (Kamrin i sur. 2000, Maynard i sur. 1999):

• Caparol, • Caparol 80W, • Cotton-Pro, • N,N´-Diisopropyl-6-methylthio-1,3,5-triazine-2,4-diyldiamine, • G 34161, • Gesagard, Gesagard 50, Gesagard 500 • Merkazin, • 2-Methylmercapto-4,6-bis (isopropylamino)-S-Triazine, • 2- Methylthio- 4,6 bis (isopropylamino)-S-Triazine, • Polisin, • Primatol, • Primatol Q, • Prometrex, • Prometryn, • Prometryne, • Selektin, • Sesagard Prometrin se rabi za suzbijanje jednogodišnjih trava i širokoslisnog korovnog bilja u

nasadima pamuka, lana ali i celera, graška, kukuruza, soje, krumpira, suncokreta i mrkve, tj.

biljaka čiji je primarni i/ili sekundarni konzument čovjek. Dokazano je da djeluje kao inhibitor

Hillove reakcije u fotosintezi (Kamrin i sur. 2000, Wallace-Hayes i sur. 2001). Dobro je topiv u

Page 22: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

9

mastima i organskim otapalima. S obzirom na otrovnost za životinjske organizme svrstan je u

skupinu II ili III, ovisno o formulaciji (Glasnik zaštite bilja 2000, Kamrin i sur. 2000).

Oralno aplicirana LD 50 vrijednost za miša je 3750 – 3800 mg/kg tjelesne težine životinje

(EPA 1996, EPA-IRIS 2001, Extoxonet 1996, Kamrin i sur. 2000). Relativno je postojan u

okolišu (od sedamdesetdva dana a ponekad i do tri godine ovisno o uvjetima okoliša) i može se

detektirati u značajnijim koncentracijama u okolišu i hrani, ovisno o postupku detekcije

(Bardalaye i Wheeler 1985, Berg i sur. 1995, Böcher i sur. 1992, Böcher i Sørensen 1994,

Gabrilevskaia i Laskina 1972, Kamrin i Montgomery 2000, Raszyk 1986, Svobodova i sur.

1995).

Slika 2: Strukturna formula molekule prometrina

Page 23: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

10

2.3.1. PRISUTNOST PROMETRINA U OKOLIŠU

2.3.1.1. Prometrin u sedimentu vodenih ekosustava i pitkoj vodi

Triazini su naširoko prisutni u vodenim ekosustavima i pitkoj vodi. Posebice je istraživan

atrazin i njegovi metaboliti primjerice hidroksiatrazin i desetilatrazin, čija se visoka toksičnost

za čovjeka već duže vrijeme poznaje (Berg i sur. 1995). Međutim manje je podataka, ali ipak

postoje o prometrinu u vodi. Istraživanje njemačkih autora provedeno na uzorcima sedimenta

Njemačkog Wadden jezera, govori o detektiranim koncentracijama većim ili jednakim 500

ng/kg uzorka. Posebno visoke koncentracije bile su prisutne u estuariju rijeke Weser, što govori

o transportu rezidua herbicida s poljoprivrednih površina u more (Bester i Huenhnerfuss 1996).

ilustrativan primjer prave opasnosti od mogućeg toksičnog djelovanja prometrina na zdravlje

čovjeka predstavlja studija biomonitoringa pitke vode gradskog vodovoda u Ljubljani autorice

Leh i suradnika (2005), gdje se iznose podaci mjerenja rezidua pojedinih pesticida u gradskom

vodovodu od kojih prometrin doseže polovicu propisanih MAK vrijednosti za pitku vodu

odnosno 0.5 μg/L.

2.3.1.2. Mikrobiološka biorazgradnja prometrina i toksičnost za

mikroorganizme Studije utjecaja na mikroorganizme okoliša ukazuju da prometrin ne predstavlja ekotoksičnu

noksu koja bi u većoj mjeri mogla narušiti populacijsku ravnotežu pojedinih komponenti

mikroflore tla koja bi uzrokovala veće promjene u ekosustavu. Mikroflora tla vrlo je bitna za

biodegradaciju prometrina koji se našao u okolišu. Bezgulov i sur. izvještavaju da prometrin

apliciran svake godine u proljeće, tijekom 8 godina u dozama od 1.5 kg/ha nije pokazao

značajan utjecaj na mikroorganizme tla. Amonificirajuće bakterije i gljive, aktinomiceti i

denitrifikacijske bakterije pokazale su se neosjetljive na sve pesticide testirane u ovoj studiji, a

tako i na prometrin (Bezuglov i sur., 1976). U okolišu osim abiotičkih čimbenika koji utječu na

degradaciju i razgradnju prometrina, važnu ulogu imaju i mikroorganizmi, najviše bakterije.

Brojni su dokazi ovoj tvrdnji. Istraživanje u kojem autoklavirani i nesterilizirani uzorci gline,

svaki tretiran s 4 ppm prometrina i inkubiran 60 dana, kao suhi, bezvodni na 4 °C ili sa

prisutnih 75 % vlage na 30 °C pokazuju da više prometrina ostaje u steriliziranom vlažnom

Page 24: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

11

uzorku nego u nesteriliziranom. Također, uzgojem biljke krastavca u ovako pripremljenim,

nesteriliziranim uzorcima tla, nije bilo znakova fitotoksičnosti prometrinom nakon 47 dana. To

ukazuje na mikrobiološku razgradnju kao jedan od glavnih načina detoksikacije prometrina u

tlu. U istom radu autori opisuju pokus u kojem su uzorku tla tretiranog s prometrinom dodali 1

%-tnu otopinu glukoze i ekstrakte kvasca, nakon 30 dnevne inkubacije. Tako tretirani uzorak

tla sadržavao je manje prometrina u odnosu na kontrolu.

Dodatkom antibiotika, bakterijskog inhibitora kloramfenikola nakon 40 dnevne inkubacije

uzorak tla predtretiranog prometrinom sadrži više prometrina u odnosu na kontrolni uzorak.

Međutim, dodatkom cikloheksamida, gljivičnog inhibitora, uzorak nije pokazao statistički

bitnu razliku u koncentraciji prometrina u odnosu na kontrolu. Autori izvode zaključak da je

mikrobiološka degradacija prometrina uglavnom zasluga bakterijskih populacija u tlu (Hulin i

sur. 1973).

Bakterije tla degradiraju prometrin tijekom faze rasta. U kulturi bakterija selektiranih

predteretmanom prometrinom, identificirana su tri metabolita biorazgradnje. Autori ovog

pokusa utvrdili su da nakon bakterijske metabolizacije triazinski prsten ostaje intaktan. Rezultat

podržava hipotezu prema kojoj metiltio-S-triazini degradiraju u tlu procesom N-dealkilacije

bočnih ogranaka molekule. Intaktnost triazinskog prstena nakon bakterijskog djelovanja

ukazuje da bakteriološka degradacija rezidua prometrina u tlu ne znači nužno i potpunu

detoksikaciju tla (Giardina i sur. 1977).

2.3.2. NAKUPLJANJE PROMETRINA U BILJKAMA LJUDSKE PREHRANE

Korjenasto bilje, poput mrkve, repe, krumpira najbolji je modelni organizam za

demonstraciju akumulacije ksenobiotika. Bioakumulacija prometrina u biljkama koje primarno

i/ili sekundarno koristi čovjek i životinje tema je brojnih studija. Rezultati ukazuju da

koncentracija rezidua u biljci rijetko prelazi 0.1 ppm. Također vremenski, rezidue ne ostaju u

biljci dulje od nekoliko mjeseci, što izravno ovisi o apliciranoj koncentraciji. U prilog tome

govore rezultati studije akumulacije prometrina provedene na biljkama mrkve koje su rasle na

tlu tretiranom s 3 kg/ha, 5 kg/ha i 10 kg/ha. Pri najnižoj apliciranoj dozi od 3 kg/ha, prosječna

koncentracija prometrina u tlu prvi dan nakon aplikacije bila je 0.5 mg/kg, što je, prema

autorima granična vrijednost dopuštena u to doba u SSSR-u.

Page 25: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

12

Veće doze prometrina od 5 kg/ha i 10 kg/ha povećale su ostatke prometrina u tlu 7-13 puta više

od dopuštene granice (Gordienko 1977).

Autori Kavolyunayte i Shpokauksas (1974) izvještavaju da se koncentracija prometrina u

krumpiru uzgojenom na tlu tretiranom s 2 kg/ha i 4 kg/ha kreće između 0 i 0.08 mg/kg, a u

gornjim slojevima tla koncentracija se kretala između 0.01 mg/kg i 0.64 mg/kg.

Heinisch i Refenstein (1971) zabilježili su koncentracije od 0.02-0.05 ppm u mrkvi ubranoj

3-5 mjeseci nakonu tretirana od 2.5 kg/ha zemljišta za uzgoj.

U sličnom istraživanju nakon tretmana tla prometrinom koncentracijama 1.5 kg/ha, 2 kg/ha,

2.5 kg/ha i 3.5 kg/ha, 2 mjeseca nakon tretmana u korjenu mrkve utvrđene su koncentracije

0.22-0.27 mg/kg za dozu 1.5 kg/ha, 0.3-0.34 mg/kg za dozu 2 kg/ha, 0.08-0.11 mg/kg u lišću

mrkve i 0.22 mg/kg u tlu. Četiri mjeseca nakon aplikacije doza 1.5 i 2 kg/ha rezidue prometrina

nisu detektirane u korjenu, lišću i tlu.

Međutim, tri mjeseca od aplikacije utvrđene koncentracije u korjenu mrkve iznosile su 0.01-

0.02 mg/kg za dozu od 2.5 kg/ha i 0.03-0.05 mg/kg za dozu od 3.5 kg/ha. Kod ovih doza, čak i

6 mjeseci nakon aplikacije herbicida, tragovi prometrina bili su detektirani u lišću i korjenu

mrkve (Ivanova i sur. 1973).

Reifenstein i Heinisch (1973) utvrđuju da mrkva koja je rasla na tlu jednokratno tretiranom s

2-3 kg/ha sadrži prometrin u koncentraciji ispod 0.03 ppm, a vrijednost od 0.15 ppm, što je

iznad granične vrijednosti koja je iznosila 0.1 ppm u biljci, a prema tadašnjim propisima DDR-

a, izmjerena je samo u jednom uzorku od ukupno 46 izmjerenih. U gornjim slojevima tla autori

su nakon jednokratnog tretmana izmjerili koncentraciju prometrina ispod 0.02 ppm. Autori

zaključuju da aplikacija herbicida prometrina ne stvara problem s akumuliranim ostacima tog

herbicida

Studija Rumunjskih znanstvenika provedena na luku i mrkvi, s dozama 2-6 kg/ha

apliciranog prometrina, spominje koncetracije od 0.28-1.5 ppm u proljeće i 0.2-0.72 ppm u

jesen. Korijen luka je sadržavao koncentraciju od 0.008-0.018 ppm, a korijen mrkve 0.05-0.1

ppm. U lišću obaju biljaka izmjerena je koncentracija od 0.001-0.05 ppm (Rughinis i sur.

1977).

Norveški znanstvenik Fiveland proveo je sličan pokus na dva različita tipa tla (sjeverna

Norveška, tlo sa 6% humusnih tvari i tlo u južnoj Norveškoj s 9 % humusnih tvari). Aplicirane

doze prometrina bile su jednokratno 1.5 i 3 kg/ha i dvokratno (pre- i postemergentno) 1.5+1.5

Page 26: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

13

kg/ha i 3+3 kg/ha. Osim mrkve, sađena je i repa, obje biljke su kasnije analizirane kao model

akumulacije. Rezultati pokazuju koncentracije prometrina ispod 0.1 ppm u svim opisanim

slučajevima na obje lokacije. Dvije godine nakon aplikacije herbicida nisu nađeni tragovi

rezidua (Fiveland 1977).

U istraživanju koje je za cilj imalo utvrditi koncentracije prometrina akumulirane u

medicinskim biljkama uzgojenim pod tretmanom s 0.8-1 kg/ha prometrina, pokazalo se da

kamilica (Matricaria chamomillla), menta (Mentha piperita) i timijan (Thymus vulgaris) sadrže

koncentracije manje od 0.02 ppm. Autori zaključuju da prometrin ne predstavlja opasnost pri

uporabi za uzgoj ljekovitog bilja (Reifenstein i sur. 1975).

Opaženo je da biljke tretirane prometrinom imaju donekle izmjenjenu koncentraciju mikro i

oligo elemenata. Biljke uzgojene u tlu tretiranom s 1 kg/ha prometrina pokazuju ove promjene:

mrkva sadrži 11-22% više željeza (Fe), a uzgojena u tlu s 2 kg/ha prometrina sadrži 22 % nižu

koncentraciju željeza, dok je aluminij (Al) povećan za 38% . Paprika (zelena) je sadržavala

44% više željeza i statistički značajno višu koncentraciju molibdena (Mo) i bakra (Cu).

Spomenute koncentracije opadaju proporcionalno s porastom aplicirane doze (1.5 i 2 kg/ha)

u odnosu na kontrolu. Rajčica međutim, nakon tretmana prometrinom sadržavala za 59 %

manju količinu aluminija (Al), a s porastom doze (1.5, 2 kg/ha) opadala je i koncentracija (84

% manje u odnosu na kontrolu), ali se koncentracija željeza (Fe), nikla (Ni) i mangana (Mn)

nije bitno mijenjala bez obzira na dozu. Patliđan pri dozi 1 kg /ha nije promjenio koncentraciju

željeza (Fe), i mangana (Mn), ali je koncentreacija bakra (Cu) pala za 30 % pri dozi od 1 kg/ha,

a za 60 % pri dozi od 1.5 kg/ha od vrijednosti kontrolnih uzoraka (Baratov 1979).

Grožđe i merelica proizvedeni na tlu tretiranom s prometrinom u koncentracijama 7 i 9

kg/ha nisu sadržavali rezidue prometrina, ali su pokazali povećanu koncentraciju željeza (Fe),

nikla (Ni) i molibdena (Mo) ali ne i mangana (Mn) (Baratov i sur. 1981).

Osim doze, načina aplikacije i vremena karence i kulinarska priprema jestivog bilja igra

značajnu ulogu na putu herbicida do čovjeka.

Nasadi mrkve tretirani prometrinom (1 i 1.5 kg/ha) 77 dana prije ubiranja biljaka za ljudsku

prehranu sadržavale su koncentraciju (0.011-0.013 ppm) prometrina nižu od propisane.

Kulinarskom obradom (čišćenje, guljenje, pranje, rezanje, kuhanje) koncentraciju rezidua

prometrina reducira se za 75-100 % (Bognar 1977).

Page 27: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

14

2.4. TOKSIČNI UČINCI PROMETRINA NA FIZIOLOŠKE SUSTAVE ŽIVOTINJA 2.4.1. UČINAK PROMETRINA U NIŽIH KRALJEŽNJAKA I

BESKRALJEŽNJAKA

U pokusu istraživača Jordana i sur. (1977) punoglavci vrste Rana temporaria u dva različita

razvojna stadija bili su izloženi djelovanju Mediazan 50 i Gesagard 50. Promjene uzrokovane

ovim tvarima nastale su na probavilu, mozgu i mišićima. Mediazan je uzrokovao djelomične

lezije crijevnog epitela i parenhima jetre. Gesagard 50 pokazao je jači toksični učinak,

uzrokujući jake degenerativne promjene u probavilu i mozgu. Uz navedene uočene su i

promjene poput inhibiranog rasta životinje i retardacije u procesu razvoja operkuluma. Mlađi

punoglavci bili su manje osjetljivi od starijih.

Učinak Gesagard 50 na regeneraciju stražnjeg mozga punoglavaca vrste Xenopus leavis,

ovisno o upotrebljenoj koncentraciji uzrokovao je inhibiciju (0.001 % koncentracija) i

poremećaje regeneracije (0.0005 % koncentracija). Najniža testirana koncentracija (0.0001 %

prometirna) imala je stimulirajući učinak na regenerativne procese (Maryanska-Nadachowska i

sur. 1980 (RECD. 1981)). U pokusu utjecaja S-triazinskih herbicida na oogenezu triju vrsta kukaca Pterostichus

cupreus, Pterostichus melanosarius i Agonium dorsale, red Coleoptera, porodica Carabidae,

Gesagard 50 (prometrin) pokazao manju kemosterilizirajuću sposobnost u odnosu na Gesatop

50 (simazin), te selektivno djelovanje 10 % koncentracije samo na vrstu Pterostichus

melanosarius u odnosu na druge dvije vrste.

Kod P. melanosarius uzrokovao je piknozu u jezgrama trofocita. Taj učinak odgovarao je

učinku 13 % otopine drugog ispitivanog pesticida Gesatop 50 (simazin) (Rozek 1978).

Page 28: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

15

2.4.2. OPĆA I SISTEMSKA TOKSIČNOST PROMETRINA

Nakon kroničnog tretmana Wistar štakora prometrinom, dozama 2 i 190 ppm, smanjivala se

apsorpcija glukoze i osjetljivost na inzulin izoliranih dijafragmi štakora, ovisno o dozi pesticida

(Madar i sur. 1982).

Analizom krvi štakora tretiranih dozom od 50 mg/kg tijekom 6 mjeseci pokazalo se da životinje

pate od hiperglikemije i hiperkolesteremije. Također, životinje su imale reduciranu aktivnost

peroksidaze i ugljikove anhidraze (Martynyuk i sur. 1970). Autori Dinerman i Levrenteva

(1969) provode pokus određivanja LD 50 na štakorima. U pokusu koriste ruski i švicarski

preparat prometrina. Pokus je proveden na 37 životinja koje su dnevno primale suspenzije

prometrina gastričkom kanilom. Probit analizom, autori dolaze do podatka da je LD50 za

štakora 2100 mg/kg tjelesne težine za sovjetsku preparat prometrina i 750 mg/kg tjelesne težine

za švicarski preparat (Dinerman i sur. 1969).

Vrijednost LD 50 za štakora od 2150-3750 mg/kg iznose Heinisch i Reifenstein u radu

publiciranom nešto kasnije (Heinisch i sur. 1971). Prema Agrochemical Pesticide-Desk

Reference, CRC net Base, Chapman & Hall, LD 50 za glodavce je 3750 mg/kg (Kamrin i sur.

1999).

Studija postnatalnog učinka kombinacije simazina i prometrina na mladunce štakora u fazi

laktacije pokazala je negativne učinke na tjelesnu težinu, neuro-muskularne veze i tjelesni

razvoj, kao i na povećanu količinu opsonizanta C-reaktivnih proteina i povećan broj leukocita

(Messow i sur. 1990). Testiran na pilećim i štakorskim embrijima prometrin nije pokazao

značajne embriotoksikološke osobine u pogledu preživljavanja embrija (Dinerman i sur. 1970).

Page 29: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

16

2.4.3. IMUNOHEMATOTOKSIČNOST PROMETIRNA Tretmanom Whistar štakora tijekom 60 dana s dvostrukom dnevnom dozom 2 ppm i 190

prometrina inducira involutivne promjene timusa koje se očituju smanjenjem timusa,

smanjenjem količine ukupnih proteina i lezije DNA u timocitima (Giurgea 1979).

U radu u kojem je praćena citogenetička analiza stanica koštane moždine štakora nakon

djelovanja herbicida S-triazinske skupine, herbicid je injektiran jednokratno u dozama 1/10,

1/30 i 1/50 LD50 Analizom nakon 24 sata otkrivene su strukturalne promjene na stanicama

(fragmentacija) i kromosomska agregacija u kasnoj anafazi i ranoj telofazi (analizirano 200

stanica po životinji). Također je određivan mitotički indeks (analizirano je 300 stanica po

životinji). 1/10 i 1/30 doze imale su inhibicijski i supresijski učinak na mitozu stanica u

koštanoj moždini, a broj kromosomskih lomova u odnosu na kontrolu se povećao (Kulakov

1970).

Štakori tretirani 6 mjeseci dnevnim dozama od 50 mg/kg imali su morfološke promjene u

strukturi krvnih stanica uz pojačanu sedimentaciju eritrocita (SE) i redukciju protrombinskog

indeksa. S dnevnom dozom od 5 mg/kg apliciranu tijekom 3 mjeseca primjećena je samo

leukocitoza i redukcija protrombinskog indeksa (Martynyuk i sur. 1970).

Gzhegotskii (1968) izvještava o učincima akutnog i kroničnog izlaganja prometrinu na

perifernu krv štakora. Akutno izlaganje rezultiralo je u smanjenjem broja leukocita i limfocita,

te porastom eozinofila, neutrofila i monocita. Brzina koagulacije je povećana (592 sekundi u

akutno otrovanih životinja naprama 866 sekundi u kontrolnoj skupini). Ove promjene bile su

još jače izražene 10 i 12 sati nakon izlaganja u životinja koje su preživjele akutnu dozu.

Životinje u pokusu kronične izloženosti 50 mg/kg imale su iste promjene. Nakon četri i šest

mjeseci razvila se hipokromna anemija.

Page 30: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

17

2.4.4. UČINAK PROMETRINA NA ENDOKRINI I REPRODUKTIVNI SUSTAV ŽIVOTINJA

Nizom pokusa, brojni autori pokazali su da prometrin jako djeluje na endokrine funkcije

odnosno da djeluje kao endokrini ometač (prema engleskom pojmu: endocrine disruptor).

Istraživanja reproduktivne toksičnosti (faza I testova teratogenosti i reprodukcije) koja

uključuje analizu sposobnosti plodnosti i začeća nakon aplikacije toksikanta pokazala su da pri

dnevnoj aplikaciji doza 5 mg/kg tijekom tri mjeseca, spareni mužjaci i ženke štakora mogu dati

potomstvo. Međutim u istom radu autori opisuju i tretman dozom od 50 mg/kg tijekom 6

mjeseci nakon čega sparene životinje nisu dale potomstvo (Martynyuk i sur. 1970).

Muški albino štakori dnevno tretirani 20-kratno s dozom 1/20 LD 50 prometrina imali su

velike citološke alteracije u sjemenim kanalićima (tubuli seminiferi). Autori zaključuju da

prometrin ima jak gonadotoksični učinak. Također, dokazano je da utječe na morfologiju jezgre

spermija, na osobine primanja boja citoplazmatske RNA i afinitet pironina za citoplazmu

(Shtabskiy i sur. 1976).

Nadalje, u pokusu utjecaja S-triazinskih pesticida na metabolizam testosterona i stvaranje

kompleksa 5-alfa-dihidroksitestosterona i 5-alfa-dihidroksitestosteronskog receptora u prostati

štakora, Kniewald i sur. pokazuju antiandrogenski učinak prometrina. Pokazano je da u in vitro

sustavu prometrin kao i mješavina prometrina i atrazina imaju statistički značajan negativan

utjecaj na stvaranje kompleksa 5-alfa-dihidroksitestosteron-specifičnog receptora. Odnosno,

prometrin djeluje inhibirajuče na enzimske aktivnosti koje kataliziraju reakcije konverzije

prekursora u testosteron. Autori zaključuju da je inhibicija reverzibilna i nekompetitivna

(Kniewald i sur. 1995).

Isti autori dokazali su inhibirajuće djelovanje prometrina na osnovne enzimske sustave i

mogućnost vezanja androgena i njihovih receptora u hipofizama dvaju vrsta: štakora

(prometrin doziran in vivo) i teleta (hipofize tretirane in vitro) nakon izlaganja prometrinu. U

hipofizama ženske teladi utvrđeno je prevođenje testosterona u 5-alfa dihidroksitestosteron i 3-

alfa diol oblik što je isti mehanizam koji je utvrđen i kod mužjaka štakora u istom pokusu. U

muške teladi uglavnom je došlo do stvaranja androstendiona i androstandiona enzimima 17-

beta hidroksisteroid dehidrogenazom i 5-alfa reduktazom. Autori su jasno pokazali da

prometrin mijenja enzimske reakcije i utjeće na vezanje androgenih hormona na receptore u

Page 31: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

18

hipofizi te napominju potrebu za jačom kontrolom ovih tvari u okolišu kako bi se izbjegli

nekontrolirani i nepoželjni učinci na sustav regulacije produkcije spolnih hormona (Kniewald i

sur. 1983).

U sličnom pokusu u kojem se istraživao učinak različitih pesticida (atrazin, lindan i prometrin)

na stvaranje kompleksa estradiola i estradiolnog receptora u uterusu ženki štakora in vivo i in

vitro. Dokazano je da pod utjecajem prometirna dolazi do smanjivanja broja slobodnih veznih

mjesta na receptoru iako se afinitet vezanja estradiola za estradiolni receptor nije mjenjao pod

utjecajem pesticida (Težak i sur. 1992).

Osim žlijezda spolnog sustava ispitivan je i učinak na štitnjaču (tiroideu) i stanice ljudske

štitnjače u staničnoj kulturi. Promatran je učinak prometrina na diobu stanica, sintezu proteina,

enzimsku aktivnost u stanicama i sintezu hormona štitnjače Dokazano je da koncentracije

prometrina od 0.001-1 mg/15 ml dozirana na stanične kulture stanica ljudske štitnjače,

stimuliraju sintezu trijodtironina (T3) i inhibiraju sintezu tiroksina (T4). U slično osmišljenom

pokusu ali na modelu in vivo, štakori tretirani akutno s 50 ppm prometrina dobiveni su slični

rezultati potaknutog lučenja T3 i inhibiranog lučenja T4. Isti autori izvještavaju da je također

smanjena i količina luteinizirajučeg hormona (LH) izlučenog u plazmu tako tretiranih životinja

(Ghinea i sur. 1980).

2.4.5. UČINAK PROMETRINA NA NUKLEINSKE KISELINE, MUTAGENOST I GENOTOKSIČNOST Postoje indicije da prometrin i/ili neki njegovi derivati mogu biti inkorporirani u molekulu

RNA i DNA. Pretpostavlja se da djeluje kao bazni analog. Rezultati istraživanja na Eschericha

coli iz 1966. godine demonstriraju da prometrin djelomično nadomješta uracil u RNA i timin u

DNA (Temperli-Turler i Ercegovich 1966).

Raznovrsne kemikalije u okolišu, uključujući pesticide koji su nosioci sekundarnih i

tercijarnih amino grupa, predstavljaju opasnost po zdravlje životinja i ljudi zbog mogućnosti

stvaranja potencijalno kancerogenih nitrozospojeva u prisutstvu nitrita i uz pH 1 (uvjeti koji su

slični uvjetima u želucu čovjeka ). Egert i Greim proveli su pokus u kojem su u vremenu od 4

sata izložili prometrin HCl-u i octenoj kiselini pri pH 1, na 37 ° C. Produkt reakcije bili su N-

Page 32: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

19

nitrozo spojevi (14 % od ukupnog prometrina). Ovi produkti per se, bili su slabo ili nikako

mutageni na sojevima E. coli K12 i Salmonella typhimurium TA 1538. Međutim, mutagenost

produkata reakcije značajno se povećala nakon metabolične aktivacije mikrosomima mišje

jetre. Zaključak je autora da osim spojeva koji sadrže metil i etil supstituirane amino skupine i

spojevi s izo-propilamino grupama mogu stvarati potencijalno kancerogene nitrozo derivate.

Isti autori također zaključuju da tvari koje daju visoku koncentraciju nitrozo derivata

predstavljaju potencijalno opasanost jer u prisutnosti nitrita u ljudskom želucu mogu stvoriti

potencijalno kancerogene spojeve (Egert i sur. 1976).

Stevens i sur. izložili su soj-SD štakora tijekom cijelog životnog vijeka životinja utjecaju

prometrina dodajući ga u hrani i promatrali incidenciju nastanka mamilarnog tumora. Nakon

dvije godine, s dozama iznad maksimalne tolerabilne doze povećala se incidencija nastanka

tumora u odnosu na kontrolu (Stevens i sur. 1994).

Znanstvenici su razvili i neka molekularnobiološka oruđa za istraživanje prometrina, tako

postoje monoklonalna protutjela za prometrin. Skupina autora na Tehničkom Sveučilištu u

Münchenu 1990 godine proizveli su mišja monoklonalna protutjela za detekciju nekih S-

triazina, između ostalog i prometrina. Za detekciju enzimskim immunoassay-em. BALB/C

miševi imunizirani su derivatima herbicida (ametrin-sulfoksid i dikloratrazin) konjugiranim na

albumin iz goveđeg seruma (BSA).

Fuzijom stanica tako imunizirane slezene i mišjih mijeloma stanica PAI-B3AG8I stvorene su

hibridoma stanice. Nakon screening-a ELISA-om izolirana su četiri monoklonalna protutjela

na S-triazine i podvrgnuta daljnjoj karakterizaciji. Protutjela proizvedena protiv ametrin-

sulfoksida imala su jak afinitet prema prometrinu i terbutrinu. Detekcijski limit postignut je kod

vrijednosti od 0.3 mg/l (Giersch i sur. 1990).

2.4.6. METABOLIČNA RAZGRADNJA PROMETRINA U ORGANIZMU (PREDLOŽENI MODEL NA ŠTAKORU) Iako je toksikokinetika i biotrnsformacija kloro-S-triazina primjerice atrazina u štakora

poznata i detaljno opisana, vrlo je malo spoznaja o metaboličnim putevima prometrina i drugih

nekloriranih triazina u organizmu sisavaca. U publikaciji Maynarda i sur., predložen je model

detoksikacijskog mehanizma i metabolizma prometrina u štakora (Maynard i sur. 1999). Cilj

rada bio je utvrditi ukupnu razinu prometrina u tkivima, udio izlučen od aplicirane doze, kao i

Page 33: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

20

identificirati glavne metabolite prometrina. Uspoređivani su utjecaj jakosti doze i spola na

metabolizam prometrina, kao i utjecaj predtretmana ponavljanih doza prometrina na

metaboličnu sudbinu spoja. Dodatno, je in vitro istraživana uključenost c-P-450

monoksigenaznog sustava i mikrosomalnih monoksigenaza koje sadržavaju flavin (FMO-

enzimski sustav) u detoksikacijskom putu te je uspoređivana s rezultatima dobivenim u

pokusima in vivo.

Studija je provedena na mužjacima i ženkama (5 u skupini). Radioaktivno obilježeni

prometrin apliciran je gastričkom kanilom u dozama od približno 0.5 i 500 mg/kg. Nakon 3 do

7 dana životinje su žrtvovane. Analiza prometrina i njegovih metabolita provedena je u urinu,

fecesu, krvi, mozgu, kosti (femur stražnje noge), masnom tkivu, ovarijima i testisima, srcu,

bubregu, jetri plućima, i slezeni. Analiza je provedena visokotlačnom kromatografijom (HPLC-

om), masenom spektrometrijom i tankoslojnom kromatografijom (TLC-om). Veći postotak

(90-98 %) aplicirane doze izlučeno je urinom (46.5-53.3 %) i fecesom (33.1-45.5 %) u roku 7

dana od aplikacije. Oko 0.4-0.6 % doze nađeno je u tkivima, a značajan dio (1.2-1.9 %) doze

detektiran je u krvi. Ostaci prometrina nakupljeni u tkivima prema količinama od najmanje do

najveće nakupljene koncentracije su: masno tkivo, mišić, bubreg, jetra.

Ovi tkivno akumulirani ostaci bili su proporcionalni apliciranim dozama. Rezultati

pokazuju da je razina prometrina bila značajno veća u tkivima ženki nego u tkivima mužjaka.

Identificirano je preko 30 metabolita (slika 3.). Prema toj studiji metabolični putevi uključuju

N-demetilaciju, S-oksidaciju, S-S dimerizaciju, OH supstituciju s NH2 i SCH3, kao i

konjugaciju s glutationom i glukuronskom kiselinom. Inkubacijom mikrosoma jetre u in vitro

modelu dobiveni su slični rezultati. Faza I metabolizma, kako in vivo tako i in vitro obuhvaćala

je uglavnom S-oksidaciju i N-dealkilaciju (Maynard i sur. 1999).

Page 34: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

21

Slika 3: Predloženi putevi metabolične degradacije Prometrina u štakora, prilagođeno iz Maynard M.S., Brumback D., Itterly W., Capps T, Rose R. Metabolism of [(1)(4)C] prometryn in rats. Journal of Agricultural food and Chemistry, Vol. 47 (9), 3858-3865, 1999

Page 35: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

22

2.4.7. ENZIMI KAO DIJAGNOSTIČKI BIOMARKERI OŠTEĆENJA POJEDINIH ORGANSKIH SUSTAVA

Kemijske se reakcije u biološkim sustavima malokad zbivaju bez katalizatora tj.

specifičnih proteina-enzima. Bitne osobine svih enzima su njihova katalitička moć i

specifičnost. Neki enzimi sudjeluju u pretvorbi raznih oblika energije.

Cjelokupni metabolizam moguć je upravo zbog djelovanja enzima. Enzimi smanjuju energiju

aktivacije i time ubrzavaju reakcije barem 107 puta. Većina reakcija u biološkim sustavima ne

odvija se bez enzima zamjetljivom brzinom.

Enzimi su visokospecifični i po reakciji koju kataliziraju i po izboru reaktanata odnosno

supstrata, pa tako obično katalizira samo jednu kemijsku reakciju ili skup vrlo srodnih reakcija.

Specifičnost za supstrat je visoka, a katkad i potpuna.

Izoenzimi kataliziraju istu reakciju i međusobno su vrlo slični, ali imaju različitu primarnu

strukturu. Razlikuju se po svojstvima koja su važna za regulaciju aktivnosti, a u tome je

vjerojatno biološka funkcija tih multiplih oblika. Prema vrsti katalitičke reakcije razlikujemo

šest glavnih skupina enzima. Unutar glavnih skupina podjela se provodi prema kemijskim

vezama koje se cijepaju ili nastaju.

Glavne skupine enzima (Karlson 1988):

1. OKSIDOREDUKTAZE

- enzimi biološke oksidacije i redukcije

2. TRANSFERAZE

- enzimi koji prenose grupe

3. HIDROLAZE

-enzimi koji kataliziraju hidrolitička cijepanja

4. LIAZE

- kataliziraju reakcije eliminacije uz stvaranje dvostruke veze ili adicije na dvostruku vezu

5. IZOMERAZE

- kataliziraju pregradnju unutar molekula

6. LIGAZE -stvaraju veze uz istovremeno cijepanje ATP

Page 36: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

23

Neki su enzimi široko rasprostranjeni u raznim tkivima, a neki su specifični samo za neko tkivo

ili organ (tablica 2.). Prema rasprostranjenosti u organizmu, enzimi se mogu podijeliti u tri

skupine:

1. ORGANSKI NESPECIFIČNI ENZIMI

Većinom sudjeluju u energetskoj mijeni tvari. To su enzimi glikolize, oksidacije

glukoze i disanja, dakle enzimi koji sudjeluju u procesima u kojima se oslobađa energija.

Glikoliza se odvija na isti način u mišiću, srcu, bubregu i drugdje, što znači da su u svim tim

organima prisutni i enzimi potrebni za te procese, ali možda u različitim kvantitativnim

odnosima. Takvi su enzimi npr. laktat-dehidrogenaza, aldolaza i dr.

2. ORGANSKI SPECIFIČNI ENZIMI

Nalaze se samo u određenim organima i sudjeluju u metaboličnim procesima

koji se odvijaju samo u određenim organima. Npr. amilaza i lipaza.

3. ORGANSKI SPECIFIČNI IZOENZIMI

Mnogi enzimi se javljaju u više multimolekularnih oblika ili izoenzima. Pojedini

izoenzimi nekog enzima su specifični za određene organe. Tako je laktat-dehidrogenaza

prisutna u mnogim organima, ali su njeni izoenzimi specifični za neke organe. U miokardu

se laktat-dehidrogenaza nalazi u obliku svog izoenzima LDH1 i nešto LDH2, dok u jetri

dolazi kao izoenzim LDH5 i nešto LDH4.

Da bi se na osnovi promjene aktivnosti nekog enzima u serumu moglo zaključiti koji je organ

oštećen, treba znati koji su enzimi karakteristični za pojedini organ, odnosno tkivo (Štraus

1992).

Page 37: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

24

Tablica 2: Organska specifičnost pojedinih enzima (Štraus 1992)

Organ Enzim Specifičnost

Gušterača Lipaza +++ Amilaza ++ Aspartat-aminotrasferaza (AST) +

Slinovnice Amilaza ++ Kosti Alkalna-fosfataza (AP) ++

Prostata Kisela fosfataza (KP) +++ Miokard LDH1 ++

Kreatin-kinaza (CK) ++ Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) +

Poprečnoprugasti mišići Kreatin-kinaza (CK) ++ Aldolaza (ALD) + Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) + Aspartat-aminotrasferaza (AST) +

Jetra Kolinesteraza (AchE) +++ LDH5 ++ Aspartat-aminotrasferaza (AST) + Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) + Aldolaza +

Žučni vodovi Alkalna-fosfataza (AlP) ++ Pepsinogen +++

Želudac LDH1 ++ Eritrociti Kisela fosfataza (KP) ++

Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) + Aspartat-aminotrasferaza (AST) +

2.4.7.1. Laktat-dehidrogenaza (LDH, EC. 1.1.1.2.7.)

U kralježnjaka laktat-dehidrogenaza naziv je koji objedinjava skupinu tetramernih

citopalzmatskih izoenzima od otprilike 140 kD. LDH pripada u skupinu oksidoreduktaznih

enzima (EC klasifikacija). LDH katalizira reverzibilnu oksidaciju laktata u piruvat i obrnuto

redukcije piruvata u laktat. U toj reverzibilnoj reakciji ravnoteža je pomaknuta u smjeru

stvaranja laktat→piruvat. Reakcija teče optimalno pri pH 8.8 – 9.8 dok se reakcija u smjeru

piruvat→ laktat odvija optimalno kod pH 7.2 – 7.8

Page 38: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

25

Ova grupa izoenzima prisutna je i u eukariota i prokariota u čijim stanicama sudjeluje u

reakcijama glikolize tj. u anaerobnoj razgradnji glukoze. U tim reakcijama molekule glukoze

nastale razgradnjom ugljikohidrata, glukoneogenezom ili glikogenolizom, razgrađuju se do

dvaju molekula pirogrožđane kiseline. U aerobnim uvjetima piruvat će se transportirati u

mitohondrij gdje će biti oksidacijski dekarboksiliran do acetil-CoA, zajedničkog

intermedijera razgradnje aminoksielina, glukoze i masnih kiselina.

Acetil-CoA je supstrat za ciklus limunske kiseline iz kojeg se stvaraju prekursori

biosinteze biomolekula a također služi da bi se reducirali u NADH i FADH2 koji u

oksidativnoj fosforilaciji oslobađaju energiju za resintezu ATP. Međutim jedini proces koji

u anaerobnim uvjetima može dati energiju je glikoliza. Proces glikolize može se odvijati

samo uz dovoljne količine NAD+. Stoga se redukcijom nastali NADH mora neprestano

reoksidirati u NAD+ (slika 4.).

Slika 4.: Prikaz molekularne strukture ljudske laktat-dehidrogenaze, podjedinice M iz poprečnoprugastog mišića Ec: 1.1.1.2.7. dobiven difrakcijom x zraka Preuzeto iz: Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L.: Structural Basis for Altered Activity of M- and H-Isozyme Forms of Human Lactate Dehydrogenase. Proteins 43 pp. 175 (2001) Naime, kada se stanica nađe u uvjetima

nedovoljne opskrbljenosti kisikom (npr. pri

jakoj mišićnoj aktivnosti), piruvat se reducira u L - laktat uz katalizu LDH, prilikom ćega se

NADH oksidira u NAD+. Ovo je put kojim se regenerira NAD+ potreban za glikolizu kada

stanice ne dobivaju dovoljno kisika. Anaerobnom glikolizom u mišićima nastali L - laktat

krvlju dospjeva u jetru. Laktat nastao pri kontrakciji mišića pretvara se u jetri u glukozu,

koja se ponovno može vratiti u mišić i pohraniti u obliku glikogena.

Page 39: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

26

Slika 5.: Prikaz molekularne strukture ljudske laktat-dehidrogenaze, podjedinice H iz srčanog mišića Ec: 1.1.1.2.7. dobiven difrakcijom x zraka, sinonim: LDH-B Preuzeto iz: Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L.: Structural Basis for Altered Activity of M- and H-Isozyme Forms of Human Lactate Dehydrogenase. Proteins 43 pp. 175 (2001)

U većini tkiva u organizmu tetramer LDH, odnosno njegove izoenzimske oblike, čine

dvije različite podjedinice koje se prema razini ekspresije u pojedinim organima označavaju

sa M (od engl. muscle) i H (od engl. heart) (slika 5.).

M i H podjedinice razlikuju se međusobno u naboju. Kod sisavaca podjedinica M je znatno

negativnija od podjedinice H, dok je kod većine ptica, gmazova i vodozemaca razlika u

naboju manja. Kod određenih vrsta riba H podjedinica je negativnija od M. Dijelovanjem 12

M otopinom ureje ili 5 M otopinom guanidina tetramer se može razgraditi na monomere. Da

se podjedinice, monomeri, spontano vežu međusobno stvarajući izoenzime LDH, pokazao je

već davno Nieland 1952. godine (Štraus 1992). Ovisno o sastavu podjedinica, biokemijskim

osobinama, elektroforetskoj pokretljivosti i rasporedu u stanicama različitih organa, u

čovjeka razlikujemo pet izoenzima:

LDH1 (H4) LDH2 (MH3) LDH3 (M2H2) LDH4 (M3H) LDH5 (M4)

Karakterističan je odnos frakcija koje se pojavljuju u svim tkivima čovjeka. LDH1 i LDH2

izoenzimi (ili α - HBDH izoenzimi) su najzastupljeniji oblici u srcu, a LDH3, LDH4 i LDH5 (ili

LDH - P izoenzimi) u poprečnoprugastim mišićima i jetri.

Različiti izoenzimi LDH pokazuju i različite enzimske osobine. LDH1 (H4) izoenzim ima

malu KM odnosno veliki afinitet za piruvat i inhibira ga visoka koncentracija ovog metabolita,

Page 40: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

27

stoga on ima funkciju laktat-oksidaze. LDH5 (M4) izoenzim ima suprotna svojstva tj. veliki

KM odnosno niski afinitet za piruvat koji ga ne inhibira, stoga je on laktat-reduktaza. (Boyer i

sur 1963, Blake i sur. 1968, Schmidt 1968, Schatz 1969, Wuntch i sur. 1969, Kruse - Jarres

1979, Franković 1990, Strayer 1991, Kopperschlager i Kirchberger 1996, Kaneko 1997,

Schmidt 2000, Hakenberger - Kutuzović 2001)

LDH izoenzimski sustav jedan je od najčešće istraživanih modela za porjeko i evoluciju

izoenzima i multigenomski reguliranih enzimskih sustava. Podjedinice kodiraju geni ldha (za

podjedinicu M stoga je neki autori nazivaju LDH - A), ldhb za podjedinicu H koju neki atori

nazivaju LDH - B. U kralježnjaka LDH - A je najupotrebljavaniji za redukciju piruvata u

anaerobnim tkivima primjerice mišiću, a LDH - B za oksidaciju laktata u aerobnim tkivima

primjerice srčanom (Bengtsson i Karlsson 1980, Shoei - Lung Li 1998). U sisavaca i

kolumbidnih ptica postoje i geni tzv. ldhc koji se eksprimiraju u germinalnom epitelu testisa

tijekom spermatogeneze stvarajući treći oblik tetramera izoenzim LDH - C4 (slika 6.)

specifičan samo za testise, koji se po svojim karakteristikama razlikuje od ostalih izoenzima

LDH i prilagođen je jedinstvenim metaboličnim potrebama pripadajućeg tkiva (Li i sur. 1998).

Tetramer LDH - C4 poznat je i pod starijim nazivom LDH - X testikularnog tkiva. U štakora je

njegova molekularna masa 125 ± 4 kD (Schatz i Segal 1969).

Slika 6.: Prikaz molekularne strukture mišje laktat-dehidrogenaze, izoenzimskog tetramera C4 iz testisa Ec: 1.1.1.2.7. dobiven difrakcijom x zraka, sinonim: LDH-B Preuzeto iz: Hogrefe, H. H., Griffith, J. P., Rossmann, M. G., Goldberg, E.: Characterization of the antigenic sites on the refined 3-A resolution structure of mouse testicular lactate dehydrogenase C4 J Biol Chem 262 pp. 13155 (1987)

U vodozemaca i gmazova dokazana je ekspresija samo LDH - A i LDH - B (Shoei - Lung Li

1998). Posebice je zanimljivo da je u očnoj leći nekih ptica i krokodila LDH - B strukturalni

Page 41: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

28

protein poznat i pod nazivom epsilon - kristalin (PROSITE 1988). U naprednijih koštunjača

LDH-C eksprimira se jedino u oku dok se kod primitivnijih teleosta, ukoliko posjeduju gen,

LDH-C eksprimira ubikvitarno. Evolutivno gledano geni za LDH-C u ptica, vodozemaca

(Xenopus) i nekih riba nastaju duplikacijom iz gena za polipeptid LDH - B (srčani izoenzim) a

u sisavaca iz gena za polipeptid LDH-A (mišićni izoenzimi). U čovjeka geni za LDH - A i

LDH-C nalaze se na kraćem kraju 11-tog kromosoma, a u miša na 7 kromosomu što nadalje

potvrđuje filogenetsku vezu dvaju gena u sisavaca (Shoei - Lung Li 1998). U obje vrste, kao i u

štakora podjedinica A sačinjena je od 332 aminokiseline (Olsson 2003). Geni LDH - A, B i C u

sisavaca isprekidani su sa 6 introna u kralježnjaka, a postojanje samo dva introna u

beskralježnjaka pokazano je po prvi puta na jednoj vrsti nematoda (Shoei - Lung Li 1998).

Usporedbom sekvenci gena za LDH u različitih vrsta sugerira se visoka sličnost i očuvanost

strukture gena za LDH, primjerice usporedbom sekvence za LDH - A laboratorijskog miša Mus

musculus i čovjeka sličnost je 93.98 %, laboratorijskog štakora 96.69 %, Drosophile

melanogaster 61.45 %, C. elegans 58.84 % E. coli 24.60 % slijeda baza.

Budući da se LDH nalazi u citoplazmi, dovoljno je da se promijeni propusnost stanične

membrane pa da enzim iz citoplazme prijeđe u cirkulaciju i da se aktivnost u serumu povisi.

Zbog toga mu se aktivnost u serumu poveća već i kod lakših oštećenja tkiva u kojima se nalazi.

Stoga LDH izoenzimi imaju veliku važnost kako u dijagnostici veterinarske i humane kliničke

analitike, fundamentalnom znanstveno istraživačkom radu na poljima filogenije, ekologije i

evolucije (Çolak i sur. 2002), ali i temeljne fiziologije (npr. fiziologija stresa), toksikologije,

ekotoksikologije, biokemijske filogenije i dr.

Normalne serumske vrijednosti LDH ovise o dobi, vrsti organizma i fiziološkom stanju

(Matsuzawa i sur. 1993), primjerice za čovjeka:

Kruse - Jarres (1979): odrasle jedinke 120 - 140 U/L , novorođenčad 300 - 700 U/L

Jaeger i Hedegaard (2002):

Odrasli bez navedenog spola, optimum 125 U/L, Štraus (1992):

Odrasli bez navedenog spola 150 - 310 U/L na 30°C.

Page 42: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

29

Za laboratorijskog miša vrijednosti vrlo varijabilne ovisno o soju miša.

Kaneko (1997): bez specificiranja soja, spola ili uzrasta 366 U/L,

Santos (2005): 25 - 35 g teške mužjake miševa soja Swiss 370.4 ± 77.4 U/L

Mady (2002): 22 - 25 g teške ženke soja Swiss 1714 ± 27.86 U/L

Za štakora prosjek aktivnosti LDH u serumu navode:

Kaneko (1997): 464 ± 22 U/L,

Anbarust (2005): mužjaci Wistar štakora, 100 - 120 g, 104.71 ± 7 U/L,

Franković (1990): 55.51 – 158.67 U/L (srednja vrijednost 100.33 ± 34.09 U/L).

Za ostale životinjske vrste nalazimo prema navodima autora naredne aktivnosti LDH u serumu.

Kaneko (1992):

1. Konj 162 - 412 U/L (252 ± 63 U/L) 2. Govedo 692 - 1445 U/L (1061 ± 222 U/L) 3. Ovca 238 - 440 U/L (352 ± 59 U/L) 4. Koza 123 - 392 U/L (281 ± 71 U/L) Svinja 380 - 634 U/L

(499 ± 75 U/L) 5. Pas 45 - 233 U/L (93 ± 50 U/L) 6. Mačka 63 - 273 U/L (137 ± 59 U/L)

Radman i Harapin (1998):

1. Konj do 400 U/L. 2. Govedo do 1500 U/L 3. Ovca do 530 U/L Svinja do 600 U/L 4. Pas do 100 U/L 5. Mačka do 7 U/L

Page 43: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

30

Prema pojedinim organima aktivnost LDH također je različita. Za čovjeka primjerice aktivnost

LDH u pojedinim organima odnosno u njihovim homogenatima Štraus (1992) navodi:

1. poprečnoprugasti mišić 147 U/g, 2. jetra 145 U/g, 3. srce 124 U/g, 4. bubreg 106 U/g, 5. limfni čvorovi 83 U/g, 6. gušteraća 50 U/g, 7. eritrociti 36 U/g, 8. pluća 27 U/g.

Za mužjake Wistar štakora 100 - 120 grama Anbarust (2005) navodi aktivnost LDH u

pojedinim organima odnosno u njihovim homogenatima:

1. pluća 19.5 ± 1.17 U/mg proteina, 2. srce 18.42 ± 1.12 U/mg proteina 3. jetra 13.80 ± 2.10 U/mg proteina, 5. bubreg 9.75 ± 0.28 U/mg proteina, 6. mozak 8.20 ± 1.09 U/mg proteina

Slično, u tekstu Clinical chemistry (http://dir.niehs.nih.gov/dirlep/2005.) iznešene su slijedeće vrijednosti LDH prema aktivnosti u organima štakora:

1. poprečnoprugasti mišić 453 U/g

2. srce 360 U/g

3. jetra 212 U/g

4. probavilo 185 U/g

5. bubreg 167 U/g

6. serum 109.5 ± 9.1 U/L

Značaj mjerenja aktivnosti LDH u toksikološkim i kliničkim istraživanjima je velik

pogotovu mjerenje aktivnosti u serumu i organima ili elektroforetska karakterizacija pojedinih

frakcija izoenzima. Najbitnije je napomenuti da se prilikom promatranja povećanja ili

smanjenja LDH u serumu, a u svrhu dijagnosticiranja bolesti ili tumačenja patološko -

toksikoloških ili farmakoloških učinaka noksi, uz LDH treba uspoređivati kretanje i drugih

kliničko fiziološko - biokemijskih (napose enzimskih) parametra.

Page 44: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

31

Za svaki organski sustav za koji se postavlja ovakav tip dijagnostike setovi varijabli koji se

uspoređuju uglavnom su dugogodišnjim istraživanjima već standardizirani, stoga u slijedećem

pregledu literature napomenut će se i kretanje ostalih parametara karakterističnih za oštećenje

pojedinog organskog sustava. LDH je raširen u većini tkiva po cijelom organizmu. Iako među

tkivima zamjetne razine u ekspresiji enzima postoje, on najčešće indicira sistemsku toksičnost

ali i oštećenja onih organa koji ga sadrže najviše. Primjerice, izraženija promjena aktivnosti

LDH u serumu uočena je kod bolesti i oštećenja skeletne muskulature, srca (uglavnom infarkt i

perikarditis), jetre, pluća a u manjoj mjeri kod kancerogenih oboljenja i oboljenja gušteraće.

Mnogi autori spore informativnost LDH enzima u patološkoj dijagnostici upravo zbog njegove

ubikvitarnosti, a drugi pak iznose brojne dokaze o njegovoj dobroj dijagnostičkoj vrijednosti.

Dio tih korelacija razine LDH s toksičnim ili patofiziološkim noksama iznosimo u daljnjem

tekstu.

LDH i poprečnoprugasti mišić. Miozitis i polimiozitis, amputacije, pasaža parazita,

distrofije, miotoksične miopatije tipična su stanja kod kojih se aktivnost LDH mijenja (raste ili

opada), dok se primjerice kod miastenia gravis izmjerene vrijednosti ne mijenjaju osim ako se

istovremeno oštećuje jetra ili drugi organi koji sadrže puno LDH. Također uočeno je da

pojačana fizička aktivnost i učestalo vježbanje u čovjeka i svinja znatno povećava aktivnost

LDH u poprečnoprugastim mišićima, dok isti parametri kod konja umanjuju aktivnost LDH u

serumu, obrazloženje nije poznato. Mehanizmi koji uzrokuju miotoksičnost poprečnoprugastih

mišića uključuju promjene u staničnoj membrani mišića i promjene u energetskom i

metaboličnom statusu povezanom s mitohondrijima (Evans 1996, Capsoni 2000, Larsson i

Oldfors 2001).

Već blaža promjena propusnosti stanične membrane uzrokuje izlazak sadržaja iz sarkoplazme u

krv, što se mjerenjem aktivnosti očitava kao povećanje aktivnosti LDH u serumu. Kako

oštećenjem membrane ona biva sve jače propusna, proporcionalno raste i vrijednost aktivnosti

serumske LDH, a ukoliko dijelovanje noksa na poprečnoprugasti mišić traje kronično može se

zabilježiti i opadanje aktivnosti LDH, ovakva dinamika vrijedi i za ostale organe i enzime

(Bacci i sur. 1999).

Uz spomenute promjene aktivnosti serumske LDH za točnije dijagnosticiranje oštećenja

poprečnoprugastih mišića uz izravne enzimsko-histokemijske metode bojanja LDH na uzorku

poprečnoprugastog mišićnog tkiva, koje su ograničene semi-kvantitativnošću, moguće je pratiti

Page 45: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

32

promjene aktivnost enzima aspartat aminotransferaze (AST), kreatin-kinazae (CK), aldolaze,

troponina (njihovo standardiziranje tek je u istraživačkoj fazi) ili kreatina i mioglobina. Iako se

promjene ovih enzima prate i kod oštećenja srčanog mišića uslijed infarkta miokarda, a metoda

razlikovnog testa je mjerenje promjena pojedinih izoenzima ili njihovo elektroforetsko

razlučivanje (CK - MP i LDH1 i LDH2 (tj. α - HBDH) najbolji su izoenzimski pokazatelji za

dijagnosticiranje miopatija skeletnog mišića). Kod infarkta miokarda, promjena aktivnosti teče

na slijedeći prepoznatljiv način. Prvo najviše poraste aktivnost CK, oko 20 - 40 puta, zatim

AST do 10 puta, sve unutar prvih 24 sata. LDH u serumu počinje rasti 8 - 10 sati nakon infarkta

miokarda, unutar 48 - 72 sata doseže povećanje 5 - 6 puta a normaliziranje vrijednosti uočava

se tek 8 - 14 dana nakon infarkta miokarda. U većine ostalih miokardijalnih oboljenja

aktivnosti enzima u serumu su normalne. Jedino kod perikarditisa mogu biti umjereno

povišene, a postoje i indicije da hipoksično - anoksična stanja nastala uslijed nekih toksikanata,

primjerice etanola mogu povistiti serumski LDH, CK i mioglobin, porijeklom iz srca, ili

promjeniti izoenzimsku elektroforetsku pokretljivost LDH mozga pri izoelektričnom

fokusiranju. Budući da su promjene spomenutih enzima na opisani način uglavnom uočene kod

infarkta miokarda, a u drugih se miokardijalnih miopatija vrlo rijetko mjenja enzimska slika

LDH i spomenutih enzima, njihova promjena najčešće se pripisuje uglavnom oštećenjima

poprečnoprugastih mišića (Schmidt 1968, Schatz 1969, Wuntch i sur. 1969, Kruse - Jarres

1979, Moses i Henderson 1987, Franković 1990, Štraus 1992, Evans 1996, Kaneko 1997,

Guppy i Littleton 1999, Schmidt 2000, Capsoni 2000, Larsson i Oldfors 2001, Rajab i sur.

2004, Park i sur. 2004, Vianna i sur. 2004).

Toksikološki gledano, brojni su primjeri miotoksičnog djelovanja različitih polutanata,

pesticida ili lijekova koji mijenjaju aktivnost LDH u serumu. U štakora klorpromazin apliciran

intramuskularno, ali ne i intraperitonealno podiže razinu aktivnosti enzima tipičnih za mišićje.

U pokusu provedenom na zečevima simvastatin, sredstvo za snižavanje lipida, izaziva lezije

poprečnoprugastog mišićja. Jedno drugo hipolipidemično sredstvo, 3-hidroksi-3-metil-glutaril-

koenzim A (HMGCoA) uzrokuje iste promjene u pokusu provedenom na marmozetu. Injekcije

diazepama, benzoktamina i petidina u pokusu provedenom na psima te diazepama, lidokaina i

digoksina u pokusu na zečevima uzrokuju nekroze mišića i povećanje razine enzima u serumu

(poglavito CK). Slična miotoksična svojstva sa relativno kratkotrajnim učinkom na povećanje

Page 46: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

33

aktivnosti serumskih LDH i CK pokazali su u pokusima na štakorima i majmunima ketamin i

tetraciklin (Evans 1996).

U studiji utjecaja kadmija i terapije antioksidantom difenilselenidom (toksikološki

antagonist mnogih teških metala poput arsena i dr.) Santos i sur. (2005) pokazuju da zbog

lipidne peroksidacije koja je uslijedila nakon aplikacije kadmija subkronično, aktivnost LDH u

serumu naraste i do 1.99 puta više od normale. Hirano (1996) u studiji utjecaja inhalatorne

toksičnosti različitih teških metala bilježi znatno povišenje aktivnosti LDH u

branhioalveolarnoj tekućini i zaključuje da je linearna korelacija porasta aktivnosti ovog

enzima i polimorfonuklearnih leukocita s dozama teških metala pokazatelj da je aktivnost LDH

najbolji indeks za vrednovanje potencijala izazivanja pulmonarne upale uzrokovane

inhalacijom aerosola koji sadrže teške metale. U raspravi rezultata autor predlaže da takvo

mjerenje postane obavezni standard pri svim inhalatornim studijama toksičnosti.

U pogledu inhalatorne toksičnosti, postoje dokazi da i duhanski dim povećava razinu LDH u

serumu (Anbarasi i sur. 2005). Anbarasi i autori pokazuju utjecaj duhanskog dima cigareta na

LDH i izoenzimski elektroforetski uzorak. Nedvojbeno razina aktivnosti ukupne LDH u

štakora je povećana u svim analiziranim organima (mozak, pluća, srce, jetra, bubreg, serum) i

izoenzimskim frakcijama. Nije uvjek slučaj da toksikanti povećavaju razinu serumske LDH

aktivnosti, neki drugi otrovi koji imaju drugačije puteve farmakokinetike, distirbucije i

akumulacije, te ciljno pogađaju organe koji sadrže manje količine LDH ne uzrokuju takve

promjene. Primjerice Boscolo i sur. (1982) u kroničnoj studiji toksičnosti arsena prisutnog u

vodi za piće u koncentraciji od 50 μg/ml tijekom 320 dana, na štakorima ne bilježe znatnije

povećanje aktivnosti LDH u serumu. Autori uočavaju manje patološke promjene na

hepatocitima, ali velika patološka oštećenja na bubregu (Boscolo i sur. 1982). Bubreg sadrži

manje LDH nego jetra, poprečnoprugasti i srčani mišić, a u samom bubregu postoje razlike u

količini LDH, pri čemu distalni kanalići imaju više LDH nego proksimalni kanalići (Stonard

1997).

Izraženiji porast aktivnosti LDH u serumu uočen je kod šoka i trauma, što je posljedica

djelovanja stresa na srčani mišić, ali i djelovanja neurohormona koji se luče tijekom stresa na

poprečnoprugasti mišić. Sanchez i sur. (2002) u studiji utjecaja akutnog stresa na oštećenja

tkiva istražuju dijelovanje socijalnog i emotivnog stresa na miševima, a kao pokazatelje

oštećenja tkiva uspoređuju razinu serumske aktivnosti LDH, AST, CK, ALT, De Ritisov omjer,

Page 47: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

34

α- HBDH, CK-MB enzima, razinu EGF i glikogena. Pri obje vrste ispitivanog stresa životinje

su pokazale razinu aktivnosti serumske LDH značajno višu od kontrolnih životinja i normalnih

referentnih vrjednosti. Rezultati pokazuju da osim srca i drugi organi doprinose povećanju

razine LDH i kod emotivnog i kod socijalnog stresa. Autori se napose osvrću i na

poprečnoprugasti mišić. LDH spada među enzime koji se standardno u medicinsko

biokemijskoj dijagnostici uspoređuju kako bi se otkrilo oštećenje jetre, iako najveći dio

dijagnostike u pogledu jetre odnosi se na aktivnosti AST i ALT te De Ritiusovog omjera.

Kolokvijalno, LDH AST, ALT (najčešće mjereni), SDH, GDH, ICDH, MDH¸ 5´nukleotidaza

(rjeđe korišteni) nazivaju se još i «jetrene probe», naime kod primjene većine ljekova, ali i pri

toksikološkim studijama u većine otrova, a zbog biotransformacijske i filtracijske uloge jetre,

dolazi do oštećenja hepatocita i/ili žučovodnog epitela. Ciroza, toksični hepatitis, virusni

hepatitis, naročito nekroza ali i apoptoza hepatocita koji slijede nakon nabrojanih stanja te kod

postojanja metastaza, osobito onih u jetri nalaze se visoke aktivnosti LDH. (Evans 1996,

Kaneko 1997, Radman i Harapin 1998, Štraus 1992). Franković primjerice (1990) dokazuje

porast aktivnosti LDH u plazmi nakon djelovanja 2,4-D na organizam štakora pri čemu se kao

glavni uzrok ovog porasta pokazao milijarni hepatitis u otrovanih životinja.

Kod oboljenja gušteraće, iako je najbolji pokazatelj patoloških promjena α - amilaza,

povećanje aktivnosti LDH u serumu daje sliku o tijeku bolesti a pogotovo usporedbom

promjena omjera aktivnosti LDH:AST govori o nekrotičnim promjenama u gušteraći (Isogai i

sur. 1998). Isogai objašnjava ulogu LDH kao osjetljivog indikatora nekroze gušteraće u razvoju

bilijarnog pankreatitisa. Autor napominje da je aktivnost tzv. jetrenih enzima u pacijenata koji

boluju od bilijarnog pankreatitisa u ranoj fazi bolesti povišena. Kao razlog navodi se akutna

upala jetrenog tkiva u najranijem tijeku bolesti. Nadalje autor govori da se pri kroničnom tijeku

bolesti, a ukoliko se u bolesnika pojavljuje nekroza gušteraće, aktivnost LDH održava na vrlo

viskoj razini. Kao potvrdu nekrotičnim promjenama autor napominje da omjer LDH:AST,

promatran tijekom tri tjedna, u pacijenata sa nekrozom gušteraće viši nego u onih koji nisu

imali taj simptom. Potvrdu postojanja nekrotičnih promjena gušteraće autor je dobio CT

skenerom abdomena pacijenata s bilijarnim pankratitisom. Isogai zaključno ističe ovaj indeks

omjera vrlo vrijednim (poput De Ritiusovog omjera za jetru) i naglašava njegovu dijagnostički

informativnu vrijednost te ga preporuča kao standardnog za spomenute bolesti gušteraće, uz

ostale pokazatelje pankrasnih oštećenja pr. α-amilaze, glukoze, inzulina.

Page 48: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

35

2.4.7.2. Gama-glutamil-transferaza, γ-GT, GGT (EC. 2.3.2.2.)

γ-glutamil-transferaza dimerni je glikozilirani enzim (glikoprotein) lociran na vanjskoj strani

membrane epitelnih stanica, veličine 80 - 90 kD prema Štraus (1992) ili 90 - 350 kD prema

Kaneko (1997). Prema EC klasifikaciji svrstava se u skupinu hidrolaza, peptidaza (točnije

karboksipeptidaza). Peptidaze kataliziraju hidrolitičko cijepanje peptida do manjih peptida ili

aminokiselina.

γ-GT reverzibilno katalizira prijenos γ- glutamilne skupine s γ-glutamil-peptida na druge

polipeptide u L-aminokiselina, uz prisutstvo ATP. Prvotno je γ-GT nazvana transpeptidaza, ali

je termin kasnije promijenjen u prikladniji, transferaza. Fiziološka uloga povezana je sa

metabolizmom glutationa (ciklus sinteze glutationa, γ-glutamilski ili Meisterov ciklus) i

stvaranjem merkapturnih kiselina u krajnjim stupnjevima detoksikacije i biotransformacije

reakcija faze II u bubregu (Kaneko 1997, Štraus 1992, Evans 1996). U daljnjem pregledu

literature biti će iznešene neke novije spoznaje o mogućim drugim različitim ulogama ovog

enzima.

γ-GT koji se koristi kao biomarker u toksikologiji tj. kao kliničko - dijagnostički marker,

dimer je sastavljen od dva glikolizirana monomera koji potječu od jednog polipeptida

(propeptid). Taj polipeptid je kodiran jednim genom sa višestrukim promotorskim mjestima i

vrlo kompliciranim procesom transkripcije, translacije te kasnijim proteolitičkom

transformacijom (splicing) u dva različita monomera. Monomeri se spajaju stvarajući

heterodimer koji se usidri na vanjskoj strani membrane stanica koje sadrže γ-GT. Manjim

dijelom (oko 10%), γ-GT može postojati u jetri, kao slobodna, topiva forma. Vezani γ - GT

prelazi u slobodni γ - GT enzimskim procesom, vjerojatno dijelovanjem proteaza ili

deterdžentskim djelovanjem žućnih kiselina.

U publikaciji Joyce - Brady i sur. (2000) demonstriralo se postojanje γ - GT enzima i na

membrani endoplazmatskog retikuluma, ali se nakon posttranskripcijske i translacijske obrade

ne događa spajanje monomera u heterodimer već su samo monomerne jedinice uklopljene u

strukturu membrane. Kao takve one su aktivne ali je primjetno da izostaje njihova transferazna

aktivnost. Označava se nazivom γ - GTΔ7, a veličine je 44 kD. Prisutnost monomera na

membrani uočena je u tkivima koja imaju visoku razinu ekspresije γ - GT, primjerice bubreg,

Page 49: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

36

stoga autori zaključno navode vjerojatno postojanje novih funkcija vezanih uz endoplazmatski

retikulum, za razliku od same transaminacije koju vrši heterodimerni ektoenzim stanične

membrane. Predlažu da monomer služi kao receptorna signalna jedinica koja signalizira manjak

ekspresije γ - GT, i aktivira ER da proizvede dodatne transpeptidazne dimere.

Razni multipli oblici enzima razlikuju se u glikozidnom dijelu molekule. Glikozidni dio

sadrži šećere heksoze, heksamine i sijalinsku kiselinu. Prema tome «izoenzimi» γ - GT nisu

pravi izoenzimi nego multipli oblici (izoforme) nastali posttranslacijskim modifikacijama

(Joyce - Brady i sur. 2000, Kaneko 1997, Štraus 1992, Evans 1996). Chikhi i sur. (1999) u

studiji organizacije i ekspresije gena za γ - GT u štakora, miša, svinje i čovjeka utvrđuju visoku

konzerviranost genoma tijekom evolucije a stoga i visoku sličnost γ-GT među spomenutim

vrstama, što potvrđuju i autori prethodno citirane publikacije Joyce-Brady i sur. (2000).

Nadalje, Chikhi i sur. (1999) u svojoj studiji zaključuju da se indukcija transkripcije gena za γ -

GT odvija s nekoliko promotorskih mjesta unutar jednog gena, upravo takva kompleksna

organizacija transkripcije omogućuje njenu indukciju nakon različitih vrsta oksidativnog

podražaja ksenobiotika koji ovisno o afinitetu za pojedino promotorsko mjesto pokreću

transkripciju s pripadajučih promotorskih mjesta. Zaključno, autori tumače da je upravo taj

komplicirani mehanizam zadužen za široku paletu stanične antioksidativne obrane preko

inducirane ekspresije γ-GT.

Elektroforezom serumskih proteina u zdravih ljudi nalaze se obično samo dvije izoforme.

Najveći dio aktivnosti otpada na izformu γ-GT1 Ostatak aktivnosti čini izoforma γ-GT 2 U

lipemičnim serumima koji sadrže hilomikrone na startu zaostaje dio koji se označuje kao γ-GT0

Dokazano je da ovaj «izoenzim» predstavlja kompleks γ-GT sa hilomikronima, i kad se uklone

hilomikroni nestaje i ova frakcija γ - GT iz seruma. Katkad se u serumu pojavljuju i γ- GT3 i γ-

GT4

Najviše γ - GT ima u bubrežnim tubulima, vezanog na četkasti obrub (engl. brush border)

epitelnih stanica proksimalnih tubula, te u Henleovoj petlji, žučovodu, stijenci tankog crijeva i

mozgu (horionskim pleksusima), dakle upravo na mjestima gdje se izvodi apsorpcija ili

prijenos aminokiselina kroz stanične membrane. Nešto manje, ali ipak znatne količine nalaze se

u hepatocitima, gušteraći i prostati. Ima ga vrlo malo, ali značajno u jajnicima, mlječnim

žlijezdama, placenti, slezeni, plućima, štitnjači, leukocitima i eritrocitima.

Page 50: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

37

U tjelesnim tekućinama najveća aktivnost γ - GT je u sjemenoj tekućini, u žuči, urinu i krvnoj

plazmi. U čovjeka normalno povišena koncentracija je u novorođenčadi do dva mjeseca

starosti. U trudnoći je razina γ - GT snižena (Štraus 1992).

Serumske vrijednosti u zdravih odraslih ljudi iznose (prema autorima u zagradi):

1. muškarci : 7 - 40 U/L (Štraus 1992), do 28 U/L (Kruse - Jarres 1979) 0 - 65 U/L, optimum 32.5 U/L (Jeger i Hedegaard 2002)

2. žene: 4 - 25 U/L (Štraus 1992), do 18 U/L (Kruse - Jarres 1979) 0 - 45 U/L, optimum 22.5 U/L(Jeger i Hedegaard 2002)

3. novorođenčad: do 100 U/L (Kruse - Jarres 1979) 4. bez specificiranog spola 2 - 65 U/L (Deepak i Rosen 2000)

Serumska aktivnost γ - GT relativno je niska u pasa mačaka, miševa i štakora, a zamjetno je

viša u konja, preživača i zamoraca. Također je dokazano da kolostrum krave, ovce i koze ali ne

i kobile sadrže visoke razine vrijednosti γ - GT (Kaneko 1997).

Kaneko navodi slijedeće vrijednosti γ - GT u serumu životinja:

1. Konj 4.3 – 13.4 U/L (7.6 ± 1.5 U/L) 2. Govedo 6.1 – 17.4 U/L (157 ± 4 U/L) 3. Ovca 20 - 52U/L (33.5 ± 43 U/L) 4. Koza 20 - 56 U/L (38 ± 13 U/L) 5. Svinja 10 - 60 U/L (35 ± 21 U/L) 6. Pas U/L 1.2–6.4 U/L (3.5±1.8 U/L) 7. Mačka 1.3 – 5.1 U/L

Radman i Harapin (1998) navodi slijedeće vrijednosti aktivnosti γ - GT za slijedeće vrste životinja:

1. Govedo do 1500 U/L 2. Svinja do 600 U/L 3. Ovca do 530 U/L 4. Konj do 400 U/L 5. Pas do 100 U/L 6. Mačka do 7 U/L

Page 51: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

38

Za miševe u literaturi se ovisno o soju navode slijedeče vrijednosti γ - GT aktivnosti u serumu:

1. Mady (2002): 12.50 ± 0.65 U/L za ženke, 22 - 25 g, Swiss albino

2. Silva i sur. (2004): 25.52 ± 3.71 U/L (serum) i 0.22 ± 0.03 U/g (jetra), mužjaci, 25 - 30 g, Swiss albino

Porast aktivnosti γ - GT u serumu izuzetno je osjetljiv i pouzdan spram drugih enzima u

serumu. Kada se koristi uz transaminaze i GLDH, vrlo je dobar za diferencijalnu dijagnostiku u

medicinskoj biokemiji. Kod akutnog hepatitisa on se od svih enzima najsporije vraća u

normalu. Njegovo utvrđivanje nije toliko važno da se utvrdi početak bolesti koliko je važno da

se utvrdi tijek bolesti. Kod hepatobilijarnih bolesti porast aktivnosti primarno je uzrokovan

oštećenjem žučovoda a tek sekundarno zbog oštećenja hepatocita.

Dobar toksikološki model je tretiranje životinja s ANIT (α - naftil - izotijocijanat) koji

primarno oštećuje žučovodni epitel a kronično uzrokuje njegovu nemalignu hiperplaziju,

posljedica čega je povišenje vrijednosti γ - GT u serumu. Kod akutne intoksikacije s oštećenjem

jetre aktivnost γ - GT poraste najmanje dvostruko. Kod slabijeg otrovanja jetre GLDH poraste

više od γ - GT. Kod zamašćenja jetre netoksičnog porijeka γ - GT raste slično transaminazama.

Kod malignih promjena u jetri vrijednosti γ - GT su enormno povišene. Kod akutnog

pankreatitisa i kod upale žučnih kanala također raste vrijednosti γ - GT.

Vrijednosti γ - GT su povišene u krvi u slijedećim slučajevima: hepatobilijarne bolesti,

bolesti gušterače, u bolesnika koji uzimaju lijekove što induciraju enzime endoplazmatskog

retikuluma (npr. barbiturati, dilentin, pogotovu alkohol). Koncentracija γ - GT je povišena i

nekoliko dana nakon infarkta miokarda. Taj se test ne upotrebljava u dijagnostici infarkta

miokarda jer nije specifičan.

Određivanje razine ovog enzima ima vrijednost i u diferencijalnoj dijagnostici žutice. Kao

marker nefrotoksičnosti, koriste se vrijednosti γ - GT u kombinaciji s AP (Štraus 1992).

U toksikologiji je posebice zanimljiv pokus na ovcama koji ističe potencijal enzimske

dijagnostike kao bitnog diskriminatornog selekcijskog fenotipskog obilježja u fundamentalnoj

populacijskoj genetici toksičnosti. Naime, ovcama koje su prirodnim putem bile izložene

hepatotoksinu sporidezminu poveća se razina γ - GT u serumu kao izravna posljedica ligacije

Page 52: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

39

žučovoda. Selektirajući one ovce sa minimalnom ili nikakvom promjenom aktivnosti γ - GT

tijekom nekoliko generacija dobiva se linija ovaca u potpunosti otpornih na ovaj hepatotoksin

(Kaneko 1997).

Page 53: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

40

2.4.7.3. Alkalna-fosfataza, ALP, AP, AlP (EC. 3.1.3.1.)

Naziv obuhvaća grupu izoformi glikoproteinskih enzima. Prema EC klasifikaciji spadaju u

skupinu enzima hidrolaza mase 40-83 kD, koji pri alkalnom pH kataliziraju hidrolitičko

cijepanje fosfatnih monoestera, uključujući i ATP.

ortofosfatni monoester + H2O → alkohol + ortofosfat

U alkalnom dijelu pH skale, između 8.4 i 10.5 se nalazi optimalno područje djelovanja, po

čemu je enzim i dobio ime. Enzim je vezan na stanične membrane kao tetramer i prisutan je u

većini tkiva, upravo na sekretornim i apsorptivnim površinama. U serumu se nalazi otopljen

kao dimerna hidrofilna forma, manje molekularne mase (Slika 7.).

Tetramernih membranskih hidrofobnih formi, veće molekularne mase najviše ima u epitelu

tankog crijeva, bubrežnim tubulima (proksimalni tubuli), u kostima (primarno na

osteoblastima), jetri (na epiteli žućnih kanalića), placenti, plućima, slezeni i leukocitima.

(Štraus 1992).

Slika 7: Prikaz molekularne strukture ljudske alkaline fosfataze, Ec: 3.1.3.1., dobiven difrakcijom x zraka Preuzeto iz: Le Du, M. H., Stigbrand, T., Taussig, M. J., Menez, A., Stura, E. A.: Crystal Structure of Alkaline Phosphatase from Human Placenta at 18 A Resolution. Implication for a Substrate Specificity. J.Biol.Chem. 276 pp. 9158 (2001)

Page 54: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

41

ALP je jedan od enzima o kojem se danas podosta zna jer je od 1920-tih pa do danas često

upotrebljavan u medicinskoj i veterinarskoj dijagnostici, ali i fundamentalnim znanstvenim

istraživanjima kao oruđe u vizualizaciji imunohistokemijskih preparata, u ELISA assay-u,

Western bloting-u i mnogim drugim znanstvenoistraživačkim metodama.

ALP je grupno specifični enzim; hidrolizira najrazličitije estere ortofosfata s primarnim i

sekundarnih alkoholima, šećerima, cikličkim alkoholima, fenolima, aminima kao akceptorskim

molekulama za oslobođeni fosfat. Ne djeluje na difosfatne estere. Niska specifičnost se očituje i

u tome što hidrolizira i pirofosfat.

Kako je već spomenuto membranski ALP je tetramer, serumski ALP je dimer, a svaka

podjedinica (monomer) sadrži atom cinka (Zn), dakle dva atoma Zn po molekuli za serumke

hidrofilne oblike i četiri za transmembranske. Zn atomi imaju ulogu u održavanju nativne

konformacije i sudjeluju u katalitičkom procesu. Nalazi se u organizmu u multimolekularnim

oblicima od kojih su neki izoenzimi, a drugi izoforme nastale nakon sinteze enzima, te se

govori o jetrenoj, koštanoj, crijevnoj, bubrežnoj i placentarnoj alkalnoj fosfatazi.

Danas znamo da svi ovi oblici nisu pravi izoenzimi. Tri su prava izoenzima ALP koje

kodiraju tri razna gena u čovjeka i majmuna primata. To su intestinalni, placentarni i tkivni

nespecifični izoenzim. Tkivni nespecifični gen izražen je u jetri, kostima i bubregu. Stoga su

intestinalna i placentarna ALP pravi izoenzimi, dok su jetrena, koštana i bubrežna ALP

izoforme jednog tkivno nespecifičnog izoenzima. Za razliku od spomenuta tri gena kod čovjeka

i primata u drugih sisavaca, nalaze se samo dva gena za ALP. Jedan koji u pravilu kodira za

intestinalnu ALP i drugi koji kodira ostale oblike ALP koji su antigenski slični budući da ih

kodira jedan gen.

Postoje rjetke iznimke, primjerice zec, kod kojeg su oba gena eksprimirana u jetri, probavilu

i bubregu ili konj kod kojeg se i intestinalna ALP eksprimira još i u bubregu. Serumska ALP

upravo zbog navedenih interspecijskih razlika potiječe u različitih vrsta u većoj mjeri od

različitih organskih sustava. U štakora primjerice glavninu aktivnosti serumske ALP

obuhvaćaju izoforme porijeklom iz probavila i kosti, kod psa glavnina aktivnosti pripisana

hepatičkoj izoformi. U pokusima na štakorima uočilo se da aktivnost ALP i serumu raste nakon

obilnog obroka dok kod drugih laboratorijskih životinja to nije slučaj. Slično u psa injiciranjem

glukokortikoida raste aktivnost ALP u serumu za koji je uočeno da je nakon takvog tretmana

Page 55: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

42

hiperglikoziliran. Vrlo niske aktivnosti serumske ALP poznate su u pasa i mačaka (Evans 1996,

Jeger i Hedegaard 2002).

Vrijednosti aktivnosti serumske ALP za laboratorijskog miša i štakora dane su s obzirom na

navode različitih autora u slijedećem popisu:

Za laboratorijskog miša: Mc Clure (1999):

C57BL; 94 - 99 U/L Albino CD-1; 22.2 U/L

Cruz i sur. (2004):

B6C3F1; 82 ± 10 U/L Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004):

Soj nije specificiran 35 - 96 U/L Kaneko (1997):

Soj nije specificiran 66 ± 19 U/L Khan i sur (2005):

Balb/c (9 - 14 tj.); 20 U/L

Za laboratorijskog štakora: Mc Clure (1999):

Soj nije specificiran; 39 - 216 U/L Franković. (1990): Y59; 44.03 ± 2.94 U/L (39.5 – 44.9 U/L) Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004):

Soj nije specificiran 16 - 50 U/L Kaneko (1997): Soj nije specificiran 133 ± 134 U/L

Kemijski sastav ALP varira ovisno o mjestu sinteze te se tako može locirati izvor povišenja

koncentracije u krvi. Općenito govoreći u većine vrsta standardnih pokusnih životinja

bubrežna ALP nije prisutna u serumu već se glavnina aktivnosti pripisuje jetrenom

porijeklu (tj. iz epitela žućnih kanalića).

Vrijednosti serumskih ALP u pojedinih životinja prema različitim autorima su navedene u

slijedečem popisu:

Page 56: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

43

Kaneko (1997):

1. Konj 143 - 395 U/L (244 ± 101 U/L) 2. Govedo 0 - 488 U/L (194 ± 126 U/L) 3. Ovca 68 - 387 U/L (178 ± 102 U/L) 4. Koza 93 - 387 U/L ( 219 ± 76 U/L) 5. Svinja 118 - 395 U/L (104 ± 84 U/L) 6. Pas 20 - 156 U/L (66 ± 36 U/L) 7. Mačka 25 - 93 U/L (50 ± 35 U/L)

Radman i Harapin (1998):

1. Konj do 190 U/L 2. Govedo do 105 U/L 3. Ovca 24 - 124 U/L 4. Svinja 74 - 157 U/L 5. Pas do 100 U/L 6. Mačka do 37 U/L

ALP je organospecifični enzim, za razliku od laktat-dehidrogenaze gdje je krakterističan

odnos frakcija koje se pojavljuju u svim tkivima. U serumu zdravih osoba potječe obično iz

jetre, u djece iz kosti, u trudnica povišena je koncentracija i u trećem tromjesečju trudnoće,

dok je bubreg izvor urinarne ALP (Štraus 1992).

U ljudskim organima nalazimo na slijedeće vrijednosti aktivnosti ALP :

Štraus (1992): 1. probavilo (duodenum) 51.1 U/g 2. kosti 42.5 U/g 3. jetra 33.1 U/g 4. bubreg 28.8 U/g 5. prostata 72 U/g

Kao normalne serumske vrijednosti bez specificiranog spola aktivnosti ALP autori navode:

Štraus (1992): 1. ljudi (odrasli) 50 - 200 U/L DEA pufer, 2. ljudi (odrasli) 30 - 90 U/L AMP pufer, 3. djeca do 3. god. 120 - 280, 4. djeca od 3. – 15. god. 100 - 300 U/L, 5. djeca od 15. – 20. god. 40 - 165 U/L.

Page 57: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

44

Kruse - Jarres (1979): 1. ljudi (odrasli) 40 - 190 U/L, 2. djeca od 1. – 10. dana 40 - 190 U/L, 3. djeca od 10. – 30. dana 110 - 600 U/L, 4. djeca od 2. – 12. mjeseca 140 - 700 U/L, 5. djeca od 2. – 8. god 110 - 600 U/L, 6. djeca od 8. god života 130 - 700 U/L

Jeger i Hedegaard (2002): odrasli : 20 - 125 U/L , optimum odrasli 72.5 U/L djeca: 40 - 400 U/L , optimum djeca 220 U/L

Koncentracija u ALP krvi povišena je u razdoblju intenzivnog rasta kostiju jer je ALP tipičan

enzim osteoblasta. Visoke koncentracije u osteoblastima sudjeluju u nagomilavanju velikih

koncentracija ortofosfata zbog čega se u konačnici omogućuje mineralizacija koštanog

matriksa. Stoga se tijekom infantilnog i juvenilnog rasta kostura uočava povišena koncentracije

ALP u krvi. Do povišenja dolazi i nakon fraktura velikih kostiju. Prilikom stvaranja kalusa

povečava se aktivnost ALP u serumu

Osobito je velika dijagnostička vrijednost određivanja ALP u koštanim bolestima i

bolestima jetre i žučnih vodova. Porast vrijednosti ALP javlja se i kod oboljenja koja su

popraćena pojačanim pregrađivanjem koštane tvari – osteitis deformans. Rahitis, osteomalacija,

hiperparatireodizam te tumori kostiju – uz približnu proporcionalnost razine ALP u serumu s

veličinom tumora; su stanja karakterizirana povišenjem koncentracije ALP u krvi.

Kod jetrenih bolesti također nailazimo na porast ALP aktivnosti, primjerice neinfektivni

hepatitis je jedno od takvih patoloških stanja. Žučne kiseline induciraju sintezu ALP, stoga je

razina ALP u krvi povišena u svakom tipu bilijarne opstrukcije, primjerice u infiltracijskih

bolesti jetre kao što su granulomi, apscesi i tumori, te u primarnoj bilijarnoj cirozi.

Blago povišenje, koje nema veze ni s jetrom niti s kostima se javlja zbog, abdominalne

bakterijske infekcije, a ponekad zbog nekih stanja miokarda. Razina ALP snižena je ispod

normalne u samo nekoliko bolesti, naročito u hipoparatireozi (Brain i Davenport 1927, Štraus

1992).

Page 58: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

45

2.4.7.4. Kreatin, kreatinin i kreatin-fosfokinaza, kretin-kinaza (CK, CPK,

EC. 2.7.3.2.)

Kreatin je po kemijskoj strukturi metilguanidooctena kiselina. Gubitkom molekule vode iz

njega nastaje kreatinin, koji je prema tome anhidrid kreatina. Metabolizam kreatina i kreatinina

odvija se u mišićima, jetri bubrezima i gušteraći. Prvo u bubrezima iz arginina i glicina nastaju

ornitin i guanidooctena kiselina. Guanidinooctena kiselina prelazi u jetru (manjim dijelom u

gušteraću), gdje se pomoću metionina metilira i nastaje kreatin.

Kreatin krvlju dospjeva u bubreg, gdje se u odraslih osoba filtrira u glomerularni filtrat i

tubulima gotovo sav reapsorbira. Iz krvne plazme ga aktivnim transportom preuzimaju mišične

stanice, u kojima se fosforilira te nastaje energetski bogati kreatin–fosfat. Prilikom kontrakcije

mišića kreatin fosfat služi kao donor energije, pri čemu se ponovno oslobađa kreatin. Kreatin-

fosfat se u mišićnim stanicama i spontano raspada pri čemu nastaje kreatinin. Tako nastali

kreatinin se krvlju prenosi do bubrega, gdje se glomerularnom filtracijom izlučuje iz

organizma. Kreatin-kinaza (CK, CPK, EC 2732) enzim je koji katalizira reakciju prijenosa

fosfata između kreatin fosfata i ADP, tj između kreatina i ATP. Iz ovih se reakcija stvara ATP

potreban za rad mišića. CK je enzim od 85 kD. Enzim je dimer koji se sastoji od monomera s

masom od 413 kD (slika 8.).

Slika 8.: Prikaz molekularne strukture ljudske kreatin-kinazae, podjedinice M iz ljudskog poprečnoprugastog mišića, Ec: 2.7.3.2 dobiven difrakcijom x zraka Preuzeto iz: Shen, Y.-Q., Tang, L., Zhou, H.-M., Lin, Z.-J.: Structure of Human Muscle Creatine Kinase Acta Crystallogr., Sect.D 57 pp. 1196 (2001)

Page 59: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

46

Poput prethodno opisane LDH i kod CK postoje monomerni oblici mišićni M (od engl. muscle)

i moždani B (od engl. brain) koji se spajaju u tri izoenzimska oblika (MM, MB, BB).

Enzim je najrasprostranjeniji u poprečnoprugastim mišićima i mozgu. Prema zastupljenosti

CK u pojedinim organima čovjeka navodi se:

Štraus (1992): 1. poprečnoprugasti mišić 2030 U/g 2. mozak 670 U/g 3. glatki mišić 12 U/g 4. bubreg 2 U/g 5. jetra 0.7 U/g 6. serum odrasli muški 20-110 U/L

odrasli ženski 10-80 U/L

Kreatina ima u serumu, eritrocitima, gastrointestinalnoj tekućini, žući, znoju i likvoru.

Koncentracija kreatina u serumu rezultat je fiziološke ravnoteže njegova nastajnja, prelaska u

mišiće i u kreatinin te izlučivanja bubrezima (Štraus 1992). Punch (2005) navodi primjere

koncentracije kreatinina koja je u novorođenčadi poradi male mišićne mase relativno niska (0,2

puta manja od odraslih ljudi), a u ljudi koji prakticiraju body building visoka. Autor također

opisuje dinamiku koncentracije serumskog kreatinina ovisno o funkciji bubrega. Navodi da

otklanjanjem jednog bubrega i neposrednim mjerenjem koncentracije kreatinina ona je još

uvijek normalna, ali se već slijedeći dan koncentracija raste za otprilike 18 puta viša od

početnog stanja i kao takva ostaje za ostatka života pacijenta, ukoliko se oba bubrega odstrane

primjerice kod tumora, koncentracija serumskog kreatinina neprekidno raste iz dana u dan do

dijalize.

Brzina porasta serumskog kreatinina biti će direktno proporcionalan mišičnoj masi jedinke. U

odraslih ljudi koncetracija kreatinina vrlo je malena te se jedva može dokazati. Normalne

vrijednosti kreatinina u čovjeka prema različitim autorima dana je u slijedećem popisu:

Štraus (1992): Odrasli, serum, muški 0.6 - 12 mg/dL, urin 0.8 - 2 g Odrasli, serum, ženski 0.5 – 1.1 mg/dL, urin 0.6 – 1.8 g

Kruse - Jarres (1979): odrasli do 1.2 mg/dL u serumu i

1 – 1.5 g/24 h u urinu http//:www.rnceus.com/renal/renalcreat.html (2004):

odrasli muški 0.8 – 1.4 mg/dL u serumu i

Page 60: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

47

ženski 0.6 – 1.1 mg/dL u serumu djeca 0.2 – 1.0 mg/dL

Prema navodima autora referentne koncentracije za laboratorijske glodavce navedene su u

slijedećem popisu:

Za laboratorijskog miša: Mc Clure (1999): C57BL 0.88 – 1.01 mg/dL Albino CD m-0.74mg/L; f-0.66 mg/dL Cruz i sur. (2004): B6C3F1; 0.24 ± 0.06 mg/dL Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004): Soj nije specificiran 0.2 – 0.9 mg/dL Kaneko (1997): Soj nije specificiran 0.5 ± 1.4 mg/dL Santos i sur (2005): Swiss albuno mužjaci (25-35 g); 0.2 mg/dL

Za laboratorijskog štakora:

Mc Clure (1999):

Soj nije specificiran 0.2 – 0.8 mg/dL Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004):

Soj nije specificiran 0.5 - 1 mg/dL Kaneko (1997): Soj nije specificiran 0.40 ± 3.75 mg/dL

Page 61: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

48

Koncentracija kreatina povišena je kod atrofije i distrofije mišića te nakon amputacija.

Određivanje serumskog kreatina dijagnostički je važno samo pri atrofiji i regeneraciji mišića u

miopatijama.

Porast kreatinina u serumu izravno je povezan s oštećenjem više od polovice ukupnog broja

nefrona u oba bubrega, pri kroničnom nefritisu, miopatijama uslijed gigantizma, akromegalije i

miastenia gravis.

Smanjene serumskog kreatinina, i kod ljudi i kod laboratorijskih životinja najčešće je

povezano s sa smanjenjem ukupne mišične mase (pr. u starijih jedinki ili fizički premalo

aktivnih) neadekvatnom prehranom s premalo proteina, miotoksičnošću, i različitim mišićnim

atrofijama. Klirens kreatinina tijekom 24 sata odnosnom promjena koncentracije kreatinina u

urinu bitna je dijagnostička odrednica bubrežnih funkcija jer za razliku od BUN testa kreatinin

nije posebno osjetljiv na hepatička oštećenja, a promjene nastaju pri većem oštećenju nefrona

(http//:www.rnceus.com/renal/renalcreat.html 2004, Kruse Jarres 1979, Štraus 1992, Kaneko

1997).

Page 62: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

49

2.4.7.5. Alanin-aminotransferaza, ALT ili AAT (EC. 2.6.1.2.)

ALT katalizira reverzibilnu reakciju transaminacije između L - alanina i 2 - oksoglutarne

kiseline. Enzim je poznat i pod sinonimima alanin-trasferaza, glutamat-piruvat-transaminaza

(od tog naziva ranije uporabljana kratica-GPT). Enzim spada u veliku skupinu

aminotransferaza tj transaminaza, koji kataliziraju reverzibilni prijenos amino skupine između

aminokiselina i ketokiselina. Većina aminokiselina u prvom koraku razgradnje i posljednjem

koraku sinteze de novo podliježu reakciji transaminacije.

U prvom koraku razgradnje aminokiselina njihove amino skupine prenose se na α -

ketokiseline pri čemu α - ketokiselina koja je akceptor aminoskupine najčešće je α -

ketoglutarat iz kojeg nastaje aminokiselina glutamat. Aminokiseline koje se na ovaj način

nakupljaju u obliku glutamata mogu biti prenošene na oksaloacetat pri čemu se regenerira α -

ketoglutarat (koji sad opet služi kao akceptor aminoskupine) i nastaje aspartat ili reducirane u

amonijak u reakciji koju katalizira glutamat dehidrogenaza.

Za reakciju transferacije amino-transferazama neophodno je prisutstvo kovalentno vezanog

koenzima piridoksal-5-fosfata (PLP). Ovaj derivat piridoksina tijekom reakcije prolazno se

aminira primitkom amino skupine određene aminokiseline te prelazi u piridoksamin-5-fosfat

(PMP). Piridoksal-5-fosfata (PLP) je kovalentno vezan za enzim tvoreći Schiffovu bazu (imin)

koja nastaje kondenzacijom aldehidne skupine grupe PLP sa ε-amino skupinom lizinskog

ostatka enzima.

Aminokiseline koje najčešće u organizmu ulaze u ovakve reacije su alanin i aspartat, a nešto

rijeđe leucin i tirozin. U skladu s time AST i ALT su dva enzima koji su najaktivnije

aminotransferaze. Iako je omjer AST i ALT specifičan za pojedino tkivo, vrstu i fiziološko

stanje najčešće AST pokazuje višu aktivnost od ALT a indeks njihovog međusobnog omjera

(AST:ALT) poznat je kao De Ritisov omjer i ima veliku dijagnostičku vrijednost.

AST i ALT homologni su ali je preklapanje svega u 15 - 25% od ukupno 400-tinjak

aminokiselina. Geni za ALT nalaze se u miša na kromosomu 15 i kodiraju za 495

aminokiselina stvarajući polipeptidni monomer od 55.011 kD (http://marvester 2005).

ALT ima važnu ulogu u interrelacijskom smislu između metabolizma ugljikohidrata i

dušikovih spojeva. ALT je lokaliziran u većine organa i tkiva, a u stanicama tih tkiva je u

citoplazmi te ga poput LDH smatramo unilokularnim enzimom. Postoji i mitohondrijska

Page 63: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

50

frakcija ovog enzima ali za razliku od AST-a mitohondrijska frakcija je nestabilna i nema

široku dijagnostičku vrijednost (Evans 1997, Kaneko 1997, Radman i Harapin 1998, Štraus

1992).

Najviše ALT ima u jetri i mjerenje serumske aktivnosti direktno govori o stanju hepatocita

iako u dijagnostičkim tumačenjima rezultata treba promatrati nekoliko enzima (AST, ALT,

LDH, AP, GLDH, GGT i dr. za jetru i bilijarne opstrukcije).

Prema aktivnostima u pojedinim tkivima autori bilježe ove vrijednosti za čovjeka:

Štraus (1992): 1. jetra 35 U/g 2. poprečnoprugasti mišić 3.4 U/g 3. srčani mišić 2.9 U/g 4. bubreg 1.3 U/g 5. gušteraća 0.7 U/g 6. eritrociti 0.1 U/g 7. serum odrasli muški 10-35 U/L

odrasli ženski 5-24 U/L

U tjelesnim tekućinama većine sisavaca normalno nalazimo ALT u serumu i

cerebrospinalnoj tekućini ali ne i u urinu. Ako usporedimo aktivnosti ALT i AST (naredni

odlomak) uočava se da je jetra nešto bogatija AST iako se ALT smatra specifičnim enzimom

jetre jer ga u ostalim organima ima puno manje nego AST. S obzirom da je ALT tipičan

citoplazmatski enzim već i kod manjih oštećenja ili promjeni propusnosti citoplazmatske

membrane enzim izlazi u krv.

U nekih nestandardnih laboratorijskih životinja serumski ALT je izuzetno nizak te nema

dijagnostičku vrjednost. Takve životinje su primjerice marmozet, goveda, svinje ovce i koze.

Vrijednosti serumske ALT za neke životinje prikazane su u daljnjem popisu prema

pripadajućim navodima autora:

Kaneko (1992):

1. Konj 3 – 23 U/L (14 ± 11 U/L) 2. Govedo 11 - 40 U/L (27 ± 14 U/L) 3. Ovca (30 ± 4 U/L) 4. Koza 6 - 19 U/L 5. Svinja 31 - 58 U/L (45 ± 14 U/L) 6. Pas 21 - 102 U/L (47 ± 26 U/L) 7. Mačka 6 - 83 U/L (26 ± 16 U/L)

Page 64: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

51

(Radman i Harapin 1998):

1. Konj do 15 U/L 2. Govedo 3 - 15 U/L 3. Ovca 2 - 10 U/L 4. Svinja 8 - 10 U/L 5. Pas do 50 U/L 6. Mačka do 50 U/L

U pasa, mačaka, čovjeka i standardnih laboratorijskih životinja štakora, miševa, zečeva ALT je

standardni parametar koji dobro pokazuje patološke promjene nastale djelovnjem noksi.

Aktivnost serumskog ALT-a u miševa prema navodima autora prikazuje slijedeći popis:

Za laboratorijskog miša: Mc Clure (1999): C57BL 68 – 85 U/L Albino CD m-70 U/L; ž-77 U/L Cruz i sur. (2004): B6C3F1; 46 ± 25 U/L Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004): Soj nije specificiran 17-77 U/L Kaneko (1997): Soj nije specificiran 19.0 U/L Santos i sur (2005): Swiss albuno mužjaci (25-35 g); 30.4 ± 9.3 U/L Mady i sur. (2002): Swiss albuno mužjaci (22-25 g); 51.80 ± 1.53 U/L Silva i sur. (2004): 74 ± 10.58 U/L (serum) i 287.28 ± 0.29 U/g (jetra), mužjaci, 25 - 30 g, Swiss albino Kawagoe i sur. (2005): 56 ± 12.09 U/L (serum) mužjaci, mjesec dana, ICR mice

Page 65: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

52

Povišene vrijednosti serumske aktivnosti koje prelaze preko 50 puta normalnu vrijednosti

ALT najčešće su uzrokovane jakom viralnom infekcijom jetre ili se javlja kod toksičnog

hepatitisa uzrokovanog ljekovima ili drugim kemijskim toksičnim tvarima najčešće popračenu

nekrotičnim promjenama. Blaže do umjereno povećanje aktivnosti ALT, uz visoke vrijednosti

AST, ukazuju na akutne hepatocelularne ozljede poput aktivne ciroze uzrokovane alkoholom.

Page 66: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

53

2.4.7.6. Aspartat-aminotransferaza, AST, GOT (EC. 2.6.1.1.)

Ovaj enzim katalizira reverzibilnu reakciju transaminacije između L-asparaginske kiseline i

2-oksoglutarne kiseline. Kako je već opisano ranije ovom reakcijom ketokiseline prelaze u

aminokiseline a spaja se i metabolizam ugljikohidrata s metabolizmom dušikovih spojeva. Kao

i prethodni enzim ALT, AST spada u veliku grupu enzima aminotransferaza. Sinonimi za ovaj

enzim su L-aspartat-2-oksoglutarat-aminotransferaza i glutamat-oksaloacetat-transaminaza

(nekada korištena kratica-GOT) (slika 9.).

Slika 9: Prikaz molekularne strukture svinjske aspartat aminotransferaze iz citosola poprečnoprugastog mišića, Ec: 2.6.1.1. dobiven difrakcijom x zraka Preuzeto iz: Rhee, S., Silva, M. M., Hyde, C. C., Rogers, P. H., Metzler, C. M., Metzler, D. E., Arnone, A.: Refinement and comparisons of the crystal structures of pig cytosolic aspartate aminotransferase and its complex with 2-methylaspartate. J Biol Chem 272 pp. 17293 (1997)

Enzim je bilokularan tj. smješten je jednako u citoplazmi (40 %) i u mitohondrijma (60 %). Ta

dva enzima razlikuju se po elektroforetskoj pokretljivosti (citoplazmatski se zaustavi bliže

anodi), osjetljivosti prema pH i termostabilnosti. Geni za ALT nalaze se u miša na kromosomu

19 i kodiraju za 412 aminokiselina stvarajući polipeptidni monomer od 461 kD

(http://marvester 2005), dok Kaneko (1997) spominje 92 kD kao masu homodimernog enzima

AST. Za razliku od nekih prethodnih enzima AST ima samo jedan monomer koji se spaja u

homodimer AST (http://marvester 2005). AST ima najviše u jetri, srčanom mišiću sadrže ga

poprečnoprugasti mišići, pri čemu su u dijagnostičkim tumačenjima rezultata treba promatrati

nekoliko enzima (AST, ALT, LDH, CK, kreatinin za poprečnoprugaste mišiće i AST, ALT,

LDH, AP, GLDH, GGT i dr. za jetru i bilijarne opstrukcije), kako je u večoj mjeri opisano u

prethodnim odlomcima.

Page 67: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

54

Prema aktivnostima u pojedinim tkivima autori bilježe ove vrijednosti za čovjeka:

Štraus (1992): 1. jetra 59 U/g 2. srčani mišić 52 U/g 3 poprečno-prug. mišić 36 U/g 4. mozak 15 U/L 5. bubreg 10 U/g 6. gušteraća 3 U/g 7. pluća 1 U/L 7. eritrociti 0.8 U/g 8. serum odrasli muški 10-35 U/L odrasli ženski 4-22 U/L

Iako AST nije specifičan enzim samo za jetru, od velike je važnosti i za dijagnostiku oštećenja

srčanog mišića. Njegova količina u serumu mijenja se kod ozljeda poprečnoprugaste

muskulature i kod mijopatija. Klinički se hepatopatije od mijopatija klinički razluće tijekom

bolesti i drugim dijagnostičkim postupcima. Kod akutnog hepatitisa vrijednosti obje

transaminaze se povisuju, a kod razvoja kronične upale jetre i kod ciroze taj rast je umjereniji.

Kod akutne opstruktivne žutice njihov je rast također umjereniji. Kod otrovanja

organofosfatima toksični hepatitis uzrokuje veliko povećanje aktivnosti transaminaza u serumu.

U životinja poznato je da je u konja normalna razina serumske aktivnosti relativno visoka u

odnosu na druge vrste.

S obzirom na serumsku aktivnost AST autori navode:

Kaneko (1997):

1. Konj 226 -366 U/L (296 ± 70 U/L/ 2. Govedo 78 - 132 U/L (105 ± 27 U/L) 3. Ovca 60 – 280 U/L (307 ± 43 U/L) 4. Koza 167 - 513 U/L 5. Svinja 32 - 84 U/L (61 ± 26 U/L) 6. Pas 23 – 66 U/L (33 ± 12 U/L) 7. Mačka 26 - 43 U/L, (35 ± 9 U/L)

Radman i Harapin (1998):

1. Konj do 240 U/L 2. Govedo do 60 U/L 3. Ovca do 60 U/L 4. Svinja 8 - 25 U/L 5. Pas do 40 U/L

Page 68: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

55

6. Mačka do 40 U/L

Razina aktivnosti serumske AST dobar je pokazatelj stanične nekroze pripadajućih tkiva

upravo zbog svoje bilokularne naravi tj. kad se stanice nekrotički raspadaju, oštećenje je toliko

da se i mitohondrijski AST otpušta u krv. Upravo stoga razine AST privremeno ili vrlo malo se

povećavaju u početku bolesti, a u kroničnom tijeku one poprimaju visoke vrijednosti. Deficit

vitamina B ili trudnoća primjerice neka su stanja u kojima je primjetno opadanje AST

aktivnosti u serumu (Jaeger i Hedegaard 2002).

U laboratorijskih životinja kao i kod prethodno spomenutih enzima vrijednosti ovise o soju, fiziološkom stanju, starosti i vrsti životinje. Za laboratorijskog miša:

Mc Clure (1999): C57BL 298 – 405 U/L Albino CD m-242 U/L; f-269 U/L Cruz i sur. (2004): B6C3F1; 86 ± 60 U/L Resarch animal resources, Unversity Minnesota (2004): Soj nije specificiran 54-278 U/L Kaneko (1997): Soj nije specificiran 37.0 U/L Santos i sur (2005): Swiss albuno mužjaci (25-35 g); 271.4 ± 63.4 U/L Mady i sur. (2002): Swiss albuno mužjaci (22-25 g); 219.8 ± 3.86U/L Silva i sur. (2004):

95.41 ± 6.13 U/L (serum) i 234.10 ± 6.13 U/g (jetra), mužjaci, 25 - 30 g, Swiss albino Kawagoe i sur. (2005):

77 ± 18.9 U/L (serum) mužjaci, mjesec dana, ICR mice

Page 69: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

56

2.4.8. METODA KOMET TESTA U PROCJENI TOKSIČNOSTI NOKSI

Komet-test ili mikrogel elektroforeza vrlo je aktualna, suvremena, učinkovita, brza, jeftina i

informativna metoda u toksikološkom i znanstveno-istraživačkom radu kojom se procjenjuje

oštećenje molekule DNA u pojedinim stanicama različitih tkiva. Metoda i na neizravan način

ukazuje na koji se način raspada DNA u pojedinim tkivima tj. neizravno možemo procjeniti

radi li se o apoptotičnoj ili nekrotičnoj smrti stanica. Prvu mikrogel elektroforezu u svrhu

procjene oštećenje DNA u pojedinim stanicama uklopljenim u agarozni gel izveli su 1984.

godine Östlin i Johanson. Metoda je dobila naziv prema obliku kometa kojeg su imale oštećene

florescirajuće stanice (Singh i sur. 1988, Rojas i sur. 1999, Singh 2000).

Komet tehnika vrlo je osjetljiva i reproduktibilna metoda (Tice i sur. 2000). Za dobivanje

rezultata ovom tehnikom dovoljno je analizirati 50 stanica. Sobzirom da se pomoću ove tehnike

procjenjuju oštečenja genoma i apoptoza i/ili nekroza pojedinih stanica, komet test daje

učinkovite rezultate na biljnim i animalnim

Slika 10: Izgled stanice čiji se genetski materijal uslijed djelovanja nokse raspao i putuje u električnom polju elektroforetski stvarajući sliku koja liči na komet koji se sastoji od glave kometa i repa kometa kojeg sačinjavaju fragmenti DNA iz jezgre.

Page 70: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

57

stanicama bilo da dolaze iz kulture ili uzravno iz živog organizma (Olive 1999, Piperakis i sur

1999, Tice i sur 2000). Neke od komparativnih prednosti ove tehnike su: (i) procjena oštećenja

u pojedinim stanicama (ii) dovoljno mali broj uzorka za analizu (iii) može se koristiti bilo koja

vrsta stanica (iv) test je dovoljno osjetljiv, jednostava, ponovljiv, brz (v) rezultati se mogu

dobiti već unutar neoliko sati na velikom broju uzoraka (Rojas i sur. 1999).

Princip tehnike komet-testa je slijedeći, preparat za analizu priprema se tako da su

suspenzija istraživanih stanica uklapa između dvaju slojeva agaroznog gela. Pomoću otopine s

visokom koncentracijom EDTA (etilen-diamin-tetraoctene kiseline) i detergenta za lizu razore

se stanična i jezgrina membrna, pri čemu se oslobađa ukupna stanična DNA. Ta se DNA

denaturira u lužnatom ili neutralnom puferom i podvrgne se elektroforezi. Zbog velike

molekularne mase najveći dio DNA ne može putovati kroz pore gela prema anodi.

Putovati mogu samo fragmenti DNA nastali jednolančanim ili dvolančanim lomovima. Što

su kraći, oni putuju brže kroz gel. Zbog razlike u brzini kretanja, fragmenti se razdvajaju prema

veličini, kraći fragmenti putuju brže dok duži fragmenti koji se teže provlaće kroz pore

agaroznog gela putuju sporije (Plappert i sur. 1995). Nakon bojenja s fluorescirajučom bojom

(najčešće etidij bromid) pod mikroskopom su vidljivi obrasci putovanja u gelu koji kod

oštećenih stanica izgledaju poput kometa. Osim etidij bromide ostale boje u uporabi su DAPI,

propidij jodid, acridin orange i HOECHST 33342. Oštećenje DNA procjenjuje se na osnovi

postotnog udjela DNA u repu kometa te također dužine repa kometa u mikrometrima (μm) i

njegovog optičkog intenziteta fluorescencije izraženog u luxima (lux) te izračunate vrijednosti

tzv. Repnog momenta ili engl. Olive tail moment (OTM), indeksa koji se smatra

najinformativnijim pokazateljem analize komet testa jer se računa iz nekoliko izmjerenih

parametara analize komet testa prema formuli:

OTM= (srednja vrijednost % DNA repa - srednja vrijednost %DNAglave) X % DNA u repu

Postoje dvije izvedbe komet-testa koje su danas najčešće u uporabi. Prva pod neutralnim

uvjetima i omogućuje specifičnu detekciju dvolančanih lomova DNA. Originalno su je razvili

Olive i sur. (1990), a kasnije je modificirana (Plappert i sur. 1995). Drugi i najčešće

Page 71: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

58

primjenjivani način izvedbe je komet-test u alkalnim uvjetima (pH 13). Ta izvedba smatra se

optimalnom za otkrivanje učinaka različitih genotoksičnih agensa, a omogućuje specifičnu

detekciju jednolančanih lomova i ukriženog povezivanja DNA-DNA i DNA-proteini. Mjesta

loma nakon djelovanja lužine nastaju na dijelovima DNA gdje postoje apurinska i

apirimidinska mjesta. Ta su mjesta podložnija oštećenjima (Singh i sur. 1988, Olive 1999,

Rojas i sur. 1999, Singh 2000). Oblik repa nastao kao trag elektroforetske pokretljivosti

fragmenata ukazuje na mehanizme i vrstu oštećenja noksi koji ih uzrokuju, naime mogu se

razlikovati stanice u apoptozi i/ili nekrozi (Fairbairn i sur. 1995, Olive 1999). Osim toga pri

uporabi komet tehnike može se pratiti i enzimski popravak DNA lomova, dakle indirektno

status enzima i drugih sustava koji upravljaju popravkom oštećenog genetičkog materijala u

stanici.

Stanice u kojih se prati popravak drže se na 37 °C. Ukoliko je popravak uspješan, u

tretiranom uzorku dobiti će se vrijednosti kometa slične kao i u kontrolnom uzorku za razliku

od istih tretiranih stanica koje su čitavo vrijeme držane na 0 °C (Miller i sur. 1994).

2.4.8.1 Apoptoza i nekroza

Dvije su vrste stanične smrti. Jasno su odvojene morfološki i biokemijski: 1) apoptoza

(fiziološka, prirodna ili programirana smrt stanice) i 2) nekroza (slučajna, sporedna ili toksična

smrt stanice).

Apoptoza.

Apotoza (grč. apoptosis = opadanje) je oblik programirane stanične smrti koja se javlja tijekom

normalnih fizioloških procesa u cilju održanja homeostaze. Apoptozu obilježavaju mnoge

morfološke, funkcionalne i biokemijske promjene unutar stanica. Uočeno je smanjenje

volumena stanica, promjene cjelovitosti citoplazmatskih organela, posebice mitohondrija i

otpuštanje citokroma C, fragmentacija DNA, te pojava novih antigena na površini stanice

(fosfatidilserin) (Galati i sur. 2000).

Prve vidljive promjene nastaju na staničnoj membrani. Volumen stanica se smanjuje i

nastaje niz morfoloških i biokemijskih promjena u jezgri što dovodi do nastanka apoptotičnih

tjelešaca koja sadrže nedirnute citoplazmatske organele i dijelove jezgre. Proces cijepanja

Page 72: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

59

stanica događa se vrlo brzo, što otežava proučavanje apoptoze. U apoptozi ne dolazi do

oslobađanja staničnog sadržaja, a apoptotična tjelešca fagocitiraju stanice mononuklearno-

fagocitnog sustava, epitelne stanice i dr. te stoga, za razliku od nekroze, ne dolazi do upalnih

reakcija (Wyllie 1993).

Biokemijske promjene i molekularni mehanizmi apoptoze malo su poznati. Mogući

unutrašnji signalni mehanizam u pokretanju apoptoze jest porast koncentracije unutarstaničnog

Ca2+ i izmjena ekspresije mRNA što uključuje onkogene i sintezu serije proteina. Štetan učinak

kalcija temelji se na aktivaciji Ca2+-ovisnih endonukleaza, proteaza, fosfolipaza i protein kinaza

što indirektno ili direktno dovodi do pucanja DNA (Galati i sur 2000). Nastali dijelovi DNA

višekratnici su od 180-200 parova baza i mogu se analizirati elektroforezom na agaroznom gelu

(Wyllie 1980). S druge strane opisani su slučajevi cijepanja DNA bez povećanja koncentracije

iona kalcija što ukazuje na postojanje Ca2+ neovisnih endonukleaza (Alnemri i Litwac 1989).

DNA topoizomeraza II uključena je u replikaciju, rekombinaciju i kromosomsku

segregaciju. ATP vezujuća mjesta na topoizomerazi II mogu služiti kao vezna mjesta za

kvercetin, što dovodi do inhibicije ATP-azne komponente i inhibicije funkcije topoizomeraze II

(Constantinou i sur. 1995).

Protein kinaze (kalmodulin-kinaze, mitogenom aktivirane protein-kinaze i dr.) važne su u

aktiviranju protoonkogena c-fos, c-myc, c-jun koji imaju važnu ulogu u proliferaciji i

diferencijaciji stanica i sudjeluju u apoptozi.

Apoptoza u tumorskim stanicama može biti posredovana mitohondrijskim toksinima.

Mitohondrijska toksičnost uključuje gubitak membranskog potencijala, otpuštanje citokroma C

i stvaranje slobodnih radikala (Wang i sur. 1999). Apoptoza može biti pobuđena oksidativnim

stresom (Chandra i sur. 2000). Mnogi pesticidi mogu biti induktori ili izvori slobodnih radikala,

glavnih uzročnika oksidativnog stresa

Nekroza

Nekroza je smrt stanice koja se nikada ne javlja unutar fizioloških uvjeta već je

posljedica letalnih i patoloških oštećenja stanica. Kod stanica u nekrozi dolazi do poremećaja

aktivnosti ionskih pumpi što dovodi do bubrenja citoplazme i organela, gubitka cjelokupnosti

membrane, poremećaja osmotskog tlaka i oštećenja stanica. Stanični sadržaj izlazi u okolno

tkivo i ovi procesi izazivaju upalni odgovor (Wyllie 1993). Ubrzani raspad stanice u kasnom

Page 73: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

60

stadiju nekroze pospješuje oslobađanje hidrolaza iz lizosoma. Tijekom procesa nekroze stanični

kromatin formira male nakupine na jezgrinoj membrani i dolazi do smanjenja ukupne količine

proteina, RNA i DNA. Oštećenje DNA u nekrozi kasniji je fenomen i kromatinski je sadržaj

izložen proteolitičkom i nukleolitičkom djelovanju. Nekroza traje satima i danima te zahvaća

veću skupinu stanica u tkivu.

Zbog ograničenih mogućnosti praćenja apoptoze pomoću morfoloških kriterija,

najčešće se koriste metode u kojima se prati cijepanje DNA. Otkrivanja apoptoze i nekroze

moguće je analizom fragmenata DNA na agaroznom gelu (Wyllie 1993). Propadanje

kromatina, smanjenje staničnog volumena i druge promjene vezane uz apoptozu i nekrozu

mogu se brzo i jednostavno pratiti na protočnom citometru.

Cijepanje DNA može se pratiti nakon što se DNA obilježi fluorescentnim DNA-

vezujućim spojevima kao što su: propidijski jodid, etidijski bromid,

7-aminoaktinomicin, akridin oranž i dr. Apoptotične stanice s pocijepanom DNA mogu se

odrediti na histogramu DNA. Postotak stanica u apoptozi može se odrediti i TUNEL metodom

na tkivnim rezovima (Wyllie 1993).

Page 74: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3. MATERIJALI I METODE

Page 75: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3. MATERIJALI I METODE

3.1. POKUSNE ŽIVOTINJE

Pokus je proveden na singeničnim miševima soja CBA T6T6, uzgojenima u uzgajalištu

laboratorijskih životinja Zavoda za animalnu fiziologiju, Prirodoslovno matematičkog

fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu. Životinje korištene za pokus bile su u dobi od 60 ± 5 dana

na početku apliciranja herbicida. Životinje su okoćene i uzgojene u standardnim uvjetima

propisanim za uzgoj laboratorijskih životinja (glodavaca), odnosno pri temperaturi od 25

˚C, dnevni ritam svjetla i tame 12/12 sati, s ponuđenom hranom i vodom ad libitum.

Kontrolne i tretirane životinje držane su pod istim uvjetima. Životinje su, nasumičnim

uzorkovanjem raspoređene u četiri skupine, s obzirom na apliciranu dozu preparata čija se

toksičnost određuje, sa po dvije podskupine s obzirom na spol životinja. U svakoj skupini

bilo je četrnaest životinja, odnosno sedam u podskupini (m-mužjaci, ž-ženke) (Springer i

sur. 1976, 1983, 1986.a, 1986.b, Franković 1990, Pavelić 1977, Thiruchelvam i sur. 2000a,

2000b, Ulm 1994, Walace-Hayes 2001, Williams 1999).

Radi praćenja svake pojedine životinje i bilježenja mase, životinje treba označiti.

Grickalicom za uške se prema navedenom crtežu označe uške.

Slika 11: Označavanje uški miševa

Svakom je mišu unutar skupine pridružen broj od 1 do 12. Na taj se način prati

pojedina životinja i lakše se uočava potencijalno ekstremno odstupanje od ostatka skupine u

62

Page 76: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

praćenim parametrima.Ovakvo označavanje omogućilo je praćenje pojedinih jedinki

tijekom čitavog pokusa i podjelu skupina prema pripadajućim dozama:

K=kontrolna skupina=0 mg/kg prometrina,

A=skupina koja je primila 185 mg/kg prometirna u 13 doza tijekom 28 dana,

B=skupina koja je primila 375 mg/kg prometirna u 13 doza tijekom 28 dana,

C=skupina koja je primila 555 mg/kg prometirna u 13 doza tijekom 28 dana.

Ovakave oznake zadržale su se u poglavlju Rezultati i ponegdje u poglavlju Rasprava, u

svrhu pojednostavljenja tabličnih i grafičkih prikaza i jasnoće rećenica gdje je to bilo

svrsishodno. Nadalje, unutar svake skupine životinji je pripisan redni broj jedinke. Također

prema spolu skupine su podjeljene na podskupine označavane sa M za muške jedinke i Ž za

ženske jedinke (u pojedinim dijagramima u poglavlju rezultati radi svojstava programa koji

ne sadrži neke znakove hrvatske abecede Š,Ž,Đ,Ć,Č skupina Ž je pisana znakom Z) . Tako

bi svaka jedinka dobivala jedinstvenu šiftu s obzirom na raspored u pokusu primjerice KŽ4,

KM4, MA4, ŽA4 …….itd.

63

Page 77: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3.2. PLAN POKUSA I NAČIN APLIKACIJE I POJEDINIH DOZA ISPITIVANOG HERBICIDA PROMETRINA

Pojedinačne opetovane doze herbicida po skupinama bile su : 0 mg/kg životinje (označeno

kao skupina K-kontrola), 185 mg/kg životinje (označeno kao skupina A-niska doza), 375

mg/kg životinje (označeno kao skupina B-srednja doza), 555 mg/kg životinje (označeno

skupina C-visoka doza).

Srednja doza je 1/10 LD 50 doze, što se u brojnim istraživanjima pokazalo kao izvrstan

model u kojem tretirane životinje preživljavaju do kraja trajanja subkronične izloženosti

toksikantu (Springer i sur. 1983, 1986, 1986, Franković 1990, Pavelić 1977, Ulm 1994).

Prije davanja otopina gastričnom kanilom, životinje su blago omamljivane dietileterom u

trajanju 7-30 sekundi. Praškasti tehnički prometrin (95%) suspendiran je u kukuruznom ulju

(proizvođač Zvijezda) otopinom na potrebni volumen (0.2 ml, tj. optimalni volumen za

želudac miša i aplikaciju per os) planirane doze. Ovakav način aplikacije najbolje simulira

ekspoziciju organizama okolišno prisutnom prometrinu, a također toksikokinetički tvar ne

zaobilazi želudac i crijeva (pH) i jetru s jetrenim detoksikacijskim enzimima koji bi

potencijalno mogli detoksicirati otrov, odnosno toksicirati otrov stvorivši još toksičnije

metabolite prometrina. Također bi se u slučaju smanjenja populacije crijevne mikroflore

mogle pojaviti druge kliničko-patološke promjene (Timbrell 2001, Walace-Hayes 2001).

Svaki puta prije aplikacije suspenzije, životinjama se izmjerila težina, radi praćenja

kliničkog stanja i korekcije volumena suspenzije da svaka životinja dobije jednaku

predviđenu dozu (u mg/kg životinje) koju se odredilo za svaku skupinu životinja. Kontrolna

skupina dobivala je uvijek jednak volumen (0.2 ml) ulja bez prometrina.

Pokus je postavljen temeljem literaturnih podataka o kinetici prometrina u organizmu

glodavca. Iz njih je vidljivo da se u tijeku 48 sati prometrin (ali i većina metabolita

prometrina nastalih u procesima detoksifikacije) uglavnom izluči iz tijela, stoga su pojedine

doze prometrina aplicirane svakih 48 sati, radi održanja konstantne koncentracije u

organizmu (Extoxonet 1996, Kamrin i sur. 2000).

Pojedinačne doze prometrina bile su aplicirane trinaest puta, svakih četrdesetosam sati

tijekom dvadesetšest dana, a razudba životinja izvršena je četrdesetosam sati nakon zadnje

aplikacije, tj. dvadesetosmog dana pokusa (tablica 1.). Ovakav plan pokusa u skladu je s

odredbom 407 OECD-a /OECD Guideline 407/ i US EPA preporukama o trajanju

64

Page 78: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

kratkoročnog imunotoksikološkog i toksikološkog testiranja (Descotes 1999., Walace-

Hayes 2001.). Potrebno je napomenuti da je C skupina tretirana najvišom dozom (555

mg/kg) počela naglo ugibati zbog posljedica otrovanja prometrinom, stoga se žrtvovanje i

razudba obavila prije spomenutog termina za ostale skupine sa ciljem da se patološkom

analizom utvrdi mehanizam kojom noksa narušava fiziološko-metaboličku ravnotežu i

izaziva smrt.

Tablica 3: Tabelarni prikaz plana pokusa.

DAN POKUSA TRETMAN

PROMETRINOM

ANALIZA KRVI VAGANJE ŽRTVOVANJE I

ANALIZA ORGANA

1. 1.

1.

3. 2.

2.

5. 3.

3.

7. 4.

4.

9. 5.

5.

11. 6.

6.

13. 7. 1.(14.dan)

7.

8. 15. 8.

17. 9.

9.

19. 10.

10.

1.(C)

21. 11.

11.

23. 12.

12.

25. 13.

13.

27.

2.(28.dan)

29. 2. (K,A,B)

*brojke označavaju redni broj pojedinog tretmana, dana pokusa, analize krvi, vaganja i žrtvovanja kronološkim redoslijedom Skupina C je radi iznenadnog ugibanja žrtvovana prije isteka pokusnog razdoblja od 28 dana.

65

Page 79: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3.3. ODREĐIVANJE TJELESNE TEŽINE POKUSNIH ŽIVOTINJA

Tjelesna težina životinja određivana je prije svake aplikacije herbicida na digitalnoj

elektroničkoj tehničkoj vagi Sartorius koja važe s točnošću ± 0.01 g.

3.4. ANALIZA SERUMSKIH ENZIMA SPEKTROFOTOMETRIJOM

Spektrofotometrijski su određivane vrijednosti određenih ezima jetre pomoću

komercijalnih kitova proizvođača Herbos dijagnostika d.o.o. Korišten je SHIMADZU UV –

VIS RECORDING SPECTROPHOTOMETER UV – 160.

Kivete s plazmom su držane u vodenoj kupelji na 37°C, da se zadovolje navedeni

uvjeti određivanja. Korištene su plastične kivete širine 10 mm.

Određivanje enzima laktat-dehidrogenaze (LDH-P)

Sastav reagensa

Fosfatni pufer pH 7,5 ± 0,1 (25°C) 55 mmol/L

Natrij piruvat 0,6 mmol/L

NADH 0,23 mmol/L

Princip reakcije

Piruvat + NADH + H+ LDH Laktat + NAD+

Postupak

Mjeri se nestanak NADH spektrofotometrijski pri 340 nm, 37°C. Pomiješa se 1ml reagensa

sa 20 μl uzorka. Nakon 60 sekundi se izmjeri A1 i nakon daljnjih 60 sekundi A2. Izračuna se

∆A/min.

Račun

LDH, U/L= ∆A/min x 8095

66

Page 80: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Određivanje enzima gama-glutamiltransferaze (γ-GT)

Sastav reagensa

TRIS puffer 100 mmol/L

Glicilglicin 100 mmol/L

L-γ-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid 2,9 mmol/L

pH = 8,2 ± 0,1 na 20°C

Metoda

Kao supstrat za određivanje katalitičke koncentracije γ-GT koristi se glukan (γ–glutamil-3-

karboksi-4-nitroanilid). γ-GT prisutan u uzorku katalizira prijenos γ-glutamilne skupine sa

supstrata na glicilglicin tvoreći glutamilglicin i 5-amino-2-nitrobenzoat. Stvoreni 5-amino-

2-nitrobenzoat proporcijalan je katalitičkoj koncentraciji γ-GT i kinetički se mjeri na 405

nm.

Princip reakcije

L-γ-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid + glicilglicin

γ-GT

L- γ-glutamilglicilglicin + 5-amino-2-nitrobenzoat

Postupak

Određivanje se vrši pri 405 nm, na 37°C. 1,0 ml reagensa se pomiješa sa 100 μl uzorka.

Očita se porast apsorbancije nakon 1, 2 i 3 minute. Izračuna se srednja vrijednost ∆A/min

Račun:

∆A/min x TV x 1000

U/L = -------------------------- = ∆A/min x 1158

EF x SV x P

TV = ukupni volumen reakcijske smjese (ml)

SV = volumen uzorka (ml)

EF = molarna apsorbancija 5-amino-2-nitrobenzena na 405 nm = 9,5

P = duljina puta svjetlosti kroz kivetu (cm)

67

Page 81: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Određivanje enzima alkalne fosfataze (ALP)

Sastav reagensa

Supstrat:

4-nitrofenilfosfat 16,3 mmol/L

Pufer:

2-amino-2-metil-1-propanol 0,42 mmol/L

Mg-acetat 2,4 mmol/L

ZnSO4 1,2 mmol/L

EDTA 2,2 mmol/L

pH = 10,4 na 30°C

Metoda:

Kao supstrat koristi se 4-nitrofenilfosfat. Pri uvjetima optimirane metode ALP katalizira

reakciju transfosforiliranja. Kod radnog pH 4-nitrofenoksid ima izrazito žutu boju. Reagens

sadrži metalno ionski pufer koji održava stalnu poželjnu koncentraciju metalnih iona cinka i

magnezija. Reakcija se prati mjerenjem porasta apsorbancije na 405 nm što je

proporcionalno katalitičkoj koncentraciji alkalne fosfataze.

Princip reakcije

ALP

4-nitrofenilfosfat + H2O 4-nitrofenoksid + fosfat Mg2+/alkalni pH

Postupak

Određivanje se vrši pri 405 nm, na 37°C. Instrument je izbaždaren na 0 destiliranom

vodom.

1,0 ml reagensa se pomiješa sa 20 μl uzorka. Očitava se porast apsorbancije svakih 30

sekundi kroz 2 minute. Izračuna se srednja vrijednost ∆A/min.

Račun

∆A/min x TV x 1000

U/L = ----------------------------- = ∆A/min x 2713

EF x SV x P

68

Page 82: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

TV = ukupni volumen reakcijske smjese (ml)

SV = volumen uzorka (ml)

EF = molarna apsorbancija 4-nitrofenoksida na 405 nm = 18,8

P = duljina puta svjetlosti kroz kivetu (cm)

Određivanje aktivnosti kinetičkog kratinina u serumu periferne krvi

Princip metode

Kreatinin reagira s alkalnim pikratom stvarajući narančasto-crveni kompleks. Mjeri se

reakcija tijekom jedne minute. Čime je izbjegnuta interferencija s drugim spojevima koji

mogu reagirati s pikratom ali sporije od kreatinina. U ovom testu korišten je komercijalni

kit Herbos Dijagnostika Sisak. Mjerenje je izvedeno prema protokolu priloženom uz kit pri

492 nm u kivetama od kvarcnog stakla. Mjerenje je izvedeno UV/VIS spektrofotometrom

Shimadzu u Zavodu za animalnu fiziologiju, PMF, Zagreb.

Određivanje aktivnosti aspartat aminotransferaze (AST) i alanil aminotransferaze

(ALT)

Za analizu je upotrebljen uzorak svježeg nehemoliziranog seruma. U testu je korišten kit

Herbos Dijagnostika Sisak. Mjerenje je izvedeno u Zavodu za animalnu fiziologiju PMF,

Zagreb korištenjem UV/VIS Shimadzu pri 340 nm u kivetama od kvarcnog stakla, istog

proizvođaća.

69

Page 83: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3.5. ANALIZA PERIFERNE KRVI

Analiza periferne krvi izvršena je 14. i 28. dana od početka pokusa, osim u skupini

tretiranoj najvišom dozom, kojoj nije izvršena analiza krvi 28 dan pokusa zbog visokog

stupnja smrtnosti.

3.5.1. Određivanje broja eritrocita i leukocita

Uzorke periferne krvi dobilo se zasijecanjem repne vene prethodno ugrijanih životinja pod

IR lampom. Za određivanje broja eritrocita uzeta je krv u eritrocitni melanžer do oznake 0.5

te je razrijeđena Hayem-ovom (Kemika, Zagreb) otopinom 1:200.

Za određivanje broja leukocita uzeta je krv u leukocitni melanžer do oznake 0.5 i

razrijeđena Türkovom otopinom (Kemika, Zagreb) 1:20. Eritrociti i leukociti brojani su u

hemocitometru po Bürker-Türku pod svjetlosnim mikroskopom Carl-Zeiss Jena, Njemačka.

3.5.2. Diferencijalna krvna slika (DKS)

Diferencijalna krvna slika (DKS) određena je kao postotni udjel pojedinih vrsta leukocita,

granulocita odnosno polimorfonuklearnih neutrofilnih, eozinofilnih i bazofilnih leukocita,

monocita i malih i velikih limfocita.

Osušeni preparat krvnog razmaza boja se metodom po Pappenheimu (May-Grünwald-

Giemsa (Kemika, Zagreb)) i analizira pod svjetlosnim mikroskopom. Na 100 izbrojanih

krvnih stanica određen je postotni udio pojedine vrste leukocita, a njihova se apsolutna

vrijednost dobila računanjem iz ukupnog broja stanica leukocita.

70

Page 84: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3.6. ANALIZA LIMFOHEMATOPOETSKIH ORGANA

Analizirana je težina i ukupna staničnost timusa, slezene, limfnih čvorova, kao i staničnost

koštane moždine femura. Težinu tih organa (osim koštane moždine) određena je na

torzionoj vagi Torsion Balance, SAD, koja važe točnošću od ± 0.2 mg.

Određivanje ukupne staničnosti timusa, aksilarnog limfnog čvora i slezene

Od timusa i slezene odvojen je mali komadić tkiva, posebno izvagan i usitnjen metalnom

spatulom na mrežici mlinarske svile u volumenu 0.1 ml Hanks-ove otopine(Kemika,

Zagreb). Isti postupak ponovljen je s limfnim čvorom. Suspenziju stanica razrijedilo se u

leukocitnom melanžeru Hanksovom otopinom. Suspenzije stanica slezene, razrijedilo se

Türkovom otopinom zbog hemolize eritrocita. Stanice su izbrojane u Bürker-Türkovom

hemocitometru pod svjetlosnim mikroskopom. Tijekom obrade podataka staničnost

pojedinih organa preračunata je na njihovu ukupnu težinu.

Određivanje ukupne staničnosti koštane moždine

Femur, očišćen od mišićnog tkiva, prerezan je na oba kraja kosti. Štrcaljkom napunjenom s

5 ml Hanksove otopine (Kemika, Zagreb) istisnuo se sadržaj koštane moždine u epruvetu.

Suspenziju stanica koštane moždine u Hanksovoj otopini centrifugiralo se 10 minuta na

2000 okretaja (Centrifuga Tehtnica Železniki Slovenija). Nakon centrifugiranja odlio se

supernatant, a preostali talog resuspendira se u 1 ml Hanksove otopine. Stanice koštane

moždine također su brojane hemocitometrom po Bürker-Türku pod svjetlosnim

mikroskopom.

3.7. KOMET TEHNIKA LEUKOCITA PERIFERNE KRVI

U istraživanju je primijenjena standardna izvedba komet-testa koju su predložili Singh

i sur. (1988) (Slika 2).

Priprema uzorka za elektroforezu u komet tehnici

71

Page 85: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Na brušeno predmetno stakalce pasteurovom pipetom nakapali smo svježe priređenu

otopina 1% agaroze normalnoga tališta (NMP, Sigma) i pokrili pokrovnicom. Nakon

polimerizacije agaroze na sobnoj temperaturi, sa stakla smo uklonili pokrovnicu i sloj gela.

Na osušeno staklo pomoću mikropipete nakapali smo 300 μl 0,6% NMP agaroze i pokrili

pokrovnicom. Stakalce smo ostavili 10 minuta na ledu. Nakon polimerizacije agaroze

postavili smo sljedeći sloj: 100 μl 0,5% agaroze niskoga tališta (LMP, Sigma) pomiješane s

2 μl uzorka krvi. Nakon 10 minuta stajanja na ledu, taj sloj gela prekrili smo sa 100 μl 0,5%

LMP agaroze i preparat ponovo držali na ledu 10 minuta.

Liza staničnih struktura

Nakon uklanjanja pokrovnice, priređene preparate uronili smo u pufer za lizu (NaCl,

Na-laurilsarkozinat, Tris-HCl, DMSO, Triton X-100, Sigma), pH=10 u kojem su stajali

jedan sat na 4˚C.

Denaturacija

Preparate smo iz pufera za lizu prebacili u pufer za denaturaciju (NaOH, Na2EDTA,

Sigma), pH=13. Denaturacija je provedena na sobnoj temperaturi, a trajala je 20 minuta.

Elektroforeza

Nakon denaturacije, preparate smo prenijeli u aparat za elektroforezu. Elektroforezu

smo sproveli u istom puferu kao i denaturaciju, pri jakosti struje od 300 mA i naponu od 25

V, a trajala je 20 minuta.

Neutralizacija

Nakon elektroforeze, preparate smo ispirali tri puta po 5 minuta u neutralizacijskom

Tris-HCl puferu, pH=7,5.

Bojanje preparata

Nakon zadnjeg ispiranja, preparate smo bojali sa 100 μl etidij-bromida u trajanju od

10 minuta. Obojene gelove kratko smo isprali u Tris-HCl puferu, pH=7,5 i pokrili ih

72

Page 86: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

pokrovnicom. Radi stabilizacije boje, preparate smo prije početka analize držali u mraku

najmanje 15 minuta.

Mikroskopska analiza

Analizu preparata sproveli smo pomoću epifluorescencijskog mikroskopa s

ekscitacijskim filterom od 515 ─ 560 nm. Mjerenja duljine repa, % DNA u repu i momenta

repa sproveli smo pomoću programa za analizu slike Comet Assay II (Perceptive

Instruments Ltd). Za svaki uzorak izmjerili smo po 50 do 100 kometa. Duljinu repa mjerili

smo od središta jezgre, a izmjerene vrijednosti izrazili smo u mikrometrima. Moment repa

izračunali smo prema formuli:

Momentrepa = (dužina repa x % DNA u repu) / 100

Prekrivanje brušenog stakalca s 1% agarozom normalnoga tališta ↓

Nanošenje sloja 0,6% NMP agaroze ↓

Miješanje uzorka krvi s 0,5% agarozom niskoga tališta i nanošenje na stakalca ↓

Nanošenje sloja 0,5% LMP agaroze ↓

Liza stanica i oslobađanje DNA ↓

Odmatanje DNA u lužnatim uvjetima ↓

Elektroforeza ↓

Neutralizacija ↓

Bojanje ↓

Mikroskopija

Slika 2 - Shematski prikaz komet tehnike

3.8. METODA PROTOČNE CITOMETRIJE Određivanje udjela apoptotičnih, nekrotičnih i vitalnih stanica leukocita periferne krvi,

timusa, slezene i limfnih čvorova

73

Page 87: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Pri analizi udjela apoptotičnih, nekrotičnih i vitalnih stanica leukocita, timusa, slezene i

limfnih čvorova koristilo se annexinVFITC reagens kit tvrtke BioVision® za 400 testova.

Organe se protisnulo kroz mrežicu od tila. Perifernu krv se liziralo buferom za lizu i

odvojilo leukocite. Stanice smo isprali 2X u hladnom PBS-u prema naputku proizvođača.

Stanični talog (1 X 105 stanica) resuspendiralo se u 100 mikrolitara vezujućeg pufera i

dodalo 10 mikrolitara FITC-konjugiranog aneksina V i isto toliko propidijskog jodida.

Nakon inkubacije od 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku dodalo se 400 mikrolitara

vezujučeg pufera i propustilo na protočnom citometru laserom (EX=488 nm;EM=530 nm)

pri tome se FL1 kanal koristio za detekciju vezanog aneksinaV-FITC kompleksa, FL2 kanal

za detekciju propidij jodida.

3.9. STATISTIČKA OBRADA PODATAKA

Statistička obrada dobivenih numeričkih podataka obavljena je metodama (Zar 1999)

deskriptivne statistike, t-testa, analize varijance-ANOVA, korištenjem programa Statistica,

Excel i SPSS for Windows. Također istim programima izračunati su i uspoređivani

koeficijenti korelacije i regresije aktivnosti enzima po skupinama kako bi se ukazalo na

njihove međuodnose i moguću povezanost. Podaci komet testa prije analize varijance,

ANOVA, transformirani su logaritmiranjem a u post hoc testiranju razlike su uspoređene

Scheffeovim testom. U svih mjerenih parametara statističkom je analizom utvrđeno

postojanje razlika doza prometrina u odnosu na kontrolnu skupinu i razlike između spolova

unutar svake skupine i između skupina doza mužjaka i ženki.

74

Page 88: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3.10. HISTOPATOLOGIJA

Odabrani organi herbicidom per os tretiranih skupina miševa analizirani su histopatološkim

metodama radi utvrđivanja nastalih lezija i fiziološko biokemijskih promjena u tkivima i

stanicama organa.

Metode bojenja u pokusu izvedene su prema protokolima opisanim u Arnold 1968., Lee i

Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.

Organi za analizu odabrani su s obzirom na njihovo sudjelovanje u mehanizmima

detoksikacije ksenobiotika, fiziološke povezanosti s imunohematopoetskim sustavom ili s

obzirom na njihovu pretpostavljenu osjetljivost i moguće ciljno djelovanje ispitivanog

herbicida.

Analizirani su: slezena, jetra, bubreg, probavilo (duodenum, tanko crijevo, želudac samo za

makropatologiju), gušterača, poprečnoprugasti mišić i mozak.

Hemalaun eozinom bojeni su mikroskopski preparati ovih organa: jetra, bubreg, tanko

crijevo s komadićem gušterače, slezena, mozak i mišić.

Histokemijskim selektivnim bojenjem PAS, PAS+AB i PAS+αAmilaza obrađeni su bubreg,

tanko crijevo i jetra.

Jetra je dodatno obojena histokemijskom reakcijom za dokazivanje glutationa u tkivima te

Sudan Black i Sudan III metodama dokazivanje masti te enzimsko histokemijskom

reakcijom na laktat-dehidrogenazu (LDH), sukcinat-dehidrogenazu (SDH) i kiselu

fosfatazu. Tkivo poprečnoprugastog mišića obojeno je reakcijom na laktat-dehidrogenazu

(LDH) i sukcinat-dehidrogenazu (ScDH).

Tablični prikaz metoda diferencijalne histopatologije i organa koji su njima obrađeni

prikazuje tablica 4.

75

Page 89: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 4.: Tablični prikaz metoda diferencijalnog histopatološkog bojenja koje su primjenjene (označeno znakom: +) na pojedinim odabranim organima tretiranih životinja u pokusu; kratice: HE-hemalaun eozinsko bojenje, PAS-perjodna kiselina-Šifova baza bojenje, PAS+AB-periodic acid Schiff base s alcian blue bojenjem, PAS+α-AM - bojenje periodic acid Schiff base s enzimom amilazom, SUD B-sudan black, SUD III-sudan tri, LDH-reakcija na laktatdehidrogenazu, SDH- reakcija nasukcinat dehidrogenazu, AlF-reakcija na alkalnu fosfatazu, KF-reakcija na kiselu fosfatazu, EST-reakcija na nespecifičnu esterazu

ANALIZA TKIVA / ORGANAMETODA

SLEZENA JETRA BUBREG PROBAVILO MOZAK MIŠIĆ

HE + + + + + +

PAS - + + + - -

PAS+AB - + + + - -

PAS+α-AM - + + + - -

SUD B - + - - - -

SUD III - + - - - -

LDH - + - - - +

SDH - + - - - +

AlF - + - - - +

KF - + - - - +

EST - + - - - +

76

Page 90: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3.10.1. Fiksacija

Na kraju pokusnog razdoblja tretiranja pokusnih životinja herbicidom prometrinom tj.

dvadesetosmog dana, uzorci organa (dimenzija 1x1x1 cm) ili cijeli organ (bubreg, slezena,

mozak, mišić) fiksirani su 4 % paraformaldehidu s fosfatnim puferom PBS-om (od engl.:

phosphat buffer saline), Kemika, Zagreb, pH 7,4 i 25° C tijekom 24 sata.

Dijelovi tkiva namijenjeni hemalauneozinskom bojenju dehidrirani su u sve koncentriranijem

etilnom alkoholu (koncentracija 50 %, 75 %, 90 % i 100 %), a oni namijenjeni rezanju

kriostatom prebačeni su u krioprotektorske nizove saharoze, (Kemika, Zagreb) (10 %, 20 % i

30 %), 24 sata, pri +8 °C. Potom su smrznuti uranjanjem u ohlađeni izopentan (Sigma) na –

80°C te napokon pohranjeni u zamrzivaču na –80°C.

Jedan dio jetre i mišić, namijenjeni bojenju enzimskohistokemijskim metodama i metodom

za dokazivanje glutationa u tkivima, uronjeni su u tekući dušik na – 175°C bez prethodne

fiksacije (Arnold 1968., Lee i Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).

3.10.2. Hemalaun-eozinsko bojenje preparata

Nakon fiksacije i dehidracije nizovima alkohola, kloroformom i mješavinom kloroforma i

paraplasta (1:1, 37°C) tkivni preparati su uklopljeni u parafinske blokove (Paraplast,

Sigma®).

Blokovi su rezani na mikrotomu na 6 μm debljine. Nakon pričvršćivanja na predmetnicu

premazanu bjelanjkom jajeta sa zrncem timola, preparati su prošli slijedeći niz u kadicama

za bojenje:

Ksilol, Kemika, Zagreb 2 x 15 minuta (deparafiniranje),

rastući koncentracijski niz etilnog alkohola (100 %, 96%, 80 % i 75 % ) 1 x 5 minuta,

destilirana voda 2 x 5 minuta,

Mayerova otopina, (Kemika, Zagreb) 1 x 3 minuta,

eozin, (Kemika, Zagreb) 1x 3 minuta (0.1 g boje na 100 ml 75 % alkohola),

destilirana voda 2 x 5 minuta,

rastući koncentracijski niz etilnog alkohola (100 %, 96%, 80 %, 75 % ) 1 x 5 minuta,,

ksilol 2 x 15 minuta (deparafiniranje),

uklapanje u kanada balzam (Kemika, Zagreb) s pokrovnim stakalcem (Arnold 1968., Lee i

Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).

77

Page 91: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3.10.3. Reakcija na glikokonjugatne spojeve, PAS (engl. periodic acid Schiff base),

PAS+AB (engl. periodic acid Schiff base+alcian blue), PAS+α A (periodic acid Schiff

base+alfa amilase)

Ovim histokemijsko dijagnostičkim testovima za dokazivanje ugljikohidrata, tj. polisaharida

u tkivima obrađeni su bubreg, jetra i tanko crijevo. Fiksirani uzorci narezani su kriostatom.

Predmetnice s rezovima isparne su u 70 % etilnom alkoholu i uronjeni u perjodnu otopinu

sastava 1 ml 50 % perjodne kiseline (HIO4) u 100 ml destilirane vode, takvoj otopini

dodano je 135 mg kristalnog natrijeva acetata otopljenog u 35 ml apsolutnog etilnog

alkohola. Preparati su držani pri sobnoj temperaturi u trajanju od 5 minuta, u otopini

natrijevog acetata te su prebačeni u reducirajuću otopinu sastava 1 g natrijevog jodida, 1g

natrijevog tiosulfata u 20 ml vode. Nakon otapanja soli dodano je 30 ml etanola i 0,5 ml 2

M klorovodične kiseline.

Slijedi ispiranje u 70 % alkoholu i uranjanje 30 minuta u Schiffov reagens (1g bazičnog

fuksina, (Sigma) otopi se u 200 ml kipuće destilirane vode. Promiješa se i ohladi na 50°C.

Nakon filtriranja doda se 30 ml 1 M klorovodične kiseline, (Kemika, Zagreb) i 3 mg

natrijeva metabisulfata. Prije uporabe ostavi se stajati 24 sata u zatamljenoj boci kako bi

došlo do reakcije stvaranja SO2-parasoanilinskog kompleksa. Preparate se ispralo u vodi,

osušilo i uklopilo s pokrovnicom.

Crvenkasto purpurno obojene strukture ukazuju na pozitivnu PAS reakciju (tj. jasno vidimo

mjesta na kojima je najviše kompleksnih ugljikohidrata, polisaharida, glikokonjugata,

mukopolisaharida, glikana i sl.).

Njihovom razlučivanju služe druge dvije upotrebljene metode, PAS+AB i PAS+α amilaza.

Mukopolisaharidi (glikozaminoglikani) zbog negativnog naboja snažno vežu kationske

(pozitivno nabijene) boje poput toluidinskog modrila, Azura A i Alcian blue (AB).

Predmetnice s rezovima ostavimo 30 minuta na sobnoj temperaturi u otopini Alcian Blue

boje pH 2,5 (1 g, AB boja 8 GX, Sigma® i 100 ml 3% ledene octene kiseline s dodatkom

nekoliko kristalića timola). Rezultat je plavkasto do crvenkasto obojenje svih polisaharida i

mukoznih struktura koje sadrže heksoze ili deoksiheksoze sa glikolnim skupinama.

Hijaluronska kiselina, sijalomucini, i svi osim najkiselijih sulfoniranih mukoznih spojeva

boje se plavo.

78

Page 92: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Pozitivna PAS reakcija pokazuje tkivni raspored kompleksnih polisaharida. Dokaz da takva

područja sadrže glikogen ili škrob je taj da nakon djelovanja amilaze (PAS+α amilaza) na

tim mjestima više nema pozitivne PAS reakcije. Preparati tretirani po istom protokolu gore

opisanom za PAS reakciju prije početka PAS bojenja tretirani su 3 sata na 37°C sa 0.5 %

otopinom α-amilaze (α-amilaza Asperygilus ryze, Serva) u 0.004 % acetatnom puferu pri pH

5,5. Rezultat je gubitak pozitivne PAS reakcije na mjestima koja su sadržavala glikogen

(Arnold 1968., Lee i Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).

3.10.4. Histokemijsko dokazivanje glutationa

Nefiksirani i kriostatom izrezani rezovi jetre osušeni su u potpunosti u sobnim uvjetima.

Predmetnice s preparatima uronjene su oko 20 sekundi u otopinu za bojenje (33 % (w/v)

otopinu željeznog klorida, (Kemika, Zagreb) u destiliranoj vodi, a neposredno prije upotrebe

pomiješati s 30 % (w/v) natrijeva fericijanida u destiliranoj vodi), potom su predmetnice

isperane kratko u destiliranoj vodi, osušene i uklopljene s pokrovnim stakalcem. Rezultat je

jako plavo obojenje tkiva na mjestima gdje je koncentriran glutation (Arnold 1968, Lee i

Luna 1961 i Chayen i Bittensky 1991).

3.10.5. Histokemijsko bojenje lipida - Sudan black B i Sudan III

Sudan B je metoda kojom dokazujemo lipidne uklopine u tkivima i stanicama organa.

Nefiksirana jetra narezana je na kriostatu. Napravljena je zasićena otopina Sudan Black B,

Sigma® u 70% etilnom alkoholu te profiltrirana. Predmetnice s rezovima ostavljene su 30

minuta u takvoj otopini a zatim su isprane od viška otopine u 70 % etilnom alkoholu, a

potom u 50 % etilnom alkoholu i na kraju u destiliranoj vodi. Nakon sušenja pokriveni su

pokrovnicom i uklopljeni u glicerin želatinu. Svi lipidi u stanici ovom metodom oboje se

sivkasto do crno-plavo.

Sudan III metoda provedena je tako da se otopi 1 g Sudan III, Sigma® reagensa u 100 ml

75 % etilnog alkohola. Kriostatski rezovi na predmetnicama provuku se kroz niz etilnog

alkohola koncentracija 100 %, 96%, 80 % i 75 % te urone u pripravljenu Sudan III otopinu

10-20 minuta. Ponovno se provuku kroz niz etilnog alkohola i uklope u glicerin želatinu.

Pozitivna reakcija lipide boji crvenkasto i narančasto (Arnold 1968., Lee i Luna 1961. i

Chayen i Bittensky 1991.).

79

Page 93: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3.11. ENZIMATSKOHISTOKEMIJSKE REAKCIJE NA TKIVA

3.11.1. Sukcinat-dehidrogenaza (ScDH)

Enzim ScDH katalizira reakciju oksidacije sukcinata u fumarat i ubikvinol. Po sastavu je

flavoprotein (FAD) koji sadrži željezo-sumporni kompleks. Enzim je dio Krebsovog

ciklusa, vezan za unutarnju membranu mitohondrija, gdje je glavni dio kompleksa II u

respiratornom lancu (Oxford Dictionary of Molecular Biology and Biochemistry 2001.).

Svježi, nefiksirani kriostatski rezovi jetre i mišića inkubirani su 30 minuta na 37°C u

reakcijskom mediju pripremljenom otapanjem 0.1 M neotetrazolijeva klorida (2,2´5,5´-

tetrafenil-3,3´difenilen tetrazolijev klorid, Sigma®, USA) u 100 ml 0,1 M fosfatnog pufera

(PBS) čija je pH vrijednost 7,8. Na 50 ml takve otopine dodano je 0,68 g natrijeva

sukcinata, Sigma® što predstavlja 0,05 M otopinu.. Nakon tako provedenog inkubiranja

preparati su isprani u destiliranoj vodi osušeni i uklopljeni. Rezultat je crvenkasto do

purpurno obojenje na mjestima aktivnosti sukcinat dehidrogenaze (Arnold 1968., Lee i

Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).

3.11.2. Laktat-dehidrogenaza (LDH)

Enzim LDH katalizira reverzibilnu reakciju prelaska mliječne kiseline (laktata) u

pirogrožđanu kiselinu (piruvat), koja ima ključnu ulogu u glikolizi. Stvaranje laktata iz

piruvata omogućava stanici da energetski izdrži smanjenu količinu (hipoksija) ili privremeni

nedostatak kisika (anoksija), tj. anaerobne uvjete (Oxford Dictionary of Molecular Biology

and Biochemistry 2001.). Preparati su inkubirani u reakcijskom mediju (1 mg/ml nitroblue

tetrazolija otopljeno je u 0,05 M PBS-u pri pH 8.0 a zatim je dodano 0,2 g natrijeva laktata

na 25 ml ove otopine. Nakon provjere pH dodano je 5 mg NAD) cca 30 minuta na 37°C, a

zatim isprani, osušeni i uklopljeni kao polutrajni preparati. Rezultat je stvaranje crvenkastih,

plavih i ljubičastih mjesta gdje je aktivnost enzima pojačana (Arnold 1968., Lee i Luna

1961. i Chayen i Bittensky 1991.).

80

Page 94: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

3.11..3. Alkalna fosfataza (AlP)

Enzim ALF katalizira reakciju hidrolize ortofosfatnog monoestera u alkohol i ortofosfat tj.

reakciju otcjepljivanja fosfata sa različitih fosfatnih estera. Optimum reakcijske aktivnosti je

pri pH 8 ili više. Nalazimo ga u bakterija, gljiva, životinja ali ne i u viših biljaka. Kofaktori

su mu cink i magnezij (Oxford Dictionary of Molecular Biology and Biochemistry 2001.).

Kriostatski rezovi inkubiraju se 1 sat na sobnoj temperaturi u inkubacijskoj otopini koja se

sastoji od: 20 ml 0,2 M Tris-pufera, Sigma®, pH=8,7, u kojeg se doda 24 mg 1-diazo-4

benzoilamino-2,5-dietoksibenzena (fast blue BB-diazonijeva sol), Sigma® zajedno sa 4 mg

naftol AS bifosfata, Sigma® koji služi kao supstrat. Nakon inkubacije i ispiranja preparati

se uklapaju u glicerin želatinu. Rezultat je crvenkasti produkt na mjestima najjače aktivnosti

enzima alkalne fosfataze (Arnold 1968., Lee i Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).

3.11..4. Kisela fosfataza (KP)

Enzim KP katalizira reakciju otcijepljivanja anorganskog fosfata sa različitih supstrata.

Kofaktori su mu cink i magnezij. Optimum njegove reakcijske aktivnosti nalazi se u

kiselom pH područaju. Kisela fosfataza nalazi se posebice unutar lizosoma i sekretornih

vezikula te je stoga najčešći marker lizosoma. Od svih tkiva najveću koncentraciju ima u

prostati, ali i u jetri i slezeni (Oxford Dictionary of Molecular Biology and Biochemistry

2001.). Svježi kriostatski rezovi inkubiraju se 1 sat pri 37 ° C u inkubacijskom mediju koji

sadrži 10 ml, 0,2 M acetatnog pufera pH=5,2 u kojem je otopljeno 2 mg supstrata naftoltol

AS bifosfata, (Sigma®), i 13 mg boje 5-kloro-4-benzamido-2-metilbenzendiazonijev

klorida (fast red-violet salt LB), Sigma®. Supstrat je netopiv u puferu pa ga se treba otopiti

najprije u par kapi acetona. Nakon inkubacije rezovi se isperu u destiliranoj vodi i uklope u

glicerin želatinu (Arnold 1968., Lee i Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).

3.11.5. Nespecifična Esteraza (EST)

Svježi kriostatski rezovi inkubiraju se 30 minuta na sobnoj temperaturi u inkubacijskoj

otopini koja sadrži 3 mg supstrata, naftilacetata najprije otopljenog s par kapi

dimetilformaldehida (DMF-a), na koje se dodaje 10 ml 0,2M Tris- pufera, 1-diazo-4

81

Page 95: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

benzoilamino-2,5-dietoksibenzena (fast blue BB-diazonijeva sol), Sigma®, pH vrijednosti

7,2, a potom se u tu otopinu doda 12 mg 1-diazo-4-benzoilamino-2,5-dietoksibenzena (fast

blue BB-diazonijeva sol), Sigma®. Nakon ispiranja u destiliranoj vodi uklapa se u glicerin

želatinu. Rezultat na mjestima aktivnosti nespecifične esteraze je plava boja (Arnold 1968.,

Lee i Luna 1961. i Chayen i Bittensky 1991.).

3.12. GLICERIN ŽELATINA I UKLOP PREPARATA

30 g želatine otopi se u 200 ml destilirane vode uz blago zagrijavanje. Dodaje se 200 ml

glicerina uz blago zagrijavanje 45-50°C u vodenoj kupelji. Nakon što otopina postane

homogena i tekuća filtrira se kroz sintetsku (perlonsku) vatu (Arnold 1968., Lee i Luna

1961. i Chayen i Bittensky 1991.).

82

Page 96: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

4. REZULTATI

Page 97: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

4. REZULTATI 4.1 PREŽIVLJAVANJE Rezultati preživljavanja mužjaka i ženki i pripadnika oba spola prikazani sun a slikama 12, 13,

14. U kontrolnoj skupini mužjaka i ženki miševa soja CBA T6T6 skupina do kraja planiranog

pokusa Slika 12: Preživljavanje mužjaka tijekom pokusa (%)

0

20

40

60

80

100

120

1/1 2/4 3/6 4/8 5/10

6/12

7/14

8/16

9/18

10/20

11/22

12/24

13/26

TRETMAN / DAN

Prež

ivlja

vanj

e (%

)

0mg/kg

185mg/kg

375mg/kg

555mg/kg

nije zabilježeno uginuće niti jedne jedinke kao posljedica stresa, djelovanja dietilnog etera

Slika 13.: Preživljavanje ženki tijekom pokusa (%)

0

20

40

60

80

100

120

1/1 2/4 3/6 4/85/10 6/1

27/14 8/1

69/18

10/20

11/22

12/24

13/26

TRETMAN / DAN

Prež

ivlja

vanj

e (%

)

0mg/kg

185mg/kg

375mg/kg

555mg/kg

84

Page 98: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

prilikom

narkotiziranja životinja ili ulja apliciranog gastričkom kanilom. Preživljavanje kontrolnih

životinja je 100 % tijekom pokusnog razdoblja (slike 12., 13., 14.).

Preživljavanje jedinki tretiranih skupina koja je primila dozu od 185 mg/kg tijekom pokusnog

razdoblja bilo je potpuno (100 % preživljavanje). U skupini koja je primila dozu od 375 mg/kg,

kod ženskih jedinki preživljavanje je 100 % do kraja pokusnog razdoblja. Međutim, među

mužjacima te skupine nakon petog tretmana preživjelo je 85,71 % jedinki, a nakon jedanaestog

dana pa do kraja pokusa 71,42 %.

Slika 14.: Preživljavanje mužjaka i ženki

0

20

40

60

80

100

120

1/1 2/4 3/6 4/8 5/10 6/12 7/14 8/16 9/18 10/20 11/22 12/24 13/26

TRETMAN/DAN

Prež

ivlja

vanj

e (%

)

0mg/kg

185mg/kg

375mg/kg

555mg/kg

U skupini tretiranoj s 555 mg/kg, među mužjacima nakon drugog tretmana preživjelo je 85,71 %,

a nakon šestog 57,14 %.

Među ženkama skupine te skupine, nakon drugog tretmana, preživjelo je 85,71 % jedinki. Nakon

petog tretmana 71,42 % a nakon šestog 57,14 % jedinki.

85

Page 99: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

4.2. REZULTATI MJERENJA AKTIVNOSTI SERUMSKIH ENZIMA Rezultati biokemijske analize krvi koji pokazuju aktivnost pojedinih enzima kao dijagnostičkih

pokazatelja toksičnog oštećenja pojedinih organskih sustava prometrinom prikazani su tablično

(tablice 5.-11.) i grafički (slike 15.-28.). Statistički značajne razlike prikazane su u tablicama

pored osnovne deskriptivne statistike pojedinog mjerenog parametra.

Aktivnosti laktat-dehidrogenaze (LDH U/L) prikazane su tablično (tablica 5.) i grafički

slikama 15. i 16. Uočene su statistički značajne razlike porasta aktivnosti LDH (p ≤ 0.01) između

mužjaka kontrolne skupine i mužjaka skupina tretiranih s 185 mg/kg i 375 mg/L. Nadalje

usporedbom pokusne skupine zbirno s obzirom na spol utvrđene su statistički značajne razlike

porasta aktivnosti LDH na istoj razini značajnosti (p ≤ 0.01) samo između kontrolne skupine i

skupine tretirane s 375 mg/kg, dok skupina tretirana s 185 mg/kg pokazuje različitost porasta

aktivnosti LDH u odnosu na kontrolnu skupinu na razini značajnosti p ≤ 0.05. Unutar skupina

značajna razlika uočava se jedino u skupini 185 mg/kg gdje ženke imaju manju aktivnost LDH

nego mužjaci.

Tablica 6. i slike 17. i 18. prikazuju aktivnosti γ- GT (U/L). Između spolova svih tretiranih

skupina nema statistički značajanih razlika. Mužjaci kontrolne skupine razlikuju se porastom

aktivnosti (p ≤ 0.01) od skupine tretirane s 375 mg/kg prometrina. Kontrolna skupina promatramo

li združeno mužjake i ženke razlikuje se aktivnosti na istoj razini značajnosti jedino od skupine

555 mg/kg.

Tablica 7. i slike 19. i 20. prikazuju aktivnosti alkalne-fosfataze (ALP) između tretiranih

skupina. Uočava se statistički značajna razlika porasta aktivnosti (p ≤ 0.05) u aktivnosti mužjaka

kontrolne skupine i mužjaka svih ostalih skupina tretiranih prometrinom. Ženke kontrolne

skupine razlikuju se na istoj razini značajnosti jačim porastom aktivnosti (p ≤ 0.01) od ženki

skupina tretiranih s 185 i 375 mg/kg. Promatramo li pokusne skupine ujedinjene s obzirom na

spol uočene su statistički značajne razlike porasta aktivnosti na istoj razini značajnosti (p ≤ 0.05)

između kontrolne skupine i skupina tretiranih s 185 i 375 mg/kg. Unutar pokusnih skupina

uočene su statistički značajne razlike između mužjaka i ženki svih skupina osim one koja je

primila najveću dozu prometrina, gdje u svim skupinama ženke imaju pojačanu aktivnost ALP

nego mužjaci.

Tablica 8. i slike 21. i 22. prikazuju koncentraciju kreatinina (μmol/dL) u krvi miševa

pokusnih skupina. Statistički značajne razlike na razini značajnosti (p ≤ 0.05) očituju se

opadanjem koncentracije kreatinina između kontrolne i svih ostalih skupina uočene su s obzirom

86

Page 100: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

na dozu (mužjaci i ženke objedinjeni zajedno unutar skupine) i pri usporedbi tretiranih skupina s

obzirom na spol. Iznimka je razlika između mužjaka kontrolne i skupine koja je tretirana s 185

mg/kg prometrina gdje je razina značajnosti p ≤ 0.01, ali se očituje opadanjem koncentracije

kreatinina. Između mužjaka i ženki u svih pokusnih skupina nisu uočene statistički značajne

razlike.

Aktivnost Apartat transaminaze (AST U/L) značajno se ralikuju (p ≤ 0.01) između mužjaka i

ženki, gdje ženke imaju povišenu aktivnost enzima unutar svih skupina osim one koja je primala

najveću dozu od 555 mg/kg, gdje se uočava obrnuta situacija smanjenja aktivnosti u ženki.

Daljnje razlike vrlo blagog porasta aktivnosti (p ≤ 0.05) uočene su između mužjaka kontrolne

skupine i skupina 185 i 555 mg/kg, dok se jedino ženke skupine 375 mg/kg razlikuju vrlo blagim

padom (p ≤ 0.01) od kontrole kako je prikazano u tablici 9. i grafički slikama 23. i 24.

Tablica 10. i slike 25. i 26. prikazuju razlike u aktivnosti alanil-transaminaze u pokusnih

skupina. Statistički značajno, ali izuzetno blagim porastom aktivnost (p ≤ 0.01, p ≤ 0.05) od

ostalih skupina odstupa jedino skupina s najvećom dozom 555mg/kg, dok između spolova nisu

uočene značajne razlike.

Izračunati indeks De Ritiusovog omjera između gore spomenuta dva enzima (AST/ALT)

statistički se jedino razlikuje blagim opadanjem koeficijenta (p ≤ 0.05) između mužjaka

kontrolne skupine i doza 185 i 375mg/kg. Nadalje, razlike između spolova (p ≤ 0.01) uočavaju se

jedino u kontrolne skupine, gdje ženke imaju manji koeficijent od mužjaka, dok u drugih skupina

ne postoje statistički značajne razlike kako je to prikazano u tablici 11. i slikama 27. i 28.

87

Page 101: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 5. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike aktivnosti laktat-dehidrogenaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina

LDH U/L

Značajne razlike Doza Spol N Srednja vrijednost

St. devijacija Minimum Maksimum unutar skupine

između skupina

m 7 343.22 93.26 232.32 463.00 NS A,B ž 7 351.88 76.53 267.94 463.84 NS NS

K 0 mg/kg

m + ž 14 388.43 145.15 232.32 751.22 a,B m 7 582.05 127.73 404.75 752.83 K,C ž 7 412.72 76.77 266.30 485.70 * NS

A 185 mg/kg

m + ž 14 497.38 134.05 266.30 752.83 k m 5 531.34 160.86 306.80 724.50 NS NS ž 7 497.40 162.49 216.13 641.90 NS C

B 375 mg/kg

m + ž 12 511.54 155.30 216.13 724.50 K m 4 495.35 320.01 148.10 857.20 NS NS ž 4 288.45 90.72 184.10 392.60 NS B

C 555 mg/kg

m + ž 8 391.90 244.23 148.10 857.20 A

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

doza

200,00

400,00

600,00

800,00

ldh

Slika 15. Korelativni odnos izmjerene aktivnosti laktat-dehidrogenaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama

88

Page 102: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Mean+SDMean-SDMean

Laktat dehidrogenaza

Doza

LDH

(U/L

)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

a,B

kK

A

Mean+SDMean-SDMeanOutliers

Laktat dehidrogenaza

Doza

LDH

(U/L

)

0

200

400

600

800

1000

m 0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg

A,B

*

*

K,C K

c

A

B

Slika 16: Srednje vrijednosti aktivnosti laktat-dehidrogenaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

89

Page 103: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 6. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike aktivnosti gama-glutamil-transferaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina

yGT U/L Značajne razlike doza spol N Srednja

vrijednost Standardna devijacija

Minimum Maksimum unutar skupine

između skupina

m 7 0.64 .4803 0.12 1.39 NS B ž 7 1.22 .5333 0.58 2.08 NS NS

K 0 mg/kg

m + ž 14 0.93 .5719 0.12 2.08 m 7 2.48 3.1110 0.00 8.68 NS NS ž 7 1.27 .6375 0.23 2.32 NS NS

A 185 mg/kg

m + ž 14 1.87 2.2461 0.00 8.68 m 5 3.60 1.9507 1.27 6.36 NS K ž 7 2.41 2.7265 0.57 8.28 NS NS

B 375 mg/kg

m + ž 12 2.91 2.4116 0.57 8.28 m 4 2.87 3.6838 0.11 8.30 NS NS ž 4 3.82 2.9880 0.00 6.71 NS NS

C 555 mg/kg

m + ž 8 3.35 3.1465 0.00 8.30

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

doza

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

YGT

U/L

Slika 17. Korelativni odnos izmjerene gama-glutamil-transferaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama

90

Page 104: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Mean+SEMean-SEMean

gama glutamil transferaza

Doza

GG

T(U

/L)

0

1

2

3

4

5

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

C

K

NS

NS

Mean+SEMean-SEMean

Gama glutamil transferaza

Doza

GG

T (U

/L)

0

1

2

3

4

5

6

m 0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg

B

K

NS NS

NS

NS

Slika 18: Srednje vrijednosti aktivnosti gama-glutamil-transferaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

91

Page 105: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 7. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike aktivnosti alkalne-fosfataze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina

AP U/L

Značajne razlike Doza Spol N Srednja vrijednost

Standardna devijacija

Minimum Maksimum unutar skupine

između skupina

m 7 63.17 6.2253 52.36 72.71 ** a,b,c ž 7 75.32 6.4252 65.11 86.27 ** a,b

K 0 mg/kg

m + ž 14 69.25 8.7591 52.36 86.27 a,b m 7 82.74 11.7224 73.25 108.52 * k ž 7 111.50 6.8632 103.17 120.72 * k,B,c

A 185 mg/kg

m + ž 14 97.12 17.5470 73.25 120.72 k,c m 5 81.11 8.7605 71.89 92.24 * k ž 7 109.92 5.0373 105.80 119.37 * A,c

B 375 mg/kg

m + ž 12 97.91 16.1802 71.89 119.37 k,c m 4 80.32 12.7005 67.80 94.90 NS k ž 4 68.49 9.4258 59.68 77.30 NS a,b

C 555 mg/kg

m + ž 8 74.41 12.1323 59.68 94.90� a,b

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

doza

60,00

80,00

100,00

120,00

AP

U/L

Slika 19. Korelativni odnos izmjerene alkalne-fosfataze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama

92

Page 106: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Mean+SDMean-SDMean

Alkalna fosfataza

Doza

AP

(U/L

)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

a,ba,b

k k

Mean+SDMean-SDMean

Alkalna fosfataza

Doza

AP

(U/L

)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 mg/kg m 0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 375 mg/kg m 375 mg/kg z 555 mg/kg m 555 mg/kg z

**

**,a,b,c

*,k

*,B

*,k

*,A

k

a,b

Slika 20: Srednje vrijednosti aktivnosti alkalne-fosfataze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

93

Page 107: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 8. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike koncentracije (µmol/L) kreatinina u serumu kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina.

KREATININ µmol/dL Značajne razlike Doza Spol N Srednja

vrijednost Standardna devijacija

Minimum Maksimum unutar skupine

unutar skupine

m 7 102.56 23.5905 61.31 131.90 NS A,b,c ž 7 91.12 18.2540 63.21 120.24 NS a,b,c

K 0 mg/kg

m + ž 14 96.84 21.1153 61.31 131.90 - a,b,c m 7 82.40 11.8191 60.77 93.92 NS K,c ž 7 64.08 18.0640 40.33 96.13 NS k

A 185 mg/kg

m + ž 14 73.24 17.4763 40.33 96.13 - k m 5 71.79 26.0844 43.64 107.70 NS k ž 7 61.91 9.0357 50.80 70.16 NS k

B 375 mg/kg

m + ž 12 66.03 17.8276 43.64 107.70 - k m 4 49.56 3.7766 44.20 53.04 NS k,a ž 4 63.60 19.0287 46.90 82.30 NS k

C 555 mg/kg

m + ž 8 56.58 14.7525 44.20 82.30� - k

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

doza

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

KR

EATI

NIN

um

ol/d

l

Slika 21. Korelativni odnos izmjerene kreatinina u serumu (µmol/dL) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama

94

Page 108: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Mean+SDMean-SDMean

Kreatinin

Doza

KR

EA

T (m

ikro

mol

/dl)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg kg

a,b,c

k k

k

Mean+SDMean-SDMean

Kreatinin

Doza

KR

EA

T(m

ikro

mol

/dl)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 mg/kg m 0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 375 mg/kg m 375 mg/kg z 555 mg/kg m 555 mg/kg z

kk

k

k

A,b,C

a,b,cK,c

k,a

Slika 22: Srednje vrijednosti koncentracije kreatinina u serumu (µmol/dL) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

95

Page 109: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 9. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike aktivnosti aspartat-transaminaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina.

AST U/L Značajne razlike doza spol N Srednja

vrijednost Standardna devijacija

Minimum Maksimum unutar skupine

između skupina

m 7 36.63 6.35 26.19 42.25 ** b,c ž 7 67.33 12.05 52.80 85.80 ** B

K 0 mg/kg

m + ž 14 51.98 18.42 26.19 85.80 NS m 7 44.52 4.72 36.52 52.80 ** b,c ž 7 59.86 5.70 51.48 70.40 ** NS

A 185 mg/kg

m + ž 14 52.19 9.41 36.52 70.40 NS m 5 69.74 16.95 49.72 92.40 ** k,a ž 7 51.54 10.45 33.00 63.36 ** K

B 375 mg/kg

m + ž 12 59.12 15.87 33.00 92.40 NS m 4 71.42 24.71 47.96 105.60 NS k,a ž 4 56.02 16.38 44.44 79.20 NS NS

C 555 mg/kg

m + ž 8 63.72 21.08 44.44 105.60 NS

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

doza

25,00

50,00

75,00

100,00

AST

U/L

Slika 23. Korelativni odnos aktivnosti aspartat-transaminaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama

96

Page 110: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Mean+SDMean-SDMean

Aspartat transferaza

Doza

AS

T (U

/L)

0

20

40

60

80

100

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

NS

Mean+SDMean-SDMean

Aspartat aminotransferaza

Doza

AS

T (U

/L)

0

20

40

60

80

100

0 mg/kg m 0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 375 mg/kg m 375 mg /kg z 555 mg /kg m 555 mg/kg z

**,b,c

**,B

**,b,c

**

**,k

**,K

k k,a

Slika 24. Srednje vrijednosti koncentracije aspartat-transaminaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

97

Page 111: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 10. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike aktivnosti alani- transaminaze (U/L) u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrina.

ALT U/L Značajne razlike Doza Spol N Srednja

vrijednost Standardna devijacija

Minimum Maksimum unutar skupine

između skupina

m 7 17.53 4.65 12.76 26.40 NS C ž 7 17.52 3.33 13.20 22.00 NS

K 0 mg/kg

m + ž 14 17.53 3.88 12.76 26.40 m 7 14.49 1.55 13.20 17.60 NS c ž 7 18.04 2.05 14.08 19.80 NS

A 185 mg/kg

m + ž 14 16.26 2.53 13.20 19.80 m 5 16.61 1.97 13.20 18.04 NS C ž 7 14.89 4.22 8.80 18.48 NS

B 375 mg/kg

m + ž 12 15.61 3.45 8.80 18.48 m 4 22.69 8.92 16.28 35.20 NS K,a,B ž 4 17.45 3.60 13.20 22.00 NS

C 555 mg/kg

m + ž 8 20.07 6.89 13.20 35.20

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

doza

10,00

20,00

30,00

ALT

U/L

Slika 25. Korelativni odnos aktivnosti alani- transaminaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama

98

Page 112: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Mean+SDMean-SDMean

Alanil aminotransferaza

Doza

ALT

(U/L

)

0

5

10

15

20

25

30

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

NS

Mean+SDMean-SDMean

Alanil aminotransferaza

Doza i spol

ALT

(U/L

)

0

5

10

15

20

25

30

35

0 mg/kg m 0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 375 mg/kg m 375 mg/kg z 555 mg/kg m 555 mg7kg z

C

C

K,a,B

c

NSNS NS

NS

Slika 26. Srednje vrijednosti koncentracije alanil-transaminaze (U/L) u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

99

Page 113: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 11. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike izračunate vrijednosti De Ritisovog indeksa (omjera aktivnosti (U/L) aspartat transaminaze i alanil transaminaze) u serumu kontrolnih miševa i miševa tretiranih pripadajućim dozama prometrin

De Ritis omjer AST/ALT Značajne razlike Doza Spol N Srednja

vrijednost Standardna devijacija

Minimum Maksimum unutar skupine

između skupina

m 7 0.51 0.24 0.30 1.01 ** a,b ž 7 0.27 8.09E-02 0.18 0.42 *

K 0 mg/kg

m + ž 14 0.39 0.21 0.18 1.01 m 7 0.32 4.28E-02 0.30 0.42 NS k ž 7 0.30 5.9E-02 0.20 0.38 NS

A 185 mg/kg

m + ž 14 0.31 5.1E-02 0.20 0.42 m 5 0.25 7.9E-02 0.17 0.35 NS k ž 7 0.30 0.16 0.15 0.51 NS

B 375 mg/kg

m + ž 12 0.28 0.10 0.15 0.51 m 4 0.31 3.2E-02 0.27 0.34 NS ž 4 0.34 0.13 0.17 0.50 NS

C 555 mg/kg

m + ž 8 0.32 9.4E-02 0.17 0.50

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

doza

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

AST

/ALT

Slika 27. Korelativni odnos aktivnosti Alanil-transaminaze u serumu (U/L) kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine prema pripadajućim dozama

100

Page 114: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Mean+SDMean-SDMean

Omjer AST/ALT, De Ritis-ov omjer

Doza

De

Riti

s om

jer

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 mg/kg 185 mg/kg 375 mg/kg 555 mg/kg

NS

Mean+SDMean-SDMean

Omejr AST/ALT, De Ritis-ov omjer

Doza

De

Riti

s-ov

om

jer

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 mg/kg m 0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 375 mg/kg m 375 mg/kg z 555 mg/kg m 555 mg/kg z

**

** NS

NS NS

Slika 28. Srednje vrijednosti De Ritiusovog omjera kontrolnih miševa i miševa tretiranih prometrinom, raspoređenih u skupine, združeno oba spola prema pripadajućim dozama (gornja slika), te dozama u mužjaka i ženki odvojeno promatranih po spolu (donja slika). Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

101

Page 115: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

4.3. Korelacije i regresije enzima Tablice 12.-23. i slike 29.-58. prikazuju korelativne i regresijske odnose između pojedinih

mjerenih enzima. Statistički značajne razlike korelacijskog koeficijenta “r” prikazane su u

tablicama 12.-23. regresijske jednadžbe s koeficijentom regresije “b” prikazane su u pojedinom

dijagramu (slike 29.-58.) linearno regresijskog odnosa pojedinih enzima promatranih s obzirom

na dozu te dozu i spol.

Uočava se statistički značajna pozitivna povezanost između odnosa AP i GGT, AP i AST kao i

GGT i AST u kontrolnih jedinki promatramo li objedinjene spolove (tablica 12.). Takav se odnos

u kontrolne skupine zadržava jedino u ženki između enzima AP i GGT (tablica 14.), dok su kod

mužjaka pozitivno statistički značajno povezani samo ALT i AST (tablica 15.). Već najmanja

doza pesticide u 28 dnevnoj izloženosti pokazuje statistički značajniju pozitivnu korelaciju

enzima LDH i serumskog kreatinina u združeno promatranih spolova, takav se odnos uočava

jedino u mužjaka promatrane (tablica 16.) skupine dok kod ženki nema statistički značajne

korelacije dvaju varijabli.

Pozitivna korelacija AP i AST i dalje ostaje statistički značajna kao i u kontrole, a ostali prije

nabrojeni enzimi koji su bili statistički značajno pozitivno korelirani gube značajnu statističku

vezu u ženki promatrane skupine, dok kod mužjaka te korelacije i dalje ostaju slične kontroli.

Nadalje posebice je uočljiva pojava statistički značajne negativne korelacije AST i ALT u ženki

promatrane skupine (tablica 17.). Skupina koja je primala dozu 375 mg/kg (tablice 18.-20.)

pokazuje statistički značajnu negativnu povezanost kreatinina i AP u združeno promatranim

spolovima u odnosu na primljenu dozu, dok u mužjaka te skupine negativno koreliran a satistički

značajan odnos pojavljuje se između LDH i GGT, a u ženki iste skupine pozitivno vezani, sa

statistički značajem LDH i AST

U skupine tretirane najvećom dozom korelitivni odnosi ne pokazuju statistički značajnu

povezanost osim u mužjaka kod enzima AST i ALT (tablica 22.).

102

Page 116: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 12. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina K: DOZA: 0mg/kg, SPOL: združeno oba spola LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,243 -0,212 0,101 -0,172 -0,234

GGT -0,243 1,000 0,680 -0,370 0,582 -0,327

AP -0,212 0,680 1,000 -0,130 0,803 -0,232

KREAT 0,101 -0,370 -0,130 1,000 -0,164 -0,010

AST -0,172 0,582 0,803 -0,164 1,000 -0,244

ALT -0,234 -0,327 -0,232 -0,010 -0,244 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p < 0,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05. Tablica 13. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina K: DOZA: 0mg/kg, SPOL: mužjaci LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,182 -0,137 0,118 0,434 -0,326

GGT -0,182 1,000 0,125 0,037 0,011 -0,193

AP -0,137 0,125 1,000 0,616 0,294 -0,205

KREAT 0,118 0,037 0,616 1,000 0,170 -0,283

AST 0,434 0,011 0,294 0,170 1,000 -0,939

ALT -0,326 -0,193 -0,205 -0,283 -0,939 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p < 0,01, dok su plavo označene značajne za p < 0,05. Tablica 14. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina K: DOZA: 0mg/kg, SPOL: ženke LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,058 0,196 -0,251 -0,254 0,010

GGT -0,058 1,000 0,853 -0,643 0,460 -0,638

AP 0,196 0,853 1,000 -0,523 0,668 -0,513

KREAT -0,251 -0,643 -0,523 1,000 0,179 0,477

AST -0,254 0,460 0,668 0,179 1,000 -0,216

ALT 0,010 -0,638 -0,513 0,477 -0,216 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p < 0,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05.

103

Page 117: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 15. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina A: DOZA: 185 mg/kg, SPOL: združeno oba spola LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 0,530 -0,457 0,615 -0,499 -0,341

GGT 0,530 1,000 0,082 0,490 -0,363 -0,211

AP -0,457 0,082 1,000 -0,444 0,687 0,522

KREAT 0,615 0,490 -0,444 1,000 -0,379 -0,491

AST -0,499 -0,363 0,687 -0,379 1,000 0,332

ALT -0,341 -0,211 0,522 -0,491 0,332 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p < 0,05. Tablica 16. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina A: DOZA: 185 mg/kg, SPOL: mužjaci LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 0,562 0,249 0,926 0,119 0,607

GGT 0,562 1,000 0,800 0,623 -0,359 -0,200

AP 0,249 0,800 1,000 0,362 0,067 -0,297

KREAT 0,926 0,623 0,362 1,000 0,125 0,366

AST 0,119 -0,359 0,067 0,125 1,000 0,444

ALT 0,607 -0,200 -0,297 0,366 0,444 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05. Tablica 17. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina A: DOZA: 185 mg/kg, SPOL: ženke LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 0,061 0,265 -0,063 0,142 -0,229

GGT 0,061 1,000 -0,453 0,513 -0,308 0,336

AP 0,265 -0,453 1,000 -0,307 -0,278 0,083

KREAT -0,063 0,513 -0,307 1,000 0,181 -0,429

AST 0,142 -0,308 -0,278 0,181 1,000 -0,899

ALT -0,229 0,336 0,083 -0,429 -0,899 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p < 0,05.

104

Page 118: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 18. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina B: DOZA: 375mg/kg, SPOL: združeno oba spola LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,085 -0,090 0,308 0,525 0,018

GGT -0,085 1,000 -0,175 0,155 0,108 0,135

AP -0,090 -0,175 1,000 -0,724 -0,441 -0,234

KREAT 0,308 0,155 -0,724 1,000 0,250 0,113

AST 0,525 0,108 -0,441 0,250 1,000 0,076

ALT 0,018 0,135 -0,234 0,113 0,076 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05. Tablica 19. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina B: DOZA: 375mg/kg, SPOL: mužjaci LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,802 0,313 0,284 0,286 -0,304

GGT -0,802 1,000 -0,171 -0,316 -0,336 0,406

AP 0,313 -0,171 1,000 -0,081 0,297 0,044

KREAT 0,284 -0,316 -0,081 1,000 -0,698 0,374

AST 0,286 -0,336 0,297 -0,698 1,000 -0,297

ALT -0,304 0,406 0,044 0,374 -0,297 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05. Tablica 20. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina B: DOZA: 375mg/kg, SPOL: ženke LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 0,430 0,167 0,172 0,988 0,121

GGT 0,430 1,000 -0,188 0,480 0,552 0,002

AP 0,167 -0,188 1,000 0,106 0,146 -0,160

KREAT 0,172 0,480 0,106 1,000 0,251 -0,458

AST 0,988 0,552 0,146 0,251 1,000 0,104

ALT 0,121 0,002 -0,160 -0,458 0,104 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05.

105

Page 119: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 21. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina C: DOZA: 555mg/kg, SPOL: združeno oba spola LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,703 -0,096 -0,195 0,246 0,265

GGT -0,703 1,000 0,208 0,444 0,143 -0,110

AP -0,096 0,208 1,000 -0,358 0,610 0,473

KREAT -0,195 0,444 -0,358 1,000 0,167 -0,368

AST 0,246 0,143 0,610 0,167 1,000 0,644

ALT 0,265 -0,110 0,473 -0,368 0,644 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05. Tablica 22. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina C: DOZA: 555mg/kg, SPOL:mužjaci LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,834 -0,580 0,759 0,239 0,080

GGT -0,834 1,000 0,803 -0,927 0,003 0,066

AP -0,580 0,803 1,000 -0,532 0,589 0,648

KREAT 0,759 -0,927 -0,532 1,000 0,324 0,296

AST 0,239 0,003 0,589 0,324 1,000 0,977

ALT 0,080 0,066 0,648 0,296 0,977 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p < 0,01, dok su plavo označene značajne za p <0 ,05.

Tablica 23. Korelacije aktivnosti enzima unutar tretiranih skupina Skupina C: DOZA: 555mg/kg, SPOL: ženke LDH GGT AP KREAT AST ALT LDH 1,000 -0,542 0,074 -0,362 -0,713 0,272

GGT -0,542 1,000 -0,410 0,915 0,646 -0,408

AP 0,074 -0,410 1,000 -0,073 0,374 -0,659

KREAT -0,362 0,915 -0,073 1,000 0,755 -0,700

AST -0,713 0,646 0,374 0,755 1,000 -0,863

ALT 0,272 -0,408 -0,659 -0,700 -0,863 1,000

Crveno označene korelacije značajne su za p <0 ,01, dok su plavo označene značajne za p < 0,05.

106

Page 120: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-250,00

0,00

250,00

500,00

750,00

ldh

ldh = 360.50 + -13.84 * ggtR-Square = 0.01

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ldh = 438.04 + 31.60 * ggtR-Square = 0.28

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

ggt

-250,00

0,00

250,00

500,00

750,00

ldh

ldh = 548.38 + -6.27 * ggtR-Square = 0.01

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

ggt

ldh = 574.87 + -54.58 * ggtR-Square = 0.49

Slika 29.: Linearna regresija enzima LDH:GGT

-500,00

0,00

500,00

1000,00

ldh

ldh = 179.87 + 2.42 * apR-Square = 0.07

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ldh = 836.49 + -3.49 * apR-Square = 0.21

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

-500,00

0,00

500,00

1000,00

ldh

ldh = 612.00 + -0.85 * apR-Square = 0.01

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

ldh = 535.84 + -1.93 * apR-Square = 0.01

Slika 30: Linearna regresija enzima LDH:AP

107

Page 121: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-1000,00

-500,00

0,00

500,00

1000,00

ldh

ldh = 283.36 + 0.66 * ckR-Square = 0.03

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ldh = 152.04 + 4.72 * ckR-Square = 0.38

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

-1000,00

-500,00

0,00

500,00

1000,00

ldh

ldh = 289.89 + 3.27 * ckR-Square = 0.10

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ldh = 575.00 + -3.24 * ckR-Square = 0.04

Slika 31.: Linearna regresija enzima LDH:kreatinin

0,00

250,00

500,00

750,00

1000,00

ldh

ldh = 329.16 + 0.22 * astR-Square = 0.00

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ldh = 835.62 + -6.39 * astR-Square = 0.25

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

0,00

250,00

500,00

750,00

1000,00

ldh

ldh = 226.94 + 4.95 * astR-Square = 0.28

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ldh = 210.56 + 2.85 * astR-Square = 0.06

Slika 32.: Linearna regresija enzima LDH:AST

108

Page 122: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

0,00

400,00

800,00

1200,00

ldh

ldh = 504.28 + -8.94 * altR-Square = 0.18

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ldh = 760.52 + -16.17 * altR-Square = 0.11

10,0 20,0 30,0

alt

0,00

400,00

800,00

1200,00

ldh

ldh = 509.41 + 1.41 * altR-Square = 0.00

10,0 20,0 30,0

alt

ldh = 203.74 + 9.38 * altR-Square = 0.07

Slika 33.: Linearna regresija enzima LDH:ALT

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00

ggt

ggt = -2.14 + 0.04 * apR-Square = 0.46

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ggt = 0.86 + 0.01 * apR-Square = 0.01

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

-5,00

0,00

5,00

10,00

15,00

ggt

ggt = 4.82 + -0.02 * apR-Square = 0.03

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

ggt = -0.66 + 0.05 * apR-Square = 0.04

Slika 34.: Linearna regresija enzima:GGT:AP

109

Page 123: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

0,00

10,00

20,00

ggt

ggt = 1.91 + -0.01 * ckR-Square = 0.14

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ggt = -2.73 + 0.06 * ckR-Square = 0.24

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

0,00

10,00

20,00

ggt

ggt = 1.03 + 0.02 * ckR-Square = 0.02

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ggt = -2.00 + 0.09 * ckR-Square = 0.20

Slika 35.: Linearna regresija enzima GGT:kreatinin

-5,00

0,00

5,00

10,00

ggt

ggt = -0.09 + 0.02 * astR-Square = 0.40

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ggt = 6.00 + -0.08 * astR-Square = 0.13

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

-5,00

0,00

5,00

10,00

ggt

ggt = 1.83 + 0.01 * astR-Square = 0.01

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ggt = 1.99 + 0.02 * astR-Square = 0.02

Slika 36.: Linearna regresija enzima GGT:AST

110

Page 124: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-10,00

-5,00

0,00

5,00

10,00

ggt

ggt = 1.77 + -0.05 * altR-Square = 0.11

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ggt = 4.61 + -0.17 * altR-Square = 0.04

10,0 20,0 30,0

alt

-10,00

-5,00

0,00

5,00

10,00

ggt

ggt = 1.30 + 0.09 * altR-Square = 0.02

10,0 20,0 30,0

alt

ggt = 4.35 + -0.05 * altR-Square = 0.01

Slika 37.: Linearna regresija enzima GGT:ALT

0,00

40,00

80,00

120,00

ap

ap = 74.47 + -0.05 * ckR-Square = 0.02

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ap = 129.80 + -0.45 * ckR-Square = 0.20

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

0,00

40,00

80,00

120,00

ap

ap = 153.89 + -0.81 * ckR-Square = 0.52

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ap = 91.06 + -0.29 * ckR-Square = 0.13

Slika 38.: Linearna regresija enzima AP:kreatinin

111

Page 125: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

50,00

100,00

150,00

200,00

ap

ap = 48.97 + 0.39 * astR-Square = 0.63

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ap = 36.21 + 1.15 * astR-Square = 0.47

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

50,00

100,00

150,00

200,00

ap

ap = 121.10 + -0.44 * astR-Square = 0.19

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ap = 52.04 + 0.35 * astR-Square = 0.37

Slika 39.: Linearna regresija enzima AP:AST

50,00

100,00

150,00

200,00

ap

ap = 78.36 + -0.52 * altR-Square = 0.05

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ap = 44.20 + 3.25 * altR-Square = 0.27

10,0 20,0 30,0

alt

50,00

100,00

150,00

200,00

ap

ap = 114.04 + -1.26 * altR-Square = 0.06

10,0 20,0 30,0

alt

ap = 57.68 + 0.83 * altR-Square = 0.22

Slika 40.: Linearna regresija enzima AP:ALT

112

Page 126: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-50,00

0,00

50,00

100,00

150,00

ck

ck = 97.97 + -0.06 * altR-Square = 0.00

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ck = 122.76 + -3.04 * altR-Square = 0.24

10,0 20,0 30,0

alt

-50,00

0,00

50,00

100,00

150,00

ck

ck = 63.90 + 0.64 * altR-Square = 0.02

10,0 20,0 30,0

alt

ck = 72.35 + -0.79 * altR-Square = 0.13

Slika 41.: Linearna regresija enzima Kreatinin:ALT

0,00

40,00

80,00

120,00

ck

ck = 106.76 + -0.19 * astR-Square = 0.02

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ck = 106.73 + -0.63 * astR-Square = 0.14

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

0,00

40,00

80,00

120,00

ck

ck = 60.32 + 0.22 * astR-Square = 0.06

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ck = 49.12 + 0.12 * astR-Square = 0.03

Slika 42.: Linearna regresija enzima Kreatinin:AST

113

Page 127: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

0,00

40,00

80,00

120,00

ast

ast = 69.75 + -1.11 * altR-Square = 0.06

0 mg/kg prometrina, oba spola 185 mg/kg prometrina, oba spola

375 mg/kg prometrina, oba spola 555 mg/kg prometrina, oba spola

ast = 32.98 + 1.23 * altR-Square = 0.11

10,0 20,0 30,0

alt

0,00

40,00

80,00

120,00

ast

ast = 55.82 + 0.36 * altR-Square = 0.00

10,0 20,0 30,0

alt

ast = 24.20 + 1.97 * altR-Square = 0.41

Slika 43.: Linearna regresija enzim AST:ALT

114

Page 128: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-1000,00

0,00

1000,00

ldh

ldh = 372.27 + -44.88 * ggtR-Square = 0.05

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ldh = 362.05 + -8.31 * ggtR-Square = 0.00

ldh = 524.78 + 23.09 * ggtR-Square = 0.32 ldh = 403.41 + 7.30 * ggt

R-Square = 0.00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

ggt-1000,00

0,00

1000,00

ldh

ldh = 785.27 + -74.46 * ggtR-Square = 0.64

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

ggt

ldh = 435.50 + 25.63 * ggtR-Square = 0.18

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

ggt

ldh = 703.74 + -72.42 * ggtR-Square = 0.69

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

ggt

ldh = 351.43 + -16.45 * ggtR-Square = 0.29

Slika 44.: Linearna regresija enzim LDH:GGT, promatranih s obzirom na spol

115

Page 129: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-1000,00

0,00

1000,00

2000,00

ldh

ldh = -55.41 + 6.31 * apR-Square = 0.18

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ldh = 175.70 + 2.34 * apR-Square = 0.04

ldh = 357.97 + 2.71 * apR-Square = 0.06 ldh = 81.70 + 2.97 * ap

R-Square = 0.07

60,00 80,00 100,00 120,00

ap-1000,00

0,00

1000,00

2000,00

ldh

ldh = 86.64 + 6.09 * apR-Square = 0.10

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

ldh = -96.10 + 5.40 * apR-Square = 0.03

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

ldh = 1670.10 + -14.62 * apR-Square = 0.34

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

ldh = 239.95 + 0.71 * apR-Square = 0.01

Slika 45.: Linearna regresija enzim LDH:AP, promatranih s obzirom na spol

116

Page 130: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-500,00

0,00

500,00

1000,00

ldh

ldh = 149.93 + 1.88 * ckR-Square = 0.23

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ldh = 447.81 + -1.05 * ckR-Square = 0.06

ldh = -242.81 + 10.01 * ckR-Square = 0.86

ldh = 429.93 + -0.27 * ckR-Square = 0.00

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

-500,00

0,00

500,00

1000,00

ldh

ldh = 176.45 + 4.52 * ckR-Square = 0.08

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ldh = 305.40 + 3.10 * ckR-Square = 0.03

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ldh = -2693.94 + 64.35 * ckR-Square = 0.58

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ldh = 398.10 + -1.72 * ckR-Square = 0.13

Slika 46.: Linearna regresija enzim LDH:kreatinin, promatranih s obzirom na spol

117

Page 131: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-1000,00

0,00

1000,00

2000,00

ldh

ldh = -87.93 + 11.77 * astR-Square = 0.64

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ldh = 448.49 + -1.69 * astR-Square = 0.09

ldh = 438.30 + 3.23 * astR-Square = 0.01 ldh = 317.36 + 1.55 * ast

R-Square = 0.02

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

-1000,00

0,00

1000,00

2000,00

ldh

ldh = 369.53 + 2.75 * astR-Square = 0.08

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ldh = -294.25 + 15.36 * astR-Square = 0.98

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ldh = 274.51 + 3.09 * astR-Square = 0.06

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ldh = 509.72 + -3.95 * astR-Square = 0.51

Slika 47.: Linearna regresija enzim LDH:AST, promatranih s obzirom na spol

118

Page 132: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-1000,00

0,00

1000,00

2000,00

3000,00

ldh

ldh = 582.88 + -13.67 * altR-Square = 0.46

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ldh = 347.36 + 0.26 * altR-Square = 0.00

ldh = -142.48 + 49.98 * altR-Square = 0.37 ldh = 528.17 + -6.40 * alt

R-Square = 0.05

10,0 20,0 30,0

alt

-1000,00

0,00

1000,00

2000,00

3000,00

ldh

ldh = 924.83 + -21.81 * altR-Square = 0.07

10,0 20,0 30,0

alt

ldh = 429.54 + 4.56 * altR-Square = 0.01

10,0 20,0 30,0

alt

ldh = 430.42 + 2.86 * altR-Square = 0.01

10,0 20,0 30,0

alt

ldh = 168.83 + 6.85 * altR-Square = 0.07

Slika 48.: Linearna regresija enzim LDH:ALT, promatranih s obzirom na spol

119

Page 133: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-50,00

-25,00

0,00

25,00

ggt

ggt = 0.62 + 0.00 * astR-Square = 0.00

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ggt = -0.09 + 0.02 * astR-Square = 0.27

ggt = 13.02 + -0.24 * astR-Square = 0.13 ggt = 2.99 + -0.03 * ast

R-Square = 0.09

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

-50,00

-25,00

0,00

25,00

ggt

ggt = 5.43 + -0.03 * astR-Square = 0.11

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ggt = -5.01 + 0.14 * astR-Square = 0.30

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ggt = 2.84 + 0.00 * astR-Square = 0.00

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ggt = -2.77 + 0.12 * astR-Square = 0.42

Slika 49.: Linearna regresija enzim GGT:AST, promatranih s obzirom na spol

120

Page 134: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-50,00

-25,00

0,00

25,00

ggt

ggt = 0.04 + 0.01 * apR-Square = 0.02

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ggt = -4.11 + 0.07 * apR-Square = 0.73

ggt = -15.09 + 0.21 * apR-Square = 0.64

ggt = 5.97 + -0.04 * apR-Square = 0.21

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

-50,00

-25,00

0,00

25,00

ggt

ggt = 5.78 + -0.04 * apR-Square = 0.03

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

ggt = 13.62 + -0.10 * apR-Square = 0.04

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

ggt = -15.82 + 0.23 * apR-Square = 0.64

60,00 80,00 100,00 120,00

ap

ggt = 12.74 + -0.13 * apR-Square = 0.17

Slika 51.: Linearna regresija enzim GGT:AP, promatranih s obzirom na spol

121

Page 135: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-150,00

-100,00

-50,00

0,00

ggt

ggt = 0.57 + 0.00 * ckR-Square = 0.00

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ggt = 2.94 + -0.02 * ckR-Square = 0.41 ggt = -11.02 + 0.16 * ck

R-Square = 0.39

ggt = 0.12 + 0.02 * ckR-Square = 0.26

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

-150,00

-100,00

-50,00

0,00

ggt

ggt = 7.62 + -0.05 * ckR-Square = 0.10

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ggt = -6.55 + 0.14 * ckR-Square = 0.23

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ggt = 47.68 + -0.90 * ckR-Square = 0.86

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ggt = -5.31 + 0.14 * ckR-Square = 0.84

Slika 51.: Linearna regresija enzim GGT:Kreatinin, promatranih s obzirom na spol

122

Page 136: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-50,00

-25,00

0,00

25,00

ggt

ggt = 0.99 + -0.02 * altR-Square = 0.04

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ggt = 3.01 + -0.10 * altR-Square = 0.41

ggt = 8.25 + -0.40 * altR-Square = 0.04 ggt = -0.15 + 0.08 * alt

R-Square = 0.11

10,0 20,0 30,0

alt

-50,00

-25,00

0,00

25,00

ggt

ggt = -2.35 + 0.32 * altR-Square = 0.14

10,0 20,0 30,0

alt

ggt = 2.39 + 0.00 * altR-Square = 0.00

10,0 20,0 30,0

alt

ggt = 2.25 + 0.03 * altR-Square = 0.00

10,0 20,0 30,0

alt

ggt = 9.72 + -0.34 * altR-Square = 0.17

Slika 52.: Linearna regresija enzim GGT:ALT, promatranih s obzirom na spol

123

Page 137: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-300,00

-200,00

-100,00

0,00

100,00

200,00

ap

ap = 46.51 + 0.16 * ckR-Square = 0.38

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ap = 92.11 + -0.18 * ckR-Square = 0.27

ap = 53.14 + 0.36 * ckR-Square = 0.13

ap = 118.99 + -0.12 * ckR-Square = 0.09

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

-300,00

-200,00

-100,00

0,00

100,00

200,00

ap

ap = 84.36 + -0.07 * ckR-Square = 0.01

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ap = 106.25 + 0.06 * ckR-Square = 0.01

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ap = 169.02 + -1.79 * ckR-Square = 0.28

40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

ck

ap = 70.80 + -0.04 * ckR-Square = 0.01

Slika 53.: Linearna regresija enzim AP:kreatinin, promatranih s obzirom na spol

124

Page 138: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-100,00

0,00

100,00

200,00

ap

ap = 52.62 + 0.29 * astR-Square = 0.09

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ap = 51.03 + 0.37 * astR-Square = 0.45

ap = 75.30 + 0.17 * astR-Square = 0.00

ap = 128.20 + -0.27 * astR-Square = 0.08

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

-100,00

0,00

100,00

200,00

ap

ap = 68.22 + 0.15 * astR-Square = 0.09

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ap = 106.30 + 0.07 * astR-Square = 0.02

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ap = 58.70 + 0.30 * astR-Square = 0.35

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ap = 56.44 + 0.22 * astR-Square = 0.14

Slika 54: Linearna regresija enzim AP:AST, promatranih s obzirom na spol

125

Page 139: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-100,00

0,00

100,00

200,00

ap

ap = 67.98 + -0.27 * altR-Square = 0.04

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ap = 92.63 + -0.99 * altR-Square = 0.26

ap = 115.19 + -2.24 * altR-Square = 0.09

ap = 107.69 + 0.21 * altR-Square = 0.01

10,0 20,0 30,0

alt

-100,00

0,00

100,00

200,00

ap

ap = 73.78 + 0.30 * altR-Square = 0.01

10,0 20,0 30,0

alt

ap = 112.80 + -0.19 * altR-Square = 0.03

10,0 20,0 30,0

alt

ap = 59.38 + 0.92 * altR-Square = 0.42

10,0 20,0 30,0

alt

ap = 98.55 + -1.72 * altR-Square = 0.43

Slika 55.: Linearna regresija enzim AP:ALT, promatranih s obzirom na spol

126

Page 140: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-100,00

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

ck

ck = 79.47 + 0.63 * astR-Square = 0.03

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ck = 72.24 + 0.28 * astR-Square = 0.03

ck = 68.44 + 0.31 * astR-Square = 0.02

ck = 35.42 + 0.47 * astR-Square = 0.03

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

-100,00

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

ck

ck = 116.15 + -0.42 * astR-Square = 0.49

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ck = 50.72 + 0.22 * astR-Square = 0.06

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ck = 46.02 + 0.05 * astR-Square = 0.11

25,00 50,00 75,00 100,00

ast

ck = 14.49 + 0.88 * astR-Square = 0.57

Slika 56.: Linearna regresija enzim kreatinin:AST, promatranih s obzirom na spol

127

Page 141: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-200,00

-100,00

0,00

100,00

200,00

300,00

ck

ck = 127.84 + -1.44 * altR-Square = 0.08

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ck = 45.48 + 2.61 * altR-Square = 0.23

ck = 42.12 + 2.78 * altR-Square = 0.13

ck = 115.25 + -2.84 * altR-Square = 0.18

10,0 20,0 30,0

alt

-200,00

-100,00

0,00

100,00

200,00

300,00

ck

ck = 50.17 + 2.18 * altR-Square = 0.18

10,0 20,0 30,0

alt

ck = 76.49 + -0.98 * altR-Square = 0.21

10,0 20,0 30,0

alt

ck = 46.73 + 0.12 * altR-Square = 0.09

10,0 20,0 30,0

alt

ck = 128.07 + -3.69 * altR-Square = 0.49

Slika 57.: Linearna regresija enzim kreatinin:ALT, promatranih s obzirom na spol

128

Page 142: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

-100,00

0,00

100,00

ast

ast = 59.10 + -1.28 * altR-Square = 0.88

kontrola muski kontrola zenski 185 mg/kg muski 185 mg/kg zenski

375 mg/kg muski 375 mg/kg zenski 555 mg/kg muski 555 mg/kg zenski

ast = 79.56 + -0.76 * altR-Square = 0.05

ast = 24.99 + 1.35 * altR-Square = 0.20

ast = 103.50 + -2.33 * altR-Square = 0.81

10,0 20,0 30,0

alt

-100,00

0,00

100,00

ast

ast = 117.19 + -2.78 * altR-Square = 0.11

10,0 20,0 30,0

alt

ast = 47.79 + 0.25 * altR-Square = 0.01

10,0 20,0 30,0

alt

ast = 9.98 + 2.71 * altR-Square = 0.96

10,0 20,0 30,0

alt

ast = 124.46 + -3.92 * altR-Square = 0.74

Slika 58: Linearna regresija enzim AST:ALT, promatranih s obzirom na

129

Page 143: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

4.4. Rezultati komet-tehnike 4.4.1. Nakon 14. dana izloženosti prometrinu

U tablicama 24.-28. i grafikonima (slike 59.-68.) prikazani su rezultati analize komet-

tehnike leukocita periferne krvi miševa kontrolnih i pokusnih skupina nakon 14 dana

tretiranja prometrinom. Statistički značajne razlike između skupina i podskupina prikazani

su tablično uz pripadajuću deskriptivnu statistiku.

Slike 59-68 prikazane su uobičajenom standardnom metodom prikaza rezultata komet testa.

unutar grupe podaci su raspoređeni u slici unutar percentila od 25 %, sa prikazom medijana

i whiskers-ima koji obuhvaćaju minimum i maksimum mjerenih vrijednosti u populaciji

stanica (Singh i sur. 1988, Olive 1999, Rojas i sur. 1999, Singh 2000, Alnemri i Litwac

1989,Chandra i sur. 2000, Wang i sur. 1999, Wyllie 1993).

Postotak DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi prikazan je tablicom 24. i

slikama 59. i 60. Uočava se statistički značajna razlika opadanja proporcionalno porastu

doze između ženki kontrolne i mužjaka kontrolne skupine i ženki skupine koja je tretirana s

555 mg/kg prometrina. Promatra li se ukupan broj mužjaka i ženki objedinjenih u skupinu s

pripadajučom dozom, sve tretirane skupine pokazuju statistički značajno opadanje s

porastom doze u odnosu na kontrolnu skupinu (slika 60.). Sve navedene razlike na razini

su značajnosti od p ≤ 0.01. Između spolova u svih skupina nisu uočene razlike.

Tablica 25. i slike 61. i 62. prikazuju postotak DNA u repu kometa. Između mužjaka i

ženki svih skupina kao i između doza raspoređenih po spolu nisu uočene statistički značajne

razlike. Porast postotka DNA u repu (p ≤ 0.01) postoje između kontrolne skupine

objedinjenih spolova i skupina koje su primile 185 i 555 mg/kg prometrina.

Repni moment odnosno OTM tretiranih skupina prikazan je tablicom 26. i slikama 63. i

64. Postoje statistički značajne razlike porasta OTM koeficijenta (p ≤ 0.01) između

kontrolne skupine objedinjenih spolova i svih ostalih tretiranih skupina. Između spolova

unutar svih skupina ne postoje značajne razlike. Nadalje, značajni se porast uočava između

skupina mužjaka kontrolne skupine tretiranih skupina mužjaka (p ≤ 0.05) i ženki kontrolne

skupine i ženki koje su primile najveću dozu (p ≤ 0.01).

Dužina repa prikazana tablicom 27. i slikama 65. i 66. statistički značajno raste (p ≤

0.01) u ženki skupine koja je primala najveću dozu u odnosu na ženke kontrole, a između

ostalih skupina nema statistički značajnijih razlika.

130

Page 144: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

U optičkom intenzitetu repa (tablica 28. i slike 67. i 68.) postoji statistički značajna

razlika porasta intenziteta između ženki kontrolne skupine i skupina A i B i ženki skupine

koja je tretirana s 555 mg/kg prometrina. Promatra li se ukupano mužjake i ženke

objedinjene u skupinu s pripadajučom dozom, sve tretirane skupine pokazuju statistički

značajan porast intenziteta fluorescencije u odnosu na kontrolnu skupinu. Sve navedene

razlike na razini su značajnosti od p ≤ 0.01. Između spolova u svih skupina nisu uočene

razlike.

131

Page 145: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 24. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u postotku DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina

% DNA u glavi kometa 14. dan Značajne razlike Doza

Spol

Srednja

vrijednost St.

devijacija Median Minimum Maksimum unutar skupine

između skupina

m 96,52 7,86 96,81 35,36 100,00 NS C ž 96,68 7,13 96,20 64,93 100,00 NS C K

0 mg/kg m + ž 96,60 7,44 96,51 35,36 100,00 A,B,C

m 92,07 8,62 94,06 54,46 100,00 NS ž 91,26 9,73 94,59 48,23 100,00 NS A

185 mg/kg m + ž 91,54 9,35 94,42 48,23 100,00 K

m 94,28 9,85 98,74 39,84 100,00 NS ž 92,45 8,17 95,57 56,29 100,00 NS B

375 mg/kg m + ž 93,29 9,01 96,65 39,84 100,00 K,

m 91,22 11,37 94,67 37,61 100,00 NS ž 90,64 11,25 94,47 21,57 100,00 NS K, C

555 mg/kg m + ž 90,84 11,28 94,59 21,57 100,00 K,

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

MaxMinMedian; 75%25%

Postotak DNA u glavi kometa 14. dan pokusa

Doza

% D

NA

10

30

50

70

90

110

0 mg/kg 185 mg/k 3755 mg/ 555 mg/k

ABC

K

K K

Slika 59. Postotak DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

132

Page 146: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

MaxMinMedian; 75%25%

Postotak DNA u glavi kometa 14. dan pokusa

DOZA

% D

NA

10

30

50

70

90

110

0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m

A,B,C

K

K K

K

A,B,C

K

K,

Slika 60. Postotak DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

Tablica 25. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u postotku DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganja pripadajućim dozama prometrina

% DNA u repu kometa Značajne razlike Doza

Spol

Srednja

vrijednost St.

devijacija Median Minimum Maksimum unutar skupine

između skupina

m 5,99 7,86 3,19 0,00 64,64 NS C ž 6,25 7,13 3,80 0,00 35,07 NS C K

0 mg/kg m + ž 6,14 7,44 3,50 0,00 64,64 A,C

m 7,93 8,62 5,94 0,00 45,54 NS ž 8,74 9,73 5,41 0,00 51,77 NS A

185 mg/kg m + ž 8,46 9,35 5,58 0,00 51,77 K

m 5,72 9,85 1,26 0,00 60,16 NS ž 7,55 8,17 4,43 0,00 43,71 NS B

375 mg/kg m + ž 6,71 9,01 3,36 0,00 60,16 C

m 8,78 11,37 5,33 0,00 62,39 NS K ž 9,36 11,25 5,53 0,00 78,43 NS K C

555 mg/kg m + ž 9,16 11,28 5,41 0,00 78,43 K,B

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

133

Page 147: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

MaxMinMedian; 75%25%

Postotak DNA u repu kometa 14. dan

Doza

% D

NA

-10

10

30

50

70

90

0 mg/kg 185 mg/k 3755 mg/ 555 mg/k

A,C

K

C

KB

Slika 61. Postotak DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

MaxMinMedian; 75%25%

Postotak DNA u repu kometa 14. dan pokusa

Doza

% D

NA

-10

10

30

50

70

90

0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m

C

C

K

K

Slika 62. Postotak DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

134

Page 148: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 26. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u repnom momentu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 14. dana pripadajućim dozama prometrina

repni moment kometa (OTM-Olive tail moment) Značajne razlike Doza

Spol

Srednja

vrijednost St.

devijacija Median Minimum Maksimum unutar skupine

između skupina

m 1,84 3,24 1,01 0,00 34,59 NS a ž 3,09 4,76 1,86 0,00 48,04 NS C K

0 mg/kg m + ž 2,56 4,22 1,34 0,00 48,04 A,B,C

m 3,46 4,23 2,42 0,00 22,62 NS k ž 5,12 7,16 2,58 0,00 49,25 NS A

185 mg/kg m + ž 4,54 6,34 2,51 0,00 49,25 K,C

m 3,56 5,64 1,15 0,00 36,84 NS k ž 3,55 4,08 2,29 0,00 24,98 NS B

375 mg/kg m + ž 3,55 4,85 2,03 0,00 36,84 K,C

m 9,45 18,44 3,98 0,00 173,83 NS b ž 6,82 13,52 3,10 0,00 155,30 NS K C

555 mg/kg m + ž 7,72 15,42 3,24 0,00 173,83 K,A,B

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

MaxMinMedian; 75%25%

Koeficijent repnog momenta OTM (Olive tail moment) 14. dana pokusa

Doza

OTM

-20

20

60

100

140

180

0 mg/kg 185 mg/k 3755 mg/ 555 mg/k

ABCKC KC

KAB

Slika 63. Repni moment (OTM) leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

135

Page 149: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

MaxMinMedian; 75%25%

Repni moment OTM (Olive tail moment) 14. dana pokusa

Doza

OTM

-20

20

60

100

140

180

0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m

C

a

k,C k,C

K b

Slika 64. Repni moment (OTM) kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

Tablica 27. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike dužini repa (μm) kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 14. dana pripadajućim dozama prometrina

dužina repa kometa (μm) Značajne razlike Doza

Spol

Srednja

vrijednost St.

devijacija Median Minimum Maksimum unutar skupine

između skupina

m 17,95 24,75 9,00 0,00 230,00 NS C ž 30,88 37,74 19,00 0,00 239,00 NS C K

0 mg/kg m + ž 25,35 33,40 14,00 0,00 239,00 C

m 42,20 53,03 18,50 0,00 234,00 NS C ž 40,10 50,34 26,00 0,00 251,00 NS C A

185 mg/kg m + ž 41,46 51,23 22,00 0,00 251,00 C

m 23,77 29,37 16,00 0,00 144,00 NS C ž 35,69 29,16 30,00 0,00 205,00 NS C B

375 mg/kg m + ž 30,24 29,81 25,00 0,00 205,00 C

m 61,73 81,75 32,00 0,00 585,00 NS K,A,B ž 58,37 70,26 30,00 0,00 428,00 NS K,A,B C

555 mg/kg m + ž 59,52 74,34 31,00 0,00 585,00 K,A,B

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

136

Page 150: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

MaxMinMedian; 75%25%

Duzina repa kometa 14. dan pokusa

Doza

duzi

na re

pa/m

ikro

met

ri

-50

50

150

250

350

450

550

650

0 mg/kg 185 mg/k 3755 mg/ 555 mg/k

C C C

KAB

Slika 65. Dužina repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

MaxMinMedian; 75%25%

Duzina repa kometa 14. dan pokusa

Doza

duži

na re

pa k

omet

a/m

ikro

met

ri

-50

50

150

250

350

450

550

650

0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m

K,A,B

C

K,A,B

C C C C C

Slika 66. Dužina repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

137

Page 151: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 28. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u intenzitetu fluorescencije repa kometa (lux) leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 14. dana pripadajućim dozama prometrina

intenzitet fluorescencije repa kometa (lux)

Značajne razlike Doza Spol

Srednja vrijednost

St. devijacija

Median Minimum Maksimum

unutar skupine

između skupina

m 14208,78 22097,22 5327,42 0,00 136206,99 NS C ž 30607,65 39206,77 18161,84 0,00 226600,47 NS C

K 0 mg/kg

m + ž 23597,14 33947,13 9330,90 0,00 226600,47 A,B,C m 44334,99 48436,45 30382,03 0,00 208873,44 NS C ž 47817,99 58113,77 26931,20 0,00 343152,04 NS C

A 185 mg/kg

m + ž 46600,01 54873,25 27078,24 0,00 343152,04 K,C m 68986,72 109224,10 21109,40 0,00 687671,57 NS C ž 40990,72 44219,38 24770,40 0,00 194434,22 NS

B 375 mg/kg

m + ž 53807,07 81809,66 24205,69 0,00 687671,57 K,C m 161647,44

23637,48

74669,2

0 1449695,0 NS K,A

ž 60799,118

89916,25

34439,115

0

816044,73 NS K,A

C 555 mg/kg

m + ž 95601,68

163713,86

40461,92

0,00

1449695,0 K,A,B

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

MaxMinMedian; 75%25%

Opticki intenzitet repa 14. dan

Doza

inte

nzite

t flu

ores

cenc

ije (l

ux)

-2e5

0

2e5

4e5

6e5

8e5

1e6

1,2e6

1,4e6

1,6e6

0 mg/kg 185 mg/k 3755 mg/ 555 mg/k

ABC KC

KC

KC

Slika 67. Optički intenzitet repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

138

Page 152: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

MaxMinMedian; 75%25%

Opticki intenzitet repa 14 dan pokusa

Doza

inte

nzite

t flu

ores

cenc

ije (l

ux)

-2e5

0

2e5

4e5

6e5

8e5

1e6

1,2e6

1,4e6

1,6e6

0 mg/kg z 185 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m

C

K,A

C

K,A

C C C

Slika 68. Optički intenzitet repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 14. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

139

Page 153: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

4.4.2. Rezultati komet-testa nakon 28. dana izloženosti prometrinu

U tablicama 29.-33. i grafikonima (slike 69.-78.) prikazani su rezultati analize komet-

tehnike leukocita periferne krvi miševa pokusnih skupina nakon 28. dana tretiranja

prometrinom. Statistički značajne razlike između skupina i podskupina prikazani su tablično

uz pripadajuću deskriptivnu statistiku.

Postotak DNA u glavi kometa prikazan je tablicom 29. i slikama 69. i 70. uočava se,

slično kao i u krvi analiziranoj 14. tog dana pokusa da sve tretirane skupine (objedinjene po

skupinama) pokazuju statistički značajnu razliku smanjenja postotka DNA glave u odnosu

na kontrolnu skupinu. Statistički značajna razlika koja se očituje smanjenjenjem % DNA

između mužjaka kontrolne skupine i mužjaka skupine koja je tretirana s 185 mg/kg

prometrina. Sve navedene razlike na razini su značajnosti od p ≤ 0.01. Između spolova u

svih skupina nisu uočene razlike.

Tablica 30. i slike 71. i 72. prikazuju postotak DNA u repu kometa. Između mužjaka i

ženki svih skupina kao i između doza raspoređenih po spolu uočene su statistički značajne

razlike koje se očituju povećanjem DNA u repu kometa ovisno o dozi (p ≤ 0.01). Između

spolova svih skupina ne postoje značajne razlike.

OTM odnosno repni moment tretiranih skupina prikazan je tablicom 31. i slikama 73. i

74. Postoje statistički značajne razlike (p ≤ 0.05) između mužjaka kontrolne skupine i

tretirane skupine 185 mg/kg, koji se očituje povećanjem koeficijenta OTM u otrovanih

životinja. Između spolova svih skupina ne postoje značajne razlike. Nadalje, značajne se

razlike koje se očituju povećanjem koeficijenta OTM u otrovanih životinja, uočavaju se

između skupina mužjaka kontrolne skupine i one koja je primila 185 mg/kg (p ≤ 0.01).

Prema dozi združene skupine mužjaka i ženki kontrolne skupine i ostalih skupina pokazuju

statistički značajne razlike povećanja koeficijenta na razini značajnosti p ≤ 0.01.

Dužina repa prikazana tablicom 32. i slikom 75. i 76. statistički se značajno razlikuje (p ≤

0.01) između kontrolne skupine i svih tretiranih skupina kod kojih se dužina repa povećava,

te između ženki kontrole i ženki skupine 185 mg/kg dok se kod mužjaka značajno razlikuju

kontrolna skupina i skupina koja je primala 185 mg/kg i najveću dozu 555 mg/kg, što se

također oćituje povećanjem dužine repa u otrovanih životinja. Između ostalih skupina nema

statistički značajnijih razlika.

140

Page 154: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

U optičkom intenzitetu repa (tablica 33. i slike 77. i 78.) postoji statistički značajna

razlika (p ≤ 0.01) između svih tretiranih skupina i kontrole, bilo združenih ili odvojeno

promatranih s obzirom na spol, koja se očituje kao povećanje intenziteta fluorescencije u

otrovanih životinja.

141

Page 155: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 29. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u postotku DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 28. dana pripadajućim dozama prometrina

% DNA u glavi kometa

Značajne razlike Doza Spol

Srednja vrijednost

St. devijacija

Median Minimum Maksimum

unutar skupine

između skupina

m 94,38 6,72 96,69 72,17 100,00 NS A ž 93,51 8,02 97,12 52,34 100,00 NS

K 0 mg/kg

m + ž 93,84 7,57 96,92 52,34 100,00 A,B,c m 85,91 15,02 90,42 23,39 100,00 NS K,B,c ž 89,81 11,82 93,44 36,50 100,00 NS

A 185 mg/kg

m + ž 87,72 13,75 92,31 23,39 100,00 K,C m 92,02 8,45 95,11 59,88 100,00 NS A ž 89,59 14,11 93,52 1,67 100,00 NS

B 375 mg/kg

m + ž 90,74 11,84 94,25 1,67 100,00 K m 91,22 8,77 93,97 55,05 100,00 NS a ž 92,67 8,86 95,50 50,38 100,00 NS

C 555 mg/kg

m + ž 91,80 8,83 94,78 50,38 100,00 k,A

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

MaxMinMedian; 75%25%

Postotak DNA u glavi kometa 28. dan pokusa

Doza

% D

NA

-10

10

30

50

70

90

110

0 mg/kg 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

ABc KC K kA

Slika 69. Postotak DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 28. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

142

Page 156: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

MaxMinMedian; 75%25%

Postotak DNA u glavi kometa 28. dan pokusa

Doza

%D

NA

-10

10

30

50

70

90

110

0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m

A

K,B,c

Aa

Slika 70. Postotak DNA u glavi kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

Tablica 30. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u postotku DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 28. dana pripadajućim dozama prometrina

% DNA u repu kometa

Značajne razlike Doza Spol

Srednja vrijednost

St. devijacija

Median Minimum Maksimum

unutar skupine

između skupina

m 5,62 6,72 3,31 0,00 27,83 NS A,B,C ž 6,49 8,02 2,88 0,00 47,66 NS

K 0 mg/kg

m + ž 6,16 7,57 3,08 0,00 47,66 A,B,C m 14,09 15,02 9,58 0,00 76,61 NS K,B ž 10,19 11,82 6,56 0,00 63,50 NS

A 185 mg/kg

m + ž 12,28 13,75 7,69 0,00 76,61 K,b m 7,98 8,45 4,89 0,00 40,12 NS K,A ž 10,41 14,11 6,48 0,00 98,33 NS

B 375 mg/kg

m + ž 9,26 11,84 5,75 0,00 98,33 K,a,C m 8,78 8,77 6,04 0,00 44,95 NS K ž 7,33 8,86 4,50 0,00 49,62 NS

C 555 mg/kg

m + ž 8,20 8,83 5,23 0,00 49,62 K,A,b

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

143

Page 157: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

MaxMinMedian; 75%25%

Postotak DNA u repu kometa 28. dan pokusa

Doza

% D

NA

-10

10

30

50

70

90

110

0 mg/kg 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

ABC Kb KaC KAb

Slika 71. Postotak DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 28. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

MaxMinMedian; 75%25%

Postotak DNA u repu kometa 28. dan

Doza

% D

NA

-10

10

30

50

70

90

110

0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185vm 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m

ABC

KB

KAK

Slika 72. % DNA u repu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

144

Page 158: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 31. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u repnom momentu kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 28. dana pripadajućim dozama prometrina.

repni moment kometa (OTM-Olive tail moment)

Značajne razlike Doza Spol

Srednja vrijednost

St. devijacija

Median Minimum Maksimum

unutar skupine

između skupina

m 3,35 5,04 1,79 0,00 33,15 NS A ž 3,05 6,36 1,49 0,00 79,81 NS b

K 0 mg/kg

m + ž 3,15 5,91 1,56 0,00 79,81 A,B,C m 10,49 17,21 4,71 0,00 131,64 NS K,B,C ž 7,10 13,05 3,16 0,00 88,69 NS

A 185 mg/kg

m + ž 8,92 15,50 3,90 0,00 131,64 K,b,c m 4,73 6,38 2,60 0,00 46,92 NS A ž 8,23 16,85 3,81 0,00 159,73 NS k

B 375 mg/kg

m + ž 6,58 13,12 3,05 0,00 159,73 K,A m 5,31 6,23 3,65 0,00 50,76 NS A ž 4,60 7,46 2,46 0,00 60,49 NS

C 555 mg/kg

m + ž 5,03 6,75 3,04 0,00 60,49 K,A

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

MaxMinMedian; 75%25%

Koeficijent repnog momenta OTM (Olive tail moment)28. dana pokusa

Doza

OTM

-20

20

60

100

140

180

0 mg/kg 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

ABC KbC KA KA

Slika 73. Repni moment kometa (OTM) leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

145

Page 159: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

MaxMinMedian; 75%25%

Koeficijent repnog momenta OTM 28. dan pokusa

Doza

OTM

-20

20

60

100

140

180

0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m

b

A

KBCk

AA

Slika 74. Repni moment (OTM) kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

Tablica 32. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike dužini repa (μm) kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 28. dana pripadajućim dozama prometrina

dužina repa kometa (μm)

Značajne razlike Doza Spol

Srednja vrijednost

St. devijacija

Median Minimum Maksimum

unutar skupine

između skupina

m 41,81 61,97 18,50 0,00 303,00 NS A,C ž 23,41 29,85 15,50 0,00 192,00 NS A,B

K 0 mg/kg

m + ž 29,96 44,81 17,00 0,00 303,00 A,B,C m 53,89 59,29 35,50 0,00 270,00 NS K ž 48,72 67,70 27,00 0,00 361,00 NS K

A 185 mg/kg

m + ž 51,49 63,32 30,00 0,00 361,00 K m 45,20 52,23 20,00 0,00 244,00 NS ž 54,77 69,00 28,00 0,00 424,00 NS K

B 375 mg/kg

m + ž 50,26 61,79 24,00 0,00 424,00 K m 49,07 48,39 35,00 0,00 244,00 NS K ž 48,33 51,47 31,00 0,00 282,00 NS K

C 555 mg/kg

m + ž 48,77 49,58 33,50 0,00 282,00 K

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i * za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

146

Page 160: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

MaxMinMedian; 75%25%

Duzina repa kometa 28 dan pokusa

Doza

Duz

ina

repa

/mik

rom

etri

-50

50

150

250

350

450

550

0 mg/kg 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

ABC

KK K

Slika 75. Dužina repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa nakon 28. dana izlaganih pripadajućim dozama prometrina. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

MaxMinMedian; 75%25%

Dužina repa kometa 28. dan pokusa

Doza

duzi

na re

pa/m

ikro

met

ri

-50

50

150

250

350

450

550

0 mg/kg z 0 mg/kg m 185 mg/kg z 185 mg/kg m 375 mg/kg z 375 mg/kg m 555 mg/kg z 555 mg/kg m

AB

ACK K

K

K K

Slika 76. Dužina repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

147

Page 161: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Tablica 33. Srednje vrijednosti i statistički značajne razlike u intenzitetu fluorescencije repa kometa (lux) leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih 28. dana pripadajućim dozama prometrina

intenzitet fluorescencije repa kometa (lux)

Značajne razlike Doza Spol

Srednja vrijednost

St. devijacija

Median Minimum Maksimum

unutar skupine

između skupina

m 32757,73 41575,58 18415,04 0,00 174137,37 NS A,B,C ž 32115,32 45422,71 14105,82 0,00 383823,91 NS A,B,C

K 0 mg/kg

m + ž 32252,83 43973,26 15796,36 0,00 383823,91 A,B,C m 98682,62 154739,45 49739,69 0,00 1522693,3 NS K ž 85230,36 120615,59 47218,18 0,00 865738,66 NS K

A 185 mg/kg

m + ž 92436,93 139961,74 49269,81 0,00 1522693,3 K m 75757,54 91552,95 41115,75 0,00 566409,20 NS K ž 81581,48 118417,98 47556,13 0,00 880082,10 NS K

B 375 mg/kg

m + ž 78838,51 106535,63 44380,61 0,00 880082,10 K m 75081,12 81941,80 47833,48 0,00 606556,38 NS K ž 72909,12 104889,01 43935,74 0,00 763580,68 NS K

C 555 mg/kg

m + ž 74209,99 91707,11 45556,42 0,00 763580,68 K

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

MaxMinMedian; 75%25%

Opticki intenzitet repa 28. dan pokusa

Doza

Opt

icki

inte

nzite

t rep

a (lu

x)

-2e5

2e5

6e5

1e6

1,4e6

1,8e6

0 mg/kg 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

ABC

KK K

Slika 77. Optički intenzitet repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

148

Page 162: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

MaxMinMedian; 75%25%

Opticki intenzitet repa 28 dan pokusa

Doza

Inte

nzite

t flu

ores

cenc

ije (l

ux)

-2e5

2e5

6e5

1e6

1,4e6

1,8e6

0 mg/ kg z 0 mg/ kg m 185 mg/ kg z 185 mg/ kg m 375 mg/ kg z 375 mg/ kg m 555 mg/ kg z 555m

ABC ABC

K

K

K K K K

Slika 78. Optički intenzitet repa kometa leukocita periferne krvi kontrolnih miševa i miševa izlaganih pripadajućim dozama prometrina tijekom 28. dana raspoređenih s obzirom na spol. Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

149

Page 163: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

150

4.5. UČINAK PROMETRINA NA BROJ ERITROCITA I LEUKOCITA U PERIFERNOJ KRVI Tablica 34. prikazuje promjene i statistički značajne razlike u broju eritrocita u perifernoj

krvi između kontrolnih i pokusnih skupina miševa 14. i 28. dan pokusa.

Vrijednosti su izražene kao broj stanica x 1012 /L krvi. U mužjaka skupine K broj

eritrocita je 9,58 ± 1,37 x 1012 /L četrnaestog dana pokusa. Dvadesetosmog dana slijedi

porast broja eritrocita (10,11 ± 1,15 x 1012 /L). U ženki kontrolne skupine broj eritrocita

od četrnaestog dana (8,62 ± 1,02 x 1012 /L) blago raste do dvadesetosmog (10,20 ± 1,69

x 1012 /L) dana. Zbirno promatrajaći prosječne vrjednosti broja eritrocita muških i ženskih

jedinki u kontrolnoj skupini možemo govoriti o početnom blagom opadanju broja

eritrocita od početka do sredine pokusa te oporavku ka početnoj vrijednosti koja se

dosegne do kraja pokusa. U odnosu na kontrolnu skupinu, i skupina A i skupina B

(zbirno gledano mužjake i ženke) pokazuje blagi, ali statistički značajan pad broja

eritrocita. Promjene broja eritrocita u skupine A i B od 14.do 28. dana blaže su nego u

kontrolne skupine životinja. Skupina C pokazuje sličnu dinamiku promjena kao i

kontrolna skupina i 14. dana pokusa zamjećuje se vrlo velik i statistički značajan pad

broja eritrocita.

Ista tablica prikazuje broj leukocita 14. i 28. dana. Uočljiva je dinamika promjene

broja leukocita, izmjerena 14. i 28. dana, a izražena kao broj leukocita x 109 /L krvi. U

mužjaka skupine K utvrđeno je da dolazi do smanjenja broja stanica od četrnaestog (9,14

± 1,78 x 109 /l krvi.) do dvadesetosmog dana (7,32 ± 1,47 x 109 /l krvi). U ženki kontrolne

skupine također uočava se porast broja leukocita od četrnaestog (5,9 ± 3,26 x 109 /l krvi)

do dvadesetosmog dana (9,42 ± 4,56 x 109 /l krvi). Za razliku od mužjaka u kontrolnoj

skupini ženke su na kraju pokusa imale jači porast broja stanica leukocita u perifernoj

krvi. Sumarno u kontrolnoj skupini možemo govoriti o vrlo blagom porastu broja

stanica leukocita. Ove blage oscilacije leukocita i prije opisanih eritrocita u kontrole

mogu se pripisati pokusnom stresu. Četrnaestog dana pokusa sve doze uzrokuju

statistički značajno veliko povećanje broja leukocita u odnosu na kontrolnu skupinu.

Tretirane skupine pokazuju značajan porast broja leukocita u skupinama A i B. Takve

vrijednosti odskaču i od literaturnih podataka o varijacijama unutar mjerenog parametra i

vrlo vjerojatno predstavljaju rezultat direktnog imunostimulirajućeg učinka doze

Page 164: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

151

ispitivane nokse na mjereni parametar. Skupina C pokazuje dinamiku sličnu kontrolnoj

skupini životinja, tj. porast broja leukocita s početka aplikacije otrova i obrušavanje

broja leukocita do završetka pokusa.

Page 165: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

152

Tablica 34.: Broj eritrocita i leukocita periferne krvi pokusnih životinja nakon 14. i 28. dana izloženosti prometrinu

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

DOZA (Oznaka skupine)

0 mg/kg(K) 185 mg/kg(A) 375 mg/kg(B) 555 mg/kg(C)

Stanice dan broj/l

SPOL

n Sred. vr. SD znač. raz. n Sred. vr. SD znač.

raz. n Sred. vr. SD znač. raz. n Sred. vr. SD znač.

raz.

m 7 9.58 1.37 C 7 8.39 1.32 C 5 8.08 0.67 C 4 5.93 2.52 K,A,B

ž 7 8.62 1.02 A,B,C 7 7.66 1.07 K 7 7.32 0.78 K 4 6.48 2.78 K eritrocitii 14.dan x 1012/l

m + ž 14 9.10 1.54 A,B 14 8.03 1.21 K,C 12 7.70 0.80 K,C 8 6.20 2.57 K,A,B

m 7 10.11 1.15 A,B 7 7.94 1.09 K 5 8.70 1.29 K 4

ž 7 10.20 1.69 A 7 8.40 0.64 K 7 8.11 0.66 K 4 eritrocitii 28.dan x 1012/l

m + ž 14 10.15 1.41 A,B 14 8.17 0.89 K 12 8.40 1.01 K 8

m 7 9.14 1.78 A,B 7 14.65 4.04 K 5 15.33 1.81 k,C 4 10.65 3.94 B

ž 7 5.90 3.26 b 7 8.37 1.23 b 7 14.73 3.16 k,a,c 4 8.14 3.16 b

leukociti 14.dan x 109/l

m + ž 14 7.43 3.14 A,B 14 12.07 4.42 K 12 15.03 2.49 K,c 8 9.30 3.30 b

m 7 7.33 1.47 a 7 7.18 2.26 k,B 5 4.51 1.70 A 4 ž 7 9.42 4.56 A 7 5.64 1.81 K, B 7 8.27 2.26 A 4

leukociti 28.dan x 109/l

m + ž 14 8.46 3.53 A 14 6.41 2.75 K 12 9.30 3.30 8

Page 166: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

153

4.6. UČINAK PROMETRINA NA DIFERENCIJALNU KRVNU SLIKU (DKS) PERIFERNE KRVI Rezultati analize sastavnica diferencijalne krvne slike nalaze se tablično prikazani u

tablicama 35. i 36. Među granulocitima najzastupljeniji tip stanica, polimorfonuklearni

neutrofilni leukociti ne pokazuju veće oscilacije promjene brojnosti u netretiranih

životinja (skupina K). Međutim, u otrovanih životinja nakon četrnaestog dana pa do kraja

pokusa u spomenutih skupina brojnost neutrofila u perifernoj krvi naglo opada dosežući

vrijednosti daleko niže od netretirane skupine. Statistički značajne razlike (p<0,01) u

broju neutrofila utvrđene između kontrolne skupine i skupine B četrnaesti dan i A i B

dvadesetosmi dan. Također značajno veći broj neutrofila (p<0,01) utvrđen je u skupine B

u odnosu na skupinu A. i C. Iako inače prisutni u relativno malom udjelu među

granulocitima, broj polimorfonuklearnih bazofilnih leukocita u perifernoj krvi u svih

tretiranih skupina tijekom pokusa, pokazuje izrazito kontinuirano povećanje, moglo bi

se reći gotovo proporcionalno u odnosu na dozu primljene nokse. Utvrđeni rezultati u

muških i ženskih jedinki kao i u oba spola ukupno skupine A i B u odnosu na kontrolnu

skupinu pokazuju statistički značajno (p<0,01) opadanje u broja stanica bazofila 14.

dana i obratno povećanje u 28. dana. Polimorfonuklearni eozinofilni leukociti do 14. dana

pokusa jedino doza B pokazuje porast broja u odnosu na kontrolu, a 28. dana i skupina A

pokazuje veći broj eozinofila stvorenih u drugoj polovici pokusa. Monociti, stanice koje

su predodređene da prodru u tkiva i diferenciraju se u makrofage, u perifernoj krvi

pokusnih skupina, usporedimo li vrijednosti četrnaestog i dvadesetosmog dana,

tendenciju porasta pokazuju jedino u skupine B. Također utvrđene su statistički značajne

razlike (p ≤ 0.01) između kontrolne skupine i skupina A i B. Limfociti, najzastupljenije

stanice među leukocitima, tijekom pokusa najveće promjene su u skupina A (u mužjaka

jače) i skupine B. Također se javlja tendencija pada od četrnaestog do dvadesetosmog

dana.

Page 167: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

154

Tablica 35: Broj stanica DKS-a periferne krvi pokusnih životinja nakon 14. dana izloženosti prometrinu

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

DOZA (Oznaka skupine)

14. dan

0 mg/kg(K) 185 mg/kg(A) 375 mg/kg(B) 555 mg/kg(C)

DKS x 109/l

SPOL

n Sred.vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.

raz. n Sred.vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.

raz.

m 7 0.400 0.307 A,C 7 0.020 0.054 K,B,C 5 0.102 0.179 A, 4 0.125 0.126 K,A

ž 7 0.083 0.095 7 0.094 0.130 7 0.000 0.000 4 0.106 0.084 bazofili

m + ž 14 0.242 0.284 A,B,C 14 0.057 0.109 K 12 0.051 0.132 K,C 8 0.116 0.101 K,A,B

m 7 0.079 0.110 B 7 0.048 0.083 B,c 5 0.376 0.266 K,A 4 0.109 0.142 b

ž 7 0.032 0.059 B 7 0.042 0.048 B 7 0.302 0.163 K,A,B 4 0.072 0.085 B eozinofili

m + ž 14 0.056 0.089 B,C 14 0.045 0.067 B 12 0.339 0.216 K,A 8 0.091 0.110 B

m 7 6.028 1.164 A,B,C 7 11.055 2.921 K 5 10.628 0.925 K 4 8.615 3.294 K

ž 7 4.435 2.901 B 7 6.316 0.534 B 7 10.874 2.209 K,A,C 4 6.215 1.799 B limfociti

m + ž 14 5.232 2.340 A,B 14 8.686 3.260 K 12 10.751 1.630 K,C 8 7.415 2.770 K,B

m 7 0.524 0.183 B,C 7 0.553 0.406 B,C 5 0.265 0.123 K,A 4 0.233 0.227 K,A ž 7 0.120 0.048 A,B,C 7 0.316 0.320 K 7 0.442 0.496 K 4 0.564 0.190 K monociti

m + ž 14 0.322 0.246 14 0.435 0.378 12 0.354 0.350 8 0.399 0.260

m 7 2.110 0.745 B 7 2.980 1.653 C 5 3.955 0.907 K,C 4 1.566 0.484 A,B

ž 7 1.228 0.565 B 7 1.606 0.399 B 7 3.108 1.326 K,A,C 4 1.185 0.408 B neutrofili

m + ž 14 1.669 0.814 B 14 2.293 1.410 b,C 12 3.532 1.170 K,a,B 8 1.376 0.469 A,B

Page 168: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

155

Tablica 36: Broj stanica DKS-a periferne krvi pokusnih životinja nakon 28. dana izloženosti prometrinu

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika

DOZA (Oznaka skupine)

28. dan

0 mg/kg(K) 185 mg/kg(A) 375 mg/kg(B) 555 mg/kg(C)

DKS x 109/l

SPOL

n Sred.vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.

raz. n Sred.vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.

raz.

m 7 0.000 0.000 7 0.266 0.384 B 5 0.178 0.120 A 4

ž 7 0.132 0.223 B 7 0.141 0.148 B 7 0.352 0.329 K,A 4 bazofili

m + ž 14 0.066 0.172 14 0.204 0.280 12 0.265 0.250 K 8

m 7 0.210 0.076 A,B 7 0.030 0.040 K 5 0.042 0.045 K 4

ž 7 0.100 0.111 a 7 0.014 0.025 k 7 0.050 0.056 4 eozinofili

m + ž 14 0.155 0.108 A 14 0.022 0.033 K 12 0.046 0.048 K 8

m 7 5.350 1.310 b,a 7 4.870 1.420 b 5 3.440 1.290 k,a 4

ž 7 7.610 3.730 7 4.770 1.490 k 7 6.360 2.010 4 limfociti

m + ž 14 6.480 3.000 a 14 4.820 1.400 k 12 4.900 2.220 8

m 7 0.163 0.158 A 7 0.432 0.254 K 5 0.321 0.164 K 4

ž 7 0.265 0.143 B 7 0.268 0.175 B 7 0.588 0.257 K,A 4 monociti

m + ž 14 0.214 0.153 B 14 0.350 0.226 12 0.455 0.248 K 8

m 7 1.602 0.292 A,B 7 0.731 0.404 K 5 0.530 0.247 K 4

ž 7 1.312 0.709 A 7 0.445 0.230 K,B 7 0.914 0.271 A 4 neutrofili

m + ž 14 1.457 0.556 A,B 14 0.588 0.350 K 12 0.722 0.310 K 8

Page 169: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

156

4.7. UČINAK PROMETRINA NA STANIČNOST KOŠTANE MOŽDINE Celularitet koštane moždine jednog femura prikazana je u tablici 38. Tako se primjerice,

u mužjaka uočava ekstremno smanjenje broja stanica u koštanoj moždini između

netretirane (skupina K) i tretireane skupine A. Nasuprot tome ženke skupina K i A ne

pokazuju značajne razlike, dok ženke skupine B pokazuju statistički značajan porast, a

ženke skupina C povećanje ukupnog broja stanica koštane moždine u odnosu na skupinu

A, a nešto manje ali još uvijek statistički značajno u odnosu na skupinu B. Također, s

obzirom na postojanje statistički značajne razlike (p<0,01) između tretiranih skupina,

uočava se da je skupina A imala najveće opadanje broja stanica, a skupina B najmanje.

4.8. UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I STANIČNOST TIMUSA Masa timusa tretiranih životinja, izražena u miligramima (mg) i predstavljena tablicom

37. signifikantno opada (p<0,01) jedino u mužjaka tretiranih skupina A (0,022 ± 0,0003

g) i B (0,020 ± 0,0003 g) u odnosu na netretiranu skupinu K (0,027 ± 0,0003 g).

Podskupina ženki ne pokazuje značajne razlike u promjeni težine timusa, što je također

slučaj ukoliko se sumarno promatra mužjake i ženke objedinjene u skupine s obzirom na

primljenu dozu. U tablici 38. prikazana je promjena staničnosti timusa gdje se statistički

značajnu promjenu (p<0,01) u odnosu na kontrolu, uočava tek u ženki skupine C i

između skupina A i C, ukoliko promatramo zajedno muške i ženske jedinke s obzirom na

primljenu dozu nokse.

4.8.1 Učinak prometrina na apoptozu, nekrozu i vitalnost timocita ispitivan protočnom citometrijom U tablici 39 i slikama 79-83 i 92-95 prikazan je postotak timocita u apoptozi, nekrozi,

mješovitih apoptotično/nekrotičnih i vitalnih stanica timusa. Uočava se statistički

značajno povećanje nekrotičnih stanica, a paralelno s time statistički značajno opada

broj odnosno postotak živih timocita. Također rastuća vrijednost postotka apoptotičnih

stanica prati povećanje doze, jedino se u skupine B ne uočava statistički značajan porast

apoptotičnih stanica.

Page 170: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

157

4.9. UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU, BROJ STANICA I HISTOLOŠKE PROMJENE SLEZENE Masa slezene, izražena u gramima (g), značajno (p<0,01) se povećava samo u mužjaka

skupine A, dok se u ženki iste skupine značajno smanjuje u odnosu na netretiranu

skupinu, također ženke skupine C pokazuju isti trend smanjenja težine slezene (p<0,01)

u odnosu na skupine K i B, što je prikazano tablicom 37. Zajedničkom usporedbom

mužjaka i ženki sjedinjenih po skupinama s obzirom na primljenu dozu značajano

(p<0,01) smanjenje težine slezene u odnosu na sve ostale skupine uočava se jedino u

skupini C koja je primila najvišu dozu pesticida. Ukupan broj stanica cijele slezene

(tablica 38.), statistički se značajno (p<0,01) razlikuje između skupina K i B i B i C u

mužjaka, te između C skupine i svih ostalih skupina u ženki. Sumarno promatrajući sve

skupine moglo bi se se govoriti da u skupini C (3,28 ± 1.61 g) postoji statistički značajna

(p<0,01) tendencija smanjenja ukupnog celulariteta slezene u odnosu na sve ostale

tretirane skupine. Histopatološkom analizom hemalun-eozinskih preparata slezene (slika

79) uočavaju se jače promjene na jedinkama tretiranih skupina u odnosu na kontrolnu

skupinu. Ovojnica (kapsula) slezene ne pokazuje nikakve lezije niti u jedne od tretiranih

životinja, međutim proporcionalno porastu primljene doze kako u mužjaka tako i u

ženki, uočava se gubitak sferoidnog oblika limfatičkih nodula, gubi se njihov pravilan

raspored oko centralnih arterija i nestaje njihovo međusobno jasno razgraničenje. Sada

tako spojeni poprimaju nepravilne oblike zauzimajući veći dio organa. Gotovo je

nemoguće strukturalno jasno rasproznati marginalnu od germinativne zone nodula.

Uočava se povremeno pojavljivanje disperzno raspoređenih megakariocita i povećanje

volumena pojedinih stanica slezene. Ovako narušen strukturalni integritet organa mogao

bi se opisati kao vrlo jaka patološka promjena. Prikazane i opisane promjene na slezeni

potvrdio je histopatolog veterinarske medicine. Nalaz opisuje kao: “Hyperplasia

lymphofollicularis partim gravis et hyperaemia partialis atque megacaryocytosis

disissemnata et gigantocellulare disisseminatae”. Promjene ukazuju na jači podražaj

imunokompetitivnog tkiva slezene što rezultira jačom limfoidnocitarnom i nodularnom

hiperplazijom i povremenom pojavom megakariocitnih stanica (Sabočanac 2002). Ove

nalaze patologa potvrdio je i histolog Lacković-Venturin (2003).

Page 171: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

158

Tablica 37: Težina organa pokusnih životinja nakon 28. dana izloženosti prometrinu

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i *za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

DOZA (Oznaka skupine)

0 mg/kg(K) 185 mg/kg(A) 375 mg/kg(B) 555 mg/kg(C) Organ težina SPOL

n Sred.vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.

raz. n Sred. vr. SD znač. raz. n Sred.vr. SD znač.

raz.

m 7 0.500 0.026 B,c 7 0.481 0.024 b 5 0.458 0.013 K,a 4 0.460 0.018 k

ž 7 0.460 0.013 C 7 0.440 0.029 C 7 0.448 0.027 C 4 0.383 0.017 K,A,B mozak (g)

m + ž 14 0.474 0.017 b,C 14 0.461 0.269 c 12 0.453 0.227 c 8 0.421 0.018 K,a,b

m 7 27,740 3,04 A,B 7 21,900 4,75 K 5 20,320 3,45 K,c 4 26,100 3,66 b

ž 7 31,220 4,09 7 32,000 7,41 7 29,920 7,19 4 32,520 2,97 timus (mg)

m + ž 14 29,480 3,91 14 27,000 7,9 12 25,920 7,5 8 29,310 3,34

m 7 0.087 7,55-3 A 7 0.100 0.012 K 5 0.092 0.020 4 0.083 0.020

ž 7 0.085 0.011 A,C 7 0.070 8,16-3 K,B 7 0.080 9,51-3 B,C 4 0.067 9,57-3 K,B

slezena

(g) m + ž 14 0.086 9,6-3 k 14 0.085 0.010 12 0.089 0.010 8 0.075 0.017 k

m 7 0.187 0.012 C 7 0.191 0.027 C 5 0.188 0.031 c 4 0.148 9,570-3 K,A,b

ž 7 0.139 6,900-3 B,C 7 0.122 0.012 7 0.129 0.017 K 4 0.113 5,000-3 K bubreg (g)

m + ž 14 0.163 0.010 C 14 0.157 0.021 12 0.153 0.024 8 0.130 7,637-3 K

m 7 10.10 6.49 7 9.61 4.61 5 8.92 2.86 4 8.10 1.91

ž 7 10.40 3.33 a 7 6.91 9.63 k,C 7 7.86 2.34 C 4 14.20 3.84 A,B limfni čvor(mg)

m + ž 14 10.25 4.96 14 8.26 3.49 12 8.30 2.50 8 11.16 4.29

m 7 1.320 0.077 C 7 1.360 0.163 c 5 1.422 0.123 c 4 1.158 0.134 K,a,b

ž 7 1.105 0.191 7 1.090 0.131 c 7 1.148 0.139 4 1.080 0.066 a jetra (g)

m + ž 14 1.210 0.145 14 1.230 0.148 12 1.263 0.133 8 1.120 0.106

Page 172: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

159

Tablica 38.: Staničnost organa pokusnih životinja nakon 28. dana izloženosti prometrinu

Statistički značajne razlike između spolova unutar skupine označene su sa ** za p ≤ 0.01 i* za p ≤ 0.05, a između doza (skupina) s K, A, B, C za p ≤ 0.01 i kao k, a, b, c za p ≤ 0.05, NS-nema statistički značajnih razlika.

DOZA (Oznaka skupine)

0 mg/kg(K) 185 mg/kg(A) 375 mg/kg(B) 555 mg/kg(C)

Organ

staničnostSPOL

n Sred. vr. SD znač. raz. n Sred. vr. SD znač.

raz. n Sred. vr. SD znač. raz. n Sred. vr. SD znač.

raz.

m 7 0.91 0.302 A 7 0.53 0.076 K,B,C 5 0.95 0.415 A,C 4 0.85 0.480 A,B

ž 7 0.57 0.110 B 7 0.49 0.124 B,C 7 0.89 0.304 K,A,C 4 0.62 0.570 B koštana srž

br.st x107

m + ž 14 0.74 0.319 a 14 0.51 0.103 B 12 0.91 0.353 A, 8 0.73 0.350 A,B

m 7 3.87 2.71 a 7 1.82 0.64 k 5 4.24 2.32 4 2.65 1.14

ž 7 2.17 1.26 c 6 4.24 2.32 7 3.78 2.54 4 5.44 0.91 k

timus br.st x107

m + ž 14 2.96 2.15 14 2.47 2.43 12 3.98 2.46 8 4.04 1.03

m 7 5.77 2.84 B 7 5.37 3.77 5 5.78 1.41 K 4 5.09 1.16

ž 7 6.59 1.12 C 7 7.07 2.98 C 7 6.30 1.80 C 4 2.55 0.66 K,A,B

slezena br.st x107

m + ž 14 6.22 2.09 C 14 6.16 3.41 c 12 6.08 1.66 C 8 3.28 1.61 K,a,B

m 7 2.440 1.085 7 2.400 1.640 B,C 5 1.520 0.274 A 4 1.575 0.316 A

ž 7 2.880 1.300 C 7 3.360 1.200 7 2.770 1.140 4 4.950 3.760 K brahijalni

limfni čvorbr.st X106

m + ž 14 2.676 1.179 14 2.840 1.487 12 3.262 3.060 8 3.460 3.370

Page 173: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

160

Slika 79: Slezena tretiranih skupina životinja, Hemalaun-eozinsko bojenje, Hiperproliferacija limfoidocitarnih stanica: A1 slezena životinje skupine A (185 mg/kg prometrina), povećanje 35 X; B1 slezena životinje skupine B (375 mg/kg prometrina), povećanje 35 X; C1 slezena životinje skupine C (555 mg/kg prometrina), povečanje 35 X; A2, B2, C2 isto kao i A1, B1, C1, samo tamnim strelicama i linijama istaknute patološke promjene

Page 174: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

161

4.9.1. Učinak prometrina na apoptozu, nekrozu i vitalnost splenocita istraživan protočnom citometrijom Tablica 40. i slike 84-87 i 96-99. prikazuju odnose apoptoze, nekroze, živih i mješovitih

apoptotično/nekrotičnih splenocita u slezeni. Nisu zabilježene nikakve statistički značajne

razlike između tretiranih skupina i kontrolnih životinja.

4.10. UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I STANIČNOST LIMFNOG ČVORA (BRAHIJALNOG)

Tablica 38. prikazuje promjenu staničnosti brahijalnog limfnog čvora, a tablica 37.

težinu. Analizom rezultata promjene težine uočava se smanjenje mase aksilarnog

limfnog čvora u mužjaka skupina A i C u odnosu na netretiranu skupinu. U ženskih

jedinki masa brahijalnog limfnog čvora tretiranih skupina A i B značajno je manja, a

masa limfnog čvora skupine C značajno je viša u odnosu na kontrolnu skupinu. Broj

stanica brahijalnog limfnog čvora u mužjaka opada u skupinama B i C, dok u ženskih

jedinki skupine C osjetno raste u odnosu na sve tretirane skupine. Sumarnom analizom

obaju spolova po skupinama uočava se, porast broja stanica u limfnom čvoru u skupini

C. Sumarno, moglo bi se govoriti o značajnom smanjenju mase aksilarnog limfnog

čvora tretiranih skupina u odnosu na netretirane skupine i značajnim razlikama između

skupina A i B u odnosu na skupinu C s obzirom na masu brahijalnog limfnog čvora.

4.10.1. Učinak prometrina na apoptozu, nekrozu i vitalnost stanica limfnog čvora istraživan protočnom citometrijom Tablica 41. i slike 88-91 i 100-103 prikazuju odnose apoptoze, nekroze, živih i mješovitih

apoptotično/nekrotičnih splenocita u limfnom čvoru. Uočava se statistički značajan

porast postotka nekrotičnih ali ne i apoptotičnih stanica u limfnom čvoru u odnosu na

porast doze. Također se jedino u ovog ispitivanog organa zamjetno i statistički značajno

mijenja omjer stanica mješovitog karaktera, onih koje pokazuju karakteristike apoptoze i

nekroze u skupine A. On statistički opada u odnosu na kontrolu.

Page 175: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

162

Tablica 39.:Timociti pokusnih životinja kontrolne skupine i tretiranih skupina životinja

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 83,706 79,316 85,544 70,364

St. devijacija 5,126 7,151 6,903 9,329 Median 82,965 81,945 83,125 74,260

Minimum 78,770 62,660 76,770 54,270 Maksimum 95,900 86,190 96,540 77,360

p ≤ 0.05 c c c k,a,b

% vitalnih timocita

Značajne razlike

p ≤ 0.01 C C C K,A,B

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 5,156 6,841 5,954 10,772

St. devijacija 2,382 3,373 3,642 1,875 Median 5,500 6,500 7,205 10,280

Minimum 0,000 3,670 0,070 9,100 Maksimum 8,580 17,570 10,580 13,920

p ≤ 0.05 c c c k,a,b

% nekrotičnih timocita

Značajne razlike

p ≤ 0.01 C C C K,A,B

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 8,371 11,889 6,731 16,188

St. devijacija 3,576 5,467 4,187 5,941 Median 8,630 11,370 8,305 13,640

Minimum 0,510 5,330 0,000 10,930 Maksimum 11,820 22,350 11,650 25,570

p ≤ 0.05 c b a,c k,b

% apoptotičnih timocita

Značajne razlike

p ≤ 0.01 C B A,C K,B

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 2,771 1,957 1,770 2,678

St. devijacija 0,955 1,007 0,925 2,143 Median 3,085 1,835 1,550 2,500

Minimum 1,160 0,670 0,790 0,770 Maksimum 3,850 4,560 3,390 6,240

p ≤ 0.05 NS NS NS NS

% timocita mješovitih

apoptotićnih i nekrotićnih

svojstava koji vežu anneksinV-

FITC i propidij jodid Značajne

razlike p ≤ 0.01 NS NS NS NS

Page 176: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

163

Tablica 40.: Splenociti pokusnih životinja kontrolne skupine i tretiranih skupina životinja

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 77,136 78,195 79,128 76,666

St. devijacija 7,919 3,357 1,791 5,471 Median 78,580 79,210 78,880 74,200

Minimum 60,000 69,670 77,530 71,950 Maksimum 86,730 82,110 81,890 85,060

unutar skupine NS NS NS NS

% vitalnih splenocita

Značajne razlike između

skupina NS NS NS NS

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 10,002 9,047 9,674 10,718

St. devijacija 6,781 2,776 1,221 3,608 Median 8,480 8,655 9,650 11,490

Minimum 2,460 4,630 7,830 6,100 Maksimum 24,810 15,920 11,170 15,490

p ≤ 0.05 NS NS NS NS

% nekrotičnih splenocita

Značajne razlike

p ≤ 0.01 NS NS NS NS

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 6,666 6,686 5,016 8,832

St. devijacija 2,853 2,115 1,896 2,059 Median 6,355 6,645 4,850 9,780

Minimum 1,780 3,330 2,210 6,010 Maksimum 13,460 10,610 7,430 10,910

p ≤ 0.05 NS NS NS NS

% apoptotičnih splenocita

Značajne razlike

p ≤ 0.01 NS NS NS NS

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 6,198 6,076 5,738 3,782

St. devijacija 2,211 2,272 0,546 0,961 Median 6,930 5,755 5,860 4,080

Minimum 3,510 3,060 5,100 2,780 Maksimum 9,070 10,390 6,450 5,010

p ≤ 0.05 NS NS NS NS

% splenocita mješovitih

apoptotićnih i nekrotićnih

svojstava koji vežu anneksinV-

FITC i propidij jodid Značajne

razlike p ≤ 0.01 NS NS NS NS

Page 177: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

164

Tablica 41.: Stanice limfnog čvora pokusnih životinja kontrolne skupine i tretiranih skupina

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 82,006 83,200 77,700 64,598

St. devijacija 7,370 3,337 5,924 13,457 Median 80,700 82,840 79,810 69,610

Minimum 64,980 77,460 71,010 44,200 Maksimum 94,690 88,420 82,280 75,720

p ≤ 0.05 c c c k,a,b

% vitalnih stanica limfnog čvora

Značajne razlike

p ≤ 0.01 C C C K,A,B

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 7,310 5,373 13,647 12,274

St. devijacija 4,601 1,225 5,849 9,098 Median 7,800 5,930 11,480 11,450

Minimum 1,090 2,270 9,190 0,450 Maksimum 19,490 6,410 20,270 25,360

p ≤ 0.05 b b,c k,a b

% nekrotičnih stanica limfnog

čvora

Značajne razlike

p ≤ 0.01 B B,C K,A B

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 8,823 10,729 7,357 10,928

St. devijacija 3,748 3,265 0,584 6,041 Median 9,335 10,420 7,240 12,650

Minimum 1,420 5,980 6,840 0,340 Maksimum 14,730 15,610 7,990 14,830

p ≤ 0.05 NS NS NS NS

% apoptotičnih stanica limfnog

čvora

Značajne razlike

p ≤ 0.01 NS NS NS NS

doza 0 mg/kg (K)

185 mg/kg

(A)

375 mg/kg

(B)

555 mg/kg

(C) Srednja vrijednost 1,881 0,698 1,297 1,596

St. devijacija 1,090 0,321 0,510 0,816 Median 1,770 0,600 1,480 1,880

Minimum 0,310 0,320 0,720 0,510 Maksimum 3,980 1,510 1,690 2,570

p ≤ 0.05 a k,c NS a

% stanica limfnog čvora mješovitih

apoptotićnih i nekrotićnih

svojstava koji vežu anneksinV-

FITC i propidij jodid Značajne

razlike p ≤ 0.01 A K,C NS A

Page 178: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

165

Slika 80: Timociti mužjaka i ženki kontrolne skupine (0 mg/kg prometrina) pokusnih životinja obilježenih annexinomV-FITC i propidij-jodidom analiziranih protočnim

citometrom

mužjaci kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

ženke kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

Page 179: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

166

Slika 81: Timociti mužjaka i ženki skupine pokusnih životinja tretiranih s 185mg/kg

prometrina, obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom

mužjaci skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

ženke skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

Page 180: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

167

Slika 82: Timociti skupine pokusnih životinja skupine 375 mg/kg obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom

Slika 83: Timociti skupine pokusnih životinja skupine 555 mg/kg obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom

ženke skupine tretirane s 375 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

ženke skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

Page 181: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

168

Slika 84: Splenociti kontrolne skupina 0 mg/kg pokusnih životinja obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom

mužjaci kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

ženke kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

Page 182: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

169

Slika 85: Splenociti mužjaka i ženki skupine tretirane s 185 mg/kg pokusnih životinja tretiranih s 185mg/kg prometrina, obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom

analiziranih protočnim citometrom

mužjaci skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

ženke skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

Page 183: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

170

Slika 86: Splenociti skupine pokusnih životinja tretiranih s 375 mg/kg s obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom

Slika 87: Splenociti skupine pokusnih životinja tretiranih s 555 mg/kg prometrina obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom.

ženke skupine tretirane s 375 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

ženke skupine tretirane s 555 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

Page 184: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

171

mužjaci kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

ženke kontrolne skupine (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

Slika 88: Stanice limfnih čvorova skupina pokusnih životinja tretiranih s 0 mg/kg prometrina obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom

Page 185: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

172

Slika 89: Stanice limfnih čvorova mužjaka i ženki skupine pokusnih životinja tretiranih s 185mg/kg prometrina, obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih

protočnim citometrometrijom

mužjaci skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

ženke skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

Page 186: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

173

Slika 90: Stanice limfnih čvorova mužjaka i ženki skupina pokusnih životinja tretiranih s 375 mg/kg prometrina, obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom

91: Stanice limfnih čvorova mužjaka i ženki skupina pokusnih životinja tretiranih s 555 mg/kg prometrina, obilježenih annexinomV-FITC i propidij jodidom analiziranih protočnim citometrom.

ženke skupine tretirane s 375 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3

ženke skupine tretirane s 185 mg/kg (odabir od ukupne skupine) životinja 1 životinja 2 životinja 3 životinja 4

Page 187: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

174

Mean; MaxMin

Timociti nekroticnih i apoptoticnih osobina

Doza

% ti

moc

ita P

I/ann

VFI

TC

0

1

2

3

4

5

6

7

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

NS

NS

NSNS

Slika 92: Omjer timocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom i anneksinom VFITC dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Mean; MaxMin

Timociti u nekrozi

Doza

% ti

moc

ita u

nek

rozi

0

5

10

15

20

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

C C C

K,A,B

Slika 93: Omjer timocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom (nekrotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Mean; MaxMin

Vitalni timociti

Doza

% v

italn

ih ti

moc

ita

0

20

40

60

80

100

120

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

C

C

C

K,A,B

Slika 94: Omjer timocita životinja tretiranih prometrinom koji se ne boje ni propidij jodidom nitii anneksinom VFITC (vitalne stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Mean; MaxMin

Timociti u apoptozi

Doza%

tim

ocita

u a

popt

ozi

0

5

10

15

20

25

30

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

CB

A,C

K,B

Slika 95: Omjer timocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje anneksinom V-FITC (apoptotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Page 188: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

175

Mean; MaxMin

Splenocita apoptoticnih i nekroticnih osobina

Doza

% s

plen

ocita

boj

anih

PI i

ann

eksi

nom

VFI

TC

0

2

4

6

8

10

12

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

NS

NS

NSNS

Slika 96: Omjer splenocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom i anneksinom VFITC dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Mean; MaxMin

Splenociti u nekrozi

Doza

% s

plen

ocita

u n

ekro

zi

0

5

10

15

20

25

30

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

NS

NS

NS

NS

Slika 97: Omjer splenocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom (nekrotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Mean; MaxMin

Vitalni splenociti

Doza

% v

italn

ih s

plen

ocita

0

20

40

60

80

100

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

NS NS NS NS

Slika 98: Omjer splenocita životinja tretiranih prometrinom koji se ne boje ni propidij jodidom nitii anneksinom VFITC (vitalne stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Mean; MaxMin

Splenociti u apoptozi

Doza

% s

plen

ocita

u a

popt

ozi

0

2

4

6

8

10

12

14

16

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

NS

NS

NS

NS

Slika 99: Omjer splenocita životinja tretiranih prometrinom koji se boje anneksinom V-FITC (apoptotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Page 189: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

176

Mean; MaxMin

Stanice limfnog cvora mjesovitih karakteristika

Doza

% s

tani

ca li

m.c

vora

boj

anih

PJ

i ann

eksi

nom

VFI

TC

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

AK,C

NS

A

Slika 100: Omjer stanica limfnog čvora životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom i anneksinom VFITC dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Mean; MaxMin

Stanice limfnog cvora u nekrozi

Doza

% s

tani

ca li

mf.c

vora

u n

ekro

zi

0

5

10

15

20

25

30

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

B

B,C

K,A

B

Slika 101: Omjer stanica limfnog čvora životinja tretiranih prometrinom koji se boje propidij jodidom (nekrotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Mean+SDMean-SDMean

Stanice limfnog cvora u apoptozi

Doza

% s

tani

ca li

mf.

cvor

a u

apop

tozi

0

5

10

15

20

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

NS

Slika 102: Omjer stanica limfnog čvora životinja tretiranih prometrinom koji se boje anneksinom V-FITC (apoptotične stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrije

Mean; MaxMin

Vitalne stanice u limfnom cvoru

Doza%

vita

lnih

sta

nica

u li

mfn

om c

voru

0

20

40

60

80

100

120

kontrola 185 mg/k 375 mg/k 555 mg/k

CC

CK,A,B

Slika 103: Omjer stanica limfnog čvora životinja tretiranih prometrinom koji se ne boje ni propidij jodidom nitii anneksinom VFITC (vitalne stanice) dobiven mjerenjem metodom protočne citometrij

Page 190: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

177

4.11. UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I HISTOPATOLOŠKE PROMJENE JETRE

Rezultati analize masa jetre pokusnih životinja, izraženi u gramima prikazani su tablica

37. Iz prikaza je vidljivo da kod muških životinja skupina B pokazuje blagi porast mase

jetre u odnosu na sve ostale skupine, dok skupina C pokazuje tendenciju smanjenja

(p<0,01) vrijednosti mase organa u odnosu na ostale skupine.

Takva se tendencija primjećuje i pri zajedničkoj analizi muških i ženskih jedinki

objedinjenih po skupinama s obzirom na dozu prometrina tj. jedino skupina B odskače od

ostalih po porastu mase jetre dok C skupina bilježi značajno smanjenje mase organa u

odnosu na ostale pokusne skupine. Histopatološkom analizom hemalun-eozinskih, PAS,

PAS+AB, PAS+D, sudan black B, sudan III, glutation, SDH, LDH, alkalna i kisela

fosfataza i nespecifična esteraza preparata jetre (slike 104-110 ) tretiranih životinja mogu

se uočiti slijedeće promjene koje bi mogle ukazivati na djelovanje nokse:

U netretiranoj skupini, kako u muških tako i u ženskih jedinki, makropatološkom

analizom jetra se čini nepromjenjena, uobičajene konzistencije i čvrstoće te boje koja

odgovara statusu potpuno zdravih životinja. Isto se može reći i za diferencijalno bojene

mikroskopske preparate. Međutim, jetra životinja pod djelovanjem ispitivane tvari,

makroskopski pogotovu u skupini C, naizgled je moglo bi se reći manja, vodenastija i

rahla tj. relativno se brzo raspada primimo li ju pincetom.

Mikroskopskom analizom hemalun-eozinskih rezova u skupina K i A ne vidi se bitno

narušena lobularna arhitektura, možemo reći da je jetra u patološkom smislu bez

osobitosti. U skupini B i C (slike 104, 105) uočava se da su ponegdje, stanice povećane, s

povremenim manjim ili većim mjestima u citoplazmi stanice koja djeluju vakuolizirano

(promjenu bismo mogli označiti kao hidropičnu vakuolizaciju jer prema Sudan bojenjima

(slika 107) velike vakuole se ne boje dok međutim disperzno u citoplazmi hepatocita

vidimo jaku prožetost mikrovezikularnim masnim infiltracijama (stanje koje se može

označiti kao mikrovezikularna steatoza), s rijetkim raspršenim pojavljivanjem

megakariocita i glomaznih stanica. Također se nazire djelomična nekroza organa,

najjasnije izražena u skupini B (Hemalun-eozinski preparati, slika 104, 105). Bojenje

preparata histokemijskom metodom za dokazivanje glutationa (slika 108) u tkivima vrlo

jasno je pokazalo da intenzitet plavog obojenja raste proporcionalno s primljenom dozom

Page 191: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

178

(K < A < B < C/najjače/). Nazire se bitne dijelove lobularne hepatičke arhitekture i moglo

bi se reći da je pozitivnija reakcija dobivena oko krvnih žila (kojima noksa i njeni

metaboliti pristižu i napuštaju jetru) i žućnih izvodnih kanalića. Ne može se reći da je

plava reakcija dobivena u nekom granuloznom obliku u stanicama i/ili tkivu (poput

primjerice Sudana B ili III), već da je plavkasto obojenje gotovo jednoliko proželo cijelo

tkivo. Zanimljivo je usporediti PAS i PAS+alfa amilaza bojenje (slike 106), na kojima se

posebno ističe intenzitet učinka proporcionalan primljenoj dozi. Tako je u kontrolne

skupine reakcija blagog intenziteta, u skupine A pojedini hepatociti pokazuju jaču

osjetljivost na noksu pa cijeli organ ima “leopardast” uzorak, u skupini B zahvaćen je

cijeli organ, a u skupini C intenzitet reakcije je najjači. Slika 110 prikazuje pripadajuća

histokemijska bojenja koja nisu dala zadovoljavajuće rezultate zbog pokidanog tkiva

uslijed krio-obrade (primjerice Sudan III i dr.), iako se i dalje mogu naslutiti određene

indikativne promjene.

Page 192: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

179

Slika 104: Hemalaun-eozinsko bojenje jetre pokusnih životinja: A jetra mužjaka kontrolne skupine K, povećanje 200 X; B jetra mužjaka kontrolne skupine K, povećanje 400 X; C jetra mužjaka skupine tretirane sa 185 mg/kg prometrina, (skupina A, povećanje) 100 X; D jetra mužjaka skupine tretirane sa 185 mg/kg prometrina (skupina A), povećanje 400 X

Page 193: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

180

Slika 105: Hemalaun-eozinsko bojenje tkiva jetre pokusnih skupina životinja: A mužjak tretiran sa 185 mg/kg prometrina (skupina A), povećanje 200 X; B mužjak tretiran sa 375 mg/kg prometrina (skupine B), povećanje 200 X; C mužjak tretiran sa 375 mg/kg prometrina (skupine B),povećanje 200 X; D mužjak tretiran sa 375 mg/kg prometrina (skupine B), povećanje 400 X; E mužjak tretiran sa 375 mg/kg prometrina (skupine B), povećanje 400 X; F mužjak skupine C, 555 mg/kg prometrina (največa aplicirana doza), povećanje 200 X

Page 194: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

181

Slika 106: PAS-histokemijsko diferencijalno bojenje tkiva jetre pokusnih skupina životinja: A mužjak kontrolne skupine, povećanje 50 X; B mužjak kontrolne skupine, povećanje 100 X; C mužjak tretiran sa 185 mg/kg prometrina (skupine A), povećanje 100 X; D mužjak tretiran sa 555 mg/kg prometrina (skupine C), povećanje 50 X; E mužjak tretiran sa 555 mg/kg prometrina (skupine C), povećanje 100 X; F mužjak tretiran sa 555 mg/kg prometrina (skupine C), povećanje 400 X

Page 195: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

182

Slika 107: Sudan Black histokemijsko diferencijalno bojenje jetrenog tkiva pokusnih skupina životinja: A ženka kontrolne skupine, povećanje 200 X; B ženka skupine B (tretiran sa 375 mg/kg prometrina), povećanje 400 X; C ženka skupine C (največa aplicirana doza), povećanje 100 X; D ženka skupine C (največa aplicirana doza, tretiran sa 555 mg/kg prometrina), ista životinja kao i na slici C, povećanje 400 X

Page 196: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

183

Slika 108: Histopatološko dokazivanje glutationa u jetri pokusnih životinja: A jetra ženke netretirane, kontrolne skupine skupine, povećanje 200 X, blaga do gotovo nikakva reakcija;

B jetra ženke skupine B (doza 1/10 LD 50), povećanje 200 X, pojačana indukcija glutationa kao molekule detoksifikacije;

C jetra ženke skupine C (največa aplicirana doza), povećanje 200 X, tigrasti uzorak otkriva pojačanu akumulaciju glutationa u tkivu; D jetra ženke skupine C (ista kao i slika C), povećanje 400 X, pod većim povećanjem otkriva se i granulozna struktura obojene tvari

Page 197: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

184

Slika 109: Enzimatsko histokemijsko diferencijalno bojenje jetre pokusnih skupina životinja: A Nespecifična esteraza, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; B Nespecifična esteraza, mužjak skupineB tretiran sa 375 mg/kg prometrina, povećanje 200 X; C SukcinatDH, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X;; D SukcinatDH, mužjak skupine B tretiran sa 375 mg/kg prometrina, povećanje 200 X;

Page 198: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

185

Slika 110: Različite enzimatsko histokemijske reakcije jetre pokusnih skupina životinja: A Alkalna fosfataza, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; B Alkalna fosfataza, mužjak skupine B, povećanje 200 X; C Sudan III, mužjak kontrolne skupine, povećanje 400 X; D Sudan III, mužjak skupine B tretiran sa 375 mg/kg prometrina, povećanje 400 X; E NADPH2, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; F Kisela fosfataza, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; G Kisela fosfataza, mužjak skupine B, povećanje 200 X; H LDH, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; I LDH, mužjak skupine B, povećanje 200 X; J beta-NADPH, mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; K beta-NADPH, mužjak skupine B, povećanje 200 X

Page 199: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

186

4.12. UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I HISTOPATOLOŠKU SLIKU BUBREGA

Značajna promjena u masi bubrega (tablica 37.) zabilježena je u mužjaka u skupini C,

gdje je vrijednost mase organa izražena u g, osjetno smanjena u odnosu na ostale

pokusne skupine. U ženskih jedinki, međutim, osim smanjenjenja mase bubrega u

skupini C, bilježimo značajano smanjenje težine bubrega i u skupini A. Analizirajući

zajedno mužjake i ženke po tretiranim skupinama može se govoriti o smanjenju težine

bubrega u skupini C u odnosu na ostale skupine. Histopatološkom analizom Hemalun-

eozinskih, preparata bubrega uočava se zamjetan gubitak broja glomerula tj.

glomerularnu atrofiju u svih tretiranih skupina a pogotovu u životinja skupine B.

Primjećuje se hiperemija tj. punokrvnost, zapunjenost krvnih žila krvlju

Page 200: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

187

4.13. UČINAK PROMETRINA NA PROBAVNI SUSTAV

Tijekom trajanja pokusa nisu primjećeni proljevi ili krvarenja ni u jedne od tretiranih

skupina. Tijekom razudbe životinja pri kraju pokusa uočeno je izrazito, gotovo

dvostruko, vrečasto povećanje želuca u skupina B i C u odnosu na skupine K i A. Radi

otkrivanja učinka ispitivanog pesticida na probavni sustav, kao mjesta ciljnog ulaska

nokse u organizam pristupilo se analizi rezultata dobivenih diferencijalnim

dijagnostičkim bejenjem dijelova tankog crijeva. Histopatološkom analizom serijskih

rezova tankog crijeva (slika 111), obojenog hemalun-eozinskim bojenjem možemo

govoriti o vrlo jakoj reakciji i pobudi tkiva zaduženog za imunosni odgovor. GALT (Gut

Associated Limphatic Tissue) tj. limfoidocitarne nodularne strukture doživljavaju

histološko-morfološke tj. u ovom slučaju nakon djelovanja nokse patološke promjene, pri

kojima je došlo do snažne mobilizacije, akumulacije, proliferacije i agregacije limfatičnih

stanica. Promjene navedene vrste poglavito su naglašene u životinja skupine B (od kojih

pak ženke imaju najjači intenzitet). Iako je rezultat lako vidljiv, prepoznatljiv i vizualno

gotovo ekstreman usporedi li se odnos velićine promjera samog crijeva i patološke

promjene, koja se očituje u povećanom rastu limftičkih čvorića u crijevu, ipak se uočava

da još nije narušena sama anatomska struktura ovih dijelova crijeva tj. još uvijek postoji

neoštećena ovojnica (kapsula) koja imunokompetentno tkivo, iako snažno podstaknuto na

reaktivni proces drži lokaliziranim. Noksa također uzrokuje ljuštenje i odumiranje

crijevnog epitela koje se može okarakterizirati kao rijetko, pojedinačno u skupini A, i

nešto jače frekvencije pojavljivanja u skupina B i C. Moglo bi se govoriti o naznakama

apoptotičnog odumiranja, sa pojedinim rijetkim nalazima takvog stanja zajedno s

promjenama koje bi se moglo opisati kao piknoza u skupini A, nešto jačeg intenziteta u

skupini B i relativno snažnijeg intenziteta ovog tipa promjena u skupini C sa

lokaliziranim slabim i povremenim naznakama promjena koje bi mogle odgovarati

nekrotizaciji. Ponegdje se, proporcionalno jačini nokse (jače u skupina B i C), pojavljuje i

niz degenerativnih promjena crijevnih resica. Nalaz je potvrdio i histopatolog

veterinarske medicine, opisujući ga kao “Hyperplasio nodularis lymphoidocytaria

mucosae intestini et desquamatio partiallis”, te nalaz potkrepljuje mišljenjem:

“…promjene, posebice u crijevima ukazuju na jači podražaj imunokompetentnog tkiva

Page 201: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

188

što rezultira jačom limfoidnocitarnom i nodularnom hiperplazijom.” (Sabočanac, 2002),

ove nalaze također je potvrdio histolog Lacković-Venturin (2003). Duodenum ne

pokazuje anatomsko morfološke promjene u patološkom smjeru, a lučenje duodenalnih

žlijezda (Brunnerovih žlijezda) neometano je, što pokazuje PAS bojenje. Diferencijalno

bejenje PAS, PAS+AB, PAS+D na tankom crijevu pokazalo je značajnije lučenje

glikokonjugiranih produkata sluznice u tretiranih skupina. Poglavito bismo mogli

ocijeniti takvo lučenje najjačim u skupina B i C. Primjerice u skupini C, u

Lieberkühnovim kriptama vidimo većinu pozitivnih reakcija bojenja (veči broj granula) u

znatno većoj mjeri nego ostalih skupina .

Page 202: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

189

Slika 111: Hemalaun-eozinski preparati crijeva pokusnih skupina životinja, prikaz jake aktivacije imunokompetentnih struktura; A mužjak skupine B, povećanje 50 X; B ženka skupine C (največa aplicirana doza 555 mg/kg prometrina), povećanje 100 X; C mužjak skupine B (srednja aplicirana doza, 1/10 LD 50, 375 mg/kg prometrina, povećanje 150 X; D mužjak skupine A (185 mg/kg prometrina), povećanje 100 X; E mužjak skupine C (555 mg/kg prometrina), povećanje 100 X; F ženka skupine B (375 mg/kg prometrina), povećanje 200 X

Page 203: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

190

4.14. UČINAK PROMETRINA NA MOZAK

Tablica 37. prikazuje promjene mase mozga u pokusnih skupina. Zamjećuje se razlika u

masi mozga mužjaka skupina B i C u odnosu na skupinu K, masa je smanjena. U ženki

samo skupina C u odnosu na netretirane skupine životinja pokazuje statistički značajno

smanjene mase. Promotrimo li zajedno muške i ženske jedinke ujedinjene s obzirom na

dozu primljene nokse, smanjenje mase mozga može se uočiti u skupine B i C, dok je

skupina A nepromjenjena s obzirom na netretiranu skupinu. Makropatološkom analizom

tijekom razudbe životinja nisu utvrđene nikakve vidljive promjene u vanjskoj strukturi

mozga, krvnih žila, moždanih ovojnica i dr. niti u jedne od tretiranih skupina.

Histopatološki nalaz hemalun-eozinom bojanih preparata (slike 112-114), skupina A i B,

ne ukazuje na vidljive patološke promjene koje bi mogle ukazivati na bilo kakve lezije,

krvarenja, nekroze, nakupljanja tekućine i dr. Također na staničnoj razini u skupina A i

B, koliko metoda to dopušta nisu nađene promjene u relativnom omjeru stanica (glija-

neuroni), ili promjene na samim stanicama (vakuolizacija, promjene na jezgri, promjene

u velićini stanica i sl.). Međutim, slika koja prikazuje mozak jedne od životinja skupine C

ukazuje na poremećenu morfološko histološku arhitekturu mozga (strelica na slici).

Takva teža patohistološka promjena možda bi mogla bi biti izravno uzrokovana

ispitivanom tvari i najvjerojatnije uzrok ugibanja životinja prije isteka pokusnog

razdoblja od dvadesetosam dana.

Page 204: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

191

Slika 112: Hemalaun-eoznsko bojenje mozga mužjaka kontrolne skupine:tretiranih samo fiziološkom otopinom tijekom pokusnog razdoblja od 28 dana: A povećanje 50x; B povećanje 100 X

Page 205: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

192

Slika 113: Hemalaun-eozinsko bojenje mozga mužjaka tretiranih skupina: A mužjak skupine A (najmanja aplicirana doza ispitivane tvari), povećanje100 X; B mužjak skupine tretirane najmanjom dozom (ista životinja kao i na slici A ali druga cerebralna regija), povećanje100 X;

C mužjak skupine B (doza 1/10 LD 50), povećanje50 X; D ista životinja kao i na slici C, povećanje100 X, strelice indiciraju moguće patološke promjene iako se sa sigurnošću ne mogu pripisati djelovanju nokse; E mozak mužjaka skupine C (najveća aplicirana doza), povećanje50 X; F ista životinja kao i na slici E ali druga cerebralna regija, povećanje50 X

Page 206: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

193

Slika 114: Mozak, hemalaon-eozinsko bojanje: A mozak ženske jedinke netretirane skupine, povećanje 50 X; B mozak ženske jedinke skupine A (najmanja aplicirana doza), povećanje 50

X;

C mozak ženske jedinke skupine B (srednja doza, 1/10 LD 50), povećanje 50 X, strelice indiciraju na postojanje narušene strukture tkiva i promjenu normalnog rasporeda stanica iako se ovaj tip promjene ne može sa sigurnošću pripisati učinku nokse; D mozak ženske jedinke skupine C (najveća aplicirana doza)

Page 207: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

194

4.15. UČINAK PROMETRINA NA POPREČNOPRUGASTO MIŠIĆNO TKIVO

Makropataloškom analizom prilikom razudbe životinja, mišić noge u svih skupina

tretiranih životinja čini se normalne velićine, građe, boje, konzistencije i čvrstoće.

Mikroskopskpom analizom hemalun-eozinskih preparata poprečnoprugastog mišićnog

tkiva noge, mogli bismo reći da se u tretiranih skupina vidi jaka inflamatorna infiltracija

najvjerojatnije pobuđenih imunoreaktivnih/imunokompetentnih stanica, što upućuje na

inflamatorni polimiozitis. Ovo zaključujemo na osnovu mnogobrojnih jezgara stanica u

periplazmatskom prostoru mišića što bi moglo ukazivati na dijapedezu monocitno-tkivno-

makrofagnog tipa stanica koji kapilarama dolazi do i ameboidnim gibanjem prodire

dublje u tkivo (slika 115-118). Čini se da je relativna brojnost tih stanica proporcionalna

primljenoj dozi, iako se ne može sa sigurnošću tvrditi bez detaljnije analize (sugeriramo

da bi možda program Image analiser mogli točnije potvrditi ovu pretpostavku). Također

hemalun-eozinski preparati svih tretiranih skupina, u odnosu na kontrolu pokazuju

intenzivnije ljubičastocrveno obojenje sarkoplazme. Predlažemo da je ovaj nalaz na neki

način nastao zbog direktnog i/ili indirektnog učinka toksikanta tako da je promjenjen pH

sarkoplazme, vjerojatno se radi o nastanku anaerobnih uvjeta pri promjenjenim

metaboličkim putevima, najvjerojatnije se radi ili o smanjenju količine glikogena

(Sandritter 1968.) ili o nekom hipoksičnom anaerobnom procesu. Promjenu boje

tumačimo tako da pretpostavljamo jače vezanje bazofilne boje inače karakteristična za

bojenje jezgara, a procijenjeno je u našim uvjetima, da bi jačina ove potaknute reakcije

također mogla biti u korelaciji s visinom primljene doze. Od enzimsko-histokemijskih

reakcija LDH, ScDH (slika 117 i 118) provedenih na ovim uzorcima, najjasnije se uočava

promjena intenziteta obojenja (K < A < B < C/najjače/) u reakciji na laktat-

dehidrogenazu LDH, što također ukazuje na pojačani metabolizam unutar tih (tretiranih)

tkiva. Za ScDH ne može se sa sigurnošću reći da se uočavaju bitnije različitosti između

skupina.

Page 208: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

195

Slika 115: Poprečnoprugasti mišić mužjaka pokusnih skupina, hemalaun-eozinsko bojanje: A mužjak kontrolne skupine, povećanje 400 X; B mužjak kontrolne skupine skupine, povećanje 400 X; C mužjak skupine B (375 mg/kg prometrina), povećanje 400 X; D mužjak skupine C(555 mg/kg prometrina, povećanje 400 X

Page 209: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

196

Slika 116: Poprečnoprugasti mišić ženki pokusnih skupina, hemalaun-eozinsko bojenje: A ženka kontrolne skupine, povećanje 400 X; B ženka kontrolne skupine skupine, povećanje 400 X; C ženka skupine A (185 mg/kg prometrina), povećanje 400 X; D ženka skupine B (375 mg/kg prometrina, povećanje 400 X; E ženka skupine C (555 mg/kg prometrina, povećanje 400 X; F ženka skupine C (555 mg/kg prometrina, povećanje 400 X

Page 210: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

197

Slika 117: LDH-enzimatsko histokemijsko diferencijalno bojenje poprečnoprugastog mišića pokusnih skupina životinja; A mužjak kontrolne skupine, povećanje 200 X; B mužjak skupine A (185 mg/kg prometrina), povećanje 100 X; C mišić muške jedinke skupine B (375 mg/kg prometrina), povećanje 150 X; D mužjak skupine C (555 mg/kg prometrina), povećanje 200 X

Page 211: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

198

Slika 118: ScDH-enzimatsko histokemijsko diferencijalno bojenje poprečnoprugastog mišićnog tkiva pokusnih skupina životinja: A mužjak netretirane kontrolne skupine, povećanje 100 X; B mužjak skupine B (srednja aplicirana doza, 1/10 LD 50), povećanje100 X; C mišić ženske jedinke netretirane kontrolne skupine, povećanje100 X; D ženka skupine skupine B (srednja aplicirana doza, 1/10 LD 50), povećanje 100 X

Page 212: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

199

Page 213: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

5. RASPRAVA

Page 214: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

5. RASPRAVA

U provedenom pokusu planirani broj životinja po skupinama (četrnaest jedinki),

odnosno s obzrom na spol (sedam jedinki) i dozu apliciranog herbicida (osim kontrolne

skupine koja je primila samo uljnu otopinu), čini se opravdanim stoga jer pregledom

publiciranih toksikoloških radova slično osmišljenih toksikoloških pokusa (Springer i sur.

1986a, 1986b, 1983, Ulm 1994, Franković 1990, Pavelić 1977, Maynard i sur. 1999,

Tiruchevlam i sur. 2000a, 2000b, ), kao i usporedbom preporuka, smjernica i standarda za

izradu toksikoloških studija ovog tipa (Descotes 1988), upotrebljen je sličan ili isti broj

životinja/uzoraka a dobiveni su vrlo pouzdani pokazatelji učinka nokse na fiziološke i

anatomske osobine organizma.

Kako je prilikom odabira načina aplikacije tj. puta ulaska pesticida u organizam u

toksikološkom pokusu bitno što bolje oponašati prirodni način ekspozicije organizma

ispitivanoj noksi u nesimuliranim/prirodnim uvjetima (Timbrell i sur. 2000, Wallace-

Hayes i sur. 2001, Walker i sur. 2001, Descotes 1999, 1988 ), tako se i u ovom pokusu

činilo najboljim odabrati oralnu aplikaciju mekanom gastričkom kanilom (“per os”) iz

nekoliko razloga.

Naime, spomenutim se načinom aplikacije pouzdano može odrediti točna doza, tj.

količina otrova koja se može korigirati s obzirom na tjelesnu težinu organizama tako da je

primljena doza nokse među jedinkama ujednačena, za razliku kada su životinje pesticidu

izložene u hrani i/ili piću, pri čemu se ne zna pouzdano koliko je pojedina jedinka pojela

i/ili popila odnosno koliku je dozu otrova u određenom vremenu unjela u tijelo.

Također, pri eksponiranju u hrani i/ili piću pokusne životinje radi promjenjenih

organoleptičnih svojstava ponuđeno katkad i odbijaju, pa mogu nastati velike promjene u

primjerice težini, razini elektrolita u tjelesnim tekućinama i drugim fiziološkim

varijablama, a za koje se ne može sa sigurnošću tvrditi da su u vezi s izravnim učinkom

nokse, već proizlaze iz pothranjenosti tj. nutritivne deficijencije. Iako, može se spekulirati,

pri načinu aplikacije koji je primjenjen u provedenom pokusu treba biti oprezan prilikom

tumačenja rezultata, stoga jer je iz literature vidljivo da se relativno mali postotak ukupne

doze preko crijevnog epitela apsorbira u organizam, a tada je to ona količina nokse koja

zapravo djeluje na molekule, substanične strukture, stanice, tkiva, organe i fiziološke

sustave uzrokujući sistemsku toksičnost.

200

Page 215: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Međutim, očito je da način aplikacije primjenjen u ovoj studiji najbolje simulira

ekspoziciju organizama okolišno prisutnom prometrinu, jer kronična izloženost prometrinu

i njegovim okolišnim reziduima nastaje preko probavila, a najčešća jednokratna, akutna

izloženost, dermalno i respirativno (pri prskanju kultura). Također, toksikokinetički tvar ne

zaobilazi crijevnu mikrofloru i jetru s jetrenim detoksifikacijskim enzimima koji bi

potencijalno mogli stvoriti još toksičnije metabolite Prometrina, ili u slučaju pada

populacije crijevne mikroflore uzrokovati druge kliničko-patološke promjene.

Poznati su putevi ulaska nokse (slika 91.) u organizam dermalno (koža),

gastrointestinalno (oralno), dišnim sustavom (plućima, trahejama ili škrgama),

intraperitonealno (i.p.), intramuskularno (i.m), subkutano (s.c) i intravenski (i.v) kako to

prikazuje slika 103. iz koje je najbolje vidljivo da noksa odmah nakon unosa probavilom,

portalnom venom dolazi i prolazi kroz jetru (organ bitan za proces detoksifikacije koji

može producirati još toksičnije tvari od primarno aplicirane), a to je još jedino u slučaju pri

intraperitonealnoj aplikaciji (na slici oznaka i.p.). Intraperitonealno aplicirana otrovna tvar,

iako kao i oralno aplicirana, portalnom venom ulazi u jetru kao prvi ciljni organ pri

prolasku u tijelu, ipak zaobilazi mikrofloru probavila. U tom slučaju na mikrofloru crijeva

djelovat će samo već pregrađeni/konjuigirani metaboliti i najvjerojatnije vrlo mala do

gotovo nikakva količina neprerađenog ispitivanog toksikanta koja se putem žući vratila u

probavilo.

Time se u potpunosti izuzimaju vrlo bitni faktori koji mogu utjecati na toksičnost, poput

primjerice mikrobne pregradnje ksenobiotika u probavilu, promjena sastava crijevne

mikroflore ili njen potpuni nestanak, što je bitno za normalno funkcioniranje organizma.

Zadnji argument za način aplikacije ispitivane tvari leži u činjenici spomenutoj u uvodnom

dijelu, pregledu literature i dosadašnjih spoznaja o prometrinu iz kojeg se vidi da se koristi

kao sredstvo za zaštitu jestivog bilja, određeno vrijeme je prisutan u okolišu (voda, biljke,

zemlja) pa i nije nevjerojatno da će upravo tako rezidue otrova biti unešene u organizam

(Timbrell i sur. 2001; Wallace-Hayes i sur. 2001).

201

Page 216: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

202

Slika 119: Putevi prolaska ksenobiotika kroz tijelo ovisno o načinu aplikacije; s. c.- subkutano; i. m.– intramuskularno; i. v. – intravenski; i.p. – intraperitonealno; prilagođeno iz: Principles of Biochemical Toxicology (Timbrell, 2000.)

Page 217: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Nadalje, prema preporukama o odabiru doza prilikom dizajniranja

toksikološkog/imunotoksikološkog pokusa preporuča se uz netretiranu, kontrolnu skupinu

životinja, odrediti i tri doze kako bi se ukazalo na moguću proporcionalnu ovisnost doze i

učinka (od eng. dose-dependent response).

Između ostalih smjernica o odabiru doze, navodi se: “… The lower dose level is similar to

the lower dose used in conventional short-term repeated administration toxicity studies.

The next higher dose should not induce systemic toxicity and a decrise in body weight,

less then 10 percent is usually considered adequate….” Odnosno, najniža upotrebljena

doza mora biti slična uobičajenim najnižim dozama u toksikološkim pokusima, a prva

iduća veća doza ne smije inducirati sistemsku toksičnost i opadanje tjelesne težine za više

od 10% (Descotes 1999).

Prema tim smjernicama i literaturi (Springer i sur. 1986a, 1986b, 1983, Ulm 1994,

Franković 1990) odabrane su i doze u provedenom pokusu. Srednje jaka doza aplicirana

skupini B jest 1/10 LD50 za miša (Kamrin i sur. 2000.) tj. 375 mg/kg i predstavljala je

središnju okosnicu za odabir drugih dvaju doza.

Iz brojnih pokusa koji su također kao srednju dozu upotrebljavali 1/10 LD50 doze

apliciranu tijekom određenog radoblja (Springer i sur. 1986a, 1986b, 1983, Ulm 1994,

Franković 1990) vidljivo je da je upravo takav model optimum između postizanja učinka

koji se prati i preživljavanja jedinki tijekom pokusa.

Iako bi se primjenjene doze u ovom istraživanju moglo komentirati kao visoke s obzirom

na količinu nokse po jedinki tj. takve da ne odgovaraju vrijednostima potencijalne

ekspozicije ksenobiotiku okoliša, potrebito je skrenuti pozornost da je provedena studija

toksikološkog a ne ekotoksikološkog tipa. Odnosno, doze u ekotoksikološkom pokusu

najčešće su takve da se njima imitira količina ispitivanog ksenobiotika u okolišu, vodi ili

hrani ili se one određuju u granicama dopuštenih vrijednosti (ADI, MDK, NOAEL i sl.)

propisanih (zakonskih) standarda za rezidue ispitivane tvari. Toksikološka studija ciljno

oštećuje organizam kako bi pokazala način na koji organski, fiziološki i biokemijski

sustavi reagiraju na djelovanje nokse (kao u provedenoj studiji) ili je pokus temeljen na

određivanju najmanje granične vrijednosti doze nokse koja bi izazvala bilo kakav toksični

učinak (LD50, ADI, RfD, MDK, NOAEL i Procjena rizika/engl.-Risk estimation/).

203

Page 218: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Sve su životinje skupina K, A i B preživjele do kraja planiranog pokusa (do razudbe

dvadesetosmog dana), a sama količina nokse bila je dovoljna da bi u kratkoročnim

testovima toksičnosti pokazala vidljive učinke na ciljne organe i organske sustave.

Međutim, količina 1.48 X veća od 1/10 LD50 doze (skupina C) izazivala je smrt jedinki

na drugoj trećini planiranog trajanja pokusa.

Usporedba promjene aktivnost serumskih enzima i diferencijalni enzimatski

histopatološki preparati najbolji su pokazatelj ciljnih vitalnih organa koje prometin svojim

djelovanjem oštećuje. Uz enzimske biomarkere također je izrađena i rutinska

diferencijalna histopatološka analiza najbitnijih ciljnih organa toksičnosti, radi lakšeg i

jasnijeg tumačenja i potvrde rezultata biokemijske analize seruma i prikaza mehanizma i

tijeka sistemske toksičnosti, ali i stoga jer je to neodvojiv dio svake ispravno provedene

toksikološke studije ovog tipa.

Tumačenje histopatoloških preparata izvršeno je prema shematskim i slikovnim

ključevima za determinaciju udžbenika i atlasa histologije i histopatologije (Sandritter i

sur. 1989, De Fiore 1967) uz naknadnu potrvrdu nalaza od strane stručnjaka patologa

veterinarske medicine (Sabočanac 2002) i potvrde histologa (Lacković-Venturin 2003).

Aktivnost serumske LDH statistički se značajno povećava s porastom doze prometrina

(rezultati tablica 5. i slike 15. i 16.). U uvodu je detaljno opisano koji organi i na koji način

pridonose ukupnoj aktivnosti LDH u serumu, to su u najvećoj mjeri srce, jetra i

poprečnoprugasti mišić (Kaneko i sur. 1997, Fudge 2000, Wallace-Hayes 2001, Schmidt

1968). Histopatološka slika LDH u mišićju pokazuje povećanje aktivnosti, ali i ekspresije u

odnosu na kontrolu (slika 117). Istovremeno razina ekspresije i aktivnosti LDH smanjena

je u jetri životinja izloženih prometrinu (slika 110). To znači da postoji povezanost

povećanja aktivnosti LDH između seruma i mišića. Tijekom ovog pokusa povećanju

serumske aktivnosti LDH u manjoj mjeri pridonosi propadanje hepatocita i najvjerojatnije

je izvor serumske LDH porijeklom iz mišića. Dokaz je i pozitivna korelacija LDH i

kreatinina (tablica 15) u skupine A gdje se može pretpostaviti da i jedan i drugi pri toj

najmanjoj dozi potjeću od mišića. Usporedimo li slike regresije enzima LDH i kreatinina

(slika 31) uočava se nulti odnos, tj. nema rasta niti pada odnosa u kontrole, za razliku od

skupine A gdje je prisutno pozitivno povećanje povezanosti koja se još zadržava i u skupini

B a pri najvećoj dozi postoji jako negativan odnos obaju faktora. Biološki mogli bismo

204

Page 219: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

tumačiti izneseno na način da je došlo do metaboličnih promjena u mišićnom tkivu koje

iziskuju dodatne izvore stvaranja ATP-a jer njegova koncentracija nije više u otrovanih

životinja dovoljna. Pa se u mišićju zbiva pojačana glikogenoliza (otud i višak LDH koji

curi van jer su membrane sarkoplazme oštećene) a kreatinina nema dovoljno jer se sav

zadržava u ciklusu kreatinin fosfokinaze i generira ATP iz ADP-a. Takvo kretanje

korelacijskih i regresijskih odnosa tumačimo tako da jedino u skupine A doza prometrina

nije dovoljno jaka da napravi prije opisanu patofiziološku situaciju, ali je dovoljna da

uzrokuje oštećenje membrane te obe varijable odlaze u krv što uzrokuje njihovu pozitivnu

koreliranost. Čini se da je osim oštećenja membrane koje ispušta LDH iz sarkoplazme

patološki s porastom doze povećana razina ekspresije i sinteze enzima zbog djelovanja

prometrina. Povećanje aktivnosti LDH u samom mišićju kako smo već opisali, govori o

povećanju metabolizmu glukoze odnosno glikolitičkog puta kako bi se generirao ATP pri

tome nakupljanje laktata, krajnjeg proizvoda LDH, vjerojatno snižava pH u mišićju. Iz toga

možemo zaključiti da ga u otrovanih životinja ima puno jer i hemalauneozinsko bojenje

mišića otrovanih životinja ukazuje na jače crvenkasto obojenje unutar sarkoplazme u

odnosu na kontrolu. Ako znamo da je eozin histološka boja koja boji kisele strukture

unutar stanice, jača reakcija u otrovanih životinja ukazuje na acidozu unutar mišića (slika

115 i 116). Na takvim preparatima uočava se povećana aktivnost makrofaga oko

sarkoplazme, što najvjerojatnije ukazuje na njenu veću propusnost i potrebu za

fagocitiranjem sadržaja koji se ispuštau krv i međustaničnu tekućinu. Nadalje s

povećanjem doze smanjuje se koncentracija kreatinina u krvi, što može značiti da ga manje

izlazi iz mišića kao što smo već opisali ali to može znaćiti i da ga bubrezi u većoj mjeri

propuštaju iz krvi u mokraću. Bubrezi na histopatološkim preparatima pokazuju naznake

glomerularnih promjena, a da li su te glomerularne promjene takve (primjerice fenestralne

lezije) da pogoduju jačem propuštanju kreatinina trebalo bi utvrditi dokazom proteinurije,

glikozurije, aminozurije ili samim utvrđivanjem koeficijenta kreatinina (24-satna količina

izlučenog kreatinina/kg tjelesne težine). Iako je koeficijent kratinina ujedno i pokazatelj

mase mišića (2% ukupnog kratinina u tijelu=konstanta(Kaneko i sur. 1997., Fudge 2000,

Wallace-Hayes 2001, Schmidt 1968)) ovdje se radi o umjetnom patološkom stanju u kojem

oštećenje bubrega sudjeluje u mjenjanju tog koeficijenta, odnosno da je bubreg u

potpunosti zdrav (histološki preparati pokazuju suprotno) tada bi sa 100 % sigurnosti mogli

govoriti o miotoksičnosti prometrina. Ovako, uz razmatrani LDH, gore opisanu

205

Page 220: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

histopatologiju i kreatinin, mora se u razmatranje uzeti i aktivnost serumskog ALT i AST,

također markera oštećenja mišića ali i jetre. Normalno u poprečnoprugastom mišićju AST

je zastupljen gotovo u jednakoj U/g kao i LDH (od ta dva enzima jedino CK ima višu U/g).

Rezultati pokazuju da u serumu životinja otrovanih prometrinom oba enzima pokazuju

relativno mali porast aktivnosti ali je AST povišen zamjetno više od ALT koji je jedva na

pragu statistički značajnih razlika (porasta) u odnosu na kontrolu. Iako AST ima više u

jetri nego u mišićju pa taj porast isprva upućuje na oštećenje jetre (jetra sadrži gotovo

jednaku visoku koncentraciju oba enzima), ALT u mišićju ima puno manje nego u jetri pa

ako koncentracija AST raste on bi morao dolaziti iz oštećenih poprečnoprugastih mišića.

Analiza De Ritiusovog indeksa govori o jedva značajnim, sporadičnim, o dozi ovisnim

promjenama od normalnog indeksa (tj. kontrolnih životinja), a on govori o stupnju

oštećenosti hepatocita. Iako histološka slika jetre otrovanih životinja ukazuje na postojeće

atrofične ili nekrotične promjene (i u slučaju najveće doze hiperproliferaciju), toksičnost

prometrina u ovom stadiju otrovanja uglavnom se može opisati kao bilijarnom

opstrukcijom uzrokovana hepatotoksičnost. Osim slabe promjene De Ritiusova indeksa, u

prilog bilijarne opstrukcije i kolestaze ide status aktivnosti y–GT i AlP u serumu koji

pokazuju statistički značajno povećanje s obzirom na porast doze. Ako uspoređujemo

pozitivnu povezanost korelacijskih i regresijskih faktora (tablica 12) u kontrole uočavamo

da jedan i drugi dolaze u krv u jednakoj mjeri iz pripadajučih izvorišnih organa. Ta

korelacijsko regresijska veza slabi ali je još povezana u najslabije doze A (tablica 15), a

odlazi prema negativnoj vezi pri srednjoj dozi B (tablica 18). Budući da znamo da iz

korelacijskih odnosa izmjerenih vrijednosti aktivnosti i doze (slike 17 i 19) obje aktivnosti

rastu s dozom, a korelacije odlaze u negativnu povezanost, to tumačimo na način da s

porastom doze jedan od enzima raste brže, a drugi sporije (ali oba rastu). Iz tablica 17 i 19

korelativne povezanosti aktivnosti vidi se da AlP raste brže nego GGT. Biološki to znači

da AlP s porastom doze dolazi iz dugih izvora koji ne sadrže onaj prvi. Također poznato je

da u akutnom hepatičkom oštećenju jetre ALT i AST su uglavnom jako povišeni a AlP

status je nizak, dok u kroničnom tijeku bolesti jetre sa kolestazom AlP i GGT u serumu

imaju povišenu aktivnsot, a ALT i AST su samo neznatno povišeni. Rezultati ovog rada

pokazuju upravo opisanu situaciju. Aktivnost AlP (histopatološki rezultati) u hepatocitima

je relativno blago povišena, a u serumu vrlo visoka. Uz prethodno spomenuto povišenje y-

GT, to AlP potvrđuje nefrotoksično djelovanje prometrina jer povećanje oba enzima

206

Page 221: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

najvjerojatnije je posljedica oštećenja bubrega. Višoj aktivnosti AlP ovisno o porastu doze,

osim lezija bubrega i opstrukcije žučnih kanalića vjerojatno pripomažu i oštećenja

probavila koja su utvrđena histopatološkim pretragama. Metode diferencijalnog bojanja

kompleksnih ugljikohidrata, glikokonjugata (PAS, PAS+AB, PAS+D) u probavilu

izvedeno je stoga jer se pretpostavljalo da se nakon aplikacije Prometrina u kiselim

uvjetima želuca, događa reakcija s HCL-om određenog broja molekula originalnog spoja.

Iz formule prometrina vidljivo je da bi teoretski od heksanskog prstena i bočnih skupina

mogli nastati brojni spojevi bazičnog ili kiselog karaktera. Kako glikokonjugatne

molekule tj. kompleksni polisaharidi prekrivaju stanice, pa tako i epitelne stanice crijeva, i

pri tome imaju ulogu prve fronte zaštite od okolišnih uvjeta, a po karakteru mogu biti

različite pH reakcije, pretpostavilo se da će prilikom pasaže ksenobiotika i njegovih

rezidua različitog pH zaštitni “šećeri” biti “otplavljeni”. Drugim riječima ukoliko

prometrin raspadom u želucu stvori više spojeva alkalnog karaktera trebali bi biti

“otplavljeni” kiseli mukopolisaharidi (najčešće sijalinizirani proteoglikani, ali i ostali

sijaloglikokonjugati) i obratno, stvori li se više rezidua kiselog karaktera biti će otplavljeni

polisaharidi alkalnije reakcije otkrivajući sluznicu i stvarajući podlogu za razvoj stanja kao

što je čir i sl. Rezultati analize su takvi da ne možemo sa sigurnošću (zapravo gotovo

nikako) tvrditi da postoje jasne razlike između kontrole i tretiranih skupina. Možda je

razlog taj što prilikom fiksacije u 4% paraformaldehidu s PBS ti spojevi bivaju uklonjeni

iz lumena crijeva. Možda bi bilo bolje koristiti svježe smrznute kriostatske rezove bez

fiksativa. Međutim, dobro je vidljivo da žljezdasti dijelovi crijeva bez obzira na dozu i

tretman i dalje luče glikozilirane produkte, iako bismo možda ustvrdili (poglavito u

skupinama B i C) da je brojnost žlijezda povećana s obzirom na dozu te da proporcionalno

dozi postoje brojne “klasične” histopatološke promjene (apoptoza, nekroza, morfološka

promjena resica, prodiranje leukocitnog tipa stanica unutar resice, kontrakcija resica,

ljuštenje epitela i sl.). S obzirom da tijekom cijelog pokusa ipak nije došlo do drastičnog

pada tjelesne težine, ali isto tako da nije uočen proljev ili krvarenja, pretpostavljamo da je

promet hranjivih tvari, iako možda otežan (na što ukazuje pojava glikogenolize,

razmotrena dalje u raspravi), ostao stalan, a crijevo iako narušene anatomsko-morfološke

arhitekture i dalje donekle obavlja propisane fiziološke zadaće, iako rezultati

histopatologije govore da možda sistemski dolazi do hipoksije i pojave “fiziološke gladi

stanica” izravno ili neizravno uzrokovane noksom. S druge pak strane jetra pokazuje jasne

207

Page 222: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

znakove reakcije na direktno djelovanje ispitivane tvari, koji se očituju u narušenoj

biokemijsko-fiziološkoj i morfološko-anatomskoj cjelovitosti. Aktivacija i

hiperproliferacija lizosoma u hepatocita proporcionalno raste s dozama a na to ukazuju sva

provedena enzimsko histokemijska bojanja (alkalna i kisela fosfataza, nespecifične

esteraze, ScDH, LDH, NADPH). Nedvojbeno se uočava ovisno o dozi proporcionalno

povećana koncentracija glutationa (diferencijalno histopatološko bojanje na glutation) u

tkivima što se preklapa s rezultatima Maynard-ove studije o detoksifikacijskim

mehanizmima prometrina u štakora, koja govori da se u fazi II detoksifikacije glutation i

glukuronidna kiselina najviše induciraju i sudjeluju u izbacivanju metabolita prometrina

(Maynard i sur. 2000). S obzirom na gore spomenuti podatak o nemijenjanju tjelesne

težine tretiranih skupina, može se razjasniti ako se uoći da pogotovu PAS, PAS+D, LDH

bojanja jetre i LDH, i HE bojanje mišića (mišić, hemalaun-eozinsko bojenje, prima više

ljubičaste boje. To može ukazati na smanjivanje količine glikogena u stanicama

(Sandritter 1989.). Ti podaci ukazuju da se glukoza sada mobilizira iz zaliha organizma,

pa se može pretpostaviti da se jedan dio troši kao energent, zbog čega ne dolazi do pada

tjelesne težine a jedan dio te glukoze morao je biti stavljen u metabolički put sinteze

glukuronidne kiseline (konjuganta faze II detoksifikacije čiji je prekursor glukoza) jer, kao

što je prije napomenuto to je, uz glutation glavni spoj za izbacivanje metaboliziranog

prometrina iz tijela. Ako usporedimo podatak spomenut u uvodnom dijelu također iz

Maynardove studije, o vremenu izlučivanja od 48 sati (što je relativno kratko), a s obzirom

da su životinje bile izložene vrlo visokim dozama, može se zamisliti vrlo velika količina

spojeva faze II detoksifikacije koja je u stvari potrebna za tu zadaću. Zasigurno mora

postojati neki “signalni put”, metabolički induciran prometrinom, koji fiziološko

biokemijsku ravnotežu metabolizma okreće u opisanom smjeru. Jači intenzitet bojanja

Sudan B metodom ukazuje na pojačano uskladištenje masti u jetri. U citoplazmu

hepatocita uložene, crno obojane uklopine, sitnog su i dispergiranog karaktera,

raspoređene jednoliko po stanici (bez neke posebne lokacijske polarizacije), te bi se to

stanje moglo označiti kao mikrovezikularna steatoza (nisu poput one u kroničnih

alkoholičara kada su to krupne “kuglice” masti tj. klasična steatoza jetre /tzv.

makrovezikularna/). Pojavu mikrovezikularne steatoze možda bi se moglo objasniti

također pokušajem organizma da se zaštiti od toksikanta na način da liposolubilni,

nemetabolizirani originalni spoj (noksu), ali i liposolubilne metabolite nastale u

208

Page 223: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

enzimatskoj pregradnji, a koje ne može brzo izlučiti iz tijela, privremeno pokušava

uskladištiti u mastima u organizmu, između ostalog i ovdje u jetri. Odnosno, mogli bismo

predložiti sljedeći patofiziološki model metabolične okosnice jetra-mišić s porastom doze

prometrina: Metabolični putevi glukoneogeneze iz laktata, koji u većoj mjeri pristiže iz

mišića u jetru poremećeni s porastom doze u smjeru stvaranja glukoze glikogenolizom jer

glukoza iz glukoneogeneze više ne dolazi u mišić u većoj mjeri. Laktat u jetri preko

koenzima A biva preusmjereni ka stvaranju lipida (nalaz steatoze na histopatologiji)

(Kaneko i sur. 1997., Fudge 2000, Wallace-Hayes 2001, Schmidt 1968). Usporedno s

time, pogotovo na hemalaun-eozin prerezima jetre skupine A, ali i na ponekim mjestima u

jetri skupine B primjećuju se velike, kuglaste uklopine koje se ne boje Sudan B bojom, pa

rezultat ukazuje da se u tih hepatpocita javlja hidropična vakualizacija, što između ostalog

govori o poremećenom radu transportnih proteina u membrani, oštečenju Na-K pumpe i

nemogućnosti stanice da se riješi suviška vode, što je sve direktna posljedica učinka

nokse. Hidropična vakuolizacija primjećena je još i u tubularnom epitelu bubrega, također

jačine proporcionalne primljenoj dozi. Zanimljivo je da se broj Kupfferovih stanica u

skupina A i B, smanjio proporcionalno s dozom. Možemo samo pretpostavljati da li su

stradale zbog direktnog učinka nokse ili u obrani organizma.

U skupina A i B hepatociti su povećani (“napuhnuti”) čime vidno smanjuju sinusoidalne

puteve, primjetno su eozinofilniji, jezgre su piknotičke, a pogotovu u skupine B

primjećuje se na nekim mjestima «rupast» izgled tkiva. Sve to ukazuje na subakutnu

hepatičku nekrozu u skupine uzrokovanu noksom. Ovo stanje početka narušavanja

hepatičke parenhimske arhitekture moglo bi se označiti kao (pred-) ciroza.

Prema opisanim i razmotrenim rezultatima provedenog pokusa, međutim, teško bi se sa

sigurnošću moglo reći, s obzirom na mehanizam hepatotoksičnosti, u koju skupinu

hepatotoksina spada prometrin. Odnosno, da li se može svrstati u skupinu izravnih

hepatotoksičnih tvari koji uzrokuje direktne lezije hepatocita i ostalih jetrenih stanica

(poput primjerice fosforne kiseline), ili spada u drugi tip indirektnih hepatotoksina koji

interferiraju sa staničnim mehanizmom pa tako indirektno narušavaju integritet stanice

(poput anaboličkih steroida ili nekih kolestatičnih toksina, iako se iz rezultata ne vidi

kolestatični učinak nokse) ili pak djeluje prema trećem mehanizmu tako da uzrokuje

hepatocelularne nekroze preko imunološke reakcije tj. da uzrokuje tzv. imunotoksični

209

Page 224: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

“autoimuni” hepatitis (kao primjerice diuretik tienilna kiselina, antihipertenzik

dihidralazin, anestetik halotan i antidepresant iproniazid) (Descotes 1999.).

Međutim, kako Hemalaon-eozin bojenjem nije uočena inkluzija, pojačana aktivnost i/ili

nadolazak bilo kakva imunoreaktivnih stanica u jetru tj. nema izrazitog pojavljivanja

stanica imunohematopoetskog sustava, osim povremeno eritrocita na mjestima gdje su

lezije relativno jake pa je došlo do blažeg krvarenja u organu i rijetkog dispergiranog

nalaza pojedinačnih megakariocita. Prema navedenim rezultatima moglo bi se isključiti

treće navedeni model autoimune-hepatotoksičnosti nokse, jer nema vidljivog napada

stanica imunološkog sustava poput primjerice u mišićju. Pretpostavlja se da prometrin nije

hepatotoksin koji djeluje poput primjerice dihidralazina, čiji metaboliti koje stvara

citokrom P450 1A2 enzim, konjugiraju s tim enzimom, stvarajući antigen na koji

organizam reagira protutjelima. Takva protutjela u jetri vežu se i na nekonjugirani

citokrom P450 1A2, u hepatocitima uzrokujući hepatocelularne nekroze. Sličan je i

primjer tienilne kiselina, samo što metabolit konjugira s citokromom P450 2C9 (Descotes

1999.).

Naglašava se još jednom da je upravo jaka infiltracija pobuđenih imunoreaktivnih stanica

u samo tkivo, koja nalikuje upalnoj reakciji, slučaj kod hemalaun-eozinskih preparata

poprečnoprugastog mišića.

U skupini C opisane pojave hemalaun-eozin bojanja jetre manje su izražene morfološko-

anatomski, ali sva biokemijska bojanja pokazala su uvijek najizraženiju reakciju upravo u

C skupini. Kako i večina drugih, mjerenih varijabli u C skupine, rezultati izgledaju više

slični rezultatima kontrolne skupine, moglo bi se pretpostaviti na osnovu rezultata

histopatologije mozga da je za smrt jedinki skupine C uglavnom najodgovornije izravno

oštećenje mozga prometrinom koji kao liposolubilna tvar prolazi krvno-moždanu barijeru.

Uz ovu pretpostavku najbitniji drugi razlog smrti u skupini C je i jako izravno oštećenje

bubrega zbog čije disfunkcije vjerojatno dolazi do uremije, proteinurije i sličnih

poremećaja. Hemalaun-eozin preparati bubrega skupina A i B ukazuju na potencijalnu

oštećenost i morfološke promjene glomerula u skupine A i smanjen ukupan broj

glomerula u skupine B. U obje skupine uočena, s dozom proporcionalna hidropična

degeneracija/vakuolizacija stanica bubrega karakterizirana je ovdje nakupljanjem vode.

Ovo stanje moglo bi ukazivati na potencijalnu hipoksiju, toksičnu enzimatsku inhibiciju,

ili inhibiciju oksidativne fosforilacije što su najkarakterističniji poremećaji koji rezultiraju

210

Page 225: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

hidropičnom degeneracijom stanica jer uglavnom uzrokuju deficijenciju ATP, čime dolazi

do disfunkcije natrijske pumpe (Sandritter 1989. Schmidt i sur. 1997, Koolman i sur.

1996). Masa bubrega, osim u skupine C gdje rapidno opada, nepromjenjena je, čime

bismo samo mogli potvrditi naprijed iznešenu pretpostavku o glavnim uzrocima smrti u

skupini C. Karakteristično također za skupinu B je i nedostatak i/ili narušeni raspored

pojedinih stanica tubularnog epitela, ponegdje s naznakom piknoze, vjerojatno uzrokovan

odumiranjem stanica uslijed aktivne pasaže nokse i njenih metabolita.

Kako se broj uzoraka u skupini C smanjivao, odlučeno je žrtvovati preostale životinje

onda kada je smrtnost unutar skupina bila blizu 50 %, prvo kako bi se pokušalo utvrditi

koji je vitalni dio fiziologije oštećen i zašto uopće dolazi do smrti životinje i drugo jer je

procijenjeno da do kraja planiranog pokusa ne bi preživjela niti jedna životinja skupine C

pa bi bilo kakva analiza bila nemoguća. Smrću životinja u skupini C i preživljavanjem

životinja u skupini B (ali i A) još se jednom pokazalo da doza 1/10 LD 50 predstavlja

relativno dobar model u toksikološkim studijama kratkotrajne kronične izloženosti

ispitivanoj noksi, i da u kronično provedenom pokusu životinje koje primaju doze veće od

1/10 LD 50 najčešće ugibaju već nakon nekoliko tretmana.

Uočava se mobilizacija stanica imunohematopoetskog sustava ka: (1) prvo napadnutim

mjestima tj. mjestima prvog susreta s ksenobiotikom (poglavito probavilo ali i organi koji

su po funkciji prvi u klirensu otpada iz krvi kao što je to npr. slezena), ali i ka (2) mjestima

na kojima su sekundarno promijenjeni biokemijsko-fiziološki uvjeti (najjasnije se to vidi

na diferencijalnim patološko-histološkim bojanjima mišića).

Takva mobilizacija stanica imunohematopoetskog sustava možda je i glavni uzrok

naizgled supresivnom i/ili lizirajućem djelovanju preparata (s obzirom na pojedine organe)

što bi se olako moglo zaključiti, jer u pojedinim tjelesnim kompartimentima broj stanica

opada a one su možda zapravo samo translocirane na druga reakcijska žarišta, a ne i

uništene.

Tako primjerice eritrociti tretiranih skupina u odnosu na kontrolu ne doživljavaju

depresiju brojnosti, najjače izraženu u kontrolnoj skupini. Može se pretpostaviti da je šok

uzrokovan ulaskom u intenzivne, stresne postupke pokusa glavni čimbenik opadanja broja

eritrocita u kontrole. Naime, nepostojanje spomenute depresije ali i nepostojanje bitne

oscilacije u broju eritrocita u skupina A i B možda bi se moglo objasniti nastankom

hipoksičnih stanja u tkivima, i označiti kao sekundarna policitemija zbog mogućeg

211

Page 226: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

hipoksičnog stanja tkiva na koje indirektno ukazuju rezultati poput diferencijalnih

histokemijskih bojanja, poglavito mišića i jetre ali i bubrega. Hipoksija nastaje zbog

promjenjenih biokemijskih uvjeta uslijed detoksifikacije (enzimska pregradnja otrova,

konjugacije otrova i metabolita, dodatna sinteza proteina poglavito enzima koji sudjeluju u

navedenim procesima), pri čemu organizam troši dosta kisika. Također moguće je da na

neki način prometrin interferira s procesom stvaranja hemoglobina, i/ili se konjugira na

već prisutni, sintetizirani hemoglobin (ili njegove prekursore) onemogućujući njegovo

pakiranje u eritrocite. U svakom slučaju, ukoliko postoji nedostatak kisika uzrokovan bilo

kojim opisanim, predloženim modelom (a potvrdu za postojanje manjka kisika dokazuje i

naprijed opisano povečanje aktivnosti glikogenolitičkih anaerobnih metaboličnih puteva i

enzima), receptori u tijelu najvjerojatnije signaliziraju njegov manjak uzrokujući možda

kaskadnu signalnu reakciju otpuštanja faktora koji djeluju na proliferaciju i otpuštanje

eritrocita u koštanoj srži. Drugi mogući scenarij, iako manje vjerojatan, jest da ispitivana

tvar ima direktan mitogeni, proliferativni učinak na proeritroblaste i/ili stimulirajuće

djelovanje na koštanu srž na način da pomaže/olakšava otpuštanje eritrocita (jer ukupni

broj stanica koštane srži skupina A, B i C opada), premda to i nije vjerojatno jer, treba

napomenuti da prilikom analize krvi u tretiranih skupina nije uočena povećana količina

nezrelih eritrocita u krvi. Učinak prometrina na signalni put eritropoetina i/ili faktora

stimuliranja kolonija, kao tvari koja utječe na eritropoezu, ipak bismo mogli izostaviti jer

histopatološkom analizom bubrega vidi se da je bubreg jako opterećen i oštećen pa je

proizvodnja eritropoetina i faktora stimuliranja kolonija najvjerojatnije smanjena.

Iznesene pretpostavke bilo bi dobro ispitati pokusima/mjerenjima koji bi se koncentrirali

na spomenute fiziološke biomarkere.

Postoji još jedna pretpostavka, do koje dolazimo na osnovu naših rezultata analize slezene.

Naime ako slezena između ostalih funkcija služi kao deponij eritrocita a histopatološka

analiza slezene pokazuje povećanje područja u kojima prevladavaju leukocitni tipovi

stanica (plava/bijela pulpa) na uštrb područja crvene pulpe (gdje prevladavaju eritrocitni

tipovi stanica), a masa slezene u skupinama K, A i B kao i ukupna staničnost ostaje

nepromjenjena (znači da se promjenio samo omjer stanica eritrociti/leukociti), to navodi

na zaključak da su eritrociti, pod pretpostavkom da nisu lizirani, možda mobilizirani

(“istisnuti”) u krvotok pa tako njihov broj u perifernoj krvi tretiranih skupina ne opada.

212

Page 227: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Predložemo to kao najsigurniji zaključak za broj eritrocita u skupina A i B, do kojeg se

može doći na osnovi dobivenih rezultata pokusa.

Depresiju/oscilaciju broja eritrocita u skupini C (koja ovdje možda naizgled više sliči

kontroli) moglo bi se možda objasniti direktnim lizirajućim učinkom nokse zbog

promjenjenih fizikalnih, kemijskih, fizioloških i biokemijskih uvjeta u krvi (izotoničnost,

pH i sl.), koji su promjenjeni zbog prisutstva ksenobiotika i njegovih rezidua (Maynardova

studija (Maynard i sur. 1999) ukazuje da najveća količina neizlučenog prometrina ostaje

akumulirana upravo u plazmi). Druga mogućnost je poremećaj u metabolizmu

aminokiselina koje se možda mobiliziraju na puteve za sintezu detoksifikacijskih proteina

(konjugatnih molekula i enzima) kao i strukturalnih proteina za popravak oštećenih stanica

tkiva a možda se i jedan dio eritrocita zadržava u nekrotiziranim lakunama u teško

oštećenim organima (poput bubrega i jetre) i unutarnjim krvarenjima, što je vrlo često

patološko stanje pri djelovanju toksina.

Prema OECD (Organization for Economic Development and Cooperation) Guideline

407 (usvojena 27. 06. 1995., revidirana 1996.) preporučuje se u ispitivanju

imunotoksičnosti, vrijeme trajanja pokusa od 28 dana, s naglasakom na makronekroskopiju

i histološku analizu limfoidnih organa (navode se: timus, slezena, limfni čvorovi, kako oni

na putu administracije, tako i oni distalni radi analize sistemske toksičnosti). Ovoj OECD-

ovoj preporuci prethodila je ona EU iz 1983, koja je također naglasak u analizi

imunitoksičnosti davala biometrijskim svojstvima i histopatološkoj analizi limfatičnih

organa (Descotes 1999, 1988).

US EPA predlaže tzv. Tier-1 i Tier-2 approach, gdje decidirano navodi elemente analize

Tier-1 za početak ispitivanja ksenobiotika. To su: imunopatologija: hematologija (broj

stanica); ukupna težina slezene, timusa, jetre; ukupni staničnost slezene, timusa, limfnih

čvorova; histopatologija slezene, timusa, limfnih čvorova (Descotes 1999, 1988).

Povećan broj leukocita periferne krvi u svih tretiranih skupina, od kojih poglavito

(najviše) u B skupini i u mužjaka skupine A, kao i smanjenje ukupnog celulariteta

koštane srži, ukazuje na stimulativno djelovanje nokse na leukocite. Tako dobiveni

rezultati slažu se sa literaturnim podacima o imunostimulirajućem djelovanju prometrina

na imunokompetentne organe i leukocite u štakora (Giurgea i sur. 1980., 1981., Messow i

sur. 1990.,). Iako rezultati analize komet testa leukocita (tablice 24-28 i slikama 92-98)

pokazuju statistički značajna oštećenja integriteta stanične DNA sa porastom doze. Iz

213

Page 228: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

izvedenoga se vidi da prometrin ima potencijalnu mutagene sposobnosti ako na ovakvom

mišjem modelu in vivo pokazuje porast dužine repa. 14. dana pokusa uočava se značajna

razlika u jačem intenzitetu florescencije repa skupine B iC, ali dužina repa u B nije toliko

velika kao u C. Biološki bismo mogli objasniti ovu pojavu sa sitnijim i večim brojem

fragmenata DNA u repu skupiune C najveće doze 14. dana. U svih ostalih skupina 14 dana

primječuje se fragmentacija DNA. Sve vrijednosti se još više povećavaju do 28. dana.

Biološki bismo to mogli obrazložiti kao interkcijsku međuovisnost doze i vremena.

Odnosno zaključuje se da dužim izaganjem višim dozama prometrina nastaje više lomova

DNA tj baze na molekuli DNA su na više mjesta oslabljene i podložne lomovima.

Narušenim DNA integritetom očito je da su leukociti u fazi nekroze i apoptoze u većoj

mjeri nego životinje koje nisu izložene otrovu, drugim rijećima povećan broj leukocita, ali

komet metodom dokazano oštećenih, najvjerojatnije dolazi iz imunohematopoetskih

organa kako bi nadomjestio one koje su narušenog DNA integriteta i predodređene

mutaciji ili nekrotičnoj ili apoptotičnoj smrti.

Na ovom mjestu vrijedi istaknuti kako je uočeno tijekom pokusa da je večina učinaka

nokse (pogotovu smrt jedinki u ovom ali i u prethodno provedenom preliminarnom

pokusu) selektivno jače oštetila i/ili izazvala reakciju u ženskih jedinki (“otrov za ženke”).

S obzirom na rezultate o broju i DNA integritetu leukocita (čija je brojnost pri najmanjoj

dozi A, veća u mužjaka nego u ženki), mogli bismo spekulirati da je između ostalih

mehanizama detoksifikacije, povećan broj leukocita zaslužan u prevladavanju štete

uzrokovane ksenobiotikom i da utjeće na bolje šanse preživljavanja mužjaka.

Iako se teoretski predloženi scenarij o leukocitima i preživljavanju mužjaka pri

selektivnoj toksičnosti među spolovima možda može i ozbiljnije razmatrati, treba se

prisjetiti dvije čvrsto dokazane činjenice: (1) Timbrell u Principima biokemijske

toksikologije u poglavlju Imunotoksikologija u kojem raspravlja o ovisnosti jačine doze

ispitivanog ksenobiotika i jakosti imunološkog odgovora naglašava da u pravilu, zbog

prirode imunološke reakcije ne postoji korelacija jačine imunog odgovora i doze

(“…There is usually no dose-response relationship for immune responses, as the

magnitude of the response is dependent on the type of reaction of the endogenous immune

system, not on the concentration of the foreign compound…” Odnosno u slobodnom

prevodu jačina imunog odgovora ne ovisi o dozi i koncentraciji strane tvari (Timbrell

2001.); Mada, Timbrell u toj svojoj tvrdnji nije u potpunosti isključiv, stoga pretpostavka

214

Page 229: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

predložena s naše strane možda i ima logike. S druge pak strane, nasuprot tvrdnji

Timbrell-a, rezultati imunotoksikoloških studija Springer i sur. (Springer i sur. 1986a,

1986b, 1983) (! Na mišu, ali različite vrste pesticida) kao i Messow (Messow i sur. 1990)

(! prometrin, ali na štakoru) pokazuju proporcionalnu ovisnost doza toksikanta naprama

broj leukocita i odgovora na poznate mitogene ili ovisnost doza toksikanta (prometrin)

naprama broj leukocita i količina opsonizanta CRP (C-reaktivnih proteina.) u radu

drugospomenutog autora; (ii) nadalje ne smijemo zaboraviti na interakciju biokemijskih

činilaca (receptora, hormona, prekursora hormona itd) spolnog endokrinog sustava koja se

najbolje vidi u brojnim radovima naših autora Kniewaldovih i njihovih suradnika (Težak i

sur. 1992, Kniewald i sur. 1983, 1979, 1995), iz kojih proizlazi da je prometrin jedan od

ometača endokrinog sustava/“endokrini disruptor”.

Poremećaji i pad vitatliteta koji slijedi do kraja pokusa, potencijalno se objašnjava općom

sistemskom poremećenošću i oštečenjima cijelog organizma, pri čemu kondicioni pad, a

ne ksenobiotik direktno, uzrokuje nemogućnost kompenzacije meatabolizma ali i

leukocitnih i stanica imunohematopoetskih stanica uz istovremeno odumiranje starih

leukocitnih i drugih stanica.

Najzanimljivija je činjenica pri analizi pojedinog tipa leukocita (DKS) kontinuirani

porast broja bazofila do kraja pokusa u svih tretiranih skupina kao i zamjena omjera malih

i velikih limfiocita u skupini C u odnosu na ostale tretirane skupine.

Vjerojatno se radi ili o sporijoj dinamici oscilacije bazofila tako da je kretanje njihove

brojnosti jednako ostalim tipovima stanica leukocita ali se “pik” postiže sporije (sa sedam

dana pomaka) pa uslijed kraja pokusa ne vidimo pad k/ili ispod početnih vrijednosti

sedmog dana pokusa a on bi možda također uslijedio kao i u ostalih tipova stanica da se

pokus produljio ili se možda ipak radi o specifičnoj reakciji na stimulaciju proizvodnje

bazofila uzrokovanog noksom.

Ukoliko je drugo spomenuti slučaj istinit a s obzirom na ulogu bazofila u lučenju

poglavito heparina ali i histamina, bradikinina, serotonina, lizosomskih enzima i

anafilaksijskih tvari sporog djelovanja, možemo pretpostaviti da dolazi do jakih tkivnih

reakcija obostrano uzrokovanih noksom i izlučevinama bazofila pa bi se takav novonastali

učinak možda mogao označiti kao sličan pseudo-alergijskoj manifestaciji, koji se pojačava

s vremenom trajanja pokusa. Odnosno, želi se reći, ukoliko povećanje broja bazofila

215

Page 230: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

nazovemo kao pseudo-alergijskoj reakciji sličnom učinku, onda je ona najjače izraženija

sekundarno u drugoj polovini pokusa (14.-28. dan).

Dakako treba istaknuti istovremeno izrazito snažno pojavljivanje imunokompetentnih

stanica u tkivima (hemalaun-eozina mišića i probavila), što je definitivno učinak sličan

vrlo jakoj upalnoj reakciji.

Drugi primarni limfoidni organ, timus, u uvjetima provedenog pokusa nije ukazao na vrlo

jaku promjenu mjerenih varijabli koje bi se mogle pripisati djelovanju ksenobiotika, iako

neke toksikološke studije ukazuju na česte promjene biometrijskih osobina timusa uslijed

djelovanja različitih pesticida najčešće kao kompenzacijskog mehanizma za nadoknadu

funkcije koštane srži (Springer i sur. 1986a, 1986b, 1983, Ulm 1994).

Moglo bi se reći da je u uvjetima ovog pokusa prometrin djelovao na timus stimulirajuće u

skupina A i B (iako se staničnost povećava a masa smanjuje, koje bi bilo pravo

objašnjenje ove pojave, neznam, iako mogu spekulirati da se radi o kombiniranoj pojavi

hiperplazije s istovremenom volumnom atrofijom svih prisutnih stanica).

Analiza rezultata protočne citometrije timocita anexinom V-FITC i PI pokazuje da u

skupini C dolazi do značajne promjene omjera vitalnih, nekrotizirajućih i apoptotičnih

stanica stanica ali ne dolazi do ikakvih promjena u težini ili celularitetu timocita. Naime

sve opisane stanice su još uvijek žive ali se povečao broj onih koje se spremaju ući u

nekrozu ali i oni koje namjeravaju ući u apoptozu. Dakle, duža izloženost visokim dozama

prometrina mogla uništavati timusne stanice u mladih jedinki uzrokujući dalekosežne

posljedice na buduću spremnost imunološkog sustava za susret sa patogenima. Analiza

protočne citometrije dala je posebno zanimljive rezultate na splenocitima. Naime u slezeni

je održan status vitalnosti stanica kao i u kontrole što znaći da u usporedbi s

histopatološkim rezultatima najvjerojatnije dolazi do repopulacije slezene ili

hiperproliferacije novim stanicama koje održavaju omjer apoptotičnih, nekrotićnih i

vitalnih u razini sa neotrovanim životinjama dakle sa normalnim stanjem.

Sekundarni limfatični organi limfni čvorovi, pokazuju reakciju, što bi moglo značiti da se

ksenobiotik i njegovi metaboliti (najvjerojatnije prisutni kao hapteni) šire i limfom.

Iako postoji preporuka (!ali ne i pravilo) da se pri oralnoj administraciji za analizu uzmu

neki limfni čvorovi koji se nalaze na direktnom putu prolaska otrova (primjerice

mesenterički limfni čvorovi) (Descotes 2001.), za analizu u ovom pokusu namjerno su

uzeti periferni, dormantni limfni čvorovi, daleko od direktnog puta širenja otrova, kako bi

216

Page 231: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

se otkrila sistemska toksična priroda ispitivanog spoja, dakako histopatološki analizirana

su i limfatička tkiva probavila (GALT, MALT), koja se nalaze izravno na putu prodiranja

otrova, pri čemu je pokazano da je reakcija na ksenobiotik jaka poglavito u crijevu, što je

već spominjano u raspravi.

U analiziranim aksilarnom i brahijalnom limfnom čvoru, dolazi do povećanja, kako mase

tako i celulariteta, tj. zaključuje se da je također potaknuta imunološka reakcija.

S obzirom na to koliki je ukupni maseni udio retikuloendotelnog tkiva, odnosno samo

limfnih čvorova u pojedinoj jedinki, dolazimo do zaključka da je takva promjena izuzetno

značajna i spada u teže patofiziološke lezije uzrokovane prometrinom. Protočna

citometrija pokazuje u stanica limfnog čvora isti trend kao i u timocita, tj da najmanje

doze više podstiću apoptozu a najveće doze nekrozu. Biološko značenje ovih podataka je

takvo da je prometrin potencijalni signalni faktor ili podstrekać lučenja mnogih

apoptotičnih signalnih molekula za ulazak stanica imunološkog sustava u apoptozu.

Ekotoksikološki je ova spoznaja vrlo bitna za zdravlje čovjeka, jer je on tijekom duže

vremena izložen manjim dozama koje onda bez vidljivih patoloških promjena (kao što to

rade nekrotične smrti stanica), potiho desetkuje obrambene elemente imunološkog sustava

apoptozom-programiranom smrću.

S obzirom na ispred navedenu raspravu o rezultatima analize učinaka prometrina na

kvantitativne i kvalitativne sastavnice imunohematopoetskog sustava (uglavnom

biometrijske, a ne funkcijske biomarkere), te s obzirom da se radilo o visokosrodnim,

singeničnim životinjama istog soja i istovrsne dobi, sumarno bi se ukratko moglo reći da

prometrin potstiče reakciju imunokompetentnih struktura (imunostimulant), indirektnim

mehanizmom ubijanja stanica, tjerajući imunohematopoetske organe i tkiva da

repopuliraju održavanjem homeostaze, narušavajući s vremenom njihov ustroj,

funkcionalnu morfologiju, a time i fiziološku ulogu (imunosupresor). i stoga (indirektno, u

kasnijim fazama kronične izloženosti), iscrpljuje organizam i umanjuje mu

imunokompetencije.

U buduću analizu također obvezno treba uključiti i druge organe poput primjerice kože,

pluća ili srca i njihove specifične biokemijske krvne parametre.

Interesantno bi bilo većinu budućih pokusa provesti na neuronima, perifernom i

centralnom živčanom sustavu. Također treba provesti još neka diferencijalno-

217

Page 232: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

histokemijska bojenja, poput primjerice amiloidnog bojanja (dokaz amiloidoze, pogovu

primjerice u mozgu, radi mogućih implikacija Alzheimerovoj bolesti sličnog učinka) ili

primjerice lipofuscinskog bojenja (pogotovu na srcu i/ili mišićima).

Guilyanovim bojenjem primjerice trebalo bi pokazati intenzitet oštećenosti živčanih

vlakana, jer prema kemijskim svojstvima, ali i prema Hemalaon-eozinskim preparatima

mozga skupine C, očito je da prometrin prolazi krvno-moždanu barijeru uzrokujući lezije i

najvjerojatnije nekrotične smrti neurona.

Posebnu pozornost također u budućim pokusima trebalo bi posvetiti poprečnoprugastim

mišićima na način da se elektroforezom mišićnih proteina, elektroforetskom i

imunokemijskom analizom kliničke enzimologije, monoklonalnim protutjelima na

kriostatskim rezovima ili nekom od imuno blot-metoda pokažu točnije i pobliže

biokemijske promjene na koje ukazuju rezultati ove studije.

218

Page 233: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

6. ZAKLJUČAK

219

Page 234: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

6. ZAKLJUČAK

Temeljem rezultata pokusa subkronične izloženosti mužjaka i ženki miševa prometrinu,

iznosimo slijedeće zaključke:

Prometrin, apliciran per os u dozama od 185 mg/kg, 375 mg/kg i 555 mg/kg, tijekom 28

dana svakih 48 utječe na metabolizam. Proporcionalno s dozom povećava se serumska

aktivnost LDH, y-GT, AlP, smanjuje se koncentracija kreatinina, a vrlo blago ali značajno

raste aktivnost AST i nešto manje aktivnost ALT. De Ritiusov se koeficijent s dozom

bitno ne mijenja.

Status istih enzima u organima mijenja se sa rastućom dozom, proporcionalno za LDH

u poprečnoprugastom mišićju a obrnuto proporcionalno u jetri. S porastom doze u jetri

proporcionalno raste aktivnost sukcinat-dehidrogenaze, esteraze i kisele-fosfataze i

umjereno AlP. Proporcionalno s dozom raste i koncentracija glutationa. U jetri narušava

biokemijsku ravnotežu uzrokujući promjene u metabolizmu ugljikohidrata, te nastaje

mikrosteatozna masna degeneracija i hidropična vakuolizacija unutar hepatocita. Također

unutar jetre narušena je lobularna strukturalna uređenost uzrokovana nekrotičnim

propadanjem hepatocita, a najvjerojatnije nastaje i bilijarna opstrukcija. U bubregu

prometrin uzrokuje lezije pojedinih glomerula i ispunjenost pojedinih glomerula krvlju. U

tankom crijevu uzrokuje propadanje crijevnog epitela i morfološke promjene crijevnih

resica. U mišićju narušava biokemijsku ravnotežu.

Prometrin naročito u prva dva tjedna izloženosti uzrokuje smanjenje broja eritrocita i

povećanje broja leukocita u perifernoj krvi. Među leukocitima mjenja se omjer pojedinih

tipova stanica od kojih se najveće povećanje broja bilježi među bazofilima, a najveće

smanjenje broja među limfocitima. Rezultati analize komet testa leukocita pokazuju

statistički značajna oštećenja integriteta stanične DNA, karakterizirana povećanom

lomljivošću DNA molekule sa porastom doze. Iz navedenoga se vidi da prometrin ima

potencijalne genotoksične sposobnosti proporcionalno porastu doze i vremenu izloženosti,

iako u nijedne životinje nisu nađene neoplastične tvorbe.

220

Page 235: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Nadalje, povećava se broj limfocitnih stanica u različitim tkivima. Do hiperplazije i

infiltracije imunokompetentnih stanica dolazi u tankom crijevu, poprečnoprugastom

mišićju i slezeni gdje je naročito narušena histološka građa, iako je u njoj broj stanica

nepromjenjen, a prisutne stanice nisu u apoptotičnim ili nekrotičnim fazama. Najmanje

doze više podstiću apoptozu, a najveće doze nekrozu u stanica limfnog čvora i u timocita.

Zaključno moglo bi se govoriti o prometrinu kao o otrovu koji ima imunotoksični,

hematotoksični, hepatotoksični, nefrotoksični, genotoksični i nadasve miotoksični učinak.

221

Page 236: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

7. LITERATURNI IZVORI

Page 237: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

LITERATURNI IZVORI Alnemri ES, Litwack G(1989) Glucocorticoid - induced lymphocytolysis is not mediated by an induced endonuclease. J. Biol. Chem. 264: 4104-4111.

Arnold M (1968) Histochemie-Einführung in Grundlagen und Prinzipien der Methoden. Springer-Verlag (ed) Berlin, Heidelberg, New York. Bacci G, Ferrari S, Longhi A (1999) Prognostic significance of serum LDH in Ewing Sarcoma of bone. Oncologic reports 6: (4), 807-811. Baratov KB (1979) Dependence of some trace element levels in vegetable products on the application of herbicides in the Tadzhik SSR. Gig. Sanit. 44: (8), 77-78. Baratov KB, Redler IO, Danilova RV, Usmanov UM, Makhmudov DM, Rasulov A, Ergashev AE, Osmanov U (1981) Zavisimost' soderzhaniya nekotorykh mikroelementov v vinograde i abrikosakh ot vida, dozirovki gerbitsidov. [Relationship between the type and dose of herbicide and the content of certain trace elements in grapes and apricots.] Vopr. Pitan. 2: 66-68.

Bardalaye PC, Wheeler WB (1985) Capillary gas chromatographic determination of prometryn and its degradation products in parsley. J. Assoc. off Analytical Chemistry: 68: (4), 750-753. Beard J (2005) DDT and human health. Science of the total enviroment. In press.1-12. Bengtsson GB, Karlsson BW (1980) Ontogenetic Changes in lactate dehydrogenase and malate dehidrogenase isozyme patterns of the mongolian gerbil as compared with the rat mouse and rabbit. Comparative Biochemistry and Physiology: Part B: 32-34. Berg M, Müller SR, Schwarzenbach RP (1995) Simultaneous determination of triazines including atrazine and their major metabolites hydroxyatrazine, desethylatrazine, and deisopropylatrazi-ne in natural waters. Analytical Chemistry 67: (11), 1860 -1865. Berlin A, Dean J, Draper MH, Smith EMB, Spreafico F (1987) Immunotoxicology-Proceedings of the international seminar on the immunological system as a target for toxic damage, present status, open problems and future perspectives. UNEP, ILO, WHO-IPCS, Commission of the EC, Martinus Nijhoff Publishers, Int. 267

223

Page 238: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Bester K, Huehnerfuss H (1996) Triazine herbicide concentrations in the German Wadden Sea. Chemosphere 32: (10), 1919-1928.

Bezuglov VG, Minenko AK, Postoeva RA (1976) Herbicides in crop rotation and soil microflora. Khim. Sel. Khoz 14: (12), 45-49. Blake NM, Kirk RL, Pryke E, Sinnett P (1968) Lactate dehydrogenase Electrophoretic Variant in a New Guinea highland population. Science 207: 701-702. Böcher M, Giersch T, Schmid RD (1992) Dextran, a heptan carrier in immunoassays for s-triazines, a comparison with ELISAs based on hapten-protein conjugates. Journal of Immunological Methods 151: 1-8. Böcher M, Sorensen K (1994) Direct couplingof an atrazine analogue to microtiter plates for a competitive immunoassays for s-triazines. Food and Agricultural Immunology 6: 155-161. Bognar A (1977) Culinary reduction or elimination of pesticide residues from edible plant products. Dtsch. Lebensmittel-Rundschau 73: (5) 149-157. Boscolo P, Carmignani M, Sacchettoni-Logroscino G, Carelli G, Bernardini P (1982) Chronic exposure to arsenic in rats: morphological and functional findings. Giornale Ital. Med. Lav. 4 (4-5): 169-174. Boyer SH, Feiner DC, Watson-Wiliams EJ (1963) Lactate dehydrogenase variant from human blood: evidence for molecular subunits. Science 141: 642-643. Brain RT, Davenport-Kay H (1927) Kidney phosphatase.II the enzyme in disease. Biochemical Journal 21: 1104-1108. Burkhart JG, Benziger J, Svensson K, Malling HV (1985) An evaluation of heterologous antibodies to lactate dehydrogenase-C in the detection of mutation. Mutat Res 148 (1-2): 135-149. Capsoni S, Ruberti F, Daniel ED, Cattaneo A (2000) Muscular dystrophy in adult and aged anti-NGF transgenic mouse resembles an inclusion body myopathy. Journal of Neuroscience research 59: 533-560. Chandra J, Samali A, Orrenius S (2000) Trrigering and modulation of apoptosis by oxidative stress. Free Rad. Biol. Med. 29: 323-333

Chayen J, Bitensky L (1991) Practical Histochemistry, John Wiley & Sons, (ed) Chichester England. 258.

224

Page 239: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Chiba M, Maley MA, Klein-Szanto AJ (2005) Sequental study of gamma-glutamyltransferase during complete and two-stage mouse skin carcinogenesis. Cancer Research 46: (1), 259-263. Chikhi N, Holic N, Guellaen N, Lapareche Y (1999) Gamma-glutamyl transpeptidase gene organisation and expression: a comparative analysis in rat, mouse, pig and human species. Comp. Biochm. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 122: (4) 367-380. Clampitt RB, Hart RJ (1978) The tissue activityes of some diagnostic enzymes in ten mammalian species. Journal of Comparative Pathology 88: (4), 607-621. Cruz OOJD, Waurzyniac B, Uckun FM (2004) A13-week subchronic intravaginal toxicity study of Pokeweed antiviral protein in mice. Phytomedicine 11: 342-351. Constantinou A, Mehta R, Runyan C, Rao K, Vaughan A, Moon R (1995) Flavonoids as DNA topoisomerase antagonists and poisons: structure-actyvity relationships. J. Nat. Prod. 58: 217-225.

Dawson J, Smith GD, Boak J, Peters TJ (1979) y-glutammyltransferase in human and mouse breast tumors. Clin. Chem. Acta 96: (1-2) 37-42. Descotes J (1988) Immunotoxicology of drugs and chemicals. Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division), Int. 189.

Descotes J (1999) An Introduction to Immunotoxicology. Taylor and Francis Int. (ed) 211. Di Fiore MSH (1967) An Atlas of Human Histology. Lea & Febriger (ed) Philadelphia 346. Dinerman AAJR, Lavrent'eva NAJR, Ill'inskaia NAJR (1970) The embryotoxic action of some pesticides. Gigiena and Sanit. 35: (7): 39-42. Dinerman Lavrent'eva NA AA (1969) The toxicity of the herbicides propazine and prometryn. Gigiena i Sanit 34: (3) 94-96.

Doening CB, Parker ET, Nicholas EC, Lollar P (2003) Decreased factor VIII levels during acetaminophen-induced murine fulminant hepatic failure. Blood, 102: (5) 1743-1745.

225

Page 240: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Egert G, Greim H (1976) Formation of mutagenic nitroso-compounds from ephedrine and from the pesticides carbaryl, dodin, and prometryn in the presence of nitrite at pH 1. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 293 (Suppl.): R66. Egert G, Greim H (1976) Formation of mutagenic N-nitroso compounds from the pesticides prometryne, dodine and carbaryl in the presence of nitrite at pH 1. Mutat Res. Nov; 37: (23) 179-186. EPA-Health effects test guidelines OPPTS 870.7800. Immunotoxicity. Public Draft EPA 712-C-96-351, USA; 1996.

EPA-IRIS (Integrated Risk Information System)-Prometryn. CASRN 7287-19-6. http://www.epa.gov/ngispgm3/irissubst/0258; 2001.

Fairbain DW, Olive PL, O`Neill KL (1995) The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research 339: 37-59. Ferrandina G, Almadori G, Maggiano N, Lanza P, Ferlini C, Cattani P, Piantelli M, Scambia G, Ranelletti FO (1998) Growth-inhibitory effect of tamoxifen and presence of tipe II estrogen binding sites in human laryngeal cancer cell lines and primary laryngeal tumors. Int. J. Cancer. 77: 747-754.

Fiveland TJ (1977) Residues of linuron and prometryne in carrots and decom position in soil in Southern and Northern Norway. Forsk. Fors. Landbruket 28: (4) 345-363. Franković M (1990) Učinak hormonskog herbicida 2,4-D (2,4-diklorfenoksioctena kiselina) na enzimatsku aktivnost u štakora. Zavod za animalnu fiziologiju, Biološki odsjek, Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu. Zagreb. 63 Fudge AM (2000) Laboratory Medicine, Avian and Exotic Pets. W. B. Saunders Company International. 295. Gabrilevskaia LN, Laskina VP (1972) Conditions for disposal of effluents from prometryne production into bodies of water. Gig Sanit 37: (3) 18-21. Gammon DW, Aldous CN, Carr WC, Snaborn JR, Pfeifer KF (2005) A risk assesment of atratine use in California: human health and ecological aspects. Pest management science 61: (4) 331-335.

226

Page 241: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Galati G, Teng S, Moridani MY, Chan TS, O'Brien PJ (2000) Cancer chemoprevention and apoptosis mehanisms induced by dietary polyphenolics. Drug. Metabol. Drug. Interact. 17: 311-349.

Ghinea E, Simionescu L, Oprescu M (1980) Studies on the action of pesticides upon the endocrines using in vitro human thyroid cells culture and in vivo animal models. II. Herbicides-prometrin and terbutrin. Endocrinologie 18: (3) 167-173. Giardina MC, Buffone R (1977) Pathway of initial prometryn degradation by a soil bacteria. Chemosphere 6: (9) 589-594.

Giersch T, Hock B (1990) Production of monoclonal antibodies for the determination of s-triazines with enzyme immunoassays Food Agric Immunol 2: (2). 85-98. Giurgea R (1979) Reaction to atrazine and prometryne in the thymus of white Wistar rats. Stud Cercet Biol; 31: (2) (RECD. 1980). 119-122. Giurgea R, Borsa M, Bucur N (1981) Immunological reactions of Wistar rats following administration of atrazine and prometryne. Arch Exp Veterinarmed 35: (6) 811-815. Glasnik zaštite bilja-glasilo sekcije za biljnu zaštitu Hrvatskog agronomskog društva 2-3, 2000. 123-125. Zadružna štampa d.d., Zagreb. 2000. Glavač V (2001) Uvod u globalnu ekologiju. Hrv. Sveučilišna naklada, Zagreb. 163. Gopal DV, Rosen HR (2000) Abnormal findings on liver function tests-Interpreting results to narrow the diagnosis and establish a prognosis. The Practical Peer-reviewed Journal for Primary Care Physicians 107: (2) 1-12. Gordienko NI (1977) [Hygienic establishment of the maximum permissible concentration of the herbicide, prometryne, in soil] Gig Sanit. (1): 22-25. Greim H, Bimboes D, Egert G, Goggelmann W, Kramer M (1977) Mutagenicity and chromosomal aberrations as an analytical tool for in vitro detection of mammalian enzyme-mediated formation of reactive metabolites. Arch Toxicol. 39: (1-2):159-169. Guppy LJ, Littleton JM (1999) Incrsed sensitivity to dammging effects of hypoxia and anoxia of isolated hearts from rats after prolonged exposure to ethanol: apparent protection by nitrendipine. Journal of cardiovascular Pharmacology 34: (5) 628-634.

227

Page 242: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Gzhegotskii MI (1968) Changes in the peripheral blood under the acute and chronic action of anti-Gramineae herbicides which act via the roots. Gigiena Truda i Prof. Zabolevaniya 12: (12) 42-43. Hakenberger - Kutuzović (2001) Optimizacija praćenja modela onečišćenja voda pomoću molekularnih biljega u riba. Doktorska disertacija. Poslijediplomski studij prirodnih znanosti. Biološki odsjek, Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu. Zagreb. 169. Handy RD, Abd El- Samei HA, Bayomy MFF, Mahran AM, Abdeen AM, El-Elamy EA (2002) Chronic diazinon exposure: pathologies of spleen, thymus, blood cells and lymph nodes are modulated by dietary protein or lipid in the mouse. Toxicology 172: 13-34. Haukić S, Kosuta D, Muminhodžić K (2005) Comparison of postoperative hepatic funcion between laparoscopic and open cholecystoctomy. Med. Princ. Pract. 14: (3) 147-150. Haussler MR, Nagode LA, Rasmussen H (1970) Induction of intestinal brush border alcaline phosphatase by vitamin D and identity with Ca-ATP-ase. Nature 28: (19) 1199-1201. Heinisch E, Reifenstein H (1971) Herbicide residues in foods of vegetable origin. Ernaehrungsforschung 16: (4) 605-615. Hirano S (1996) Evolution of pulmonary toxicity of heavy metal componds. Nippon Eiseigaku Zasshi 50: (6), 1013-025. Howard J, Worman MD (2005) Common laboratory tests in liver diseases. http://cpmcnet.columbia.edu/dept/gi/labtests.htm/. 1-3. http://dir.niehs.nih.gov/dirlep/Webpacages/assytxt.htmlClinicalchemistry2005 The significance of creatinine in renal desease (2004) http://rnceus.com/renal/renalcreat.html 2004 Clinical chemistry of LDH, GGT, ALP, AST, ALT(2005) http://marvester 2005 Hulin N, Henis Y, Horowitz M (1973) Microbial degradation of prometryne in soil. Phytoparasitica1 (1) 65. Inui T, Nakashima H, Habu Y, Nakagawa R, Fukasawa M, Kinoshita M, Shinomya N, Seki S (2005) Neutralization of tumor necrosis factor abrogates hepatic failure induced by α-galactosylceramide without attenuating its antitumor effect in aged mice. Journal of Hepatology in press. 1-10.

228

Page 243: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Ivanova Ye P, Nekrasova AS, Bakanov Sh A, Mayorova R I (1973) The efficacy of prometryne for weed control in carrot cultivation and its residues occurring in the crop and soil. Khim. Sel. Khoz. 11: (7) 541-543. Iwangoff P Armabruster R, Enz A, Meier-Ruge W (1980) Glycolitic enzyms from human autoptyc brain cortex: normal aged and demented cases. Mech. Ageing. Dev. 14: (1-2) 203-209. Jaeger JJ, Hedegaard H (2002) About blood tests. The Danish Hepatitis C web site. http://home3.inet.tele.dk/omni/attest.htm/. 1-15. James RW (1993) The relevance of clinical pathology to toxicology studies. Comparative haematology int. 3, 190-195. James RW (1999) Preclinical testing of antibodies safty aspects. In: Biotechnology, ed. Rehm HJ, Reed G in cooperation with Puhler A and Stadler P. Wiley-VCH, WeinheimFR Germany, 5a, 304-309. Kalender S, Ogutcu A, Uzunhisarcikli M, Acikgoz F, Durak D, Ulusoy Y, Kalender Y (2005) Diazinon-induced hepatotoxicity and protective effect of vitamin E on some biochemical indices and ultrastructural changes. Toxicology in press, 1-10. Kamrin MA, Montgomery JH (2000) Agrochemical and pesticide desk reference. CD-ROM, Chapman & Hall CRC net BASE, Int. Kaneko JJ, Harvey JW, Bruss M L (1997) Clinical Biochemistry of Domestic Animals; Academic Press Int. 789. Kavolyunayte IA, Shpokauksas AK (1974) Prometryn residues in potatoes and soil. Khim. Sel. Khoz. 12 (1): 54-57. Kawagoe M, Hirasawa F, Wang CS, Liu Y, Ueno Y, Sugiyama T (2005) Orally administrated rare earth element cerium induces metallothionein synthesys and increases glutathione in the mouse liver. Life Sciences in press. 1-16. Khan MS, Sobti RC, Kataria L (2005) Pesticide induced alteration in mice hepato-oxidative status and protective effects of black tea extract. Clinica Chimica Acta in press. 1-8. Kniewald J, Kniewald Z (1983) Effects Of S-Triazine Herbicides On The Mode Of Androgen Action On Calf Pituitary. Periodicum Biologorum 85 Supplement 1: 115-121.

229

Page 244: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Kniewald J, Mildner P, Kniewald Z (1979) Effects of s-triazine herbicides on hormone-receptor complex formation, 5 alpha-reductase and 3 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase activity at the anterior pituitary level. J Steroid Biochem. 11: (1C) :833-838. Kniewald J, Osredecki V, Gojmerac T, Zechner V, Kniewald Z (1995) Effect of s-triazine compounds on testosterone metabolism in the rat prostate. J Appl Toxicol. 15: (3) 215-218. Koolman J, Röhm KH (1996) Color Atlas of Biochemistry. Thieme International. Kopperschlager G, Kirchberger J (1996) Methods for the separation of lactate dehydrogenases and clinical significance of the enzyme.Journal of chromatography B. Biomed Appl. 20: 684 (1-2), 25-49. Kruse - Jarres J (1979) Klinische chemie,Band II, Yspezielle klinish-chemishe analytik. Moderne Laborpraxis, Gustav Fisher Verlag. Stuttgart. 288. Kulakov AE (1970) Cytogenetic analysis of bone marrow cells in rats under the action of herbicides from the s-triazine group. Farmakol. and Toksikol. 33: (2), 224-227. Larsson NG, Oldfors A (2001) Mitochondrial myopathies. Acta Physiology Scandinavica 171: 385-393. Lee G, Luna H T (1970) Manual of histologic staining methods of the armed forces institute of pathology. McGrow-Hill book Company, Int.(ed) Leh B, Žinko B, Narat M, Marinšek-Logar R (2005) Monitoring of genotoxicity in drinking water using in vitro comet assay and Ames test. Food Technology and Biotechnology 43: (2) 139-146. Li S, Zhou W, Dogilo L, Goldberg E (1998) Transgenic mice demonstrate a testis specific promoter for lactate dehydrogense, LDHC, The Journal of Biological Chemisty 273: (47) 31191-31194. Li Shoei - Lung S (1998) Structure, regulation and evolution of vertebrate lactate dehydrogenase genes. Zoological studies 37: (1) 1-6. Li Shoei - Lung S, Feldmann RJ, Okabe M, Pan YCE (1983) Molecular features and imunological properties of lactate dehydrogenase C4 isozymes from mouse and rat testes. The Journal of Biological Chemstry 258: (11) 7017-7028.

230

Page 245: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Madar I, Giurgea R (1981) The effect of Atrazine and Prometryne on the glucose consumption and the insulin-sensitivity of diaphragms of white rats. Stud Cercet Biol Ser Biol Anim; 33: (2). (RECD. 1982). ) Mady EA (2002) Antitumor and biochemical effect of Echis coloratus crude venom on Ehrlich ascites carcinoma cells in vivo. Journal of Venomous Animals and Toxins 8: (2) 1-8. Martynyuk VZ, Gzhegotskii MI, Shtabskii BM (1970) A sanitary-toxicological characterization of the herbicide Prometryne. FAKT VNESHN SREDY ZNACHENIE ZDOROV'YA NASE (2): 64-69.

Maryanska-Nadachowska A (1980) The effect of a pesticide, Gesagard 50, on regeneration of the endbrain of Xenopus laevis (Daud.) Tadpoles. Folia Biol (Krakow) 28: (4) 375-389.

Masatoshi I, Akihiro Y, Akihiro H, Kaneoka Y (1998) LDH to AST ratio in biliary pancreatitis-a posible indicator in pancreatic necrosis: preliminary results. The American Journal of Gastroenterology 93: (3), 363-367. Matsusawa T, Nomura M, Unno T (1993)Clinical pathology reference ranges of laboratory animals. Working group II, nonclinical safty ealuation subcomittee of the Japan Pharmaceutical manufactures assotiation. J. Vet. Med. Sci. 55: (3)351-362. Maynard M S, Brumback D, Itterly W, Capps T, Rose R (1999) Metabolism of [(1)(4)C] prometryn in rats. Journal of Agricultural food and Chemistry 47: (9): 3858-3865. Mays ET (1975) Physiologic consequences of hepatic lobectomy in man. South Medical Journal 68: (4), 399-406. McClure D (1999) Clinical pathology and sample collection in the laboratory rodent. Vetrinary Clinics of North America: Exotic Animal Praxis 2: 3, 565-589. Messow A, Benkwitz F, Hellwig A (1990) Studies on the toxicity of a prometryne and simazine combination in lactating rats. z gesamte hyg grenzgeb 36: (3) 170-173. Moses GC, Henderson AR (1987) Incrised serum lactate dehydrogenase isoenzyme 1 and «flipped» LD-1/LD-2 ratio in myopathy associated with partial carnitine palmytoyltransferaze deficiency. Clinical Chemistry 33 (11), 2111-2113.

231

Page 246: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Naz RK, Vanek MC (1998) Testis-specific proteins and their role in contraceptive vaccine development. Frontiers in bioscience 3, 39-48. Niida S, Kwahara M, Ishizuka Y, Ikeda Y, Konodo T, Hibi T, Suzuki Y, Ikeda K, Taniguchi N (2004) y-glutamyltranspeptidase stimulates receptor activator of nuclear factor κB ligand expression independent of its enzymatic activity and serves as pathological bone-resorbing factor. The Journal of Biological Chemistry 279: (7) 5752-5756. Olive PL. (1999) DNA damage and repair in individual cells: applications of the comet assay in radiobiology. International Journal of Radiation Biology 75: (4) 395-405.

Olsson PG, Tsjuioka H, Narisawa S, Goldberg E, Millan JL (2003) An abundance of repetitive sequence elements in the mouse testis specific lactate dehydroenase gene. Journal of andrology, 24: (6) 918. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. (2001.) Ur.: Smith A. D. Butler and Tanner Ltd., Great Britain. Park B, Jeong SK, Lee WS, Seong JK, Palk YK (2004) A simple pattern clasification method for alcohol responsive proteins that a differentialy expressed in mouse brain. Proteomics 4: 3369-3375. Pavelić J, (1977) Kvantitetne i kvalitetne promjene hematopoetskih stanica miševa s aplastičnim karcinomom. Magistarski rad, Zavod za animalnu fiziologiju, Zagreb. 73. Perez DO, Krutzik PO, Nolan PG (2004) Flow cytometric analysis of kinaze signaling cascades. In: Methods in Molecular Biology: Flow cytometry Protocols 2nd edition. ed. Hawly TS & Hawly RG. Humana Press Inc., Totowa, NY. 67-93. Pratt DS, Kaplan MM (2000) Evaluation of abnormal liver enzyme results in asymptomatic patients. The New England Journal of Medicine. 342: (17), 1266-1271. Piperakis SM, Visvardis EE, Tassiou AM. (1999) Comet assay for nuclear DNA damage. Methods in Enzymology 300: 184-194.

Radman P, Harapin I (1998) Interna klinička propedeutika domaćih životinja, izd. Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb. ISBN 953-6062-08-9. Rajab P, Fox J, Rijaz S, Tomlinson D, Ball D, Greenhaff L (2000) Sceletal muscle myosin havy chain isoforms and energy metabolsim after clenbuterol treatment in the rat. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 279: R1076-R1081.

232

Page 247: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Raszyk J (1986) Physical, chemical and biological study of dust from large-scale pig farms. Vet. Med. (Praha) 31: (4) 233-244. Reifenstein H, Pank F (1975) Triazine residues in medicinal plants. Pharmazie. 30: (6) 391-3. Rozek M (1978) The effect of the S-triazine herbicides Gesatop 50 and Gesagard 50 on oogenesis of Pterostichus cupreus L., Pterostichus melanarius Ill., and Agonum dorsale Pnt. (Coleoptera : Carabidae). Folia Biol (Krakow) 26: (3) 171-179. Rughinis D, Caramete A, Rus V, Diaconu E (1977) Herbicide residues in vegetables and soil. An. Inst. Cercet. Prot. Plant., Acad. Stint. Agric. Silvice 12: 449-455. Sanchez O, Arnau A, Pareja M, Poch E, Ramirez I, Soley M (2002) Acute stress-induced tissue injury in mice: differences between emotional and social stress. Cell Stress and Chaperons 7: (1) 36-46. Santos FW, Zeni G, Roscha JBT, Weis SN, Fachinetto JM, Favero AM, Nougueira CW (2005) Diphenyl diselenide reverses cadmium –induced oxidative damage on mice tissues. Chemico-Biological Interactions 151: 159-165. Sauviat MP, Pages N (2002) Cardiotoxicity of lindane, a gamma isomere of hexachlorocyclohexane. J. Soc. Biol. 196: (4) 339-348. Schatz L Segal H (1969) Reduction of α- ketoglutarate by homogenous lactic dehydrogenase X of testicular tissue. Journal Biological Chemistry 244: (16) 4393-4397. Schmidt E, Schmidt F W (1968) Fundamentals of Diagnostic Enzymology; Medizinische Hochschule Hannover and Boehringer & Soehne GmbH Boehringer Mannheim GmbH, Biochemical Department Germany. 52.

Schmidt RF, Willis WD, Reuss L (2000) Memorix Physiology. Chapman & Hall Medical, Int. 281. Shtabskiy B M (1976) Cumulative properties and gonadotoxic effects of chemical substances. Gig. Sanit. 41 (1): 82-84. Silva LP, Miyasaka CK, Martins EF, Leite YRSA, Lacava ZGM, Curi R, Azevedo RB (2004) effect of bullfrog (Rana catesbeiana) oil administrated by gavage on the fatty acid composition and oxidative stress on mouse liver. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 37: 1491-1496.

233

Page 248: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Singh M, Rishi S (2005) Plasma acetylcholinesterase as a biomarcer of trazophos neurotoxicity in young and adult rats. Enviromental Toxicology and Pharmacology 19: 471-476. Singh NP, Stephens RE, Schneider EL. (1994) Modifications of alkaline microgel electrophoresis for sensitive detection of DNA damage. International Journal of Radiation Biology 66; 23-28.

Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider LL. (1988) A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research 175: 184-191.

Springer O, Rožić M, Košuta-Špoljar D (1986) Effects of s-Triazine herbicide atrazine on immunohematopoietic organs in CBA mice. Periodicum Biologorum 88: (Supp. 1) 137-138 a. Springer O, Rožić M, Škrinjar Lj, Grgić Z (1986) Comparative response of mice to insecticide lindane, dinitrobutyl-phenol and parathion. Periodicum Biologorum 88: (Supp. 1) 139-140 b. Springer O, Škrinjar Lj, Grgić Z (1983) The Effect of pesticide lindane on hematopoietic tissue. Periodicum Biologorum 85: (Supp. 3) 123-125. Stevens JT, Breckenridge CB, Wetzel LT, Gillis JH, Luempert LG, Eldridge JC (1994) Hypothesis for Mammary Tumorigenesis in Sprague-Dawley Rats Exposed to Certain Triazine Herbicides Journal of Toxicology and Environmental Health 43: (2) 139-153. Stout RL (2005) Serum chemistries, cotinine, blood alcohol and carbohydrate deficient transferin. CRL News & Views 5: 1. Strayer L (1991) Biokemija. Školska knjiga, Zagreb. 876. Suggitt M, Fearnley J, Swaine DJ, Volpato M, Phillops RM, Bibby MC, Loadman PM, Anderson D (2003) Comet assay and flow cytometry of DNA repair in normal and cancer cells treated with known mutagens with different mechanisms of action. Teratogenesis, Carcinogenesis and Mutagenesis, Supplment 2, 13-29.

234

Page 249: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Suri A (2004) Sperm specific proteins –potential candidate moleculs for fertility control. Reproductive biology and endocrinology 2 (10), 1-16. Svobodova Z, Piačka V, Vykusova B, Machova J, Hejtmanek M, Hrbakova M, Bastl J (1995) Residues of pollutants in siluriformes from various localities of the Czech Republic. Acta Vet. Brno 64x: 195-208. Štraus B (1992) Medicinska biokemija-drugo dopunjeno i obnovljeno izdanje. Medicinska naklada. Zagreb. 1209. Temperli K, Turler H, Ercegovich CD A Mode of Action of Pesticides I. Incorporation of S Triazines ( Cyanuric Acid and Prometryne ) into Bacterial Nucleic Acid , Z Naturforsch; 21b:903-4, 1966 ). Tezak Z, Simic B, Kniewald J (1992) Effect of pesticides on oestradiol-receptor complex formation in rat uterus cytosol. Food Chem Toxicol. 30: (10) 879-885. Thiruchelvam M, Brockel B J, Richfield E K, Baggs R B, Cory-Slechta D A (2000) Potentiated and preferential effects of combined paraquat and maneb on nigrostiatal dopamine systems: environmental risk factors for Parkinson disease. Brain Research 873: 225-234 a. Thiruchelvam M, Richfield E K, Baggs R B, Tank A W (2000) Cory-Slechta D.A. The nigrostriatal dopaminergic system as a preferential target of repeated exposures to combined Paraquat and Maneb: Implications for Parkinson´s disease. The Journal of Neuroscience 20: (24) 9207-9214 b. Timbrell J (2000) Principles of Biochemical Toxicology. Taylor & Francis, Int.ed. Tuschl H, Landsteiner HT, Kovac R (2002) Application of the poplitheal lymph node assay in immunotoxicity testing: complemantion of direct popliteal lymph node assay with flow cytometric analyses. Toxicology 172: 35-48. Ulm L (1994) Učinak prenatalne i postnatalne ekspozicije herbicida 2,4-D na imunohematopoetski sustav miša. Magistarski rad, Zavod za animalnu fiziologiju, Biološki odsjek, Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu. Zagreb. Vianna MA, Vianna AG, Borges CTL, Borba FE, Calerio MTC, Bonfa E, Marie SKN (2004) Myositis in mixed connective tissue disease. Arq. Neuropsiquiatr 62: (4) 923-934.

235

Page 250: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Villarini M, Scassellati-Sforzolini G, Moretti M, Pasquini R (2000) In vitro genotoxicity of terutryn evaluated by the alcaline single-cell microgel-electorforesis «comet assay». Cell Biology and Toxicology 16: (5) 285-292. Walker CH, Hopkins S P, Sibly R M, Peakall D B (2001) Principles of Ecotoxicology. Taylor & Francis, Int. 197. Wallace-Hayes A (2001) Principles and Methods of Toxicology. Taylor & Francis, Int. (ed) 77-137, 243-285, 285-365, 917-959, 1415-1451. Wilem van der Laan J, Lovren H, . Vos J G, Dean J H , Hastings K L (1997) Immunotoxicity of pharmaceuticals: current knowledge, testing strategies, risk evaluation & consequences for human health. Drug Information Journal 33. 1301-1305. Williams KD, Maneke J D, AbdelHameed M, Hall R, Palmer T E, Kitano M, Hidaka T (1999) 52-week oral gavage chronic toxicity study with ubiquinone in rats with 4 week recovery. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47, 3756-3763. Wang IK, Lin-Shiau SY, Lin JK (1999) Induction of apoptosis by apigenin and related flavonoids trought cytochrome c release and activation of caspase-9 and caspase-3 in leucemia HL-60 cells. Eur. J. Cancer 35: 1517-1525.

Wuntch T, Vesell ES, Chen FR (1969) Studies on rats of abortive ternary complex formation of lactate dehydrogenase isozymes 244: (22) 6100-6104. Wyllie AH(1980)Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 284: 555- 556.

Wyllie AH(1993)Apoptosis. Br. J. Cancer 67: 205-208.

Zandbergen EG, de Haan RJ, Hijdra A (2001) Systematic review of prediction of poor in anoxic-ischaemic coma with biochemical markers of brain damage. Intensive Care Medicine 27: (10) 1661-7. Zar H J (1999) Biostatistical Analysis, Prentice Hall, New Jersey. 368.

236

Page 251: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

ŽIVOTOPIS

DOMAGOJ ĐIKIĆ

Osobni podaci datum i mjesto rođenja: 31. 08. 1975., Zagreb

Obrazovanje 1989. – 1993. XII Gimnazija,Zagreb 1993. – 1999. Dodiplomski studij Biologije-Ekologije, Prirodoslovno-

matematički Fakultet 18.03.1999. Diplomirao u Zavodu za animalnu fiziologiju, na temu

Infracrvena i ultraljubičasta fotografija u biologiji sa odličnim uspjehom stekao zvanje

Dipl. Ing. Biologije smjer Ekologija

Svibanj, 1999. Upisuje poslijediplomski studij Toksikologija na PMF-u

25. 09. 2003. u Zavodu za animalnu fiziologiju obranjen magistarski rad naslovljen

«Imunohematotoksični učinci subtoksičnih doza herbicida prometrina u miša»

Radno iskustvo 01. 12. 2000. - danas Prirodoslovno-matematički fakultet. Biološki odsjek Zavoda za animalnu fiziologiju. Asistent na katedrama Ekotoksikologija, Neurofiziologija, Animalna Fiziologija, Osnove patofiziologije.

17. 05. 1999 –– 01. 12. 2000. Zoološki vrt Zagreb. Dipl. Ing. Biologije, u svojstvu Zoolog zoološkog vrta

Ostale aktivnosti radnog iskustva

11.– 19. 09. 2004. Instruktor na međunarodnom znanstvenom tećaju: EMBO, Practical Course-Anatomy and Embriology of the Laboratory Mouse. Zagreb University School of Medicine

Svibanj, 2004. Član Državnog povjerenstva Ministarstva znanosti

i tehnologije za Državno natjecanje škola iz biologije, polje-Fiziologija čovjeka

Studeni, 2004.-danas Voditelj sekcije Pauci, Studentske udruge

BIUS studenata biologije PMF-a,

Page 252: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Publikacije i znanstveni skupovi

Znanstveni radovi u znanstvenim časopisima Cvetinić Ž., Margaletić J., Đikić M., Glavaš M., Đikic D., Špičić S., Jurić I., Salajpal K. (2002) Rodents as posible reservoirs of leptospirosis in extensive swine breeding systems. Acta Agr. Kapos. Vol 6 No 2: 77-82 Sabočanec R., Đikic D., Čuljak K., Robić M., Kostelić A., Jurić I., Jerković I., Đikić M. (2002) Pathological changes in organs of clinically healthy Turopolje breed hogs. Acta Agr. Kapos. Vol 6 No 2: 83-91 Sažeci u zbornicima znanstvenih skupova Đikić D., Kemfelja S., Springer O. (2005) Hemocyte classification of the spider Geolycosa vultuosa (Araneae, Lycosidae), by giemsa, Pappenheim and acridine orange staining. 2. slovensko-hrvaški kongres o ljubiteljskih-eksotičnih in prostoživečih živali.26.-28. Septembra. Ljubljana. P 63. Kemfelja S., Katušić L., Meštrović O., Kelava I., Jurić I., Majer M., Jurkas Ž., Zec M., Đikić D. (2005) Sekcija za pauke-udruga studenata BIUS. 2. slovensko-hrvaški kongres o ljubiteljskih-eksotičnih in prostoživečih živali.26.-28. Septembra. Ljubljana. P 64. Kemfelja S., Katušić L., Meštrović O., Kelava I., Jurić I., Majer M., Đikić D. (2005) Usporedba rezultata višegodišnjeg istraživanja pauka na području JUPP Papuk. 2. slovensko-hrvaški kongres o ljubiteljskih-eksotičnih in prostoživečih živali.26.-28. Septembra. Ljubljana. P 65. Heffer-Lauc M., Mojsović A., Đikić D., Biruš I., Schnaar R. I. (2004) Changes in the distribution of major brain gangliosides during vertebrate evolution. US/Japan Glyco 2004, Joint meeting of the Society for Glycobiology and Japanese Society of Carbohydrate Research. Honolulu, HI, USA, November 17.-20. 2004. Mojsović A., Heffer-Lauc M., Đikić D., Biruš I., Peternel H., Schnaar R. I., Lauc G. (2004) Changes in the distribution of major brain gangliosides during vertebrate evolution. Book of Abstracts. Congress of the Croatian Society of Biochemistry and Molecular Biology-with international participation. 30 th September-2nd October, Bjelolasica Croatia. P 107. Đikić D., Mojsović A., Biruš I., Peternel H., Schnaar R. I., Heffer-Lauc M. (2004) Comparative study of ganglioside expression in vertebrate central nervous system. Zbornik radova-1. hrvatsko-slovenski simpozij o egzotičnim i divljim životinjama. 25.-27. Studeni, Studeni, Zagreb. ISBN: 953-99864-0-0. P 59. Tadić Z., Lisičić D., Đikić D., Oršolić N., Horvat-Knežević A. (2004) Blood cell types and some plasma biochemical values in sand viper (Vipera ammodytes). Zbornik radova-1. hrvatsko-slovenski simpozij o egzotičnim i divljim životinjama. 25-27. Studeni, Zagreb. ISBN: 953-99864-0-0. P 60. Mojsović A., Peternel H., Đikić D., Schnaar R. I., Heffer-Lauc M. (2002) Evolutional pattern of gangliosides expression in spinal cord. 1st Croatian Congress on Molecular Life Sciences with international participation. Opatija, Croatia. Book of Abstracts. P 152 Đikić M., Jurić I., Rupić I., Gomerčić H., Djikic D. (2002) Turopolje pig tissue composition and proportion in carcass. Session 25. Developing sustainable breeding strategies in medium to low input systems. 7th World Congress on Genetics Applied to livestock Production. Montpellier, France. Congress papers. P 25-32.

Page 253: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

Knjige i poglavlja u knjizi Đikić D. i sur. Ekološki leksikon, ur: Springer O. P. Barbat i ministarstvo zaštite okoliša, Zagreb 2001. Đikić D. Recenzija prevoda knjige: Neil Carter. Strategije zaštite okoliša-ideje, aktivizam, djelovanje. Ur. Oskar P. Springer. Barbat, Zagreb 2004. ISBN 953-181-056-7. Đikić M., Jurić I., Rupić V., Gomerčić H., Đikić D. Suvremena istraživanja na turopoljskoj svinji-Turopoljska svinja, sastav trupa i masnih kiselina tkiva, u: Turopoljska svinja autohtona hrvatska pasmina, ur. Marija Đikić, Ivan Jurić, Franjo Kos, izd., Plemenita općina turopoljska, Velika Gorica 2002. 143-148 Sabočanec R., Đikić D., Čuljak K., Robić M., Kostelić A., Jurić I., Jerković I., Đikić M. Suvremena istraživanja na turopoljskoj svinji.Patološke promjene u organima klinički zdravih svinja, u: Turopoljska svinja autohtona hrvatska pasmina, ur. Marija Đikić, Ivan Jurić, Franjo Kos, izd., Plemenita općina turopoljska, Velika Gorica 2002. 159-164 Cvetinić Ž., Margaletić J., Đikić M., Glavaš M., Đikić D., Špičić S., Juirić I., Salajpal K. Suvremena istraživanja na turopoljskoj svinji-Glodavci kao mogući rezervoari leptospiroze u otvorenim sustavima držanja svinja, u: Turopoljska svinja autohtona hrvatska pasmina, ur. Marija Đikić, Ivan Jurić, Franjo Kos, izd., Plemenita općina turopoljska, Velika Gorica 2002. 165-172

Dodatno usavršavanje tijekom poslijediplomskog magistarskog studija

FEBS Advanced Course on Glycoconjugates. Versatile Structures and Intriguing Functions, Dubrovnik, Croatia, 24-27 Rujan 2001. A training course: Microsatellites , mitohondrial DNA and conservation genetics. Principles and applications, Zagreb, Croatia 25-27 veljače 2002. Metodološki tečajevi u biologiji i medicini. DNA i RNA, Institut Ruđer Bošković, 12-16 Svibanj 2003. Metodološki tečajevi u biologiji i medicini. Stanice i proteini, Institut Ruđer Bošković, 26-30 Svibanj 2003. Metodološki tečajevi u biologiji i medicini. Konfokalna i fluorescencijska mikroskopija, Institut Ruđer Bošković, 2004.

Van nastavne aktivnosti tijekom dodiplomskog studija

01.07.– 31.08.1998. Institut für die Biologie Landwirtschaftliches Nutztiere, Rostock, Deutschland. U svojstvu razmjenski student. Samostalno vođenje pokusa utjecaja selekcije i autotreninga na motoričke sposobnosti miševa i rad na populacijskoj genetici miševa kao model organizama

1996. –1998. sudjelovao u istraživanju utjecaja sukcesije vlažnih livada reda Deschampsietalia u šumu reda Populetalia albae na Entomofaunu u Turopoljskom lugu, pod vodstvom Mr. Perovića, HRVATSKI PRIRODOSLOVNI MUZEJ

1998., Ožujak. Sudionik međunarodnog edukativnog Ekološkog kampa u Turopoljskom lugu, u sklopu međunarodne godine zaštite

Page 254: UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH … · 2018. 4. 17. · Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Domagoj Đikić UČINAK PROMETRINA

vodozemaca, u organizaciji udruge Hyla

1998., Svibanj: Sudionik međunarodnog edukativnog ekološkog kampa u Nacionalnom parku Paklenica, u organizaciji udruge Hyla

1999. u LABOROTORIJU ZA KONTROLU KVALITETE VODE I ZAŠTITE OKOLIŠA JARUN stječe znanje o biološkom i kemijskom monitoringu vodenih ekosustava pod vodstvom mr. Počuća

1999 Sudjeluje u istraživanju utjecaja neionizirajučeg zračenja na INSTITUTU ZA MEDICINSKA ISTRAŽIVANJA pod vodstvom dr.sc. Trošić

Volonterski rad 1997.-1998. Rad u IAESTE-u, organizaciji za međunarodnu razmjenu studenata prirodoslovnih i tehničkih fakulteta