UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE FARMACIA

GENÉTICA MOLECULAR DE LA DEFICIENCIA ERITROCITARIA HUMANA EN PIRUVATO QUINASA

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR

Amando Garrido Pertierra

Bajo la dirección de los Doctores:

José Manuel Bautista Santa Cruz

Bartolomé Ribas Ozonas

Madrid, 2002

ISBN: 84-669-2029-3

Resumen ................................................................................................ i Summary ................................................................................................ ii Abreviaturas ............................................................................................ iii I. Introducción ....................................................................................... 1

I. 1. Los eritrocitos .......................................................................... 2 I. 1. 1. Características generales............................................. 2 I. 1. 2. Génesis, diferenciación y destrucción de los eritrocitos ............................................................. 3

I. 1. 3. Bioquímica del eritrocito ............................................ 7 I. 1. 3. 1. Las rutas metabólicas en el eritrocito ..................... 9 I. 1. 3. 2. La regulación de la glucolisis en los eritrocitos ..... 10 I. 1. 3. 3. El ciclo del 2,3-bisfosfoglicerato .......................... 12

I. 2. Las anemias hemolíticas ............................................................. 14 I. 3. Mutaciones, función proteica y fenotipo .................................. 17

I.3.1. Las alteraciones en las proteínas multiméricas ............ 19 I. 4. Piruvato quinasa ........................................................................ 22 I. 4. 1. Estructura tridimensional de la piruvato quinasa ................... 24

I. 4. 2. Lesiones moleculares en la deficiencia piruvato quinasa .................................................................... 25

I.4. 3. El metabolismo de eritrocitos deficientes en piruvato quinasa ............................................................... 25 I. 4. 4. Mutaciones en el gen de la piruvato quinasa ......................... 28

I. 4. 5. Expresión y regulación del gen piruvato quinasa .................. 30 I. 4. 6 Terapia habitual y génica en la deficiencia piruvato quinasa ................................................................... 30

II. Objetivo del trabajo ................................................................... 33

III.Materiales y Métodos ................................................................ 35 III. 1. Reactivos ............................................................................................ 36

III 2. Material biológico ................................................................... 36 III. 3. Aparatos utilizados .................................................................. 36 III. 4. Procedimientos generales ........................................................ 36 III. 4. 1. Extracción de DNA de células nucleadas humanas ............. 37 III. 4. 2. Extracción de RNA total de sangre entera ........................... 37 III. 4. 3. Análisis electroforéticos ....................................................... 38 III. 4. 3. 1. Marcadores de tamaños de fragmentos de DNA ............. 39 III. 4. 4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ........................ 39

III. 4. 5. Inserción y unión de los productos de PCR al vector pGEM-T ........................................................ 41 III. 4. 6. Transformación de celulas de Escherichia coli ........ 43 III. 4. 7. Aislamiento de los plásmidos conteniendo los insertos de DNA ..................................................... 44

III. 4. 8 . Aislamiento y caracterización de los insertos plasmídicos .............................................................. 45

III. 4. 10. Secuenciación automática de DNA ........................ 46 III. 4. 11. Construcción de modelos moleculares ................... 46

IV Resultados y Discusión ............................................................ 47 IV.1 Las mutaciones en piruvato quinasa y sus consecuencias fisiopatológicas ...................................................................................... 48

IV.1.1. Manifestaciones clínicas de pacientes defectivos en piruvato quinasa ................................................................ 48 IV.1.2. Caracterización molecular de pacientes con deficiencia en piruvato quinasa ................................................................ 51 IV.1.3. Naturaleza química de las mutaciones ................................... 53 IV.1.4. Distribución de la frecuencia de las mutaciones en piruvato quinasa ................................................................. 55 IV.1.5. Herencia genética de las deficiencias piruvato quinasa: Genealogías .............................................................. 59 IV.1.6. Localización de las mutaciones en los exones y en las regiones del gen piruvato quinasa ................................. 62

IV. 2. Las relaciones estructura/función de las enzimas defectivas en piruvato quinasa ............................................................................... 66

IV.2.1. Los cambios aminoacídicos y sus efectos en la actividad piruvato quinasa ...................................................... 66 IV.2.2. Efectos de las mutaciones sobre la estructura de la piruvato quinasa: Modelos moleculares ............................. 67

V. Conclusiones .................................................................................... 79 VI. Bibliografia ..................................................................................... 82

Resumen i

Resumen La piruvato quinasa (ATP: piruvato 2- O- fosfotransferasa; EC 2.7.1.40) cataliza la transformación de fosfoenolpiruvato y ADP en piruvato y ATP. La enzima, que aparece en toda las células vivas, es clave en la ruta central del metabolismo de carbohidratos. En la especie humana han sido caracterizados dos genes diferentes: El PK-M que, se encuentra en el cromosoma 15 y, codifica las isoenzimas del tejido muscular y de los leucocitos y la PK-LR, que aparece en el cromosoma 1, que codifica las isoenzimas del hígado y de los eritroci-tos. La deficiencia en piruvato quinasa, debida a una mutación en el gen PK-LR, origina alteraciones, únicamente, en el metabolismo de los eritrocitos, porque estas células no son capaces de compensar el defecto enzimático aumentando la síntesis de enzima mutada ni utilizar otras rutas degradativas. Por ello, la deficiencia de esta enzima es causa principal de la anemia hemolítica no esferocítica; los síntomas clínicos de esta enfermedad abarcan desde un estado hemolítico compensado hasta una anemia grave que puede provocar incluso la muerte de los pacientes. Los métodos clásicos para estudiar las variantes con deficiencia piruvato quinasa han sido estardadizados por la Comisión Internacional de Estardalización en Hematología (ICSH). Sin embargo, la interpretación de los resultados bioquímicos de las enzimas defi-cientes en la actividad piruvato quinasa se ve dificultada por la alta frecuencia de heterocigo-tos que conducen a, presumiblemente, enzimas híbridas con diferentes propiedades molecula-res. Además, debido a la baja actividad de la enzima en los eritrocitos de los pacientes, estos requieren constantemente sangre y la caracterización de la enzima deficiente se ve difi-cultada por las actividades de la enzima de los eritrocitos normales del donante y del produc-to del gen PK-M de los leucocitos. Estos problemas ha llevado a estudiar la enzimopatia eritrocitaria piruvato quinasa mediante técnicas de Biología Molecular, utilizando funda-mentalmente la amplificación del gen PK-R mediante la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación nucleotídica del mismo. Los resultados así obtenidos han proporcionado un diagnostico exacto de la enfermedad y marcan la pauta a seguir en el transcurso de la misma, y facilitando la aplicación de una terapia adecuada. El trabajo se realizó sobre 10 pacientes no relacionados familiarmente con deficien-cia en piruvato quinasa eritrocitaria y anemia hemolítica no esferocítica. No se ha podido establecer una correlación directa entre el nivel de actividad de la enzima obtenido y el grado de alteración clínica observada. Mediante al análisis molecular se han encontrado 11 muta-ciones diferentes en los 17 alelos mutados: tres de estas mutaciones, G694A, A1150G y G1154A, no habían sido previamente descritas. El bajo nivel de actividad piruvato quinasa que se encuentra en aquellos pacientes con mutaciones localizadas en los dominios A y C del monómero se explica fácilmente por-que dichos dominios son claves en la acción catalítica de la enzima. Sin embargo, no se ha encontrado una explicación lógica para la disminución de la actividad enzimática correspon-diente a la sustitución aminoacídica Gly232 → Ser que se localiza en el dominio C del mo-nómero, y en el que hasta el momento no se descubierto una función determinada en el pro-ceso catalítico.

A las mutaciones que originan fuertes modificaciones en la estructura local de la mo-lécula, observadas mediante estudios de modelización molecular, como consecuencia de un desajuste en el balance de las cargas eléctricas o por impedimento estérico, corresponden valores disminuidos de la actividad de la enzima en aquellos pacientes portadores de dichas mutaciones.

Summary ii

Summary

The enzyme pyruvate kinase (PK) (ATP: pyruvate 2-O-phosphotransferase) catalyses the transformation of phosphoenolpyruvate and ADP to pyruvate and ATP. The activity of this ubiquitous enzyme is essential for the central carbohydrate metabolism. Two genes encoding isoenzymes of PK have been characterized in human cells: PK-M from chromosome 15 is expressed in leukocytes and muscle tissue, and PK-LR from chromosome 1 is present in erythrocytes. Deficiency in PK activity causes non-espherocitic haemolytic anaemia, due to alterations in the metabolism of erythrocytes. The red cell lacks alternate metabolic pathways for pyruvate, and can not cope with the enzymatic fault by increasing the synthesis of the protein. Clinical symptoms in patients harbouring a PK deficiency range from a balanced haemolytic condition to severe anaemia, which may lead to death.

The International Commission for Standardization in Haematology (ICSH) provides biochemical methods to study the variants for deficiency in PK. However, results derived from enzymatic activities measurements may be misinterpreted due to the high frequency of heterocygous, which, presumibly, produce hybrid enzymes. In addition, the low PK activity in the patient erythrocytes obliges to frequent blood transfusions, and donor pyruvate kinase may also lead to misleading results. These problems led to the application of molecular biology tools, basically the amplification of the PK-R gene using PCR and the sequencing of the products obtained. The results obtained have allowed the precise diagnosis of the disease, and also can help in its monitoring and the choice of therapy strategies.

The present work was performed on 10 PK deficient patients familly-unrelated. It was not possible to establish a direct correlation between the enzymatic activities and the degree of physiological alterations. By means of molecular analysis, we have found 11 different mutations in the 17 alleles analysed, three of which have not been previously reported.

The low pyruvate kinase activity, found in patients harbouring mutations at the A and C domain, can be explained as these domains are essential for the enzyme activity. However, the reason for the low activity found in a mutant carrying the amino acidic substitution Gly232 -> Ser, located at the C domain, remains obscure, as this domain has not been associated with any catalytic process.

Changes in the protein structure caused by mutations which introduce steric hindrance or substitutions in charged residues, analised by molecular modeling, showed a clear correlation with the reduction in PK activity in the patients studied.

Abreviaturas iii

A: Adenina Å: Angström(s) ADP: Adenosina difosfato Ala: Alanina, (A) AMP: Adenosina monofosfato ATP: Adenosina trifosfato Arg: Arginina, (R) Asn: Asparragina, (N) Asp: Acido aspártico, (D) Asx: Asparragina o ácido aspártico (B) BFU-E1: Unidad formadora de células

inmaduras BFU-E2: Unidad formadora de celulas de

maduración media BPF: Factor promotor de colonias 2,3-BPG: 2,3-bisfosfoglicerato C: Citosina cDNA: DNA complementario CFU-E: Unidad formador de colonias de

eritrocitos CFU-G: Unidad formadora de colonias de

granulocitos CFU-LH: Unidad formadora de colonias

linfoides y hematopoyéticas CFU-S: Unidad formadora de colonias de

bazo CNSHA: Anemia hemolítica crónica no

esferocítica Cys: Cisteína, (C) dATP: Desoxiadenosina trifosfato dCTP: Desoxitimidina trifosfato dCTP: Desoxicitidina trifosfato dGTP: Desoxiguanosina trifosfato DHAP: Dihidroxiacetona fosfato DNA: Acido desoxirribonucleico DNasa: Desoxirribonucleasa dNTPs: Desoxinucleósidos trifosfato FBP: Fructosa 1,6-bisfosfato G: Guanina Glu: Acido glutámico, (E) Gly: Glicina, (G) Glx: Glutamina o ácido glutámico, (Z) G-SH: Glutation Hb: Hemoglobina Hb O2: Oxihemoglobina His: Histidina, (H)

ICSH: International Committee for Stan-dadization in Haematology

IDH: Indice de la distribución estándar del volumen corpuscular de los eritro-citos

Ile: Isoleucina, (I) Leu: Leucina, (L) Lys: Lisina, (K) MAT1A: Gen de la metionina adenosil-

transferasa Met: Metionina, (M) mRNA: RNA mensajero NAD+: Nicotinamida adenina dinucleótido

(forma oxidada) NADH: Nicotinamida adenina dinucleóti-

do (forma reducida) NADP+: Nicotinamida adenina dinucleó-

tido fosfato (forma oxidada) NADPH: Nicotinamida adenina dinucleó-

tido fosfato (forma reducida) PCR: Reacción en cadena de la polimera-

sa PEP: Fosfoenolpiruvato Phe: Fenilalanina, (F) PK: Piruvato quinasa PK-M: Gen de las isozimas M1 y M2 PK-LR: Gen de las isozimas L y R PK-M1: (ó M1), isozima M1 de la piruvato

quinasa PK-M2: (ó M2), isozima M2 de la piruvato

quinasa PK-L: (ó L), isozima L de la piruvato

quinasa Pro: Prolina, (P) PK-R: (ó R), isozima R de la piruvato

quinasa RNA: Acido ribonucleico RNasa: Ribonucleasa T: Timina Thr: Treonina, (T) Trp: Triptófano, (W) Tyr: Tirosina, (Y) U: Uracilo Val: Valina, (V)

I.1. Los eritrocitos

I.1.1. Características generales

Los eritrocitos, hematíes o glóbulosrojos son células sanguíneas cuya fun-ción principal es la de transportar eloxígeno desde los pulmones a los teji-dos. Los eritrocitos normales son dis-cos bicóncavos con un diámetro mediode, aproximadamente, 7-8 micras, unespesor en el centro de 1 micra y en superiferia, el punto más ancho, de 2,5micras, y un volumen medio de 90 a95 micras cúbicas.

La forma de los eritrocitos puedecambiar cuando atraviesan los capila-res. En realidad son células que pue-den deformarse adoptando casi cual-quier forma. Además, debido a queposee una membrana celular de un ta-maño bastante superior al perímetrodel material que encierra, la deforma-ción no fuerza la membrana demasiadoy, en consecuencia, la célula no serompe como sucede con las de otrasclases. En los varones de la especiehumana el número medio de eritrocitospor mililitro es de 5.200.000 y en lasmujeres de 4.700.000, aunque variosfactores como la altitud y, por tanto lapresión de oxígeno, a la que viven laspersonas, pueden hacer variar estascifras.

Los eritrocitos, además de trans-portar hemoglobina, realizan otrasfunciones y por ello contienen variasenzimas. Así, contienen una gran can-tidad de anhidrasa carbónica que cata-liza la reacción entre el dióxido decarbono y el agua para formar bicar-bonato. La rapidez con que se lleva acabo la reacción gracias a la accióncatalítica de la enzima, que aumenta lavelocidad 107 veces, hace que el aguade la sangre reaccione con el CO2 y

transporte este compuesto desde lostejidos a los pulmones en forma de bi-carbonato. En este sentido, los eritro-citos participan en el equilibrio ácido-base de la sangre ya que la hemoglo-bina que contienen es una excelentesustancia reguladora de dicho equili-brio.

Esta acción se realiza gracias a lainterconversión entre la hemoglobina yla oxihemoglobina por el oxígeno, losprotones y los sistemas reguladoreshemoglobinato/hemoglobina y oxihe-moglobinato/oxihemoglobina. En losalveolos pulmonares, con una elevadaconcentración de oxígeno, se favorecela conversión de hemoglobina enoxihemoglobinato y la liberación deprotones mediante la anhidrasa carbó-nica que favorece la liberación de di-óxido de carbono. Sin embargo, en lostejidos, debido al metabolismo, se pro-duce dióxido de carbono y otros ácidosque disminuyen el pH, por lo que latransformación se realiza en sentido deoxihemoglobinato a hemoglobina fa-voreciendo la libera-ción de oxígeno ycon ello una mayor participación delsistema hemoglobinato/hemoglobina.El conjunto de estos procesos impideque se produzcan grandes cambios depH y que tengan lugar los correspon-dientes intercambios oxígeno/dióxidode carbono en los tejidos y en los al-veolos pulmonares (Lozano y col.,1997)

Los eritrocitos tienen la capacidadde concentrar la hemoglobina en ellíquido intracelular hasta los 340mg/mL. La concentración nunca seeleva por encima de este valor porqueconstituye un límite metabólico delmecanismo de formación de hemoglo-bina en la célula. Cuando la formaciónde hemoglobina en la médula ósea esdeficiente, el porcentaje de hemoglo-

bina en las células puede reducirseconsiderablemente por debajo de estevalor y también reducirse el volumende hematíes debido a la menor canti-dad de hemoglobina que ocupa la cé-lula.

Cuando el hematocrito (volumende sangre ocupado por los eritrocitos)y la cantidad de hemoglobina de cadacélula son normales, la sangre com-pleta de los varones contiene una me-dia de 160 mg de hemoglobina por mLy la de las mujeres una media de 140mg/mL. Cada gramo de hemoglobinapura es capaz de combinarse con unos2 mg de oxígeno. Por lo tanto, el varónnormal puede transportar más de 300mg de oxígeno combinados con lahemoglobina por cada litro de sangre yla mujer normal 270 mg ( Guyton yHall, 1996)

I.1.2. Génesis, diferenciación ydestrucción de los eritrocitos

Las células sanguíneas derivan decélulas de la médula ósea llamadascélulas progenitoras hematopoyéticaspluripotenciales (Fig.1). A medida queestas células se reproducen, hecho quesucede a lo largo de la vida de una per-sona, una porción de ellas permaneceen la médula ósea, exactamente igualque las células originales, aunque sunúmero disminuye con la edad. Sinembargo, la mayor parte de las célulaspluripotenciales se diferencia paraformar otras células sanguíneas: eri-trocitos, monocitos, linfocitos, etc.

La primera descendencia no puedetodavía diferenciarse de las célulasprogenitoras pluripotenciales, aunqueya estén comprometidas en una líneacelular particular, y se denominan cé-lulas progenitoras comprometidas.Cuando estas células crecen en culti-

vos producen colonias de tipos especí-ficos de células sanguíneas. Así, unacélula progenitora comprometida queproduzca eritrocitos se denomina uni-dad formadora de colonias de eritro-citos (CFU-E) (colony forming uniterythrocyte). De igual modo, las uni-dades formadoras de colonias que ori-ginan granulocitos y monocitos se de-signan CFU-G, CFU-M y así sucesi-vamente.

La proliferación y reproducción delas diferentes células progenitoras es-tán controladas por múltiples proteínasllamadas inductores de la prolifera-ción. Se han descrito cuatro inductoresprincipales, cada uno con característi-cas diferentes. Uno de ellos, la inter-leucina-3, favorece la proliferación yreproducción de casi todos los tiposdiferentes de células progenitoras,mientras que los otros inducen la proli-feración sólo de tipos específicos decélulas progenitoras comprometidas.

Los inductores de la proliferaciónpromueven este proceso, pero no ladiferenciación de las células. Esta fun-ción está destinada a otro grupo deproteínas denominadas inductoras dela diferenciación. Cada una de ellashace que un tipo de célula progenitorase diferencie en uno o más pasoshacia un tipo final de célula sanguíneaadulta.

La formación de los inductores dela proliferación y diferenciación estácontrolada por factores externos a lamédula ósea. Por ejemplo, en el casode los eritrocitos, la exposición del or-ganismo a una baja presión parcial deoxígeno durante un largo periodo detiempo, provoca la inducción de laproliferación, la diferenciación y laproducción de un número más elevadode eritrocitos. En el caso de algunosleucocitos, las enfermedades infec-

ciosas provocan la proliferación, ladiferenciación y la formación final detipos específicos de leucocitos que sonnecesarios para combatir la infección(Harrison, 1984).

El principal factor que estimula laproducción de hematíes es una hormo-na circulante denominada eritropoyeti-na, una glucoproteína de 34 kDa. Endiferentes estudios hematológicos seha comprobado, que el papel esencialde la eritropoyetina es estimular laproducción de proeritroblastos a partirde las células progenitoras hematopo-yéticas en la médula (Rich,1987).

En la formación de las células ma-duras sanguíneas en período de creci-miento y en la vida adulta participan,consecutivamente, tres clases de cé-lulas independientes entre sí: Célulaspluripotenciales, células unipotencialesy células en fase de especialización.

La producción de eritrocitos, comode otras células de la serie mieloide(granulocitos, megacariocitos, etc.)tiene lugar en la médula ósea, mientrasque los de la serie linfoide ocurre prin-cipalmente en el bazo y en los órganoslinfoides. En el crecimiento y diferen-ciación de ambas series desempeñanun papel fundamental las células queforman parte del estroma de los dis-tintos órganos (fibroblastos, preadipo-citos, células endoteliales, etc.)

El hecho de que todas las célulassanguíneas tengan una vida media li-mitada, exige que su produccióntranscurra a un ritmo continuo durantetoda la vida del individuo con el fin demantener un nivel constante de lasmismas. Ello requiere la existencia deun acervo celular en la médula ósea,común para todas las líneas hematopo-yéticas, que está constituido por unapoblación relativamente pequeña de

células germinales no diferenciadas,las cuales se depositan en las cavida-des óseas durante las primeras etapasde la embriogénesis. Aunque su núme-ro es pequeño, estas células poseenuna gran capacidad de autorrenovación(producción de células hija germina-les) y, además, se caracterizan por laposibilidad de diferenciarse en una se-rie de líneas celulares distintas (célulaspluripotenciales). Debido a esta capa-cidad precursora, tanto de la seriemieloide como de la linfoide, estascélulas germinales han recibido elnombre de unidad formadora de colo-nias linfoides y hematopoyéticas(CFU-LH).

La diferenciación de las célulasgerminales conduce, por un lado, a lacélula progenitora hematopoyéticaprecursora de las series eritrocitarias,granulocítico-monocítica y megacario-cítica y, por otro, a las células proge-nitoras linfopoyéticas que son especí-ficas para la producción de los linfo-citos T y B.

La célula progenitora hemato-poyética pluripotencial recibe el nom-bre de unidad formadora de coloniasde bazo (CFU-S). Entre sus caracte-rísticas más importantes, resalta quetiene una elevada capacidad de auto-rrenovación permitiendo así satis-facerla demanda de células ejercida, tantopor parte del compartimento unipoten-cial como del propio pluri-potencial, yen la que es preciso sustituir aquellascélulas destruidas por accidente o en-fermedad.

Como consecuencia del proceso dediferenciación celular surge, a partir deCFU-S, un grupo de células determi-nadas que sigue el desarrollo hacia unalínea celular fija. Estas células unipo-tenciales son las progenitoras de lastres hematopoyéticas primordiales:

granulocítica, meganocítica y eritrocí-tica (Brewer, 1984).

Las células destinadas a la produc-ción de eritrocitos se denominan célu-las sensibles a la eritropoyetina, debi-do a que esta hormona controla la pro-liferación y diferenciación de los proe-ritroblastos. A diferencia de la CFU-S,presentan ciclos celulares mucho máscortos (mayor velocidad de prolifera-ción) y tienen una menor capacidad deautorrenovación. De acuerdo con elgrado de respuesta a la eritropoyetinay con su velocidad de proliferación,cabe distinguir tres tipos de poblacio-nes eritropoyéticas. El de células másinmaduras corresponde a la unidadformadora de colonias eritrocitariasque estallan (burst) o BFU-E1, quesurgen en respuesta a la acción sobrela CFU-S de un factor promotor deeste tipo de colonias (BPF). Estas cé-lulas requieren ciertos niveles de eri-tropoyetina y necesitan un largo perío-do de incubación para que aparezca enellas la diferenciación eritroblástica(Rich, 1987; Luque y col., 1991).

La acción del BPF conduce a laformación de un segundo tipo de colo-nias denominadas BFU-E2 con mayorgrado de maduración y que presentaun número elevado de receptores demembrana para la eritropoyetina. Es apartir de este último tipo, del que surge

el tercer subgrupo de formación de-nominado unidad formadora de colo-nias eritrocitarias normales (CFU-E),que precisan escasos niveles de eritro-poyetina y un período de cultivo corto,para dar lugar al proeritroblasto. Elsegundo subgrupo de células unipo-tenciales (BFU-E2) tienen una mayorvelocidad de proliferación y es menossensible a la eritropoyetina que el ter-cer subgrupo.

La primera célula que puede identi-ficarse como perteneciente a la seriede eritrocitos es el proeritroblasto, elcual se divide varias veces formandomuchos eritrocitos maduros (Fig.2).Las células de la primera generaciónse llaman eritroblastos basófilos por-que se tiñen con pigmentos básicos; eneste punto la célula ha acumulado muypoca hemoglobina. En las generacio-nes siguientes, las células se llenan dehemoglobina hasta una concentraciónde, aproximadamente, un 34 % delvolumen total, al mismo tiempo quese reabsorbe el retículo endoplásmico.La célula en este estadio se llama reti-culocito porque todavía contiene unapequeña cantidad de material basófilo,constituido por restos del aparato deGolgi, mitocondrias y otros pocos ti-pos de orgánulos citoplásmicos. Du-rante esta fase, los reticulocitos pasande la médula ósea a los capilares san-

Fase de especialización

Fase de maduración

SANGRE MEDULA OSEA

Proerit roblast o Erit roblast obasófilo

Erit roblast opolicromat óf ilo

Eritr oblast oort ocromát icoRet iculocit o

Int ramedularRet iculocit osErit rocit os

Figura 2. Desarrollo celular en médula ósea y sangre circulante, durante la fase de especializacióny maduración celular de los eritrocitos

guíneos por estrangulamiento a travésde los poros de la membrana capilar.El resto del material celular desaparecenormalmente en 1 ó 2 días, y el reti-culocito se convierte en un eritrocitomaduro.

Cuando los eritrocitos pasan de lamédula ósea al sistema circulatorio,normalmente circulan una media de120 días, antes de ser destruidos. Aun-que los eritrocitos maduros no tienennúcleo, mitocondrias, ni retículo en-doplásmico, mantienen las enzimascitoplásmicas que son capaces demetabolizar la glucosa para formar pe-queñas cantidades de ATP y, espe-cialmente, de la forma reducida delnicotinamina adenina dinucleótido fos-fato (NADPH). El NADPH, mediantesu posición junto al glutation en lacascada de reacciones de oxido-reducción, mantiene un ambiente re-ducido en la célula que sirve para eli-minar el peróxido de hidrógeno y otrasespecies reactivas del oxígeno y poseeimportantes funciones en los eritroci-tos, entre las que se encuentran: a)Mantener la flexibilidad de la mem-brana celular. b) Mantener el trans-porte de iones a través de la membra-na. c) Mantener el hierro de la hemo-globina de la célula en estado ferroso yno férrico, lo que provocaría la for-mación de metahemoglobina d)Evitarla oxidación de las proteínas intrace-lulares.

Una vez que la membrana de loshematíes se hace frágil, la célula serompe al pasar a través de algún es-trechamiento del sistema circulatorio.Muchos de los eritrocitos se fragmen-tan en el bazo, porque se comprimenal pasar a través de su pulpa roja. Estose explica porque los espacios entrelos trabéculos estructurales de la pulparoja, a través de los cuales deben pasar

la mayor parte de las células, son tansólo de 3 nm de anchura mientras queel diámetro del eritrocito es más de 2,5veces mayor (Brewer, 1980; Guyton yHall, 1996; McMullin, 1999).

I.1.3. Bioquímica del eritrocito

Como se ha indicado anteriormente,el eritrocito es un elemento anucleadoque realiza el transporte de oxígenocasi exclusivamente mediante la inter-vención de la hemoglobina.

A lo largo de su vida, un eritrocitorecorre casi medio millón de veces elaparato circulatorio y, debido a queposee una resistencia mecánica excep-cional y una gran flexibilidad, atravie-sa continuamente circuitos de diámetroinferior a su propio tamaño; en ciertomodo se comporta como un semisólidoelástico y, aunque presenta una formabicóncava, es una célula capaz de de-formarse. Todas estas propiedadesvienen condicionadas por varios facto-res que atañen a la membrana, entrelos que destacan su composición lipí-dica, su carga electrostática y, en par-ticular, la presencia de una rígida ma-lla de proteínas adosada a la superficiecitoplasmática que se denomina es-queleto submembranoso (Harrison,1984).

La membrana de los eritrocitos seaísla con facilidad mediante un trata-miento con disoluciones hipotónicas oagentes tensioactivos, que provocan lahemólisis y, consecuentemente, la pér-dida del contenido celular (integradomayoritariamente por la hemoglobi-na). La membrana, así aislada, se de-nomina estroma, y mantiene su forma,tamaño, composición y permeabilidadcaracterísticas. Contiene un 40% delípidos, un 52% de proteínas y un 8%de glícidos. La bicapa que establecen

los lípidos es asimétrica en cuanto a lacomposición de sus dos láminas.(Bennet, 1985).

Aunque no está completamente es-tablecida la disposición del esqueletosubmembranoso, se conocen un grannúmero de detalles estructurales. Elcomponente que constituye la tramafilamentosa básica, y que supone lamitad de su masa total, es la espectri-na, un heterodímero cuyas subunida-des α y β, de pesos moleculares 260y 225 KDa respectivamente, se unenentrelazándose de forma laxa, en sen-tido longitudinal; forman una especiede varillas de 100 nm de longitud que,a su vez, se asocian por la cabeza for-mando tetrámeros (α2ß2), cuya flexibi-lidad les permite adoptar muchas con-formaciones. La espectrina es un com-ponente fundamental del eritrocito,como indica su conservación estructu-ral a lo largo de la evolución. Asociadalateralmente a ambas subunidades dela espectrina, en un punto próximo a lacola del dímero, se encuentra la actina,que está polimerizada (actina F), for-mando protofilamentos cortos integra-dos por 10 - 20 monómeros. Ademásdel sitio de asociación con la actina, ymuy cerca de éste, la espectrina poseeun sitio de unión para otra de las pro-teínas componentes del esqueleto co-mo es la banda denominada 4.1, conuna masa de 78 kDa. Esta proteína esuna molécula globular que, por un la-do, promueve cooperativamente launión espectrina-actina y, por otro, seliga al dominio citoplasmático de laglicoforina, y constituye así una de lasuniones a la membrana. Es de destacarque para la unión de la banda 4.1 a laglicoforina, se requiere que esta últimaproteína interaccione con un determi-nado lípido de la bicapa, lo que conce-de un papel primordial a estos consti-

tuyentes en la fijación del esqueletosubmembranoso.

Sin embargo, la unión principal nose efectúa directamente a la banda 4.1,sino a través de otra proteína, la anqui-rina (banda 2.1), que es una gran mo-lécula piramidal de masa 240 kDa,que posee dos dominios estructurales;mediante uno de ellos se liga estre-chamente a la espectrina y mediante elotro lo hace a una zona citoplasmáticade otra proteína denominada banda 3.Así se establecen enlaces cruzados,constituyendo la anquirina el elementoprimordial de fijación de la red fila-mentosa de la espectrina a la membra-na.

I.1.3.1. Las rutas metabólicas enel eritrocito

A diferencia de otras células y desus propios precursores, el eritrocitomaduro carece de orgánulos subcelu-lares. En sentido estricto podría decir-se que no es una célula viva, al menoscomo las demás, puesto que no puedesintetizar proteínas, glucógeno ni lípi-dos y es incapaz de llevar a cabo lafosforilación oxidativa. En consecuen-cia, su metabolismo, muy reducido,queda limitado a la glucolisis, ciclo delas pentosas fosfato, ciclo del 2,3-bifosfoglicerato, reacciones de oxido-rreducción para la detoxificación desustancias oxidantes y ciertos aspectosdel metabolismo nucleotídico. Estasrutas y reacciones son justamente lasprecisas para mantener sus necesida-des metabólicas durante los 4 mesesde vida media celular. El eritrocito re-quiere la energía para la realizacióndel transporte iónico (sodio, potasio ycloro, principalmente), para el mante-nimiento del hierro de la hemoglobinaen su forma divalente, de los grupos

sulfhidrilo de las proteínas enzimáticasy de la hemoglobina en estado reduci-do y para la conservación de su propiamorfología celular. Por otro lado, con-tiene una concentración de fosfatosorgánicos del orden de 50 a 100 vecessuperior a la existente en el plasma, lamayoría de los cuales son de naturale-za orgánica (azúcares-fosfatos yATP). Gracias a la producción de unfosfato orgánico característico, el 2,3-bifosfato, el eritrocito puede modular,en combinación con el pH y la presiónde CO2, el grado de eficiencia con queel oxígeno es cedido a los tejidos.

La glucolisis comienza con la in-corporación de monosacáridos a lacélula; la glucosa y la fructosa, trans-portadas al interior de la célula por unproceso de difusión facilitada, me-diante un transportador común, sontambién fosforiladas en el carbono 6por la hexoquinasa (Fig.3). La veloci-dad de transporte de la fructosa es mu-cho mayor que la de la glucosa, por loque aquella puede acumularse en elinterior del eritrocito. La presencia deglucosa a concentración fisiológica,inhibe la utilización in vivo de la fruc-tosa, tanto en el transporte como en lafosforilación. Ello demuestra que lafructosa no es un substrato fisiológicopara el eritrocito, y confirma que sólose emplea metabólicamente en ausen-cia de glucosa. La galactosa tambiénes transportada por difusión facilitada,y una vez fosforilada a galactosa-1-fosfato por la galactoquinasa, se intro-duce en la glucolisis mediante la inter-vención de la uridin bisfosfato glucosa(UDPG) y la acción de la galactosa 1-fosfato uridil transferasa, la UDPG-4-epimerasa y la fosfoglucomutasa. Laglucosa 6-fosfato que se forma se iso-meriza a fructosa-6-fosfato mediantela fosfohexosa isomerasa, con lo quese inicia la secuencia de reacciones

características de la glucolisis hasta laformación de lactato como productofinal (Brewer, 1980, 1984).

Las enzimas glucolíticas del eritro-cito se han aislado y en ellas se handeterminado sus propiedades cinéticasy reguladoras. Se conocen todos losvalores de la actividad enzimática eri-trocitaria en condiciones estardar deensayo y saturantes de sustratos, enlas que se consigue la máxima activi-dad; sin embargo estas condicionesraramente coinciden con la situación invivo, puesto que las concentracionesde los sustratos, el pH o la temperatu-ra empleados para su medida experi-mental no son los que existen en lacélula. Asímismo, in vitro tampoco setiene en cuenta el efecto activador oinhibidor de muchos metabolitos intra-celulares o la interacción mutua de lasinnumerables proteínas presentes.Aunque el significado de los valoresde la actividad encontrada bajo condi-ciones in vitro, tienen validez porhaber sido determinadas todas ellasbajo las condiciones de máxima acti-vidad, lo cierto es que no suponen unaextrapolación real de las actividadesenzimáticas presentes en la célula bajosituaciones fisiológicas normales. Deahí que exista en la actualidad, unatendencia a encontrar sistemas de me-didas de actividades en condicionesmás próximas a las fisiológicas (siste-mas in situ) por las enormes dificulta-des que existen para realizarlo in vivo.(Beutler, 1986).

I.1.3.2. La regulación de la gluco-lisis en los eritrocitos

El control de la glucolisis en eleritrocito se ejerce mediante la acciónde distintos metabolitos sobre las tresenzimas que catalizan reacciones irre-

versibles, y que cumplen con todas lascondiciones para considerarlas regula-doras: hexoquinasa, fosfofructo-quinasa y piruvato quinasa (Fig.4). Elefector más importante es el ATP que,al sobrepasar determinados niveles,inhibe la fosfofructoquinasa y la piru-vato quinasa. Ello conlleva una dismi-nución de la utilización de glucosa porla ruta glucolítica y un aumento de laconcentración de los sustratos corres-pondientes de ambas enzimas sobretodo de la fructosa-6-fosfato; lo cual esimportante a efectos de regulación,puesto que supone, al mismo tiempo,un aumento de la glucosa-6-fosfato,debido a la reversibilidad de la reac-ción catalizada por la glucosa-6-fosfato isomerasa. Al ser la glucosa 6-fosfato un inhibidor de la hexoquinasa,se refuerza la acción inhibidora de laglucolisis ejercida por el ATP sobre lafosfofructoquinasa. Cuando, comoconsecuencia de la alta concentraciónde ATP, disminuya la actividad fosfo-fructoquinasa, también descenderá laconcentración del producto de la reac-ción, la fructosa 1,6-bifosfato, con loque desaparece igualmente el efectoactivador de este compuesto sobre lafosfofructoquinasa y la piruvato quina-sa (McGilvery y Murray, 1974). Todoello contribuye al detenimiento o en-lentecimiento más o menos parcial, dela glucolisis. Ahora bien, el efecto in-hibidor global del ATP sobre la gluco-lisis puede contrarrestarse y, por tanto,el flujo metabólico restaurarse, gra-cias, fundamentalmente, a la accióndesinhibidora de determinados meta-bolitos frente a la inhibición de la fos-fofructoquinasa por ATP. De entre ta-les efectos alostéricos destaca el delAMP, que se origina en la hidrólisisdel propio ATP cuando su concentra-ción es alta, mediante la intervenciónde la ATPasa. El descenso de los ni-

veles de ATP hace que desaparezcanlos efectos inhibidores directos sobrela fosfofructoquinasa y la piruvatoquinasa y los indirectos sobre la hexo-quinasa reactivándose la degradaciónglucolítica de la glucosa (Beutler,1986a; Luque y col., 1991).

También deben tenerse en cuentalas posibles variaciones del pH quetienen lugar durante la oxigenación yla desoxigenación de la hemoglobina(HbO2 + H+ = HbH + O2). De nuevo, elprincipal punto de regulación por me-dio del pH se ejerce sobre la fosfo-fructoquinasa cuya actividad respondepositivamente al aumento del pH y ne-gativamente a la disminución del mis-mo. La liberación de oxígeno en lostejidos supone un aumento del pH in-tracelular, lo que equivale a un incre-mento de la actividad fosfofructoqui-nasa y, por tanto, de la glucolisis Porel contrario, como consecuencia delproceso de oxigenación de la hemo-globina en los pulmones, aumenta laconcentración de hidrogeniones y dis-minuye el flujo glucolítico (Yoshika-wa y Rapoport, 1974; Perutz, 1990).

I.1.3.3 El ciclo del 2,3-bifos-foglicerato

En la ruta glucolítica de los eritro-citos existe una desviación a nivel del1,3-bifosfoglicerato en la que, a partirde esta sustancia, por acción de la bi-fosfoglicerato mutasa, se produce 2,3-bifosfoglicerato. La enzima requiere3-fosfoglicerato como cofactor y esinhibida por el propio producto de lareacción, el 2,3-bifosfoglicerato (Fig.5). La degradación del 2,3-bifos-foglicerato mediante la enzima bifos-foglicerato fosfatasa, libera fosfato yconduce a la formación de 3-fosfo-glicerato que se incorpora de nuevo a

la secuencia glucolítica. La actividadde esta enzima es inhibida fuertementepor el producto de la reacción, el 3-fosfoglicerato (Perutz, 1990).

Es bien conocido el papel esencialque desempeña el 2,3-bifosfogliceratoen la regulación de la afinidad de lahemoglobina por el oxígeno en los te-jidos. El mecanismo de control se ba-sa en la capacidad que tiene el 2,3-bifosfoglicerato para unirse específi-camente a los resíduos básicos de lacavidad existente entre las dos cadenasβ de la desoxihemoglobina, pero no dela oxihemoglobina. La hemoglobina enestado oxigenado no tiene afinidad porel 2,3-bifosfoglicerato ya que, comoconsecuencia de la oxigenación, seproduce un estrechamiento en la ca-vidad central de la estructura proteica.En cierto modo este hecho supone unacompetencia entre el 2,3-bifos-foglicerato y el oxígeno molecular,en el sentido de que, en el primerotiende a prevalecer unido a la forma no

oxigenada, mientras que en el segundotiende a formar oxihemoglobina conla consiguiente liberación del 2,3-bifosfoglicerato.

El significado fisiológico del 2,3-bifosfoglicerato se encuentra en su pa-pel estabilizador de la estructura cua-ternaria de la desoxihemoglobina. Ensu ausencia, la afinidad de la hemo-globina por el oxígeno sería de tal en-tidad que prácticamente no permitiríala liberación del gas al pasar la sangrepor los capilares tisulares. La presen-cia del fosfato supone un descenso dela afinidad de la hemoglobina por eloxígeno y, por tanto, una mayor facili-dad para la liberación de éste en lostejidos (Perutz, 1990).

La regulación de los niveles de 2,3-bifosfoglicerato viene condicionadapor la concentración de ADP, cuyadisminución conlleva un aumento del1,3-bifosfoglicerato, puesto que así loexige el equilibrio de la reacción ca-

1 ,3-bisfosfoglicerato

2,3-bisfoglicerato

3 -fosfoglicerato

2 ADP

2 ATP

Pi2

Pi

1

2

4

Figura 5. El ciclo del 2,3-bisfosfoglicerato. Los números correspondena las enzimas siguientes: 1. Fosfoglicerato quinasa. 2. Bisfosfogliceratomutasa. 3. Bisfosfoglicerato fosfatasa. 4. ATP sintasa

4

3

talizada por la fosfoglicerato quinasa(Figs. 4 y 5). El aumento de 1,3-bifosfoglicerato favorece la síntesis de2,3-bifosfoglicerato, mientras que, porel contrario, el aumento de ADP harádisminuir los niveles de 1,3-bisfosfoglicerato y, por tanto, la sínte-sis de 2,3-bifosfoglicerato.

Cuando la síntesis de este fosfatose encuentra favorecida, también dis-minuye el nivel de 3-fosfoglicerato,con lo que desaparece el efecto inhibi-dor que este compuesto tiene sobre labifosfoglicerato fosfatasa, colaboran-do así a que el 2,3-bifosfoglicerato seadegradado para recuperar su nivel y,en definitiva, para que se restablezcael flujo metabólico normal de la ruta.

I.2. Las anemias hemolíticas

Las alteraciones que afectan a loseritrocitos pueden ser clasificadas endos grandes grupos, teniendo encuenta sus manifestaciones clínicasmás características (Tabla 1). Lasanemias, que vienen definidas por unareducción del número de eritrocitos, dela concentración de hemoglobina o delvalor del hematocrito, y las policite-mias, que vienen definidas por unaelevación en el número de eritrocitos(Hardisty y Weatheral, 1982).

Existen anemias por pérdida desangre, por disfunción de la médulaósea, y por deficiencia vitamínica deB12 o de ácido fólico. Las anemiashemolíticas se originan por diferentesalteraciones de los eritrocitos, muchasde las cuales son hereditarias. Lascélulas que presentan gran fragilidad,se rompen al pasar por los capilares,especialmente en el bazo. En ocasio-nes el número de eritrocitos formadoses normal, o incluso mayor de lo nor-mal, pero su vida es tan corta que se

produce una anemia grave (Gilsanz,1996a, 1996b).

Se han descrito diferentes clases deanemias, siendo las más frecuentes:

Anemia hemolítica esferocítica oesferocitosis hereditaria. En este tipode anemia los hematíes pierden suforma natural de disco bicóncavos ypasan a ser esféricos y de tamaño me-nor. En estas células existe una defi-ciencia en la síntesis de una de las doscadenas de la espectrina, la proteínade membrana que circunda y protegeal eritrocito como una malla (Selwyn yDacie, 1954). Los eritrocitos con estadeficiencia no pueden comprimirseporque la membrana carece de estruc-tura y al pasar a través de la pulpa es-plénica, o simplemente por una ligeracompresión, se rompen con facilidad(McGilvery, 1988; Lecomte et al.,1997).

Anemia de células falciforme o dre-panocitosis. Esta enfermedad es debi-da a que los eritrocitos contienen unahemoglobina denominada hemoglobi-na S, formada con cadenas ß anorma-les. Se denomina así porque, en pre-sencia de oxígeno, precipita en crista-les alargados dentro de los eritrocitosque le dan un aspecto de hoz. Lahemoglobina precipitada lesiona lamembrana celular produciendo célulasmuy frágiles.

Eritroblastosis fetal. Este tipo deanemia se origina cuando los hematíesRh-positivos del feto reaccionan conlos anticuerpos Rh-negativos de laprogenitoras. Estos anticuerpos debi-litan las células provocando una ruptu-ra rápida y haciendo que el recien na-cido sufra una anemia grave.

Enzimopatías eritrocitarias. Estaclase de anemia es debida a una defi-ciencia en algunas de las enzimas delmetabolismo intermediario del eritro-cito, generalmente las del metabolismode la glucosa. Es posible subdividirlasen grupos de acuerdo con la vía meta-bólica donde se localiza la deficiencia:glucolítica, fosfatos de pentosa, nu-cleotídico, etc. Todas ellas se caracte-rizan, en general, por la ausencia deesferocitosis, presión osmótica yhemoglobina normales. Los defectosenzimáticos pueden aparecer bajo

formas homocigóticas, heterocigóticas,acompañados de hemólisis celular ycuyo mecanismo desencadenante de-pende de la lesión molecular.

La sintomatología similar que pre-sentan estas alteraciones ha resultadoun escollo difícil de superar para co-nocer la causa de los diferentes tiposde anemia y, por ello, se han requeridonumerosas observaciones experimen-tales y clínicas. Así, en 1950 Crosby ycol. describieron estas enfermedadescomo anemias hemolíticas no esfero-cíticas de carácter heredidario. Tres

Tabla 1. Trastornos patológicos de los eritrocitos

Macrocíticas

Normocíticas

Hipocrómicas

Anemias

Absolutas

Relativas

Criteriosmorfológicos

Criteriosfisiopatológicos

Produccióndisminuidade eritrocitos

Destrucciónaumentadade eritrocitos

Precursoreshematopoyéticospluripotenciales

Precursoresunipotenciales(eritroideos)

Causasextrínsecas

Causasintrínsecas

MembranaMetabolismoHemoglobina

Policitemias

Absolutas

Relativas

Primarias

Secundarias

años más tarde Dacie y col. (1953) lasclasificaron en dos tipos, I y II, basa-dos en que a las de tipo II la adición deglucosa no corregía la mayor veloci-dad de autohemólisis; este hecho suge-ría una alteración en la ruta de Emb-den-Meyerhof. De Gruchy y col.,(1960) y Robinson y col., (1961) des-cribieron que los pacientes de tipo IIcon anemia hemolítica no esferocíticatenian altas concentraciones de 2,3-bisfosfoglicerato en los eritrocitos. Enese mismo año, Valentine y col.(1961) determinaron la actividad de lasenzimas glucolíticas en pacientes detipo II descubriendo que tenían unadeficiencia en piruvato quinasa.

Los eritrocitos en sus 120 días devida realizan 1,7 x 105 ciclos, para loque requieren un contínuo suministrode ATP y equivalentes redox que seutilizan en mantener la estructura bi-cóncava, las concentraciones catióni-cas intracelulares específicas, y el es-tado reducido, de los átomos de hierrode la hemoglobina, de los grupos sulf-hidrilo de las enzimas, del glutatión ylos componentes de la membrana.Naturalmente, si existe, una deficien-cia en alguna de las enzimas de lasrutas metabólicas, se limita principal-mente la producción de ATP yNADPH.

La mayoría de las necesidades me-tabólicas de los eritrocitos son cubier-tas por la glucólisis, la ruta de los fos-fatos de pentosa, el ciclo del glutatión,el metabolismo nucleotídico y la MetaHb reductasa. Han sido descritas defi-ciencias enzimáticas hereditarias entodas las rutas y las que causan ane-mias hemolíticas no esferocíticas apa-recen en la Tabla 2. Sus frecuenciasdifieren marcadamente con respecto ala enzima afectada y a la distribucióngeográfica. Hay más de 400 millones

de personas afectadas con deficienciasen glucosa 6-fosfato deshidrogenasaen nuestro planeta. La frecuencia degen más alta ha sido encontrada entrelas población del área mediterránea ydel sudeste asiático, los judíos kurdosy los negros africanos y americanos(Luzzatto y Mehta, 1995).

Sin embargo, en la Europa Centraly del Norte, la frecuencia en la defi-ciencia en glucosa 6-fosfato deshidro-genasa es comparable a la de piruvatoquinasa, la enzimopatías más frecuenteen este área (Beutler, 1990; De Medi-cis y col.,1992; Luzzatto y Mehta,1995). La relación entre el grado dedeficiencia enzimática y la extensiónde la disfunción metabólica en los eri-trocitos y otros tejidos depende de va-rios factores como son la importanciade la enzima afectada, su velocidad deexpresión, la estabilidad de la enzimamutada frente a la degradación pro-teolítica y las anormalidades funcio-nales, así como de la posibilidad decompensar la deficiencia por una so-breexpresión de alguna isoenzima co-rrespondiente o por la utilización deuna ruta metabólica alternativa.

En los casos más severos, las difi-cultades en estimar el grado cuantitati-vo de la lesión son debidas a que estaspoblaciones celulares contienen mu-chos reticulocitos que tienen activida-des enzimáticas y concentraciones deintermediarios superiores y diferentesa las de los eritrocitos.

I.3. Mutaciones, función pro-teica y fenotipo.

En 1956, Ingram propuso que el fe-notipo de la anemia falciforme (sicklecell anemia) podía ser debido a la sus-titución de un aminoácido (ácido glu-támico) por valina en la ß-

hemoglobina. Siguiendo con esta ex-traordinaria idea en genética humana,los estudios es-tructurales del mutanteproporcionaron explicación para en-tender la anemia y su alta frecuenciaobservada en las poblaciones de aque-llas regiones en que esta enfermedades endémica. Desde entonces los avan-ces en la tecnología molecular hanañadido nuevas dimensiones a la capa-cidad para analizar la disfunción pro-teica.

Mientras los desórdenes genéticosnos proporcionan la oportunidad deobservar los efectos fenotípicos de loscambios que aparecen en el DNA, losgenes mutados in vitro son de granvalor, especialmente cuando las muta-ciones se diseñan utilizando la estruc-tura proteica tridimensional. Avancesen la tecnología de la información yotras metodologías basadas en la com-putación, se han centrado en este áreano sólo por la provisión de datos paraestudios comparativos, sino tambiénpara diseñar y realizar prediccionesestructura-función.

Por conveniencia, las mutaciones seclasifican con respecto a sus efectossobre las proteínas, pero esta clasifica-ción es, inevitablemente, algo arbitra-ria. Las mutaciones asociadas con en-fermedades genéticas pueden debersea delecciones, inserciones que produ-cen la terminación prematura de la ca-dena, simplemente a un cambio delcodon que origina la sustitución de unaminoácido, a una pequeña duplica-ción intrínseca o a la inestabilidad delmRNA. También, aunque con menorfrecuencia, pueden encontrarse muta-ciones en los promotores o en el pro-ceso de corte y empalme del mRNA(splicing). Estas categorías no se pue-den diferenciar respecto a la funciónproteica, puesto que la producción deproteína anormal puede también estar

asociada a la pérdida completa de lafunción debida a la inestabilidad de laproteína que le impide alcanzar co-rrectamente su lugar de acción, o tam-bien a una mutación en una región crí-tica, como por ejemplo el centro activode una enzima. Sin embargo, en mu-chos casos aparecen situaciones com-plejas debidas a las interacciones deunas proteínas con otras y con com-puestos celulares tales como ligandos,sustratos y otras moléculas (Dacie,1985).

Las mutaciones puntuales, delec-ciones o inserciones pueden, como seha indicado anteriormente, conducir auna terminación prematura de la cade-na. En estos casos puede sintetizarseuna proteína incompleta aunque, amenudo, el mRNA o la proteínamuestren una estabilidad reducida. Laruptura o corte puede conducir a unaproteína anormal o a la inestabilidaddel transcripto. Niveles bajos demRNA pueden también proceder demutaciones en el promotor. Muchasmutaciones sin sentido, así como pe-queñas delecciones e inserciones, alte-ran el plegamiento y las afinidadesentre las subunidades. En muchas oca-siones el plegamiento de las proteínasen la célula está facilitado por la inter-acción con proteínas denominadaschape-roninas o carabinas , las cualestambién protegen a las cadenas na-cientes de las proteínas, de las posiblesinteracciones con otras moléculas delretículo endoplásmico. Las mutacio-nes que rompen las interacciones conlas chaperoninas, a menudo conducena la inestabilidad proteica y/o a la pér-dida de la actividad funcional. (Tho-mas y col., 1995). En particular, esteparece ser el caso para proteínas liso-somales, secretoras y de la membranaplasmática.

Un estudio interesante en el que seobserva cómo las mutaciones condu-cen a un plegamiento defectuoso conpérdida de la estabilidad, es el descritopor nuestro equipo sobre la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de eritrocitos.(Gómez-Gallego y col. 1996, 2000).La variante A- , que muestra deficien-cia enzimática, difiere de la variante Bo forma normal en dos aminoácidos.La doble sustitución aminoacídica setraduce en un plegamiento defectuosodebido a la pérdida de interacción en-tre las estructuras secundarias de lasregiones donde se localizan las muta-ciones. El centro activo de la enzimano se modifica pero los cambios que seoriginan entre los residuos aminoací-dicos en el dominio del coenzima y laalteración parcial de la estructura ter-ciaria son suficientes para producir unnotable descenso de la estabilidad dela proteina en el eritrocito.

En algunas ocasiones las mutacio-nes se localizan en sitios enlazablespara los sustratos, los efectores, losligandos u otras proteínas (Leblond ycol., 1978). En otras ocasiones losefectos principales no se correspondencon ninguno de los descritos anterior-mente sino con una acumulación exce-siva de la proteína anormal. En esascondiciones una actividad del 10-20%suele ser suficiente para permitir sufuncionamiento en circunstanciasnormales. Esto significa que los hete-rocigotos, con un alelo normal, se en-cuentran afectados en pocas ocasiones,ya que la forma de expresarse una en-fermedad es recesiva. Las mutacionesen las proteínas estructurales demues-tran fácilmente el carácter hereditariode una enfermedad; también cuando lasíntesis de la cadena proteica es menordel 50% de la normal se puede esperarque sea insuficiente para desarrollar

una función normal (Baronciani y col.,1996a, 1996b).

En proteínas fibrosas la alteraciónen la estructura secundaria puede con-ducir a una polimerización en fibrillasinsolubles con consecuencias graves.Por ejemplo, la estructura alterada deuna proteína origina placas amiloides ydepósitos de tejido lipídico eosinófilocaracterístico de la enfermedad deAlzheimer, el cual está compuesto deformas insolubles de proteínas nor-males como la gelsolina, transtiretina ylisozima (Booth y col., 1997).

Muchas proteínas sufren modifica-ción durante o después de la traduc-ción. Algunos cambios se miden en-zimáticamente, incluyendo la proteóli-sis, fosforilación y glicosilación. Lasmutaciones en los aminoácidos quedeterminan estas modificaciones pue-den conducir a un fallo en el procesonormal. Así, mutaciones que originanrestos glucosilados han sido descritosen el factor VIII de la sangre.

Las mutaciones de las enzimas en elproceso de síntesis son, generalmente,pleiotrópicas en sus efectos. Esta esuna condición bien conocida en la mu-colipidosis II o enfermedad celular eIen la que son deficientes numerosasenzimas lisosomales. La causa prima-ria de este desorden es la deficienciaen N-acetilglucosamina-1-fosfotrans-ferasa, la cual está implicada en la ge-neración de residuos fosfomanosilosde enzimas lisosomales (Kaufman yPipe, 1997).

I.3.1. Las alteraciones en las proteí-nas multiméricas

Las mutaciones en genes que codi-fican proteínas con una estructuramultimérica o aquellas implicadas en

un complejo multiproteico, frecuente-mente tienen otros efectos además dela simple pérdida de función. En algu-nos casos un fenotipo severo surge deun alelo mutado que codifica unaproteína en un heterocigoto individual.Este tipo de herencia que se refierecomo “dominante negativo” puedeimplicar, por ejemplo, un polipéptidomutante. Los portadores heterozigóti-cos de tales mutaciones están más omenos afectados dependiendo de laintensidad del efecto en la subunidadmutada.

Las mutaciones en heterocigotosque implican proteínas multiméricas, amenudo no muestran un fenotipo clíni-co. Por ejemplo, los heterocigotos de-ficientes en la actividad de galactosa-1-fosfato uridil transferasa (GALT) nomuestran síntomas de galactosemia,aunque existe un aumento de riesgo deproblemas oftalmológicos y ginecoló-gicos (Elsevier y Fridovich-Kiel,1996). Se ha encontrado una mutaciónpuntual que cambia Gln 188 por Argen el 60-70% de los casos. GALT fun-ciona como un dímero, compuesto desubunidades idénticas, cada una con sucentro activo y el polipéptido mutanteArg 188, inactivo, que se unen comohomodímeros y heterodímeros activoscon la subunidad Gln 188.

Las interacciones entre las subuni-dades son de una gran importancia pa-ra los factores de transcripción en elcontexto de la enfermedad humana,puesto que muchos funcionan comodímeros o tetrámeros y la flexibilidadtranscripcional puede conseguirse porformación de heterodímeros con otromiembro de la misma familia genética.Por lo tanto, una mutación en la es-tructura del dominio afectará las pro-piedades enlazantes y tendrá una re-percusión directa en el proceso de re-

presión-activación del DNA. Así, loscentros enlazantes de DNA en lospromotores de los genes objetivo pue-den estar bloqueados por factorestranscripcionalmente inactivos, y estopuede originar efectos negativos en elcomplejo dominante. Hay, a menudo,ejemplos ilustrativos que implican afamilias diferentes de factores detranscripción. Entre ellos está el domi-nio POU (Pit-Oct-Unc) en el que hansido identificadas las proteínas muta-das que inhiben el proceso transcrip-cional, formando homodímeros yheterodímeros inactivos (Treacy y col.,1991).

Las interacciones entre las subuni-dades, pueden explicar también cómolas formas dominantes y recesivas dela herencia surgen de mutacions dife-rentes en un gen simple. Por ejemplo,la hipermetionuria persistente, como lamayoría de las deficiencias enzimáti-cas, se hereda generalmente como ras-go autosómico recesivo y se debe amutaciones en el gen de la metioninaadenosil-transferasa (MAT1A). Sinembargo, la herencia dominante se vetambien en un número pequeño de fa-milias. El gen MAT1A se expresa enel hígado y codifica dos isozimas:MATI y MATII que son tetrámeros ydímeros, respectivamente, formados desubunidades idénticas. En familias quemuestran herencia recesiva, las muta-ciones, generalmente, conducen a unaterminación de la cadena de formaprematura con pérdida de función. Sinembargo, en familias que muestranherencia dominante una mutaciónG—A en un alelo, conduce a un cam-bio en la posición 264 de Arg a Hisprovocando pérdida de actividad en-zimática (29% de la normal). En 1997Chamberlin y col., mediante experi-mentos de co-transfección y mutagé-nesis in vitro, demostraron cómo la

mutación MAT1A se traduce en unfenotipo negativo dominante parcialobteniendo varios cDNA de MAT1Acon mutaciones en el resíduo aminoa-cidico 264 y los expresaron en Esche-richia coli. Estos contenían actividadenzimática MAT1A cuando reteníanuna carga positiva en la posición 264,pero perdían, casi totalmente, la acti-vidad y la capacidad para formar dí-meros. Los estudios cristalográficosrealizados sobre este gen revelaron queel residuo 264 está implicado en laformación de enlaces electrostáticosentre las subunidades.

A partir de las consideraciones an-teriores, se puede deducir que muchasproteínas funcionan como moléculasheteroméricas (espectrina, ß-hexosa-minidasa y hemoglobina) y proteínascomplejas, las cuales se forman porunión a partir de los productos de al-gunos genes que funcionan como unaunidad, y son particularmente vulnera-bles a las mutaciones contribuyendo acambios en las estructuras. A menudo,las mutaciones en genes diferentes quecodifican los polipéptidos componen-tes originan el mismo o similar fenoti-po clínico. Las mutaciones en los ge-nes SPTA o SPTB que codifican lassubunidades de espectrina, se traducenen una elipsocitosis hereditaria domi-nante autosomal. De la mayoría de lasmutaciones en el gen de HFE resultaun descenso en la capacidad de losheterodímeros para formar tetrámerosque se traduce desde una enfermedadfenotípica a una anemia hemolíticasevera.

I.4. Piruvato quinasa

La piruvato quinasa (ATP: piruvato2-o-fosfotransferasa; EC 2.7.1.40) esuna enzima que cataliza la transforma-ción de fosfoenolpiruvato y ADP enpiruvato y ATP:

La reacción es la segunda de la rutaglicolítica que genera ATP. Los ionesdivalentes manganeso o magnesio, y elpotasio son absolutamente necesariospara la actividad de la enzima. La en-zima, que es clave en la ruta centraldel metabolismo de los hidratos decarbono aparece en todas las célulasvivas, y en aquellas en que tiene lugarsimultáneamente reacciones de la rutaglucolítica y gluconeogénica, juega unpapel importante en la regulación deambos procesos inversos (García-Olalla y Garrido-Pertierra, 1987)

En la especie humana se han identi-ficado dos genes codificantes de la pi-ruvato quinasa, el PK-M y el PK-LR(Fig 6). En el proceso de transcripción,estos dos genes originan 4 isoenzimaso isozimas diferentes con actividadpiruvato quinasa, denominados M1,M2, L y R, las cuales se expresan deforma diferente en cada tejido u órga-no (Noguchi y col., 1987; Consler ycol.,1989). Todas las formas consistenen tetrámeros con subunidades de unos50-60 kDa, y muestran algunas pro-piedades moleculares y físico-químicas similares, pero difieren ensus propiedades cinéticas y regulado-ras.

La PK-M2 se encuentra presente ennumerosos tejidos durante la vida fe-tal, y es codificada por el locus 15q22.Al final del periodo fetal y en el post-natal temprano, aparecen otras isozi-mas, pero la forma M2 persiste en leu-cocitos, plaquetas, pulmón, riñones,bazo, tejido adiposo y, como un com-ponente menor, en hígado. La enzima

COOH

CO

CH 2

+ ADP

COOH

CO

CH 3

+ ATPK+

PK

∆G= -31,4 kJ/mol

Mn2+ ,

desaparece, normalmente, durante lamaduración de los eritroblastos (Miway Fujii, 1985, Miwa, 1990).

La isoenzima PK-M1 es un pro-ducto del mismo locus genético que laM2, pero el mRNA sufre un reagrupa-miento o ajuste diferencial. Esta formapredomina en el músculo estriado y enel tejido cerebral. La forma M1 es laúnica de las isoenzimas con actividadPK, que no está sujeta a modulaciónalostérica por el sustrato ni por el co-factor (Oberfelder y col.,1984)

La isoenzima PK-L es la forma deisozima que predomina en los hepato-citos y está codificada por el PK-LRgen en el locus 1q21 (Marie ycol.,1981; Cognet y col.,1987)). LaPK-L es un homotetramero en el quecada subunidad está constituida por543 aminoácidos. En células eritroi-deas inmaduras, las subunidades de laPK-L tienen un peso molecular supe-rior a las correspondientes de loshepatocitos y se las designan por L´.Las subunidades L´se pueden convertirin vitro en subunidades L en condicio-nes proteolíticas suaves, e in vivo porpro-teólisis provocada por la evolu-ción progresiva de las diferentes iso-zimas eritrocitarias cuando las célulasmaduran (Miwa, 1990).

La isozima PK-R se encuentra bajocontrol del mismo locus genético quela PK-L, pero es un producto del pro-ceso de traducción con un mRNA dife-rente al de la forma L, que está modi-ficado en el extremo 5´ y con promo-tores específicos. La isozima PK-R decélulas eritroideas inmaduras estácompuesta predominantemente porhomotetrámeros L´(L´4) y se designaPK-R1. Por proteolisis el PK-R1 seconvierte en heterotetrámeros (L´2 L2),y se designa PK-R2 que es la formamayoritaria en eritrocitos maduros la

cual, a su vez, se puede convertir invitro por proteólisis en la forma PK-L.Los homotetrámeros L y L´ tienen di-ferentes características bioquímicasque pueden ser funcionalmente signi-ficativas. La PK-R1 (L´4) de célulaseritroides inmaduras, muestran unabaja afinidad por el sustrato cuando secompara con la PK-R2 (L´2L2) y la PL-L, pero sus propiedades reguladorasson más efectivas (Miwa, 1990).

La PK-R es dependiente de K+ yMn2+ y exhibe propiedades alostéricasque reflejan su estructura polimérica.Esta forma es muy sensible a la mo-dulación alostérica por la fructosa 1,6-bifosfatasa y, cantidades micromole-culares de este intermediario, aumen-tan significativamente la afinidad de laenzima por el sustrato, PEP, convir-tiendo la cinética sigmoide en hiper-bólica. Las propiedades cinéticas deesta enzima, pueden explicarse fácil-mente según el modelo concertado deenzimas alostéricas de Monod y col.(1963). Así, la enzima, se puede en-contrar en un equilibrio transicionalentre dos conformaciones, R=T, rela-jada y tensada. La forma T no tieneafinidad por K+ y muy poca por elPEP y su cinética es sigmoide (coefi-ciente de Hill de 1,5-2,0), mientras laforma R tiene alta afinidad por K+ ypor PEP. A partir de los datos cinéti-cos, se ha llegado a la conclusión deque la unión K+ es esencial para laposterior unión del PEP. Los efectorespositivos fructosa 1,6-bifosfato, fruc-tosa 2,6-bifosfato y 6-fosfogluconatodisminuyen la cooperatividad de laPK-R hacia PEP, porque el equilibrioR = T se desplaza hacia el estado R.Los efectores negativos, ATP y alani-na, operan en sentido opuesto. Elequilibrio tetrámero-monómero estáregulado por la relación FBP/ATP lacual determina la relación asociación-

disociación. La unión del PEP tambiénparece estar influenciada por los resi-duos tiol e histidina; la fotooxidaciónde las 3 histidinas, así como la adiciónde glutation oxidado, disminuye la afi-nidad por PEP y la actividad catalítica,y aumenta la inestabilidad por el calorde la forma R de PK. (Ikeda y col.,1997).

I.4.1. Estructura tridimensionalde la piruvato quinasa

Aunque es posible determinar, conuna certeza casi completa, la secuenciade aminoácidos de una proteína a par-tir de la secuencia nucleotídica de ungen, no se puede conocer bien la rela-ción entre la secuencia de aminoácidosy la conformación tridimensional nati-va de una proteína. Se han obtenidolas secuencias aminoacídicas comple-tas de las isozimas de piruvato quinasade varias especies, desde mamíferos amicroorganismos. Así, por ejemplo, seconocen las de la especie humana, elgato, conejo, gallo, rata, ratón, sapo,mosca, levaduras, Lactobacilus y Es-cherichia coli. Las comparacionesevolutivas, de modulado y la acumula-ción de la estructura de bases de datosayudan a predecir patrones de plega-miento a partir de la secuencia prima-ria. Sin embargo, la predicción de lasestructuras terciaria y cuaternaria, sonmeras conjeturas hasta que la nuevaproteína no haya sido objeto de estu-dios cristalográficos (Branden y Too-ze, 1991). Este es un serio vacío ennuestro conocimiento, puesto que sólose ha determinado la estructuras cris-talina de un 6% de las 50.000 proteí-nas codificadas por genomas de mamí-feros,. Debido a las dificultades in-herentes a la metodología y a las ca-racterísticas de las enzimas, hasta lafecha, sólo se han podido obtener

cristalizadas y estudiadas mediantedifracción de rayos X, dos piruvatoquinasas: la de músculo de gato(Muirhead y col., 1986) y la de mús-culo de conejo (Larsen y col., 1994).Estos investigadores realizaron un es-tudio detallado de las estructuras mo-leculares, mediante mapas de densidadelectrónica obtenidos de las enzimascristalizadas con una resolución de 2,6y de 2,9 A, respectivamente. En amboscasos la secuencia de los aminoácidosse obtuvo utilizando cDNA. Las enzi-mas de las dos especies tienen el 94%de secuencia idéntica y, especialmentela región del centro activo, se encuen-tra muy conservada. Por ello, la in-mensa mayoría de los estudios que serealizan sobre las estructuras de laspiruvato quinasas, se hace tomandocomo modelo las homólogas de gato yde conejo. La información estructural,junto con la obtenida mediante muta-génesis, ha permitido acercarse al en-tendimiento de las relaciones estructu-ra⇔ función y, en muchos casos, a in-terpretar las posibles interaccionesentre la proteína y el resto de los com-ponentes celulares.

I.4.2. Lesiones moleculares en la de-ficiencia piruvato quinasa

La heterogeneidad bioquímica enla deficiencia en PK ha sido encontra-da en más de 400 casos descritos en labibliografía sobre el tema, habiendosido evaluada una pequeña proporciónsegún los criterios estándar del Inter-national Committee for Standardiza-tion in Haemotology (ICSH) (1979;Miwa y col.,1979). No obstante, la in-terpretación de estos criterios ha sidocomplicada por la aparición simultá-nea de isozimas en las células defi-cientes en PK, y en la mayoría de loscasos son compuestos heterocigotos de

dos alelos mutados, en vez de verda-deros homocigotos. También se puedepresentar una heterogeneidad adicio-nal, como una consecuencia de launión de subunidades normales de lascadenas mutadas (Miwa y Fujii, 1985).

Dada las complejas característicasestructurales y reguladoras de la PK,no es sorprendente que los productosdel gen mutado, exhiban una extensavariedad de propiedades bioquímicasque dependen del lugar preciso en elque se produce la lesión molecular ysus efectos sobre la conformación delas enzimas. Las alteraciones queafectan a las propiedades reguladorasasí como a la estabilidad y actividadespecífica, aparecen a menudo en estedesorden heterogéneo (Tanaka,1985a,1985b).

Entre las alteraciones más comunesse encuentran la inestabilidad de lasenzimas, la disminución de la afinidadpor el sustrato, PEP, y/o la modifica-ción de la respuesta al activador alos-térico, FBP. Otras anormalidades, quese encuentran con menor frecuencia,son el aumento de la sensibilidad a lainhibición por ATP, el descenso de laafinidad por el cofactor, el aumento dela afinidad por el sustrato o la dismi-nución de la síntesis de la enzima. Loscomportamientos anormales de lasproteínas pueden reflejarse, sencilla-mente, en una alteración en la migra-ción electroforética, en la variación delpunto isoeléctrico, del pH óptimo, delas velocidades de inactivación térmicay/o concentraciones óptimas de catio-nes. De forma general se puede indicarque la gravedad clínica de las defi-ciencias PK, se corresponde mejor conlas alteraciones en las propiedadesbioquímicas que con los descensos dela actividad enzimática medida encondiciones estándar de ensayo. (Va-

lentine y col., 1989; Tanaka, y Paglia,1975; Miwa, 1990; Lukens, 1993).

I.4.3. El metabolismo de eritrocitosdeficientes en piruvato quinasa

Las alteraciones en las funcionescelulares por una deficiencia en PKafecta únicamente a los eritrocitosporque éstos no son capaces de com-pensar el defecto enzimático aumen-tando la síntesis de la enzima mutadani utilizando otras rutas alternativas(Kanno y Miwa, 1992).

En 1961 Valentine y col. descubrie-ron la primera enzimopatía piruvatoquinasa en un paciente que sufríaanemia hemolítica no esferocítica.Desde entonces se han descrito nume-rosos casos, debidos principalmente aMarie y col., 1977; Zanella y col.,1989; ; De Medicis y col.,1992; Feng ycol., 1993; Baronciani y col., 1995,1996a, 1996b; Kanno y col., 1991,1993, 1995, 1997; Lenzner y col.,1997; Zanella y Bianchi, 2000, y por-tadores de esa deficiencia se han en-contrado en todos los continentes.

Los mecanismos precisos que con-ducen a la destrucción de los eritroci-tos con deficiencia en piruvato quina-sa no han sido clarificados todavía. Noobstante, la inmensa mayoría de losinvestigadores están de acuerdo sobreque en dichos mecanismos intervienenbásicamente dos hechos: el descensode la concentración de ATP y el au-mento de la de 2,3-bifosfoglicerato.

Se ha observado que el incorrectofuncionamiento de las reacciones de-pendientes de ATP originan una re-ducción de la concentración intracelu-lar de este compuesto lo que desenca-dena una serie de procesos que condu-cen a la hemolisis. Así, las células con

niveles bajos de ATP pierden grandescantidades de potasio y agua, se des-hidratan y se vuelven rígidas. Estosprocesos reducen significativamenteel flujo glucolítico especialmente enel sistema retículo endotelial, bazo,hígado y médula ósea favoreciendo ladestrucción prematura de los eritroci-tos (Miwa y Fujii, 1985).

Sin embargo está hipótesis no ex-plica la hemolisis que sufren los pa-cientes con deficiencia eritrocitaria enPK y con unos niveles de ATP nor-males o superiores en los eritrocitos.En estas circunstancias la explicaciónse centra en el aumento de la concen-tración del 2,3-bifosfoglicerato.

Este aumento se origina porque lareducción de la actividad PK causa,inicialmente, un aumento en la con-centración de su sustrato, PEP. Comoconsecuencia de este hecho, se produ-ce un aumento en las concentracionesintracelulares de todos los metabolitosde la ruta gucolítica por encima delbloqueo, particularmente del 2,3-bifosfoglicarato y 3-fosfoglicerato(Fig. 4). Las concentraciones de estecompuestos aumentan del orden dedos, tres y hasta cuatro veces por en-cima del valor normal, y esto es sufi-ciente para cambiar la curva de diso-ciación (presión de O2 frente a centrosocupados de hemoglobina por el O2)significativamente hacia la oxigena-ción de los tejidos.

Concentraciones elevadas de 2,3-bifosfoglicerato pueden también cau-sar efectos deletéreos inhibiendo en-zimas que limitan el flujo metabólicode la ruta glucolítica, como la hexo-quinasa y la fosfofructoquinasa y de laruta de las pentosas fosfato, concreta-mente, la glucosa 6-fosfato deshidro-genasa, la 6-fosfogluconato deshidro-genasa, la transaldolasa y la transce-

tolasa. También inhibe la actividad dela PP-ribosa-P sintetasa la primera en-zima de la ruta biosintética de AMP,NAD/ NADH y NADP/NADPH (Ta-naka, 1985).

Algunos efectos de estas accionesinhibidoras, como consecuencia de laelevada concentración de 2,3-bifosfoglicerato en los eritrocitos, de-ben ser similares a los que produce ladeficiencia en glucosa-6-fosfato des-hidrogenasa. En los eritrocitos la únicafuente de obtener NADPH es mediantelas dos reacciones catalizadas por lasdeshidrogenasas. El hecho fundamen-tal en la deficiencia en G6P deshidro-genasa es la reducción de la concen-tración de NADPH, lo mismo que pro-duce una deficiencia PK como conse-cuencia de la inhibición de la enzimapor el 2,3-bifosfoglicerato y de la re-ducción de la síntesis de NADP/NADPH . En este aspecto, Zerez yWeis (1986) demostraron, en personascon deficiencia eritrocitaria PK, quela primera enzima de la ruta biosintéti-ca de estos nucleótidos, la PP-ribosa-Psintetasa, es poco activa in vivo debi-do a la baja concentración de ATP yla alta de 2,3- bifosfoglicerato.

La disminución de la concentraciónde NADPH produce alteraciones tangraves en el funcionamiento y estruc-tura de los eritrocitos que terminan porprovocar su lisis. El NADPH sirve pa-ra reducir la forma disulfuro del gluta-tion a la forma sulfhidrilo, que a su vezactúa como un regulador de grupossulfhidrilo para mantener en estadoreducido los residuos de la hemoglobi-na y otras proteínas de los eritrocitos.También juega un papel esencial enlos mecanismos de desintoxicación, yaque reacciona con el peróxido dehidrógeno y los peróxidos orgánicos,evitando con ello a las células daños

irreparables. Además el glutation enforma reducida, es imprescindible paramantener la estructura normal del eri-trocito. Esta hipótesis se ve reforzadapor el hecho de que la anemia hemolí-tica se agrava en individuos deficien-tes en PK que sufren estados de infec-ción, de estrés metabólico u oxidativo(Beutler, 1978; 1986).

Durante la maduración de los reti-culocitos deficientes en PK, al mismotiempo que desciende la concentra-ción de ATP, aparece un descenso dela fosforilación oxidativa y un au-mento de la viscosidad interna (pérdi-da de agua y aumento de 2,3-bifosfoglicerato), disminuyendo la de-formabilidad y favoreciendo su libera-ción por los macrófagos del bazo. Porello, después de una esplenectomía elnúmero de reticulocitos es general-mente muy alto. El mecanismo por elcual los macrófagos detectan una defi-ciencia en PK en los eritrocitos per-manece desconocido (Beutler, 1986).

Se han utilizado modelos matemáti-cos para investigar los desajustes me-tabólicos de los eritrocitos en portado-res de tres deficiencias PK diferentessin ninguna influencia de los reticulo-citos (Holzhütter y col.,1985; Schustery Holzhüter, 1995). En estos estudios,los autores confirman también una re-lación próxima entre el desorden me-tabólico y el acortamiento de la vidade los eritrocitos. Recientemente, enun excelente trabajo Martinov y col.(2000) utilizando un modelo matemá-tico del eritrocito muy completo y queincluye todas las reacciones de la glu-colisis, el metabolismo de los nucleó-tidos de adenina, el balance iónico y laregulación osmótica del volumen eri-trocitario determinaron los valoresmínimos críticos de Na,K-ATPasa ylos de las actividades de todas las en-

zimas en que el eritrocito pierde suviabilidad. Estos autores demuestranque los valores de la actividad de lafosfofructoquinasa, la glucosa fosfatoisomerasa, la triosa fosfato isomerasao la fosfoglicerato quinasa en eritroci-tos de pacientes con anemia hemolíti-ca eran significativamente mas altosque los calculados como valores críti-cos. Sin embargo, los valores de la ac-tividad de la hexoquinasa y de la pi-ruvato quinasa son próximos a los va-lores críticos calculados, lo que es in-dicativo de un efecto grave que con-duce a la hemolisis de la célula.

La bajas concentraciones de ATPen los eritrocitos con deficiencia PKpueden, y de hecho tienen, otros efec-tos perjudiciales para la viabilidad dela célula. Así, la membrana celularlimita las reacciones que consumenenergía, como son es, las de la bombacatiónica y las de la fosforilación delas proteínas de membrana. Por otraparte, el bajo nivel de ATP puede fa-vorecer el flujo de K+ al exterior y laacumulación de Ca2+ en los eritrocitos.Se ha supuesto que el transporte decationes está relacionado con las pro-piedades funcionales del dominio N-terminal de la banda 3 (Passow, 1986).La ruptura de esta banda conduce a unacortamiento de la vida media del eri-trocito. Se ha demostrado que el Ca2+

activa la capaína, la cual degrada labanda 3 y que este proceso aumentanotablemente en una deficiencia PK.La ruptura de esta banda aparece en laregión transmembrana, y está asociadacon un cambio en la estructura tercia-ria, iniciando la unión a los anticuer-pos IgG y la liberación por macrófagos(Jacobasch y Rapoport, 1996).

I.4.4. Mutaciones en el gen piruvatoquinasa

El gen PK-LR se localiza en el bra-zo largo del cromosoma 1 y en la ban-da 21 (Fig.7). El cDNA de la PK-LRfue clonado y secuenciado en 1988(Neubauer y col., 1988). Su tamaño esde alrededor de 8600 pb y comprende12 exones y 11 intrones (Naguchi ycol.,1987; Tani y col.,1988a, 1988b).La cadena polipeptídica de PK-R deeritrocitos humanos tiene 574 aminoá-cidos de longitud y la de PK-L 543.Esta diferencia de longitud entre las

dos isoenzimas resulta de la diferen-cia en los transcriptos del primer exónde cada isozima, así el primer exón dela PK-R codifica 33 aminoácidos,mientras que el primero de la PK-Lcodifica únicamente dos. Hasta elmomento no se han encontrado muta-ciones en el DNA del exón 1(R) ni delexón 1 (L).

Los pacientes que sufren una en-zimopatía PK se caracterizan por te-ner un baja actividad catalítica juntocon la pérdida de sus propiedadesalostéricas y un aumento de la afinidadpor el PEP. En raras ocasiones se handescrito cambios en la afinidad por elADP. Las variantes genéticas de la PKpueden ser identificadas por su sensi-

bilidad a la degradación proteolítica ysu diferente movilidad electroforética.Unicamente un 10% de mutantes de-fectivos en PK son relativamente esta-bles, con una actividad normal o lige-ramente disminuida y manteniendo laspropiedades alostéricas.

La caracterización bioquímica es elprimer paso para identificar variantesgenéticas de la PK. El primer casoatribuido a un defecto PK fue descritoen 1961 (Valentine y col.). En Españala primera referencia a la deficienciaen PK de eritrocitos fue encontrada

en 1977 por Kahn y col. Estos autores,en ese mismo año, identificaron estadeficiencia en seis pacientes relacio-nados familiarmente (Vives-Corrons,1977). En la actualidad han sido des-critos en la bibliografía más de 400casos diferentes con deficiencia piru-vato quinasa (Kanno y col.,1994,1995; Mason, 1999; Zanella y col.,2001). Aunque puede parecer que ladistribución de las mutaciones a lo lar-go del cromosoma es regular, hay unatendencia de las mutaciones a acumu-larse, principalmente, en los exones 8,9, 10 y 11 (Mc Mullin, 1999; Martinovy col., 2000).

La multiplicidad clínica de los dife-rentes casos con deficiencia PK surge

1(R)

1(L)

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

R A B C D E F G H I J

3´5´

Figura 7. Esquema del gen LR de piruvato quinasa. Los fragmentos de color gris correspondena los intrones y los de rojo a los exones. La extensión nucleotíca de cada sección es la siguiente:1(R), 1-230; 2, 231-300; 3, 301-320; 4, 321-487; 5, 488-664; 6, 665-942; 7, 943-1105;8, 1106-1272; 9, 1273-1436; 10, 1437-1594; 11, 1595-1722.

E

del hecho de que los dos alelos de unpaciente estén afectados por mutacio-nes disfuncionales resultando molécu-las de enzima con dos subunidades di-ferentes cambiadas, esto es un dobleheterocigoto. De las 142 mutacionesdiferentes identificadas (Zanella y col.,2001) y distribuidas a lo largo de laregión codificante, 98 son sustitutivasde un solo aminoácido, 12 por despla-zamiento de marco de lectura, 12 en elcentro de maduración (splicing ), 9 sinsentido, 9 pequeñas delecciones e in-serciones y 1 que corresponde a unagran delección (182 bp) (Baronciani yBeuler, 1995; Zanella y Bianchi,2000),

La mayoría de las mutaciones sonesporádicas aunque existen evidenciasde que algunas mutaciones tienen rela-ción con la etnia y el territorio. En elhemisferio Este la mutación C1468Tes considerada la más común mientrasen el Oeste la incidencia más alta delas mutaciones encontradas correspon-de a la G1529A y a la 1456T. Esteúltimo predomina en América delNorte con una incidencia del 41,6% yen el Centro y Norte de Europa con41,0%.

La mutación 1456T es la más co-mún en el Sur de Europa, mientras laG1529A es muy rara. Esta mutación,a pesar de los amplios estudios reali-zados en el Japón, tampoco ha sidoencontrada en pacientes de ese país(Kanno y col., 1991; Miwa y Fujii,1996). Con el fin de conocer si la altafrecuencia de mutación en la posición1529 es debido a un área especial-mente sensible, se han realizadohaplotipos de los pacientes utilizandodos polimórficos: el C/A del nucleóti-do 1705 y el triplete repetido ATT delintrón J. (Kanno y col., 1992a, 1992b,1993a, 1993b; Lezner y col., 1994). En

todos los casos la mutación G1529Aexhibe el mismo haplotipo 1705C yun ATT repetido. Estos resultadosapoyan la hipótesis de un origen co-mún simple (Baroncini y Beutler,1993). La mutación 1529A resulta deuna sustitución del aminoácido Arg-Glu en la posición 510. La Arg 510está localizada en el dominio C de laenzima, la cual se considera impor-tante para el contacto de las subunida-des mediante enlaces electrostáticos.Es de destacar que 13 de las sustitu-ciones aminoacídicas corresponden aresiduos de arginina y 7 de ellas se en-cuentran en el dominio C.

Aunque en casi todos los casos laspropiedades cinéticas de las variedadesgenéticas de la PK se modifican, ensolo unos pocos los aminoácidos im-plicados se encuentran próximos alcentro activo. Esto es así en la inser-ción de la Ser en lugar de Cys 401 yen la sustitución Gly275-Arg. La sus-titución aminoacídica Ile344-Thr estárelacionada posicionalmente con losresiduos Lys 313 y Glu 315, los cualesse consideran de gran importancia enla unión del Mn2+ o Mg2+ (Lakomeck ycol.,1994).

Las referencias a deficientes en PKen que la enzima tiene un valor alto deKm por el PEP son escasas, aunque almenos han sido descritas 11 mutacio-nes diferentes en este grupo. Con laexcepción de tres homozigotos(Glu421-Lys; Arg426-Glu; Ala468-Val) todos los otros pacientes se hanidentificado como heterocigotos com-puestos. Es de destacar que alguna deestas mutaciones están localizadas enregiones de los dominios C y A queson los responsables de la unión a laFBP y al K+. Puesto que la unión deeste catión a PK es esencial para laposterior unión del PEP, la causa me-

diata de la disminución de la actividaden estos mutantes sería la unión de-fectuosa del catión a la enzima. Unarazón para explicar el valor alto de laKm de la enzima por el PEP sería elaumento de la constante alostérica.Este parece ser el caso en la mutaciónArg486-Trp. A partir de los estudioscinéticos y los modelos matemáticos(Jacobasch y Rapo-port, 1996) se de-duce que la constante alostérica estáaumentada dos órdenes de magnituden las moléculas enzimáticas de estasvariantes de PK respecto a las de losindividuos normales (Demina y col.,1998).

En otros estudios sobre la deficien-cia PK se ha observado que la muta-ción G1529A que causa el cambio deArg por Gln en la posición 510 estabapresente en 14 pacientes de 18 anali-zados y que procedían de Inglaterra yAlemania y solamente uno de Eslove-nia (Lenzner y col., 1997). Análisis dehaplotipos de estos pacientes sugierenun único origen de esta mutación en lapoblación del Norte de Europa. Lamutación G1529A, como se ha indica-do anteriormente, no ha sido encontra-da en pacientes japoneses pero estápresente en el 72% de los norteameri-canos de raza blanca (Baronciani yBeutler, 1995; Beutler y Gelbart,2000). Estos datos sugieren que es unamutación relativamente reciente (des-pués de la separación de la poblacióneuropea y asiática) o de una prolifera-ción diferencial del alelo mutado porderiva genética en diferentes gruposétnicos (Lenzner y col., 1997)

I.4.5. Expresión y regulación del gende la piruvato quinasa

La gran mayoría de los inves-tigadores están de acuerdo en que para

introducir un gen en células humanasin vivo con el fin de paliar una defi-ciencia hereditaria es esencial conocerla estructura del gen y su regulación.

El promotor del gen PK-LR de eri-trocitos humanos, que no se puedeconsiderar un verdadero promotorconstitutivo, fue identificado compa-rando secuencias de DNA genómicoclonado con cDNAs específicos y congenes de rata caracterizados previa-mente (Consler y col., 1989; Noguchiy col., 1987). La expresión transitoriadel marcador CAT en células eritro-leucémicas bajo el control de variospromotores truncados, demostraronque la secuencia de 270 bp adyacenteal extremo 5´de la secuencia codifi-cante era esencial para la actividad delpromotor. Esta secuencia contiene va-rias GATA y CAC que se han descritoque dirigen cooperativamente la trans-cripción específica en los eritrocitos.El efecto de estos elementos en el genhumano in vivo no se conoce todavíapero se han obtenido interesantes re-sultados en el gen homólogo de rata.Utilizando ratones transgénicos quecontienen el gen de rata se ha podidodetectar un inductor específico eneri-trocitos de 37 Kpb por delante en sen-tido 5´del lugar donde comienza latranscripción. El sitio ha sido mapeadocomo un centro hipersensible de nu-cleasa de hígado fetal y se encontróque el centro de 200 pb del inductormúltiple con elementos GATA yCACC se encontraba unido a proteí-nas. Estos datos apuntan a que el pro-motor PK-LR de eritrocitos se asemejaa un promotor específico de tejidos(Lacronique y col., 1995).

I.4.6. Terapia habitual y génicaen la deficiencia piruvato quinasa

Se puede afirmar que no existe untratamiento definitivo para el defectopiruvato quinasa. La terapia que másha sido utilizada en niños para paliarlos efectos de una deficiencia PK, sonlas transfusiones de sangre cuando losvalores de hemoglobina son bajos.Después de la niñez muchos pacientesse adaptan a un nivel compensado dehemólisis que no suele requerir trans-fusión, a menos que existan otrascomplicaciones como un estado infec-cioso, embarazo u otras condicionesadicionales (Valentine y col., 1985;Gilsanz y col., 1993).

En casos graves de adultos se suelepracticar la esplenectomía que en oca-siones permite mejorar el proceso,aunque no se puede predecir el gradode eficacia para un caso particular(Gilsanz, 1997a, 1997b). En niños y enadolescentes también se suele utilizarla esplenectomía. Esta terapia debeaplicarse con cautela ya que no es po-sible conocer con seguridad la res-puesta, y el enfermo, una vez esple-nectomizado, se encuentra ante unmayor riesgo de infecciones y de acci-dentes trombóticos. En las personasesplenectomizadas suele aumentar laconcentración de hemoglobina de 1 a 3g/dl, lo que hace innecesario las trans-fusiones y el paciente suele crecer ydesarrollarse normalmente (Tanaka yPaglia,1971).

Se han realizado varios estudios consustancias que modifican la actividadenzimática PK, administrándolos porvía oral o parental, como son: AMP,magnesio, manosa, galactosa, fructosa,adenina, inosina y guanosina. Tambiénse han utilizado otros factores estimu-lantes hematopoyéticos y esteroides.Los resultados obtenidos medianteestos procedimintos han resultado in-satisfactorios (Tanaka, 1985).

El argumento de que, mediantetransferencia del gen PK a células delsistema hematológico, se pueden paliarlos efectos provocados por esa defi-ciencia enzimática, es el mismo que elutilizado para el trasplante de médulaósea alogénico. Según los casos lossíntomas se evitan, se estabilizan o nose alteran, así que no se puede prede-cir el éxito que tendría la transferenciadel gen en las enzimopatías más seve-ras. Aubourg y col., (1990) y Hooger-brugge y col. (1995) señalaron que elposible mecanismo por el que el trans-plante de médula ósea podía aliviar lossíntomas en células hematopoyéticas,debería incluir la transferencia de laenzima desde células de la médulaósea normales a células deficientesbien por contacto célula-célula o porliberación de la enzima en el plasma.Recientemente se ha demostrado queel transplante de médula ósea es efi-caz, al menos, en niños. Tamphichitry col. (2000) consiguieron eliminar losefectos de una enzimopatía PK en unniño de cinco años utilizando dichoprocedimiento. El donante fue su her-mana con idéntico antígeno HLA yactividad piruvato quinasa normal.Tres años después de la operación elniño tiene un nivel normal de hemo-globina y de actividad PK con ausen-cia de hemolisis.

Respecto a la transferencia de genescon fines terapeúticos en humanos, esevidente que el procedimiento deberealizarse con un mínimo riesgo y congran probabilidad de éxito. Para ellotiene que ser convenientemente proba-do en modelos animales. En el caso dela deficiencia de PK han podido obte-nerse modelos animales mediantetransgenicidad. Utilizando recombi-nación homóloga con células de talloembrionario es posible producir rato-nes con una mutación puntual en el

lugar deseado y por tanto, en principio,los modelos de ratas con deficienciasenzimáticas resultarían fáciles de ob-tener sustituyendo los aminoácidosconservados que están alterados. Losmodelos de ratones son muy útilespara evaluar los efectos del gen altera-do y así ha sido demostrado experi-mentalmente en el PK-LR (Tani y col.,1994). Estos autores obtuvieron unalínea celular mediante transfecciónretroviral del cDNA de la PK-Lhumana. La línea celular fue utilizadapara transducir células NIH/3T3 deratón y líneas celulares leucémicas. ElmRNA de la PK humana fue detectadoen las células transducidas. Posterior-mente se intentaron transducir célulasde médula ósea de rata enriquecidascon células progenitoras a ratones le-talmente irradiados. El mRNA co-rrespondiente al gen recombinantehumano se detectó en la sangre perifé-rica de los ratones pero a niveles ex-tremadamente bajos (sólo detectablepor PCR). Este estudio aunque de-muestra la viabilidad del procedi-miento deja entrever que queda mu-cho trabajo por realizar antes deintentar una terapia molecular enla especie humana con suficiente ga-rantía de éxito. Las enzimopatías pue-den causar enfermedades severas ylos tratamientos actuales todavía sonlimitados. Ahora que la base molecularde la mayoría de las enfermedadesmoleculares se está clarificando, sepuede comenzar a abordar un con-junto de posibles tratamientos por téc-nicas de transferencia de genes (Hoo-gerbrugge y col., 1995).

Cuando solamente las células san-guíneas sufren la principal manifesta-ción de un defecto genético, como esel caso de la PK, hay fundadas espe-ranzas de que la transferencia de genesa células progenitoras hematopoyéticas

sea efectiva. Naturalmente, como entodas técnicas de transferencia de ge-nes, existe todavía un largo camino porrecorrer hasta desarrollar un procedi-miento seguro y una metodología efi-caz y sencilla que permita obtenerunos resultados satisfactorios.

La deficiencia en piruvato quinasa es laenzimopatología hereditaria mas frecuenteen la ruta glucolítica de los eritrocitos, quese origina como consecuencia de una mu-tación genética, y que causa una anemiahemolítica no esferocítica. En la especiehumana se han descrito dos clases de ge-nes piruvato quinasa, PK-LR y PK-M,que codifican, cada uno, dos tipos de iso-zimas diferentes. El PK-LR codifica laisozima L que se encuentra principalmenteen hígado, riñones e intestino delgado, y laR que es específica de los eritrocitos.El PK-M codifica la M1 que es la isozimamayoritaria en el músculo esquelético,corazón y cerebro y la M2 que se encuen-tra en los tejidos fetales y en la mayoría delos tejidos de los adultos. El gen PK-LR seencuentra formado por doce exones, sien-do el primero y el segundo los que trans-criben específicamente los mRNA del tipoR o L con el concurso de dos diferentespromotores específicos de tejido.

En los tejidos y células del organismohumano las mutación en los genes que co-difican las diferentes isozimas con activi-dad piruvato quinasa no se traduce en nin-gún síntoma patológico apreciable debidoa la ubicuidad de los tipos L, M1 y M2. Sinembargo, en los eritrocitos, una mutaciónen el gen P-KLR puede producir una iso-zima defectiva del tipo R, que al ser ex-clusiva de estas células curse en una ane-mia hemolítica. La catálisis imperfecta deesta enzima clave en la ruta glucolíticaorigina en los eritrocitos, simultáneamen-te, una elevada concentración de 2,3-bisfos-foglicerato y una disminución de laproducción de ATP, los cuales son ne-cesarios que permanezcan a niveles nor-males para regular el proceso de uniónhemoglobina-oxígeno y mantener la formay estructura de las células.

Los procedimientos para descubrir las

variantes deficientes en piruvato quinasahan sido normalizadas por el Internatio-nal Committee for Standardization inHaematology (ICSH). Sin embargo, la in-terpretación de los valores de las propie-dades bioquímicas de las enzimas muta-das, se puede ver enmascarada o confun-dida por la inestabilidad parcial de las en-zimas, por la alta frecuencia relativa de losheterozigotos que originan enzimas condiferentes propiedades o por el diferentemetabolismo energético que existe entrelos pacientes debido a la edad, a una en-fermedad añadida o a un tratamiento tera-peútico basado en medicamentos. Ade-más, los pacientes con anemia hemolítica,requieren con frecuencia transfusiones desangre que impiden la caracterización bio-química de los mutantes porque aportaneritrocitos y leucocitos que contienen elproducto del gen normal.

Actualmente estos problemas han po-dido ser superados utilizando métodos deanálisis molecular. Mediante la clonacióndel gen tipo LR del cDNA de piruvatoquinasa se puede estudiar directamente lasmutaciones en la enzima a nivel de DNA yobtener información acerca de los defec-tos moleculares.

La deficiencia piruvato quinasa se e n-cuentra muy extendida en el planeta,habiendo países y regiones en que ha sidobien investigada. Este hecho contrasta conlos pocos estudios realizados en nuestropaís. Sería interesante obtener informaciónacerca de la naturaleza y la frecuencia delas mutaciones existentes en una pobla-ción tan heterogénea genéticamente co-mo la española.

Por ello, nuestro objetivo principal hasido la identificación y caracterizaciónde mutantes en el gen PK-LR responsa-bles de fenotipos deficientes de piruvatoquinasa en eritrocitos humanos.

III.1 Reactivos

Para la preparación de disolucionestampón y otras disoluciones se utiliza-ron reactivos (grado analítico) de lascasas Sigma, Merck, Probus y Anale-ma. El agua que se usó en los mediosde cultivo, disoluciones y tamponesfue destilada y desionizada.

El xilencianol, el EDTA, el Trizmabase (TIRS) y el SDS se obtuvieron dela casa Sigma.

Las columnas de purificación deDNA, las enzimas de restricción y laTaq. DNA polimerasa de Biotools.

La Taq. Gold polimerasa y el Kit deaislamiento de plásmidos High PurePlasmid Isolation Kit de Perkin Elmer.

La proteinasa K de Gibco.La agarosa y el bromuro de etidio

de Boehringer Mannheim.Los Desoxinucleótidos (dNTPs) de

Finnzymes OY, Biotools y Ecogen.Los cebadores, los oligonucleótidos

y la Dynazyme de Perkin-Elmer,Cruachem y Pharmacia-Biotech.

Las columnas de Chroma SpinTM deClontech.

El Kit para la extracción de RNA deQiagen.

El ladder-100TM de Pharmacia-Biotech.

La T4 DNA ligasa y vector pGEM-T de Promega.

III.2 Material biológico

En el desarrollo del presente trabajose han utilizado muestras de sangreproporcionadas por el Servicio de He-matología del Hospital Doce de Oc-tubre de Madrid. Las muestras de san-

gre fueron obtenidas de pacientes yfamiliares en las condiciones adecua-das. Los análisis hematológicos y lasobservaciones clínicas de los pacientesfueron realizados por el Servicio deHematología citado anteriormente. Ladeficiencia en piruvato quinasa fuediagnosticada determinando la activi-dad de la enzima según las normasdel ICSH. Para este propósito se ex-trajeron unos 5 ml de sangre y semantuvieron en tubos de polipropilenoa 4ºC hasta su utilización.

III.3 Aparatos utilizados

Termocicladores automáticos : PCRsystem PERKIN ELMER 2400 y EP-PENDORF Mastercycler gradient.

Microfugas: Sorvall (DUPONT),Microspin12 y Biofuge HERAEUS.

Centrifugas: BECKMAN J2-21 yCENTRIKON T-42K.

Cabina : Microflow Laminer FlowCabinet.

Baño de agua: Pharmacia LKB.Multitemp II.

Desionizador-purificador de agua:ELGASTAT UHQPS.

Cámara fotográfica: KODAK. Di-gital science.

Transiluminador: PHARMACIA-BIOTECH. 2001 Macrovue.

Cubetas y fuentes de electroforesis:PHARMACIA-BIOTECH.

III.4 Procedimientos generales

Para todas las manipulaciones de lasangre, extracción de DNA y RNA se

utilizaron guantes y condiciones esté-riles en la campana de flujo laminar.

El material de vidrio y plástico depolipropileno se esterilizó a 121˚C y1,2 atmósferas de presión durante 20minutos. El plástico estéril de poliesti-reno y polivinilo se deshechó despuésde usado. La esterilización de agua yde los tampones, cuando fue necesario,se realizó en autoclave (20 minutos,121˚C, 1,2 atmósferas).

Medios de cultivo y otras disolucio-nes y compuestos que se descomponena temperatura superior a la normal seesterilizaron a través de membranasMillipore de 0,22 µm.

III.4.1. Extracción de DNA de célu-las nucleadas humanas.

Se han utilizado las siguientes di-soluciones tampón:

Tampón de lisis: Tris-HCl (pH8,2), 10 mM; NaCl, 0,4 mM yNa2EDTA, 2 mM

Tampón TE: Tris-HCl pH 7,5, 10mM y Na2EDTA, 0,2 mM

El método seguido ha sido, funda-mentalmente, el descrito por Miller ycol. (1988). Las células nucleadas(leucocitos) obtenidas después de cen-trifugar aproximadamente 5 ml desangre a 2.500 r.p.m. durante 5 minu-tos, fueron resuspendidas en 3 ml detampón de lisis en un tubo de centrí-fuga de polipropileno de 15 ml de ca-pacidad. El lisado celular fue digeridocon 0,2 ml de SDS al 10% y 0,5 ml deuna disolución de proteasa K (1 mg deproteasa K en 1% de SDS y 2 mM deNa2EDTA) a 37˚C durante toda la no-che.

Una vez que la digestión se com-pletó se añadió 1 ml de disolución sa-turada de NaCl (aproximadamente 6M) e inmediatamente el tubo se agitófuertemente durante 15 segundos y secentrifugó a 2.500 r.p.m. durante 15minutos. El sobrenadante, que contieneel DNA, fue transferido cuidadosa-mente a otro tubo de polipropileno, alque se agregó 2 ml de etanol absoluto,se tapó y se agitó invirtiendo el tubovarias veces hasta que se observó queel DNA había precipitado. El DNA,precipitado en formas filamentosas, serecogió cuidadosamente con una es-pátula o pipeta y se transfirió a un mi-crotubo de centrífuga que contenía 1,5ml de tampón TE. El DNA se incubódurante 2 horas a 37˚C, tiempo sufi-ciente para su disolución, antes de pro-ceder a su determinación cuantitativa.La calidad del DNA extraido se valorómediante electroforesis en geles deagarosa a l0,8% en TAE 1X.

III.4.2. Extracción de RNA total desangre entera

Para la obtención del RNA de lasangre se ha utilizado un kit propor-cionado por la marca QIAGEN y elprocedimiento seguido fue el descritoen su manual de instrucciones RNeasyBlood Mini Handbook . En un tubo decentrífuga de 25 ml de capacidad seagrega 7,5 ml de tampón de Erythro-cyte lysis (EL) y 1 ml de sangre. Lamezcla se introduce en hielo durante10-25 minutos procurando agitarlasuave y manualmente dos veces du-rante el tiempo de incubación. La lisisde los eritrocitos se puede observar

porque, en ese periódo de tiempo, lamezcla se vuelve transparente; si nofuera así la incubación en hielo se pue-de prolongar durante otros 20 minutos.

Posteriormente se centrifuga a400xg durante 10-15 minutos a 4˚C.El sobrenadante con los eritrocitos sedescarta y al precipitado, que contienelos leucocitos, se le agrega 2 ml detampón EL. Las células se resuspendencon ayuda de una pipeta y la suspen-sión se vuelve centrifugar a 400xg, 10minutos a 4˚C. Nuevamente se des-carta el sobrenadante teniendo la pre-caución de eliminar la mayor cantidadposible de él, pues interfiere con lascolumnas de RNeasy y reduce nota-blemente el rendimiento del proceso.Posteriormente, al precipitado, se leañaden 600 µl tampón de RNeasy Ly-sis (RTL) y la mezcla se agita me-diante pipeta o en un agitador tipoVortex, y se deposita directamente enuna columna de QIAshredder que tie-ne aplicado un tubo colector de 2 ml decapacidad. Se centrifuga en una mi-crofuga 2 minutos a 12.000 r.p.m. y serecoge el lisado homogenizado al quese le añade 350-600 µl de etanol al70%. El precipitado se resuspende uti-lizando una pipeta y la suspensión, cu-yo volumen no debe exceder de 700 µl,se aplica a la columna de RNeasy,centrifugando a 10.000 r.p.m. durante15 segundos. Posteriormente se aplicaa la columna de RNeasy 700 µl detampón RW1 y se centrifuga a 10.000r.p.m. durante 15 segundos, descartan-do el líquido eluido y el tubo colector.

Se aplica un tubo colector nuevo ala columna de RNneasy y se añaden ala columna 500 µl de tampón RPE,centrifugando a 10.000 r.p.m. durante

15 segundos. Se descarta el eluato y sevuelve a colocar el tubo colector. Seaplican 500 µl de tampón RPE a lacolumna de RNeasy y se centrifuga a12.000 r.p.m. durante 2 minutos parasecar la membrana de la columna. De-be tenerse cuidado de que la membranase mantenga lo más seca posible, yaque el etanol puede interferir en pro-cesos posteriores, y de que el extremoinferior de la columna no contacte conel liquido eluído. Se coloca en la co-lumna de RNeasy un nuevo tubo co-lector de 1,5 ml y se aplican directa-mente a la membrana de la misma 30-50 µl de agua libre de RNasa. Se cen-trifuga a 10.000 r.p.m. durante 1 mi-nuto y se recoge el líquido eluido. Elproceso se repite dos veces y los elua-tos se recogen en un tubo estéril.

III.4.3. Análisis electroforéticos

El procedimiento seguido ha sido eldescrito por Sambrook y col. (1989).

Las disoluciones y tampones utili-zados han sido:

Tampón TAE: Tris-acetato pH 9,1,40 mM y EDTA, 1 mM.

Tampón de muestra: Azul de bro-mofenol, 0,25%; Xilencianol, 0,25%,Glicerol, 30% en agua destilada.

Disolución de bromuro de etidio: Sedisuelve 1 g de bromuro de etidio enagua agitando durante varias horas. Ladisolución se debe guardar al amparode la luz y a temperatura ambiente.

Para la preparación de los geles deagarosa se disuelven 2 ml de TAE en98 ml de agua y se mezclan con unacantidad de agarosa que varía según el

tamaño de los fragmentos de DNA quese deseen visualizar (Tabla 3).

Tabla 3. Relación del porcentaje de agarosa yel margen de resolución

de los fragmentos de DNAAgarosa

(%) Resolución (kb)

0, 3 1, 7 --7, 0

0, 5 0, 7 – 4, 5

0, 8 0, 4 – 2, 0

1, 0 0, 3 – 1, 0

1, 2 0, 2 -- 8,0

1, 5 0, 2 – 6, 0

La mezcla se calienta a 60˚C, prefe-rentemente en un horno microondas,hasta que la agarosa se haya disuelto,y, después de esperar unos minutoshasta que la temperatura desciendaaproximadamente a 45˚C, se agregan 3µl de la disolución de bromuro de eti-dio, se agita y se vierte lentamente so-bre el molde con el peine incorporado.Una vez solidificado el gel, éste se in-troduce en la cámara de electroforesis,se agrega buffer de electroforesis hastacubrir el gel (aproximadamente 1 mm)y se colocan las muestras de DNA enlos pocillos de carga previamente di-luidas con 1-2 µl de tampón de mues-tra.

Posteriormente se cubre con la tapala cámara electroforética y se conectanlos electrodos de la fuente de alimenta-ción. Se aplica un voltaje de 3-5 V/cmy el proceso se da por finalizado cuan-do la mancha correspondiente al azulde bromofenol emigra del gel (aproxi-madamente 30 min).

Los geles se examinan a la luz ul-travioleta donde se visualizan losfragmentos de DNA y, si es necesario,se fotografian.

III.4.3.1 Marcadores de tamaños defragmentos de DNA

λ-Hind III. Es un marcador que seutiliza para visualizar fragmentos deDNA con tamaños superiores a 500 pb. Para ello se toman 20 µl del DNAdel fago λ, 1,5 µl de tampón de la en-zima de restricción, 2 µl de la enzimaHind III y se añade 23 µl de agua des-tilada.

La disolución se mantiene a 37˚Chasta la completa digestión, añadien-dose a continuación 300 µl de aguadestilada y 50 µl de tampón de carga.El preparado se puede almacenar a–20˚C hasta su utilización.

Ladder-100TM. Es un marcador quese utiliza para visualizar fragmentos deDNA de tamaños superiores a 100 pb.La preparación es una mezcla de frag-mentos de DNA cuyo tamaño se dife-rencia en 100 pb. La cantidad de frag-mento del tamaño de 800 pb es dobleque el del resto, para facilitar la identi-ficación de fragmentos de DNA de ta-maño igual o superior.

III.4.4 Reacción en cadena de la po-limerasa (PCR)

Las disoluciones y los tamponesque se utilizaron fueron:

Tampón de reacción PCR: Tris-HCl, pH 9,0, 75 mM; KCl, 50 mM;(NH4)2SO4 20 mM y BSA al 0,001%.

Disolución de nucleótidos: Contienelos 4 desoxinucleótidos fosfato (dATP,dTTP, dCTP y dGTP) a una concentra-ción de 10 mM.

Disolución de cloruro de magnesio:La concentración de MgCl2 es de 50mM.

Disoluciónes de cebadores (pri-mers): Cada disolución contiene uncebador a una concentración de 150mg/ml.

Los cebadores, utilizados para am-plificar los once exones, se diseñaronen zonas flanqueantes no codificantesy sus secuencias nucleotídicas son lassiguientes:

EXON 1Dir. 5’ TATTCCATGGTCCCGCAG 3’Inv. 5’ GGCTCCTAGTTTTCACCCTC 3’

EXON 2Dir.. 5’GCATGGGGAGGAAGGGCAGG 3’Inv. 5’ATAGGCCCTGTGTGGCTGCA 3’

EXON 3Dir. 5’GGTTGCCTCTCATGTTCTGGG 3’Inv. 5’GGAAGGTGGCCAGGACCTCG 3’

EXON 4Dir.. 5’CGAGGTCCTGGCCACCTTCC 3’Inv. 5’CGGCCGCCTTTCCGGCCCTG 3’

EXON 5Dir. 5’GCAGGGGCGGGTCCCGGACT 3’Inv. 5’TGCCCAGCGCACGGATGTGG 3’

EXON 6Dir. 5’ CAACTGTGCCCCGTCCTCA 3’Inv. 5’ GTGATGGGGAATAGCGACAG 3’

EXON 7Dir. 5’CACCTTTCTTCTCCTGCCTG 3’Inv..5’CAGGTGTCCCTAAAACCCAC 3’

EXON 8Dir. 5’GTAGCTTGGGCAGGGTCCCC 3’Inv..5’GGGCACTGGGGTATGGAAGG

EXON 9Dir. 5’CCTTCCATACCCCAGTGCCC 3’Inv.5’GCCCACCCCTGACCCAAAGC 3’

EXON 10Dir. 5’CTCGTTCACCACTTTCTTGC 3’Inv.5’ GGGGCTCCTGATACAAATGG 3’

EXON 11Dir. 5’TGTGAGCCACCACACCTGTC 3’Inv. 5’CGAAGGGGCTAGATGACAGT 3’

La mezcla de reacción contenía porcada tubo de ensayo especial para PCRde 0,2 ml de capacidad: tampón de re-acción PCR, 5 µl; disolución de NTPs,1 µl; enzima Taq polimerasa, 1 µl yagua, 41 µl ; los volúmenes de las di-soluciones de los cebadores y las con-centraciones de MgCl2 dependieronde las condiciones del programa y de laclase de enzima utilizada (Tabla 4). Entodas las series de ensayos se utilizó untubo en blanco que contenía todas lassustancias de la reacción salvo el ceba-dor y que fue sometido a los mismosprocesos que los de las muestras.

El programa de amplificación porPCR consistió en las siguientes pasos oetapas:

1ª. Temperatura: 94˚C. Tiempo: 5min con la Taq de Biotools y 10 mincon la Gold. Proceso: Inicio de la des-naturalización de la doble hélice deDNA.

Las etapas 2ª, 3ª y 4ª se repitierondurante 40 ciclos.

El proceso de PCR se controla so-metiendo a electroforesis sobre gelesde agarosa al 1,5%, 5µl de muestra decada uno de los tubos, utilizando comomarcador el Ladder-100.

2ª. Temperatura: 94˚C. Tiempo: 30seg. Proceso: Desnaturalización de ladoble hélice de DNA en el proceso cí-clico.

3ª. Temperatura: (variable, segúnTabla). Tiempo : 20 seg. Proceso:

Hibridación específica entre las cade-nas del cebador y las de DNA.

4ª. Temperatura: 72˚C. Tiempo: 20seg. Proceso: Elongación de las cade-nas sintetizadas de nuevo.

5ª Temperatura: 72˚C. Tiempo: 3min. Proceso: Elongación final

6ª. Temperatura: 4˚C. Tiempo: ∞Proceso : Mantenimiento.

Tabla 4. Condiciones particulares de amplifi-cación por PCR de los exones del gen PK-LR

ExónNº

Polimer.Taq

Temper.Hibrid.

[Mg 2+](mM)

1 Biotools 51˚C 1,0

2 Biotools 53˚C 1,0

3 Biotools 56˚C 1,5

4 Biotools 56˚C 1,5

5 Biotools 47˚C 1,5

6 Biotools 51˚C 1,5

7 BiotoolsGold

56˚C 1,0 1,25

8 Biotools 56˚C 1,5

9 Gold* 58˚C 1,0

10 Biotools 48˚C 1,5

11 Biotools 51˚C 1,5

• Con el cebador del exón nº9 la tempe-ratura y el periodo de extensión fueron72˚C y 10 segundos

III.4.5 Inserción y unión de los pro-ductos de PCR al vector pGEM -T

Para determinar las secuencias nu-cleotídicas de los genes, los productosde la reacción en cadena de la polime-rasa (PCR) fueron insertados en elplásmido vector pGEM -T. Este ele-mento tiene la ventaja de poseer dostiminas que permiten la unión con losextremos adenilados de los fragmentosde DNA procedentes del PCR en una

región que conlleva dianas para variosenzimas de restricción (Fig. 8) y elgen lac Z. El vector también contieneotra región que le confiere resistencia aampicilina.

Las disoluciones y tampones que seutilizaron fueron:

Tampón de unión T4 DNA ligasa:Tris-HCl (pH 7,8), 60 mM; MgCl2, 20mM; DTT, 20 mM y ATP, 1 mM.

Disolución de T4 DNA ligasa:Contiene 1 unidad Weiss de enzima/µlen disolución tampón de Tris-HCl 10mM (pH 7,4); KCl, 50 mM; DTT, 0,1mM; EDTA, 1 mM y glicerol al 5%.

Disolucion vector pGEM -TDisolución vector control pGEM -

TEl procedimiento seguido ha sido el

descrito en el Technical Bulletin, queacompaña al kit de PROMEGA y queconsta de los siguientes pasos:

1º. Centrifugar brevemente (un pul-so) en una microfuga los tubos del kitque contiene el vector pGEM -T(pGEM -T vector) y el vector con-trol pGEM -T (pGEM -T VectorControl) con el fin de que los conteni-dos se concentren en el fondo de lostubos.

2º. Preparar la mezcla de reacciónque contiene: Tampón de unión T4DNA ligasa, 2,5 µl; disolución vectorpGEM -T, 0,5 µl; disolución conte-niendo los productos de la reacción dePCR, 1,5 µl y disolución de T4 DNAligasa, 0,5 µl. La reacción control con-tiene todos los reactivos salvo los pro-ductos de la reacción de PCR que sonsustituidos por la disolución vectorcontrol pGEM -T, 1,5 µl.

3º. La reacción se incuba toda lanoche a 4°C

III.4.6 Transformación de células deEscherichia coli

El material utilizado en esta técnicaha sido:

Células de Escherichia coli JM109Estas células son High EfficiencyCompetent y su genotipo es recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdrR17, relA1, su-pE44, ∆(lac-proAB), [F¨, traD36,proAB, lacIqZ∆M15]

Disolución de IPTG: Disolver 1,2 gde IPTG en un volumen final de 50 mlde agua (0,10 M). La disolución seesteriliza por filtrado y se almacena a4°C.

Disolución X-Gal: Disolver 100 mgde 5-bromo-cloro-3-indolil-β-D-galac-tósido en 2 ml de N-N´dimetil-formamida.

Medio de cultivo LB: Añadir a 1litro de agua destilada, 10 g de Bac-to -triptona, 5 g de extractos de leva-dura Bacto y 5 g de NaCl. Ajustar elpH a 7,0 y esterilizar en autoclave

Medio de cultivo TYP: Añadir a 1litro de agua destilada, 16 g de Bac-to -triptona, 16 g de extractos de le-vadura Bacto , 5 NaCl y 2,5 g deK2HPO4 .

Placas de LB con ampicilina: Aña-dir 15 g de agar a 1 litro de medio LB.Esterilizar. Dejar que el medio se en-frie a unos 50°C, y adicionar ampicili-na a una concentración final de 100µg/ml. Agitar lentamente y verter enplacas de Petri unos 25 ml del medioen cada una. Dejar que el medio se so-lidifique. Las placas se pueden alma-cenar una semana a temperatura am-biente ó a 4°C durante un mes.

Placas de LB con ampicilina/IPTG/X-Gal: La preparación de estas

placas es similar a la de las placas conampicilina salvo que en éstas se añadeal medio IPTG y X-Gal, a una concen-tración final de 0,5 mM y 80 µg/ml,respectivamente. Otra forma alternati-va de preparar estas placas ha sido es-parciendo por la superficie de cadaplaca con ampicilina, 100 µl de la di-solución de IPTG y 20 µl de la disolu-ción de X-Gal.

El procedimiento seguido para latransformación ha sido el descrito en elTechnical Bulletin de Promega y queconsta de los siguientes pasos:

1º. Centrifugar la disolución quecontiene el vector DNA ligado-pGEM

-T. Tomar cantidades alícuotas de 2 µldel fondo del tubo y llevarlos a tubosesteriles de microfuga de 1,5 ml decapacidad, introduciéndolos en hielo.

2º Descongelar la suspensión decélulas de E.coli colocando el tubo enun baño de hielo (aproximadamente 5minutos). Tomar cuidadosamentemuestras de 50 µl de la suspensión yagregarlas a los tubos que contienen elvector.

3º. Agitar los tubos suavemente porinversión y colocarlos en el baño dehielo durante 20 minutos.

4º. Extraer los tubos y someterlos aun “choque térmico” en un baño deagua a 42°C exactamente y durante45-50 segundos. Inmediatamente in-troducir los tubos en hielo durante 2minutos.

5º. Añadir medio LB a los tubos se-gún la relación: 450 µl si el inserto delos productos de PCR es, aproximada-mente, de 1.500 pb y 1,4 ml si es,aproximadamente, de 500 pb. Mezclarpor inversión suavemente e incubar 1hora a 37°C.

6º. Posteriormente, esparcir 50 µl dela mezcla de transformación por la su-perficie de dos placas y otros 100 µlen otras dos y almacenar la mezclasobrante en el congelador a 4° C.

7º. Incubar las placas a 37°C du-rante 24 horas. Pasado este tiempo se-leccionar las colonias de color blancoque son las que con mucha probabili-dad contiene el inserto.

III.4.7 Aislamiento de los plásmidosconteniendo los insertos de DNA

El aislamiento de los plásmidosconteniendo los insertos fue realizadomediante dos métodos. Generalmente,en primer lugar se realizaba el métododescrito en el Manual Cloning (Sam-brook et al. 1989) que permite de for-ma rápida obtener plámidos y, poste-riormente, el descrito en el manual deBoehringuer Mannhein que permiteobtener los plámidos con mayor gradode pureza.

A) El método descrito por Sam-brook y col (1989) requiere los si-guientes tampones:

Disolución I: glucosa, 50 mM, Tris-HCl (pH 8,0), 25 mM y EDTA 10 mM.Preparar 100 ml y esterilizar en auto-clave a 121°C durante 15 minutos.

Disolución II: NaOH 0,2 mM ySDS al 1%. La disolución se preparamomentos antes de utilizarla.

Disolución III: 60 ml de acetatopotásico 5 M, 11,5 ml de ácido acéticoglacial y 28,5 ml de agua.

El procedimiento, que es una modi-ficación de los métodos de Birnboim yDoly (1979) y de Ish-Horowicz y Bur-

ke (1981), consta de los siguientes pa-sos:

a. En un frasco de 15 ml se agregan2 ml de cultivo LB y se inocula labacteria con el plásmido dejando cre-cer toda la noche a 37°C con agitación.

b. Tomar 1,5 ml del cultivo y lle-varlo a tubo de microfuga. Centrifugara máxima velocidad durante 30 segun-dos. Almacenar el resto del cultivo a4°C.

c. Extraer mediante aspiración elmedio dejando el precipitado lo másseco posible.

d. Resuspender el precipitado en100 µl de la disolución I mantenida enbaño de hielo y agitar fuertemente enun Vortex.

e. Agregar 200 µl de la disolución IIrecién preparada. Tapar el tubo y mez-clar los contenidos por inversión du-rante 5 segundos. Dejar estar el tubo enhielo.

f. Añadir 150 µl de la disolución IIIenfriada en baño de hielo. Tapar el tu-bo y agitarlo en posición invertida enel Vortex durante 10 segundos. Dejarel tubo en hielo durante 3-4 minutos.

g. Centrifugar a la máxima veloci-dad durante 5 minutos a 4°C en unamicrofuga. Extraer el sobrenadante poraspiración. Dejar el tubo con el preci-pitado en una posición invertida sobreun papel de filtro para favorecer un se-cado completo y eliminar las gotas delas paredes interiores del tubo.

h. Lavar el precipitado, que conti e-ne el DNA de doble hebra, con 1 ml deetanol. Centrifugar a velocidad máxi-ma durante 5 minutos. Descartar el so-brenadante y secar el tubo como sedescribe en el paso g. Dejar secar elprecipitado al aire durante 10 minutos

i. Redisolver el precipitado en 50 µlde TE (pH 8,0) conteniendo RNAasade páncreas libre de DNAasa a unaconcentración de 20 µl/ml. Agitar bre-vemente en el Vortex y guardar a –20°C.

B) El método descrito en el manual“ High Pure Plasmid Isolation” deBoehringer Mannheim, requiere lossiguientes tampones:

Tampón de suspensión: Tris-HCl(pH 8,0), 50 mM y EDTA, 10 mM.

Tampón de lisis: NaOH, 0,2 M ySDS al 1%.

Tampón de unión: Cloruro de gua-nidina, 4 M y acetato potásico (pH4,2), 0,5 M.

Tampón de lavado I: Cloruro deguanidina, 5 M y Tris-HCl, (pH 6,6)20 mM.

Tampón de lavado II: Cloruro sódi-co, 20 mM y Tris-HCl, 2 mM.

Tampón de elución: Tris-HCl (pH8,5), 10 mM y EDTA, 1 mM.

Los tres primeros pasos a, b y c , deeste método son idénticos al anterior;el procedimiento continua de la si-guiente manera:

d. Resuspender el precipitado en250 µl de tampón de suspensión.

e. Añadir 250 µl de tampón de lisis,mezclar suavemente y dejar estar 5minutos a temperatura ambiente.

f. Añadir 350 µl de tampón de uniónmantenido en hielo, mezcla suave-mente por inversión, 3-6 veces, y dejaren hielo durante 5 minutos. La disolu-ción se enturbia y flocula.

g. Centrifugar durante 10 minutos ala máxima velocidad en una microfu-ga.

h. Ajustar el tubo colector al tubocon el filtro High Pure, colocar el so-brenadante en el reservorio superior ycentrifugar en una microfuga a lamáxima velocidad durante 30-60 se-gundos.

i. Descartar el eluato. Añadir 500 µlde tampón de lavado II y centrifugar ala máxima velocidad durante 30-60segundos.

j. Descartar el eluato. Añadir 700 µlde tampón de lavado II y centrifugarnuevamente a la máxima velocidaddurante 30-60 segundos.

k. Descargar el eluato. Centrifugar ala máxima velocidad durante 30-60segundos para eliminar cualquier resi-duo del agua de lavado.

l. Quitar el tubo colector y colocaruno nuevo de 1,5 ml de capacidad.Añadir 100 µl de tampón de elución ó100 µl de agua y centrifugar a lamáxima velocidad durante unos 30 se-gundos.

III.4.8. Aislamiento y caracteriza-ción de los insertos plasmídicos.

Para aislar y caracterizar los frag-mentos de DNA insertados en losplásmidos, los vectores pGEM -T fue-ron digeridos con dos enzimas de res-tricción cuyas secuencias objetivo selocalizan en el sitio de multiclonación.Los productos de la digestión se some-tieron a electroforesis.

El Tampón utilizado y las disolu-ciones fueron:

Tampón de reacción: Tris-HCl (pH7,9), 50 mM; MgCl2,, 10 mM; NaCl,100 mM y DTT, 1 mM.

Disolución Pst I : Contiene 20U/µlde enzima Pst I en tampón H formadopor Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM; NaCl,200 mM; EDTA, 0,1 mM; DTT, 1mM; Triton-X, 0,15%; BSA, 200µg/ml y glicerol 50%.

Disolución Sph I: Contiene 750U/ml de enzima Sph I en tampón Kque está formado por Tris-HCl (pH7,5), 10 mM; KCl, 100 mM; EDTA,0,1 mM; BSA, 0,01 % y glicerol al50%.

Se prepara una premezcla que, para25 ensayos, contiene: Tampón de reac-ción, 25 µl; disolución de Pst I, 12,5µl; disolución de Sph I, 12,5 µl;RNAasa (10 mg/ml), 6,25 µl y agua68,7 µl. La mezcla de reacción contiene, en cada tubo de ensayo, 5 µl de lapremezcla y 5 µl del DNA plasmídicocon el inserto. La reacción se incuba a37°C durante toda la noche. A la ma-ñana siguiente se comprueban los en-sayos sometiendo cada producto de lareacción de digestión a electroforesissobre geles de agarosa al 1,5 %.

III.4.9 Secuenciación automática deDNA

El procedimiento de secuenciaciónde DNA fue realizado con un secuen-ciador automático (ALF-Pharmacia-Biotech ) y según el procedimientodescrito por Sanger y col. (1977). Eloligonucleótido cebador correspon-diente a la secuencia del polilinker delplásmido se marca en su extremo5´con una substancia fluorescente yalargado mediante la T7 DNA polime-rasa en cuatro reacciones indepen-dientes cada una en presencia de un

2´,3´didesoxinucleótido diferente(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP).Muestras de las reacciones son aplica-das a geles de poliacrilamida al 6%,con urea 7 M y sometidas a electrofo-resis. Después de este proceso, lasbandas de DNA se localizan porqueemiten fluorescencia al ser excitadaspor una emisión láser en sentido per-pendicular al plano del gel. La fluores-cencia es captada por fotodetectores,digitalizada y procesada en un ordena-dor.

III.4.10. Construcción de modelosmoleculares.

Los estudios sobre la estructura tri-dimensional de las enzimas normal ymutadas están basados en los trabajosrealizados por Allen y Muirhead(1998) con difracción de rayos Xsobre las enzimas homólogas crista-lizadas de musculo de conejo y degato. Las secuencias corregidas de loscDNA del gen PK-LR fue alineada conla secuencia derivada de las estructurasPKM utilizando el programa “Aligne-ment of Multiple Protein Sequences”(AMPS) (Barton, 1990).

Los programas utilizados en el es-tudio de la estructura, la localizaciónde las mutaciones y los efectos localesde las sustituciones fueron el RasMolv.2.6 y el Swiss Model (SwissPdbViewer v.3.1).

IV.1 Las mutaciones en piruvato qui-nasa y sus consecuencias fisiopatológi-cas

IV. 1. 1. Manifestaciones clínicas depacientes defectivos en piruvato qui-nasa.

En la Tabla 5 se muestran los datoshematológicos y las observaciones clíni-cas de 10 pacientes con anemia hemolí-tica de edades comprendidas entre los 7y 59 años, que fueron proporcionadospor el Servicio de Hematología delHospital 12 de Octubre (INSALUD,Madrid) Se puede observar en todos lospacientes un aumento del número de re-ticulocitos y una disminución (exceptoen el nº 4) de la concentración de hemo-globina respecto a los niveles normales.Por otra parte, en todos los casos en quese ha determinado, los valores del índicede distribución estándar del volumencorpuscular de los eritrocitos se encuen-tran dentro de los normales o son lige-ramente superiores. Una disminución dela masa de hemoglobina circulante es unÌndice claro de anemia. El aumento de lacifra de reticulocitos permite clasificar laanemia de carácter regenerativo de tipohemolítico, ya que este aumento es debi-do al aumento de la capacidad eritropo-yética como consecuencia del acorta-miento de la vida media de los eritroci-tos. El hecho de que los valores de IDHestén dentro o próximos a la normalidadindica una población eritroide homogé-nea con ausencia de anisocitósis. Elexamen conjunto de los datos anteriorespermite tipificar a los pacientes comoportadores de una anemia hemolítica noesferocítica. Además, como los valoresde la actividad piruvato quinasa de to-dos los pacientes eran sensiblemente in-feriores a los normales, permitió a los

clínicos, que nos proporcionaron lasmuestras, efectuar un diagnostico previode que la anemia era consecuencia de ladeficiencia en la enzima piruvato quina-sa.

Los datos de la Tabla 5 han sido ob-tenidos a partir de muestras de sangre depacientes al ingresar éstos en el centrohospitalario, previas a posibles transfu-siones. Los análisis están basados enlos métodos recomendados por el Co-mité Internacional para la Estandarliza-ción en Hematología (ICSH) para lacaracterización de pacientes con defi-ciencia en piruvato quinasa (Miwa ycol., 1979). La aplicación de estos méto-dos, basados en la determinación de pa-rámetros bioquímicos y manifestacionesclínicas, ha permitido identificar mas decuatrocientos casos con deficiencia endicha enzimopatía (Zanella y col., 2001).Sin embargo no existe una relación dire-cta entre los datos hematológicos y lasmanifestaciones clínicas observadas.Así, los pacientes que muestra menoractividad piruvato quinasa en sangre ( nº3, nº 4 y nº 9) no son los que presentanlos síntomas más graves de anemia, ytampoco el que mayor actividad tiene (nº8) los síntomas más leves. Estos datosestán de acuerdo con los obtenidos porotros investigadores (Wintrobe, 1983;Miwa y col.,1993) y que demuestran lapoca correlación que existe entre la gra-vedad de la anemia y el nivel de activi-dad de la enzima en las pruebas in vitro.Estas discrepancias se han intentado ex-plicar como consecuencia a las diferen-tes propiedades químico-físicas y catalí-ticas de las variantes deficientes en piru-vato quinasa. (Gilsanz, 1996a, 1996b),aunque muy posiblemente estén tambiénrelacionadas con el carácter recesivo dela enfermedad y la usual presentación delas mutaciones como dobles heterozigo-tos. El defecto piruvato quinasa es la

mas frecuente de las anemias hemolíticaspor deficiencia enzimática en los eritro-citos (Baronciani y col.,1996a,1996b). Eldefecto aparece en todo tipo de pobla-ciones y se suele acompañar de ictericiay esplenomegalia (Kanno, 1992; Baron-ciani y Beutler, 1993; Zanella y col.,1997; Lenzner y col., 1997 y Zarza y col,1998). España, en un amplio estudiorealizado en 1979 por García y colabo-radores sobre una muestra de 2.129 per-sonas, se encontró que la frecuencia conque aparece la deficiencia piruvato qui-nasa es del 0,24%.

Según se observa en la Tabla 5 elintervalo de manifestaciones de la ane-mia hemolítica es amplio e implicadesde anemias severas que requieren es-plecnoctomía y transfusiones de sangreocasionales hasta estados hemolíticoscompensados. Así, siete de los pacientesmuestran anemia crónica, siendo necesa-rio, en dos de ellos (nº 1 y nº 8) transfu-siones de sangre y esplenectomÌa. Enlos tres restantes la anemia es de carácterleve y se presenta en un estado hemolíti-co compensado. En este grado la anemiano suele exacerbarse a lo largo de la vidasi excluimos los episodios de hipoplásiaeritroide debidos a infecciones comoparvovirus B-19 y a mujeres en gesta-ción (Gilsanz, 1996a, 1996b).

En la Tabla 6 se muestran algunosdatos hematológicos de los familiaresmas cercanos de los pacientes estudiadosen la Tabla 5. Al ser la deficiencia de PKde carácter recesivo los valores de laconcentración de hemoglobina se en-cuentran dentro de los límites considera-dos normales lo cual es un Ìndice de laausencia de anemia. En la tabla se ponede manifiesto que es necesario presentarlos dos alelos mutados, ya que ningunode los pacientes cursa con dicha enfer-

medad a pesar de que los valores de laactividad enzimática se encuentren, enalgunos casos, claramente disminuidosrespecto a los normales.

Este hecho pone de manifiesto, en elcaso de las concentraciones de reticulo-citos de los padres del paciente nº 8, queaunque presentan valores ligeramente in-feriores a los normales, los del paciente(Tabla 5) se encuentra aumentados masde 200 veces con claros síntomas deanemia hemolítica que requiere inclusola aplicación de transfusiones periódicasde sangre.

Por lo que respecta a los valores de laactividad piruvato quinasa de la mayoríade los familiares de los pacientes se pue-de observar que son normales o ligera-mente inferiores a los normales. Si, co-mo veremos posteriormente, cada proge-

Tabla 6. Datos hematológicos de los familiaresrelacionados con pacientes de la tabla 5

Relaciónfamiliar

Hb(g/dL)

Reticuloc.(x 103/µL)

Act. PK(U.I./g Hb)

Padre 2 N.D. N.D. 8, 7

Madre 2 N.D. N.D. 6, 4

Padre 3-4 13, 5 N.D. 6,21

Madre 3-4 N.D. N.D. 5,9

Padre 5 14, 8 254 6, 6

Madre 5 15, 2 145 18, 6

Padre 6 N.D. N.D. 12, 8

Madre 6 N.D. N.D. 11, 5

Padre 7 15, 4 N.D. N.D

Madre 7 13,4 N.D. N.D.

Padre 8 16,7 6 N.D.

Madre 8 14,4 5 N.D.

Madre 9 14,1 93 3,57

Valoresnormales 12 -17 10 -20 12,0 -14,0

nitor es portador de un alelo mutado, esevidente que el producto del alelo nor-mal es suficiente para proporcionar unosniveles fenotípicamente normales.

IV.1.2. Caracterización molecular depacientes con deficiencia en piruvatoquinasa.

La identificación bioquímica de pa-cientes con deficiencia en piruvato qui-nasa mediante análisis enzimáticos se vedificultada por la frecuencia relativa-mente alta de personas doble heterozi-goticas y, por consiguiente, que portanenzimas híbridas con propiedades dife-rentes. Además, la baja actividad resi-dual de la enzima en los eritrocitos deestos pacientes obliga a que se practi-quen transfusiones y los eritrocitos yleucocitos de los donantes, que contie-nen el producto del normal piruvato qui-nasa, enmascaran y confunden la carac-terización bioquímica de la enzima defi-ciente. Por otra parte la aplicación de losmétodos clásicos de purificación de en-zimas tampoco proporcionan resultadossatisfactorios, ya que las variantes enzi-máticas suelen perder su actividad al sermás lábiles y, además, los procedimien-tos requieren grandes volúmenes de san-gre que deben ser obtenidos antes derealizar la primera transfusión o mesesdespués de la última, con las consi-guientes dificultades clínicas.

Estas particularidades sugieren estu-diar la enzimopatía piruvato quinasa anivel molecular puesto que es lógicopensar que los fenotipos deficientes ob-servados sean consecuencia de las muta-ciones detectadas en la molécula deDNA. Para ello, la utilización de la re-acción en cadena de la polimerasa puedefacilitar la tarea y proporcionar informa-

ción que lleve a relacionar los genesmutados con las manifestaciones clínicasobservadas. Esta información puedetambién ayudar a establecer criterios denaturaleza genética y, en algunos casos,elaborar pronósticos que marque pautasde terapia en el transcurso de la enfer-medad.

En la Tabla 7 se recogen las diferen-tes mutaciones encontradas en el genPK-LR de los pacientes estudiados condeficiencia piruvato quinasa. Los exonesdel gen fueron amplificados por PCR ysu secuencia nucleotídica determinadasegún se indica en la Sección de Mate-riales y Métodos. Todas las mutacionesencontradas son causadas por la sustitu-ción de un nucleótido. Doce de ellas sonsustitutivas y originan el cambio de unaminoácido por otro: cuatro de ellas co-rresponden a C1456T y el resto aA1150G, G1529A, C993A, G1174A,G1154A, C1492T, A694G y G821C. Las5 mutaciones restantes son sin sentido,esto es, ocasionan la síntesis incompletade la proteína, cuatro de ellas corres-ponden a G721T y la restante a C1675T.Tres de las mutaciones, G694A A1150G,y G1154A, no han sido descritas pre-viamente. Todos los pacientes son hete-rozigotos compuestos o dobles y solouno (nº 10) muestra las mutaciones enel mismo exón. La mutación G1529A(Arg → Glu), que es la descrita comomás frecuente en el Norte y Centro deEuropa (Baroncelli y Beutler, 1993;Lenzner y col., 1997), ha sido encontra-da solamente una vez en nuestro estudio.En tres de los pacientes (nº 2, nº 5 y nº 8)no se encontró un segundo alelo conmutación aunque presentan claros sín-tomas de anemia, lo que induce a pensarque la segunda mutación se debe encon-trar en las regiones reguladoras del genPK-LR. También es posible que la

muestra proporcionada contuviera sangrede transfusión lo que dificulta detectar lamutación.

En los pacientes en que se ha encon-trado mutaciones sustitutivas en los dosalelos se ha observado que los valores dela actividad piruvato quinasa encontra-dos en sangre son, en la mayoría, nota-blemente inferiores a los normales. Sinembargo, el cuadro anémico observadoabarca un amplio espectro desde unaanemia severa a un estado hemolíticocompensado. Este es un cuadro anémicosimilar al descrito por Lenzner y col.(1997) en estudios con pacientes defecti-vos en piruvato quinasa. Es lógico llegara la conclusión de que no existe relaciónentre los datos moleculares obtenidos yla severidad de la enfermedad; esto es,pacientes con la misma disfunción sonafectados de forma diferente. Sin embar-go, en este estudio como excepción aesta regla, hemos encontrado dos pa-cientes (nº 3 y nº 4) que tienen las mis-mas mutaciones sustitutivas y similargrado de anemia hemolítica. Claro queen este caso, los dos pacientes son her-manos y a la similitud de la expresión delos genes debe asociarse la semejanzadel resto de factores que intervienen enen la manifestaciones clínicas de la en-fermedad. Este hecho se ve corroboradoen los trabajos de Vives-Corrons y col.,(1980) que en su intento de encontraruna relación entre las anormalidadesmoleculares y las variantes defectivasen PK observan una concordancia en pa-cientes relacionados familiarmente.

IV.1.3. Naturaleza química de las sus-tituciones

La mutación A694G corresponde aun cambio en la posición 232 de la se-

cuencia aminoacídica, de glicina por se-rina, esto es, de un aminoácido con ungrupo polar sin carga y sin actividad óp-tica por otro de la misma naturaleza po-lar pero con estereoespecificidad; estehecho podría influir en la estructura ter-ciaria del monómero de la enzima (Tabla8).

La mutación C721T, que fue encon-trada por primera vez por Baronciani yBeutler (1993), origina una detenciónprematura de la cadena proteica en la po-sición 241 y, por consiguiente, una pro-teína truncada con la actividad enzimá-tica prácticamente nula.

La mutación G821C descrita ini-cialmente por Zanella y col. (1997) im-plica una sustitución, en la posición 275de Gly en Arg. Un cambio, de aminoáci-do no polar por otro polar positivo, queafecta, lógicamente, al balance de lascargas eléctricas de la proteína.

La mutación C993A, descubierta porBaronciani y col. (1995), se produce porsustitución de la tercera base del triplete,lo que provoca un cambio por un ami-noácido de naturaleza química similar alsustituido, Asp → Glu, siendo por ello laposible alteración que se origine en laestructura, debida únicamente a unefecto estérico.

La mutación A1150G origina uncambio, en la posición 384, de treoninapor alanina, dos aminoácidos de bajo pe-so molecular, teniendo el primero ungrupo polar sin carga y el segundo ungrupo alifático. A pH fisiológico el cam-bio no debería ocasionar trastornos signi-ficativos en la estructura de la enzima,aunque resulte obvio que debe produciruna disfunción apreciable al manifestar-se la anemia.

La mutación G1154A produce un-cambio en la posición 385, de argininapor lisina, dos aminoácidos de la mismanaturaleza química pero la lisina con untamaño ligeramente mayor que la argini-na y con la carga positiva desplazada 1,5Å aproximadamente, por lo que la posi-ble alteración en la estructura podía atri-buirse a un efecto estérico.

La mutación G1174A fue encontradaen 1994 por Lenzner y col. en pacientescon anemia hemolítica y deficiencia PKde Eslovenia. El triplete mutado codificaun cambio de alanina por treonina en laposición 392, dos aminoácidos con unapequeña diferencia de tamaño, pero unono polar alifático y otro polar sin carga.

La mutación C1456T fue descritapor primera vez por Baronciani y Beu-tler, (1993) y posteriormente por Pastorey col., 1995a, 1995b). Mas tarde se des-

cubrió que las variedades denominadas“Soresina”, “Milano” y “Parma” porta-ban la misma mutación (Bianchi y col.,1994, 1995). Esta mutación produce uncambio Arg → Trp en la posición 486 dela secuencia proteica (Tabla 8), que co-rresponde a la sustitución de un aminoá-cido polar con carga positiva por otro nopolar y voluminoso, del que resulta unligero incremento de la Km por el fos-foenolpiruvato, esto es, disminuye la afi-nidad de la enzima por uno de los sus-tratos (Bianchi y col., 1995).

En 1996 Pastore y col. describieronla mutación C1492T que corresponde aun cambio en la posición 498 de Arg→ Cys, dos aminoácidos de naturalezaquímica diferente por lo que puede espe-rarse una alteración en la estructuraproteica y por consiguiente en la activi-dad de la enzima.

Tabla 8. Localización de las mutaciones en la secuencia ami-noacídica de la piruvato quinasa

Mutación Sustitución aminoacídica Posición en la cadena

A694G Gly ⇒ Ser 232

G721T Gly ⇒ Stop 241

G821C Gly ⇒ Arg 275

C993A Asp ⇒ Glu 331

A1150G Thr ⇒ Ala 384

G1154A Arg ⇒ Lys 385

G1175A Ala ⇒ Thr 392

C1456T Arg ⇒ Trp 486

C1492T Arg ⇒ Cys 498

G1529A Arg ⇒ Glu 510

C1675T Arg ⇒ Stop 559

La mutación G1529A fue descritapor primera vez por Baronciani y Beutler(1993); en ella se produce el cambio deArg → Gln en la posición 510. SegúnLenzner y col. (1997) este intercambio,como consecuencia de la aparición deun nuevo grupo polar puede desestabili-zar la proteína , ya que como se ha com-probado in vitro, muestra una baja ter-moestabilidad y un aumento en la sus-ceptibilidad a la degradación proteolíti-ca.

La primera mutación en el nucleótido1675 fue descrita por Baronciani y y col.(1995) pero corresponde a un cambio deC en G encontrado en un paciente. Unamutación de la misma naturaleza que laencontrada por nosotros, (CGA →TGA), fue descubierta, también en pa-cientes españoles, por Zarza y col.(1998) y conduce, como en C721T, a lainterrupción de la síntesis de la cadenapolipeptídica en la posición 559, aunqueen este caso el efecto sobre la actividadpodría ser menor ya que la mutación seencuentra próxima al final de la secuen-cia codificante.

En la Figs. 9, 10 y 11 se muestranlas gráficas correspondientes a las se-cuencias nucleotídicas (en sentido di-recto e inverso) de los mutantes G694A,A1150G y G1154A, descritos en estetrabajo por primera vez; en ellas se indi-can los lugares en que aparecen los picosdobles en el cromatograma de la se-cuencia correspondiente a los cambiosde los nucleótidos de los codones GGT→ AGT, ACG → GCG y AGG →AAG. Estos cambios corresponden, co-mo se ha indicado anteriormente, a lassustituciones aminoacídicas de Ser →Gly, Thr → Ala y Arg → Lys, respecti-vamente, y de las que no cabría esperar,en principio, grandes cambios en las

propiedades químico-físicas de las pro-teínas codificadas por los genes de laspiruvato quinasa con estas alteraciones,aunque obviamente deben producir unadisfunción proteica que conduce a laaparición de sintomatología clínica.

V.1.4. Distribución de la frecuencia delas mutaciones en piruvato quinasa.

La distribución de la frecuencia delas 17 mutaciones correspondientes a los10 pacientes deficientes en piruvato qui-nasa que cursan con anemia hemolíticano esferocítica aparecen en el histogra-ma de la Fig.12. Se puede observar quelas mutaciones mas frecuentes son laC1456T y la G721T, mutaciones susti-tutivas que aparecen, independiente-mente, en más del 20% de los cromoso-mas mutados. La mutación C1456T apa-rece en todos los casos con una segundamutación en un estado heterozigotocompuesto.

Como se desprende de la Tabla 9, enque aparece la distribución de la fre-cuencia de mutaciones PK en diversospaíses, la mutación C1456T es la quetambién con mayor frecuencia se ha en-contrado en otros análisis similares reali-zados en España (Zarza y col., 1998),Italia (Zanella y col., 1997) y Che-quia/Eslovaquia (Lenzner y col., 1997) yes la segunda mutación mas frecuenteencontrada en pacientes de Inglaterra,Alemania y Estados Unidos (Lenzner ycol.,1997; Baronciani y Beutler, 1995 yBaronciani y col., 1995; Zanella y Bian-chi, 2000).

La mutación G721T aparece tambiencon una frecuencia mayor del 20%: 4 delos 17 alelos mutados; es una mutaciónsin sentido que conduce a un codon de

terminación de cadena. La G721T es lasegunda mutación mas frecuente encon-trada en pacientes de España y Francia(Zarza y col., 1998 y ouger y col., 1996)y la tercera mas frecuente en Italia yEstados Unidos (Zanella y col., 1996;Baronciani y Beutler, 1995; Baronciani ycol., 1995). Sin embargo, esta mutaciónno ha sido encontrada en pacientes pro-cedentes de Alemania, Inglaterra y Che-quia /Eslovaquia ni en Japón y China,donde la mutación que predomina es laC1468T (Kanno y col., 1994a, 1994b)que, por otra parte no ha sido descrita enlos países de Europa.

El resto de las mutaciones, 9 alelosde 17 (53%) son todas diferentes, lo queindica la gran variabilidad genética delas deficiencias piruvato quinasa. Tres deestas mutaciones, como anteriormente seha indicado, G694A, A1150G yG1154A, se describen por primera vez.En resumen, se puede deducir que lasmutaciones en el gen PK que conducen auna deficiencia piruvato quinasa est·n

muy distribuidas a lo largo del planeta.Quizás la única generalización que re-sulta de este hecho es que en Europa lamutación que predomina en el Norte esla G1529A mientras que en el Sur lamás frecuente es la C1456T (Baroncianiy col., 1995; Rouger y col., 1996; Lennery col., 1997; Zanella y col., 1997 y Zarzay col., 1998).

Las particularidades regionales yétnicas de la distribución de mutacionesde PK, que se pueden relacionar en laTabla 9, sugieren que la mayoría de es-tas no pueden ser muy antiguas, al me-nos, mucho mas recientes que la separa-ción de los grupos étnicos entre Europa yel Este asiático e incluso más recientesque las migraciones europeas que se ex-tendieron a principio de los años milhacia el Oriente, ya que existe una clarasegregación de mutaciones restringidasa áreas geográficas limitadas.

Figura 12. Distribución de las frecuencias de mutaciones piruvato quinasa en los pacientes estudiados

23,5 23,5

5,88

0

5

10

15

20

25

C1456T G721T Otros

Mutaciones

Po

rce

nta

je d

e m

uta

ció

n

C1456T

G721T

Otros

IV.1.5. Herencia genética de las defi-ciencias piruvato quinasa: Genealogí-as

Las genealogías de los pacientes nº1, 3, 4, 6, 7 y 9 portadores de mutacionesen el gen piruvato quinasa se muesran elas Fig. 13 y 14. Se puede fácilmenteconstatar el carácter hereditario de lasmutaciones que originan deficiencias pi-ruvato quinasa.

El paciente nº 1 es heterozigotocompuesto con dos mutaciones que selocalizan en la posición 1150 que heredadel padre y la 1529 que hereda de la ma-dre. Los pacientes nº 3 y nº 4 son herma-nos y ambos, heterozigotos compuestos,heredan la mutación 721 del padre y1456 de la madre.

En la Fig. 14 se muestra como el pa-ciente nº 6 es portador de dos mutacio-nes, la 1456 que hereda de la madre y la1675, que con toda probabilidad procededel padre, del que no se tienen datos porfallecimiento. Posteriormente, hemospodido detectar que el paciente trans

fiere uno de sus alelos mutados a su hijoy el otro a su hija, que les convierte enportadores. El paciente nº 7 hereda lamutación 1492 del padre y la 1154 de lamadre es, por lo tanto, también unheterozigoto compuesto. El paciente nº 9también es un heterozigoto compuesto,con un alelo mutado que procede de lamadre y otro que presumiblemente pro-cede del padre y del que no ha sido posi-ble obtener muestra.

IV.1.6. Localización de las mutacionesen los exones y en las regiones del genpiruvato quinasa

Como se ha indicado anteriormente,en la Tabla 7 se detalla la localizaciónde las mutaciones encontradas en el genPK de eritrocitos humanos. Se puede ob-servar que las diecisiete mutaciones ob-tenidas se encuentran entre los exonesnº 5 y nº 11. De ellas, seis se localizanen el exón nº 10 (35,5%) y cinco en elexón nº 6 (29,4%). Solamente se ha en-contrado una en el exón nº 5 , otra en elnº 7 y una tercera en el nº 11.

Tabla 9. Distribución geográfica de las mutaciones más frecuentes en el gen PK-LR

Mutaciones

PAISES C1456T G721T G1529A BibliografíaEspaña 32% 14% 0% Zarza y col., 1998

Italia 27% 4% 12% Zanella y col. 1997Francia 0% 4% 63% Rooger y col.,1996

Alemania 4,2 0% 66% Lenzner y col.,1997Inglaterra 9,0% 0% 50% Lenzner y col.,1997

Cheq./Eslov. 13,6% 0% 9,0% Lenzner y col.,1997Estados Unidos 9% 5% 50% Baronciani y col.,1995

Japón 0% 0% 0% Kanno y col., 1995China 0% 0% 0% Kanno y col.,1995

En el histograma de la Fig. 15 secompara la frecuencia de la localizaciónde las mutaciones en los exones asocia-das a una deficiencia en piruvato quinasadescritas en España (incluidas las de estetrabajo) con las encontradas en Europa,en América y en el Lejano Oriente.Hasta el momento actual el número totalde diferentes mutaciones asociadas a ladeficiencia piruvato quinasa se eleva a142. Del examen de la figura se puedecomprobar que las mutaciones se en-

cuentran desigualmente distribuidas a lolargo de la región codificante. Ningunamutación ha sido detectada en el exónnº 1 que es específico de la isoenzimaPK-R de eritrocito y que corresponde ala región reguladora del gen y solamentese ha encontrado una en el exón nº 2(Ueneka y col., 1995).

De forma general, se puede observaren la Fig. 15 que, las mutaciones au-mentan progresivamente desde los pri-meros exones, concentrándose el mayor

número de ellas en los exones 6, 7, 8 y10. En España los exones en donde seencuentra con mayor frecuencia muta-ciones son el nº 7 y el nº 10, los mismosque en las mutaciones descritas en Esta-dos Unidos y Extremo Oriente. En com-paración con los exones adyacentes con-trasta notablemente el bajo número demutaciones descritas en el exón nº 9 y enparticular con una escasa frecuencia enlos países europeos. Esta observación nopuede tener su base en la mayor proba-

bilidad por el tamaño de los exones, yaque el nº 9 (153 nucleótidos) es más dedos veces mayor que el nº 8 (66 nucleó-tidos).

En la Figura 16 se muestran el ali-neamiento de las secuencias aminoacídi-cas de las regiones en que parecen lasmutaciones de piruvato quinasa de eri-trocitos humanos comparadas con las deeritrocitos, ratón, rata y perro, las demúsculo de gato, conejo, gallo y sapo ylas de mosca y gusano; también apare-

Figura 15. Distribución de la frecuencia de las mutaciones en los exones del gen PK

0

5

10

15

20

25

30

35

40

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Exón nº

Po

rce

nta

je

de

la

s

mu

tac

ion

es

España

Europa

EE.UU

Ext.Oriente

cen las de levadura (Saccharomices ce-revisiae) y de Escherichia coli. Esta úl-tima es la mas alejada de la especiehumana de las que se conoce su estructu-ra primaria. En E.coli han sido caracteri-zados bioquímica y genéticamente dosisoenzimas (I y II) con actividad piru-vato quinasa (Garrido-Pertierra y Coo-per, 1977, 1983). La isoenzima I es sen-sible a la activación por fructosa 1,6-bisfosfato y tiene unas propiedades ciné-ticas y reguladoras semejantes a las delos eritrocitos humanos.

En la Figura 16 se puede observarque el cambio Gly232 → Ser, que co-rresponde a la mutación G694A, se en-cuentra en una posición conservada envertebrados salvo en el perro (Whitney ycol., 1994), pero flanqueada por secuen-cias de aminoácidos muy variables. Estaobservación y el hecho de que la sustitu-ción producida sea a serina, que es elaminoácido que aparece en la secuenciasde PK de gusano, hace pensar que lamutación debe alterar de una forma sutilla funcionalidad de la enzima.

La mutación G821C origina la sus-titución de un aminoácido por otro conun tamaño y propiedades químicas muydiferentes (Gly275 → Arg) y, además,en una posición muy conservada en to-das las especies incluidas los procariotas.Es previsible por tanto que el cambioafecte, de forma esencial, a la estructuratridimensional de la enzima, y por ende asu funcionalidad.

La mutación G821C produce lasustitución de Asp33 → Arg. Esto es, dedos aminoácidos con cargas opuestas yen una posición y región muy conserva-das en todas las especies. Además, elcambio está muy próximo a la secuenciaMVARGDL donde se encuentra el

Asp339 uno de los ligandos a los que seune el Mn2+ (Larsen y col., 1994), y porel que, como se sabe, la enzima tiene unrequerimiento absoluto. Es lógico pensarque tal sustitución produzca una gravedisfunción de la enzima.

Las mutaciones A1150G, G1154A yG1175A originan los cambios sustituti-vos de Thr384 → Ala, Arg385 → Lys yAla392 → Thr, respectivamente, en po-siciones y en una región extraordinaria-mente conservados. Esta región se en-cuentra entre los amino·cidos Thr371,Gln372 y Glu406 los cuales participanen el proceso catalitico activamente .Así, en el transcurso del mismo, los dossustratos de la enzima, PEP y ADP, seunen al K+, el cual a su vez se enlaza a laGln372 y al Glu406. (Muirhead ycol.,1986). Por su parte el Thr371 juntocon la Lys313 posicionan y orientan elPEP en el centro activo (Larsen y col.,1994). Por ello, es indudable que la sus-titución aminoacídica en cualquiera delas tres posiciones conlleve graves con-secuencias en el proceso catalítico.

Las mutaciones C1456T, C1492T yG1529A que originan los cambiosArg486 → Trp, Arg498 → Trp yArg510 → Gln, respectivamente, se en-cuentran en una región relativamente pe-queña de la secuencia aminoacídica de laenzima. Van Solinge y col. (1997) sugie-ren que la arginina en la posición 486forma enlaces de hidrógeno con otros re-siduos aminoacídicos próximos en laestructura terciaria y que su sustituciónocasionaría graves alteraciones en lamisma. Sin embargo, como se puede ob-servar en la Figura 16, la posición no seencuentra bien conservada y en la de ra-ta, cuya homología con la de humana esmás del 97%, se encuentra sustituida porla glutamina y no es lógico pensar que

las conformaciones de esas dos enzimassean muy diferentes. Lo mismo se po-dría argumentar en la sustitución de laarginina en la posición 498, pero ademásen este caso como veremos más adelan-te, el aminoácido se encuentra alejadodel centro activo y de otros aminoácidoscon los que potencialmente pudiera for-mar enlaces de hidrógeno, por lo que noparece que este cambio pudiera alterarsignificativamente la estructura tercia-ria de la enzima.

La sustitución de glutamina por argi-nina en la posición 510 ha sido bien es-tudiada por Van Solinge y col. (1997).Según estos investigadores la sustitu-ción conduce a la formación de un nue-vo enlace de hidrógeno que no apareceen la enzima normal. Este hecho juntocon el de que la arginina se encuentramuy bien conservada en todas las espe-cies induce a pensar que el cambio pro-duce una importante alteración en laconformación de la piruvato quinasa.

IV.2. Las relaciones estructura/función de las enzimas defectivas enpiruvato quinasa

IV.2.1. Los cambios aminoacídicos ysus efectos en la actividad piruvatoquinasa

Una primera aproximación a la rela-ción entre estructura y función deberíaobtenerse del cambio en las propieda-des químicas de los aminoácidos que sesustituyen en la secuencia aminoacÌdicade la proteína. Podría esperarse que, loscambios de aminoácidos con propieda-des químico-físicas mas diferentes po-drían alterar en mayor medida la con-formación de la enzima disminuyendo

notablemente su actividad y provocandouna mayor alteración fisiopatológica quecursaría con una manifestación mas se-vera de anemia hemolítica. Naturalmen-te, a dichos cambios hay que agregar losque conducen a una terminación prema-tura de la cadena polipeptídica.

De las diecisiete mutaciones encon-tradas cinco corresponden a señales determinación de la cadena, tres a cam-bios conservativos (aminoácidos conpropiedades químico-físicas similares) yonce a cambios no conservativos (Tabla8). Como se ha indicado anteriormente,de los primeros y de los últimos son delos se puede esperar una mayor altera-ción en la estructura proteica. Los prime-ros porque una prematura terminaciónde cadena originan proteínas incomple-tas con una evidente disfunción enzimá-tica si el fragmento sintetizado no tieneun tamaño adecuado, y de las sustitucio-nes no conservativas porque cuandointervienen aminoácidos, en los que ladiferencia en sus propiedades físico-químicas es grande, sus efectos se pue-den traducir en mayores disminucionesde la actividad y, por consiguiente, en untipo de anemia hemolítica mas grave. Si-guiendo con esta pauta es lógico pensarque el cambio de un aminoácido polarcargado por otro también cargado perocon carga neta contraria originaría unaalteración notable en la estructura de laenzima que se correspondería con unmayor descenso de la actividad y conuna manifestación de tipo mas grave deanemia. Sin embargo, este razonamientono siempre parece cumplirse y, así, elcambio no conservativo Arg → Glu enun alelo del paciente nº1 no origina undescenso tan esperado de la actividadenzimática aunque se manifieste unaanemia crónica severa, acompañada deictericia y esplenomegalia. Por otra par-

te, el cambio conservativo Asp → Gluque conlleva la piruvato quinasa del pa-ciente nº 2 y, debido a que la naturalezaquímica de los dos aminoácidos es se-mejante, se podía esperar una actividadenzimática similar a la de la normal y,como mucho, un estado hemolítico com-pensado. Sin embargo, la actividad en-zimática es más de seis veces menor quela de la enzima normal y la deficienciacursa con anemia hemolítica crónica.

Por tanto, como han indicado otrosinvestigadores (Lenzner y col. 1994;Demina y col., 1998 ) no existe o, almenos, no se ha encontrado una relacióndirecta entre las propiedades químico-fÌsicas de los aminoácidos intercambia-dos, las actividades enzimáticas de lapiruvato quinasa en sangre y las mani-festaciones clínicas observadas. Y estoes particularmente difícil de encontrar enpacientes heterozigotos compuestos, yaque se debe tener en cuenta las propie-dades de los productos de ambos genes.Lo que hasta ahora parece evidente esque los casos mas severos de anemia co-rrelacionan con una pérdida significativade la actividad enzimática y con un pro-ceso de degradación complejo debido ala rápida eliminación de los péptidos in-estables como consecuencia de la modi-ficación de la estructura de la enzima.Lenzner y col., (1997 ) señalan que laactividad piruvato quinasa en los eritro-citos depende, al menos, de dos factores:un factor constante, que es en esencia lamutación que origina una enzima conactividad reducida y/o estabilidad altera-da, y un factor variable, que se basa en laactividad proteolítica intracelular. Sinembargo, no debe dejarse de lado otrosfactores que se encuentran en el entornointra y extracelular y que aunque su in-fluencia sea bastante menor son capacesde marcar diferencias en las manifesta-

ciones clínicas incluso entre parientespróximos, como pueden ser padres ehijos o hermanos. Tambien debe tenerseen cuenta la asociación de subunidadescon diferente mutación lo que hace másdificilmente previsible el efecto de lamutación en los dos alelos.

Podría resumirse que la situación dedeficiencia piruvato quinasa es parecidaa la que tiene lugar en pacientes conotras enzimopatías hereditarias que semanifiestan en los eritrocitos (Luzzatto yMehta, 1995; Bautista y Luzzatto, 1997).Y es que además del genotipo, los facto-res bioquímicos y fisiológicos del entor-no celular juegan un papel clave en elgrado de severidad de la enfermedad.Este hecho se pone de manifiesto en pa-cientes, con idéntico genotipo deficientepiruvato quinasa que suelen poseer unasmanifestaciones clínicas parecidas de laenfermedad. Los pacientes nº 3 y nº 4son hermanos y, como se demuestra eneste trabajo, sus características genéti-cas respecto a la deficiencia piruvatoquinasa son idénticas, la actividad de lasenzimas son iguales y el grado de seve-ridad de las anemias hemolíticas simila-res.

IV.2.2. Efectos de las mutaciones so-bre la estructura de la piruvato qui-nasa: Modelos moleculares

El conocimiento de la posición de lasmutaciones piruvato quinasa en la se-cuencia aminoacídica junto con el cono-cimiento de un modelo tridimensional ylos efectos que producen en la confor-mación de la enzima puede ayudarnos aentender la pérdida de actividad de laenzima y predecir o, al menos, aproxi-marnos al entendimiento de alguno delos procesos moleculares que ocasionan

las alteraciones clínicas en las deficien-cias enzimáticas. Un hecho a tener encuenta es que todos los pacientes estu-diados son heterozigotos compuestos pa-ra dos diferentes mutaciones en PK-LR yello, como mencionamos anteriormente,complica considerablemente la interpre-tación de los efectos debidos a mutacio-nes específicas.

La piruvato quinasa de eritrocitosestá constituida como se ha indicadopreviamente, por un homotetrámero de574 aminoácidos. La subunidad tienenforma eliptica con el eje longitudinal de75 Å y el transversal de 45 Å (Fig. 17) ycontiene un centro activo en donde seunen los dos substratos, PEP y ADP ydos sitios para la unión de los dos catio-nes esenciales para la actividad, Mg2+ oMn2+ y K+. Además, como la enzima seencuentra alostéricamente regulada tie-ne al menos un centro en el que se unenlos efectores positivos, como la fructosa-1,6-bisfosfato, y otro al que se une losefectores negativos como el ATP.

El progreso en el conocimiento de laestructura de la enzima PK ha sido posi-ble gracias a los análisis de difracción derayos X de las piruvato quinasas cristali-zadas de músculo de gato (Muirhead ycol.,1986) y de conejo (Larsen y col.,1994) y que han sido resueltas con reso-luciones de 2,6 y 2,9 Å, respectivamente.Se ha podido comprobar que la PK-M1de músculo de conejo y de gato muestranuna homología muy significativa con laPK-R de eritrocitos humanos, con unaidentidad de la secuencia de alrededordel 70% y con 44 residuos extra en laregión N-terminal de la isozima R.

El estudio de la estructuras tridimen-sionales de la piruvato quinasa de mús-culo de conejo y de gato ha permitido

conocer los sitios de unión de los subs-tratos, de los cationes esenciales y de losefectores y el mecanismo del procesoenzimático. También ha servido parapredecir las modificaciones que sufrela estructura molecular de las enzimasdebido a los cambios que originan lasustitución de un aminoácido por otrocomo consecuencia de una mutación. Sinembargo, debido a las diferencias en lasestructuras primarias entre la PK de co-nejo y de gato y de estas con la de eri-trocitos humanos, las predicciones debenrealizarse con la debida cautela y tenien-do en cuenta esta circunstancia.

Siguiendo con este criterio es lógicopensar que las sustituciones de los resi-duos aminoacídicos que se localicenpróximos a los sitios de unión de lossustratos, o de unión de los cationes,tengan graves efectos ya que los cambioseléctricos y/o conformacionales que seoriginan en esas áreas directamente im-plicadas en la catálisis, llevan asociadosacusados descensos de la actividad en-zimática que se traducen, muy posible-mente, en alteraciones hematológicas yclínicas graves.

Desafortunadamente no existe unmodelo tridimensional de la piruvatoquinasa humana en base a su estructuracristalina y, por ello, se modelizan sobrelas estructuras de las enzimas de mús-culo de conejo y de gato (Fig.18). En ca-da subunidad de la PK se diferenciancuatro dominios formados por cadenasunidas por segmentos polipeptÌdicosflexibles con una función o funcionesdeterminadas. Estos dominios se deno-minan: N (o N-terminal), A, B y C (o C-terminal) (Muirhead y col., 1981).

El dominio N-terminal, comprendidoentre los residuos 42 y 85, implica el

área de contacto entre las subunidades enla molécula tetramérica. El dominio A,de mayor tamaño y formado por dossegmentos de estructura primaria (86-159 y 263-431), tiene forma de cilindro,el clásico barril de conformación α −β,con 8 helices α y 8 láminas β dispuestasen sentido antiparalelo. El dominio Bcomprende desde el aminoácido 160 al262, con un lazo característico que seextiende desde el extremo a la terceralámina β del dominio A y consiste prin-cipalmente en laminas β antiparalelasque forman la parte de la molécula masalejada del centro del tetrámero con unaestructura poco densa y de aparienciaflexible, al cual no se ha podido adscri-bir una función clara. Finalmente, eldominio C-terminal, comprende desde elresiduo 432 al 574 y forma una estructu-ra retorcida y abierta de tipoαβ que juega un importante papel en elproceso de tetramerización (Wouter ycol. 1997)

Los dominios A y C se interconectanentre si formando una región o zonacompacta que se considera el núcleo dela enzima y donde se encuentra, aunquemás próximo de A que de C, el centroactivo. Según Muirhead y col. (1986) yLarsen y col. (1994) el PEP se enlaza alfinal de la 8ª lámina β del dominio A y auna distancia de 2,2 Å se une el catiónbivalente. Walker y col. (1992) propo-nen la existencia de dos cavidades degran importancia en el área de la interac-ción de los dominios A y C, la cavidad86 (Arg 86) para al unión de ADP y lacavidad 510 (Arg 510) para la unión deun segundo activador alostérico. Estascavidades están divididas por la cuartahélice del dominio C (C α 4), la cual seenlaza, por puentes salinos y enlaces dehidrógeno, y a través de los residuos deAla 399, Arg 510 y Arg 488, a los de

Leu 401, Asp 400 y Asn 113, del do-minio A. Este hecho origina una con-formación especial en la interfase de losdominios A y C.

A los sitios de unión anteriormenteindicados deben añadirse por su impor-tancia en el proceso catalítico los resi-duos aminoácidicos que forman el centroactivo y se une el fosfoenolpiruvato (Arg163, Ser 286, Phe 287, Lys 313, Gly338, Thr 371) y las que intervienen en lacatálisis ácido-base y en la unión al K+

(Asn 156, Lys 313) y al Mn2+ (Glu 315,Asp 339). (Walker y col., 1992; Larsen ycol., 1994; Van Solinge y col., 1997)

De las nueve mutaciones sustitutivasdiferentes descritas en este trabajo (Ta-bla 10), una se localiza en el dominio B(694) cinco en el dominio A (821, 993,1150,1154 y 1175), y tres en el dominioC (1456, 1492 y 1529) (Fig. 17 ).

La mutación A694G origina el cam-bio Gly232 → Ser el cual se localiza enel dominio B en una región molecular-mente poco densa y a la que hasta ahorano se adscrito una función específica enla catálisis por lo que no es de esperarque el cambio aminoacídico altere deforma importante la actividad enzimáti-ca. Sin embargo, el nivel de la actividadenzimática de la piruvato quinasa ensangre del paciente nº 9, que es el porta-dor de la mutación, está disminuido cer-ca de la décima parte del valor normal.Este hecho conduce a pensar que la po-sición 232, que como se puede observaren Fig. 18 se encuentra bien conservadaen una región de gran variabilidad enanimales vertebrados, debe jugar un pa-pel importante en la estructura de laproteína, bien a nivel de catálisis o deestabilidad. Podía pensarse que esta re-gión contiene alguna estructura o sitio

donde se fije algún regulador o que par-ticipe en los estados de transición de laenzima. Sin embargo el lugar donde selocaliza el sitio de unión del activadormás efectivo, la fructosa 1,6-bisfosfato,se encuentra en el dominio C (Jurica ycol. 1998 ) y, se ha demostrado, que eldominio B es el mas alejado del area decontacto entre las subunidades (Muir-head y col. 1981, 1986). Por todo ello,aunque todavía no se le ha asignadoninguna función determinada al dominioB su considerable pérdida de actividadpor esta sustitución puede estar relacio-nada con un impedimento estérico delresiduo de la Ser232 con el de Phe 235que podría alterar notablemente la es-tructura terciaria de la PK (Fig. 19, A yB)

La mutación G821C origina la sus-titución en la posición 275 de un residuoaminoacídico de pequeño tamaño comoes Gly por otro de tamaño considerable-mente mayor como la Arg. Podía espe-rarse por tanto una alteración en la es-tructura de la hélice α (concretamente laAα3) simplemente por efecto estérico.Pero a este hecho debe añadirse laproximidad del residuo Asp 277 que de-be originar una atracción electrostáticamuy fuerte con el de Arg (Fig 19, C y D)lo cual limitaría la movilidad de la cade-na lateral de este aminoácido impidién-dole ocupar una posición estable y, porconsiguiente, rompiendo la conforma-ción de la proteína en esa región. Porotra parte, la posición 275 se encuentrarelativamente próxima a la de los resi-duos Ser 286 y Phe 287 que intervienendirectamente en la estructura del centroactivo. Por ello es fácilmente predecibleque la actividad de la PK se encuentredisminuida como así se puede observaren los análisis enzimáticos realizados enla sangre del paciente 10 que es el porta-

dor de la mutación G821C.

La mutacion C993A ocasiona elcambio Asp → Glu en la posición 331de la estructura primaria de la PK. En laenzima normal el residuo de Asp se en-cuentra unido mediante dos enlaces dehidrógeno con el de Ile 310 y con unpuente salino con la Lys 365 , debido ala proximidad del grupo amino de la ca-dena lateral de este residuo (3,07Å)(Creighton, 1993). En la sustitución delAsp por el Glu se rompe un enlace dehidrógeno pero permanece la distanciaentre los grupos distintamente cargadoslo que hace suponer que la fuerza delpuente salino permanece intacta. La re-gión en que se encuentra la mutaciónestá situada entre la Aα5 y la láminaAβ6 una región espaciosa, sin estructurasecundaria y en la que el simple efectoestérico que se produce en la sustituciónno debe alterar la conformación de laenzima de forma significativa (Fig. 19, Ey F). Sin embargo, la posición 331 seencuentra en la hendidura del centro ac-tivo y muy próxima al residuo Asp 339que interviene directamente en el proce-so catalítico. El paciente nº 2 es el porta-dor de la mutación C993A que produceesta sustitución y a pesar de llevar el otroalelo normal el nivel de la actividad dela PK en sangre es considerablementemenor que en el de individuos normales.

La mutación A1150G produce elcambio de Thr por Ala en la posición384. La Thr se encuentra entre la Pro383 y la Arg 385 en una zona inmediataa la hélice Aα7. La sustitución por Aladebe modificar la posición de dicha héli-ce respecto a las otras estructuras adya-centes del dominio A condicionando a suvez la posición del Glu 387 al que estáunido por un enlace de hidrógeno y a laGly 388 que interviene directamente en

la conformación del centro activo (Fig.20, A y B). Por ello se debe esperar quela actividad de la enzima se encuentredisminuida respecto a la normal.

La mutación G1154A causa, en laposición 385 el cambio de Arg por Lysdos aminoácidos polares con carga posi-tiva a pH fisiológico. El cambio se loca-liza en el inicio de la hélice A α7 y enuna región aparentemente, sin ningunarelación con otras estructuras de la en-zima. Podría esperarse una atracciónelectrostática entre los grupos cargadosde la Lys y el Glu 387; sin embargo, laorientación en la estructura proteicamantiene estos grupos alejados. Despuésde la sustitución, la distancia del grupoamino a la Pro 383 pasa de 3,74 a 9,45 Å(Fig. 20 , C y D). Por ello, la posible al-teración que pueda sufrir la conforma-ción en esta región, por otra parte pocodensa molecularmente, no debe influirde forma significativa en las regionesesenciales de la enzima para disminuirsu capacidad catalítica. El paciente nº 9que es portador de dicha mutaciónmuestra, en sangre, un 50% de la activi-dad PK de individuos normales que semanifiesta en un estado hemolítico com-pensado.

La mutación G1174A origina elcambio de amino·cidos Ala → Thr en laposición 392. En la enzima normal laAla se encuentra unida por tres enlacesde hidrógeno con la Val 395, Leu 396 ySer 389 y en la enzima mutada aunquedesaparece el de Ser 389 se forma unonuevo con la Ile 424. La sustitución noparece alterar la conformación de la en-zima de forma esencial, ya que ademásde que el tamaño de los aminoácidos essimilar, la estructura de la hélice (semantiene compacta en una región relati-vamente distante del área de interco-

nexión de los dominios A y C en la quese encuentra el centro activo (Fig.20, E yF) Los datos hematológicos del pacientenº 5, que es portador de esta mutación,no varían significativamente respecto alos normales y el estado del paciente esdel tipo hemolítico compensado.

La mutación C1456T origina el cam-bio de Arg → Trp en la posición 486 lo-calizada en la hélice 3α del dominio C.La Arg forma un enlace de hidrógenocon la Gln 483 y otro con la His 482. Lasustitución por Trp rompe el enlace conla Gln pero mantiene el de His (Fig. 21A y B ). De la diferencia de tamaño entrelos dos residuos aminoacídicos puedeesperarse una ruptura de la conformaciónde la hélice α y aunque la región es es-paciosa se encuentra en la zona de inter-conexión entre los dominios A y C. Co-mo se ha indicado previamente la zonade conexión entre estos dos dominios esde gran importancia ya que además deestar próxima al centro activo se en-cuentra el sitio de unión para el efectorfructosa 1,6-bisfosfato (Junica y col.,1998). La inserción de este aminoácidode gran tamaño debe provocar, por tanto,efectos perjudiciales en la estructura dezona esencial para la actividad y regula-ción de la enzima. Estas alteraciones seven reflejadas en que la actividad de laPK de la sangre de los pacientes 3 y 4,que son portadores de dicha mutación,está muy disminuida.

La mutación C1492T causa el cam-bio Arg →Cys en la posición 498 de lasecuencia aminoacídica de la proteína.En la enzima normal la Arg está unidacon 5 enlaces de hidrógeno a cuatroaminoácidos vecinos (Glu 476, Asp519, Pro 520 y Asp 528) (Fig. 21, C y D)lo que debe proporcionar a esta pequeñaregión de sólo tres aminoácidos sin es-

tructura secundaria, y comprendida en-tre la lamina Cβ2 y la hélice Cα4, unaestructura relativamente rígida. La sus-titución por Cys ocasiona la desapari-ción de 4 enlaces de hidrógeno, mante-niéndose el del Glu 476 y formándoseuno nuevo con la Cys 517, muy próximaa la posición 498. Esta proximidad hacesuponer que, a pH fisiológico, se formeun puente disulfuro entre los dos resi-duos cisteínicos. Sin embargo dichadistancia, aunque pequeña, 5,73Å, no pa-rece lo suficiente para que los dos gruposSH reaccionen entre sí. La piruvato qui-nasa contiene 6 residuos cisteínicos yningún puente disulfuro; este hechocontrasta con la estructura de otras pro-teínas, como la lisozima y la ribonuclea-sa, que forman 4 enlaces disulfuro y, enel caso de la ribonucleasa no existe nin-gún SH libre (Cantor y Schinmel, 1980).En nuestro caso, como la inserción deuna Cys no parece implicar la formaciónde un enlace covalente -S-S- y si la des-aparición de neta de tres enlaces dehidrógeno esto debe permitir mayormovilidad a Cβ2 y Cα, pero las nuevasposiciones que tomen en el espacio estasestructuras no deben ocasionar alteracio-nes importantes a la estructura terciariade la enzima que afecten a su actividadcatalítica. La actividad de la PK encon-trada en la sangre del paciente nº 7 quees el portador de esta mutación es solo lamitad de la encontrada en individuosnormales y la deficiencia cursa con unestado hemolítico compensado.

La mutación G1529A produce elcambio de Arg → Gln en la posición510. En la enzima normal la Arg formaun enlace de hidrógeno con la Ala 399 yotro con la Arg 488. Por otra parte la Thr88 se encuentra en una posición muypróxima (4,2 Å) y como proponen VanSolingen y col. (1997) debe existir un

puente salino con la Arg 510. La sustitu-ción por Gln aunque crea un nuevo enla-ce con el Asp 400 desaparece el de laAla, la cadena lateral se pliega sobre simisma y la distancia con la Thr se in-crementa mas del doble desapareciendoo, al menos, reduciéndose la atracciónelectrostática entre los grupos opuesta-mente cargados (Fig. 21, E y F). Estoshechos favorecen la libre conformaciónentre los dominios A y C, alterando laconformación de la proteína entre di-chos dominios en una región que partici-pa directamente en la unión con otrassubunidades y con los efectores de la en-zima. Como la transición desde el estadoT (baja afinidad) al R (alta afinidad) re-quiere la rotación de las 4 subunidadesdel tetrámero mediante goznes o bisagrasflexibles, la formación y/o escisión delos puntos de contacto entre las subuni-dades podría enlentecer o interrumpir larespuesta de los efectores y con ello alte-rar la actividad y/o la regulación de laenzima.

En el presente trabajo de investiga-ción se ha estudiado la deficiencia piru-vato quinasa eritrocitaria de diez pa-cientes con el objeto de identificar ycaracterizar molecularmente las muta-ciones en el gen PK-LR y conocer laposible relación de aquellas con la acti-vidad catalítica de la enzima, las carac-terísticas estructurales y las manifesta-ciones clínicas de la enfermedad.

Del trabajo se pueden extraer las si-guientes conclusiones:

1ª. Los análisis de la relación entre acti-vidad y clínica en los pacientes con de-ficiencia piruvato quinasa que se carac-terízan por una baja actividad específi-ca de la enzima en sangre y un cuadrode anemia hemolítica no esferocítica hapermitido establecer una correlacióndirecta entre la actividad de la enzima yel grado de alteración clínica observada.

2ª. El proceso de la reacción en cadenade la polimerasa (PCR) y el análisis dela secuencia nucleotídica resultan unsistema de gran utilidad en el diagnosti-co molecular de la deficiencia piruvatoquinasa y en la determinación de la mu-tación genética en la zona codificantedel gen. De los 10 pacientes, 7 resulta-ron con una mutación diferente en lasecuencia codificante de cada alelo y enlos 3 restantes en uno de sus alelos no seencontró mutación en la zona codifi-cante. Las genealogías de los pacientesestudiados confirman el caracter here-ditario de la mutación.

3ª. Como consecuencia de la mutaciónde nucleotidos en el gen PK-LR de pa-cientes con deficiencia en piruvato qui-

nasa, se han encontrado, en los 17 alelosidentificados, 11 mutaciones diferentes.Nueve de estas causan la sustitución deun aminoácido en la cadena proteica ylas dos restantes originan la síntesis in-completa de la misma. Tres de estasmutaciones, G694A, A1150G y G1154Aque produce los cambios Gly232 → Ser,Thr384 → Ala y Arg385 → Lys, res-pectivamente, se describen por primeravez.

4ª La mayor frecuencia de las mutacio-nes piruvato quinasa se localiza en elexón nº 10, lo mismo que las mutacionesdescritas en otros países de Europa,América y el Extremo Oriente. Las mu-taciones descritas se encuentran en posi-ciones y en regiones contíguas muy con-servadas en las secuencias nucleotídicashomólogas de diferentes especies.

5ª. La disminución en la actividad enzi-mática que producen ocho de las muta-ciones sustitutivas localizadas en losdominios A y C del monómero de la PKes fácilmente comprensible ya que entreambos dominios se encuentran los sitiosde unión de los sustratos, de los catio-nes, de los efectores y la zona de con-tacto entre la subuniddes. Sin embargo,la mayor disminución de la actividadenzimática corresponde a la presencia dela mutación A694G (Gly232 → Ser), lacual se localiza en el dominio B del queno se conoce una función específica enel proceso catalítico.

6ª Los estudios de modelización mole-cular reflejan que las mutaciones queoriginan los cambios Gly275 → A,Thr384 → Ala, Arg486 → Trp yArg510 → Gln, bien porque desajustan

el balance de las cargas eléctricas de laproteína o bien por impedimento estéri-co ocasionan fuertes modificaciones enla estructura local de la molécula. Ade-más, al encontrarse esta parte próximaal centro activo se puede explicar losvalores disminuidos de actividad de laenzima.

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