UNIVERSITI PUTRA MALAYSIA

KAJIAN INTERAKSI BIOMOLEKUL KOKO (THEOBROMA CACAO L.) TERHADAP JANGKITAN PENYAKIT BUAH HITAM YANG DISEBABKAN

OLEH KULAT PHYTOPHTHORA SP.

NORHAYATI BT. YUSUF

FSAS 2000 34

KAJIAN INTERAKSI BIOMOLEKUL KOKO (THEOBROMA CACAO L.) TERHADAP JANGKITAN PENYAKIT BUAH HITAM YANG DISEBABKAN

OLEH KULAT PHYTOPHTHORA SP.

Oleh

NORHAYATI BT. YUSUF

Tesis ini Disediakan bagi Memenuhi Keperluan untuk Ijazah Master Sains di Fakulti Sains dan Pengajian Alam Sekitar

Universiti Putra Malaysia

Ogos 2000

Abstrak tesis yang dikemukakan kepada Senat Universiti Putra Malaysia sebagai memenuhi syarat untuk mendapat ijazah Master Sains.

KAJIAN INTERAKSI BIOMOLEKUL KOKO (THEOBROMA CACAO L.) TERHAOAP JANGKITAN PENYAKIT BUAH HIT AM YANG OISEBABKAN

OLEH KULAT PHYTOPHTHORA SP.

Oleh

NORHAYATI YUSUF

Ogos 2000

Pengerusi : Nor' Aini Mohd. Fadzillah, PhD.

Fakulti : Sains dan Pengajian Alam Sekitar.

Kajian telah d ijalankan untuk melihat perubahan sistem pertahanan

antioksidan tumbuhan koko (Theobroma cacao L.) hasil interaksi dengan

Phytophthora sp . iaitu kulat yang menyebabkan penyakit buah hitam. Dua

klon koko yang digunakan ialah ICS 95, satu klon yang rintang dan MJS

47, satu klon yang rentan kepada penyakit buah hitam.

Phytophthora sp. telah diasingkan daripada pod koko yang menunjukkan

gejala-gejala penyakit buah h itam. Pertumbuhan miselium kulat adalah

lebih baik di atas medium agar tidak menentu berbanding dengan medium

agar menentu , manakala medium Richard 's berupaya menyokong

pertumbuhan yang lebih baik berbanding dengan medium cecair yang lain.

Ni lai pH filtrat kultur ku lat (FKK) berada dalam ju lat 4 .0 hingga 8.5 unit.

II

Biocerakin kesitotoksikan FKK kasar Phytophthora sp. ke atas ceper daun

koko menunjukkan peratus nekrosis semakin meningkat (Iebih 50%)

dengan peningkatan umur FKK yang d igunakan terutamanya

menggunakan FKK berumur 1 2-24 hari pengeraman. Peratus nekrosis

juga lebih tinggi dalam klon MJS 47 berband ing ICS 95. Sebal iknya,

kandungan klorofil akan terus berkurangan dengan meningkatnya umur

FKK yang digunakan. FKK juga dapat merencat pertumbuhan biji benih

Brassica chinensis terutamanya menggunakan FKK berumur 1 2-24 hari

pengeraman. Kesan kesitotoksikan adalah lebih ketara menggunakan FKK

yang d isediakan dari med ium ekstrak ubi kentang-dekstrosa (PO)

berbanding dengan medium Murashige & Skoog (MS).

Paras malond ialdehid adalah lebih tinggi dalam klon MJS 47 berbanding

klon ICS 95 terutamanya selepas 1 6 hari rawatan dengan FKK. Begitu

juga dengan penghasilan h idrogen peroksida selepas 1 1 hari rawatan .

Aktiviti spesifik enzim peroksidase (POD) dan polifenol oksidase (PPO)

pada mulanya adalah lebih tinggi dalam klon MJS 47 berbanding klon ICS

95 terutamanya pada tempoh rawatan 0 hingga 4 hari dan semakin

berkurangan selepas 4 hari rawatan dengan FKK. Aktiviti spesifik enzim

glutathion reduktase (GR) pu la lebih tinggi dalam klon ICS 95 (selepas 7

hari rawatan) berbanding dengan klon MJS 47 . Begitu juga dengan aktiviti

spesifik enzim katalase (KAT) yang lebih tinggi dalam klon ICS 95 selepas

III

2 hingga 7 hari rawatan. Rawatan dengan FKK Phytophthora sp.

menyebabkan berlakunya peningkatan aktiviti spesifik enzim kajian

berbanding dengan kawalan yang digunakan bagi kedua-dua klon ICS 95

dan MJS 47.

Kandungan askorbat dan a-tokoferol adalah lebih tinggi dalam klon ICS 95

berbanding klon MJS 47 terutamanya pada hari ke 2 hingga 1 1 bagi asid

askorbik dan hari 0 hingga 1 6 bagi a-tokoferol selepas rawatan dengan

FKK. Kandungan molekul glutathion bentuk teroksida (GSSG) dan terturun

(GSH) selepas rawatan dengan FKK adalah lebih tinggi dalam klon yang

rintang berbanding dengan klon yang rentan. Pada amnya, paras GSH

adalah lebih tinggi daripada GSSG dalam kesemua kajian yang dijalankan.

Nisbah GSH:GSSG adalah lebih tinggi dalam klon yang rintang

terutamanya pada hari 0, 1 dan 1 1 hari rawatan .

Kesemua keputusan yang d iperoleh i menunjukkan bahawa FKK kasar

Phytophthora sp. mungkin mengandungi sebatian toksik yang boleh

merencat pertumbuhan tumbuhan dan meransang perubahan aktiviti

spesifik enzim dan paras molekul antioksidan sebagai suatu mekanisme

tindakbalas pertahanan tumbuhan terhadap jangkitan patogen . Jangkitan

oleh Phytophthora sp. dengan itu berupaya menyebabkan keadaan

tegasan oksidatif dalam tisu daun koko.

iv

Abstract of thesis presented to the Senate of University Putra Malaysia in fulfilment of the requirement for the degree of Master of Science.

BIOMOLECULAR RESPONSES OF COCOA (THEOBROMA CACAO L.) AGAINST BLACK POD DISEASE CAUSED BY PHYTOPHTHORA SP.

Chairman

Faculty

By

NORHAYATI YUSUF

August 2000

Nor'Aini Mohd. Fadzil lah, PhD.

Science and Environmental Studies .

This study investigated the changes in the antioxidant defense systems of

cocoa (Theobroma cacao L . ) in response to black pod disease as induced

by Phytophthora sp. . Two cocoa clones were used namely ICS 95, a

resistant clone and MJS 47, a susceptible clone to black pod disease.

The fungal pathogen Phytophthora sp. was isolated from cocoa pods

showing symptoms of black pod disease. Growth of the fungal mycel ium

was optimal on undefined medium compared to that on defined medium.

Meanwhile, Richard's medium was the best liquid medium for growth and

development of this pathogen compared to the other media used . pH

values of the cu lture filtrates (CFs) were in the range of 4.0 to B.S.

Cytotoxicity bioassays using crude CFs of Phytophthora sp. on cocoa leaf

discs showed that the percentage of necrosis was increasingly higher (by

v

more than 50%) with older CFs especially using 1 2-24 days old CFs.

Necrosis in leaf tissues of MJS 47 was also h igher compared to that in ICS

95. Meanwhile , chlorophyll content decreased with older CFs. I n bioassays

using Brassica chinensis seeds, growth of the seeds were inh ibited by 1 2-

24 days old CFs. The CFs obtained from potato dextrose (PO) medium

showed h igher cytotoxic effects compared to CFs prepared from Murash ige

& Skoog (MS) medium.

The malondialdehyde levels were h igher in MJS 47 compared to ICS 95

after 1 6 days of treatment with CFs. Hydrogen peroxide concentrations

also showed similar results after 1 1 days.

Specific activities of peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO) were

in itia lly h igher in MJS 47 compared to ICS 95 especially at 0-4 days of

treatment wh ich decreased after 4 days. Glutathione reductase (GR)

specific activities were h igher in treated ICS 95 after 7 days compared to

that in MJS 47 clone. Similar results were observed for catalase (CAT)

specific activities after 2-7 days of treatment. In response to the treatment

with CFs of Phytophthora sp. specific activities of the enzymes studied

were higher in both clones compared to its respective controls.

Ascorbate and a-tocopherol content were h igher in ICS 95 compared to the

MJS 47 clone especially after 2 to 1 1 days of treatment for the former

VI

and 0-16 days of treatment for the latter. Concentrations of both oxid ized

glutathione (GSSG) and reduced g lutath ione (GSH) were higher in the ICS

95 clone as compared to MJS 47 clone. General ly, GSH levels were higher

compared to GSSG in al l the treatments. Ratio of GSH:GSSG was also

higher in the resistant clone especial ly at day 0, 1 and 11 of treatments with

CFs.

Results obtained thus indicate that crude CFs of Phytophthora sp. may

contain toxic compounds that can inhib it plant growth and development.

These growth inhibitory substances were also able to induce changes in

the specific activities of antioxidant enzymes as wel l as concentration of the

endogenous antioxidants as a response in the plant defense system

against pathogen infection. The infection of Phytophthora sp. was thus

shown to be able to induce conditions of oxidative stress in the leaf tissues

of cocoa .

vii

PENGHARGAAN

DENGAN NAMA ALLAH YANG MAHA PENGASIH LAGI MAHA PENYAYANG

Selawat dan Salam Ke Atas Junjungan Besar Nabi Muhammad S.A.W.

Sekalung ucapan terima kasih yang tidak terhingga ditujukan khas buat Dr.

Nor'Aini Mohd. Fadzil lah selaku ketua penyelia projek d i atas segala tunjuk

ajar, nasihat, teguran dan bimbingan yang telah d iberikan.

Setinggi-tinggi penghargaan juga dirakamkan buat Prof. Madya Dr. Radzal i

Muse dan Dr. Misri Kusnan d i atas segala bantuan dan tunjuk ajar

sepanjang projek ini d ijalankan.

Tidak lupa juga buat ahl i-ahli makmal Kultur Tisu, Jabatan Biologi dan

makmal 230, Jabatan Biokimia dan Mikrobiologi yang turut memberi

sokongan dan juga bantuan.

Akhir kata buat suami tercinta, Azman Jali, anak tersayang, Mohd. Akmal ,

Mohd . Amirul Hakim, kedua ibu bapa dan adik-adik, terima kasih di atas

segala sokongan dan pengorbanan yang telah diberikan .

Terima Kasih.

viii

Saya mengesahkan bahawa Jawatankuasa Pemeriksa bagi Norhayati Bt. Yusuf telah mengadakan pemeriksaan akhir pada 22hb. Ogos 2000 untuk menilai tesis Master Sains beliau yang bertajuk "Kaj ian Interaksi Biomolekul Koko ( Theobroma cacao, L.) Terhadap Jangkitan Penyakit Buah H itam yang Disebabkan oleh Kulat Phytophthora sp." mengikut Akta Universiti Pertanian Malaysia ( Ijazah Lanjutan) 1 980 dan Peraturan-Peraturan Universiti Pertanian Malaysia ( Ijazah Lanjutan) 1 981 . Jawatankuasa Pemeriksa memperakukan bahawa calon ini layak dianugerahkan ijazah tersebut. Anggota Jawatankuasa Pemeriksa adalah seperti berikut:

FARIDAH ABDULLAH, Ph. D Fakulti Sains dan Pengaj ian Alam Sekitar, Universiti Putra Malaysia. (Pengerusi)

NOR'A IN I MOHO. FADZILLAH , Ph. D Faku lti Sains dan Pengajian Alam Sekitar, Universiti Putra Malaysia. (Ahl i)

PROF. MAOYA RADZALI MUSE, Ph. D Fakulti Sains dan Pengajian Alam Sekitar, Un iversiti Putra Malaysia. (Ahl i)

M ISRI KUSNAN , Ph. D Faku lti Sains dan Pengajian Alam Sekitar, Univers iti Putra Malaysia. (Ahl i)

AINI IOERIS , Ph. D Profesor Oekan Pusat Pengajian Siswazah Universiti Putra Malaysia

Tarikh: 2 5 MAY 2001

ix

Tesis ini telah diserahkan kepada Senat Universiti Putra Malaysia dan telah d iterima sebagai memenuhi keperluan Ijazah Master Sains.

x

AINI IDERIS, Ph. D. Profesor Dekan Pusat Pengajian Siswazah Universiti Putra Malaysia

Tarikh:

Saya mengaku bahawa tesis ini adalah hasil kerja saya yang asli melainkan petikan dan sedutan yang telah diberi penghargaan di dalam tesis. Saya juga mengaku bahawa tesis ini tidak dimajukan untuk ijazah­ijazah lain di Universiti Putra Malaysia atau institusi-institusi lain .

Norhayati Bt. Yusuf

Tarikh: :1:1. (J � �

XI

JADUAL KANDUNGAN

ABSTRAK ABSTRACT PENGHARGAAN PENGESAHAN PEMERI KSA AKUAN PELAJAR JADUAL KANDUNGAN SENARAI RAJAH SENARAI PLAT SENARAI S INGKATAN

BAB

Mukasurat

i i v vii i ix xi xii xvi xix xxii

PENGENALAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . ... . . . . . . . . . . . . . . ... . ... . . . . . . . . . . . ...... 1

I I

Objektif kajian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ................................. ............. 8

ULASAN LITERATUR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Koko Secara Am . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Ciri-ciri Botani Tanaman Koko . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Status Penanaman Koko di Malaysia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Sejarah Penanaman Koko . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Keluasan Tanaman Koko . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Masalah Penanaman Koko di Malaysia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Penyakit Buah H itam . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . .

Organisma yang Menyebabkan Penyakit Buah Hitam . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Kitaran Hid up Kulat Phytophthora palmivora . . . . . . . . . . .

Gejala-gejala Serangan Penyakit Buah Hitam . . . . . . . . .

Punca-Punca Jangkitan Kulat Phytophthora sp . . . . . . . .

Kepentingan Ekonomi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Langkah-Langkah Kawalan Penyakit. . . . . . . . . ' " . . . . . . . . . .. .

Amalan Tani . .... . . ... . . . ....... . . . . . ....... . .... . ...... . . ... . Kawalan Kimia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . . . .

Kerintangan Kultivar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . .. .... .. . . . . . . Tegasan Oksidatif dalam Tumbuhan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Penghasilan Spesies Oksigen Reaktif dalam Tumbuhan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tindakbalas Berangkai Peroksidaan Lipid pada Membran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Mekanisme Pertahanan Tumbuhan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Sistem Pertahanan enzim . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . .. Sistem Bukan Enzim . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . .

xii

9 9

11 12 12 13 16 19

19 20 23 23 27 28 28 29 30 30

31

35 38 41 43

I I I

Kewujudan Spesies Oksigen Reaktif Oalam Mekanisme Pertahanan Tumbuhan Terhadap Patogen. . . .......... ... ... .... 47 Mekanisme yang Mengawal Penghasilan Spesies Oksigen yang Reaktif Semasa Jangkitan Patogen . . . . . . . . . . . . ...... ....... 49 Keberkesanan Spesies Oksigen Reaktif Sebagai Rintangan Terhadap Jangkitan Patogen ... . . . . . . ............ ..... 52

BAHAN DAN KAEOAH . . . . . . . . . ... . . . .. .. . .. . .. . . . . . . . . . . ... ...... . . . . ... . . . .

Senarai Bahan . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . .. ... . . . . . .

Sumber Bahan Kaj ian . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . .

Penyemaian Anak Pokok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . Kaj ian Awal Patogen . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . ... . . . . . . .. .. . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . .

Sumber Inokulum . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. .. . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . Proses Pensterilan Permukaan Pod . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Permulaan Kultur Phytophthora sp . .. .... . . . . . . .. . . . . . . . . . . . Pemel iharaan Kultur Kulat. . . . . . . . .. .. . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . .. . . . . .

Kaj ian Pertumbuhan dan Perkembangan Patogen Kulat . . . . . Kaj ian Pertumbuhan pada Medium Pepejal . .. . . . .. . . . . . .

Kajian Pertumbuhan pada Medium Cecair . . . ..... . . . . . . . Penyediaan Medium Kultur Kulat . . . . . .. .. . . .... .. . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Medium Tidak Menentu . . . . .. . . .. . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . .

Medium Ubi Kentang-Oekstrosa Beragar (POA} . . . .. . . Medium Jus Sayuran va-CaC03 Beragar (VaJ/CaC03} . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . , . . . . . . . . . Medium Lobak Merah Beragar (CA} . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . .. . . . Medium Ekstrak Kacang Peas Beragar (PEA} .. . . .. .. . . Medium Oatmeal Beragar (OMA} . . . . . . . . . . . ..... . . . . .. . . . . .. . . Medium Ekstrak Malt Beragar (MEA} . . . . . . . . . .... . . . . . .. . . . .

Medium Menentu . .. . . . .. . . . . . . . .. ... . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. . .. .... . .. . . . . ..... . . . . . Medium Murashige & Skoog Beragar (MSA} . . . . . . . . . . . Medium Czapex-Oox Beragar (COA} . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . Medium Richard's Beragar (RA} . . .. . . .. .. . . . . . . . .. .. . . . . . .. . . .

Biocerakin Filtrat Kultur Phytphthora sp . . . . . . . ..... . . .... . . . .. . . . .. . . Penyediaan F iltrat Kultur Kulat Phytphthora sp . . . . . . . Proses Pensterilan Permukaan Oaun Koko . .. . . . . . . . .. . Kaedah Biocerakin Menggunakan Ceper Oaun Koko . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Penentuan Nekrosis Ceper Oaun ..... . . . .... .. . . . . Penentuan Kandungan Klorofil .... . ..... . ... . . ... . .

Pensterilan Permukaan Biji Benih Sawi ... . . . . .. . .. . .. . . .

Biocerakin Bij i Benih Sawi Brassica chinensis . . . . . . . . . Kajian Interaksi Biomolekul Oaun Koko Dengan Fi ltrat Kasar Kultur Phytophthora sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . . .

Penentuan Paras Hidrogen Peroksida . . . . ..... . . . ... . . . . . . Penentuan Kadar Peroksidaan Lipid . ... . . . .. . . .. . . . . . .... . . .

Cerakinan Aktiviti Spesifik Enzim . . . ... .. .. . ... .. . . . .. .. . . . . .. . . . . .. . . . . Aktiviti Spesifik Enzim Peroksidase .... . . . ..... . .. ... . . . . . .

XlII

57 57 58 58 59 59 59 62 63 63 64 64 65 65 65

66 66 66 67 67 67 67 68 68 69 69 69 70

71 71 72 73

73 75 76 77 77

IV

Aktiviti Spesifik Enz im Polifenol Oksidase . . . ...... ... ... 79 Aktiviti Spesifik Enzim Katalase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 Aktiviti Spesifik Enz im Glutathion Reduktase. . . . . . . . . . 81

Penentuan Kandungan Protein . . . . . . ............. ... ..... ............... 82 Penyediaan Keluk Piawai Protein . . . . . . . . ... . . . . . ......... 82 Penentuan Kandungan Protein Ekstrak Kasar. . . . . . . . . 83

Penentuan Kandungan Molekul Antioksidan . . . . .. ... ... .......... 83 Penentuan Kandungan Asid Askorbik (Vitamin C) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......... ............. .......... 83 Penentuan Kandungan a-Tokoferol (Vitamin E) . . . ... ... ... ... ... ...... ... ... ... ... ...................... 84 Penentuan Kandungan Molekul Glutathion . . . . . . ......... 86

Penentuan Kandungan Jumlah Glutathion, Glutath ion dalam Bentuk Teroksida (GSSG) dan Glutathion dalam 86 Bentuk Terturun (GSH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Analisis Statistik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... ........................................... 88

KEPUTUSAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Kajian Pertumbuhan dan Perkembangan Patogen Kulat Phytophthora sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Kajian Pertumbuhan bagi Medium Pepejal . . . . . . . . .

Kaj ian Pertumbuhan bagi Medium Cecair. . . . . . . . . . . . . . . .

Nilai pH Filtrat Kultur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Biocerakin Filtrat Kasar Kultur Phytophthora sp . . . . . . . . . . . . . . . . .

Peratus Nekrosis Ceper Daun . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Kandungan Klorofil Ceper Oaun . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .

Pertumbuhan Bij i Benih Brassica chinensis . . . . . . . . . . . . .

Pertumbuhan H ipokotil dan Radikal Bij i Ben ih Brassica chinensis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Interaksi Ceper Oaun Koko dengan Filtrat Kasar Kultur Phytophthora sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Paras H idrogen Peroksida pada Ceper Oaun . . . . . . . . . . .

Peroksidaan Lipid pada Membran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Aktiviti Spesifik Enzim Antioksidan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aktiviti Spesifik Enzim Peroksidase (POD) .... ......... .

Aktiviti Spesifik Enz im Polifenol Oksidase (PPO) . . . . . .

Aktiviti Spesifik Enzim Katalase (KAT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Aktiviti Spesifik Enzim Glutath ion Reduktase (GR) . . . . Kandungan Molekul Antioksidan Oi Oalam Oaun Koko Selepas Interaksi dengan Filtrat Kasar Kultur Phytophthora sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Kandungan Asid Askorbik (Vitamin C) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Kandungan a-Tokoferol (Vitamin E) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kandungan Molekul Glutath ion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

xiv

89

89

89 95

106 108 109 114 117

119

124 128 131 134 134 136 138 140

143

143 145 147

v

VI

RUJUKAN

LAMPIRAN

BIOGRAFI

PERBINCANGAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kultur Tulen Phytophthora sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pertumbuhan Dan Perkembangan Patogen Kulat Phytophthora sp. di dalam Medium Agar Pepejal dan Medium Cecair. ....................................... � ................. . Aktiviti Kesitotoksikan Filtrat Kasar Kultur Kulat Phytophthora sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kesan Interaksi Filtrat Kasar Kultur Kulat Phytophthora sp. dengan Ceper Daun Koko . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . Perubahan Aktiviti Beberapa Enzim Antioksidan Hasil I neraksi Ceper Daun Koko Dengan Filtrat Kasar Kultur Kulat Phytophthora sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

R INGKASAN DAN KESIMPULAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

xv

153 153

154

161

168

174

186

191

219

226

SENARAI RAJAH

RAJAH Mukasurat

1 Carta Pengeluaran Bij i Koko Kering Di Malaysia. . . . . . . . . .. . . . 1 8

2 Kitaran Hidup Kulat P. palmivora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3 Punca-Punca Jangkitan Kulat Phytophthora sp.... . . . . . . . . . . . 26

4 Skema Penurunan Elektron dalam Penghasilan Spesies Oksigen Reaktif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . :. . . . . . . . . . . . . . 32

5 Tindakbalas Berangkai Peroksidaan Lipid pada Membran 37

6 Kerosakan yang D isebabkan oleh Spesies Oksigen yang Reaktif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . 40

7 Tapak Jalan Hall iwel l-Asada . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . ,. . . . . 43

8 Kitaran Glutathion Askorbat. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . 44

9 Kaitan antara Sistem Antioksidan . . . . . . . , . . . . . . . . ,. . . . . . . . . . . . . 46

1 0 Mekanisme yang Mengawal Penghasilan Radikal Superoksida dalam Sistem yang Dijangkiti oleh Patogen. 51

1 1 Pertumbuhan Garispusat Koloni Phytophthora sp. Selama 5 Hari Pengeraman pada 27 ± 2 °C di atas a) Medium Agar Tidak Menentu b) Medium Agar Menentu . . . . . . . . . . . . . . . 91

1 2 Berat Kering Kulat Phytophthora sp. (g/kultur) Selama 24 Hari Pengeraman pada Suhu 27 ± 2 °C dengan Kelajuan 1 00 psm d i dalam a) Medium Cecair Tidak Menentu b) Medium Cecair Menentu . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

1 3 Nilai p H Filtrat Kasar Kultur Kulat Phytophthora sp. Selama 24 Hari Pengeraman pad a Suhu 27 ± 2 °C dengan Kelajuan 100 psm di dalam a) Medium Tidak Menentu b) Medium Menentu . . . . . . . . . ... . . . . .. . . . '" . . . . . , .. . . . . . 107

14 Peratus Nekrosis Ceper Daun Koko Klon ICS 95 dan Juga MJS 47 Selepas 6 Hari Pendedahan dalam Keadaan Gelap dengan Fi ltrat Kasar Kultur Phytophthora

xvi

sp. yang Dised iakan dari a) Medium Ceeair Ubi Kentang- 1 1 0 Dekstrosa b) Medium Ceeair Murashige dan Skoog . . . . . . . .

1 5 Peratus Kandungan Klorofil Ceper Daun Koko Klon ICS 95 dan Juga MJS 47 Selepas 6 Hari Pendedahan dalam Keadaan Gelap dengan Fi ltrat Kasar Kultur Phytophthora sp. yang Disediakan dari a) Medium Ceeair Ubi Kentang- 1 1 6 Dekstrosa b) Medium Ceeair Murashige Dan Skoog . . . . . . . .

1 6 Peratus Pereambahan Bij i Benih B. Chinensis Selepas 5 Hari Pendedahan dalam Keadaan Gelap dengan Filtrat Kasar Kultur Phytophthora sp. yang Disediakan dari a) Medium Ceeai r Ubi Kentang-Dekstrosa b) Medium 1 1 8 Ceeair Murashige dan Skoog . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1 7 Pertumbuhan H ipokotil dan Radikal Biji Benih B. Chinensis (em) Selepas 5 Hari Pendedahan dalam Keadaan Gelap dengan Filtrat Kasar Kultur Phytophthora sp. yang Disediakan dari a) Medium Ceeair Ubi Kentang- 1 2 1 Dekstrosa b) Medium Ceeair Murashige dan Skoog . . . . . . ..

1 8 Paras Hidrogen Peroksida pada Ceper Daun Koko a) Klon MJS 47 b) Klon ICS 95 e) Klon MJS 47 Dan ICS 1 30 95 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1 9 Peroksidaan Lipid pada Ceper Daun Koko a) Klon MJS 1 32 47 b) Klon ICS 95 e) Klon MJS 47 dan ICS 95 . . . . . . . . . . . . . . .

20 Aktiviti Spesifik Enzim Peroksidase untuk Ceper Daun Koko a) Klon MJS 47 b) Klon ICS 95 e) Klon MJS 47 1 35 dan ICS 95 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2 1 Aktiviti Spesifik Enzim Pol ifenol Oksidase untuk Ceper Daun Koko a) Klon MJS 47 b) Klon ICS 95 e) Klon MJS 1 37 47 dan ICS 95 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

22 Aktiviti Spesifik Enzim Katalase untuk Ceper Daun Koko a) Klon MJS 47 b) Klon ICS 95 c) Klon MJS 47 dan ICS 1 39 95 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23 Aktiviti Spesifik Enzim Glutathion Reduktase Ceper Daun Koko a) Klon MJS 47 b) Klon ICS 95 c) Klon MJS 47 1 42 dan ICS 95 . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . .... . . . . ... . . . ... . . . . . . .

24 Kandungan Asid Askorbik (Vitamin C) untuk Ceper Daun Koko a) Klon MJS 47 b) Klon ICS 95 c) Klon MJS 47 1 44

xvii

dan ICS 95 . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

25 Kandungan a-Tokoferol untuk Ceper Daun Koko a) Klon 1 46 MJS 47 b) Klan ICS 95 c) Klan MJS 47 dan ICS 95 . . . . . .

26 Kandungan Jumlah Glutathian, Glutathian Teroksida (GSSG) dan Glutathian Terturun (GSH) untuk Ceper Oaun Kaka Klon MJS 47 dengan Menggunakan a) Medium Cecair Ekstrak Ubi Kentang Oekstrasa (PO) b) 1 48 Filtrat Kultur (KF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

27 Kandungan Jumlah Glutathian, Glutathion Teroksida (GSSG) dan G lutathian Terturun (GSH) untuk Ceper Daun Koka Klon ICS 95 dengan Menggunakan a) Medium Cecair Ekstrak Ubi Kentang Oekstrosa (PO) b) 1 49 Filtrat Kultur (KF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

28 Nisbah Kandungan Glutathian untuk Ceper Oaun Kaka a) Klan MJS 47 b) Klan ICS 95 c) Klan MJS 47 Dan ICS 1 52 95 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

xviii

PLAT

1

2A-21

3

4

5

6

7

8

9

1 0

1 1

SENARAI PLAT

Mukasurat

Pokok Koko (Theobroma cacao) yang Telah Mengalami Perkembangan yang Sempurna . . . . . . . . .

Bentuk Morfolog i Sporangium (A, B, C, D . E dan H) dan Oogonium (F, G dan I ) Ku lat Phytophthora palmivora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .

Pod Koko yang telah Matang dan Masak (Klon ICS 95) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Pod Koko yang telah Matang dan Masak (Klon MJS 47) . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . . . . . . . . . . . .

Pod Koko (Klon MJS 47) yang Menunjukkan Gejala Penyakit Buah H itam yang disebabkan oleh Kulat Phytophthora sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di atas Medium Ekstrak Kacang Peas Beragar (PEA) Selepas 5 Hari Pengeraman pad a Suhu 27 ± 2 °C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di atas Medium Ekstrak Ubi Kentang-Dekstrosa Beragar (PDA) Selepas 5 Hari Pengeraman pad a Suhu 27 ±2°C . . .... . . ... ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... . .. . . .... . .. . ... . . . . . . . . .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di atas Medium Ekstrak Malt Beragar (MEA) Selepas 5 Hari Pengeraman pad a Suhu 27 ± 2°C . . . ... .. . . . . . . . .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di atas Medium Jus Sayuran V8-CaC03 Beragar (V8J/CaCO:A) Selepas 5 Hari Pengeraman pada Suhu 27 ± 2°C .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di atas Medium Oatmeal Beragar (OMA) Selepas 5 Hari Pengeraman pada Suhu 27 ± 2°C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Pertumbuhan Ku lat Phytophthora sp. di atas Medium Lobak Merah Beragar (CA) Selepas 5

xix

1 0

22

60

60

61

92

93

93

93

94

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

Hari Pengeraman pada Suhu 27 ± 2°C.. . . .. ...... .... 94

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di atas Medium Murashige dan Skoog 8eragar (MSA) Selepas 5 Hari Pengeraman pada Suhu 27 ± 2°C ..

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di atas Medium Czapex Oox 8eragar (COA) Selepas 5 Hari Pengeraman pad a Suhu 27 ± 2°C .. .. . .... . .... . .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di atas Medium Richard 8eragar (RA) Selepas 5 Hari Pengeraman pada Suhu 27 ± 2°C . ... ...... .. ' " . . . . . . . .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di dalam Medium Cecair Ekstrak Kacang Peas (PE) Selepas 24 Hari Pengeraman pad a 27 ± 2°C, 100 psm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di dalam Medium Cecair Ekstrak Ubi Kentang-Oekstrosa (PO) Selepas 24 Hari Pengeraman pada 27 ± 2°C, 100 psm .......................... . .. . .... ..... ... ....... ...... .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di dalam Medium Cecair Ekstrak Malt (ME) Selepas 24 Hari Pengeraman pada 27 ± 2°C, 100 psm .......... . . . . . . .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di dalam Medium Cecair Jus Sayuran V8-CaC03 (V8J/CaC03) Selepas 24 Hari Pengeraman pada 27 ± 2°C, 100 psm ....................... ..... . .............. .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di dalam Medium Cecair Lobak Merah (C) Selepas 24 Hari Pengeraman pada 27 ± 2°C, 100 psm ............... .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di dalam Medium Cecair Murashige dan Skoog (MS) Selepas 24 Hari Pengeraman pada 27 ± 2°C, 100 psm ................ ......... .................. .. ... ............. .

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di dalam Medium Cecair Richard (R) Selepas 24 Hari Pengeraman pad a 27 ± 2°C, 100 psm ... ............. . .

xx

96

96

97

100

100

101

101

102

104

104

22

23

24

25

26

27

28

Pertumbuhan Kulat Phytophthora sp. di dalam Medium Cecair Czapex Oox (C�) Selepas 24 Hari Pengeraman pada 27 ± 2°C, 100 psm ...... . . . . . . .... . .

Nekrosis bagi Ceper Oaun Koko Klon ICS 95 Selepas 6 Hari Pendedahan dengan Filtrat Kasar Kultur Phytophthora sp . yang Disediakan dari Medium Cecair Ubi Kentang-Dekstrosa (PO) .. . . . .. . .

Nekrosis bagi Ceper Oaun Koko Klon MJS 47 Selepas 6 Hari Pendedahan dengan Filtrat Kasar Kultur Phytophthora sp. yang Disediakan dari Medium Cecair Ubi Kentang-Oekstrosa (PO) . . . .... .

Biji Benih B. chinensis yang Menunjukkan Pertumbuhan Hipokotil dan Radikal Selepas Oidedahkan Selama 5 Hari dengan Filtrat Kasar Kultur Phytophthora sp. yang Oisediakan dari Medium Cecair Ubi Kentang-Oekstrosa (PO) pada Suhu 27 ± 2°C . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . ' " . . . . . . . . . . . .

Biji Benih B. chinensis yang Menunjukkan Pertumbuhan Hipokoti l dan Radikal Selepas Didedahkan Selama 5 Hari dengan Fi ltrat Kasar Kultur Phytophthora sp. yang Oisediakan dari Medium Cecair Murashige dan Skoog (MS) pada Suhu 27 ± 2°C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Ceper Oaun Koko Klon ICS 95 yang Oiberi Pendedahan dengan Filtrat Kasar Kultur Phytophthora sp. yang Berumur 16 Hari Selama 0, 1, 2, 4, 7, 11, 16 dan 22 Hari Oibandingkan dengan Kawalan ... ........ . .. . ............ ................ .

Ceper Oaun Koko Klon MJS 47 yang Oiberi Pendedahan dengan Filtrat Kasar Kultur Phytophthora sp. yang Berumur 16 Hari Selama 0, 1, 2, 4, 7, 11, 16 dan 22 Hari Oibandingkan dengan Kawalan .............. . . ........... .. ... .. . .......... .

xxi

1 05

111

1 12

122

123

126

127

Mlmin 102 Abs APx bb BSA CA Ca2+ CBB CDA -CH2-CHS Cu/ZnSOD CU3+ DAG DCPI P DHA DHAR DNA DTNB e EDTA Fe2+ Fe3+ FeS04.7H20 FeSOD FKK xg g/kultur GR GSH GSSG H+ H20 H20Z HCI HR ICS IKF IP3 I PD KAT KCI KF

SENARAI SINGKATAN

perubahan absorban per minit oksigen tunggal absorban askorbat peroksidase berat basah Bovine Serum Albumin medium lobak merah beragar ion kalsium ( I I ) Coomassie Bril liant Blue medium Czapex-Dox beragar kumpulan metilene Chalcone syntase kuprum/zink superoksid dismutase ion kuprum ( I I I ) diasilg liserol diklorofenol indofenol dehidroaskorbat dehidroaskorbat reduktase asid deoksiribonukleik asid 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoik elektron asid etilenediamine-tetraasetik ion ferum ( II) ion ferum ( I II) ferum su lfat ferum superoksid dismutase filtrat kultur kulat daya graviti gram per ku ltur glutathion reduktase glutathion bentuk terturun glutathion bentuk teroksida ion hidrogen molekul air hidrogen peroksida asid hidroklorik tindakbalas hiperkepekaan Imperial College Selection rawatan untuk koko klon ICS 95 inositol 1 .4,5-trifosfat kawalan untuk koko klon ICS 95 katalase kalium klorida filtrat kultur

XXII

MDA MOHAR MEA MJS MKF MnSOD MPD MSA NADP NADPH

NaN03 NaOH O2 O2 OH OMA PAL PAR PDA PDT PEA PLC POD PPO Psm PUFA PVP RA R-OO R-OOH SA SAR SOD TBA TCA Ti UV v/v V8J/CaCO� VSD w/v

potasium dwihidrogen fosfat Institut Penyelidikan dan Perkembangan Pertanian Malaysia malondialdehid monodehidroaskorbat reduktase medium ekstrak malt beragar Mardi Jerangau Semenanjung rawatan untuk koko klon MJS 47 manganese superoksid d ismutase kawalan untuk koko klon MJS 47 medium Murashige dan Skoog beragar Nicotinamida Adenin Dinukleotida Fosfat Nicotinamida Adenin Dinukleotida Fosfat, bentuk terturun natrium nitrat natrium hidroksida oksigen radikal superoksida rad ikal hidroksil medium oatmeal beragar fen ilalanin amonia lyase 4-(2-pyridu lazo) resorcinol medium ubi kentang-dekstrosa beragar 3-(2-pyridyl)-5,6-diphenyl-1 ,2 ,4 triazine medium ekstrak kacang peas beragar fosfol ipase C peroksidase polifenol oksidase pusingan se minit asid lemak politaktepu polivini l pirolidon medium Richard's beragar radikal lipid peroksil l ipid hidroperoksida asid salisil ik systemic acquired resistance superoksid dismutase asid thiobarbiturik asid trikloroasetik titanium ultraungu isipad u/isipad u medium jus sayuran V8-CaC03 beragar vascular streak dieback beratlisipad u

xxiii

BAB I

PENGENALAN

Koko ( Theobroma cacao L.), daripada famili Sterculiaceae merupakan

suatu tanaman tropika yang berasal dari Amerika Selatan. lanya

dipercayai pertama kali ditemui di hutan Lembah Amazon dan Orinoco

(Opeke, 1 982) . Penduduk pertama yang dipercayai menanam koko ialah

orang-orang Maya dan Aztec dari Amerika Tengah, manakala peneroka­

peneroka Eropah pula bertanggungjawab terhadap penyebaran tanaman

koko ke negara-negara dimana pokok ini belum dikenali sebelumnya

(Wood, 1 985).

Koko kemudiannya telah ditanam di seluruh dunia terutamanya di negara

tropika dan telah menjadi suatu tanaman utama di Asia Tenggara, Afrika

Barat, Hindia Barat, India Selatan dan Amerika Selatan. Kini tanaman koko

mempunyai kepentingan sebagai komoditi di pasaran dunia (Opeke, 1 982).

Oi Malaysia, usaha untuk menanam koko secara komersil telah dijalankan

d i antara tahun 1 958 hingga 1 959. Oi Semenanjung Malaysia, usaha ini

telah dimulakan dengan penanaman koko jenis Amelonado di Jerangau,

Terengganu di kawasan seluas 405 ha (Mohd Yusof, 1 986). Penanaman

koko ini terus berkembang maju secara komersil sebagai salah satu