La transizione dalla vita anaerobica alla vita aerobica è stata una delle tappe piùimportanti dell’evoluzione, perché ha reso disponibile una grande riserva di ener-gia. L’energia che si può estrarre dal glucosio è quindici volte più elevata in pre-senza di ossigeno che in assenza. Gli organismi unicellulari e altri minuscoli orga-nismi viventi assorbono l’ossigeno necessario per il metabolismo cellulare diretta-mente dall’aria o dall’ambiente acquoso circostante. I vertebrati invece hanno svi-luppato due meccanismi principali per rifornire le loro cellule di una quantità ade-guata di ossigeno. Il primo è un sistema circolatorio che distribuisce attivamentel’ossigeno alle cellule dei diversi tessuti e organi. Il secondo è l’utilizzo di proteinedeputate al trasporto e all’immagazzinamento dell’ossigeno: l’emoglobina e la mio-globina. L’emoglobina, contenuta nei globuli rossi, trasporta l’ossigeno dai pol-moni ai tessuti, e nello stesso tempo contribuisce al trasporto del biossido di car-bonio e degli ioni idrogeno dai tessuti ai polmoni. La mioglobina, localizzata neimuscoli, costituisce una riserva di ossigeno, disponibile in caso di necessità.

L’analisi comparativa dell’emoglobina e della mioglobina ha permesso di otte-nere preziose informazioni su molti aspetti strutturali e funzionali delle proteine.Entrambe le proteine, evoluzionisticamente correlate, possiedono strutture quasiidentiche per il legame con l’ossigeno. Però, mentre l’emoglobina è un trasporta-tore di ossigeno assai efficiente, in grado di utilizzare fino al 90% della sua poten-ziale capacità di trasporto, la mioglobina è in grado di utilizzarne solo il 7%. Acosa è dovuta questa differenza così netta? La mioglobina è formata da una singo-la catena polipeptidica, mentre l’emoglobina è un tetramero. Le quattro catenedell’emoglobina legano l’ossigeno cooperativamente, cioè il legame dell’ossigeno a

Capitolo supplementare A

Nel torrente circolatorio gli eritrociti trasportanol’ossigeno dai polmoni ai tessuti, dove è richie-sto. L’emoglobina, una proteina tetramericache contiene l’eme, un pigmento responsabiledel colore rosso del sangue, si lega all’ossige-no, che viene trasportato fino ai tessuti, doveviene rilasciato. L’emoglobina è stata una delleprime proteine di cui sia stata determinata lastruttura: il disegno qui in alto mostra il ripiega-mento spaziale (folding) di una singola subu-nità. [Fonte: (foto a sinistra) Dr. DennisKunkel/Visual Unlimited.]

Sommario

A1 La mioglobina e l’emoglobinalegano l’ossigeno a livellodell’atomo di ferro dell’eme

A2 L’emoglobina lega l’ossigeno conun meccanismo cooperativo

A3 Gli ioni idrogeno e il biossido dicarbonio promuovono il rilasciodell’ossigeno: l’effetto Bohr

A4 Le mutazioni nei geni checodificano per le subunitàdell’emoglobina sono responsabilidi alcune malattie

Una proteina in azione: l’emoglobina

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La catena beta dell’emoglobina

0000000000000000000006060606060606060606060606060606060606060606060606060606060606060

2 A. Una proteina in azione: l’emoglobina © 88-08-07893-0

una catena aumenta la probabilità che le altre trecatene leghino l’ossigeno. Inoltre, l’affinità del-l’ossigeno per l’emoglobina è modulata dal lega-me degli ioni idrogeno e del biossido di carbo-nio, che aumenta la capacità di trasporto dell’os-sigeno. La cooperatività e la risposta agli effetto-ri possono essere spiegate sulla base delle varia-zioni della struttura quaternaria dell’emoglobi-na, che si verificano a seguito del legame di dif-ferenti combinazioni di molecole modulatrici.

L’emoglobina e la mioglobina occupano unposto importante nella storia della biochimica.Esse sono state le prime proteine di cui sia statadeterminata la struttura tridimensionale per cri-stallografia a raggi X. Inoltre, una malattia delsangue, l’anemia a cellule falciformi, causata dal-la sostituzione di un singolo amminoacido in unadelle catene dell’emoglobina, ha dimostrato perla prima volta che un cambiamento nella sequenzaamminoacidica di una proteina può risultare nel-l’insorgenza di una malattia. Non solo per quan-to di per sé ci insegna, ma anche come paradig-ma per molte altre proteine che incontreremo inseguito, l’emoglobina può essere considerata unafonte di apprendimento e di discussione.

A1 LA MIOGLOBINA EL’EMOGLOBINA LEGANOL’OSSIGENO A LIVELLODELL’ATOMO DI FERRO DELL’EME

La mioglobina di capodoglio è stata la prima pro-teina di cui è stata determinata la struttura tridi-mensionale attraverso la cristallografia a raggi X.Gli studi pioneristici di John Kendrew si con-clusero con la risoluzione della struttura della pro-teina negli anni 1950 (figura A1). La mioglobi-na è formata per gran parte da �-eliche unite traloro da avvolgimenti non casuali, a formare unastruttura globulare.

La mioglobina può trovarsi in una forma pri-

va di ossigeno, denominata deossimioglobina, o inuna forma legata all’ossigeno, denominata ossi-mioglobina. La capacità sia della mioglobina siadell’emoglobina di legare l’ossigeno dipende dal-la presenza di un gruppo prostetico, chiamatoeme.

Il color rosso del muscolo e del sangue è dovutoalla presenza dell’eme. L’eme è costituito da unacomponente organica e da un atomo di ferro inposizione centrale. La componente organica, de-nominata protoporfirina, è costituita da quattroanelli pirrolici legati da ponti metinici per for-mare un anello tetrapirrolico. All’anello sono le-gati quattro gruppi metilici, due gruppi vinilici,e due catene laterali di propionato.

L’atomo di ferro è localizzato al centro dellaprotoporfirina, ed è legato ai quattro atomi diazoto degli anelli pirrolici. In condizioni norma-li è nello stato di ossidazione ferroso (Fe2+). Inol-tre, lo ione ferro può formare altri due legami,uno su ciascuna delle due facce del piano nell’e-me. Questi siti di legame sono chiamati quintoe sesto sito di coordinazione. Nella mioglobina ilquinto sito di coordinazione è occupato dall’a-nello imidazolico di un residuo di istidina dellaproteina, denominata istidina prossimale. Nelladeossimioglobina il sesto sito di coordinazionenon è occupato, ed è disponibile per il legamecon l’ossigeno. Lo ione ferro si trova circa 0,4 Åall’esterno del piano porfirinico, perché lo ioneferro, nella forma presente nella deossimioglobi-na, è un po’ troppo voluminoso per adattarsi en-tro la cavità dell’anello porfirinico (parte sinistradella figura A2).

Il legame della molecola di ossigeno al sestosito di coordinazione dello ione ferro provoca unnotevole riordinamento degli elettroni del ferro,che diventa più piccolo, e può così spostarsi nel

N

FeFe

NN

Eme(Fe-protoporfirina IX)

N

OO–

OO–

Gruppovinilico

Gruppometilico

Gruppopropionico

Anellopirrolico

Mioglobina

Figura A1 Strutturadella mioglobinaSi noti che la mioglobina èformata da una singolacatena polipeptidica, chepossiede �-eliche unite daavvolgimenti non casuali.La mioglobina contiene unsingolo sito di legame perl’ossigeno. [Fonte:1MBD.pdb.]

A. Una proteina in azione: l’emoglobina 3© 88-08-07893-0

piano della porfirina (parte destra della figuraA2). Il cambiamento nella struttura elettronicapuò essere monitorato seguendo le modificazio-ni delle proprietà magnetiche, che sono il fon-damento della risonanza magnetica nucleare perimmagini (fMRI), una delle tecniche più avan-zate per lo studio delle funzioni del cervello (par.32.1). Nel 1936, quasi 25 anni prima che venis-se chiarita la struttura tridimensionale della mio-globina, Linus Pauling, sulla base di misurazionimagnetiche, aveva previsto che dovessero verifi-carsi modificazioni strutturali nella proteina, aseguito del legame con l’ossigeno.

La struttura della mioglobina previene ilrilascio di specie reattive dell’ossigeno

Il legame dell’ossigeno al ferro dell’eme è ac-compagnato dal parziale trasferimento di un elet-trone dallo ione ferroso all’ossigeno. La struttu-ra che si forma può essere descritta come un com-plesso tra lo ione ferrico (Fe3+) e l’anione super-ossido (O2

–), come illustrato nella figura A3. È im-portante però che l’ossigeno, una volta rilasciatodall’emoglobina, rimanga ossigeno molecolare, enon diventi anione superossido. Infatti l’anionesuperossido stesso e altri composti che potrebbe-ro derivarne sono specie reattive dell’ossigeno(cap. 18, p. 460) che possono danneggiare mol-te macromolecole biologiche. Inoltre, dopo il ri-lascio del superossido, lo ione ferro si trova allostato ferrico. La mioglobina che contiene il ferroferrico, denominata metmioglobina, non è in gra-do di legare l’ossigeno, e perde così la possibilitàdi immagazzinarlo. La struttura della mioglobi-na stabilizza il complesso con l’ossigeno, in modoche risulta più difficile il rilascio del superossido.In particolare, nella sacca idrofoba, dove l’ossi-

geno si lega al ferro dell’eme, è presente un altroresiduo di istidina (denominato istidina distale)che forma un legame a idrogeno con la moleco-la di ossigeno (figura A4). Il parziale carattere disuperossido dell’ossigeno legato rafforza l’intera-zione tra l’istidina distale e l’ossigeno. Si può quin-di affermare che la componente proteica della mio-globina controlla la reattività intrinseca dell’eme,rendendolo più adatto a legare reversibilmentel’ossigeno.

Ferro

His

0,4 ÅPorfirina

Nella deossiemoglobina

Nell’ossiemoglobina

O2

Figura A2 Variazioninella posizione delloione ferro a seguito dellegame dell’ossigenoLo ione ferro è situatoleggermente all’esterno delpiano della protoporfirinadell’eme nella deossiemo-globina (a sinistra), ma sisposta sul piano dell’emea seguito dell’ossigenazio-ne (a destra).

Fe2+ Fe3+

Ione superossidoOO–

OO

Figura A3 Legame ferro-ossigenoL’interazione tra il ferro e l’ossigeno nell’emoglobina può essere descritta come una combina-zione di due strutture di risonanza, una col Fe2+ e l’ossigeno molecolare, e l’altra col Fe3+ elo ione superossido.

Figura A4 Stabilizzazio-ne dell’ossigeno legatoall’emeUn legame a idrogeno(linea verde tratteggiata)che si forma tra l’istidinadistale e l’ossigeno legatoallo ione ferroso contribui-sce a stabilizzare l’ossimio-globina.

Istidina distale

4 A. Una proteina in azione: l’emoglobina © 88-08-07893-0

L’emoglobina umana è formata daquattro subunità simili alla mioglobina

La struttura tridimensionale dell’emoglobina dicavallo è stata risolta da Max Perutz subito dopola determinazione della struttura della mioglobi-na. In seguito sono state determinate le struttu-re di emoglobine isolate da altri organismi, in-cluso l’uomo. Tutte posseggono quattro catenepolipeptidiche: una coppia di catene �, che han-no la stessa sequenza amminoacidica, e una cop-pia di catene �, la cui sequenza amminoacidica èdiversa da quella delle catene � (figura A5). Cia-scuna subunità comprende una serie di �-elichedisposte in modo simile a quelle della mioglobi-na. La struttura ricorrente è denominata ripiega-mento globinico. In accordo con questa similaritàstrutturale, le sequenze amminoacidiche delle ca-tene � e � dell’emoglobina umana possono esse-re allineate con la sequenza amminoacidica del-la mioglobina di capodoglio, ottenendosi rispet-tivamente il 25% e il 24% di omologia. I residuiessenziali per la funzione, come l’istidina prossi-male e l’istidina distale, sono conservati in tuttele catene. Quindi le catene � e � dell’emoglobi-

na sono correlate tra loro e con la miosina perevoluzione divergente (vedi cap. 7, p. 167).

Il tetramero dell’emoglobina, indicato in ge-nere come emoglobina A (HbA) è meglio descrittocome una coppia di due dimeri �� identici (�1�1e �2�2) che si associano per formare un tetrame-ro. Nella deossiemoglobina i due dimeri sono giu-stapposti da una vasta interfaccia, che include,tra le altre regioni, l’estremità carbossiterminaledi ciascuna catena. I gruppi eme sono ben sepa-rati nel tetramero: le distanze ferro-ferro sonocomprese tra 24 e 40 Å.

A2 L’EMOGLOBINA LEGAL’OSSIGENO CON UNMECCANISMO COOPERATIVO

Consideriamo ora le cinetiche di ossigenazionedella mioglobina e dell’emoglobina. Le caratteri-stiche di legame dell’ossigeno vengono descrittedalla curva di legame dell’ossigeno (detta anche cur-va di saturazione dell’ossigeno), un grafico in cuila saturazione frazionale viene riportata in fun-zione della concentrazione dell’ossigeno. La sa-turazione frazionale, Y, è definita come la frazio-ne dei possibili siti di legame a cui è effettiva-mente legato l’ossigeno. Il valore di Y varia da 0(tutti i siti sono vuoti) a 1 (tutti i siti sono occu-pati). La concentrazione dell’ossigeno viene con-venientemente riportata sotto forma di pressioneparziale dell’ossigeno, pO2. La forma della curvadi ossigenazione della mioglobina è quella di unsemplice equilibrio chimico (figura A6). Si notiche il valore della saturazione frazionale della mio-globina aumenta rapidamente all’aumentare del-la pO2, fino a mantenersi costante a valori di pO2relativamente bassi. Il valore della pressione par-ziale di ossigeno a cui la metà dei siti sono occu-pO2 (Torr)

0,0

Y (s

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ne fr

azio

nale

)

1,0

0,5

0 25 50 75 100

P50 = 2 Torr

Figura A5 Strutturaquaternaria della deos-siemoglobinaL’emoglobina, che è com-posta da due catene � edue catene �, funzionacome se fosse formata dauna coppia di dimeri ��.(A) Modello a nastri. (B)Modello a spazi pieni.[Fonte: 1A3N.pdb.]

Figura A6 Curva di os-sigenazione della mio-globinaMetà delle molecole dimioglobina sono legateall’ossigeno quando lapressione parziale dell’ossi-geno è di 2 Torr.

A. Una proteina in azione: l’emoglobina 5© 88-08-07893-0

pati dall’ossigeno (P50 corrispondente al 50% disaturazione) è di appena 2 Torr (mm Hg).

Per contro, la curva di ossigenazione dell’e-moglobina nei globuli rossi mostra alcune carat-teristiche interessanti (figura A7). Essa non puòessere ricondotta a una semplice curva di legame,come è quella della mioglobina, e presenta inve-ce forma a «S». Curve di questo tipo vengono de-nominate sigmoidi. Si noti che l’ossigeno si legapiù debolmente all’emoglobina che alla mioglo-bina. Infatti l’emoglobina ha un valore di P50 paria 26 Torr, contro un valore di P50 della mioglo-bina di 2 Torr. Si noti inoltre che la curva di le-game è quella che si ottiene lavorando con i glo-buli rossi. All’interno dei globuli rossi l’emoglo-bina interagisce con il 2,3-bisfosfoglicerato, unamolecola che diminuisce significativamente l’af-finità dell’emoglobina per l’ossigeno, come si ve-drà più avanti.

Una curva di legame sigmoidale suggerisceche la proteina possiede caratteristiche peculiari.In particolare la sigmoidicità della curva di ossi-genazione dell’emoglobina suggerisce che, unavolta che l’ossigeno si lega a uno dei quattro pos-sibili siti di legame, aumenta la probabilità cheesso si leghi a uno degli altri tre siti. Analoga-mente, il distacco dell’ossigeno da uno dei grup-pi eme facilita il distacco dell’ossigeno dagli altritre. Questo meccanismo di legame viene dettocooperativo (vedi oltre, p. 7), perché le reazioni dilegame dell’ossigeno a ognuno dei siti dell’emo-globina non sono tra loro indipendenti. Torne-remo più avanti sul meccanismo della cooperati-vità dell’emoglobina.

Qual è il significato fisiologico del legame coo-perativo dell’ossigeno nell’emoglobina? L’ossige-no deve essere trasportato nel torrente circolato-rio dai polmoni, dove la sua pressione parziale èrelativamente alta (circa 100 Torr), ai tessuti aelevata attività metabolica, dove la pressione par-ziale dell’ossigeno è molto più bassa (normal-mente, 20 Torr). Vediamo ora come la coopera-tività tra i siti di legame, suggerita dalla formasigmoidale della curva di ossigenazione, renda piùefficiente il trasporto dell’ossigeno (figura A8).Nei polmoni l’emoglobina è pressoché totalmentesaturata con l’ossigeno, e il 98% dei siti di lega-me con l’ossigeno sono occupati. Quando l’e-moglobina raggiunge i tessuti e rilascia l’ossige-no, il livello di saturazione scende fino al 32%.Quindi un totale di 98 – 32 = 66% dei poten-ziali siti di legame contribuisce al trasporto del-l’ossigeno. Il rilascio dell’ossigeno avviene in modocooperativo, e favorisce una più completa distri-buzione ai tessuti. Se invece dell’emoglobina ve-nisse utilizzata la mioglobina, la saturazione sa-

rebbe sempre del 98% nei polmoni, ma nei tes-suti sarebbe del 91%. Quindi un totale di 98 –91 = 7% dei potenziali siti di legame contribui-rebbero al trasporto dell’ossigeno; in altre paro-le, la mioglobina lega l’ossigeno troppo salda-mente, per essere un buon trasportatore di ossi-geno. Si potrebbe immaginare una situazione di-versa, cioè ipotizzare una proteina che si sia evo-luta in modo ottimale per il trasporto dell’ossi-geno, ma senza cooperatività. Per una tale pro-teina l’ossigeno che potrebbe essere trasportatoda un organo dove la pO2 è di 100 Torr a un al-tro dove la pO2 è di 20 Torr è di 63 – 25 = 38%.Quindi il legame e il rilascio dell’ossigeno di tipocooperativo permettono all’emoglobina di di-stribuire ai tessuti 10 volte più ossigeno di quan-to potrebbe essere distribuito dalla mioglobina,e più di 1,7 volte di più di quanto potrebbe es-sere distribuito da una proteina non dotata dicooperatività.

Un più attento esame delle concentrazionidell’ossigeno a riposo e durante l’esercizio fisicochiarisce meglio il ruolo dell’emoglobina nel tra-sporto dell’ossigeno (figura A9). In condizioni diriposo la concentrazione dell’ossigeno nei mu-scoli è di circa 40 Torr, ma scende a 20 Torr du-rante l’esercizio fisico. La diminuzione della pres-sione parziale dell’ossigeno da 100 Torr nei pol-

pO2 (Torr)

0,0

Y (s

atur

azio

ne fr

azio

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)

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0,4

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0 25 50 75 100

Emoglobina

Mioglobina

pO2 (Torr)

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Y (s

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0 5020 100 150 200

Emoglobina

Cooperativitàassente

(situazioneipotetica)

MioglobinaTessuti Polmoni

38%

7%

66%

TorrUnità di misura dellapressione, equivalentealla pressione esercitatada una colonna dimercurio alta 1 mm a 0°C e a gravità standard(1 mm Hg). Dal nomedi Evangelista Torricelli(1608-1647) inventoredel barometro amercurio.

Figura A7 Curva di os-sigenazione dell’emo-globinaLa curva, ottenuta utilizzan-do globuli rossi interi, hapressappoco forma a «S». Ilche indica che in ognimolecola di emoglobinasono presenti siti separatiper il legame con l’ossige-no, che interagiscono traloro. La linea tratteggiatanera mostra, per confronto,la curva di ossigenazionedella mioglobina.

Figura A8 La cooperati-vità facilita il rilasciodell’ossigenoLa cooperatività tra i siti dilegame dell’O2 fa sì chel’emoglobina rilasci piùossigeno ai tessuti rispettoalla mioglobina e a ognialtra proteina non dotata dicooperatività, anche rispet-to a una proteina dotata diaffinità ottimale per l’ossi-geno.

6 A. Una proteina in azione: l’emoglobina © 88-08-07893-0

moni a 40 Torr nei tessuti corrisponde a una va-riazione della saturazione dell’emoglobina dal98% al 77%. Ne consegue che la quota di ossi-geno rilasciato è pari a 98 – 77 = 21% per unadiminuzione della pressione parziale dell’ossige-no di 60 Torr. Durante l’esercizio fisico la pres-sione parziale dell’ossigeno scende da 40 a 20 Torre la saturazione dell’ossigeno dal 77% al 32%.Ne consegue che la quota di ossigeno rilasciato èpari a 77 – 32 = 45% per una diminuzione del-la pressione parziale dell’ossigeno di soli 20 Torr.Poiché la variazione della concentrazione del-l’ossigeno dalla condizione di riposo all’eserciziofisico corrisponde alla parte più ripida della cur-va di ossigenazione dell’emoglobina, l’ossigenopuò essere trasferito ai tessuti dove è più richie-sto. Nel paragrafo A3 verranno esaminate altreproprietà dell’emoglobina, che ne chiarisconomeglio il ruolo fisiologico.

L’ossigenazione provoca una sensibilevariazione nella struttura quaternariadell’emoglobina

La cooperatività della curva di ossigenazione com-porta che il legame a uno dei quattro siti dell’e-moglobina influenzi le proprietà di legame deglialtri tre. Una diretta interazione tra i siti non èpossibile, perché essi si trovano ben separati nel-la molecola dell’emoglobina, lontani l’uno dal-l’altro. Ne consegue che l’interazione deve esseremediata da meccanismi indiretti, correlati con lastruttura quaternaria dell’emoglobina.

L’emoglobina va incontro a imponenti varia-zioni della sua struttura quaternaria durante l’os-sigenazione: i dimeri �1�1 e �2 �2 ruotano di cir-ca 15° l’uno rispetto all’altro (figura A10). Però,pur andando incontro a variazioni strutturali, essimantengono sostanzialmente la stessa forma. Èquindi l’interfaccia tra i dimeri �1�1 e �2�2 a su-bire le maggiori transizioni strutturali. Studi re-centi hanno dimostrato che i dimeri �1�1 e �2�2sono più liberi di muoversi l’uno rispetto all’al-tro nello stato ossigenato, rispetto allo stato deos-sigenato.

La struttura quaternaria della forma deossi-genata dell’emoglobina viene spesso denomina-ta stato T (T sta per tense, «teso») perché le quat-tro subunità vengono tenute saldamente unitel’una all’altra da interazioni non covalenti. Lastruttura quaternaria dell’emoglobina totalmen-te ossigenata viene invece denominata stato R (Rsta per relaxed, «rilassato»). Considerando che laforma R dell’emoglobina è meno tesa, le due de-signazioni, T e R, appaiono particolarmente ap-

Eserciziofisico Polmoni

Riposo

45%

21%

pO2 (Torr)

0,0

Y (s

atur

azio

ne fr

azio

nale

)

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0 4020 100 150 200

Figura A9 Effetto del-l’esercizio fisico sultrasporto dell’ossigenoLa brusca diminuzionedella concentrazione del-l’ossigeno da 40 Torr neitessuti a riposo fino a 20Torr nei tessuti durantel’esercizio fisico corrispon-de alla parte più ripidadella curva di ossigenazio-ne. In conseguenza, l’emo-globina è molto efficientenel rifornire di ossigeno itessuti durante l’esercizio.

Figura A10 Variazioninella struttura quater-naria dell’emoglobina aseguito dell’ossigena-zioneSi noti che, a seguito del-l’ossigenazione, un dimeroscivola rispetto all’altro,attraverso un movimentodi rotazione di 15°. [Fonte:1A3N.pdb e 1LFQ.pdb.]

A. Una proteina in azione: l’emoglobina 7© 88-08-07893-0

propriate. Quando l’emoglobina si trova nellostato R, i siti di legame dell’ossigeno sono in gra-do di legare il gas con maggiore affinità rispettoai siti dell’emoglobina che si trova nello stato T.Il legame dell’ossigeno a uno dei quattro siti indu-ce una variazione conformazionale dell’emoglobi-na dallo stato T allo stato R, che a sua volta au-menta l’affinità per l’ossigeno degli altri siti.

Per spiegare la cooperativitàdell’emoglobina si può far ricorso anumerosi modelli

Per spiegare il meccanismo con cui i ligandi pos-sono legarsi in modo cooperativo a proteine mul-timeriche, come l’emoglobina, sono stati propo-sti due modelli limite. Nel modello concertato,noto anche come modello MWC, dai nomi di Jac-ques Monod, Jeffries Wyman e Jean-Pierre Chan-geux, che per primi lo proposero, la proteina mul-timerica può esistere in due stati conformazio-nali: lo stato T e lo stato R. Il legame del ligan-do sposta l’equilibrio tra i due stati (figura A11).Quindi, man mano che il tetramero dell’emo-globina lega una molecola di ossigeno, aumentala probabilità che assuma lo stato conformazio-nale R. Nella forma deossigenata l’emoglobina sitrova quasi esclusivamente nello stato T. Però illegame dell’ossigeno in uno dei siti sposta l’e-quilibrio verso lo stato R. Quando una moleco-la assume la struttura quaternaria R, aumenta l’af-finità per l’ossigeno dei suoi siti di legame, e quin-di aumenta la probabilità che altre molecole diossigeno si leghino ai siti liberi. Ciò spiega per-ché la curva di ossigenazione dell’emoglobina sale

lentamente all’inizio, quando tutte le molecolesi trovano nello stato T, diventa più ripida via viache aumenta la frazione delle molecole che si tro-vano nello stato R, e di nuovo si appiattisce, quan-do tutti i siti delle molecole allo stato R sono oc-cupati dall’ossigeno (figura A12). L’insieme diquesti eventi spiega la forma sigmoidale della cur-va di ossigenazione dell’emoglobina, così impor-tante ai fini di un trasporto efficiente dell’ossi-geno.

Nel modello concertato ciascun tetramero puòesistere solo in due stati: lo stato T e lo stato R.Nel modello sequenziale, alternativo al modelloconcertato, il legame di un ligando a un sito diuna proteina multimerica aumenta l’affinità dilegame dei siti vicini, senza indurre la completaconversione della proteina dallo stato T allo sta-to R (figura A13).

Il legame di tipo cooperativo dell’ossigeno vie-ne descritto meglio dal modello concertato o dal

O2 O2 O2 O2

O2 O2 O2

O2

O2 O2

KT

O2 O2 O2 O2

O2 O2 O2

O2

O2 O2

KR

Stato T

Stato R

È fortementefavorito

lo statoT

È fortementefavoritolo stato R

Curva di legame dello stato R

Curva di ossigenazioneosservata sperimentalmente

Curva di legamedello stato T

pO2 (Torr)

0,0

Y (s

atur

azio

ne fr

azio

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)

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0 50 100 150 200

Figura A11 ModelloconcertatoTutte le molecole si trovanoo nello stato T o nello statoR. A ogni livello di ossigena-zione corrisponde un equili-brio tra i due stati T e R. Inassenza di ossigeno l’equili-brio è fortemente spostatoverso la forma T. In presen-za di ossigeno, quando tuttii siti sono legati all’ossigeno,l’equilibrio è fortementespostato verso la forma R.Lo stato R ha una maggioreaffinità per l’ossigeno rispet-to allo stato T.

Figura A12 Transizionedallo stato T allo stato RLa curva di ossigenazionedell’emoglobina che siosserva sperimentalmentepuò essere consideratacome la combinazionedelle due curve di ossige-nazione che si otterrebberose tutte le molecole diemoglobina rimanessero onello stato T o nello statoR. La curva sperimentale haforma sigmoidale perché lemolecole di emoglobina siconvertono dallo stato Tallo stato R man mano chel’ossigeno si lega.

O2 O2 O2 O2

O2 O2 O2

O2

O2 O2

K1 K2 K3 K4

Figura A13 ModellosequenzialeIl legame di un ligandocambia la conformazionedella subunità a cui si lega.La variazione conformazio-nale induce cambiamentinelle subunità vicine, e laloro affinità per il ligandoaumenta.

8 A. Una proteina in azione: l’emoglobina © 88-08-07893-0

modello sequenziale? Nessuno dei due modellida solo è in grado di descrivere compiutamenteil comportamento dell’emoglobina. È necessarioricorrere a un modello combinato. Si può affer-mare che il comportamento dell’emoglobina se-gue il modello concertato, in quanto la struttu-ra quaternaria dell’emoglobina con tre siti occu-pati dall’ossigeno è riconducibile in prevalenzaallo stato R. Il rimanente sito non occupato haun’affinità per l’ossigeno 20 volte superiore a quel-la che ha l’emoglobina completamente deossige-nata per la prima molecola di ossigeno. Però ilcomportamento dell’emoglobina non segue fe-delmente il modello concertato, perché quandosi lega una sola molecola di ossigeno la strutturaquaternaria è riconducibile in prevalenza allo sta-to T. Tuttavia l’affinità per l’ossigeno di questamolecola monossigenata è tre volte superiore aquella dell’emoglobina deossigenata, in accordocon il modello sequenziale. Questi dati sottoli-neano che il modello concertato e il modello se-quenziale rappresentano casi limite ideali, ai qua-li i sistemi biologici possono avvicinarsi, ma cheraramente raggiungono.

I cambiamenti strutturali a livello deigruppi eme vengono trasmessiall’interfaccia �1�1

_�2�2

Vediamo ora come il legame dell’ossigeno a unsito sia in grado di spostare l’equilibrio tra lo sta-to R e lo stato T del tetramero emoglobinico.Come si è visto per la mioglobina, il legame del-l’ossigeno fa sì che ciascun atomo di ferro dell’e-moglobina si sposti dall’esterno del piano nel pia-no della porfirina. Quando l’atomo di ferro simuove, insieme a esso si muove anche il residuodi istidina legato alla quinta valenza di coordina-zione. Questo residuo di istidina fa parte di un’�-elica, che quindi si muoverà a sua volta (figuraA14). La sua terminazione carbossiterminale gia-

ce nell’interfaccia tra i due dimeri ��. Il cambiodi posizione della terminazione carbossitermina-le dell’elica favorisce la transizione dallo stato Tallo stato R. In conseguenza, la variazione strut-turale a livello dello ione ferro in una subunità vie-ne direttamente trasmessa alle altre. Il riordina-mento dell’interfaccia tra i due dimeri costitui-sce un meccanismo molecolare di comunicazio-ne tra le subunità, che rende possibile la coope-ratività del legame dell’ossigeno.

Il 2,3-bisfosfoglicerato ha un ruolofondamentale nel determinare l’affinitàdell’ossigeno per l’emoglobina nei globulirossi

Perché l’emoglobina possa trasferire efficiente-mente l’ossigeno ai tessuti è importante che laforma T rimanga stabile, fino a che il legame del-l’ossigeno la converte nella forma R. Però lo sta-to T dell’emoglobina è così instabile, che l’equi-librio sarebbe talmente spostato verso lo stato R,da non permettere il rilascio dell’ossigeno in con-dizioni fisiologiche. È quindi necessario l’inter-vento di un altro meccanismo, che stabilizzi lostato T. Tale meccanismo venne scoperto con-frontando le proprietà di legame dell’ossigenodell’emoglobina all’interno dei globuli rossi conquelle dell’emoglobina altamente purificata (fi-gura A15). L’emoglobina purificata lega l’ossige-no molto più saldamente dell’emoglobina in-traeritrocitaria. Questa drastica differenza è do-vuta alla presenza nei globuli rossi del 2,3-bisfo-sfoglicerato (2,3-BPG; noto anche come 2,3-difo-sfoglicerato o 2,3-DPG).

Questo composto fortemente anionico è presen-te nei globuli rossi a una concentrazione appros-simativamente pari a quella dell’emoglobina (cir-ca 2 mM). In assenza di 2,3-BPG l’emoglobinasarebbe un trasportatore di ossigeno estremamenteinefficiente, perché potrebbe rilasciare nei tessu-ti soltanto l’8% del suo carico di ossigeno.

In che modo il 2,3-BPG diminuisce in modocosì rilevante l’affinità dell’emoglobina per l’os-sigeno? L’esame della struttura cristallina delladeossiemoglobina in presenza di 2,3-BPG ha ri-velato che una singola molecola di 2,3-BPG si

O

C HO

O

POO

O O

PO

O O

–

2–

2–

2,3-Bisfosfoglicerato(2,3-BPG)

DeossiemoglobinaOssiemoglobina

Interfaccia�1�1–�2�2

Figura A14 Modifica-zioni conformazionalinell’emoglobinaIl movimento dello ioneferro che si verifica a segui-to dell’ossigenazione portail residuo di istidina legatoal ferro verso l’anello porfi-rinico. Il movimento dell’�-elica a cui a sua volta èlegata l’istidina modifical’interfaccia tra i dimeri ��,inducendo altre modifica-zioni strutturali. A scopo diconfronto, la struttura delladeossiemoglobina è mo-strata in grigio, dietro quel-la dell’ossiemoglobina incolore.

A. Una proteina in azione: l’emoglobina 9© 88-08-07893-0

lega al centro del tetramero, in una tasca che èpresente solo nella forma T (figura A16). A se-guito della transizione dallo stato T allo stato Rla tasca si contrae e il 2,3-BPG è rilasciato. Per-ché la transizione dallo stato T allo stato R pos-sa aver luogo, è necessario che i legami tra il 2,3-BPG e l’emoglobina siano rotti. In presenza di2,3-BPG, un maggior numero di siti di legameper l’ossigeno deve essere occupato, per pro-muovere la transizione dallo stato T allo stato R;pertanto l’emoglobina rimane allo stato T di bas-sa affinità finché non viene raggiunta una più ele-vata concentrazione di ossigeno.

La regolazione dell’emoglobina da parte del2,3-BPG è di notevole interesse, perché il 2,3-BPG non assomiglia in alcun modo all’ossigeno,la molecola sulla quale l’emoglobina esercita lasua funzione. Il 2,3-BPG viene denominato ef-fettore allosterico (dal greco allos, «altro» e stereos,«struttura»). La regolazione da parte di moleco-le non correlate strutturalmente all’ossigeno èpossibile, perché l’effettore allosterico si lega a unsito che è completamnte distinto da quello a cuisi lega l’ossigeno. Gli effettori allosterici vengo-no presi in considerazione anche nel capitolo 10,trattando la regolazione enzimatica.

� Il legame del 2,3-BPG all’emoglobina ha al-tre importanti implicazioni fisiologiche. Il geneper la globina espresso dal feto umano differisceda quello espresso dall’adulto; il tetramero del-l’emoglobina fetale è formato da due catene � eda due catene �. La sequenza amminoacidica del-la catena �, che è il prodotto di una duplicazio-ne genica, è per il 72% identica alla sequenza

amminoacidica della catena �. Una differenzaimportante è la presenza di un residuo di serinain posizione 143 nella catena �, che sostituisceuna istidina presente nella stessa posizione nellacatena �. Poiché l’istidina fa parte del sito di le-game del 2,3-BPG, la rimozione di due carichepositive (una per ogni catena) riduce l’affinitàdel 2,3-BPG per l’emoglobina fetale. In conse-guenza, l’affinità per l’ossigeno dell’emoglobinafetale è più alta di quella materna (figura A17).Tale differenza di affinità rende possibile il tra-sferimento dell’ossigeno dai globuli rossi mater-ni a quelli fetali. Si tratta di un esempio che di-mostra come la duplicazione genica e la specia-lizzazione molecolare abbiano permesso la rapi-da soluzione di un problema biologico; nel casospecifico, il trasporto dell’ossigeno dalla madreal feto.

pO2 (Torr)

0,0

Y (s

atur

azio

ne fr

azio

nale

)

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0 50 100 150 200

8%

20

Tessuti

Emoglobina(intraeritrocitaria,

contenente2,3-BPG)

Emoglobinapurificata(2,3-BPGassente)

Polmoni

66%

Figura A16 Legame del2,3-BPG alla deossie-moglobina umanaIl 2,3-bisfosfoglicerato siposiziona nella cavità cen-trale della deossiemoglobi-na (a sinistra), dove intera-gisce con tre gruppi carichipositivamente, apparte-nenti a ciascuna delle cate-ne � (a destra). [Fonte:1B86.pdb.]

Figura A15 Curve diossigenazione dell’e-moglobina purificata edell’emoglobina intrae-ritrocitaria a confrontoL’emoglobina purificatalega l’ossigeno più salda-mente dell’emoglobinaintraeritrocitaria. La diffe-renza è dovuta alla presen-za del 2,3-bisfosfogliceratonei globuli rossi.

10 A. Una proteina in azione: l’emoglobina © 88-08-07893-0

A3 GLI IONI IDROGENO E ILBIOSSIDO DI CARBONIOPROMUOVONO IL RILASCIODELL’OSSIGENO: L’EFFETTOBOHR

Abbiamo visto come il meccanismo cooperativodi rilascio dell’ossigeno dall’emoglobina permet-ta un’adeguata distribuzione dell’ossigeno ai tes-suti, dove la pressione parziale dell’ossigeno è bas-sa. Ma l’emoglobina risponde anche ad altre mo-lecole segnale, presenti nel suo ambiente fisiolo-gico, che segnalano il bisogno di ossigeno. I tes-suti a rapido metabolismo, come il muscolo incontrazione, producono ioni idrogeno e biossi-do di carbonio in notevole quantità. L’emoglo-bina è in grado di rispondere prontamente ai li-velli elevati di questi due composti, in modo darilasciare più ossigeno proprio dove ve ne è piùbisogno. Come il 2,3-BPG, lo ione idrogeno e ilbiossido di carbonio sono effettori allosterici, chesi legano all’emoglobina in siti distinti dai siti dilegame dell’ossigeno. La regolazione del legamedell’ossigeno da parte degli ioni idrogeno e delbiossido di carbonio va sotto il nome di effettoBohr, dal nome di Christian Bohr, che per primola descrisse nel 1904.

L’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno di-

minuisce al diminuire del pH, a partire dal valo-re fisiologico di 7,4 (figura A18). In conseguen-za, man mano che l’emoglobina raggiunge di-stretti in cui il pH tende a diminuire, la sua ten-denza a rilasciare ossigeno aumenta. Per esempio,il trasporto dell’ossigeno dai polmoni, dove il pHè 7,4 e la pressione parziale dell’ossigeno è di 100Torr, al muscolo in contrazione, dove il pH è 7,2e la pressione parziale dell’ossigeno è 20 Torr, ri-sulta in un rilascio di ossigeno pari al 77% dellacapacità di trasporto totale. Se non vi fosse va-riazione di pH, la capacità di trasporto si ridur-rebbe al 66%. Studi di carattere strutturale e chi-mico hanno permesso di chiarire molti aspetti re-sponsabili dell’effetto Bohr. Almeno due sono igruppi chimici responsabili: i gruppi �-ammini-ci degli amminoacidi terminali delle catene � e iresidui delle istidine �146 e �122. Per ognunodi essi il valore del pKa è intorno a 7. Conside-riamo l’istidina �146, che occupa la terminazio-ne carbossilica della catena �. Nella deossiemo-globina il gruppo carbossilico terminale dell’am-minoacido �146 forma un ponte salino con unresiduo di lisina della subunità � dell’altro di-mero ��. Tale interazione blocca la catena late-rale dell’istidina 146 in una posizione tale da po-ter formare un ponte salino con la carica negati-va dell’aspartato 94 della stessa catena, purché ilgruppo imidazolico del residuo di istidina sia pro-tonato (figura A19).

Anche gli altri gruppi partecipano alla for-mazione di legami salini presenti nella forma T.La formazione dei ponti salini stabilizza lo stato T,favorendo in tal modo il rilascio dell’ossigeno. A pHpiù elevati, la catena laterale dell’istidina non èprotonata, e il ponte salino non si forma. Ma,man mano che il valore di pH si abbassa, la ca-tena laterale dell’istidina �146 si protona, si for-ma il ponte salino con l’aspartato �94, e si sta-bilizza lo stato T.

Il biossido di carbonio, una molecola neutra,attraversa la membrana del globulo rosso e pe-netra nella cellula. Il trasporto è facilitato da tra-sportatori di membrana, che includono le pro-teine del tipo Rh. Il biossido di carbonio favori-sce il rilascio dell’ossigeno con due meccanismi.Primo, la presenza di elevate concentrazioni dibiossido di carbonio provoca una diminuzionedel pH intraeritrocitario (figura A20). Il biossi-do di carbonio reagisce con l’acqua e forma aci-do carbonico, H2CO3. La reazione viene accele-rata dall’anidrasi carbonica, una proteina enzi-matica abbondante nei globuli rossi, che vienetrattata diffusamente nel capitolo 9. L’acido car-bonico è un acido forte, con un pKa di 3,5. Quin-di, una volta formatosi, si dissocia per formare

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 50 100

Y (s

atur

azio

ne fr

azio

nale

)

Globuli rossimaterni

Globuli rossifetali

L’O2 passadall’ossiemoglobina maternaalla deossiemoglobina fetale

pO2 (Torr)

pO2 (Torr)

0,0

Y (s

atur

azio

ne fr

azio

nale

)

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0 10020

PolmoniTessuti

pH 7,4pH 7,2

66%

77%

Figura A17 Affinità perl’ossigeno dei globulirossi fetaliI globuli rossi fetali hannomaggiore affinità per l’ossi-geno rispetto ai globulirossi materni, perché l’e-moglobina fetale non legail 2,3-BPG con la stessaaffinità dell’emoglobinamaterna.

Figura A18 Effetto delpH sull’affinità per l’os-sigeno dell’emoglobinaUna diminuzione del pHda 7,4 (curva rossa) a 7,2(curva blu) risulta in unmaggior rilascio di O2 dal-l’ossiemoglobina.

A. Una proteina in azione: l’emoglobina 11© 88-08-07893-0

ione bicarbonato, HCO3–, e H+. Ne deriva un ab-

bassamento del pH, che stabilizza lo stato T del-l’emoglobina col meccanismo riportato sopra.

Il secondo meccanismo comporta una inte-razione diretta tra il biossido di carbonio e l’e-moglobina, che stimola il rilascio dell’ossigeno.Si può ben apprezzare l’effetto del biossido di car-bonio sull’affinità dell’emoglobina per l’ossige-no, comparando le curve di ossigenazione in as-senza e in presenza di biossido di carbonio allapressione parziale di 40 Torr e a pH 7,2 (figuraA21). In presenza di biossido di carbonio e allapressione parziale di 40 Torr e a pH 7,2 la quan-tità di ossigeno rilasciata si avvicina al 90% del-la massima capacità di trasporto.

Il biossido di carbonio stabilizza la deossie-moglobina reagendo con i gruppi amminici ter-minali e formando così residui di carbammato ca-richi negativamente, diversamente dalle caricheneutre o positive dei gruppi amminici liberi.

I gruppi amminici terminali giacciono sull’in-terfaccia, tra i dimeri �� e i gruppi carichi nega-tivamente del carbammato, e partecipano alla for-mazione di legami salini, che stabilizzano lo sta-to T, favorendo il rilascio dell’ossigeno. Questoprocesso costituisce anche un meccanismo per iltrasporto del biossido di carbonio, ma solo per il14% del totale del biossido di carbonio traspor-tato.

La maggior parte del biossido di carbonio ri-lasciata dagli eritrociti raggiunge i polmoni sottoforma di ione bicarbonato, HCO3

–, prodotto peridratazione del biossido di carbonio all’internodegli eritrociti stessi (figura A22). L’HCO3

– vienepoi trasportato all’esterno da uno specifico tra-sportatore, localizzato sulla membrana eritrocita-ria, che scambia l’HCO3

– intracellulare con lo ioneCl– extracellulare. Ne consegue un aumento del-la concentrazione sierica dell’HCO3

–. In tal modouna notevole quantità di biossido di carbonio vie-ne trasportata dai tessuti ai polmoni sotto formadi HCO3

–. Nei polmoni il processo si inverte: loione HCO3

– viene riconvertito in biossido di car-bonio, che viene eliminato attraverso l’espirazio-ne. In sintesi, il biossido di carbonio, generato dalmetabolismo tissutale, viene convertito negli eri-trociti in una forma che contribuisce ad abbassa-re il pH intracellulare, favorendo il rilascio del-l’ossigeno, e che viene poi trasportato dal sanguefino ai polmoni, per essere espirato.

R

N C

O

O

R

C

O

O

HH

NH

+ –

Carbammato

+ H+

C terminale

�1 His 146

�2 Lys 40

�1 Asp 94

+−

−

+ Protonazione

Figura A19 Le basi chimichedell’effetto BohrNella deossiemoglobina tre resi-dui amminoacidici formano dueponti salini che stabilizzano lastruttura quaternaria nello statoT. La formazione di uno dei pontisalini dipende dalla presenza diun protone sull’anello imidazoli-co dell’istidina �146. La vicinan-za della carica negativa dell’a-spartato �94 nella deossiemo-globina favorisce la protonazionedell’istidina. Si noti che il pontesalino tra l’istidina �146 e l’a-spartato �94 viene stabilizzatoda un legame a idrogeno (lineaverde tratteggiata).

Capillare sanguignoTessuto

HCO3− + H+H2CO3CO2 + H2OCO2

CO2

Figura A20 Biossido di carbonio e pHIl biossido di carbonio diffonde dai tessuti ai globuli rossi. All’interno dei globuli rossi reagiscecon l’acqua, per formare acido carbonico, attraverso una reazione catalizzata dall’anidrasi car-bonica. L’acido carbonico si dissocia, formando HCO3

– e H+, con conseguente abbassamentodel pH intraeritrocitario.

Figura A21 Effetti del biossido di carbonioLa presenza del biossido di carbonio diminuisce l’affinità per l’ossigeno al di sotto dell’effettodovuto alla diminuzione del pH. Il trasporto dell’ossigeno dai tessuti ai polmoni viene cosìulteriormente facilitato.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 100

pO2 (Torr)

Y (s

atur

azio

ne fr

azio

nale

)

20

Tessuti Polmoni

88%

77%

pH 7,4,CO2 assentepH 7,2, CO2 assentepH 7,2, 40 Torr CO2

12 A. Una proteina in azione: l’emoglobina © 88-08-07893-0

A4 LE MUTAZIONI NEI GENI CHECODIFICANO PER LE SUBUNITÀDELL’EMOGLOBINA SONORESPONSABILI DI ALCUNEMALATTIE

Oggi, dopo il sequenziamento del genoma uma-no, siamo abituati a pensare che variazioni nellasequenza amminoacidica delle proteine, codifi-cata dai geni, siano la causa di specifiche malat-tie. L’ipotesi che molte malattie possano esserecausate da difetti molecolari fu avanzata da Li-nus Pauling nel 1949 (4 anni prima che Watsone Crick proponessero la doppia elica del DNA)per spiegare la patogenesi di una malattia deno-minata anemia a cellule falciformi. Il nome deri-va dalla forma a falce degli eritrociti privati di os-sigeno, che si osserva nei soggetti affetti dalla ma-lattia (figura A23). Pauling propose che l’anemiafalciforme potesse essere causata da una specifi-ca variazione della sequenza amminoacidica diuna delle due catene dell’emoglobina. Oggi sap-piamo che l’ipotesi di Pauling è corretta. Infatticirca il 7% della popolazione umana è affetto da

forme patologiche, causate da una variazione del-la sequenza amminoacidica dell’emoglobina. Con-cluderemo questo capitolo trattando le due piùimportanti emoglobinopatie: l’anemia a cellulefalciformi e la talassemia.

L’anemia a cellule falciformi risultadall’aggregazione di molecole mutate dideossiemoglobina

� I soggetti affetti da anemia a cellule falciformipresentano una serie di sintomi rilevanti. L’esa-me dei globuli rossi rivela la presenza di lunghiaggregati fibrosi di emoglobina (figura A24). Lefibre si estendono all’interno dei globuli rossi, di-storcendoli. I capillari vengono ostruiti e il flus-so ematico rallentato. Ne risulta un doloroso gon-fiore alle estremità e un elevato rischio di infartoe di infezioni batteriche (conseguenza della cat-tiva circolazione). Le cellule falciformi non ri-mangono in circolo tanto a lungo quanto gli eri-trociti normali, causando anemia.

Qual è il difetto molecolare associato all’ane-mia a cellule falciformi? Nel 1956 Vernon In-gram, utilizzando tecniche cromatografiche in-novative, dimostrò che una semplice sostituzio-ne amminoacidica nella catena � dell’emoglobi-na è responsabile della malattia, precisamente lasostituzione di un residuo di glutammato con unresiduo di valina in posizione 6. La forma muta-ta viene denominata emoglobina S (HbS). Neisoggetti affetti da anemia a cellule falciformi, am-bedue gli alleli del gene per la catena � dell’e-moglobina (HbB) sono mutati. La sostituzionepresente nell’HbS diminuisce sensibilmente lasolubilità della deossiemoglobina, anche se nonaltera in modo evidente le proprietà dell’ossie-moglobina.

L’esame della struttura dell’emoglobina S ri-vela che il residuo di valina si trova sulla superfi-cie dell’emoglobina allo stato T (figura A25).Questa nuova zona idrofoba interagisce con un’al-

Capillare sanguignoCapillare sanguigno PolmoneTessuto

Alveolo

CO2

CO2

Hb

CO2

CO2

HCO3− + H+

Cl− HCO3−

Hb

H+ + HCO3−

CO2 + H2O

EndotelioEndotelio

prodottodalle celluledei tessuti

CO2 + H2O

Cl− HCO3−

Figura A22 Trasporto diCO2 dai tessuti ai pol-moniLa maggior parte del bios-sido di carbonio vienetrasportata ai polmoni sot-to forma di ione HCO3

–

prodotto nei globuli rossi equindi trasferito nel pla-sma. Una minor quantitàviene trasportata dall’emo-globina, sotto forma dicarbammato.

Figura A23 Emazie fal-ciformiImmagine al microscopioelettronico a scansione,che mostra una emaziafalciforme, accanto adalcune emazie normali.

A. Una proteina in azione: l’emoglobina 13© 88-08-07893-0

tra zona idrofoba, formata dalla Phe 85 e dallaVal 88 della catena � di una molecola di emo-globina adiacente, iniziando un processo di ag-gregazione. Un’analisi più approfondita ha di-mostrato che una singola fibra di emoglobina Sè formata dall’insieme di 14 filamenti di mole-cole di emoglobina S legate l’una all’altra. Comemai gli aggregati non si formano quando l’emo-globina S è ossigenata? L’emoglobina S ossigena-ta si trova nello stato S, e i residui Phe 85 e Val88 delle catene � si trovano nascosti all’internodella molecola. Al residuo idrofobo di Val in po-sizione 6 della catena � viene quindi a mancareun partner con cui interagire, e il processo di for-mazione delle fibre non può essere innescato.

Nell’Africa occidentale circa l’1% della po-polazione è affetto da anemia a cellule falciformi.Visto che la malattia ha conseguenze talvolta de-vastanti, come mai è così diffusa in Africa e in al-tre particolari zone? Ricordiamo che ambedue lecopie del gene dell’HbB sono mutate nei sogget-ti affetti da anemia a cellule falciformi. Tuttaviai soggetti con una copia del gene HbB e una co-pia del gene HbS sono relativamente sani. Essisono però portatori del tratto per l’anemia fal-ciforme, perché possono trasmettere il gene del-l’HbS. Questi soggetti portatori sono resistentialla malaria, una malattia dovuta a un parassita,il Plasmodium falciparum, che è presente nel glo-bulo rosso durante uno stadio del suo ciclo vita-le. L’effetto devastante della malaria sulla salutee sulla possibilità riproduttiva di popolazioni chevivono in regioni dove storicamente la malaria haavuto una diffusione endemica, ha favorito i por-tatori del tratto dell’anemia falciforme, aumen-tando così la prevalenza dell’allele HbS (figuraA26).

La talassemia è causata da una sintesisbilanciata delle catene emoglobiniche

� L’anemia a cellule falciformi è causata dalla so-stituzione di un singolo amminoacido in una del-le catene dell’emoglobina. Invece la talassemia,l’altra emoglobinopatia a carattere ereditario lar-gamente diffusa, è causata dalla perdita o dallanetta diminuzione di una singola catena. In con-seguenza, il livello di emoglobina normale e laproduzione di emoglobina nei globuli rossi sononotevolmnte ridotti, con conseguente insorgen-za di anemia, astenia, pallore diffuso e alterazio-ni funzionali a livello della milza e del fegato. Latalassemia comprende diverse sindromi correla-te. Nella �-talassemia, la catena � dell’emoglo-bina non è prodotta in sufficiente quantità. Inconseguenza, si formano tetrameri emoglobinici

formati solo da catene �. Tali tetrameri, deno-minati emoglobina H (HbH), legano l’ossigeno,ma con una affinità abnormemente alta e inmodo non cooperativo. Ne risulta un insufficienterilascio di ossigeno nei tessuti. Nella �-talassemiasono le catene � dell’emoglobina a non essereprodotte in quantità sufficiente. In assenza di ca-tene �, le catene � formano aggregati insolubiliche precipitano all’interno dei globuli rossi im-maturi. La diminuzione dei globuli rossi condu-ce ad anemia. La forma più grave di �-talassemiaè chiamata talassemia maior o anemia di Cooley(morbo di Cooley).

Sia la �- sia la �-talassemia sono associate avari tipi di alterazioni genetiche, e si manifesta-no con quadri clinici molto differenziati. Le for-

Figura A25 Emoglobina S deossigenataL’interazione tra la Val 6 (in blu) della catena � di una molecola emoglobinica deossigenata ela zona idrofoba formata dalla Phe 85 e dalla Val 88 (in grigio) di una seconda molecola diemoglobina deossigenata provoca l’aggregazione di molecole di emoglobina. Il residuo dellaVal 6 esposto sulla superficie della catena � della seconda molecola di emoglobina partecipaa un’altra identica interazione, e così via. Si formano così lunghe fibre di emoglobina S.[Fonte: 2HBS.pdb.]

Figura A24 Fibre diemoglobina presentinelle cellule falciformiFotografia al microscopioelettronico a scansione,che mostra un globulorosso da cui fuoriesconofibre di emoglobina S.[Fonte: Per gentile conces-sione di Robert Josephs eThomas E. Wellems, Uni-versity of Chicago.]

14 A. Una proteina in azione: l’emoglobina © 88-08-07893-0

me più gravi di �-talassemia risultano letali pri-ma, o subito dopo la nascita. Però sono piutto-sto rare. Se si considera il repertorio dei geni perl’emoglobina nel genoma umano, se ne trova laspiegazione. Normalmente l’uomo possiede quat-tro alleli per la catena �, anziché due, disposti inmodo che due geni sono localizzati uno accantoall’altro alla terminazione di ciascun cromosoma16. Pertanto la completa assenza della catena �richiede che siano alterati quattro alleli. La �-ta-lassemia è più comune, perché normalmente ab-biamo solo due alleli per la catena �, uno su cia-scuna copia del cromosoma 11.

Normalmente le catene �dell’emoglobina non si accumulano

La presenza di quattro geni che esprimono la ca-tena �, contro i due per la catena �, suggerisceche la catena � venga prodotta in eccesso (assu-mendo semplicisticamente che l’entità dell’e-spressione delle catene � da parte di ogni genesia la stessa). Se l’ipotesi è corretta, perché l’ec-cesso di catene � non precipita? Una recente sco-perta ha messo in evidenza un meccanismo chemantiene le catene � in soluzione. I globuli ros-si producono una proteina di 11 kD, denomi-nata proteina stabilizzante l’�-emoglobina (AHSP).Il complesso è solubile. La struttura cristallina delcomplesso tra l’AHSP e l’�-emoglobina mostrache l’AHSP interagisce sulla stessa faccia dell’�-emoglobina, dove interagisce la �-emoglobina(figura A27). L’AHSP si lega sia alla forma deos-sigenata sia alla forma ossigenata della catena �.Nel complesso con l’ossigeno legato è l’istidinadistale, anziché l’istidina prossimale, che lega l’os-sigeno.

L’AHSP ha la funzione di legare l’�-emoglo-bina, man mano che questa viene sintetizzata. In-vece la �-emoglobina, man mano che viene pro-dotta, sposta l’AHSP, perché il complesso dime-rico �-emoglobina–�-emoglobina è più stabiledel complesso �-emoglobina–AHSP. Quindil’AHSP previene l’accumulo e la precipitazionedell’�-emoglobina libera. Sono in corso ricercheintese a verificare se le mutazioni del gene che co-difica l’AHSP giocano un ruolo nel modulare lagravità della �-talassemia.

> 6

2–6

Diffusioneendemicadella malaria

Percentuale dellapopolazione totaleche possiede un soloallele dell’anemia acellule falciformi(emoglobina S)

Istidinadistale

α-Emoglobina

AHSP

Figura A26 Tratto dell’anemia a cellule falciformi e malariaEsiste una significativa correlazione tra le regioni ad alta frequenza dell’allele HbS e le regioni con alta incidenza della malaria.

Figura A27 Stabilizza-zione dell’�-emoglobinaViene mostrata la strutturadel complesso tra AHSP e�-emoglobina. In questocomplesso l’atomo di ferrosi lega all’ossigeno e all’isti-dina distale. Si noti chel’AHSP interagisce con l’�-emoglobina sulla stessazona di interazione della �-emoglobina. [Fonte:1Y01.pdb.]

A. Una proteina in azione: l’emoglobina 15© 88-08-07893-0

Il genoma umano codifica anche per altreglobine

� In aggiunta a quelli per la mioglobina, per l’�-emoglobina e per la �-emoglobina, il genomaumano aploide contiene altri geni per le globine?Abbiamo già parlato dell’emoglobina fetale, checontiene una catena � al posto della catena �. Madurante lo sviluppo vengono espressi geni che co-dificano per altri tipi di subunità emoglobiniche,note come catena �, catena � e catena �.

Il recente sequenziamento del genoma uma-no ha rivelato la presenza di altre due globine.Entrambe sono proteine monomeriche, quindipiù somiglianti alla mioglobina che all’emoglo-

bina. La prima, denominata neuroglobina, vieneespressa soprattutto nel sistema nervoso centra-le, e in particolare nella retina. La neuroglobinapotrebbe avere un ruolo protettivo contro l’ipos-sia (apporto insufficiente di ossigeno). La secon-da, denominata citoglobina, ha una distribuzio-ne più ampia. Studi strutturali e spettroscopicihanno rivelato che nella neuroglobina e nella ci-toglobina sia l’istidina prossimale sia l’istidina di-stale vengono coordinate dal ferro nella formadeossigenata; ma a seguito dell’ossigenazione l’i-stidina distale si stacca. Ulteriori studi potrannochiarire il ruolo funzionale di questi due mem-bri della famiglia delle globine.

SOMMARIO

A1 La mioglobina e l’emoglobina legano l’ossigeno a livellodell’atomo di ferro dell’eme

La mioglobina è una proteina formata in gran parte da �-eliche,alle quali si lega il gruppo prostetico eme. L’eme è formato da unacomponente organica, una protoporfirina che a sua volta è costi-tuita da quattro anelli pirrolici con uno ione ferro centrale allo sta-to di ossidazione Fe2+. Nella mioglobina lo ione ferro è coordinatocon un residuo di istidina, denominato istidina prossimale. Unodegli atomi di ossigeno della molecola biatomica O2 si lega a unodei siti di coordinazione dello ione ferro. A causa del parziale tra-sferimento elettronico dal ferro all’ossigeno, il ferro si sposta nel pia-no della porfirina a seguito del legame dell’ossigeno. L’emoglobinaè formata da quattro catene polipeptidiche: due catene � e due ca-tene �. Ognuna di esse possiede una sequenza amminoacidica si-mile a quella della mioglobina. Anche il loro avvolgimento spazia-le, a formare una struttura tridimensionale, è simile a quello dellamioglobina. Il tetramero dell’emoglobina può essere consideratoformato da due dimeri ��.

A2 L’emoglobina lega l’ossigeno con un meccanismocooperativo

La curva di ossigenazione della mioglobina descrive un sempliceprocesso di equilibrio. La mioglobina si satura per il 50% a unapressione parziale di ossigeno di circa 2 Torr. La curva di saturazio-ne dell’ossigeno dell’emoglobina ha forma a «S» (sigmoidale), indi-cando che l’ossigeno si lega in modo cooperativo. Il legame del-l’ossigeno a uno dei siti di legame del tetramero emoglobinico in-fluenza l’affinità per l’ossigeno degli altri siti. La cooperatività dellegame e del rilascio dell’ossigeno aumenta significativamente l’ef-ficienza del trasporto. Infatti l’entità del trasporto dell’ossigeno daipolmoni (dove la pressione parziale dell’ossigeno è di 100 Torr) aitessuti (dove la pressione parziale è di 20 Torr) è pari al 66% dellapotenzialità massima (in altri termini, il 66% dell’ossigeno presen-te nell’ossiemoglobina formatasi nei polmoni viene rilasciato neitessuti). Se la mioglobina fosse stata scelta per trasportare l’ossige-no, l’entità del trasporto sarebbe solo del 7%.

La struttura quaternaria dell’emoglobina cambia a seguito dellegame con l’ossigeno. Quella della deossiemoglobina viene deno-minata stato T. Quella dell’ossiemoglobina viene denominata stato

R. I due dimeri �� ruotano approssimativamente di 15° l’uno ri-spetto all’altro durante la transizione dallo stato T allo stato R. Lacooperatività della curva di ossigenazione può essere spiegata ricor-rendo al modello concertato o al modello sequenziale. Nel model-lo concertato, ciascuna molecola di emoglobina assume o lo statoT, o lo stato R; l’equilibrio tra i due stati è determinato dal nume-ro di siti di legame occupati dall’ossigeno. Il modello sequenziale,invece, ammette l’esistenza di strutture ibride intermedie. I cam-biamenti strutturali che avvengono a livello del ferro legato alla por-firina in risposta al legame dell’ossigeno vengono trasmessi all’in-terfaccia tra i due dimeri, influenzando l’equilibrio tra lo stato T elo stato R.

I globuli rossi contengono un trioso fosfato, il 2,3-bisfosfoglice-rato, a una concentrazione approssimativamente uguale a quelladell’emoglobina. Il 2,3-BPG si lega saldamente allo stato T, ma nonallo stato R, stabilizzandolo, e diminuendo l’affinità per l’ossigenodell’emoglobina. L’emoglobina fetale lega l’ossigeno meglio dell’e-moglobina dell’adulto, perché lega il 2,3-BPG più debolmente.Questa differenza tra le due emoglobine permette all’ossigeno dipassare dal sangue materno a quello fetale.

A3 Gli ioni idrogeno e il biossido di carbonio promuovono ilrilascio dell’ossigeno: l’effetto Bohr

L’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno è fortemente influenzatadal pH e dalla presenza di biossido di carbonio, un fenomeno notocome effetto Bohr. L’aumento della concentrazione degli ioni idro-geno, cioè la diminuzione del pH, diminuisce l’affinità per l’ossi-geno dell’emoglobina, a causa della protonazione di alcuni residuidi istidina. Una volta protonati, i residui di istidina contribuisconoa stabilizzare lo statoT. L’aumento della concentrazione del biossi-do di carbonio diminuisce l’affinità per l’ossigeno dell’emoglobinaattraverso due meccanismi. Il biossido di carbonio viene converti-to in acido carbonico, che a sua volta abbassa l’affinità per l’ossige-no dell’emoglobina diminuendo il pH intraeritrocitario. Oppure silega ai gruppi amminoterminali dell’emoglobina, formando residuidi carbammato. Le cariche negative del carbammato stabilizzano ladeossiemoglobina per mezzo di interazioni ioniche. Poiché gli ioniidrogeno e il biossido di carbonio si producono attivamente nei tes-suti a rapido metabolismo, l’effetto Bohr favorisce il rilascio del-l’ossigeno nei distretti dove ce n’è più bisogno.

16 A. Una proteina in azione: l’emoglobina © 88-08-07893-0

A4 Le mutazioni dei geni che codificano per le subunitàdell’emoglobina sono responsabili di alcune malattie

L’anemia a cellule falciformi è causata dalla sostituzione di un resi-duo di glutammato con uno di valina nella catena � dell’emoglo-bina. Si genera così una zona idrofoba sulla superficie della deos-siemoglobina (stato T), che provoca la formazione di polimeri fi-brosi. Le fibre alterano la forma dei globuli rossi, conferendo loroun aspetto a falce. L’anemia a cellule falciformi è stata la prima ma-lattia di cui è stato possibile ricondurre l’insorgenza a un cambia-mento nella sequenza amminoacidica di una proteina. Le varie for-

me di talassemia sono causate da una ridotta produzione della ca-tena � o della catena � dell’emoglobina. Vengono prodotti tetra-metri emoglobinici contenenti un solo tipo di subunità. Tali tetra-metri sono caratterizzati da una diminuita capacità di rilascio del-l’ossigeno e da una bassa solubilità, che provocano la lisi dei globulirossi durante il loro sviluppo. I precursori dei globuli rossi normal-mente producono un lieve eccesso di catene � rispetto alle catene�. Per prevenirne l’aggregazione, essi producono una proteina sta-bilizzante l’�-emoglobina, che si lega specificamente ai monomeri�, formando un complesso solubile.

APPENDICE Si possono proporre modelli di legame di tipo cooperativo in termini quantitativi: il grafico di Hill e il modello concertato

Il grafico di Hill

Un modo utile per descrivere quantitativamente il legame di tipocooperativo, com’è quello dell’emoglobina, è stato sviluppato da Ar-chibald Hill nel 1913. Consideriamo l’ipotetico equilibrio tra unaproteina X e un ligando S:

X + nS X(S)n (1)

dove n è una variabile che può assumere valori interi o frazionari.Il parametro n è una misura del grado di cooperatività del legamedi S, anche se l’equazione 1 non si riferisce a un vero e proprio pro-cesso fisico. Per X = emoglobina e S = O2, il massimo valore che npuò assumere è 4. Questo valore potrebbe essere raggiunto se il le-game dell’ossigeno con l’emoglobina fosse completamente coope-rativo, cioè se la cooperatività fosse la massima possibile. Se inveceil legame dell’ossigeno fosse totalmente non cooperativo, il valoredi n sarebbe 1.

Analizzando l’equilibrio della reazione 1, si ottiene la seguenteespressione per la saturazione frazionale, Y:

dove [S50] è la concentrazione alla quale la saturazione del ligandoX è pari al 50% (X è saturato per metà). Per l’emoglobina l’espres-sione diventa

Yn

n n=

+[ ]

[ ] [ ]

S

S S50

dove P50 è la pressione parziale di ossigeno alla quale l’emoglobinaè saturata per metà. L’espressione può essere così riordinata:

pertanto

Questa equazione predice che, riportando in un grafico log(Y /1 –Y ) in funzione di log(P50) (grafico di Hill ), si otterrà una retta, lacui pendenza è n.

I grafici di Hill per la mioglobina e per l’emoglobina sono ri-portati nella figura A28. Il grafico di Hill risulta lineare per la mio-globina, con una pendenza pari a 1. Per l’emoglobina, invece, il gra-fico non è completamente lineare, perché la reazione di equilibriosu cui si basa il grafico di Hill non è pienamente corretta. Il grafi-co è comunque approssimativamente lineare nella sua porzione me-diana, dove la pendenza è pari a 2,8. La pendenza, spesso denomi-nata coefficiente di Hill, è una misura del grado di cooperatività di

log log log( )Y

Y

p

Pn p n

n

n12

50−⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

=⎛

⎝⎜

⎞

⎠⎟ = −

OO2 llog( )P50

YY

p

P

n

n12

50−=

O

Yp

p P

n

n n=

+O

O2

2 50

log ( pO2)

Mioglobina3

2

1

0

log

(––––

)Y

1 −

Y

1 2 3 40−4

−3

−1

−2

−1

3

2

1

0

−4

−3

−2

−1

n = 1,0

log ( pO2)

Emoglobina

log

(––––

)Y

1 −

Y

1 2 3 40−1

n = 2,8

Figura A28 Grafico diHill per la mioglobina eper l’emoglobina

A. Una proteina in azione: l’emoglobina 17© 88-08-07893-0

legame dell’ossigeno. L’utilità del grafico di Hill sta nel fatto cheesso fornisce un’idea quantitativa del grado di cooperatività di le-game. Utilizzando l’equazione di Hill, e ponendo il valore del coef-ficiente di Hill pari a 2,8, si ottiene una curva che rassomiglia mol-to a quella dell’emoglobina (figura A29).

Il modello concertato

Il modello concertato può essere trattato in termini quantitativi.Sono richiesti solo quattro parametri: (1) il numero dei siti di lega-me nella proteina (si assume che siano equivalenti), (2) il rapportotra le concentrazioni degli stati T e R in assenza di ligandi, (3) l’af-finità per i ligandi dei siti della proteina allo stato R, e (4) una mi-sura del rapporto tra l’affinità per i ligandi della proteina allo statoR e l’affinità per i ligandi della proteina allo stato T. Il numero deisiti di legame, n, può essere ricavato da altre informazioni. Per l’e-moglobina, n = 4. Il rapporto tra le concentrazioni degli stati T eR in assenza di ligandi è una costante:

L = [T0]/[R0]

dove il pedice si riferisce al numero dei ligandi presenti (in questocaso, zero). L’affinità per l’ossigeno delle subunità nello stato R puòessere valutata dal valore della costante di dissociazione della rea-zione di legame dell’ossigeno a un singolo sito dello stato R, KR.Allo stesso modo l’affinità per l’ossigeno delle subunità nello statoT, può essere valutata dal valore della costante di dissociazione del-la reazione di legame dell’ossigeno a un singolo sito dello stato T,KT. Definiremo il rapporto tra queste due costanti come

c = KR/KT

Questo rapporto è una misura di quanto più fortemente una sin-gola subunità di una proteina allo stato R (subunità R) lega il li-gando rispetto a una subunità della proteina allo stato T (subunitàT). Si noti che c < 1, perché KR e KT sono costanti di dissociazio-ne, e un legame forte corrisponde a un basso valore della costantedi dissociazione.

Qual è il rapporto tra la concentrazione di una proteina allo sta-to T con un sito occupato da un ligando e la concentrazione dellaproteina allo stato R con un sito occupato da un ligando? Indi-chiamo la costante di dissociazione per un singolo sito nello statoR con KR. Per una proteina con n siti vi sono n possibili siti dove ilprimo ligando può legarsi. Questo fattore statistico favorisce il le-game del ligando a una proteina con n siti rispetto a una proteinacon un singolo sito. Pertanto [R1] = n[R0][S]/KR. Analogamente[T1] = n[T0][S]/KT. Quindi

Una simile analisi rivela che, per stati con i ligandi legati, [Ti]/[Ri]= c iL. In altre parole, il rapporto tra la concentrazione dello statoT e la concentrazione dello stato R viene ridotta di un fattore paria c per ogni ligando legato.

Definiamo ora una scala conveniente per la concentrazione di S:

� = [S]/KR

Questa definizione è utile, perché è il rapporto tra la concentrazio-ne di S e la costante di dissociazione che determina l’estensione dellegame. Utilizzando questa definizione si vede che

[ ]

[ ]

[ ][ ]

[ ][ ]

[ ]

[ ]

T

R

T S

R S

T

R

T

R

R

T

1

1

0

0

0

0

= = =

n

Kn

K

K

K

ccL

Analogamente,

Qual’è la concentrazione delle molecole allo stato R con due li-gandi legati? Di nuovo dobbiamo considerare il fattore statistico,cioè il numero di modi in cui un secondo ligando può legarsi a unamolecola con un sito occupato. Questo numero è n – 1, che peròva diviso per 2, perché non importa quale sia il «primo» e quale il«secondo» ligando. Quindi

Possiamo derivare simili equazioni nel caso di i ligandi che si le-gano allo stato T.

Possiamo ora calcolare la saturazione frazionale, Y. Questa puòessere considerata come la concentrazione dei siti con il ligando le-gato divisa per la concentrazione di tutti i potenziali siti di legame.Quindi,

Sostituendo in questa equazione, troviamo

Sostituendo [T0] = L[R0] e sommando, si ottiene

Y

n nc nn

=

+ + −⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

[ ] [ ]( )

[ ]R T R0 0 022

12

� � �

++ −⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

+ + +21

22

02

0 0nn

c n ncn n( )[ ] [ ] [ ]T R T� ))

([ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [

�

� � �

n

n nn n nc cR T R T R0 0 0 0 0+ + + + + + TTn ]�n

···

···

Yn

nn n=

+ + + + + +([ ] [ ]) ([ ] [ ]) ([ ] [ ])

(

R T R T R T1 1 2 22

[[ ] [ ] [ ] [ ]) ([ ] [ ])R T R T R T0 0 1 1+ + + + + +n n

···

···

[ ]

[ ][ ]

[ ]

R

R S

R

R2

1

1

12

1

2

=

−⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

= −⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

= −

n

K

n

n

�

11

2

1

2

0

02

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

= −⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

( [ ] )

[ ]

n

nn

R

R

� �

�

[ ][ ][ ]

[ ]TT S

RT

10

0= =n

KncL �

[ ][ ][ ]

[ ]RR S

RR

10

0= =n

Kn �

pO2 (Torr)

0,0

Y (s

atur

azio

ne fr

azio

nale

)

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0 50 100 150 200

n = 4n = 2,8

n = 1

Figura A29 Curve diossigenazione corri-spondenti ad alcunivalori del coefficien-te di HillLa curva con numerodi Hill pari a 2,8 (n =2,8) è molto simile aquella dell’emoglobina.

18 A. Una proteina in azione: l’emoglobina © 88-08-07893-0

Possiamo ora utilizzare questa equazione per verificare se è in ac-cordo con la curva di ossigenazione dell’emoglobina, utilizzandodiversi valori per i parametri L, c e KR (con n = 4). Una eccellentecorrispondenza si ottiene ponendo L = 9000, c = 0,014 e KR = 2,5Torr (figura A30).

Insieme con la saturazione frazionale, vengono anche mostratele concentrazioni delle specie T0, T1, T2, R2, R3 e R4. Le concen-trazioni delle altre specie sono molto basse. La possibilità di otte-nere informazioni sulle concentrazioni delle singole specie costi-tuisce un’importante differenza tra l’equazione di Hill e l’analisi delmodello concertato. L’equazione di Hill fornisce soltanto il valoredella saturazione frazionale, mentre l’analisi del modello concerta-to fornisce i valori delle concentrazioni delle singole specie. Nel no-stro caso l’analisi fornisce il valore del rapporto tra le concentrazio-ni dello stato T e dello stato R a ogni stato di legame. Il rapportovaria da 9000 a 126 a 1,76 a 0,025 a 0,00035, quando sono legatezero, una, due, tre o quattro molecole di ossigeno. Il rapporto co-stituisce una misura quantitativa della popolazione di molecole diemoglobina che passa dalla stato T allo stato R.

Anche il modello sequenziale può essere formulato in terminiquantitativi. Però la formulazione richiede più parametri, e inoltre,anche utilizzando diversi set di parametri, si ottengono spesso cur-ve teoriche che descrivono bene la curva sperimentale di saturazio-ne dell’ossigeno.

YLc cL c

n n

n n= + + +

+ + +

− −� � � �

� �

( ) ( )

( ) ( )

1 1

1 1

1 1

pO2 (Torr)

T0

T1

T2

R4

R3R2

Y

0,0

Fraz

ione

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0 50 100 150 200

Figura A30 Curve di legame dell’ossigeno basate sul modello con-certatoSaturazione frazionale (Y ) in funzione di pO2: L = 9000; c = 0,014; e KR =2,5 Torr. Vengono mostrate la frazione di molecole allo stato T, con zero, unae due molecole di ossigeno legate (T0, T1 e T2) e la frazione di molecole allostato R con due, tre e quattro molecole di ossigeno legate (R2, R3 e R4). Ilvalori delle frazioni di molecole in altre forme (T3 e T4, R0 e R1) sono troppobassi per poter essere mostrati.

TERMINI CHIAVE

anemia a cellule falciformi (p. 12)anidrasi carbonica (p. 10)anione superossido (p. 3)2,3-bisfofoglicerato (p. 8)carbammato (p. 11)catena � (p. 4)catena � (p. 4)citoglobina (p. 15)coefficiente di Hill (p. 16)curva di legame dell’ossigeno (p. 4)dimero �� (p. 4)effetto Bohr (p. 10)eme (p. 2)

emoglobina fetale (p. 9)emoglobina H (p. 13)emoglobina S (p. 12)grafico di Hill (p. 16)istidina distale (p. 3)istidina prossimale (p. 2)malaria (p. 13)metmioglobina (p. 3)modello concertato (modello MWC) (p.

7)modello sequenziale (p. 7)neuroglobina (p. 15)pressione parziale (p. 4)

proteina stabilizzante l’�-emoglobina(AHSP) (p. 14)

protoporfirina (p. 2)ripiegamento globinico (p. 4)risonanza magnetica nucleare per

immagini (fMRI) (p. 3)saturazione frazionale (p. 4)sigmoide (p. 5)stato R (p. 6)stato T (p. 6)talassemia (p. 13)talassemia maggiore (morbo di Cooley)

(p. 13)

LETTURE CONSIGLIATE

Da dove cominciare

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Struttura

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A. Una proteina in azione: l’emoglobina 19© 88-08-07893-0

Interazione dell’emoglobina con gli effettori allosterici

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Altre globine e proteine leganti le globine

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PROBLEMI

1. Esplorando la biosfera. La prima struttura proteica che è statadeterminata è quella della mioglobina di capodoglio. Perché il mu-scolo di capodoglio è una sorgente ricca in mioglobina?

2. Trasporto dell’ossigeno ad alta quota. Immaginate di stare sca-lando una montagna e che la pressione parziale dell’ossigeno sia ri-dotta a 75 Torr. Calcolate la percentuale della capacità di trasportodell’ossigeno, assumendo che il valore del pH, sia dei tessuti sia delsangue, sia 7,4 e che la concentrazione dell’ossigeno nei tessuti siadi 20 Torr.

3. Adattamento alle alte quote. Dopo un periodo di uno o più gior-ni ad alta quota (dove la pressione parziale dell’ossigeno è pari a 75

Torr), la concentrazione del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG) au-menta nei globuli rossi. Qual è l’effetto dell’aumento della concen-trazione del 2,3-BPG sulla curva di ossigenazione dell’emoglobina?E perché tale aumento favorisce l’adattamento alle alte quote?

4. Un altro trasportatore di ossigeno. Gli artropodi, come le arago-ste, possiedono trasportatori di ossigeno che differiscono nettamentedall’emoglobina. Il loro funzionamento non è basato sulla presen-za dell’eme, ma su quella di composti che forniscono una coppia diioni rame(I). Le variazioni strutturali che accompagnano il legamedell’ossigeno vengono mostrate qui sotto. Come potrebbero essereutilizzate per facilitare il legame cooperativo dell’ossigeno?

O2

NH

N

N

N N

N N

N N

N

NN

N

HN

HN

HN

HN

HN

HN

NH

NH

NH

NH

NH

Cu CuCuCuO

O

20 A. Una proteina in azione: l’emoglobina © 88-08-07893-0

5. Una disconnessione. Usando la tecnica della mutagenesi mirataè stata ottenuta una emoglobina in cui i residui di istidina prossi-male di ambedue le catene � e � sono sostituiti con un residuo diglicina. L’anello imidazolico dell’istidina può essere rimpiazzato, ag-giungendo imidazolo libero in soluzione. Vi aspettate che una emo-globina così modificata mostri cooperatività per il legame con l’os-sigeno? Spiegate la vostra risposta.

6. Sostituzioni efficaci. I globuli rossi di alcuni uccelli non con-tengono 2,3-bisfosfoglicerato. Tra i composti indicati qui sotto (a-d), quale pensate che potrebbe svolgere lo stesso ruolo del 2,3-bis-fosfoglicerato? Spiegate brevemente perché.

7. Curve teoriche. (a) Servendovi dell’equazione di Hill, disegna-te la curva di ossigenazione di una ipotetica emoglobina dimerica,con n = 1,8 e P50 = 10 Torr. (b) Ripetete utilizzando il modello con-certato con n = 2, L = 10000, c = 0,01, e KR = 10 Torr.

8. Effetto dei parassiti. Il metabolismo del P. falciparum nei glo-buli rossi produce sostanze acide. Quale effetto potrebbe avere lapresenza di acidi sulla capacità di trasportare l’ossigeno dei globulirossi? E sulla possibilità di formare cellule falciformi?

9. La porfirina «a palizzata». Se l’eme libero viene esposto all’os-sigeno, si forma rapidamente e irreversibilmente una specie dime-rica dell’eme, contenente un ponte ossigeno.

I chimici hanno progettato e sintetizzato uno speciale derivato del-l’eme, costituito da una porfirina cosiddetta «a palizzata», che legareversibilmente l’ossigeno, senza formare specie dimeriche.

Fe2�2

Eme Dimero

� 1/2O2 Fe3� Fe3�O

Spermina

NH

HN NH2H N2

Indolo

HN

Colina

+N

CH3

CH3CH3

HO

Inositolo pentafosfato

OH

�O3POOPO3

OPO3

�O3PO

�O3PO

�

�

(a)

(b)

(c) (d)

NHN

lmidazolo

Su che base è stata progettata la molecola, e quale potrebbe essereuna possibile spiegazione della reversibilità del legame con l’ossige-no?

Problema sull’interpretazione dei dati

10. Ossigenazione di una emoglobina primordiale. Le lamprede sonoorganismi primitivi, i cui antenati si differenziarono dagli antenatidei pesci e dei mammiferi circa 400 milioni di anni fa. Il sanguedelle lamprede contiene una emoglobina correlata strutturalmentecon l’emoglobina dei mammiferi. Però l’emoglobina delle lampre-de è monomerica allo stato ossigenato. I dati di ossigenazione perl’emoglobina delle lamprede sono i seguenti:

pO2 Y pO2 Y pO2 Y

0,1 0,0060 2,0 0,112 50,0 0,8890,2 0,0124 3,0 0,170 60,0 0,9050,3 0,0190 4,0 0,227 70,0 0,9170,4 0,0245 5,0 0,283 80,0 0,9270,5 0,0307 7,5 0,420 90,0 0,9350,6 0,0380 10,0 0,500 100 0,9410,7 0,0430 15,0 0,640 150 0,9600,8 0,0481 20,0 0,721 200 0,9700,9 0,0530 30,0 0,8121,0 0,0591 40,0 0,865

(a) Riportate i dati in un grafico per ricavare la curva di ossigen-zione. A che pressione parziale di ossigeno corrisponde il 50% disaturazione? Osservando la curva si può giudicare se il legame è ditipo cooperativo?(b) Costruite un grafico di Hill utilizzando i dati della tabella. Si

può concludere che il legame dell’ossigeno è di tipo cooperativo?Che cos’è il grafico di Hill?(c) Ulteriori studi hanno rivelato che l’emoglobina delle lampre-

de allo stato deossigenato forma oligomeri, soprattutto dimeri. Pro-ponete un modello che spieghi la cooperatività che si osserva nel-l’emoglobina di lampreda.

NN

NNFe

HN

HNNH

NH

CH3

H3CCH3

CH3

H3C

H3C

H3C

CH3H3C

H3C CH3

CH3

O

OO

O

N

N

CH3

Complesso porfirinico «a palizzata»