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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
WILLIAN VANDERLEI MEIRA
RELAÇÃO ENTRE O METABOLISMO ENERGÉTICO E A MELANOGÊNESE EM
CÉLULAS DE MELANOMA (B16-F10)
CURITIBA
2019
WILLIAN VANDERLEI MEIRA
RELAÇÃO ENTRE O METABOLISMO ENERGÉTICO E A MELANOGÊNESE EM
CÉLULAS DE MELANOMA (B16-F10)
Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciências- Bioquímica, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências- Bioquímica. Orientadora: Profª. Drª. Glaucia Regina Martinez Coorientadora: Profª Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena
CURITIBA
2019
Dedico essa tese aos meus pais, meus exemplos de vida.
AGRADECIMENTOS
À toda minha família, em especial aos meus pais, que sempre me
incentivaram e sacrificaram muito por mim. Não há palavras pra descrever a
importância de vocês em minha vida.
Aos meus ex-mestres, principalmente à Drª. Mariza Boscacci e à Drª.
Julianne Milléo, que foram inspiração.
À minha orientadora, Drª. Glaucia Regina Martinez, pela confiança,
dedicação e, principalmente, paciência durante todos esses anos. Foi uma jornada
de muita aprendizagem.
Às demais professoras do grupo de oxidações biológicas, em especial à Drª.
Sílvia Cadena, pela coorientação; e às professoras Drª. Guilhermina Noleto e Drª.
Sheila Winnischofer, partes da minha banca interna, pelas correções e contribuições
nesse trabalho.
Às minhas queridas amigas Marina e Janaina, que desde o mestrado tem
sido meu apoio, sempre com um conselho e um sorriso no rosto, apesar de toda
dificuldade. Eu tenho certeza que não teria ido até o final se vocês não estivessem
ao meu lado, muito obrigado!
Dentre tantas pessoas especiais que passaram pelo laboratório durante
esses anos não posso deixar de agradecer à família que a pós-graduação me deu.
Principalmente às minhas amigas Carolina, Paloma, Juliana e Elaine, que além de
toda amizade e ajuda, dentro e fora do laboratório, me pouparam muito tempo e
esforço através das caronas muito mais que bem-vindas. Agradeço também a minha
amiga Monique, por toda amizade e auxílio no laboratório e por ter sido uma ponte
importante para a realização do meu período sanduíche na França. Além disso,
preciso agradecer a todos os outros membros que passaram pelo laboratório
durante esses anos, incluindo alunos e técnicos, que sem dúvida tiveram alguma
participação nesse trabalho.
Aos meus mentores na França, Dr. Jacques Pouysségur e à Drª. Maša
Ždralević, pela oportunidade de realizar o estágio sanduíche, pela confiança e por
terem me recebido tão bem no laboratório. Esse agradecimento estendo também à
toda equipe do laboratório de Nice (Tumour Hypoxia & Cancer Metabolism) e
Mônaco (Hypoxie tumorale et métabolisme), por toda hospitalidade e ajuda em tudo
que precisei, dentro e fora do laboratório. Fiz grandes amigos durante esse período
e gostaria de deixar um agradecimento especial à Lucilla Fabbri, minha grande
amiga, sem você esse período longe de casa teria sido muito mais difícil.
À Drª. Nadja C. Souza-Pinto do Departamento de Bioquímica (IQ) da
Universidade de São Paulo (USP) e a Aline, pela ajuda com os experimentos de
dano ao mtDNA.
Ao Engenheiro Dr. Jérôme Durivault, do laboratório do Centre Scientifique de
Monaco, por desenhar os primers para os silenciamentos por CRISPR/Cas9.
À Dr. Konstantina Fragaki do laboratório de genética mitocondrial do Centre
Hospitalier Universitaire de Nice (CHU), pela ajuda na realização dos experimentos
de atividade da ATPase.
Ao técnico da plataforma FACS do IRCAN, Ludovic Cervera, pela ajuda nos
experimentos de citometria.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências- Bioquímica da Universidade
Federal do Paraná.
Às agências financiadoras, Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) e Fundação Araucária. Em particular, ao Programa de
Doutorado Sanduíche no Exterior (PSDE) da CAPES.
“Se a educação sozinha não transforma a sociedade, sem ela tampouco a
sociedade muda”
Paulo Freire
RESUMO
A melanina é um polímero sintetizado nos melanócitos e derivado da reação de
oxidação do aminoácido L-tirosina pela enzima tirosinase. Esse pigmento confere
cor à pele, olhos e pelos e desempenha uma função fotoprotetora nas células
epiteliais contra danos provocados pela radiação UV. Entretanto, estudos têm
mostrado que a presença de melanina em melanoma está associada a diversos
efeitos celulares, como inibição na respiração celular, diminuição na proliferação
celular e aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Visando
elucidar um mecanismo de resposta celular frente ao estímulo melanogênico, esse
trabalho teve como objetivo geral verificar o papel da via melanogênica na alteração
do metabolismo energético de células de melanoma B16-F10, com enfoque na
glicólise aeróbica. Nesse trabalho, as células B16-F10, submetidas ao estímulo
melanogênico, apresentaram aumento de danos mitocondriais, maior produção de
ânion superóxido pela mitocôndria e indução no metabolismo glicolítico em
detrimento à fosforilação oxidativa, compatíveis com a diminuição no consumo de
oxigênio e aumento na produção de lactato. Essa mudança é acompanhada pelo
acúmulo de Nrf2 e HIF-1α. Além disso, o comprometimento do metabolismo
energético celular promoveu alterações no processo melanogênico e inibição na
produção de melanina, como demonstrado através da quantificação da produção de
melanina nos mutantes B16-F10 GPi-KO e ATP5A1-KO, onde a glicólise e a
fosforilação oxidativa estão comprometidas, respectivamente. Esses resultados
mostram que as células de melanoma murino B16-F10 apresentam uma resposta de
defesa frente ao estresse celular causado pelo estímulo melanogênico e aumento de
ROS, alterando seu metabolismo energético em favorecimento ao metabolismo
glicolítico, garantindo às células maior resistência a esses efeitos, assim como uma
vantagem em ambientes adversos, como por exemplo, sob baixas concentrações de
oxigênio, agregando um papel mais amplo ao processo de melanogênese no
melanoma.
Palavras-chave: Melanina; Efeito Warburg; Glicólise; Forscolina; ROS; HIF-1α.
ABSTRACT
Melanin is a polymer synthesized in melanocytes and derived from the oxidation
reaction of the amino acid L-tyrosine by the tyrosinase. This pigment gives color to
the skin, eyes and hair and performs a photoprotective function on the epithelial cells
against damage caused by UV radiation. However, studies have shown that the
presence of melanin in melanoma is associated with several cellular effects, such as
inhibition of cell respiration, decreased cell proliferation and increased production of
reactive oxygen species (ROS). Aiming to elucidate a mechanism of cellular
response to melanogenic stimulation, this study aimed to verify the role of the
melanogenic pathway in altering the energy metabolism of B16-F10 melanoma cells,
focusing on aerobic glycolysis. In this study, B16-F10 cells submitted to melanogenic
stimulation showed increased mitochondrial damage, higher production of
superoxide anion by mitochondria and induction in glycolytic metabolism over
oxidative phosphorylation, compatible with decreased oxygen consumption and
increased lactate production. This change is followed by the accumulation of Nrf2
and HIF-1α. In addition, the impairment of cellular energy metabolism promoted
changes in melanogenic process and inhibition of melanin production, as
demonstrated by quantifying melanin production in B16-F10 GPi-KO and ATP5A1-
KO, where glycolysis and oxidative phosphorylation are impaired, respectively.
These results show that B16-F10 murine melanoma cells show a defensive response
to cellular stress caused by melanogenic stimulation and increased ROS, altering
their energy metabolism in favor of glycolytic metabolism, ensuring cells greater
resistance to these effects, thus as an advantage in unfavorable environments, such
as under low oxygen concentrations, adding a broader role to the melanogenesis
process in melanoma.
Key words: Melanin; Warburg Effect; Glycolysis; Forskolin; ROS; HIF-1α.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. REPRESENTAÇÃO DA LOCALIZAÇÃO DOS MELANÓCITOS NA
EPIDERME E SUA INTERAÇÃO COM OS QUERATINÓCITOS ...... 23
FIGURA 2. ESTRUTURA MOLECULAR DOS ELEMENTOS CONSTITUINTES DA
MELANINA ......................................................................................... 24
FIGURA 3. ESQUEMA DAS REAÇÕES NA BIOSÍNTESE DE MELANINA.............. 25
FIGURA 4. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA REGULAÇÃO DA
MELANOGÊNESE PELA ATIVAÇÃO DO RECEPTOR MCR1 .......... 27
FIGURA 5. ESQUEMA DA PROGRESSÃO DO MELANOMA A PARTIR DE
MELANÓCITOS NORMAIS ............................................................... 30
FIGURA 6. COMPARAÇÃO ENTRE MELANOMAS E NEVO BENIGNOS ............... 31
FIGURA 7. ESQUEMA REPRESENTATIVO DA ESTABILIZAÇÃO E DEGRADAÇÃO
DE HIF-1α REGULADAS PELAS CONCENTRAÇÕES DE OXIGÊNIO
........................................................................................................... 36
FIGURA 8. IMAGENS REPRESENTATIVAS DO PELLET DE CÉLULAS APÓS O
ESTÍMULO ......................................................................................... 50
FIGURA 9. DOSAGEM DE MELANINA TOTAL EM CÉLULAS TRATADAS COM L-
TIROSINA E NH4Cl ............................................................................ 51
FIGURA 10. MEDIDA DA ATIVIDADE DA ENZIMA TIROSINASE ........................... 52
FIGURA 11. DOSAGEM DE MELANINA TOTAL EM CÉLULAS TRATADAS COM
FORSCOLINA .................................................................................... 53
FIGURA 12. EFEITO DO ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE SOBRE A
VIABILIDADE DAS CÉLULAS B16-F10 ............................................. 54
FIGURA 13. EFEITO DO ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE SOBRE A
PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS B16-F10 ....................................... 55
FIGURA 14. ENSAIO CLONOGÊNICO DAS CÉLULAS B16-F10 COM
MELANOGÊNESE ESTIMULADA ..................................................... 57
FIGURA 15. NÍVEIS DE RADICAL SUPERÓXIDO EM MITOCÔNDRIAS DE
CÉLULAS ESTÍMULADAS COM L-TIROSINA E NH4Cl .................... 60
FIGURA 16. NÍVEIS DE RADICAL SUPERÓXIDO EM MITOCÔNDRIAS DE
CÉLULAS ESTÍMULADAS COM FORSCOLINA ............................... 61
FIGURA 17. EXPRESSÃO DE NRF2 APÓS O ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE . 62
FIGURA 18. DANOS AO MTDNA INDUZIDOS PELA MELANOGÊNESE ............... 65
FIGURA 19. TAXA DE CONSUMO DE OXIGÊNIO (OCR) DAS CÉLULAS
SUBMETIDAS AO ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE ..................... 68
FIGURA 20. TAXA DE ACIDIFICAÇÃO EXTRACELULAR (ECAR) ......................... 69
FIGURA 21. ENSAIO CLONOGÊNICO DAS CÉLULAS B16-F10 ESTIMULADAS NA
AUSÊNCIA DE GLUCOSE ................................................................ 70
FIGURA 22. NÍVEIS DE LACTATO EXTRACELULAR APÓS O ESTÍMULO
MELANOGÊNICO .............................................................................. 71
FIGURA 23. EXPRESSÃO DE HIF-1Α E GLUT1 APÓS O ESTÍMULO DA
MELANOGÊNESE ............................................................................. 72
FIGURA 24. POSSÍVEIS RESPOSTAS CELULARES DAS CÉLULAS B16-10
FRENTE AO ESTÍMULO MELANOGÊNICO ..................................... 76
FIGURA 25. ATIVIDADE DA ENZIMA TIROSINASE APÓS SILENCIAMENTO DA
ENZIMA ............................................................................................. 78
FIGURA 26. DOSAGEM DE MELANINA TOTAL APÓS SILENCIAMENTO DA
ENZIMA TIROSINASE ....................................................................... 79
FIGURA 27. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA DA ATP
SINTASE ............................................................................................ 81
FIGURA 28. IMAGEM REPRESENTATIVA DA EXPRESSÃO DE ATP5Α APÓS
SILENCIAMENTO POR CRISPR/Cas9 ............................................. 82
FIGURA 29. ATIVIDADE DA ATPASE E CITRATO SINTASE NOS MUTANTES
ATP5A1-KO ....................................................................................... 83
FIGURA 30. TAXA DE CONSUMO DE OXIGÊNIO (OCR) DAS CÉLULAS B16-F10
APÓS SILENCIAMENTO DA GENE ATP5Α...................................... 85
FIGURA 31. TAXA DE ACIDIFICAÇÃO EXTRACELULAR (ECAR) APÓS O
SILENCIAMENTO DO GENE ATP5A ................................................ 86
FIGURA 32. NÍVEIS DE LACTATO EXTRACELULAR DAS CÉLULAS B16-F10
ATP5A1-KO ....................................................................................... 87
FIGURA 33. PROLIFERAÇÃO CELULAR DAS CÉLULAS ATP5A1-KO EM
NORMÓXIA E HIPÓXIA ..................................................................... 88
FIGURA 34. CAPACIDADE CLONAL DOS MUTANTES ATP5A1-KO ..................... 89
FIGURA 35. DOSAGEM DOS NÍVEIS DE MELANINA INTRACELULAR DOS
MUTANTES GPI-KO E ATP5A1-KO .................................................. 90
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. SEQUÊNCIA DOS PRIMERS E PROGRAMA DO TERMOCICLADOR . 45
TABELA 2. SEQUÊNCIA DO RNA GUIA (gRNA) ..................................................... 48
LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS
ARD1 - Arrest-defective-1 protein
BCL-2 - B-cell lymphoma protein 2
CREB- Proteína de ligação de resposta a cAMP
CRISPR/Cas9- Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
DCT- Dopacromo tautomerase
DOPA - L-3,4-dihidroxifenilalanina
ECAR - Taxa de acidificação extracelular
FCCP - Carbonil cianeto p-trifluormetoxifenilhidrazona
FK - Forscolina
GLUT1- Transportador de glucose 1
GLUT4- Transportador de glucose 4
HIF-1α- Fator induzível por hipóxia 1 alfa
HK - Hexoquinase
MAPK -Proteína quinase ativada por mitógeno
MITF - Fator de transcrição de microftalmia
MTT - 3-metil-[4-5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazólio
Nfr2 - Nuclear factor erythroid 2-related factor 2
OXPHOS - Fosforilação oxidativa
OCR - Taxa de consumo de oxigênio
PBS - Tampão fosfato
pCREB- Proteína de ligação de resposta a cAMP fosforilada
PDH- Prolil hidroxilases
pH - Potencial hidrogeniônico
PK - Piruvato quinase
PKA - Proteína quinase A
ROS - Espécies reativas de oxigênio
SFB - Soro fetal bovino
TYRP1- Proteína relacionada a tirosinase 1
TYRP2- Proteína relacionada a tirosinase 2
UV - Radiação ultravioleta
VHL- Proteína Von Hippel-Lindau
ΔΨm - Potencial de membrana mitocondrial.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS ............................................................................ 19
3 ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL ........................................................................... 21
3.1 OBJETIVO 1 ........................................................................................................ 21
3.2 OBJETIVO 2 ........................................................................................................ 21
4 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 22
4.1 MELANINA E A MELANOGÊNESE .................................................................... 22
4.2 MELANOMA ........................................................................................................ 28
4.3 METABOLISMO ENERGÉTICO EM CÉLULAS DE MELANOMA ...................... 32
4.4 FATOR INDUZÍVEL POR HIPÓXIA (HIF-1) ........................................................ 34
5 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 39
5.1 MATERAIS E REAGENTES ................................................................................ 39
5.2 CULTIVO DE CÉLULAS ...................................................................................... 39
5.3 ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE ..................................................................... 40
5.4 QUANTIFICAÇÃO DE MELANINA ...................................................................... 40
5.5 ATIVIDADE DA TIROSINASE ............................................................................. 41
5.6 VIABILIDADE E PROLIFERAÇÃO CELULAR .................................................... 41
5.7 ENSAIO CLONOGÊNICO ................................................................................... 42
5.8 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE RADICAL SUPERÓXIDO (O2•-)
MITOCONDRIAL ....................................................................................................... 43
5.9 AVALIAÇÃO DOS DANOS OXIDATIVOS AO DNA MITOCONDRIAL ................ 44
5.10 ANÁLISE METABÓLICA: TAXA DE RESPIRAÇÃO CELULAR E
ACIDIFICAÇÃO EXTRACELULAR ........................................................................... 45
5.11 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE LACTATO EXTRACELULAR ................... 46
5.12 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS POR WESTERN
BLOTTING ................................................................................................................ 46
5.13 SILENCIAMENTO DOS GENES TYR E ATP5A1 POR CRISPR/CAS9............ 47
5.14 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ATPASE E CITRATO SINTASE .......... 48
5.15 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................... 49
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 50
6.1 EFEITOS DA MELANOGÊNESE SOBRE A VIABILIDADE E PROLIFERAÇÃO
CELULAR .................................................................................................................. 50
6.2 EFEITOS DA MELANOGÊNESE SOBRE O METABOLISMO OXIDATIVO ....... 58
6.3 EFEITOS DA MELANOGÊNESE SOBRE O METABOLISMO ENERGÉTICO
CELULAR .................................................................................................................. 65
6.4 SILENCIAMENTO DA ENZIMA TIROSINASE .................................................... 77
6.5 EFEITOS DO COMPROMETIMENTO NO METABOLISMO ENERGÉTICO
SOBRE A PRODUÇÃO DE MELANINA EM CÉLULAS B16-F10 ............................. 79
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 92
8 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 93
16
1 INTRODUÇÃO
A estimativa da American Cancer Society apontou um aumento de 5% no
número de diagnósticos de melanoma nos Estados Unidos para o ano de 2019,
enquanto que, no Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estimou o surgimento
de 6.260 novos casos de melanoma em 2018, representando um aumento de,
aproximadamente, 10% (INCA, 2017; SIEGEL et al., 2019). Apesar da sua baixa
incidência, a mortalidade de pacientes diagnosticados tardiamente é alta, sendo que
apenas 17% apresentam uma sobrevida de até 5 anos (SIEGEL e MILLER; JEMAL,
2018).
Os melanomas são tumores derivados dos melanócitos, células produtoras de
melanina. Esse pigmento confere coloração à pele, cabelos e olhos e é sintetizado
em organelas especializadas, os melanossomos, através de um processo conhecido
como melanogênese, que envolve diversas reações enzimáticas e não enzimáticas.
O processo se inicia a partir da hidroxilação da L-tirosina ou oxidação da L-3,4-
dihidroxifenilalanina (L-DOPA) pela enzima tirosinase (ITO e WAKAMATSU, 2008),
onde dois polímeros principais podem ser gerados, a eumelanina e a feomelanina.
Sendo a eumelanina composta de unidades de 5,6-dihidroxi-indol (DHI) e ácido 5,6-
dihidroxi-indol-2-carboxílico (DHICA) e a feomelanina composta por unidade de
benzotiazinas, esta última gerada pela incorporação de L-cisteína nas reações.
Em condições normais, a função mais bem elucidada da melanina é proteger
a célula de possíveis danos causados pela radiação ultravioleta (UV), tanto por
absorver parte dessa radiação, como através do sequestro de espécies reativas de
oxigênio (ROS) (WANG et al., 2008).
Além do papel fotoprotetor, a melanina desempenha outras funções celulares.
Estudos realizados com as duas formas de melanina, eumelanina e a feomelanina, e
com o seu precursor, o DHICA, mostraram que esses compostos são capazes de
promover quebras no DNA, possivelmente através de reações do tipo Fenton, e
ainda prejudicam a ação de enzimas de reparo sobre essas lesões (PELLOSI et al.,
2014; SUZUKAWA et al., 2012).
Em relação ao tratamento de melanomas, a presença da melanina pode
proteger a célula tumoral, aumentando sua resistência a terapias. Particularmente
em relação à terapia fotodinâmica (PDT), esta proteção poderia estar associada à
sua capacidade de absorção em certos comprimentos de onda, o que poderia
17
diminuir a eficiência de alguns fotossensibilizadores, como a hipericina (BROZYNA
et al., 2016; HADJUR et al., 1996). Além disso, células de melanoma com maior
conteúdo de melanina são mais resistentes aos efeitos de ROS, indicando que o
poder antioxidante da melanina é outro fator de resistência contra o estresse
oxidativo induzido por essas terapias (HADJUR et al., 1996; HUANG et al,.2013).
Em modelo de células de melanoma B16-F10 sob o estímulo da
melanogênese utilizando L-tirosina e cloreto de amônio (NH4Cl), Cunha et al. (2012)
observaram um aumento nas concentrações de ROS, indicando sua produção
durante a melanogênese. Os autores demonstraram ainda que o estímulo da
melanogênese durante 48h resultou na inibição reversível da proliferação celular,
aumentando o número de células na fase G1/G0 do ciclo e também foi capaz de
alterar o perfil de expressão de diversas proteínas relacionadas ao metabolismo
energético, citoesqueleto e progressão do ciclo celular.
Adicionalmente, Meira et al. (2017) demonstraram que o estímulo da
melanogênese utilizando L-tirosina e cloreto de amônio (NH4Cl) por 48h, resultou em
redução, de aproximadamente 50%, no consumo de oxigênio, tanto no estado basal
da respiração como no estado desacoplado de células de melanoma B16-F10, sem
afetar o potencial de membrana mitocondrial (Δψm). Essa inibição na proliferação e
a redução do consumo de oxigênio em células de melanoma, submetidas ao
estímulo na síntese de melanina, sugerem que esse processo pode estar
promovendo uma diminuição no metabolismo aeróbico em favorecimento ao
anaeróbico, tornando a glicólise a principal fonte de ATP da célula (DANG e
SEMENZA, 1999; MEIRA et al., 2017).
Essa alteração no metabolismo é observada em diversos tipos de células
tumorais, sendo conhecida como Efeito Warburg, que é caracterizado pelo aumento
na expressão de transportadores de glucose e de enzimas da via glicolítica, como
GLUT1, Hexoquinase (HK), Fosfofrutoquinase (PFK) e Piruvatoquinase (PK) (DIAZ-
RUIZ et al., 2011; MACHEDA et al., (2005). Nesse contexto, HIF-1α (fator induzível
por hipóxia 1 alfa) têm um papel fundamental. Em baixas concentrações de oxigênio,
HIF-1α promove a transcrição de diversos genes envolvidos no metabolismo
energético, apoptose, angiogênese, crescimento e migração celular (FEIGE et al,
2011; SEMENZA, 2012). Entre os alvos de HIF-1α estão os transportadores de
glucose 1 e 4 (GLUT1 e GLUT4), além de múltiplas enzimas da via glicolítica, que
18
promovem a transição da oxidação da glucose pela fosforilação oxidativa (OXPHOS)
para o metabolismo glicolítico (SEMENZA, 2012; ZBYTEK et al., 2013).
De fato, Slominski et al. (2014) observaram um aumento na expressão de
HIF-1α em células de melanoma humano SKMEL-188 e AbC1 de hamster,
relacionada à maior produção de melanina e Buscà et al. (2005) demonstraram que,
essa indução de HIF-1α era correlacionado ao aumento na expressão de MITF (fator
de transcrição associado a microftalmia), de forma independente da concentração
de oxigênio.
Embora os estudos descritos tenham abordado respostas celulares frente ao
aumento na melanina e da atividade melanogênica, tanto em células de melanoma
quanto em melanócitos, os efeitos e a relação desse processo com o metabolismo
energético da célula permanecem contraditórios ou desconhecidos. Portanto, esse
trabalho tem como objetivos gerais verificar o papel da via melanogênica na
alteração do metabolismo energético de células de melanoma B16-F10 e os efeitos
de alterações no metabolismo energético no processo melanogênico.
19
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Os diagnósticos de melanoma vêm crescendo a cada ano e os fatores de
resistência desses tumores contribuem para a baixa eficiência nos tratamentos e
para o alto índice de mortalidade. A presença da melanina nessas células tem sido
considerada por alguns autores como um fator de resistência, devido às suas
características químicas. Entretanto, o processo de melanogênese, também
desencadeia diversas alterações celulares, como aumento nos níveis de ROS,
redução do consumo de oxigênio e inibição na proliferação das células de melanoma
na fase G1/G0 do ciclo celular. Em geral, em células tumorais, uma diminuição no
consumo de oxigênio, frequentemente, está relacionada com uma mudança no
metabolismo oxidativo da glucose, apresentando uma diminuição da fosforilação
oxidativa e um favorecimento da glicólise aeróbica, geralmente associado com
aumento na expressão de HIF-1α, que por sua vez promove a superexpressão de
diversas proteínas envolvidas na via glicolítica.
Visando obter informações que possam delinear uma resposta metabólica das
células de melanoma frente ao estímulo da melanogênese, esse estudo teve como
primeiro objetivo geral verificar o papel da via melanogênica na alteração do
metabolismo energético de células de melanoma B16-F10, com enfoque na glicólise
aeróbica.
Para alcançar esse objetivo, foram traçados objetivos específicos com o
intuito de avaliar:
• A resposta de células submetidas a duas diferentes metodologias de
estímulo da síntese de melanina, pela suplementação do meio de
cultura com L-tirosina e NH4Cl ou pela presença do composto
forscolina;
• Os efeitos do estímulo da melanogênese sobre a proliferação e
capacidade clonogênica das células de melanoma;
• O perfil metabólico das células submetidas à maior produção de
melanina, através da determinação da respiração celular, atividade da
via glicolítica e produção de lactato;
• Os possíveis danos mitocondriais em resposta ao estímulo da
melanogênese e a produção de ROS pela mitocôndria. Além da
expressão de Nfr2 nas células após o estímulo melanogênico;
20
• O envolvimento de HIF-1α sobre a resposta celular induzida pela
melanogênese, através da análise da expressão dessa proteína e seu
alvo, GLUT1;
• A resposta do tratamento com forscolina em células B16-F10
incapazes de produzir melanina, através da obtenção e caracterização
do mutante TYR-KO, silenciado para a enzima tirosinase.
Como descrito, a melanogênese desencadeia efeitos importantes nas células,
sugerindo que esse processo pode influenciar o metabolismo energético celular. Por
outro lado, pouco se sabe em relação aos efeitos de alterações no metabolismo
energético na síntese de melanina. A fim de entender melhor essa relação, o
segundo objetivo desse trabalho foi verificar os efeitos de alterações no metabolismo
energético no processo melanogênico, para esse propósito foram traçados objetivos
específicos:
• Obter uma linhagem de células B16-F10 que apresente deficiência na
fosforilação oxidativa (OXPHOS) e consequente inibição na respiração
celular, através do silenciamento da subunidade alfa da ATP sintase
(ATP5α1);
• Caracterizar esse mutante verificando a expressão da proteína
(ATP5α), a capacidade proliferativa e o perfil metabólico em condições
de normóxia (Nx) e hipóxia (Hx);
• Avaliar os efeitos de alterações no metabolismo energético em relação
à síntese de melanina, através da utilização de linhagens knockout das
proteínas GPi (Glucose-6-fosfato isomerase), previamente obtido e
caracterizado por De Pádua et al., (2017), e da subunidade alfa do
complexo V da cadeia de transporte de elétrons (ATP5α1).
21
3 ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL
3.1 OBJETIVO 1
3.2 OBJETIVO 2
22
4 REVISÃO DE LITERATURA
4.1 MELANINA E A MELANOGÊNESE
A melanina é um polímero sintetizado por diversas espécies entre fungos,
plantas e animais, que apresenta diferentes funções e importância evolucionária. Em
pássaros, por exemplo, a presença desse pigmento nas penas garante a diversidade
de cores, auxiliando a comunicação e reprodução dessas espécies (GALVÁN e
SOLANO, 2016). Já em humanos, a melanina é responsável pela coloração da pele,
olhos e pelos, apresentando grande diversidade entre as populações humanas.
Estudos genéticos nessa área apontam uma variação genética de apenas 10-15%,
sugerindo que a seleção natural, mediada pela pressão geográfica dessas
populações, é responsável por essa diversidade (JORDE e WOODING, 2004;
PARRA, 2007; TISHKOFF e KIDD, 2004).
Na pele, a melanina é sintetizada em células especializadas localizadas na
membrana basal da epiderme, chamadas de melanócitos. Os melanócitos são
células dendríticas que mantêm contato com, aproximadamente, 36 queratinócitos e
uma célula de Langerhans, formando unidades conhecidas como unidades
epidermo-melânicas (Figura 1).
A produção de melanina é restrita a organelas chamadas de melanossomos,
no interior dos melanócitos. Após a maturação dos melanossomos, esses são
transportados, através dos dendritos dos melanócitos, até os queratinócitos
adjacentes, onde os grânulos de melanina se acumulam na região perinuclear
(CICHOREK et al., 2013; MONTAGNA e CARLISLE, 1991; SEIBERG, 2001).
A distribuição dos grânulos de melanina ao redor do núcleo dos queratinócitos
favorece a ação fotoprotetora da melanina frente aos raios UV, protegendo o DNA
dessas células. Essa característica fotoprotetora da melanina é garantida pela sua
estrutura química, que permite a absorção de parte dessa radiação (RILEY, 1997),
mas também através da captação de ROS que são formadas a partir dessa
exposição, como demonstrado por Bustamante et al. (1993) e Tada et al. (2010).
A coloração da pele é determinada por uma mistura de carotenóides, oxi e
desoxi- hemoglobina e em maior extensão pela melanina, mais especificamente,
pela sua distribuição, armazenamento e pela taxa de composição entre os tipos de
melanina (STAMATAS et al., 2004).
23
FIGURA 1. REPRESENTAÇÃO DA LOCALIZAÇÃO DOS MELANÓCITOS NA EPIDERME E SUA INTERAÇÃO COM OS QUERATINÓCITOS
FONTE: O autor (2019) baseado em Cichorek et al. (2013) com autorização de The Company of Biologists (número 11820789), ilustrações (https://smart.servier.com/) NOTA: Representação da estrutura da pele humana e das unidades epidermo-melânica, formadas pelos melanócitos, queratinócitos e células de Langerhans. A melanina sintetizada nos melanócitos é transferida dentro dos melanossomos até os queratinócitos adjacentes através das projeções dendriticas. Os grânulos de melanina endocitados se distribuem ao redor do núcleo dos queratinócitos, onde desempenham a função de proteger o DNA dessas células da radiação UV.
Quimicamente, a melanina pode ser dividida em dois tipos principais, a
eumelanina e feomelanina (RILEY, 1997). A eumelanina apresenta coloração
escura, variando do preto ao marrom, e é um polímero heterogêneo formado a partir
de diferentes estados oxidativos do 5,6-dihidroxi-indol (DHI) e do ácido 5,6-dihidroxi-
indol-2-carboxílico (DHICA) (Figura 2), sendo mais abundante em pessoas de pele
escura. Já a feomelanina é encontrada em maior quantidade em pessoas de pele,
cabelos e olhos claros. Apresenta coloração variando do vermelho ao amarelo e sua
estrutura consiste basicamente de unidades de benzotiazina, com menor
contribuição de unidades de benzotiazol e isoquinolinas, apresentando enxofre (S)
como heteroátomo (Figura 2) (ITO e WAKAMATSU, 2008; MORGAN et al., 2013).
24
FIGURA 2. ESTRUTURA MOLECULAR DOS ELEMENTOS CONSTITUINTES DA MELANINA
FONTE: Adaptado de Riley (2003) com autorização de John Wiley and Sons (número: 4602100949652) NOTA: Diagrama esquemático da estrutura das unidades de eumelanina e feomelanina. Eumelanina compreende predominantemente subunidades indólicas e a feomelanina, contém átomos de enxofre, principalmente na forma de resíduos de benzotiazinila.
O processo de síntese da melanina é conhecido como melanogênese e,
devido à toxicidade dos intermediários dessa via como o DHICA e quinonas, essa
reação é restrita ao interior de organelas especializadas nos melanócitos, os
melanossomos (RILEY, 1997).
Os melanossomos são organelas tipo lisossomos que contém todas as
enzimas necessárias para o processo melanogênico, como a tirosinase (TYR),
dopacromo tautomerase (DCT) e proteínas relacionadas a tirosinase 1 e 2 (TYRP-1
e 2) (ORLOW, 1995). O processo de maturação dessa organela se dá no interior dos
melanócitos e é finalizado com a transferência dos grânulos de melanina aos
queratinócitos (RAPOSO e MARKS, 2007; WASMEIER et al., 2008).
A síntese, tanto da eumelanina quanto da feomelanina, esquematizada na
figura 3, envolve reações enzimáticas e não enzimáticas, tendo como passo inicial e
limitante a oxidação do aminoácido tirosina à dopaquinona pela metaloenzima
tirosinase (ANCANS et al., 2001). A dopaquinona é uma orto-quinona altamente
reativa que desempenha um papel chave no controle químico da melanogênese. Na
ausência de compostos com grupo sulfidril, como a cisteína, dopaquinona sofre
ciclização para formar ciclodopa que é rapidamente oxidada por reações redox à
dopacromo. Dopacromo então gradualmente e espontaneamente sofre rearranjo
para formar 5,6-dihidroxindol (DHI) e ácido 5,6-dihidroxindol-2-carboxílico (DHICA),
esse rearranjo é determinado pela dopacromo tautomerase, TRP1 e TRP2. A
oxidação e polimerização desses dihidroxindóis produzem eumelanina. Entretanto,
na presença de cisteína, cisteinildopas são oxidadas por reações redox com
25
dopaquinonas e cisteinildopaquinonas que, sequencialmente, levam à formação de
feomelanina (ITO e WAKAMATSU, 2008; VIDEIRA et al., 2013).
FIGURA 3. ESQUEMA DAS REAÇÕES NA BIOSÍNTESE DE MELANINA
FONTE: Adaptado de Parra (2007) com autorização de John Wiley and Sons (número: 4602170948154) NOTA: Representação esquemática da síntese de melanina (eumelanina e feomelanina) a partir da oxidação do aminoácido tirosina. Nesse processo, a síntese de feomelanina é favorecida, em detrimento da síntese de eumelanina, na presença de cisteína. Esse processo envolve reações enzimáticas e não enzimáticas. TYR- tirosinase; DQ- dopaquinona; DCT- dopacromo tautomerase; TYRP1- proteína relacionada a tirosinase 1; DHI- 5,6-dihidroxindol; DHICA- 5,6-dihidroxindol-2-carboxílico.
A melanogênese pode ser influenciada por diversos fatores intrínsecos e
extrínsecos, assim como por fatores genéticos, idade e etnia. Fatores extrínsecos
incluem a radiação UV e certos compostos químicos, enquanto fatores intrínsecos
incluem moléculas secretadas pelos queratinócitos e células inflamatórias (D’MELLO
et al., 2016).
A radiação UV é o principal fator regulador da melanogênese epitelial. A
exposição a essa radiação promove a secreção do hormônio α-MSH (hormônio
26
estimulante de alfa- melanócitos) pelos queratinócitos que fazem parte das unidades
epidermo-melânicas na pele (SLOMINSKI et al., 2012). Esse hormônio é secretado e
se liga a uma classe de receptores acoplados à proteína-G na membrana plasmática
dos melanócitos, chamados de receptores de melanocortina (MCR), principalmente
MCR1 que apresenta uma maior afinidade por esse hormônio (MILLINGTON, 2006).
A ativação dos receptores MCR1 promove um aumento na síntese de cAMP, através
da enzima adenilato ciclase (AC). O aumento de cAMP intracelular ativa a proteína
quinase A (PKA), que promove a fosforilação de CREB (elemento de resposta ao
cAMP). Por sua vez, pCREB atua como um fator de transcrição de vários genes,
incluindo o fator de transcrição associado à microftalmia (MITF). O aumento na
expressão de MITF promove a expressão de diversas enzimas da via melanogênica
como TYR, TYRP1 e DCT (PARK et al., 2009; VIDEIRA, et al., 2013; YAMAGUCHI,
et al., 2007). A figura 4 mostra um esquema da regulação da melanogênese pelo
hormônio α-MSH e indução de MITF.
Apesar desse processo ser regulado e confinado aos melanossomos,
condições anormais podem facilitar a liberação dos intermediários tóxicos para o
citosol da célula, permitindo a interação desses com os componentes celulares.
Esse é o caso de células de melanoma, que podem apresentar maior expressão das
enzimas da via melanogênica e, consequentemente, maior taxa de produção de
melanina (HARA et al., 1994) associadas com melanossomos estruturalmente
comprometidos (BOROVANSKÝ et al., 1991).
Enquanto a eumelanina é frequentemente associada ao papel fotoprotetor e
antioxidante (MEREDITH e SARNA, 2006), a feomelanina apresenta características
que indicam que sua presença pode trazer danos às células. Ranadive et al. (1986)
e Korytowski et al. (1987) demonstraram que a irradiação de feomelanina por
radiação UVA promoveu a geração de ROS, como radical superóxido (O2∙-) e
peróxido de hidrogênio (H2O2), respectivamente. Além disso, apesar de não
conseguirem comprovar de forma experimental, alguns autores sugerem que a
síntese de feomelanina pode levar à uma depleção de cisteína intracelular, que
comprometeria as defesas antioxidantes celulares, causado pela diminuição na
síntese de glutationa (MORGAN et al., 2013).
Estudos realizados com as duas formas de melanina, eumelanina e a
feomelanina, e com o seu precursor, o ácido 5,6-dihidroxi-indol-2-carboxílico
27
(DHICA), mostraram que esses compostos são capazes de promover quebras no
DNA, possivelmente através de reações do tipo Fenton, e ainda interferem na ação
de enzimas de reparo sobre essas lesões (PELLOSI et al., 2014; SUZUKAWA et al.,
2012).
Outras características da melanina envolvem a capacidade de captação de
cálcio intracelular (BUSH e SIMON, 2007; HOOGDUIJN et al.; 2004) e outros íons
metálicos (HONG et al., 2004), além da ligação a xenobióticos (KARLSSON e
LINDQUIST, 2013; LINDQUIST et al., 1986).
FIGURA 4. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA REGULAÇÃO DA MELANOGÊNESE PELA ATIVAÇÃO DO RECEPTOR MCR1
FONTE: O autor (2019), baseado em D’Mello et al. (2016), ilustrações (https://smart.servier.com/) NOTA: Eumelanina e feomelanina são sintetizadas dentro dos melanossomos a partir de reações catalizadas por enzimas specíficas como tirosinase (TYR), proteínas relacionadas a tirosinase (TYRP) e dopacromo tautomerase (DCT). A expressão dessas enzimas está diretamente relacionada à regulação pelo fator de transcrição de microftalmia (MITF). Esse fator é ativado pela fosforilação de CREB, pela proteína quinase A (PKA) em resposta ao aumento nas concentrações de cAMP, promovido pela ativação da adenilato ciclase (AC) pela ligação do hormônio α-MSH nos receptores melanocortina 1 (MCR1).
Além dos efeitos diretos da melanina citados anteriormente, o processo
melanogênico também parece desencadear efeitos importantes no contexto celular.
28
Após o estímulo da melanogênese em células de melanoma B16-F10, utilizando L-
tirosina e cloreto de amônio (NH4Cl), Cunha et al. (2012) observaram um aumento
nas concentrações de ROS, indicando sua produção durante a melanogênese. Os
autores demonstraram ainda que, o estímulo da melanogênese durante 48h resultou
na inibição da proliferação celular, aumentando o número de células na fase G1/G0
do ciclo celular, induzindo a célula a um estado de quiescência, e também foi capaz
de alterar o perfil de expressão de diversas proteínas, como ATP sintase, CDK3
(quinase dependente de ciclinas 3) e chaperonas, relacionadas ao metabolismo
energético, citoesqueleto e progressão do ciclo celular.
Utilizando a metodologia de estímulo anterior, Meira et al. (2017),
demonstraram que 48h de indução ao processo melanogênico resultaram em uma
redução de aproximadamente 50% na respiração celular. No entanto, esta inibição
da respiração não afetou o potencial de membrana mitocondrial (Δψm) e ainda
promoveu um aumento na massa mitocondrial das células submetidas ao estímulo,
sugerindo uma indução à biogênese mitocondrial em resposta a este efeito.
Chiarelli-Neto et al. (2014) observaram ainda que células de melanoma
submetidas ao estímulo da melanogênese, com L-tirosina e NH4Cl, tornaram-se
mais sensíveis a ação da radiação visível, promovendo a geração de ROS, aumento
na permeabilidade da membrana plasmática, danos ao DNA e levando a célula à
morte.
Ainda nesse contexto, células de melanoma murino B16-F10 com maior
concentração de melanina parecem apresentar maior sensibilidade à terapia
fotodinâmica (PDT) como demonstrado por Kalegari (2017). Nesse trabalho, a
autora submeteu as células ao estímulo melanogênico, com L-tirosina e NH4Cl, por
48h e, após o tempo de estímulo, as células foram tratadas com o
fotossensibilizador Rosa Bengala acetato (RBAc) e irradiadas por 15 min. Os
resultados mostraram que as células com maior concentração de melanina
apresentaram redução de até 60% na viabilidade celular e aumento no dano
oxidativo ao DNA nuclear, promovendo a formação de 8-oxo-2'-desoxiguanosina (8-
oxodGuo) e de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD).
4.2 MELANOMA
Diversos dos estudos realizados para elucidar o papel da melanina e da
melanogênese foram realizados em modelo de células de melanoma e voltados ao
29
tratamento antitumoral. Nesse contexto, Riley (1991) sugere que o processo
melanogênico poderia ser um possível alvo na terapia antitumoral, devido ao seu
poder nocivo e a sua alta atividade em células malignas. De fato, o autor cita dois
modelos para essa abordagem. O primeiro modelo (Calcanhar de Aquiles), baseia-
se no uso de substratos análogos para a tirosinase, que são projetados para
maximizar a geração de produtos reativos de oxidação da ortoquinona. Esses
produtos então, seriam liberados no citoplasma, através das membranas defeituosas
dos melanossomos, com um potencial para reagir com componentes celulares vitais
e causar danos irreversíveis. Já a segunda abordagem (Cavalo de Tróia), tem como
princípio o uso de precursores de melanina contendo radioisótopos que são
incorporados ao pigmento sintetizado e em conjunto ao tratamento radioterápico,
promovem danos e a morte das células tumorais (RILEY, 2003).
O melanoma é um dos mais raros e agressivos tumores de pele, sua
incidência é de apenas 2% quando comparado a outros tipos de tumores cutâneos
(SIEGEL, MILLER e JEMAL, 2018), entretanto, sua letalidade pode chegar a 86%
em pacientes diagnosticados tardiamente, já na fase metastática. Quando
diagnosticado precocemente, as chances de cura são de 95% (SATYAMOORTHY e
HERLYN, 2002).
Os melanomas são derivados dos melanócitos, que, em humanos, não se
dividem rapidamente, mas fatores ambientais, como a radiação UV, podem
promover a proliferação e induzir as células a sintetizar pigmentos citoprotetores. A
transformação maligna dos melanócitos é resultado de uma complexa interação
entre fatores genéticos e ambientais (SATYAMOORTHY e HERLYN, 2002).
A radiação UV, principalmente UVA (320-400nm) e UVB (280-320nm), tem
múltiplos efeitos sobre a pele, incluindo indução de mudanças genéticas, formação
de ROS, alterações na função imune e produção de fatores de crescimento (LO e
FISHER, 2014).
Mutações, deleções genéticas e o histórico familiar também estão associados
ao aparecimento do melanoma. Entre os genes que aparecem frequentemente
mutados nessas células estão os genes CDKN2A, PTEN, TP53, BRAF (HILL et al.,
2013; LO e FISHER, 2014). O histórico familiar de melanoma e tumores prévios
também são considerados fatores de risco associados a essa doença (LEONG et al.,
2012; THOMPSON, SCOLYER e KEFFORD, 2005).
30
O modelo aceito para explicar a progressão do melanoma, desde as primeiras
alterações no melanócito até o desenvolvimento da capacidade de invasão e
metástase, foi proposto por Clark et al. (1984). Nesse modelo, ilustrado pela Figura
5, alterações fenotípicas nos melanócitos, em resposta a mutações no DNA, levam à
proliferação clonal aberrante dessas células, formando o chamado nevo benigno,
que não progride, possivelmente devido à ativação do processo de senescência.
Melanócitos alterados são predispostos a danos acumulativos no DNA, que podem
resultar em um nevo displásico. Este, por sua vez, pode progredir para um estágio
de crescimento superficial (RGP- radial growth phase) que é limitado à epiderme e
tem baixíssimo potencial invasivo. Finalmente, células no estágio de crescimento
radial adquirem a habilidade de invadir a derme, passando para o estágio de
crescimento vertical (VGP- vertical growth phase), podendo alcançar os vasos
sanguíneos e sofrer metástase, colonizando outros órgãos, como o pulmão
(THOMPSON et al., 2005; ZAIDI et al., 2008).
FIGURA 5. ESQUEMA DA PROGRESSÃO DO MELANOMA A PARTIR DE MELANÓCITOS NORMAIS
FONTE: Adaptado de Zaidi et al. (2008) com permissão de Macmillan Publishers Ltd: Journal of Investigative Dermatology NOTA: Progressão do melanoma, no qual, o melanócito sofre sucessivos e acumulativos danos ao DNA, podendo adquirir a capacidade de invadir a derme e sofrer metástase. RGP- fase de crescimento superficial; VGP- fase de crescimento vertical.
Em relação ao diagnóstico do melanoma, o autoexame é aconselhável, uma
vez que a detecção precoce aumenta consideravelmente as chances de cura e a
31
expectativa de vida dos pacientes. Para uma avaliação prévia a fim de identificar
alguma pigmentação suspeita, a regra utilizada é a do ABCDE: A- assimetria; B-
bordas irregulares; C- coloração diferenciada; D- diâmetro maior que 6mm; E-
evolução (Figura 6) (RIGEL et al., 2010; TRONNIER et al., 2013). Quando há
suspeita de melanoma, a confirmação do diagnóstico pode ser realizada através de
microscopia epiluminescente, dermoscopia digital, análise histopatológica ou
imunohistoquímica utilizando marcadores específicos (TRONNIER et al., 2013).
FIGURA 6. COMPARAÇÃO ENTRE MELANOMAS E NEVO BENIGNOS
FONTE: O autor (2019), baseado em RIGEL et al. (2010), ilustrações (https://smart.servier.com/) NOTA: A figura mostra a comparação entre a morfologia das manchas características de melanoma e os nevos benignos, apresentando, o primeiro, morfologia ABCD: A- assimetria; B- bordas irregulares; C- mais de uma coloração; D- dimensões maiores que 6mm.
O tratamento do melanoma varia de acordo com o estágio do tumor. Para
tumores em estágios iniciais, com crescimento ainda radial, a melhor opção é a
excisão cirúrgica total (TRONNIER et al., 2013). No caso de melanomas em estágio
avançado e metastáticos, o tratamento se torna difícil, uma vez que essas células
apresentam resistência a terapias convencionais, devido a sua resistência à
apoptose, capacidade de evadir o sistema imune e habilidade angiogênica
(MÁRQUEZ-RODAS et al., 2011). Dacarbazina, temozolomida e fotemustina são os
quimioterápicos largamente utilizados no tratamento sistêmico contra melanoma
devido à baixa toxicidade (SARGSYAN et al., 2015). Quimioterápicos que atuam nos
genes BRAF como o Vemurafenib e o Dabrafenib, apresentam maior eficiência e
menor toxicidade quando comparados às terapias usuais, em casos de pacientes
que apresentam mutações nesse gene (LO e FISHER, 2014).
Recentemente, a imunoterapia tem surgido como uma forma promissora no
combate ao melanoma. A imunoterapia consiste em uma variedade de abordagens
que abrangem agentes modificadores imunológicos (citocinas e vacinas), vírus
32
oncolíticos, bem como inibidores de checkpoints imunológicos. O termo "terapia
passiva" refere-se à administração de citocinas, anticorpos e células imunes para
iniciar uma ação antitumoral sem gerar uma memória imunológica. Em contraste, a
imunoterapia "ativa" estimula o sistema imunológico do paciente a produzir um efeito
antitumoral específico ao antígeno, resultando em uma resposta duradoura
(CONSTANTINIDOU et al., 2018).
A presença da melanina pode proteger a célula tumoral, aumentando sua
resistência a terapias, como a terapia fotodinâmica (PDT), através da sua
capacidade de absorção em certos comprimentos de onda, o que poderia diminuir a
eficiência de alguns fotossensibilizadores, como a hipericina (BROZYNA et al., 2016;
HADJUR et al., 1996). Além disso, células de melanoma com maior conteúdo de
melanina são mais resistentes aos efeitos de ROS, indicando que o poder
antioxidante da melanina é outro fator de resistência contra o estresse oxidativo
induzido por essas terapias (HADJUR et al., 1996; HUANG et al., 2013).
Diversos mecanismos de resistência a apoptose foram caracterizados em
melanoma, como a capacidade de ligação da melanina ao cálcio, um importante
sinalizador das vias apoptóticas, demonstrado por Hoogduijn et al. (2004), a
superexpressão de fatores antiapoptóticos como Bcl-2 e Mcl-1 e a super-expressão
de transportadores ABC, responsáveis pelo efluxo de drogas das células
(GROSSMAN e ALTIERI, 2001; SOENGAS e LOWE, 2003; BEBES et al. 2011;
PINON et al., 2011; HUANG et al., 2013).
4.3 METABOLISMO ENERGÉTICO EM CÉLULAS DE MELANOMA
O ATP é a principal fonte de energia para as células e é produzido,
principalmente, através do metabolismo oxidativo e não oxidativo da glucose. A
fosforilação oxidativa produz até 32 moléculas de ATP por unidade de glucose,
enquanto a glicólise resulta em apenas 2 moléculas de ATP (NELSON e COX,
2018).
Uma característica das células tumorais é a capacidade de apresentar
glicólise aeróbica altamente ativa, através do aumento na captação de glucose e
regulação de enzimas da via glicolítica, em detrimento à fosforilação oxidativa
(OXPHOS), mesmo na presença de oxigênio, esse efeito é conhecido como Efeito
Warburg (glicólise aeróbica) (DIAZ-RUIZ et al., 2011).
33
Por unidade de glucose, a glicólise aeróbica é um meio ineficiente de gerar
ATP, quando comparada à quantidade obtida através da respiração mitocondrial. No
entanto, a taxa de metabolismo da glucose é maior, de tal forma que a produção de
lactato, a partir da glucose, ocorre 10 a 100 vezes mais rápido que a oxidação
completa da glucose na mitocôndria. Assim, essa diferença inerente à cinética é
umas das hipóteses que justificaria o motivo pelo qual as células empregariam a
glicólise aeróbica como fonte de ATP (LIBERTI e LOCASALE, 2016; NAYAK et al.,
2018).
Além da geração de energia, o efeito de Warburg foi proposto como um
mecanismo de adaptação a fim de suportar as exigências biossintéticas da
proliferação descontrolada. Neste cenário, o aumento do consumo de glucose é
usado como uma fonte de carbono para os processos anabólicos, necessários para
suportar a proliferação celular. Esse excesso de carbono é desviado para a geração
de nucleotídeos, lipídios e proteínas (EPSTEIN et al., 2017; LIBERTI e LOCASALE,
2016; NAYAK et al., 2018).
Essas mudanças no metabolismo energético têm como objetivo a produção
de precursores essenciais para a biossíntese de moléculas, a fim de sustentar a
sobrevivência, a rápida proliferação, invasão e metástase das células tumorais
(PAVLOVA e THOMPSON, 2016; SCHULZE e HARRIS, 2012), permitindo que as
células tumorais se adaptem às novas condições do microambiente tumoral
(PAVLOVA e THOMPSON, 2016).
Em células de melanoma, essa característica não parece ser exclusiva e o
balanço entre o metabolismo aeróbio e anaeróbio parece variar em resposta as
mudanças adversas no ambiente a fim de promover o crescimento e sobrevivência
do tumor (THEODOSAKIS et al., 2014). Moura et al. (2012), observaram que quando
comparadas à melanócitos normais, células de melanoma metastático WM1158
apresentaram níveis da atividade da OXPHOS maiores, ao mesmo tempo que
demais linhagens de melanoma apresentam maior captação de glucose e um
aumento relativo no metabolismo anaeróbico e produção de ácido lático (HALL et al.,
2013; THEODOSAKIS et al., 2014).
Poucos estudos focam nos efeitos do processo melanogênico sobre o
metabolismo celular. Além do trabalho de Meira et al. (2017), que evidenciou a
redução no consumo de oxigênio por células de melanoma murino B16-F10
submetidas ao estímulo da síntese de melanina; Aliprandini (2010), em condições
34
experimentais similares, observou uma diminuição na relação ATP/ADP nas células
B16-F10 submetidas ao estímulo melanogênico, quando comparadas às células não
estimuladas.
Em relação aos parâmetros mitocondriais, Daniele e Schiaffino (2014)
mostraram, através de tomografia eletrônica, que mitocôndrias de melanócitos
estabelecem contato físico com os melanossomos, através de pontes fibrilares de
mitofusina 2 (Mfn2), o que facilitaria a ação da melanina ou de intermediários da sua
síntese sobre a mitocôndria dessas células.
Boulton e Birch-Machin (2015) verificaram o impacto da hiperpigmentação,
induzida por L-tirosina e cloreto de amônio (NH4Cl), sobre a geração de ânion
superóxido e sobre os complexos enzimáticos da cadeia de transporte de elétrons
em 3 linhagens de melanoma humano (CHL1, FM55 e FM94), e concluíram que a
hiperpigmentação aumentou a produção de ânion superóxido pelo complexo II, cuja
expressão também estava aumentada nestas células.
Diversas alterações intracelulares estão relacionadas ao efeito Warburg, entre
elas, a desregulação do gene c-Myc e a atividade do fator induzível por hipóxia (HIF-
1α) (BRAHIMI-HORN, et al., 2011; HEIDEN et al., 2009; HSIEH et al., 2015). Esses
mecanismos ainda não estão completamente esclarecidos. O efeito de Warburg tem
sido ligado à hipóxia, entretanto, Lu et al. (2002) demonstraram que os produtos da
glicólise, lactato e piruvato, podem também regular a expressão gênica induzida pelo
fator induzível por hipóxia 1 (HIF-1), um importante fator de transcrição que regula
positivamente uma série de genes envolvidos no metabolismo, angiogênese,
sobrevivência celular e eritropoiese (SEMENZA, 2012). Sugerindo outras
possibilidades relacionadas ao efeito Warburg, além da condição de hipóxia
geralmente associada à transformação maligna.
4.4 FATOR INDUZÍVEL POR HIPÓXIA (HIF-1)
O fator de transcrição HIF-1 é um heterodímero composto por subunidades de
120 e 90 kDa, denominadas de HIF-1α e HIF-1β, respectivamente (WANG e
SEMENZA, 1995). Enquanto que HIF-1β é expresso constitutivamente, HIF-1α é
regulado conforme a disponibilidade de oxigênio.
Em condições de normóxia, HIF-1α encontra-se ligado à proteína Von Hippel-
Lindau (VHL) e está sujeito a poliubiquitinação, mediada por esta proteína, levando à
sua degradação proteossomal. A formação do complexo HIF-1α e pVHL é garantida
35
pela ação de prolil hidroxilases (PHD) que promovem a hidroxilação de resíduos de
prolina (P402/P564) em HIF-1α. Esses resíduos de hidroxiprolinas se ligam então ao
núcleo hidrofóbico de pVHL. As prolil hidroxilases (PHD) são dioxigenases que
requerem oxigênio e 2-oxoglutarato como substrato. Essas enzimas transferem um
átomo de oxigênio para o resíduo de prolina e o segundo átomo de oxigênio reage
com o 2-oxoglutarato, gerando succinato. Portanto, atividade de PHD em hidroxilar
HIF-1α depende da concentração de O2 e em condições de hipóxia, a degradação
de HIF-1α é interrompida, pela estabilização e desligamento da proteína VHL, o que
promove a sua ativação (Figura 7) (FEIGE et al., 2011; LEE et al., 2004; MASOUD e;
LI, 2015; SEMENZA, 2012).
Entre os alvos de HIF-1α estão diversas proteínas envolvidas no metabolismo
da glucose, como os transportadores de glucose 1 e 4 (GLUT1 e GLUT4), as
enzimas lactato desidrogenase A (LDH-A), piruvato desidrogenase quinase
isoenzima 1 (PDK1), hexoquinase 2 (HK2), os transportadores de monocarboxilato 4
(MCT4), e fatores angiogênicos, incluindo fator de crescimento vascular endotelial A
(VEGF), que promovem a transição do metabolismo oxidativo para o metabolismo
glicolítico (SEMENZA, 2012; SLOMINSKI et al., 2014; ZBYTEK et al., 2013).
36
FIGURA 7. ESQUEMA REPRESENTATIVO DA ESTABILIZAÇÃO E DEGRADAÇÃO DE HIF-1α
REGULADAS PELAS CONCENTRAÇÕES DE OXIGÊNIO
FONTE: O autor (2019), baseado em Huang et al. (2017) com permissão de Spring Nature (nùmero: 4602500512467) NOTA: Em condições de normóxia (20% de oxigênio), HIF-1α sofre degradação proteossomal, pela ação das polihidroxilases e consequente ligação com a proteína Von Hipple- Lindau (VHL). Em condições de hipóxia, VHL é S-nitrozilado perdendo sua função, impedindo sua ligação a HIF-1α, que então é translocado para o núcleo se ligando ao HIF-1β (constitutivamente expresso e não regulado pelas concentrações de O2), levando a expressão de inúmeros genes, incluindo aqueles relacionados à via glicolítica, como por exemplo, os transportadores GLUT1-4 (transportadores de glucose 1 e 4), LDH (lactato desidrogenase), piruvato desidrogenase quinase isoenzima 1 (PDK1), HK (hexoquinase) e fator de crescimento vascular endotelial A (VEGF).
Além disso, HIF-1α tem como alvo direto o gene que codifica para a enzima
piruvato desidrogenase quinase 1 (PDK1), promovendo sua expressão. Essa enzima
é responsável por fosforilar e modular negativamente o complexo piruvato
desidrogenase (PDH), que catalisa a conversão de piruvato à acetil-coenzima A
(Acetil CoA). Dessa forma, o metabolismo do piruvato através do ciclo do ácido
tricarboxílico (TCA) é desfavorecido, comprometendo a respiração mitocondrial (KIM
et al., 2006; PAPANDREOU et al., 2006).
Dessa forma, HIF-1α desempenha um papel importante no crescimento e na
progressão maligna dos tumores, induzindo a transcrição de genes que atuam na
adaptação de células a um microambiente deficiente em oxigênio (KOYASU et al.,
2018; PARKS et al., 2013; PARKS, CORMERAIS e POUYSSÉGUR, 2017).
37
Em melanócitos e em células de melanoma, HIF-1α parece desempenhar um
papel importante, também na presença de oxigênio. Slominski et al. (2014)
observaram que após estímulo na síntese de melanina através da suplementação do
meio de cultivo com L-tirosina, houve um acúmulo de HIF-1α e indução na
expressão dos seus genes alvos em células de melanoma humano SKMEL-188 e
melanoma de hamster AbC1. Os autores também verificaram, através de ensaios de
imuno-histoquímica em amostras de pacientes, uma relação positiva entre o estágio
do melanoma e a expressão de HIF-1α.
De fato, Buscà et al. (2005) já haviam demonstrado que, de forma restrita à
melanócitos, HIF-1α é alvo de MITF (fator de transcrição associado a microftalmia),
que regula HIF-1α de forma transcricional e independente da concentração de
oxigênio. MITF também desempenha um papel chave na síntese de melanina,
regulando proteínas chaves na melanogênese como a tirosinase (HSIAO e FISHER,
2014), assim como na diferenciação e sobrevivência de melanócitos (BUSCÀ et al.,
2005).
Ainda, estudos realizados por Feige et al. (2011) mostraram que a expressão
de HIF-1α era inversamente proporcional a de MITF, indicando que essa regulação
ocorria de forma mútua, sendo que a superexpressão de HIF-1α promoveu a inibição
na expressão de MITF.
Cheli et al. (2012) relataram que células de melanoma murino B16-F10
submetidas à hipóxia apresentam maior poder tumorigênico e metastático em
ensaios “in vivo”, sugerindo ainda que células de melanoma que apresentam taxa de
proliferação mais lenta ou paradas na fase G1/G0 do ciclo celular teriam maior
capacidade de formar tumores e progredir para metástases. De fato, HIF-1α pode
promover o crescimento de diversos tumores de diferentes formas: através da
regulação da captação de nutrientes, atuando sobre transportadores de glucose
GLUT1 e GLUT4 e transportadores de aminoácidos como LAT1 (transportador de
aminoácido tipo-L 1); modulando a expressão de proteínas envolvidas na via
glicolítica como PDH (piruvato desidrogenase) e LDH (lactato desidrogenase);
promovendo a maior resistência a apoptose, através da indução da fissão
mitocondrial e recrutamento dos fatores BNIP3 e BNIP3L para a membrana da
mitocôndria; e através da regulação de pH intra e extracelular através da regulação
de transportadores de lactato, como MCT1 e MCT4 (transportadores de
monocarboxilatos 1 e 4), e de transportadores anidrase carbônica IX e XII ligadas à
38
membrana (CHICHE et al., 2010; PARKS et al., 2016; PARKS et al., 2013;
SEMENZA, 2012).
39
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 MATERAIS E REAGENTES
Células de melanoma murino B16-F10 foram cedidas pelo Professor Dr.
Roger Chammas da Universidade de São Paulo (USP). Essa linhagem foi obtida a
partir de camundongos da linhagem C57BL/6.
Meio RPMI-1640 foi adquirido da Cultilab (Campinas, Brasil). Soro fetal
bovino (SFB) e gentamicina, ambos da Gibco® foram adquiridos da Induslab (Brasil).
Ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfônico (HEPES), bicarbonato de
sódio (NaHCO3), tripsina, melanina sintética, cristal violeta, brometo de 3-metil-[4-5-
dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazólio (MTT), dimetilsulfóxido (DMSO) rotenona, ADP,
carbonil cianeto p-trifluormetoxifenilhidrazona (FCCP), antimicina A, nicotinamida
adenina dinucleótido hidreto (NADH), nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+),
foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Brasil). Forscolina, Ácido Kójico, meio DMEM
básico, sem glucose, glutamina, NaHCO3 ou HEPES (D5030) foi adquirido de Sigma
(França).
MitoSOXTM Red, kit Taq DNA Polymerase (Invitrogen™) e anticorpo primário
anti-tirosinase adquiridos da ThermoFisher (Brasil).
Anticorpos primários monoclonais anti-Glut-1 e anti-Nrf2, anti-tirosinase
foram adquiridos pela Abcam (França), anticorpos primários policlonais anti-HIF-1α
(RICHARD et al. 1999) e ARD-1 foram produzidos no laboratório de Tumor Hipóxia e
Metabolismo (Nice –França) (BILTON et al. 2005)
Anticorpos secundários: anti-rato e anti-coelho foram adquiridos pela
Promega (França).
5.2 CULTIVO DE CÉLULAS
As células de melanoma B16-F10, foram mantidas em meio RPMI-1640
suplementado com 7,5% (v/v) de soro fetal bovino, 0,8mM de bicarbonato de sódio,
20mM de HEPES (pH 7.4) e 50μg/mL de gentamicina, acondicionadas em
incubadora umidificada, contendo 5% (v/v) CO2 à 37°C (CUNHA et al. 2012). Para
alguns ensaios, as células foram mantidas em atmosfera de 1% de O2 em câmara
anaeróbica (Ruskinn Technology Ltd, Bridgend, South Wales) onde o ar foi
substituído por N2. O CO2 foi mantido a 5% em uma temperatura de 37ºC.
40
5.3 ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE
O estímulo da síntese de melanina, foi realizado de duas maneiras. Pelo
tratamento das células com meio de cultura RPMI-1640 suplementado com L-
tirosina e NH4Cl nas concentrações de 0,4mM e 10mM, respectivamente, pelo
período de 24 ou 48h (Cunha et al. 2012). O cloreto de amônio (NH4Cl), uma base
lisossomotrófica, aumenta o pH do melanossomo e promove a maturação
melanossomal, enquanto a adição de L-Tirosina, um substrato da síntese de
melanina cria um ambiente ótimo para a enzima tirosinase (ANCANS et al. 2001;
KONGSHOJ et al. 2007).
Outra forma de estímulo utilizada foi a incubação das células B16-F10 com 25μM
do composto forscolina, por 24 ou 48h. A forscolina é um diterpeno, permeável à
membrana plasmática, e funciona como ativador da enzima adenilato ciclase (AC).
Da mesma maneira que ocorre in vivo, através do hormônio α-MSH, a ativação da
adenilato ciclase pela forscolina, promove o aumento nos níveis de cAMP
intracelular, ativando o fator de transcrição MITF, responsável pela diferenciação dos
melanócitos e indução da expressão das enzimas da via melanogênica, como
tirosinase, TYRP1 e TYRP2, promovendo dessa forma, o aumento na síntese de
melanina (BERTOLOTTO et al. 1996; BUSCÀ et al. 2005; D’ORAZIO, 2015 e PINTO
et al. 2008).
Para alguns experimentos, foi também utilizado ácido kójico na concentração
de 200μM a fim de inibir a produção de melanina. O ácido kójico (5-hidroxi-2-
(hidroximeti1)--pirone) é um metabólito de origem fúngica, com poder quelante de
cobre, que apresenta característica inibitória da atividade de monofenolase da
enzima tirosinase e uma inibição mista da sua atividade de difenolase (CHANG,
2009 e SINGH et al. 2016).
5.4 QUANTIFICAÇÃO DE MELANINA
Para a medida da concentração de melanina, as células foram plaqueadas
(3x105 céulas/ placa) em placas de 60mm. Após 24 ou 48h de estímulo, as células
foram lavadas com PBS, tripsinizadas e centrifugadas a 1200rpm por 5 min. As
células foram lisadas com 300μL de solução de NaOH 1M contendo 10% de DMSO.
Uma alíquota de 10μL foi retirada para quantificação posterior de proteínas. O
restante (290μL) foi incubado a 90ºC por 1h ou 37ºC overnight. Após o tempo de
incubação, a absorbância foi lida a 450nm usando leitor de microplacas (EPOCHTM).
41
Para determinar a concentração de melanina, a absorbância foi comparada a uma
curva padrão de melanina sintética (Sigma) e o dados normalizados pela
concentração de proteínas. Os resultados foram expressos em μg de melanina/μg
de proteína (HOSOI, ABE e SUDA, 1985; YOO et al., 2007).
5.5 ATIVIDADE DA TIROSINASE
A atividade da tirosinase foi determinada como atividade de DOPA- oxidase,
como descrito por Takashi e Parsons (1992) e Winder e Harris (1991), com
pequenas modificações. Nesse ensaio, as células B16-F10 foram plaqueadas a uma
densidade de 3x105 células por placa em placas de 60mm e submetidas ou não ao
estímulo da melanogênese por 48h. Após o período de incubação, as células foram
lavadas duas vezes com PBS e lisadas por gelo-degelo em solução de PBS 0,1M
pH 6.8 contendo 0,1% de Triton X-100 e inibidores de proteases. O lisado foi então
centrifugado a 10.000g por 10 min. Em uma placa de 96 poços, 50μL do lisado foi
adicionado juntamente com 100μL de PBS 0,1M pH 6.8 e 50μL da solução de L-
DOPA (concentração final= 10mM), preparada poucos minutos antes do
experimento. Após a 30 min de incubação a 37ºC, a atividade da tirosinase foi
avaliada espectrofotometricamente pela oxidação de DOPA a dopacromo a 475nm,
utilizando leitor de microplacas (EPOCHTM). Os valores foram normalizados pela
concentração de proteínas e os resultados expressos em % da atividade da
tirosinase comparado ao controle.
5.6 VIABILIDADE E PROLIFERAÇÃO CELULAR
A viabilidade celular foi monitorada através do método do MTT (brometo de
3-metil-[4-5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazólio). Segundo o princípio do método, as
células viáveis e metabolicamente ativas reduzem o sal de tetrazólio a formazan,
cristais solúveis em DMSO, que podem ser quantificados a 550nm (MOSMANN,
1983).
As células foram plaqueadas (5x10³ células/poço) em placas de 96 poços e
após 24h para adesão, o meio de cultura foi substituído pelo meio suplementado
com 25μM de forscolina e/ ou 200μM de ácido kójico. Após 24 e 48h de estímulo, o
meio foi retirado e substituído por solução de 0,5mg/mL MTT em HBSS. As culturas
foram então incubadas a 37°C, em atmosfera de 5% de CO2 durante 3h. Após o
tempo de incubação, o meio foi retirado e os cristais de formazan dissolvidos em
42
200μL de DMSO e absorbância mensurada em leitor de microplacas (EPOCHTM) a
550nm, utilizando DMSO como branco. Os resultados foram expressos em
porcentagem de células viáveis, considerando 100% para o controle.
Já a proliferação celular foi determinada pelo método do cristal violeta que
cora ácidos nucléicos de células aderidas e fixadas, de acordo com Gillies et al.
(1986). Para esse experimento, células B16-F10 foram plaqueadas (5x10³
células/poço) em placas de 96 poços e após 24h de adesão foi realizado o estímulo
da síntese de melanina durante 24 e 48h, com 25μM de forscolina ou a inibição
desse estímulo através da suplementação do meio com 200μM de ácido kójico,
inibidor competitivo da enzima tirosinase. Após os tempos de estímulo, as células
foram lavadas com PBS e fixadas com metanol absoluto (100μL/poço) durante
10min em temperatura ambiente. Em seguida, o metanol foi removido e adicionado
100μL de cristal violeta (0,2% diluída em etanol 2%) por 3 min. Por fim, as células
foram submetidas a sucessivas lavagens com PBS, para retirada do excesso e o
corante foi eluído com a adição de citrato de sódio 0,05M em etanol 50%. A
absorbância foi mensurada em leitor de microplacas (EPOCHTM) a 550nm e os
resultados expressos em porcentagem de células viáveis (células aderidas),
considerando 100% para o controle.
Em relação aos mutantes B16-F10 WT e ATP5A1-KO, a viabilidade e
proliferação celular foram determinadas como descrito a seguir. As células foram
plaqueadas em placas de 6 poços a uma densidade de 4x104 células/poço. Após o
tempo de adesão de 24h, as células foram mantidas em condições de normóxia ou
hipóxia (1% de oxigênio), em câmara anaeróbica (Ruskinn Technology Ltd,
Bridgend, South Wales) por 24, 48 e 72h. O número de células totais e de células
viáveis, medida através da marcação com iodeto de propídeo, foi determinada pelo
equipamento ADAM-MC (Digital Bio, NanoEnTek Inc., Seoul, Korea). A taxa de
proliferação celular foi obtida através da razão entre o número total de células
obtidas em cada período em relação ao número total de células em 24h (resultado
no tempo x/ resultado em 24h = taxa de dobramento).
5.7 ENSAIO CLONOGÊNICO
A capacidade de formar colônias a partir de células individuais na presença
de indutores da via melanogênica foi determinada por ensaio clonogênico, de acordo
com De Padua et al. (2017). As células B16-F10 foram plaqueadas em baixa
43
densidade (1000 células/ placa) em placas de 60mm. Após o tempo de adesão
(24h), o meio de cultura foi suplementado com os compostos indutores (25μM de
forscolina ou 10mM de NH4Cl e 0,4mM de L-tirosina), na presença ou não de 200μM
de ácido kójico. A incubação foi mantida até a visível formação de colônias no grupo
controle (7 dias), sem substituição do meio nesse período, e então coradas com
corante cristal violeta (0,2% diluída em etanol 2%). Esse ensaio também foi
realizado em células mantidas em meio RPMI-1640 não contendo glucose ou na
presença de 3μM de oligomicina.
Em relação ao ensaio clonogênico realizado com o mutante B16-F10
ATP5A1-KO, as células foram plaqueadas em uma densidade baixa (1000 células/
placa) em placas de 60mm. Após 24h para adesão, o meio de cultivo foi substituído
por meio contendo ou não glucose, glutamina e 3μM de oligomicina. As células
foram mantidas em condições de normóxia e hipóxia (1% de O2) e a formação de
clones foi observada após 7 dias, sem substituição do meio nesse período, através
da coloração com o corante Giemsa (Sigma-Aldrich, Hannover, Germany).
5.8 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE RADICAL SUPERÓXIDO (O2•-)
MITOCONDRIAL
A produção de radical superóxido foi mensurada através da utilização da
sonda MitoSOXRed (TermoFisher) de acordo com as especificações do fabricante.
As células foram plaqueadas (5x10³ células/ poço) em placas pretas de 96 poços e
após o tempo de adesão submetidas ao estímulo da melanogênese por 12, 15, 24 e
48h com 0,4mM de L-Tirosina e 10mM de NH4Cl ou 25μM de forscolina, na
presença ou não de ácido kójico. Após esse período, o meio de estímulo foi retirado
e as células lavadas 1 vez com PBS, e então incubadas com 5μM de MitoSOXRed
por 10 min a 37ºC. A intensidade de fluorescência foi obtida em leitor de microplacas
TECAN (Infinity) com valores de excitação e emissão de 510/580nm. Os valores
foram normalizados pela concentração de proteínas.
A sonda MitoSOXRed (Molecular Probes) é um composto derivado do
brometo de etídio que apresenta uma alta afinidade pela mitocôndria e, nesta
organela é oxidado especificamente por radicais superóxido, e não por outras
espécies reativas de oxigênio ou nitrogênio. O produto oxidado torna-se fluorescente
ao ligar-se ao DNA mitocondrial (ROBINSON et al. 2008).
44
5.9 AVALIAÇÃO DOS DANOS OXIDATIVOS AO DNA MITOCONDRIAL
A determinação dos níveis de dano ao DNA mitocondrial (mtDNA) após o
estímulo da melanogênese foi realizada em colaboração com a Profª. Drª. Nadja C.
Souza-Pinto do Departamento de Bioquímica (IQ) da Universidade de São Paulo
(USP). O principio desse método se baseia na utilização de uma Taq polimerase de
alta afinidade capaz de amplificar longos fragmentos de mtDNA (10Kb). A
inabilidade de amplificar o DNA a partir de um dano oxidativo, resulta na
amplificação de pequenos fragmentos de DNA que após a corrida em gel de
agarose e marcação com brometo de etídio, resulta em uma banda com intensidade
inversamente proporcional ao número de danos. Um fragmento curto de 128bp
também foi amplificado e utilizado como normalizador, uma vez que por
probabilidade, apresenta menor chance de sofrer danos (KOVALENKO e SANTOS,
2009).
As células B16-F10 foram plaqueadas (5x105 células/ placas) em placas de
100mm e submetidas ao estímulo da melanogênese através da suplementação do
meio de cultura com 10mM de NH4Cl e 0,4mM de L-tirosina. Após 48h de estímulo,
as células foram tripsinizadas, centrifugadas a 1200rpm por 5 min e o pellet
congelado a -80ºC até o momento do experimento.
O DNA total de células, foi extraído através da utilização do kit DNeasy Blood
and Tissue (Qiagen). As amostras foram diluídas em água ultrapura (Milli-Q) a uma
concentração final de 6ng/μL de DNA.
O fragmento curto de mtDNA amplificado foi o Ms Sml mt RNR1, de tamanho
128bp, uma região não codificante para proteínas (www.genecards.org). Para esse
fim, foi realizado uma PCR utilizando-se o kit Taq DNA Polymerase (Invitrogen;
#10342-053), com uma Taq polimerase padrão, 10μM dos primers (forward e
reverse), 10mM dNTP, 50mM MgCl2 e 6ng/μL DNA. Após a amplificação foi
realizada uma eletroforese do produto em gel de poliacrilamida 10%, não
desnaturante durante 2h a 60V. Para a corrida as amostras foram marcadas com
Orange DNA Loading Dye (Thermo, #R0631) e como padrão de peso molecular,
GeneRuler Low Range DNA Ladder (Thermo, #SM1193). A sequência dos primers e
o programa utilizado no termociclador estão mostrados na tabela 1.
Em relação ao fragmento longo de mtDNA (Ms XLmt), o fragmento
amplificado tem tamanho de 10090bp, nesse caso, foi realizado uma PCR overnight
utilizando-se o kit AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen,
45
#12346086), 10μM primer forward, 10μM primer reverse, 10mM dNTP, 50mM MgCl2
e 6ng/μL DNA. Após a amplificação, o produto foi fracionado em gel de agarose 1%,
corado com Orange DNA Loading Dye (Thermo, #R0631) e marcador de padrão de
peso molecular, Lambda DNA/HindIII. A corrida foi realizada a 80V por 2h. A
sequência dos primers e o programa utilizado no termociclador estão mostrados na
tabela 1.
Em ambas as PCRs, foram realizadas reações controle com a metade de
DNA das amostras da condição controle.
Após o fracionamento das regiões amplificadas, por gel de poliacrilamida ou
agarose, os géis foram incubados em solução de brometo de etídio 4μg/mL por
cerca de 15 min e fotografados sob luz UV em aparelho fotodocumentador. A
intensidade/ área das bandas foram quantificadas por meio do software ImageJ e os
resultados para o fragmento longo normalizados em relação aos resultados do
fragmento curto.
ALVO SEQUÊNCIA DOS PRIMERS PRODUTO PROGRAMA
MsSmlmt
RNR1
Fw AACCTCCATAGACCGGTGTAAAA
128bp
94ºC por 30min (1 ciclo);
94ºC por 30seg, 55ºC por
30s, 72ºC por 1min (22
ciclos).
Rv TTTATCACTGCTGAGTCCCGT
MsXLmt
Fw GCCAGCCTGACCCATAGCCATA
ATAT 10090bp
94ºC por 3s (1 ciclo); 94ºC
por 30s, 55ºC por 30 s,
68ºC por 18min (22
ciclos).. Rv
GAGAGATTTTATGGGTGTAATG
CGG
TABELA 1. SEQUÊNCIA DOS PRIMERS E PROGRAMA DO TERMOCICLADOR
FONTE: O Autor (2019)
5.10 ANÁLISE METABÓLICA: TAXA DE RESPIRAÇÃO CELULAR E
ACIDIFICAÇÃO EXTRACELULAR
As taxas de consumo de oxigênio (OCR) e de acidificação extracelular
(ECAR) das células B16-F10 após o estímulo da melanogênese foram realizadas
através do equipamento Seahorse XF24 extracellular flux analyzer (Seahorse
Bioscience, MA, USA) de acordo com protocolo utilizado por DE PADUA et al.
(2017). Para esse experimento as células foram plaqueadas em uma densidade de
46
3x104 células em placas de 24 poços próprias do aparelho, para que em 72h a
confluência total fosse atingida. Após 24h do plaqueamento, as células foram
incubadas por 48h com 25μM de forscolina e 200μM de ácido kójico, quando
necessário. Uma hora antes da análise, o meio de cultura foi substituído pelo meio
de ensaio (sem glucose, piruvato, soro fetal bovino ou tampão, D5030- Sigma) e as
placas foram incubadas a 37ºC na ausência de CO2. Os níveis basais de OCR e
ECAR foram medidos por 24 min, seguido do ensaio de estresse mitocondrial
(10mM glucose, 1μM oligomicina, 3μM FCCP, 1μM rotenona/1μM antimicina A). Os
resultados foram normalizados pela concentração de proteínas e representados
como mpH/min/μg protein para ECAR e como pMoles O2/min/μg protein para OCR.
No caso dos ensaios com os mutantes knockout da subunidade alfa da ATP-
sintase (B16-F10 ATP5A1-KO), a densidade celular para a linhagem selvagem (WT)
foi de 105 células/poço e para as células mutantes 1,5x105 células/poço. O ensaio foi
realizado após 24h ao plaqueamento.
5.11 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE LACTATO EXTRACELULAR
As células B16-F10 (106) foram plaqueadas em placas de 100mm e após o
tempo para adesão (24h) foram estimuladas por 48h com 25μM de forscolina, na
presença ou não de 200μM de ácido kójico. Os sobrenadantes foram centrifugados
(8000g, 4°C, por 5 min) e analisados pelo equipamento Cobass c701 instrument
(Roche), em colaboração com o laboratório de Bioquímica da Universidade de Nice.
Este método é baseado na conversão enzimática de lactato a piruvato pela lactato
oxidase, juntamente com a reação colorimétrica de peróxido de hidrogênio formado
na primeira reação, resultando em um composto colorido, cuja intensidade é medida
espectrofotometricamente e é diretamente proporcional à concentração de lactato.
Em relação aos experimentos realizados com o mutante ATP5A1-KO, as
células foram plaqueadas (106) e o sobrenadante analisado após 3, 6 e 24h. Os
resultados foram normalizados pela quantidade de proteína e expressos em mM de
lactato/ μg de proteína.
5.12 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS POR WESTERN
BLOTTING
Para obtenção dos extratos proteicos, as células foram plaqueadas em placas
de 60mm e lisadas em tampão Leammli 1,5x (65,8mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS,
47
26.3% (w/v) glicerol, 0,01% azul de bromofenol). A determinação de proteínas foi
realizada através do kit BCA (Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit)
seguindo as especificações do fabricante.
Para a realização do ensaio, 40μg/mL de proteínas foram separadas em uma
eletroforese em gel de 10% SDS-PAGE e transferidas em uma membrana de PVDF
(Millipore). As membranas foram bloqueadas utilizando 5% de leite desnatado em
tampão TN (50mM de TRIS-HCl pH 7,4, 150mM de NaCl). Os anticorpos primários
para HIF-1α (anticorpo policlonal produzido no laboratório), NRF2 (Abcam,
ab137550), GLUT-1 (Abcam, ab652), tirosinase (Abcam, ab180753 e TermoFisher
T311), ATP5A1 (Abcam, ab14748) e o loading control ARD1 (produzido em
laboratório) foram incubados overnight em câmara fria a 4ºC. Os anticorpos
secundários anti-mouse e anti-rabbit (Promega) foram incubados por 1h a
temperatura ambiente e as bandas imunoreativas detectadas pelo sistema ECL
(Amersham Biosciences). A quantificação das bandas foi realizada utilizando o
software ImageJ e normalizados pela intensidade do loading control, ARD1. ARD1
(arrest-defective-1 protein) é uma acetil-transferase, utilizada como loading control
em técnicas de western blotting em alguns trabalhos, tanto pelo reduzido tamanho
(~33kDa) como pela não regulação em condições de hipóxia (BILTON et al., 2005;
DE PADUA et al., 2017)
5.13 SILENCIAMENTO DOS GENES TYR E ATP5A1 POR CRISPR/Cas9
Para o silenciamento dos genes TYR e ATP5A1, que codificam para a enzima
tirosinase e para a subunidade alfa da ATP sintase, respectivamente, as células
B16-F10 foram plaqueadas (1x106 células/ placa) em placas de 100mm e após o
tempo de adesão (24h) foram transfectadas com o plasmideo pSpCas9(BB)-2A-GFP
(PX458). Esse plasmideo contendo a região codificante para a proteína fluorescente
GFP e o gRNA para os genes de interesse foi desenhado Engenheiro Dr. Jérôme
Durivault, do laboratório do Centre Scientifique de Monaco, utilizando a ferramenta
CRISPR Design Tool (http://crispr.mit.edu), as sequências do gRNA estão
apresentadas na tabela 2.
Para a transfecção foi utilizado o kit JetPRIME® (Poly plus transfection,
Illkirch, France) seguindo as especificações do fabricante. No dia seguinte, as
células GFP positivas foram selecionadas através de cell sorting (FACS) e
adicionadas individualmente a cada poço de 4 placas de 96 poços contendo meio
48
RPMI-1640 que foram condicionadas em incubadora umidificada, contendo 5% (v/v)
CO2 à 37°C. Os clones que surgiram foram analisados por western blotting, no caso
do knockout para o gene ATP5A1, ou análise enzimática, no caso do silenciamento
da enzima tirosinase. Por fim, dois clones de cada silenciamento foram escolhidos
para a realização dos ensaios.
ALVO SEQUÊNCIA DO gRNA
TYR TCTGCCTGAAAGCTGGCCGC (AGG)
ATP5A1 GCCGTGCCCTCCCTCGACGGG
TABELA 2. SEQUÊNCIA DO RNA GUIA (gRNA)
FONTE: O autor (2019).
5.14 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ATPASE E CITRATO SINTASE
A avaliação da atividade do complexo V da cadeia de transporte de elétrons
mitocondrial foi realizada em colaboração com Dr. Konstantina Fragaki do
laboratório de genética mitocondrial do Centre Hospitalier Universitaire de Nice
(CHU). A análise da atividade do complexo V foi realizada de acordo com Barrientos
et al. (2009), medindo-se a hidrólise de ATP, espectrofotometricamente, de forma
indireta pela oxidação do NADH em um ensaio acoplado a reação de redução do
piruvato a lactato, mediada pela lactato desidrogenase (LDH). Nesse sistema, o ATP
é hidrolisado pela ATPase em ADP + Pi. O fosfoenolpiruvato é convertido a piruvato
com a produção de novo ATP (sistema regenerador para não limitar o ATP no
sistema). O piruvato formado é reduzido a lactato (devido a presença de LDH), com
a oxidação do NADH a NAD+. Assim, a quantidade de piruvato formado é
dependente da disponibilidade de ADP proveniente da atividade da ATPase e a sua
redução (com a oxidação de NADH) reflete indiretamente a atividade da ATPase
(hidrólise de ATP).
Para esse experimento, a linhagem parental (WT) e o mutante B16-F10
ATP5A1-KO, foram cultivados em placas de 150mm até atingir a confluência. As
células foram então, lavadas com PSB, tripsinizadas e centrifugadas a 1400rpm por
7 min a 4ºC. O pellet de células foi submetido a imersão em nitrogênio líquido por 15
min e posteriormente congelado a -80ºC até o momento do uso. No dia da análise,
as células foram suspendidas e lisadas utilizando tampão específico (20mM Tris-
49
HCl, 0,25M sucrose, 40mM KCl, 2mM EGTA, pH 7.2) suplementado com digitonina,
um detergente não iônico usado para permeabilizar membranas celulares. Após 10
min em gelo, as células foram centrifugadas 2x a 5000rpm durante 5 min a 4ºC e
ressuspensas em 100μL do mesmo tampão, sem digitonina. Em uma cubeta foram
adicionados a amostra (10μL) e o tampão de reação para dar início a reação, a
37ºC. Esse tampão continha, 50mM Tris·Cl, pH 8, 5mg/ml BSA, 20mM MgCl2, 50mM
KCl, 15μM CCCP, 5μM antimicina A, 10mM PEP, 2,5mM ATP, 4U lactato
desidrogenase e piruvato quinase e 1mM NADH. A leitura da absorbância em
340nm foi realizada durante 3 min. Após o período de incubação, foram adicionados
3μM de oligomicina e a leitura realizada por mais 3 min, a fim de subtrair a atividade
de ATPase não acoplada a cadeia de transporte de elétrons. Os resultados foram
normalizados pela concentração de proteínas e mostrados como nmol de NADH
oxidado/min/mg de proteína, sendo que cada nmol de NADH oxidado
correspondente a 1nmol de fosfato liberado.
A atividade da citrato sintase também foi avaliada como marcardor da
atividade do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). A amostra de células foi incubada
por 5 min a 30ºC solução contendo 10mM Tris-HCl, pH 7.5, 0,2% Triton X-100,
0,1mM DTNB, 0,2mM acetil-CoA. O baseline foi mensurado a 412nm por 5 min. A
reação foi iniciada com a adição de 0,5mM de oxalacetato, preparado pouco antes
do uso, e acompanhada por 5 min a 412nm. A taxa de atividade da citrato sintase foi
expressa em nmol de DTNB reduzido/ minuto/ mg de proteína (BARRIENTOS et al.
2009).
5.15 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram analisados utilizando o software GraphPad Prism 6, e
submetidos a análise estatística através do Student's T test ou ANOVA seguido do
teste de Tukey. Níveis de significância estão mostrados nas legendas das figuras.
50
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 EFEITOS DA MELANOGÊNESE SOBRE A VIABILIDADE E PROLIFERAÇÃO
CELULAR
A melanina é um polímero não proteico sintetizado a partir da oxidação do
aminoácido L-tirosina pela enzima tirosinase (D’MELLO et al., 2016). Sua síntese
pode ser induzida em culturas de melanócitos ou em células de melanoma de
diferentes maneiras, como por exemplo, utilizando-se agonistas dos receptores
MCR, como os hormônios α-MSH e adrenocorticotrópico (ACTH), ou ainda através
da irradiação das células por radiação UV (MILLINGTON, 2006; VILLAREAL et al.,
2017).
Neste estudo, foram utilizados dois diferentes protocolos de indução do
processo melanogênico. O primeiro, foi descrito por Kongshoj et al. (2007) e
adaptado por Cunha et al. (2012). Nesse protocolo, células de melanoma murino
B16-F10 foram cultivadas na presença de 0,4mM de L-tirosina e 10mM de cloreto de
amônio (NH4Cl) por 24 ou 48h. O cloreto de amônio, uma base lisossomotrófica,
aumenta o pH do melanossomo e promove a maturação melanossomal, enquanto a
adição de L-tirosina, um substrato da síntese de melanina, cria um ambiente ótimo
para a enzima tirosinase (ANCANS et al., 2001 e KONGSHOJ et al., 2007). De fato,
como representado na Figura 8 A-B, é possível observar a coloração escura no
pellet de células após 24 e 48h de estímulo, indicando a maior produção de
melanina por essas células.
FIGURA 8. IMAGENS REPRESENTATIVAS DO PELLET DE CÉLULAS APÓS O ESTÍMULO
FONTE: Meira et al. (2017) NOTA: (A-B) Imagens representativas do pellet celular após 24h (A) e 48h (B) de estímulo na síntese de melanina utilizando 0,4mM de L-tirosina e 10mM de NH4Cl.
51
A concentração de melanina intracelular foi mensurada,
espectrofotometricamente, após o tempo de estímulo de 24 e 48h. Os resultados
mostram que há um aumento significativo na produção de melanina em 24h
(aproximadamente 5 vezes) e, após 48h de tratamento com 0,4mM de L-tirosina e
10mM de NH4Cl, esse aumento torna-se ainda mais expressivo, chegando a 10
vezes quando comparado ao grupo controle (Figura 9 A-B).
FIGURA 9. DOSAGEM DE MELANINA TOTAL EM CÉLULAS TRATADAS COM L-TIROSINA E NH4Cl
FONTE: O Autor (2019) NOTA: Analise espectrofotométrica da concentração de melanina intracelular no lisado de células após 24 e 48h de estímulo. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em duplicata e os resultados são expressos como μg de melanina/ μg de proteína (*p≤0,005;***p≤0,001; ****p≤0,0001).
Neste trabalho, a melanogênese também foi induzida pela incubação das
células B16-F10 com o composto forscolina, numa concentração de 25μM, conforme
descrito por Buscà et al. (2005). A forscolina é um composto diterpeno, permeável à
membrana plasmática, conhecido pelo seu papel ativador da enzima adenilato
ciclase. Essa enzima catalisa a conversão de ATP a cAMP, uma importante
molécula de sinalização celular envolvida em diversas funções como diferenciação,
crescimento e metabolismo celular (HANOUNE e DEFER, 2001; SUNAHARA et al.,
1996). Essa ativação não é específica, uma vez que a forscolina é capaz de ativar 8
das 9 isoformas da enzima adenilato ciclase expressas em células de mamíferos
(PINTO et al., 2008). O aumento nos níveis de cAMP intracelular, promove a
ativação de MITF (fator de transcrição associado a microftalmia) induzindo a
52
expressão das enzimas da via melanogênica, como a tirosinase e as proteínas
relacionadas a tirosinase (TYRP1 e TYRP2) (BERTOLOTTO et al., 1996; D’ORAZIO
et al., 2006; PINTO et al., 2008).
A incubação das células de melanoma murino B16-F10, por 48h, com 25μM
de forscolina promoveu um aumento de, aproximadamente, 50% na atividade
difenolásica da enzima tirosinase, medido através da oxidação de L-DOPA a
dopacromo, como mostrado na figura 10. Podemos observar também que, a
presença de ácido kójico, inibidor competitivo da enzima tirosinase (TAKASHI e
PARSONS, 1992; WINDER e HARRIS, 1991), foi capaz de inibir sua atividade para
o nível do grupo controle.
FIGURA 10. MEDIDA DA ATIVIDADE DA ENZIMA TIROSINASE
FONTE: O Autor (2019) NOTA: Analise espectrofotométrica da atividade de oxidação de L-DOPA a dopacromo pela enzima tirosinase após 48h de estímulo com 25μM de forscolina, na presença ou não de 200μM de ácido kójico. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em duplicata e os resultados são expressos em porcentagem em relação ao controle em normóxia (***p≤0,001; ****p≤0,0001).
A produção de melanina também foi avaliada nas células B16-F10 tratadas
com 25μM de forscolina, os resultados após 24 e 48h de estímulo estão
representados na Figura 11. Não foi observado estímulo na produção de melanina
durante 24h, mas é possível notar que houve um aumento significativo, de
aproximadamente 2 vezes, na concentração de melanina em células estimuladas
por 48h, quando comparadas ao grupo controle. Esse efeito foi reduzido
significativamente (30%), na presença de 200μM de ácido kójico.
53
FIGURA 11. DOSAGEM DE MELANINA TOTAL EM CÉLULAS TRATADAS COM FORSCOLINA
FONTE: O Autor (2019). NOTA: Analise espectrofotométrica da concentração de melanina intracelular no lisado de células após 24 e 48h de estímulo na presença de 25μM de forscolina e/ ou 200μM de ácido kójico. Os dados correspondem a média ± SD de quatro experimentos independentes em duplicata e os resultados são expressos como μg de melanina/μg de proteína (**p≤0,005; ***p≤0.0005; ****p≤0,0001).
Há uma diferença em relação à produção de melanina entre as duas
metodologias de estímulo (Figuras 9-11). As células submetidas ao tratamento com
0,4mM de L-tirosina e 10mM de NH4Cl, quando comparadas as células B16-F10
tratadas com 25μM de forscolina, apresentam quase 2 vezes mais melanina ao final
de 24h de estímulo, chegando a um aumento de 3,2 vezes após 48h. Essa diferença
deve-se, provavelmente, ao fato de as células cultivadas em meio suplementado por
L-tirosina não apresentarem restrição de substrato para a enzima tirosinase, que
pode ser uma limitação para as células tratadas com forscolina, uma vez que o meio
de cultivo, RPMI-1640, não foi acrescido desse aminoácido.
Entretanto, uso da forscolina como indutor da melanogênese apresenta a
vantagem de mimetizar o que ocorre in vivo, através da ativação da adenilato
ciclase, da mesma maneira que o hormônio α-MSH liberado pelos queratinócitos,
mas sem a dependência de receptores de membrana, uma vez que seu caráter
apolar confere permeabilidade através da membrana plasmática (D’MELLO et al.,
2016; HANOUNE e DEFER, 2001).
A viabilidade celular foi mensurada através da metodologia do MTT, que
avalia a redução do sal de tetrazólio a formazan pelas células viáveis e, como
54
representado na figura 12, não houve diferença significativa na viabilidade celular
após 24 ou 48h de estímulo melanogênico por forscolina. Ainda, a inibição da
melanogênese por ácido kójico não foi diferente da observada para os demais
grupos.
FIGURA 12. EFEITO DO ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE SOBRE A VIABILIDADE DAS CÉLULAS B16-F10
FONTE: O Autor (2019) NOTA: A viabilidade das células B16-F10 foi determinada, espectrofotometricamente a 550nm, através do método MTT após 24 e 48h de estímulo da melanogênese por 25μM de forscolina, as células também foram tratadas com 200μM de ácido kójico, um inibidor competitivo da enzima tirosinase. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em triplicata e os resultados foram expressos em % de células viáveis em comparação ao grupo controle.
Já o efeito do estímulo na síntese de melanina sobre a proliferação celular foi
avaliado utilizando o corante cristal violeta (CV). O CV é um corante de ácidos
nucléicos, permeável às membranas biológicas, que cora o DNA das células viáveis
e aderidas à placa de cultura. A incorporação do corante é proporcional a
quantidade de DNA, oferecendo uma estimativa da proliferação e viabilidade das
células (GILLIES et al., 1986). Os resultados, mostrados na figura 13, não
evidenciam diferença significativa na proliferação celular após 24h de estímulo. Em
48h, uma diminuição na proliferação de, aproximadamente, 24% foi observada nas
células tratadas com 25μM de forscolina, que se manteve na presença de ácido
kójico.
55
FIGURA 13. EFEITO DO ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE SOBRE A PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS B16-F10
FONTE: O autor (2019) NOTA: A viabilidade das células B16-F10 foi determinada, espectrofotometricamente a 540nm, através do método cristal violeta (CV) após 24h (gráfico A) e 48h (gráfico B) de estímulo da melanogênese por 25μM de forscolina, as células também foram tratadas com 200μM de ácido kójico, um inibidor competitivo da enzima tirosinase. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em triplicata e os resultados foram expressos em % de células viáveis em comparação ao grupo controle (p≤0,05).
O efeito do estímulo da melanogênese, induzida pela forscolina sobre a
viabilidade das células B16-F10 foi diferente do observado quando o estímulo foi
obtido pela suplementação do meio com L-tirosina e NH4Cl, como descrito por
Cunha et al. (2012) e Meira et al. (2017), que observaram uma redução significativa,
de 30% e 72%, respectivamente, na viabilidade das células estimuladas avaliadas
pelo MTT.
Entretanto, corroborando com o presente estudo, os autores também
observaram uma diminuição da proliferação através do cristal violeta. Ainda, Cunha
et al. (2012) relacionaram a inibição na proliferação, após 48h de estímulo, ao
aumento do número de células na fase G1 do ciclo celular, atribuindo esse efeito a
entrada das células com maior conteúdo de melanina em um estado de parada
reversível de proliferação conhecido como quiescência. Porém, em células B16-F10
56
estimuladas por forscolina, o ciclo celular e a entrada em quiêscencia não foram
avaliados.
Neste trabalho, foi determinada a capacidade de células B16-F10 de formar
clones na presença de indutores da melanogênese (Figura 14). Para isso, o meio foi
suplementado com 0,4mM de L-tirosina e 10mM de NH4Cl (Figura 14A) ou 25μM de
forscolina e 200μM de ácido kójico (Figura 14B), quando necessário.
Independentemente da metodologia de estímulo, as células induzidas
apresentam uma menor capacidade clonal quando comparadas ao grupo controle
(Figura 14). É possível observar também que o efeito inibitório, na formação de
clones, não foi revertido na presença do inibidor da enzima tirosinase (Figura 14B),
sugerindo que o efeito sobre a proliferação em células tratadas com forscolina
poderia ser consequência da ativação da adenilato ciclase. Sabe-se que a ativação
da enzima adenilato ciclase e consequente aumento nos níveis de cAMP promovem
uma inibição na proliferação celular através de diferentes vias de sinalização, como
por exemplo a inibição da via MAPK (proteína quinase ativada por mitógeno)
mediada por PKAs (proteína quinase dependente de cAMP) (SCHMITT e STORK,
2001), o que poderia explicar os efeitos observados.
Entretanto, estudos anteriores mostram efeitos contraditórios em relação aos
efeitos de agentes indutores de cAMP e a ativação da via MAPK em células B16-
F10. Englaro et al. (1995), observaram que em células de melanoma B16-F10
tratadas com compostos que estimulam a síntese de cAMP como forscolina (10µM)
e IBMX (isobutilmetilxantina), apresentaram aumento na síntese de melanina e
estimulo das vias MAPK, através da ativação de MEK/ERK1 (quinase ativadora de
MAP quinase). Nesse trabalho, os autores sugeriram uma regulação da
melanogênese induzida por cAMP mediada pela via MAPK. Entretanto, essa
hipótese foi refutada em trabalhos posteriores do mesmo grupo, que observaram
que mesmo na presença de um inibidor de MEK (PD98059), o tratamento com
forscolina (10µM) foi capaz de induzir a melanogênese em células B16-F10. Nesse
mesmo trabalho os autores também demonstraram que a ativação da via Ras/MAPK
promoveu uma inibição na síntese de melanina dessas células, sugerindo uma
importância da via melanogênica no controle de diferenciação das células de
melanoma B16-F10 (ENGLARO et al., 1998).
Adicionalmente, Flori et al. (2017) observaram que o hormônio αMSH atuou
como mitógeno em culturas primárias de melanócitos (NHM 1 e NHM 2) e promoveu
57
a inibição da proliferação de células de melanoma B16-F10 e Mel13-SM,
aumentando o número de células na fase G1/G0 do ciclo celular. Contrariamente, o
tratamento das células com 1µM de forscolina estimulou a proliferação nas células
de melanoma, após 24 e 48h, promovendo um aumento de células na fase G2/M do
ciclo celular, o que apresenta divergência com os resultados apresentados nas
figuras 13 e 14.
FIGURA 14. ENSAIO CLONOGÊNICO DAS CÉLULAS B16-F10 COM MELANOGÊNESE ESTIMULADA
FONTE: O autor (2019) NOTA: Imagens representativas do poder clonal das células B16-F10 na presença ou não de indutores melanogênicos. As células B16-F10 foram plaqueadas a uma densidade de 10³ células e, após o tempo de aderência (24h), foram incubadas ou não com 0,4mM de L-tirosina e/ou 10mM de NH4Cl (A); 25 μM de forscolina e 200μM de ácido kojico (B) por 7 dias. (C) Após 48h de estímulo da melanogênese com 25μM de forscolina, as células foram tripsinizadas e novamente plaqueadas a uma densidade de 103 células e mantidas na presença ou ausência de forscolina por 7 dias. Imagens representativas de dois experimentos independentes em duplicata.
Entretanto, a diminuição na proliferação (Figura 13) e na formação de clones
(Figura 14), também foi observada nas células tratadas com L-tirosina e NH4Cl
(Figura 14A), que promovem o aumento na produção de melanina pela
disponibilidade de substrato e não pela ativação de AC. Além disso, os efeitos
clonais se mantém mesmo após a remoção da forscolina, prolongando-se por até
sete dias após a incubação, como demonstrado pelo ensaio clonogênico onde as
células foram tratadas previamente com forscolina por 48h, tripsinizadas,
58
plaqueadas em baixa densidade (10³ células/ placa) e cultivadas em meio contendo
ou não forscolina (Figura 14C).
Ainda em relação ao ensaio clonogênico, foi possível observar que o
tratamento apenas com 10mM de NH4Cl causou um forte efeito inibitório na
formação de clones, semelhante ao tratamento combinado com L-tirosina (Figura
14A). Entretanto, como mostrado na Figura 8, a presença do NH4Cl foi capaz de
induzir a melanogênese em células B16-F10 e esse estímulo pode ser o responsável
pelos efeitos observados.
6.2 EFEITOS DA MELANOGÊNESE SOBRE O METABOLISMO OXIDATIVO
ROS são constantemente geradas a partir do metabolismo ou por agentes
externos. Em células normais, ROS são produzidas de maneira controlada e
algumas atuam como importantes moléculas sinalizadoras para regular processos
como divisão celular, inflamação, função imunológica, autofagia e resposta ao
estresse (FINKEL, 2011). A produção descontrolada de ROS resulta em estresse
oxidativo, que altera as funções celulares e danifica biomoléculas como lipídeos,
proteínas e ácidos nucléicos, incluindo o DNA (THANNICKAL e FANBURG, 2008).
É evidente o envolvimento de ROS na melanogênese, trabalhos apontam que
ROS são formados durante esse processo (PAVEL et al., 2004; SZATROWSKI e
NATHAN, 1991). De fato, Cunha et al. (2012), observaram a produção de ROS
durante a melanogênese através da sonda fluorescente DCFH-DA. Outros estudos
mostraram também, que o tratamento de células de melanoma com compostos
antioxidantes como retinol, hesperidina e NAC foram capazes de inibir a produção
de melanina induzida pelo hormônio α-MSH (CHEN et al., 2014; KIM et al., 2014;
Lee et al., 2015).
No presente estudo, verificou-se a produção específica do radical superóxido
(O2•-) pela mitocôndria das células submetidas ao estímulo melanogênico. O radical
superóxido (O2•-) é uma das principais ROS formadas nas células, principalmente
nas mitocôndrias, através do vazamento de elétrons pela ETC e redução do oxigênio
molecular (O2). Apesar das baixas taxas de reação do O2•- com moléculas
biológicas, a reação de dismutação do O2•-, tanto espontânea como catalisada pela
enzima superóxido dismutase (SOD), geram peróxido de hidrogênio (H2O2), uma
espécie reativa de alta taxa de difusão que pode promover o aumento de espécies
59
mais reativas, como o radical hidroxila (OH•) através de reações do tipo Fenton
(HERMES-LIMA, 2005).
A determinação dos níveis de O2•- foi realizada através da utilização da sonda
MitoSOX Red. A sonda MitoSOXRed (Molecular Probes) é um composto derivado do
brometo de etídio, que apresenta uma alta afinidade pela mitocôndria e, nesta
organela, é oxidada especificamente por radicais superóxido, e não por outras
espécies reativas de oxigênio ou nitrogênio. O produto oxidado torna-se fluorescente
ao ligar-se ao DNA mitocondrial (ROBINSON et al., 2006).
Os resultados deste ensaio evidenciaram um aumento de, aproximadamente,
80% nos níveis de ânion superóxido em células de melanoma B16-F10 após 24h de
estímulo com 0,4mM de L-tirosina e 10mM de NH4Cl, seguido de um aumento ainda
mais significativo, aproximadamente 190%, após 48h do estímulo melanogênico
(Figura 15).
Ainda em relação aos resultados da Figura 15, nota-se que as células na
presença de apenas NH4Cl já apresentam um aumento significativo nos níveis de
ânion superóxido, a partir de 15h, que permanecem estáveis até 48h de estímulo. É
importante salientar que o tratamento com NH4Cl é suficiente para promover um
aumento na síntese de melanina, como observado na Figura 8 e, portanto, esse
aumento na formação de radical superóxido pode ser devido ao aumento na
concentração de melanina intracelular ou ativação das vias melanogênicas.
60
FIGURA 15. NÍVEIS DE RADICAL SUPERÓXIDO EM MITOCÔNDRIAS DE CÉLULAS ESTÍMULADAS COM L-TIROSINA E NH4Cl FONTE: O autor (2019) NOTA: Células B16-F10 foram submetidas ao estímulo melanogênico por 12, 15, 24 e 48h, através da suplementação do meio de cultivo com 0,4mM de L-tirosina e 10mM de NH4Cl, e os níveis de radical superóxido foram mensurados a partir da intensidade de fluorescência da sonda MitoSOX Red. O composto antimicina A (2μM), inibidor do complexo III da cadeia de transporte de elétrons foi utilizado como controle positivo da produção de ROS mitocondrial. Os valores foram normalizados pelo número de células viáveis. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em quadruplicata e os resultados são expressos como intensidade de fluorescência do MitoSOX Red em % em relação ao controle. Quando não indicada pela linha, a diferença estatística foi comparada ao grupo controle (*p≤0.05; ***p≤0,01; ****p≤0,001).
Os níveis de radical superóxido também foram avaliados em células B16-F10
estimuladas com 25μM de forscolina, na presença ou não de 200μM de ácido kójico.
Os resultados estão mostrados na figura 16 e apontam uma diferença em relação às
duas metodologias de estímulo. No caso das células estimuladas por forscolina,
houve um aumento significativo, de aproximadamente 196%, nos níveis de radical
superóxido após 15h de indução, que foi revertido na presença de ácido kójico,
indicando que esse efeito é devido a atividade da enzima tirosinase. Após 24 e 48h
de estímulo a produção de O2•- retornou aos níveis basais.
61
FIGURA 16. NÍVEIS DE RADICAL SUPERÓXIDO EM MITOCÔNDRIAS DE CÉLULAS ESTÍMULADAS COM FORSCOLINA
FONTE: O autor (2019) NOTA: Células B16-F10 foram submetidas ao estímulo melanogênico por 12, 15, 24 e 48h, através da suplementação do meio de cultivo com 25μM de forscolina e/ 200μM de ácido kójico, e os níveis de radical superóxido foram mensurados a partir da intensidade de fluorescência da sonda MitoSOX Red. O composto antimicina A (2μM), inibidor do complexo III da cadeia de transporte de elétrons foi utilizado como controle positivo da produção de ROS mitocondrial. Os valores foram normalizados pelo número de células viáveis. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em quadruplicata e os resultados são expressos como intensidade de fluorescência do MitoSOX Red em % em relação ao controle. Quando não indicada pela linha, a diferença estatística foi comparada ao grupo controle (*p≤0,05; ****p≤0,001).
O restabelecimento dos níveis basais de radical superóxido após o pico em
15h de estímulo pode ser resultado da ativação de mecanismos antioxidantes. As
células apresentam diversos mecanismos de defesa contra o aumento de ROS
intracelular, uma vez que essas espécies altamente reativas são capazes de causar
danos a diversas biomoléculas (EKOUE et al., 2017; JONES, 2008; POPRAC et al.,
2017).
Nesse contexto, o fator de transcrição Nfr2 (nuclear factor erythroid 2 (NFE2)-
related factor 2) é importante na percepção e ativação de mecanismos antioxidantes.
Em condições fisiológicas normais, Nrf2 é constantemente sintetizada. No entanto,
seu nível no citoplasma é regulado pela formação do complexo Nrf2-Keap1. A
ligação de Keap1 ao fator de transcrição Nrf2 inibe diretamente sua atividade, uma
vez que Keap1 medeia a poliubiquitinação e degradação proteossomal de Nrf2. No
entanto, um aumento de ROS intracelular pode levar à oxidação de resíduos de
cisteína em Keap1, alterando sua conformação e causando a dissociação de Nrf2 do
complexo. Nrf2 livre não pode ser ubiquitinado e degradado. Por sua vez, é
translocado para o núcleo, promovendo a expressão de proteínas importantes para
62
detoxificação de ROS e RNS (espécies reativas de nitrogênio) como por exemplo,
glutationa S-transferase (GST), glutationa peroxidase (GPX) e a superóxido
dismutase (SOD) (GĘGOTEK e SKRZYDLEWSKA, 2015; KLOSKA et al., 2018; Ma,
2013).
Devido ao importante papel de Nfr2 sobre o metabolismo oxidativo e ao
aumento na produção de ROS observado durante a melanogênese (Figura 15-16), a
expressão de Nrf2 em células submetidas ao estímulo melanogênico por 48h com
forscolina foi analisada através de western blotting.
É possível observar um aumento significativo, de aproximadamente 12 vezes,
no acúmulo de Nrf2 nas células B16-F10 submetidas ao estímulo melanogênico por
48h com 25μM de forscolina. (Figura 17).
FIGURA 17. EXPRESSÃO DE NRF2 APÓS O ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE
FONTE: O autor (2019) NOTA: Células B16-F10 foram submetidas ao estímulo melanogênico por 48h com 25μM de forscolina,na presença ou não de 200μM de ácido kójico, inibidor da enzima tirosinase, e então lisadas com tampão Laemmli. (A) Imagem representativa da análise de western blotting do fator de transcrição Nrf2 (~110kDa). (B) Quantificação da intensidade das bandas através do Software ImageJ e normalizadas pelo loading control ARD1 (~33 kDa). Os valores foram normalizados pelo controle. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes. (***p≤0,001; ***p≤0,0001).
Curiosamente, os efeitos do tratamento com forscolina sobre a expressão de
Nrf2 foram parcialmente revertidos, na presença do inibidor da enzima tirosinase
(Figura 17).
Kokot et al. (2009) observaram em ensaios in vivo e em culturas de
melanócitos que a irradiação por radiação UVB promoveu, de forma não esperada,
uma supressão na expressão de Nfr2 nessas células. Além disso, os autores
relataram que a presença do hormônio α-MSH foi rapaz de reverter totalmente essa
supressão, promovendo a expressão de Nfr2 de forma transcricional. Indicando uma
63
correlação entre a sinalização de cAMP e o aumento da expressão de Nfr2,
entretanto, a inibição por ácido kójico sugere uma associação mais próxima com o
processo melanogênico.
Estudos anteriores mostram que melanócitos deficientes na maquinaria de
autofagia sofrem diminuição da proliferação, aumento de ROS, p62 e Nrf2 (ZHANG
et al., 2015). Dessa forma, torna-se também interessante relacionar os resultados
com uma possível ativação não canônica de Nrf2 (DODSON e ZHANG, 2017), na
qual uma disfunção autofágica leva a agregação ou acumulação de p62 no
autofagossomo que então sequestra KEAP1, resultando numa ativação prolongada
de NRF2.
Para esclarecer melhor esse cenário, seria interessante avaliar a autofagia
nessas células e também verificar a ativação de Nrf2 em células com melanogênese
estimulada na presença de algum agente antioxidante. O principal problema dessa
abordagem é que diversos estudos mostram que compostos antioxidantes, como os
fenóis, apresentam propriedades antimelanogênicas, geralmente atribuídas à
captação de ROS (PILLAIYAR et al., 2017; ZOLGHADRI et al., 2019), então a
dissociação dos fenômenos seria complexa.
Kalegari (2017) verificou que células com maior conteúdo de melanina são
mais sensíveis a ação do fotossensibilizador rosa bengala acetato (RBAc), uma vez
que após a irradiação no comprimento de onda de luz visível, foi observado um
aumento no dano oxidativo ao DNA nuclear, promovendo a formação de 8-oxo-2'-
desoxiguanosina (8-oxodGuo) e de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD). Ainda
nesse trabalho, a autora também verificou que após o estímulo da melanogênese e
irradiação das células, a atividade das enzimas GRed e GPx estavam diminuídos,
sugerindo um comprometimento da defesa antioxidante dessas células após a
melanogênese.
O aumento nos níveis intracelulares de ROS e comprometimento das defesas
antioxidantes podem trazer danos a diversas biomoléculas. Estudos apontam que o
DNA mitocondrial (mtDNA) é mais suscetível ao dano causado por ROS quando
comparado ao DNA nuclear, devido à falta de histonas, da interação transitória com
membrana interna mitocondrial e a proximidade dos sítios de produção de ROS
(ANSON et al., 2000; BOHR et al., 2002; SANTOS et al., 2006).
Assim, para verificar os possíveis danos oxidativos ao mtDNA em células
após o estímulo da melanogênese, o DNA total de células B16-F10, submetidas ou
64
não ao tratamento com 0,4mM de L-tirosina e 10mM de NH4Cl por 48h, foi extraído e
uma qPCR de longa extensão foi realizada. Foram utilizados primers mitocondriais
(Tabela 1) a fim de amplificar dois fragmentos do mtDNA, um longo de,
aproximadamente 10Kbp e outro curto, de 128bp. Após o fracionamento dos
produtos de amplificação em eletroforese de gel de agarose e a marcação por
brometo de etídio, as bandas foram quantificadas. Nesse método, a inabilidade da
enzima polimerase em amplificar regiões do mtDNA que contenham danos, produz,
após o fracionamento, bandas de intensidade inversamente proporcional ao número
de danos daquele grupo (KOVALENKO e SANTOS, 2009).
Os resultados estão apresentados na Figura 18, na qual se observa uma
diminuição na intensidade das bandas após o estímulo da melanogênese por 48h
(Fig. 18A, painel superior), quando comparadas com o mtDNA controle, indicando
um maior dano ao mtDNA das células estimuladas. Após a normalização das
bandas com o fragmento de amplificação mais curto (Fig. 18A, painel inferior), os
dados plotados no gráfico mostram uma diminuição significativa na amplificação
relativa do mtDNA das células B16-F10 após 48h de estímulo da melanogênese,
mostrando que esse processo é capaz de induzir danos ao mtDNA, provavelmente
resultado do aumento de ROS (Figura 15).
O tratamento apenas com NH4Cl foi utilizado como controle nesse
experimento, uma vez que a presença desse composto foi capaz de induzir um
aumento significativo na produção de radical superóxido (Figura 15). Mas nesse
caso, os níveis de ROS gerados pelo tratamento apenas como NH4Cl não foi capaz
de induzir danos ao mtDNA (Figura 18).
65
FIGURA 18. DANOS AO MTDNA INDUZIDOS PELA MELANOGÊNESE
FONTE: O autor (2019). NOTA: Células B16-F10 foram submetidas ao estímulo melanogênico por 48h e os níveis de dano ao mtDNA foram avaliados por qPCR. (A) Imagens representativas do gel de agarose após a corrida do produto de amplificação do fragmento longo (10Kb), painel superior, e do gel de poliacrilamida do fragmento curto (128bp), painel inferior, mostrando a intensidade das bandas após marcação com brometo de etídio. (B) Os valores foram normalizados pela intensidade das bandas do fragmento curto. # controle de amplificação contendo metade da concentração de DNA total (3ng). Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em duplicata e os resultados são expressos em % de amplificação relativa comparado com o controle (**p≤0.005).
Danos ao mtDNA podem promover uma amplificação do estresse oxidativo
através da diminuição da expressão de proteínas críticas para o transporte de
elétrons levando ao ciclo vicioso de produção de ROS (HOUTEN et al., 2006).
6.3 EFEITOS DA MELANOGÊNESE SOBRE O METABOLISMO ENERGÉTICO
CELULAR
Os danos mitocondriais podem contribuir para a diminuição na respiração,
como observado por Meira et al. (2017) em células B16-F10 estimuladas com L-
tirosina e NH4Cl por 48h. Nesse estudo, as células de melanoma com maior
concentração de melanina apresentaram uma redução de 50% da respiração, tanto
66
no estado basal, quando no estado desacoplado, na presença de FCCP, condição
em que as taxas respiração celular são máximas. Os autores sugeriram uma
possível mudança do metabolismo aeróbio para o metabolismo anaeróbio, mesmo
na presença de oxigênio.
De fato, uma característica das células tumorais é a capacidade de
apresentar glicólise aeróbica altamente ativa, através do aumento na captação de
glucose e regulação positiva da expressão de enzimas da via glicolítica, em
detrimento à fosforilação oxidativa (OXPHOS), mesmo na presença de oxigênio,
efeito conhecido como Efeito Warburg (DIAZ-RUIZ et al., 2011). Mas em células de
melanoma essa característica não parece ser exclusiva e, apesar da elevada
captação de glucose e atividade glicolítica, células de melanoma parecem manter
altas taxas de respiração (MOURA et al., 2012; SCOTT et al., 2011). Ainda nestas
células, o balanço entre o metabolismo aeróbico e anaeróbico parece variar em
resposta às mudanças adversas no ambiente a fim de promover o crescimento e
sobrevivência do tumor (THEODOSAKIS et al., 2014). Tendo isso em vista, no
presente trabalho, foram investigados os efeitos do estímulo da melanogênese,
induzida por forscolina por 48h, sobre o metabolismo energético das células de
melanoma murino B16-F10. Dessa forma, foi possível determinar a taxa de consumo
de oxigênio (OCR), que é um reflexo da atividade da fosforilação oxidativa e a taxa
de acidificação extracelular (ECAR), que reflete a atividade glicolítica das células.
Estes ensaios foram realizados em equipamento Sea Horse (Seahorse
Bioscience, MA, USA) em células aderidas. De acordo com as adições realizadas, é
possível determinar o OCR durante os seguintes estados da respiração: basal, ATP-
linked, próton-leak e da respiração máxima (desacoplado). (BRAND E NICHOLLS,
2011; e SEAHORSE, 2017), (Figura 19-B). A Respiração Basal corresponde a
demanda energética sem a adição de qualquer substrato ou inibidor, medida pelo
consumo de oxigênio em reflexo à demanda de ATP e o do próton leak mitocondrial;
Respiração ATP-linked, representa a porção basal da respiração utilizada para a
produção de ATP, calculada subtraindo-se os valores do consumo de oxigênio após
a adição de oligomicina (inibição da ATP sintase) dos valores da respiração basal;
Próton-Leak é definido como a respiração não acoplada à produção de ATP, em
resposta a inibição da ATP sintase pela oligomicina e o fluxo de prótons através da
membrana mitocondrial interna em direção a matriz. O próton leak pode refletir dano
mitocondrial; Capacidade máxima respiratória é a taxa máxima de consumo de
67
oxigênio, obtida pela adição de FCCP (carbonil cyanida-4-(trifluorometoxi)
phenilhidrazona), um desacoplador da fosforilação oxidativa. O FCCP possibilita o
livre movimento de prótons através da membrana mitocondrial interna, o que resulta
na atividade máxima do complexos da cadeia de transporte de elétrons com o
objetivo de restabelecer o gradiente eletroquímico de prótons, com consequente
aumento no consumo de oxigênio e oxidação dos substratos. Uma diminuição na
capacidade respiratória máxima é então um forte indicador de disfunção
mitocondrial. Por fim, para cessar a atividade da cadeia de transporte de elétrons, é
adicionado rotenona e antimicina A, inibidores dos complexos I e III,
respectivamente. O consumo de oxigênio neste estado não reflete a respiração
mitocondrial (BRAND E NICHOLLS, 2011; e SEAHORSE, 2017).
Como representado na Figura 19-A, houve uma inibição no consumo de
oxigênio na respiração basal, ou seja, previamente à adição de qualquer substrato
ou inibidor, das células submetidas ao estímulo da melanogênese, quando
comparadas ao grupo controle. No entanto, esta inibição não foi restrita apenas a
este estado. A figura 19-B, mostra que as células B16-F10 submetidas ao estímulo
por 48h apresentaram uma inibição de, aproximadamente, 50% na respiração
associada à produção de ATP e também na respiração máxima, em presença do
desacoplador FCCP. Esse resultado foi o mesmo observado por Meira et al. (2017)
em células de melanoma submetidas a indução melanogênica com L-tirosina e
NH4Cl por 48h, indicando que ambos os métodos de estímulo, sendo um atuando no
início da via melanogênica e outro no fim, apresentam o mesmo efeito sobre o
consumo de oxigênio das células de melanoma. Da mesma forma, Meira et al.
(2017) também não relataram diferenças significativas sobre o estado próton-leak da
respiração, sugerindo que essa inibição não é resultado de alterações na
permeabilidade da membrana mitocondrial interna.
68
FIGURA 19. TAXA DE CONSUMO DE OXIGÊNIO (OCR) DAS CÉLULAS SUBMETIDAS AO ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE
FONTE: O autor (2019) NOTA: Células B16-F10 foram submetidas ao estímulo melanogênico por 48h com 25μM de forscolina e 200μM de ácido kójico, e então a taxa de consumo de oxigênio foi medida pelo equipamento Seahorse XF24 bioanalyzer. (A) Perfil metabólico das células após o estímulo. Glc: glucose; oligo: oligomicina, inibidor da ATP sintase; FCCP: desacoplador; rot/antA: rotenona e antimicina A, inibidores dos complexos I e III, respectivamente. (B) Parâmetros mitocondriais medidos a partir dos resultados de OCR. Respiração basal- calculada pela subtração dos valores após total inibição mitocondrial com rotenona e antimicina A dos valores basais. Respiração ATP- linked- calculada subtraindo-se os valores de OCR após adição da oligomicina dos valores basais. Próton leak- consumo de oxigênio após a adição de oligomicina. Capacidade máxima respiratória- calculado a partir dos valores de OCR no estado desacoplado (FCCP) menos os valores no estado inibido (Rotenona e antimicina A). Os resultados são representados em % comparados ao controle. Valores referentes a média ± SD de quatro experimentos independentes em duplicata (*p≤0,05).
Vale destacar também que todos os efeitos sobre o consumo de oxigênio,
observados, quando a melanogênese foi estimulada por forscolina, foram
parcialmente revertidos na presença de 200μM de ácido kójico, indicando que de
69
fato, a inibição da tirosinase e consequente interrupção da via melanogênica ou
ainda, a ausência de melanina, desempenha um importante papel nesse processo
inibitório, não sendo resultado de um efeito secundário do tratamento com a
forscolina (Figura 19).
Outro parâmetro analisado foi a taxa de acidificação extracelular (ECAR), que
determina as mudanças de pH no meio extracelular induzidas pela adição de
substratos e inibidores mitocondriais. Este parâmetro, em conjunto com os
resultados de OCR, fornece um perfil energético celular. Quando a glucose é
adicionada como substrato, o ECAR reflete a atividade glicolítica das células.
Na figura 20 temos os resultados referentes à taxa de acidificação celular
(ECAR) das células B16-F10 após 48h de estímulo melanogênico com 25μM de
forscolina. Apesar de não haver diferença significativa, é possível observar que, em
comparação as células controle, a taxa de acidificação tende a ser maior após a
adição de glucose (Glc) no grupo tratado, sugerindo um aumento na atividade da
glicólise nas células estimuladas. Novamente, a inibição da enzima tirosinase, com
ácido kójico, foi capaz de inibir esse efeito.
FIGURA 20. TAXA DE ACIDIFICAÇÃO EXTRACELULAR (ECAR)
FONTE: O autor (2019) NOTA: Células B16-F10 foram submetidas ao estímulo melanogênico por 48h com 25μM de forscolina e 200μM de ácido kójico, e então a taxa de acidificação extracelular foi medida pelo equipamento Seahorse XF24 bioanalyzer. Glc- glucose; Oligo- oligomicina. Valores referentes a média ± SD de quatro experimentos independentes em duplicata.
A fim verificar a importância da glicólise para as células B16-F10 submetidas
ao estímulo da melanogênese foi realizado um ensaio clonogênico na ausência de
glucose. Para esse ensaio, as células foram plaqueadas em baixa densidade (1000
70
células/ placa 60mm) e após o tempo de adesão, o meio foi substituído ou não por
meio RPMI 1640 sem glucose, como indicado, e a melanogênese foi induzida por
25μM de forscolina. As células foram mantidas nessas condições por 7 dias e então,
coradas com giemsa.
Os resultados apresentados na figura 21 mostram que as células, na
presença de forscolina, são mais dependentes de glucose do que as células em
condições controle, uma vez que não foram capazes de gerar clones na ausência de
glucose, fortalecendo a hipótese de que as células após o estímulo da
melanogênese tendem a utilizar a glicólise como fonte de energia em detrimento da
OXPHOS, mesmo na presença de oxigênio.
FIGURA 21. ENSAIO CLONOGÊNICO DAS CÉLULAS B16-F10 ESTIMULADAS NA AUSÊNCIA DE GLUCOSE
FONTE: O autor (2019) NOTA: Imagens representativas do poder clonal das células B16-F10 na presença ou não de forscolina cultivadas na ausência de glucose. As células B16-F10 foram plaqueadas a uma densidade de 103 células, após o tempo de aderência (24h), foram incubadas ou não com 25μM de forscolina por 7 dias. As células foram mantidas em meio não contendo glucose durante todo o experimento, quando indicado. Glc- glucose. Imagens representativas de dois experimentos independentes.
Em seguida, a fim de confirmar esse aumento nas taxas glicolíticas e
mudança do metabolismo energético induzidas pelo estímulo da melanogênese,
foram determinados os níveis de lactato em células B16-F10 após a indução na
síntese de melanina mediada por forscolina, uma vez que, o estímulo da via
glicolítica e diminuição no consumo de oxigênio resultaria em um acúmulo de
lactato, como produto desse processo (DIAZ-RUIZ et al., 2011). Os resultados
71
destes ensaios estão representados na Figura 22, em que se observa um aumento
significativo, de aproximadamente 50%, na produção de lactato, após 48h de
estímulo, em acordo com os resultados anteriores. Da mesma forma, esse efeito foi
revertido pela inibição da enzima tirosinase pela ação do ácido kójico, demonstrando
novamente que os efeitos observados são resultado da atividade da tirosinase e
indução da melanogênese.
FIGURA 22. NÍVEIS DE LACTATO EXTRACELULAR APÓS O ESTÍMULO MELANOGÊNICO
FONTE: O autor (2019) NOTA: Células B16-F10 foram submetidas ao estímulo melanogênico por 48h com 25μM de forscolina, na presença ou não de ácido kójico (200μM) e os níveis de lactato no sobrenadante medidos pelo equipamento Cobass c701 instrument (Roche). Os valores foram normalizados pela concentração de proteínas e estão representados como % na produção de lactato em relação ao controle. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em duplicata (*p≤0,05).
Essa mudança no metabolismo energético em favorecimento ao metabolismo
anaeróbico pode ser resultado de diversas alterações intracelulares, entre estas o
crescimento celular descontrolado, a má regulação dos genes c-Myc e a atividade
do fator induzível por hipóxia (HIF-1α) (BRAHIMI-HORN et al., 2011; HEIDEN et al.,
2009; HSIEH et al., 2015).
HIF-1α é um fator de transcrição chave, em condições onde a concentração
de oxigênio é baixa, para a expressão de diversas proteínas envolvidas no
metabolismo energético como os transportadores de glucose 1 e 4 (GLUT1 e
GLUT4), além de múltiplas enzimas da via glicolítica, que promovem a transição do
metabolismo oxidativo para o metabolismo anaeróbico. Em condições de normóxia,
HIF-1α encontra-se ligado à proteína Von Hippel-Lindau (VHL) e está sujeito a
poliubiquitinação, mediada por VHL, levando à sua degradação. Já na ausência de
oxigênio, a degradação de HIF-1α é interrompida, pela estabilização e desligamento
72
da proteína VHL, o que promove sua ativação (FEIGE et al., 2011; SEMENZA,
2012).
Devido ao potencial envolvimento de HIF-1α no contexto deste estudo, a
expressão dessa proteína foi avaliada nas células submetidas ao estímulo
melanogênico, em condições de normóxia e hipóxia (1% de O2), considerando seu
acúmulo em resposta a esta última condição (controle). Para esse ensaio, as células
foram incubadas por 48h com 25μM de forscolina, na presença ou não de ácido
kójico, e a expressão de HIF-1α e um dos seus alvos, o transportador de glucose
(GLUT1), foi determinada por técnica de western blotting.
Como mencionado, em normóxia HIF-1α é normalmente degradado,
entretanto, os resultados mostraram que a expressão dessa proteína está
significativamente aumentada nas células B16-F10 após 48h de estímulo, mesmo na
presença de oxigênio (Figura 23). Assim como a expressão do seu alvo, o
transportador de glucose1 (GLUT-1).
FIGURA 23. EXPRESSÃO DE HIF-1Α E GLUT1 APÓS O ESTÍMULO DA MELANOGÊNESE
FONTE: O autor (2019) NOTA: Células B16-F10 foram submetidas ao estímulo melanogênico por 48h com 25μM de forscolina, em condição de normóxia ou 1% de oxigênio (Hx), e então lisadas com tampão Laemmli. (A) Imagem representativa da análise de Western Blotting do fator de transcrição HIF-1α (~110 kDa), GLUT1 (~55 kDa). (B-C) Quantificação da intensidade das bandas através do Software ImageJ e normalizadas pelo loading control ARD1 (~33 kDa). Os valores foram normalizados pelo controle em condição de nórmóxia. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes. (*p≤0.05; **p≤0.01; ***p≤0,005).
Buscà et al. (2005) demonstraram que, de forma restrita aos melanócitos, o
aumento de cAMP intracelular é capaz de induzir a expressão de HIF-1α, através da
73
ativação do fator de transcrição MITF (fator de transcrição de microftalmia). Os
autores concluíram que a ativação de MITF devido ao aumento de cAMP, induzido
pelo hormônio α-MSH, regula positivamente a transcrição de HIF-1α, independente
da concentração de oxigênio, de forma transcricional, diferentemente da regulação
usual em condições de hipóxia, que ocorre de forma pós-traducional.
Entretanto, no presente estudo, foi observado que a inibição da enzima
tirosinase, pelo ácido kójico, foi suficiente para reverter, parcialmente, a expressão
de HIF-1α em condições normais de oxigênio. Esse resultado pode sugerir que a
regulação de HIF-1α, na verdade, ocorre a jusante à reação de oxidação de L-
tirosina pela enzima tirosinase, e não necessariamente à expressão de MITF, devido
ao acúmulo de melanina, aos intermediários da via melanogênica ou mais
provavelmente, pela formação de ROS durante esse processo, uma vez que
trabalhos anteriores demonstraram que espécies reativas de oxigênio podem
promover a estabilização de HIF-1α em algumas linhagens tumorais (JUNG et al.,
2008; MOVAFAGH et al., 2015).
A estabilização de HIF-1α pelas ROS se dá pela oxidação de íons de ferro
nos centros catalíticos de prolilhidroxilases (PHD), promovendo a inativação e
impedindo a hidroxilação de prolinas necessárias para a ligação de HIF-1α ao fator
Von Hippel-Lindau (VHL). Essa regulação de HIF-1α é reversível e independente da
concentração de oxigênio (COMITO et al., 201; LU et al., 2005). Ainda nesse
contexto, foi observado que o estímulo da melanogênese promove a formação de
ROS por vias mitocondriais (Figuras 15-16). Foi relatado que a formação de ROS
pela mitocôndria, mais precisamente pelo complexo III da cadeia de transporte de
elétrons, é essencial para a estabilização e regulação de HIF-1α. Nesses estudos os
autores verificaram que células Rho (ρ0), que apresentam função mitocondrial
comprometida pela ausência de mtDNA, eram incapazes de estabilizar HIF-1α e,
através da utilização de antioxidantes com afinidade mitocondrial e inibidores dos
complexos mitocondriais, concluíram que as espécies reativas formadas pelo
escape de elétrons no complexo III desempenham papel importante na sinalização e
inativação das PHDs (CELESTE e SIMON, 2006; COMITO et al., 2011;
DEGENHARDT et al., 2010; KLIMOVA e CHANDEL, 2008)
A estabilização e ativação de HIF-1α, além de contribuir para o aumento na
atividade glicolítica, através da indução na expressão das proteínas envolvidas
74
nessa via, também pode ser responsável pela inibição na respiração observada em
células submetidas ao estímulo melanogênico (Figura 19). Dois trabalhos publicados
simultaneamente, Kim et al. (2006) e Papandreou et al. (2006), demonstraram que
HIF-1α tem como alvo direto o gene que codifica para a proteína piruvato
desidrogenase quinase 1 (PDK1), promovendo sua expressão. Essa proteína é
responsável por fosforilar e inibir a proteína piruvato desidrogenase (PDH), que
catalisa a conversão de piruvato à acetil-CoA. Dessa forma, o metabolismo do
piruvato através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) é diminuído, comprometendo
então, a respiração mitocondrial.
Apesar dos dados apontarem um aumento no metabolismo anaeróbico
induzido pelo estímulo da melanogênese, Cunha et al. (2012) relataram dados
controversos. Em seu estudo, células B16-F10, submetidas a melanogênese com L-
tirosina e NH4Cl, apresentaram menores níveis da enzima lactato desidrogenase
(LDH) através de análises proteômicas, assim como menor atividade enzimática.
Essa enzima é responsável pela conversão de piruvato a lactato em uma reação
reversível acoplada à oxidação/redução de NADH (ŽDRALEVIĆ et al., 2018). Além
disso, Cunha et al. (2012) também verificaram, por RT-PCR, que outra enzima
importante na via glicolítica, a piruvatoquinase, apresentava níveis diminuídos após
48h de tratamento com L-tirosina e NH4Cl. Essas discordâncias podem ser resultado
das diferentes metodologias de estímulo da melanogênese, enquanto a forscolina
atua no início da via de sinalização, promovendo um aumento de MITF, que por sua
vez regula, HIF-1α; a utilização do substrato L-tirosina e do NH4Cl promovem um
aumento na síntese de melanina pela disponibilidade de substrato, sendo
desconhecido seu efeito sobre MITF ou HIF-1α.
Os resultados obtidos até aqui sugerem que o estímulo da melanogênese
está promovendo um estado intracelular de hipóxia, através do aumento de ROS e
acúmulo de HIF-1α. Células tumorais submetidas a condições de hipóxia geralmente
apresentam fenótipo mais resistente e agressivo.
De fato, o ambiente com menor concentração de oxigênio e consequente
indução de HIF-1, promovem alterações celulares relacionadas ao poder
metastático, como por exemplo, (i) ativando o metabolismo glicolítico, permitindo a
sobrevivência em condições de hipóxia; (ii) aumentando a expressão de
metaloproteínases que promovem a degradação e remodelamento da matrix
extracelular; (iii) e finalmente, contribuí para a angiogênese tumoral, através da
75
indução de VEGF (COMITO et al., 2011; HUANG et al., 2009; OKAMOTO et al.,
2017; PENNACCHIETTI et al., 2003).
Comito et al. (2011), observaram que células de melanoma Hs29-AT
submetidas a hipóxia por 24h apresentavam um fenótipo maior de invasão e
agressividade. Kuphal et al. (2010), utilizando diferentes linhagens de melanoma
(Mel Im, Mel JU, HMB2 e 501 Mel) com diferentes graus de malignidade,
observaram que a expressão de HIF-1α era maior nas células com fenótipo
metastático, sugerindo uma relação entre a expressão dessa proteína e a
malignidade dessas células.
Em resumo, as informações discutidas nessa seção foram reunidas e estão
representadas na figura 24.
76
FIGURA 24. POSSÍVEIS RESPOSTAS CELULARES DAS CÉLULAS B16-10 FRENTE AO ESTÍMULO MELANOGÊNICO
FONTE: O autor (2019) NOTA: (1) A forscolina (FK), um diterpeno permeável a membrana plasmática, promove a ativação da proteína de membrana adenilato ciclase (AC), gerando um aumento nos níveis de cAMP intracelular (2) (PINTO et al., 2008). Esse aumento nos níveis de cAMP ativam a proteína PKA (3) (proteína quinase A) que ativam MITF (fator de transcrição de microftalmia) através da fosforilação de CREB (4)(D’MELLO et al., 2016), PKA também é responsável pela inibição da proliferação mediada pela inativação das vias MAPK (17) (SCHMITT e STORK, 2001). Após a ativação de MITF, esse fator de transcrição é translocado para o núcleo onde promove a expressão de proteínas envolvidas na melanogênese (5), como TYR (tirosinase) e TYR1-2 (proteínas relacionadas a tirosinase 1 e 2) (D’MELLO et al., 2016), além de promover a regulação de forma transcricional de HIF-1α (fator de indução de hipóxia alfa) (6) (BUSCÀ e BALLOTTI, 2000). Nos melanossomos, o aumento na expressão das enzimas envolvidas na melanogênese promovem um aumento na síntese de melanina (7), juntamente com o aumento na formação de espécies reativas durante esse processo (8) (CUNHA et al., 2012; MEIRA et al., 2017). Esse aumento de ROS intracelular pode promover a estabilização de HIF-1α (9), através da oxidação de centros catalíticos de prolilhidroxilases (PHD) (ZBYTEK et al., 2013). O acúmulo de HIF-1α promove a transcrição de genes e aumento da expressão de proteínas envolvidas no metabolismo oxidativo da glucose, como os transportadores GLUT1 (10), além da PDK (piruvato desidrogenase quinase isoenzima 1), levando um aumento das vias glicolíticas (11) e diminuindo a respiração (12), através da fosforilação e inativação da enzima piruvato desidrogenase (PDH) (KIM et al., 2006; PAPANDREOU et al., 2006). A inibição da respiração é acompanhada pelo aumento dos níveis de radical superóxido mitocondrial (13), que podem levar a danos as mtDNA (14), criando um ciclo vicioso de inibição da respiração (15). Esses danos mitocondriais acompanhados da inibição da respiração, também podem promover uma inibição na proliferação e crescimento celular (16).
77
6.4 SILENCIAMENTO DA ENZIMA TIROSINASE
Devido aos efeitos induzidos pelo estímulo da melanogênese em células de
melanoma B16-F10 terem sido total ou parcialmente revertidos na presença do
inibidor da enzima tirosinase, ácido kójico, outro objetivo desse trabalho foi silenciar
o gene responsável pela expressão dessa enzima, a fim de verificar se os resultados
observados seriam repetidos em células de melanoma onde não houvesse ativação
da via melanogênica, tampouco a produção de melanina.
Os ensaios de silenciamento da enzima e caracterização dos mutantes foram
iniciados no Laboratório de Hipóxia e Metabolismo Tumoral, em Nice/FR, sob
supervisão do Dr. Pouysségur e deveriam ter sido finalizados no Brasil. No entanto,
devido a problemas de importação das células, os experimentos não foram
concluídos. A seguir, serão discutidos os resultados preliminares de caracterização.
A tirosinase é uma proteína de membrana, codificada pelo gene Tyr, de
aproximadamente 60 kDa, ancorada à membrana dos melanossomos, que contém
dois átomos de cobre no seu centro catalitico. A reação que catalisa é a de
conversão de monofenóis, como o aminoácido L-tirosina, em o-difenóis, L-DOPA
(atividade de monofenolase), seguindo-se a oxidação desse o-difenóis em sua o-
quinona correspondente, no caso, dopaquinona (atividade de difenolase). Assim,
esta enzima é responsável pelo passo inicial e limitante da via melanogênica (LAI et
al., 2018; NIU e AISA, 2017).
Utilizou-se a técnica do CRISPR/Cas9 como ferramenta para o silenciamento
da enzima tirosinase nas células de melanoma murino, B16-F10. Como descrito na
seção 5.12 do Material e Métodos, após transfecção do plasmídeo, foi realizado o
sorting das células GFP-positivas em 4 placas de 96 poços. Foram obtidos no total,
45 clones, que foram, em seguida, submetidos ao screening para determinação da
efetividade do silenciamento.
Geralmente, é utilizada a técnica de western blotting para determinação do
knockout homozigoto dos genes após utilização da ferramenta de edição genética.
Entretanto, os anticorpos utilizados anti-tirosinase não foram específicos o suficiente
para uma conclusão. Durante os experimentos, foram utilizados dois anticorpos
policlonais de diferentes procedências, mas após a revelação das membranas,
durante o western blotting, foram observadas diversas bandas inespecíficas (dados
não mostrados).
78
Portanto, optou-se em realizar o screening dos clones através da avaliação da
atividade da enzima tirosinase. A atividade de difenolase da tirosinase foi
mensurada, espectrofotometricamente, em todos os clones obtidos, através da
oxidação de L-DOPA a dopacromo (dados não mostrados).
Para a realização dos demais experimentos, foram escolhidos os dois clones
que apresentaram menor atividade, representados aqui como clones #13 e #30. Os
resultados da atividade da enzima tirosinase para esses dois clones estão
mostrados na Figura 25. É possível observar que a atividade foi praticamente nula
em ambos os casos. Sugerindo que a depleção ocorreu da maneira pretendida.
FIGURA 25. ATIVIDADE DA ENZIMA TIROSINASE APÓS SILENCIAMENTO DA ENZIMA
FONTE: O autor (2019) NOTA: Analise espectrofotométrica da atividade de oxidação de L-DOPA a dopacromo pela enzima tirosinase dos mutantes, 13, 30, após o silenciamento do gene responsável pela expressão da enzima, comparados a atividade da linhagem selvagem (WT), na presença ou não de ácido kójico (KA). Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em duplicata e os resultados são expressos em porcentagem em relação ao WT (*p≤0,05; **p≤0,005).
Além da atividade da tirosinase, a capacidade dos clones, #13 e #30, em
sintetizar melanina foi mensurada através da determinação espectrofotométrica da
produção de melanina após estímulo da melanogênese com o composto forscolina
(25μM), por 48h. Confirmando o resultado anterior, os dados mostrados na Figura 26
mostram que ambos os mutantes não apresentaram aumento na produção de
melanina, mesmo após indução da via melanogênica, induzida por forscolina,
indicando uma deficiência nessa via.
79
FIGURA 26. DOSAGEM DE MELANINA TOTAL APÓS SILENCIAMENTO DA ENZIMA TIROSINASE
FONTE: O autor (2019) NOTA: Analise espectrofotométrica da concentração de melanina intracelular no lisado de células após 48h de estímulo. Os dados correspondem a média ± SD de quatro experimentos independentes em duplicata e os resultados são expressos como μg de melanina/ μg de proteína (*p≤0,05;**p≤0,005; ***p≤0.001; ****p≤0.0001).
Xiu-Hua et al. (2010), utilizando células de melanoma B16-F10, realizaram o
knockdown da enzima tirosinase através de RNA de interferência (siRNA),
entretanto, a atividade da enzima tirosinase apresentou diminuição de,
aproximadamente 40%, interferindo parcialmente na produção de melanina. Além
disso, os efeitos do knockdown não foram permanentes, sendo revertidos após 72h.
Os resultados referentes a edição genética por CRISPR/Cas9, mostram a
eficiência do silenciamento da enzima tirosinase e os mutantes obtidos poderão ser
utilizados como modelos experimentais de células B16-F10 incapazes de produzir
melanina em futuros experimentos envolvendo o processo melanogênico.
6.5 EFEITOS DO COMPROMETIMENTO NO METABOLISMO ENERGÉTICO
SOBRE A PRODUÇÃO DE MELANINA EM CÉLULAS B16-F10
No decorrer desse trabalho, foi demonstrado que a indução da melanogênese
é capaz de promover alterações no metabolismo energético celular através do
favorecimento do metabolismo anaeróbico, mesmo na presença de oxigênio,
mediado pela ativação de HIF-1α.
Outro objetivo desse trabalho foi verificar se mudanças no metabolismo
energético promovem alterações na via melanogênica. Para cumprir esse objetivo,
dois mutantes de células de melanoma B16-F10, com metabolismo comprometido
80
em diferentes vias metabólicas, foram utilizados. O mutante GPI-KO, onde a
proteína glucose-6-fosfato isomerase foi silenciada, portanto, tendo seu metabolismo
restrito a fosforilação oxidativa e o mutante ATP5A1-KO, que tem seu metabolismo
sustentado pela via glicolítica, uma vez que a subunidade alfa da ATP sintase foi
silenciada.
O mutante deficiente da proteína glucose-6-fosfato isomerase (B16-F10 GPI-
KO) foi estabelecido e descrito previamente por De Padua et al.(2017). GPI é a
segunda enzima da via glicolítica e catalisa a conversão da glucose-6-fosfato em
frutose-6-fosfato (ŽDRALEVIĆ et al., 2017). No trabalho de De Padua et al. (2017),
os autores demonstraram que o silenciamento da enzima GPI suprimiu fortemente a
glicólise nessas células, mesmo em hipóxia, juntamente com a produção de ácido
lático e foi capaz de promover uma mudança em favorecimento ao metabolismo
oxidativo, promovendo uma maior taxa de respiração a fim de manter a síntese de
ATP sem comprometer o crescimento celular.
Por outro lado, a obtenção do mutante B16-F10 ATP5A1-KO, silenciado para
a subunidade alfa da ATP sintase, foi realizada como parte do presente trabalho e
os resultados de caracterização serão apresentados a seguir.
Segundo a teoria quimiosmótica, a ATP sintase, também conhecida como
complexo V, gera ATP utilizando o gradiente eletroquímico de prótons ~(ΔH+)
formado a partir do transporte de elétrons através dos complexos respiratórios
mitocondriais (MITCHELL, 1961).
A ATP sintase (Figura 27) consiste em dois subcomplexos; Fo, consistindo de
três subunidades (a, b e c) que formam o canal de prótons através da membrana
mitocondrial interna; e o domínio F1, porção polar voltada para a matriz mitocondrial
e que contém o núcleo catalítico, formado por subunidades α(3), β(3), γ(1), δ(1) e
ε(1). As subunidades formadoras da ATP sintase são codificadas tanto por genes
localizados no mtDNA quanto no nDNA, como é o caso do gene ATP5A1,
responsável pela expressão da subunidade alfa (α) da porção F1 (MARTÍNEZ-
REYES e CUEZVA, 2015; MUKHERJEE e WARSHEL, 2017; MÜLLER et al., 2003;
SIGNES e FERNANDEZ-VIZARRA, 2018; VOLKÁN-KACSO e MARCUS, 2017).
81
FIGURA 27. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA DA ATP SINTASE
FONTE: Adaptado de Yoshida et al. (2001) com permissão de Springer Nature (número: 4602460367911) NOTA: A ATP sintase é composta por dois subcomplexos (FoF1) conectados O subcomplexo Fo é hidrofóbico e localiza-se na membrana mitocondrial interna, enquanto que F1, de caráter hidrofílico, está voltado à matrix mitocondrial e contém o centro catalítico da enzima. F1 é composto por cinco subunidades, em uma estequiometria de α3 β3 γ1 δ1 ε1. Já Fo apresenta três tipos de subunidades transmembranas- a, b e c, com uma estequiometria de a1, b2, c10.
Para o silenciamento do gene ATP5A1, foi utilizada a técnica do
CRISPR/Cas9. A linhagem parental das células B16-F10 (WT) foram transfectadas
com plasmídeo contendo, além da maquinaria necessária para o funcionamento do
sistema CRISPR/Cas9, os genes para a proteína fluorescente GFP e o gRNA tendo
como alvo o gene de interesse. Após a transfecção, as células GFP-positivas foram
selecionadas por cell sorting (FACS) e plaqueadas em formato single cell em 4
placas de 96 poços.
Foram obtidos, no total, 62 clones. O screening para determinar a eficiência
do silenciamento foi realizado através de western blotting da subunidade α da ATP
sintase (Anti-ATP5α) e parte dos resultados está apresentado na Figura 28.
82
FIGURA 28. IMAGEM REPRESENTATIVA DA EXPRESSÃO DE ATP5Α APÓS SILENCIAMENTO POR CRISPR/Cas9
FONTE: O autor (2019) NOTA: Os clones obtidos após transfecção das células B16-F10 foram lisados com tampão Laemmli. A imagem é representativa da análise de western blotting do da proteína tirosinase, ATP5α, (~60 kDa). Loading control ARD1 (~33 kDa). WT- linhagem selvagem.
Dos mutantes obtidos, foram selecionados dois clones para realização dos
experimentos seguintes (#19 e #33). Como os resultados foram semelhantes, a
partir desse ponto, serão apresentados apenas os resultados para o mutante #33,
renomeado como ATP5A1-KO.
A atividade enzimática da ATP sintase após o silenciamento da subunidade α
foi determinada medindo-se a hidrólise de ATP (atividade de ATPase),
espectrofotometricamente, de forma indireta pela oxidação do NADH (BARRIENTOS
et al. 2009). Os resultados apresentados na figura 29 mostram que há uma redução
significativa, de aproximadamente 50%, na atividade de hidrólise de ATP, pela ATP
sintase, nos mutantes ATP5A1-KO. A atividade da citrato sintase (figura 29) foi
medida como controle. O silenciamento da subunidade α não foi suficiente para
abolir totalmente a atividade do complexo V.
Apesar da atividade remanescente da ATP sintase observada no mutante, as
taxas de consumo de oxigênio e de acidificação extracelular foram traçadas a fim de
verificar o impacto dessa inibição no metabolismo energético celular (figuras 30 e
31). Para esse ensaio, as células B16-F10, tanto WT quanto o mutante, foram
plaqueadas e após 24h, a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de
acidificação extracelular (ECAR) foram mensuradas pelo equipamento Sea Horse
(Seahorse Bioscience, MA, USA).
83
FIGURA 29. ATIVIDADE DA ATPASE E CITRATO SINTASE NOS MUTANTES ATP5A1-KO
FONTE: O autor (2019) NOTA: (A) Atividade do complexo V, nos mutantes ATP5A1-KO e WT, determinada espectrofotometricamente através do acompanhamento da oxidação do NADH a 340nm, a partir da hidrólise de ADP pelo ATP sintase em uma reação acoplada a redução do lactato a piruvato, mediada pela lactato desidrogenase. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em duplicata e os resultados são expressos como nmol de NADH oxidado/min/mg de proteína (*p≤0,001). (B) Atividade da enzima citrato sintase, nos mutantes ATP5A1-KO e WT, determinada espectrofotometricamente através do acompanhamento da redução do DTNB a 412nm, mediada pela CoASH. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em duplicata e expressos como nM de DTNB reduzido/ minuto/ mg de proteína.
Além dos índices basais, os parâmetros sob estresse mitocondrial, na
presença de inibidores, foram avaliados. Novamente, de acordo com as adições
realizadas, é possível determinar o OCR durante os seguintes estados da
respiração: basal, ATP-linked, próton-leak e da respiração máxima (desacoplado)
(BRAND e NICHOLLS, 2011; SEAHORSE, 2017).
Pelo perfil de consumo de oxigênio apresentado na figura 30 é possível
observar que os mutantes B16-F10 ATP5A1-KO apresentam uma respiração basal
significativamente menor que a linhagem parental (WT), e essa redução se mantém
em todos os outros estados.
A capacidade máxima respiratória, na presença do desacoplador FCCP,
também foi significativamente reduzida, o que não era esperado, uma vez que a
diminuição no estado desacoplado pode indicar uma disfunção mitocondrial (BRAND
e NICHOLLS, 2011; SEAHORSE, 2017), sugerindo que o silenciamento da
subunidade alfa da enzima ATP sintase seja responsável por maiores alterações
mitocondriais além do comprometimento da fosforilação oxidativa, provavelmente
efeito de uma desestabilização da permeabilidade da membrana mitocondrial, uma
vez que o próton-leak nas células silenciadas também apresentou uma diferença
significativa.
84
A expressão de ambas as subunidades, α e β, que formam região Fo da ATP
sintase parecem necessárias para a montagem da região catalítica. Mutantes de
células HeLa onde a expressão da subunidade β do sítio catalítico da enzima foi
silenciada, através de short hairpin RNA (shRNA), apresentaram redução também
nos níveis de proteínas da subunidade α, de acordo com experimentos de western
blotting. Entretanto, os autores atribuem essa diminuição à degradação da proteína
α livre, incapaz de formar o complexo α-β, e não a uma regulação direta mediada
pelo knockdown da subunidade β. Ainda, os autores relatam que os mutantes
shRNA β, não foram capazes de produzir ATP mitocondrial (FUJIKAWA e
YOSHIDA, 2010; RAK et al., 2011).
Como esperado, a inibição no consumo de oxigênio nos mutantes ATP5A1-
KO foi acompanhado de um aumento significativo na acidificação extracelular após a
adição de glucose (Figura 31), como esse parâmetro é reflexo da atividade
glicolítica, esses dados sugerem que os mutantes apresentam uma dependência
maior à glicólise em detrimento à OXPHOS.
85
FIGURA 30. TAXA DE CONSUMO DE OXIGÊNIO (OCR) DAS CÉLULAS B16-F10 APÓS SILENCIAMENTO DA GENE ATP5Α
FONTE: O autor (2019) NOTA: A taxa de consumo de oxigênio das células B16-F10 WT e do mutante onde a subunidade alfa da ATP sintase foi silenciada (ATP5A1-KO) foi medida pelo equipamento Seahorse XF24 bioanalyzer. (A) Perfil metabólico das células após o estímulo. Glc: glucose; oligo: oligomicina, inibidor da ATP sintase; FCCP: desacoplador; rot/antA: rotenona e antimicina A, inibidores dos complexos I e III, respectivamente. (B) Parâmetros mitocondriais medidos a partir dos resultados de OCR. Respiração basal- calculada pela subtração dos valores após total inibição mitocondrial com rotenona e antimicina A dos valores basais. Respiração ATP- linked- calculada subtraindo-se os valores de OCR após adição da oligomicina dos valores basais. Próton leak- consumo de oxigênio após a adição de oligomicina. Capacidade máxima respiratória- calculado a partir dos valores de OCR no estado desacoplado (FCCP) menos os valores no estado inibido (Rotenona e antimicina A). Os resultados são representados em % comparados ao controle. Valores referentes a média ± SD de quatro experimentos independentes em duplicata (*p≤0,05; p≤0,01).
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FIGURA 31. TAXA DE ACIDIFICAÇÃO EXTRACELULAR (ECAR) APÓS O SILENCIAMENTO DO GENE ATP5A
FONTE: O autor (2019) NOTA: A taxa de acidificação extracelular (ECAR) em células B16-F10 (WT e ATP5A1-KO) foi medida pelo equipamento Seahorse XF24 bioanalyzer. Glc- glucose; Oligo- oligomicina. Valores referentes a média ± SD de quatro experimentos independentes em duplicata (*p≤0,05).
Como mencionado anteriormente, o aumento nas taxas glicolíticas em
detrimento à OXPHOS tem como produto um acúmulo de ácido lático (DIAZ-RUIZ et
al., 2011). Por essa razão, os níveis de lactato produzidos pelas células ATP5A1-KO
foram determinados (figura 32). Para esse ensaio, as células foram plaqueadas e os
níveis de lactato extracelular foram avaliados em 3, 6 e 24h de cultivo, através do
equipamento Cobass c701 instrument (Roche).
Os resultados, representados na Figura 32, mostram um aumento significativo
na produção de lactato pelas células mutantes ATP5A1-KO, quando comparadas a
linhagem parental (WT), após 24h de cultivo. Esses dados, juntamente com o perfil
metabólico das células após o silenciamento (Figuras 30-31) sugerem fortemente
uma mudança para o metabolismo anaeróbico, induzido pela deficiência na atividade
da ATP sintase.
87
FIGURA 32. NÍVEIS DE LACTATO EXTRACELULAR DAS CÉLULAS B16-F10 ATP5A1-KO
FONTE: O Autor (2019) NOTA: Os níveis de lactato medidos pelo equipamento Cobass c701 instrument (Roche) foram determinados após 3, 6 e 24h de cultivo. Os valores foram normalizados pela concentração de proteínas e estão representados como mM de ácido lático/μg de proteína. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos independentes em duplicata (*p≤0,05).
Primeiramente, o impacto do silenciamento da subunidade alfa da ATP
sintase e a mudança para o metabolismo glicolítico sobre a proliferação das células
foi avaliada durante 24, 48 e 72h, em condições de normóxia e hipóxia (1% de
oxigênio), através da determinação do número de células total, pelo equipamento
ADAM-MC (Digital Bio, NanoEnTek Inc., Seoul, Korea). É possível observar através
dos resultados que os mutantes (ATP5A1-KO), em condições normais de oxigênio
(Figura 33), apresentam um crescimento mais lento em relação à linhagem parental
(WT), não atingindo, mesmo em 72h, confluência semelhante a linhagem controle.
Esse quadro parece ser revertido quando a concentração de oxigênio é mantida
baixa (1%), e os mutantes apresentam um crescimento exponencial maior que a
linhagem parental (WT) após 48h (Figura 33).
Esses resultados de proliferação, em condições de normóxia e hipóxia,
sugerem que os mutantes ATP5A1-KO não apresentam a dependência ao oxigênio
observado no WT.
88
FIGURA 33. PROLIFERAÇÃO CELULAR DAS CÉLULAS ATP5A1-KO EM NORMÓXIA E HIPÓXIA
FONTE: O autor (2019) NOTA: Avaliação da proliferação celular (dobramento) das células B16-F10 WT e ATP5A1-KO, em condições de normóxia e hipóxia. A proliferação celular foi monitorada após 24, 48, 72h. Os valores representam a média ± o SD de três experimentos independentes em duplicata e estão representados como dobramento em relação ao tempo de 24h. (***p≤0,005; ****p≤0,001).
Células que utilizam preferencialmente a via glicolítica como fonte de ATP,
apresentam uma dependência pela glucose e tolerância a baixas concentrações de
oxigênio (ŽDRALEVIĆ et al., 2017). Tendo isso em vista, a capacidade clonal do
mutante ATP5A1-KO foi avaliada, por ensaio clonogênico, na ausência de glucose e
em condições de hipóxia (1% O2).
Como apresentado na figura 34, o silenciamento da subunidade α da enzima
ATP sintase foi capaz de promover uma inibição na formação de clones das células
B16-F10 em condições normais de oxigênio. Essa característica foi parcialmente
revertida em condições de hipóxia, corroborando com os dados de proliferação
obtidos e apresentados na figura 33. É importante ressaltar que o grupo controle do
mutante ATP5-KO em condição de hipóxia mostrou crescimento mais acelerado que
o mesmo grupo em hipóxia, devido a essa característica e visando-se manter a
mesma condição experimental de incubação por 7 dias, o resultado foram colônias
maiores que durante a coloração, acidentalmente tiveram o centro lavados das
placas, o que pode levar a uma interpretação errônea de que a formação de colônias
nessa condição foi inibida.
89
FIGURA 34. CAPACIDADE CLONAL DOS MUTANTES ATP5A1-KO
FONTE: O autor (2019) NOTA: Imagem representativa do ensaio clonogênico realizado das células B16-F10 WT e ATP5A1-KO. As células foram plaqueadas a uma densidade baixa (103) e após 24h, para adesão, o meio de cultivo foi substituído por meio não contendo glucose ou contendo 3μM de oligomicina, inibidor da ATP sintase. O grupo controle foi mantido em meio normal. Os clones formados foram corados após 7 dias com o corante Giemsa. Imagem representativa de dois experimentos independentes em duplicata.
Os resultados referentes às células ATP5A1-KO mostram que o silenciamento
da subunidade α da ATP sintase foi suficiente para comprometer a OXPHOS,
levando a uma inibição na respiração celular forçando as células a um metabolismo
anaeróbico, mesmo na presença de oxigênio, a fim de sustentar a demanda
energética para o crescimento celular. Como consequência, as células apresentam
maior atividade glicolítica, dependência a glucose e um crescimento celular
comprometido.
90
A partir da obtenção do mutante ATP5A1-KO (células com capacidade
respiratória deficiente e atividade glicolítica alta) e juntamente com a utilização dos
mutantes GPi-KO (que apresentam a via glicolítica interrompida e tem seu
metabolismo energético baseado na fosforilação oxidativa), foi possível verificar se
alterações no metabolismo energético celular são capazes de promover mudanças
na produção de melanina dessas células.
Para avaliação desse parâmetro, as células B16-F10 WT e os mutantes
ATP5A1-KO e GPi-KO, foram submetidos à indução melanogênica por 48h, através
da utilização de forscolina (25μM) e a produção de melanina foi determinada
espectrofometricamente como descrito no item 5.3 da seção de Material e Métodos.
FIGURA 35. DOSAGEM DOS NÍVEIS DE MELANINA INTRACELULAR DOS MUTANTES GPI-KO E ATP5A1-KO
FONTE: O autor (2019) NOTA: Analise espectrofotométrica da concentração de melanina intracelular no lisado de células após 48h de estímulo com 25μM de forscolina, na presença ou não de 200μM de ácido kójico, inibidor da enzima tirosinase. Os dados correspondem a média ± SD de três experimentos em duplicata independentes e os resultados são expressos como μg de melanina/ μg de proteína (*p≤0,05; **p≤0.01; ***p≤0,005; ****p≤0,001).
Os resultados apresentados na Figura 35 mostram que há uma inibição na
produção de melanina em ambos os mutantes, GPi-KO e ATP5A1-KO, quando
comparados a linhagem WT. Entretanto, o mutante ATP5A1-KO apresentou um
pequeno aumento nos níveis de melanina intracelular após a indução da
melanogênese, comparado com a mesma linhagem na ausência de forscolina,
sugerindo um papel mais importante da via glicolítica no processo melanogênico.
91
Essa observação, juntamente com os resultados apresentados na seção 6.3 desse
trabalho, que sugerem uma indução da glicólise mediada por HIF-1α em resposta ao
estímulo da melanogênese por forscolina, reforçam uma possível relação entre o
processo glicolítico e a síntese de melanina.
Além disso, é evidente que o comprometimento do metabolismo energético
geral da célula e, consequentemente, na produção de ATP, é suficiente para inibir a
melanogênese nas células B16-F10. É importante destacar que a indução da
melanogênese pela forscolina é, provavelmente, limitada pela concentração de ATP
intracelular, uma vez que essa molécula é substrato da enzima AC para síntese de
cAMP (PINTO et al., 2008) e a sua depleção, teria efeito inibitória na atividade da
AC, apesar da ativação pela forscolina.
Entretanto, De Padua et al. (2017) mediram os níveis de ATP nas células GPi-
KO e observaram que esse mutante apresentou maiores níveis de ATP intracelular
quando comparados à linhagem parental, o que sugere que nossas observações em
relação à produção de melanina nesse mutante está, possivelmente, mais
relacionado à inibição da via glicolítica do que às concentrações intracelulares de
ATP.
92
7 CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos nos experimentos realizados com as células de
melanoma murino B16-F10 submetidas ao estímulo melanogênico, podemos
concluir que o tratamento das células submetidas a duas diferentes metodologias de
estímulo da síntese de melanina, pela suplementação do meio de cultura com L-
tirosina e NH4Cl ou pela presença do composto forscolina são eficientes em
aumentar a pigmentação das células, entretanto, os níveis quantificados mostram
que o estímulo com a forscolina é menor.
O estímulo da melanogênese com forscolina causou menor proliferação e
capacidade clonogênica das células de melanoma. que podem ser resultado do
aumento de cAMP intracelular resultante da ativação da enzima adenilato ciclase,
uma vez que essa inibição não foi revertida na presença do inibidor da tirosinase, o
ácido kójico.
Além disso, o perfil metabólico das células submetidas à maior produção de
melanina mostrou estímulo da glicólise em detrimento da fosforilação oxidativa,
mesmo na presença de oxigênio.
Houve aumento de ROS nas mitocôndrias das células estimuladas, como
indicado pelos níveis de radical superóxido, mais danos no DNA mitocondrial,
aumento na expressão de Nfr2, estabilização e consequente acúmulo de HIF-1α e
de seu alvo (GLUT-1).
Por fim, alterações no metabolismo promoveram inibição na via
melanogênica, uma vez que células cujo metabolismo glicolítico (GPi-KO) e
respiratório (ATP5A1-KO) estavam comprometidos não foram capazes de sintetizar
melanina nas mesmas proporções das células da linhagem parental (WT), mesmo
em condições de indução desta via com o composto forscolina.
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8 REFERÊNCIAS
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