UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL DAUN

SIRSAK (Annona muricata L) TERHADAP LARVA

Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE

SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)

Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN

Oleh:

Nur Zaki Hanifah

NIM: 1111103000075

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI

SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

1436 H / 2015 M

v

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh

Segala puji bagi Allah SWT Tuhan semesta alam atas segala rahmat dan karunia-

Nya serta shalawat dan salam selalu tercurahkan kepada Baginda Nabi Besar

Muhammad SAW. Alhamdulillah, penulis dapat menyelesaikan penelitian dan

penulisan skripsi dengan judul “UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK

METANOL DAUN SIRSAK (Annona muricata L) TERHADAP LARVA

Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY

TEST (BSLT)” sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana

Kedokteran di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta.

Dalam kesempatan kali ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :

1. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. dr. Achmad Zaki, Sp.OT, M.Epid selaku Ketua Program Studi Pendidikan

Dokter Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta.

3. dr. Nurul Hiedayati, Ph. D selaku pembimbing 1 yang selalu membantu,

mengarahkan, menyediakan waktu, tenaga, dan pikiran untuk

membimbing penulis selama proses penelitian dan penyusunan laporan

penelitian ini. dr Nurul, Ph. D juga selaku PJ laboratorium Farmakologi

yang telah memberikan izin penggunaan laboratorium.

4. Ibu Zilhadia, M.Si, Apt selaku pembimbing 2 yang selalu membantu,

mengarahkan, menyediakan waktu, tenaga, dan pikiran untuk

membimbing penulis dalam melakukan penelitian dan penyusunan laporan

penelitian.

vi

5. dr. Alyya Siddiqa, Sp. FK dan drg. Laifa Annisa Hendarmin, Ph. D selaku

penguji sidang laporan penelitian ini.

6. dr. Flori Ratna Sari, Ph. D dan dr. Nouval Shahab, Sp.U, Ph.D, FICS,

FACS selaku penanggung jawab riset PSPD angkatan 2011 dan 2012.

7. Ibu Puteri Amelia, M. Farm, Apt selaku PJ laboratorium Farmakognosi

dan Fitofarmaka, Ibu Eka Putri, M.Si, Apt selaku PJ laboratorium

Penelitian 1, Ibu Endah Wulandari, M.Biomed selaku PJ laboratorium

Biokimia, dan Ibu Zeti Harriyati, M.Biomed selaku PJ laboratorium

Biologi yang telah memberikan izin untuk menggunakan laboratorium.

8. Mas Rachmadi, Mbak Rani, Kak Lisna, Mbak Ai, dan Mbak Lilis selaku

laboran yang telah memberikan bantuan kepada penulis selama proses

penelitian.

9. Pihak-pihak lembaga luar yaitu Pusat Konservasi Tumbuhan-Kebun Raya

Bogor LIPI yang telah bersedia memberikan surat determinasi, Balai

Penelitian Tanaman Rempah dan Obat yang telah membantu dalam

pengeringan dan penghalusan sampel sehingga menjadi serbuk simplisia,

dan Bapak Suwedi yang telah memberikan sampel daun sirsak yang

digunakan pada penelitian ini.

10. Dinas Kesehatan Kabupaten Hulu Sungai Utara, Kalimantan Selatan yang

telah memberikan beasiswa kepada penulis sehingga penulis dapat

menyelesaikan laporan penelitian ini.

11. Kedua orang tua Bapak Drs. Supomo dan Ibu Siti Kusmiatun serta adik-

adik penulis Nur Kholis Hanifah, Nur Arif Majid, dan Ahmad Hammam

Burhanudin yang telah memberikan limpahan kasih sayang, doa, dan

dukungan sepanjang hidup penulis.

12. Feby Wulandari, Tazkiyatul Firdaus, Rona Qurrotul Aina yang membantu

dalam melakukan penelitian.

13. Teman-teman PSPD 2011 dan 2012 yang telah berjuang bersama dan

memberikan dukungan kepada penulis dalam menyelesaikan laporan

penelitian ini, serta pihak lain tidak bisa disebutkan satu per satu.

vii

Tidak ada harapan dari penulis, semoga dengan terselesaikannya laporan

penelitian ini dapat memberikan manfaat bagi penulis sendiri maupun

pembaca. Penulis menyadari laporan penelitian ini jauh dari kesempurnaan,

karena itu kritik dan saran yang membangun dari semua pihak sangat

diharapkan.

Wassalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh.

Jakarta, 1 Oktober 2015

Penulis

viii

ABSTRAK

Nur Zaki Hanifah. Program Studi Pendidikan Dokter. Uji Toksisitas Akut Ekstrak

Metanol Daun Annona muricata L Terhadap Larva Artemia salina Leach Dengan

Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 2015

Sirsak (Annona muricata L) termasuk famili Annonaceae yang telah dikenal

sebagai tumbuhan obat. Daun Annona muricata L mengandung alkaloid, tannin,

dan beberapa kandungan kimia lainnya termasuk acetogenin yang diduga

memiliki potensi sitotoksik. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui

potensi toksisitas akut ekstrak metanol daun Annona muricata L terhadap larva

Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yang

ditunjukkan dengan nilai LC50. Penelitian eksperimental ini menggunakan 4

konsentrasi perlakuan (15 ppm, 10 ppm, 5 ppm, dan 2,5 ppm) dan 1 kontrol

negatif dengan 3 kali pengulangan. Larva Artemia salina Leach yang digunakan

berjumlah 150 ekor dengan masing-masing 10 ekor larva untuk tiap konsentrasi.

Kematian larva dihitung setelah 24 jam perlakuan. Berdasarkan analisis probit,

nilai LC50 dari ekstrak daun Annona muricata L adalah 4, 187 ppm. Hal ini

menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun Annona muricata L memiliki potensi

toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach karena LC50 <1000 ppm.

Kata Kunci: Annona muricata L, Uji Toksisitas Akut, Artemia salina Leach,

BSLT, LC50

ABSTRACT

Nur Zaki Hanifah. Medical Education Study Program. Acute Toxicity Test Of

Methanol Extract Of Annona muricata L Leaves Toward Artemia salina Leach

Using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Method. 2015

Soursop (Annona muricata L) belongs to Annonaceae family, has been known as

herbal plant. Annona muricata L leaves contains alkaloids, tannin, and several

other chemical constituents, including acetogenin that allegedly to have cytotoxic

potential. This goal of this research was to find out acute toxicity potency of

methanol extract of Annona muricata L leaves toward Artemia salina Leach using

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method which is shown by LC50 value. This

experimental research was done by using 4 consentration treatments (15 ppm, 10

ppm, 5 ppm, and 2,5 ppm) and 1 negative control with 3 times replication. Total

samples were 150 Artemia salina Leach larvae with 10 larvae for each

consentration. Death larvae was calculated 24 hours after treatment. According

probit analysis, the LC50 value of methanol extract of Annona muricata L was

4,187 ppm. It means that methanol extract of Annona muricata L leaves had acute

toxicity potency toward Artemia salina Leach because LC50 <1000 ppm.

Keywords: Annona muricata L, Acute Toxicity Test, Artemia salina Leach,

BSLT, LC50

ix

DAFTAR ISI

LEMBAR PERNYATAAN ........................................................................ ii

LEMBAR PERSETUJUAN ....................................................................... iii

LEMBAR PENGESAHAN ........................................................................ iv

KATA PENGANTAR ................................................................................. v

ABSTRAK ................................................................................................... viii

DAFTAR ISI ................................................................................................ ix

DAFTAR TABEL ....................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiii

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang ....................................................................................... 1

1.2. Rumusan masalah .................................................................................. 3

1.3. Tujuan penelitian ................................................................................... 3

1.3.1. Tujuan umum .............................................................................. 3

1.3.2. Tujuan khusus ............................................................................. 3

1.4. Manfaat penelitian ................................................................................. 3

1.4.1. Bagi masyarakat ......................................................................... 3

1.4.2. Bagi institusi ............................................................................... 3

1.4.3. Bagi peneliti ................................................................................ 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Landasan teori ....................................................................................... 5

2.1.1. Obat tradisional ........................................................................... 5

2.1.2. Tumbuhan Annona muricata L ................................................... 7 2.1.2.1. Klasifikasi sirsak (Annona muricata L) .................................. 7

2.1.2.2. Morfologi sirsak (Annona muricata L) .................................. 8

2.1.3. Annonaceous acetogenin ...................................................................... 11

2.1.4. Ekstraksi ............................................................................................... 13

2.1.5. Uji toksisitas ............................................................................... 15

2.1.6. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) .......................................... 16

2.1.7. Artemia salina Leach .................................................................. 17

2.1.7.1. Taksonomi Artemia salina Leach ............................................ 17

2.1.7.2. Ekologi spesies ........................................................................ 18

2.1.7.3. Deskripsi .................................................................................. 19

2.1.7.4. Siklus hidup ............................................................................. 19

2.1.7.5. Alasan penggunaan Artemia salina Leach sebagai hewan uji . 21

2.1.8. Pelarut ......................................................................................... 23

2.2. Kerangka teori ........................................................................................ 24

2.3. Kerangka konsep ................................................................................... 25

2.4. Definisi operasional .............................................................................. 26

BAB III METODE PENELITIAN

3.1. Desain penelitian ................................................................................... 27

x

3.2. Lokasi dan waktu penelitian .................................................................. 27

3.3. Populasi dan sampel .............................................................................. 27

3.3.1. Populasi ...................................................................................... 27

3.3.2. Sampel ........................................................................................ 27

3.3.2.1. Kriteria inklusi ................................................................ 27

3.3.2.2. Kriteria eksklusi .............................................................. 27

3.3.3. Besar sampel ............................................................................... 28

3.3.4. Cara pengambilan sampel ........................................................... 28

3.4. Determinasi tanaman ............................................................................. 28

3.5. Bahan yang diuji ................................................................................... 28

3.6. Alat dan bahan penelitian ...................................................................... 28

3.6.1. Alat penelitian ............................................................................. 28

3.6.2. Bahan penelitian ......................................................................... 29

3.7. Cara kerja penelitian ............................................................................. 29

3.7.1. Persiapan dan pembuatan simplisia ............................................ 29

3.7.2. Pembuatan ekstrak daun sirsak (Annona muricata L) ................ 29

3.7.3. Penetasan larva udang ................................................................ 30

3.7.4. Persiapan larutan sampel yang akan diuji ................................... 31

3.7.5. Prosedur uji toksisitas dengan metode BSLT ............................. 31

3.8. Alur penelitian ....................................................................................... 33

3.9. Pengolahan dan analisis data ................................................................. 34

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil ekstraksi daun Annona muricata L .............................................. 35

4.2. Hasil uji toksisitas akut dengan metode BSLT ..................................... 36

4.3. Nilai LC50 .............................................................................................. 38

BAB V SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan ............................................................................................... 42

5.2. Saran ...................................................................................................... 42

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 42

LAMPIRAN ................................................................................................ 47

xi

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Perbedaan obat tradisional/obat herbal dengan obat modern ...... 5

Tabel 2.2. Modalitas reproduksi Artemia salina ........................................... 19

Tabel 3.1. Data konsentrasi ekstrak pada well plate ..................................... 32

Tabel 4.1. Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol daun Annona

muricata L terhadap larva Artemia salina Leach ......................... 37

Tabel 4.2. Perhitungan nilai LC50 dengan metode probit ............................. 38

Tabel 6.1. Tabel transformasi persen-probit ................................................ 54

xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Buah sirsak .............................................................................. 8

Gambar 2.2. Daun dan batang sirsak ........................................................... 9

Gambar 2.3. Bunga dan bagian-bagian bunga sirsak ................................... 10

Gambar 2.4. Klasifikasi annonaceous acetogenin ........................................ 11

Gambar 2.5. Artemia salina .......................................................................... 18

Gambar 2.6. Karakteristik anatomi nauplia Artemia salina .......................... 20

Gambar 2.7. Karakteristik anatomi Artemia salina dewasa .......................... 21

Gambar 3.1. Bagan alur penelitian ............................................................... 33

Gambar 4.1. Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol daun Annona

muricata L terhadap larva Artemia salina Leach ..................... 38

Gambar 4.2 Grafik regresi linier ekstrak metanol daun sirsak (Annona

muricata L) terhadap nilai probit ............................................. 39

Gambar 6.1. Surat keterangan determinasi tanaman ..................................... 50

Gambar 6.2. Daun Annona muricata L sebelum dikeringkan ...................... 51

Gambar 6.3. Serbuk simplisia daun Annona muricata L sebanyak 572 g .... 51

Gambar 6.4. Proses maserasi daun Annona muricata L ............................... 51

Gambar 6.5. Penyaringan filtrat hasil maserasi ............................................ 51

Gambar 6.6. Destilasi pelarut metanol .......................................................... 52

Gambar 6.7. Hasil destilasi metanol ............................................................. 52

Gambar 6.8. Filtrat maserat yang telah disaring ........................................... 52

Gambar 6.9. Evaporasi menggunakan rotary evaporator ............................. 52

Gambar 6.10. Ekstrak kental metanol daun Annona muricata L sebanyak

57 gram ................................................................................... 53

Gambar 6.11. Larutan induk 2000 ppm dihomogenkan menggunakan hot

plate stirrer ............................................................................. 53

Gambar 6.12. Penetasan larva Artemia salina Leach ................................... 53

Gambar 6.13. Konsentrasi ekstrak metanol daun Annona muricata L ......... 53

Gambar 6.14. Uji BSLT ................................................................................ 53

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Perhitungan konsentrasi ekstrak metanol daun

Annona muricata L dan nilai LC50 ........................................... 47

Lampiran 2. Surat keterangan determinasi tanaman ..................................... 50

Lampiran 3. Alat dan bahan penelitian ......................................................... 51

Lampiran 4 Tabel transformasi persen-probit ............................................. 54

Lampiran 5 Riwayat penulis ........................................................................ 56

1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Masalah

Berdasarkan data International Agency for Research on Cancer (IARC),

perwakilan WHO khusus kanker, diperkirakan terdapat 14,1 juta kasus baru

kanker dan 8,2 juta kematian akibat kanker pada tahun 2012. Jumlah tersebut

meningkat dibandingkan dengan tahun 2008 dimana terdapat 12,7 juta kasus baru

dan 7,6 juta kematian.1

Di Indonesia, kanker dan Penyakit Tidak Menular (PTM)

kronis lain merupakan 63 % penyebab kematian di seluruh dunia dengan

mortalitas mencapai 36 juta jiwa per tahun.2 Untuk PTM prioritas yang

dikendalikan program-program pengendalian di Direktorat Pengendalian Penyakit

Tidak Menular, Direktorat Jenderal Pengendalian Penyakit dan Penyehatan

Lingkungan (P2PL), kanker merupakan penyebab kematian kedua setelah

penyakit jantung pada kasus rawat inap dari tahun 2009-2010.3

Banyak cara yang dilakukan untuk untuk mengobati kanker, dengan cara

medis maupun tradisional. Melalui medis, dapat dilakukan dengan operasi,

kemoterapi, dan radiasi. Namun melalui cara medis memiliki banyak efek

samping, sehingga masyarakat mulai menggunakan obat tradisional sebagai

alternatif antikanker.4

Selain itu, perkembangan obat dari bahan alam memiliki kecenderungan

yang tinggi di negara berkembang seperti Indonesia karena harganya lebih

terjangkau, tersedia dalam jumlah cukup dibandingkan obat sintesis yang

harganya sering berada di luar jangkauan masyarakat berpenghasilan rendah.

Kecenderungan umum untuk kembali ke alam juga terlihat di seluruh dunia. Hal

ini dapat diketahui dari meningkatnya obat bahan alam dan obat tradisional (India,

Cina, Korea). Berbagai pusat penelitian ini menggunakan metode ilmiah terbaru

untuk menganalisis bahan aktif dari tanaman dan untuk menemukan obat baru dari

2

bahan alam yang aktif secara biologis.5 Salah satu obat tradisional yang dipercaya

sebagai antikanker adalah sirsak.4

Tanaman sirsak termasuk famili Annonaceae dan memiliki aktivitas

farmakologi seperti antikanker. Secara umum tanaman famili Annonaceae dapat

dibedakan dari bentuk buahnya. McLaughlin (1995) melaporkan bahwa tanaman

famili Annonaceae mengandung banyak senyawa acetogenin. Acetogenin

merupakan senyawa metabolit sekunder yang secara alami terbentuk dalam

tumbuhan, yang secara spesifik menyerang sel kanker tanpa memengaruhi sel

normal pada makhluk hidup. Penelitian mengenai khasiat daun sirsak dalam

mengatasi sel kanker di Indonesia telah diteliti oleh Prof. Solaksono

Sastrodihardjo dan Dr. Jerry Mc Laughlin pada tahun 1995. Hasil penelitian

tersebut menemukan beberapa senyawa aktif yang termasuk ke dalam

annonaceous acetogenins. Beberapa senyawa turunan acetogenin yang ditemukan

adalah acetogenin-muricatocin A, muricatocin B, annonacin A, trans-

isoannonacin, annonacin-10-one, dan muricatocin. Senyawa-senyawa aktif

tersebut ditemukan di dalam daun dan batang sirsak yang ternyata mampu

membunuh lebih dari 12 jenis sel kanker.6

Penelitian sebelumnya, yang dilakukan oleh Monica Wijaya (2012) dan R.

Juliani (2014) menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sirsak memiliki efek

sitotoksik yang tinggi dengan nilai LC50 masing-masing sebesar 3,062 dan 0,85

ppm.4,7

Salah satu metode untuk uji sitotoksik adalah Brine Shrimp Lethality Test

(BSLT). Metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan aktivitas antikanker

dan memiliki tingkat kepercayaan hingga 95 %.8 Selain itu metode ini juga mudah

dikerjakan, murah, cepat, cukup akurat, dan hanya menggunakan sejumlah kecil

material uji.9,10

` Penelitian ini dilakukan untuk melihat potensi toksisitas akut daun sirsak

yang diperoleh dari kebun warga di desa Tinggarjaya, kecamatan Jatilawang,

Banyumas, Jawa Tengah. Perbedaan dengan penelitian sebelumnya yang

dilakukan oleh Monica Wijaya dan R. Juliani terletak pada lokasi asal sampel

daun sirsak dan metode ekstraksi.Dengan demikian, dilakukan uji toksisitas akut

3

ekstrak metanol daun sirsak (Annona muricata L) terhadap Artemia salina Leach

dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).

1.2. Rumusan Masalah

Bagaimana aktivitas toksisitas akut ekstrak metanol daun sirsak (Annona

muricata L) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp

Lethality Test (BSLT)?

1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1. Tujuan umum

Untuk mengetahui aktivitas toksisitas akut ekstrak metanol daun

sirsak (Annona muricata L) terhadap larva Artemia salina Leach.

1.3.2. Tujuan khusus

a. Menentukan data persentase kematian larva Artemia salina Leach

setelah pemberian ekstrak metanol daun sirsak (Annona muricata L)

b. Menentukan nilai LC50 ekstrak metanol daun sirsak (Annona muricata

L) dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).

1.4. Manfaat Penelitian

1.4. 1. Bagi Masyarakat

a. Menambah sumber informasi bagi masyarakat mengenai aktivitas

toksisitas daun sirsak (Annona muricata L).

b. Meningkatkan pengetahuan masyarakat mengenai manfaat tanaman

bagi kesehatan.

1.4. 2. Bagi Institusi

a. Penelitian ini diharapkan dapat memperkaya data ilmiah mengenai

penggunaan obat herbal dari tumbuhan.

b. Penelitian ini dapat menambah sumber referensi di Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta.

4

1.4. 3. Bagi Peneliti

a. Penelitian ini menjadi salah satu syarat mendapatkan gelar sarjana

kedokteran di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

b. Memperoleh suatu pengalaman dalam bidang penelitian eksperimental

terutama dalam bidang kesehatan.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Landasan Teori

2.1.1. Obat Tradisional

Di Indonesia, obat tradisional tidak hanya digunakan di desa yang jauh

dari fasilitas kesehatan dan obat modern sulit didapat, namun juga digunakan di

kota besar yang memiliki fasilitas kesehatan lengkap dan obat modern mudah

didapatkan.11

Definisi obat tradisional ialah bahan atau ramuan bahan yang berasal

dari tumbuhan, hewan, mineral, sediaan sarian (galenik) atau campuran dari bahan

tersebut, yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan

berdasarkan pengalaman.12

Jamu adalah obat tradisional Indonesia.13

Tabel 2.1. Perbedaan obat tradisional/obat herbal dengan obat modern

Obat modern Obat tradisional/obat herbal

Kandungan senyawa

kimia

Satu atau beberapa di-

murnikan/ sintetik

Campuran banyak senyawa

alami

Zat aktif Jelas Sering tidak diketahui atau

tidak pasti

Kendali mutu Relatif mudah Sangat sulit

Efektivitas dan

keamanan

Ada bukti ilmiah, uji klinik Umumnya belum ada bukti

ilmiah/uji klinik

Sumber: Dewoto, 2007

Agar obat tradisional dapat diterima di pelayanan kesehatan formal/

profesi dokter, maka hasil data empirik harus didukung bukti ilmiah adanya

khasiat dan keamanan penggunaannya pada manusia. Tahapan pengembangan

obat tradisional menjadi fitofarmaka adalah sebagai berikut:

a. Tahap Seleksi

Sebelum dimulai penelitian, perlu dilakukan pemilihan jenis obat tradisional

dengan pertimbangan sebagai berikut:

Khasiatnya diharapkan untuk mengobati penyakit yang secara

epidemiologi berada pada urutan atas.

Berdasarkan pengalaman mempunyai khasiat untuk penyakit tertentu.

6

Dapat digunakan sebagai alternatif jarang untuk penyakit tertentu,

misalnya AIDS atau kanker.11

b. Tahap Uji Preklinik

Uji preklinik dilakukan dengan cara in vitro atau in vivo. Bentuk sediaan dan

cara pemberian pada hewan uji disesuaikan dengan rencana pemberian pada

manusia. Penelitian farmakodinamik obat tradisional bertujuan untuk

mengetahui efek farmakodinamik dan mempelajari mekanisme kerja dalam

menimbulkan efek. Selain untuk melihat efek farmakodinamik, uji preklinik

juga digunakan untuk melihat toksisitas suatu obat tradisional.11

c. Standarisasi Sederhana, Penentuan Identitas dan Pembuatan Sediaan

Terstandar

Pada tahap ini dilakukan standarisasi simplisia, penentuan identitas, dan

menentukan bentuk sediaan yang sesuai. Beberapa hal yang mempengaruhi

efek obat tradisional yang ditimbulkan yaitu: bentuk sediaan obat tradisional,

proses pengolahan, segar/ kering bahan, prosedur ekstraksi, dan jenis pelarut

yang digunakan dalam ekstraksi.11

d. Uji Klinik

Uji klinik dilakukan dengan tujuan untuk membuktikan khasiat dan

keamanannya untuk menjadi fitofarmaka. Gold standard uji klinik

menggunakan desain randomized double-blind controlled clinical trial.

Sebelum dilakukan pada manusia, uji klinik harus terbukti aman dan

mempunyai khasiat pada uji preklinik. Pembagian fase dalam uji klinik yaitu:

Fase I bertujuan untuk menguji keamanan dan tolerabilitas obat

tradisional, dilakukan pada sukarelawan sehat.

Fase II awal dilakukan pada pasien dengan jumlah terbatas, tanpa

menggunakan pembanding.

Fase III akhir dilakukan pada pasien dengan jumlah terbatas,

menggunakan pembanding. Fase III merupakan uji klinik definitif.

Fase IV bertujuan untuk melihat efek samping yang lambat atau jarang

muncul, dilakukan setelah pemasaran.11

7

Tingginya efek samping obat sintesis mendorong pencarian bahan baku

obat dari alam. Nilai tukar rupiah yang rendah membuat harga bahan obat sistesis

naik tak terkendali, karena sebagian besar obat sintesis masih diimpor. Baik

negara maju maupun berkembang seperti Indonesia dalam dekade ini terlihat

kecenderungan back to nature.14

Pemilihan tanaman yang akan diteliti untuk mencari obat dari alam dapat

dilakukan melalui dua pendekatan yaitu berdasarkan aktivitas biologik dan

berdasarkan kemotaksonomi. Berdasarkan aktivitas biologik dapat dilakukan

dengan mencari informasi khasiat yang terbukti empiris. Informasi ini dapat

diperoleh dari masyarakat, referensi obat tradisional, atau hasil penelitian

sebelumnya. Berdasarkan kemotaksonomi dilakukan dengan menetapkan

hipotesis berdasarkan kesamaan genus atau famili dengan tanaman lain yang

mempunyai efek biologis.14

2.1.2. Tumbuhan Annona muricata L

2.1.2.1. Klasifikasi Sirsak (Annona muricata L)

Sirsak atau Annona muricata L sering disebut nangka belanda, durian

belanda, atau nangka seberang. Tanaman yang masih satu famili dengan sirsak

ialah kenanga (Canangium odoratum) atau ilang-ilang. Sementara tanaman lain

yang termasuk ke dalam genus Annonaceae ialah Annona squamosa L. (sirkaya

atau custrard apple), Annona reticulate L. (kemulwa, buah nona, atau bullock’s

heart), Annona montana L. (sirsak bali atau kemulwa gunung), dan Annona

diversifolia L. (buah ilama atau sirsak hutan). Contoh jenis sirsak hutan adalah

sirsak sabun atau sirsak irian.15

Susunan taksonomi tanaman sirsak sebagai berikut.

Divisio : Spermatophyta

Subdivisio: Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Ordo : Ranales

Famili : Annonaceae

8

Genus : Annona

Spesies : Annona muricata L.15

Gambar 2.1.Buah sirsak

Sumber: Sunarjono, 2005

Dua jenis sirsak yang dikenal di Indonesia yaitu sirsak manis (zoetzak) dan

sirsak asam (zuurzak). Kedua tanaman tersebut susah dibedakan dari

morfologisnya. Perbedaannya hanya dapat diketahui dari uji organoleptik (uji

rasa) atau dengan BRix. Sirsak manis umumnya mengandung gula 68 % dari total

bahan pelarut (TSS) dengan bagian daging yang dapat dimakan (edible pulp)

sebesar 67,5 %. Sirsak manis disebut juga sirsak ratu.15

2.1.2.2. Morfologi Sirsak (Annona muricata L)

Sirsak merupakan tanaman buah tropis yang bersifat tahunan (perennial).

Umurnya tidak lebih dari 20 tahun. Tanaman sirsak tersebut berbentuk semak,

tingginya tidak lebih dari 4 meter.15

a. Daun

Daun sirsak berbentuk bulat panjang dengan ujung runcing dan tepi rata.

Warna daun bagian atas hijau tua, sedangkan bawah hijau kekuningan. Daun

9

sirsak tebal dan agak kaku menyirip atau tegak pada urat daun utama.15,16

Daunnya mengandung senyawa tanin, kalsium oksalat, fitosterol, alkaloid

murisin, monotetrahidrofuran asetogenin, seperti anomurisin A dan B,

gigantetrosin A, annonasin-10-one, murikatosin A dan B, annonasin dan

goniotalamisin.17

Gambar 2.2. Daun dan batang sirsak

Sumber: Sunarjono, 2005

b. Batang

Batang sirsak umumnya kecil, tetapi agak liat sehingga tidak mudah patah.

Dibandingkan dengan pohon sirkaya, pohon sirkaya berkayu keras, bercabang

sedikit, arah cabangnya tidak menentu.15

c. Bunga

Tanaman sirsak mampu berbunga tunggal sepanjang tahun. Bunganya

besar, muncul pada ketiak daun, cabang, ranting, dan ujung cabang. Aroma bunga

sirsak tidak sedap sehingga pada saat mencari madu, lebah jarang membantu

penyerbukan. Bunga sirsak mempunyai tangkai pendek. Kelopak terdiri dari tiga

sepalum yang berukuran kecil dan tebal. Daun kelopak berwarna hijau tua sampai

hijau kekuningan.15

Daun mahkota berwarna hijau muda. Jumlah daun mahkota 4 helai, terbagi

dalam 2 lapis. Tiga daun mahkota lapis luar lebih lebar dan tebal, sedangkan tiga

daun mahkota lapis dalam lebih kecil. Daun mahkota bagian dalam berseling

dengan daun mahkota bagian luar.15

10

Bunga sirsak termasuk bunga sempurna, artinya mempunyai kelamin 2.

Jarang ada yang mempunyai kelamin 1. Bakal buah (ovarium) yang jumlahnya

banyak masing-masing mengandung bakal biji (ovulum) yang banyak juga. Bakal

buah mempunyai putik yang terdiri dari tangkai putik (stilus) dan kepala putik

(stigma). Keseluruhan organ betina ini disebut genaecium. Organ jantan

(androecium) terdiri dari benang sari (polen). Jumlah benangsari yang banyak

mengelilingi bakal buah sengan tangkai sari (filamentum) yang pendek. Tepung

sarinya berwarana kuning dan agak bergetah. Bunga sirsak kebanyakan

melakukan penyerbukan silang.15

Gambar 2.3. Bunga dan bagian-bagian bunga sirsak

Sumber: Sunarjono, 2005

d. Buah

Umumnya buah sirsak berbentuk lonjong, berduri halus, dan lunak.

Buahnya membesar dari perkembangan banyak bakal buah sehingga disebut buah

majemuk. Biji buah saling berhimpitan dan kehilangan batas antar buah. Daging

buah berwarna putih, yang dapat dimakan disebut pseudocarp. Rasa buah bisa

masam sampai manis. Biji buah yang telah tua berwarna hitam kecoklatan dan

gepeng.15,16

Daging buahnya mengandung serat dan vitamin, kandungan zat gizi

terbanyak dalam buah sirsak adalah karbohidrat.18

e. Akar

Akar tanaman ini cukup dalam, dapat menembus sampai kedalaman 2

meter. Akar sampingnya cukup banyak dan kuat sehingga baik untuk korservasi

11

lahan yang miring karena mencegah erosi.15

Akar pohon sirsak berwarna coklat

muda, bulat dengan perakaran tunggang.16

2.1.3. Annonaceous acetogenin

Annonaceous acetogenin hanya ditemukan pada famili Annonaceae.

Khasiat Annonaceous acetogenins antara lain sebagai antitumor, antiparasit,

antihelmintik, antiprotozoa, antimikroba, dan pestisidal.19

Annonaceous acetogenin merupakan suatu kelompok fitokimia yang

mengandung poliketida. Kebanyakan acetogenin adalah derivat rantai panjang

asam lemak (C32 atau C34) dan asam carboxylic terminal yang dikombinasi

dengan 2 unit propanolol pada posisi C2 untuk membentuk methylsubstituted α,β-

unsaturated-γ-lactone.20

Struktur annonaceous acetogenin adalah sebagai berikut.

Gambar 2.4. Klasifikasi annonaceous acetogenin

Sumber: Alali et al, 1999

Annonaceous acetogenin terdiri dari annocatalin, annohexocin,

annomonicin, annomontacin, annomuricatin A & B, annomuricin A thru E,

annomutacin, annonacin, (multiple iso, cis, one, etc.), annonacinone,

annopentocin A thru C, cis-annonacin, cis-corossolone, cohibin A thru D,

12

corepoxylone, coronin,corossolin, corossolone, donhexocin, epomuricenin A & B,

gigantetrocin, gigantetrocin A & B, gigantetrocinone, gigantetronenin,

goniothalamicin, isoannonacin, javoricin, montanacin, montecristin, muracin A

thru G, muricapentocin, muricatalicin, muricatalin, muri-catenol, muricatetrocin

A & B muricatin D, muricatocin A thru C muricin H, muricin I, muricoreacin,

murihexocin 3, murihexocin A thru C, murihexol, murisolin, robustocin,

rolliniastatin 1 & 2, saba-delin, solamin, uvariamicin I & IV, xylomaticin.19,21

Mayoritas annonaceous acetogenin yang ditemukan memiliki sifat

sitotoksik terhadap sel kanker dan menunjukkan aktivitas imunosupresif.

Mekanisme sitotoksik acetogenin melalui: 1) Menghambat oksidase dari NADH

di membran plasma pada sel kanker sehingga ATP yang dihasilkan akan menurun;

2) Menghambat komplek I (NADH : ubiquimone oxidoreduktase) dalam system

transport electron di mitokondria dan menghambat fosforilasi oksidasi sehingga

pertumbuhan sel kanker terhambat; 3) Menghambat sel kanker yang multidrug

resistant. Meningkatkan ekspresi dari plasma membrane pump, P-glycoprotein

yang berkontribusi terhadap multidrug resistant. Pompa meningkatkan eliminasi

dari kandungan antikanker sebelum kandungan tersebut dapat berpengaruh

terhadap sel kanker. Dua tempat ATP berikatan pada intraselular ditemukan pada

P-glycoprotein, dan aktivitas pompa membutuhkan ATP. Acetogenin, melalui

penurunan ATP, dapat menurunkan aktivitas atau mematikan pompa P-

glycoprotein; 4) Sel kanker pada siklus sel fase S lebih rentan terhadap acetogenin

annonacin. Annonacin mampu mengistirahatkan siklus sel pada fase G1 dan

menghambat progresi fase S. Annonacin juga meningkatkan ekspresi p53 dan

p21; 5) Acetogenin annonacin memicu apoptosis sel dengan cara meningkatkan

ekspresi Bax dan Bad, tetapi tidak Bcl-2 atau Bcl-xL.22

Pada studi in vitro telah diketahui bahwa acetogenin yang diisolasi dari

daun sirsak berguna melawan berbagai sel, yaitu human hepatoma hep G, prostate

adenocarcinoma PC-3, pancreatic carcinoma PACA-2, murine leukemia L1210

dan P388 leukemia, human breast adenocarcinoma MDA-MB231 dan carcinoma

MCF-7, human lung carcinoma A-549, dan human colon cancer HT-29.

Berdasarkan Nasional Cancer Institute dan Nasional Institute of Health (NIH),

annonaceous acetogenins dapat secara selektif menghambat pertumbuhan sel

13

kanker dan juga menghambat pertumbuhan sel tumor yang resisten terhadap

kemoterapi contohnya adriamycin.23

2.1.4. Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga

terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair.24

Sediaan yang

diperoleh melalui cara ekstraksi disebut ekstrak.5 Ada beberapa metode ekstraksi,

yaitu:

a. Ekstraksi dengan menggunakan pelarut, dapat dilakukan melalui 2 cara, yaitu

cara dingin dan cara panas.

Cara dingin

Maserasi

Maserasi dilakukan dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali

pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar).

Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah

dilakukan penambahan penyaringan maserat pertama, dan

seterusnya.24

Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

terjadi penyaringan sempurna yang umumnya dilakukan pada

temperatur kamar. Tahapan perkolasi terdiri dari tahapan

pengembangan bahan, maserasi antara, perkolasi sebenarnya

(penampungan ekstrak), terus-menerus sampai diperoleh ekstrak

(perkolat).24

Cara panas

Refluks

Teknik ekstraksi ini menggunakan pelarut pada temperatur titik

didihnya selama waktu tertentu dan dalam jumlah pelarut terbatas yang

relatif konstan dengan adanya pendingin balik.24

Digesti

Digesti merupakan maserasi dengan pengadukan kontinu pada

temperatur yang lebih tinggi dari temperatur kamar yaitu pada 40-50º

C.24

14

Infus

Infus menggunakan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana

infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 90ºC)

selama 15-20 menit.5,24

Dekok

Dekok hampir sama dengan infus, menggunakan temperatur sampai

titik didih air (90ºC - 98ºC), namun waktu ekstraksi selama 30

menit.5,24

Soxhlet

Sohxlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru dan

jumlah pelarut relatif konstan sehingga terjadi proses ekstraksi kontinu

dengan adanya pendingin balik. Metode ini dilakukan dengan alat

khusus.24

b. Destilasi uap

Destilasi uap adalah ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak

atsiri) dari bahan (segar atau simplisia) dengan uap air berdasarkan peristiwa

tekanan parsial senyawa kandungan menguap dengan fase uap air dari ketel secara

kontinu sampai sempurna dan diakhiri dengan kondensasi fase uap campuran

(senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi) menjadi destilat air bersama

senyawa kandungan yang memisah sempurna atau memisah sebagian.24

c. Cara ekstrak lainnya

Ekstraksi berkesinambungan

Proses ekstraksi yang dilakukan berulangkali dengan pelarut yang berbeda

atau resirkulasi cairan pelarut. Tujuan proses ini dilakukan yaitu untuk

meningkatkan efisiensi (jumlah pelarut) dan dirancang untuk sejumlah

besar bahan yang terbagi dalam beberapa bejana ekstraksi.24

Superkritikal karbondioksida

Cara ekstraksi ini pada prinsipnya menggunakan karbondioksida. Dengan

variabel tekanan dan temperatur akan diperoleh spesifikasi kondisi

polaritas tertentu yang sesuai untuk melarutkan golongan senyawa

kandungan tertentu. Mudahnya penguapan karbondioksida menyebabkan

15

penghilangan cairan pelarut mudah dilakukan, sehingga hampir langsung

diperoleh ekstrak.24

Ekstraksi Ultrasonik

Getaran ultrasonik (> 20.000 Hz) memberikan pengaruh pada proses

ekstrak dengan prinsip meningkatkan permeabilitas dinding sel,

menimbulkan gelembung spontan sebagai stress dinamik serta

menimbulkan fraksi interfase. Hasil ekstraksi tergantung pada frekuensi

getaran, kapasitas alat dan lama proses ultrasonikasi.24

Ekstraksi energi listrik

Energi listrik digunakan dalam bentuk medan listrik, medan magnet serta

electric-discharges yang dapat mempercepat proses dan meningkatkan

hasil dengan prinsip menimbulkan gelembung spontan dan menyebarkan

gelombang tekanan berkecepatan ultrasonik.24

2.1.5. Uji Toksisitas

Pengujian toksisitas biasanya dibagi menjadi tiga kelompok:

a. Uji toksisitas akut

Uji ini dilakukan dengan memberikan zat kimia yang sedang diuji sebanyak

satu kali atau beberapa kali dalam jangka waktu beberapa jam.25

b. Uji toksisitas jangka pendek (subkronis)

Uji ini dilakukan dengan memberikan zat kimia tersebut berulang-ulang,

biasanya setiap hari atau 5 kali seminggu, selama jangka waktu kurang lebih

10 % masa hidup hewan, yaitu 3 bulan untuk tikus dan 1 atau 2 tahun untuk

anjing. Namun, beberapa peneliti menggunakan jangka waktu yang lebih

pendek, misalnya pemberian zat kimia selama 14 dan 28 hari.25

c. Uji toksisitas jangka panjang (kronis)

Percobaan jenis ini mencakup pemberian zat kimia secara berulang selama 3-6

bulan atau seumur hidup hewan, misalnya 18 bulan untuk mencit, 24 bulan

untuk tikus, dan 7-10 tahun untuk anjing dan monyet. Memperpanjang

percobaan kronis lebih dari 6 bulan tidak akan bermanfaat, kecuali untuk

percobaan karsinogenik.25

16

Uji toksisitas jangka panjang salah satu contohnya yaitu penelitian

teratogenik. Penelitian teratogenik dapat berlangsung terus sampai beberapa

generasi. Penelitian ini umumnya dilakukan pada 2 jenis spesies binatang,

masing-masing minimal selama 90 hari, dengan menggunakan sedikitnya 3

tingkatan dosis, satu di antaranya untuk menentukan level (tingkatan) dosis

terkecil yang memberikan efek toksik. Penggunaan binatang lebih dari satu

spesies dimaksudkan untuk dapat meliputi semua reaksi atau efek samping yang

tidak terlihat pada satu spesies, mungkin terlihat pada spesies lain.26

Berbeda dengan percobaan toksisitas akut yang terutama mencari efek

toksik, maksud utama percobaan toksisitas kronis ialah menguji keamanan obat.

Penafsiran keamanan obat untuk manusia dapat dilakukan melalui serangkaian

percobaan toksisitas terhadap hewan. Dikatakan penafsiran karena data dari

hewan tidak dapat diekstrapolasikan begitu saja tanpa mempertimbangkan segala

faktor yang membedakan antara hewan dan manusia.25

2.1.6. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan salah satu metode untuk

menguji bahan-bahan yang bersifat toksik dan digunakan sebagai suatu bioassay

yang pertama untuk penelitian bahan alam9 dan sebagai agen antitumor, pestisida,

dan skrining ekstrak tumbuhan untuk aktivitas farmakologi.27

Uji toksisitas

dengan metode BSLT ini merupakan uji toksisitas akut. Prosedurnya dengan

menentukan nilai LC50 dari aktivitas komponen aktif tanaman terhadap larva

Artemia salina Leach.9

Teknik ini cepat, sederhana (tindakan aseptik tidak diperlukan), mudah,

tidak mahal, dan menggunakan sejumlah kecil material uji (2-20 mg atau kurang).

BSLT digunakan untuk memprediksi aktivitas toksisitas dan pestisidal.29

Korelasi

positif ditunjukkan antara toksisitas BSLT dengan aktivitas antitumor dari

tanaman27

dan sitotoksisitas pada sel 9 KB (karsinoma nasofaringeal manusia)

dan tumor solid lain, seperti pada sel P388 (leukemia in vivo).28

Beberapa kelebihan dari uji toksisitas dengan BSLT diantaranya:

17

a. Metode penapisan farmakologi awal yang mudah, cepat, dan relatif tidak

mahal

b. Metode yang telah teruji hasilnya dengan tingkat kepercayaaan 95 %

untuk mengamati toksisitas suatu senyawa dalam ekstrak kasar tumbuhan.

c. Metode ini sering digunakan dalam tahap awal isolasi senyawa toksik

yang terkandung dalam suatu ekstrak.

d. Metode ini sering dihubungkan sebagai metode penapisan untuk mencari

senyawa antikanker dari tumbuhan.29

BSLT menggunakan larva (nauplia) Artemia salina Leach digunakan

sebagai hewan coba. Jumlah kematian larva dihitung setelah 24 jam perlakuan dan

hasilnya dinilai sebagai LC50 atau LD50, dosis yang dibutuhkan untuk membunuh

50 % larva.30

Tolak ukur atau parameter yang digunakan untuk menunjukkan

adanya aktivitas biologi suatu senyawa pada Artemia salina Leach yaitu dengan

menghitung jumlah kematian larva udang akibat pemberian senyawa dengan

konsentrasi yang telah ditetapkan. Hasil uji dikatakan efektif terhadap larva

Artemia salina Leach apabila ekstrak yang diujikan menyebabkan 50 % kematian

pada kurang dari 1000 ppm.29

Apabila suatu ekstrak tanaman bersifat toksik

menurut harga LC50 dengan metode BSLT, maka tanaman tersebut dapat

dikembangkan sebagai obat antikanker. Hal ini disebabkan karena terdapat

hubungan antara sitotoksisitas dan BSLT pada ekstrak tanaman yang diteliti.31

2.1.7. Artemia salina Leach

2.1.7.1. Taksonomi Artemia salina Leach

Artemia adalah jenis Crustacea tingkat rendah dari phyilum Arthropoda

yang banyak mengandung nutrisi terutama protein dan asam-asam amino. Dalam

dunia hewan Artemia atau brine shrimp adalah merupakan makrozooplankton

yang diklasifikasikan dalam:

Kingdom : Animalia

Philum : Arthropoda

Kelas : Crustacea

18

Sub kelas : Branchiopoda

Ordo : Anostraca

Famili : Artemiidae

Genus : Artemia

Species : Artemia salina (Linnaeus, 1758)32

Gambar 2.5. Artemia salina

Sumber: Dumitrascu M, 2011

2.1.7.2. Ekologi Spesies

Artemia salina hanya hidup di danau dan kolam dengan salinitas tinggi

(antara 60-300 ppt). Spesies ini endemik di Mediterranean, tapi dapat ditemukan

di seluruh benua. Dapat mentolerir garam dalam jumlah besar (300 g/L air) dan

dapat hidup dalam larutan yang berbeda dari air laut, seperti kalium permanganat

dan perak nitrat, sedangkan yodium berbahaya bagi spesies ini. Hewan ini mampu

mengurangi tekanan osmotik hemolimf dengan ekskresi NaCl melawan gradien

konsentrasi. Keadaan ini bertujuan untuk menjaga hemolimf hipotonik ekstrim

dalam konsentrasi garam yang ekstrim. Pertahanan lain dilakukan Artemia salina

dalam air dengan defisiensi oksigen yang tinggi. Konsentrasi minimum oksigen

untuk Artemia salina dewasa sangat rendah (0,5 mg/L) dan untuk nauplia kurang

dari 0,3 mg/L.32

2.1.7.3. Deskripsi

19

Tubuhnya dibagi menjadi 3 segmen: kepala, thorax, dan abdomen. Hewan

jantan dewasa mempunyai panjang 8-10 mm, sedangkan pada betina 10-12 mm.

Artemia salina dewasa mempunyai 3 mata dan 11 pasang kaki. Dalam kondisi

alami, pangan Artemia salina berupa algae, protozoa, dan detritus. Partikel yang

kurang dari 40-60 mm akan dilepaskan oleh filter aktif non-selektif yang dimiliki

oleh Artemia salina.32

Artemia salina jantan memiliki 2 organ reproduksi. Uterus dari Artemia

salina betina berisi hingga 200 telur, baik pada spesies ovipar maupun ovovivipar.

Mereka memproduksi telur, yang mengapung dalam air dan dapat berkembang

menjadi nauplia (larva) atau kista jika lingkungan tidak menguntungkan

(kekeringan air). Kista adalah bentuk dorman dari hewan ini, yang akan bertahan

lama dalam keadaan kering. Kista akan menetas menjadi nauplia jika kondisi

lingkungan memungkinkan.32

2.1.7.4. Siklus Hidup

Cara reproduksi Artemia salina dikontrol oleh faktor lingkungan yaitu

konsentrasi oksigen di air dan fluktuasinya, tipe pangan, kadar garam, dan

lainnya (tabel 2.2.). Kadar garam/salinitas pada ovovivipar kurang dari 150 ppt,

sedangkan pada ovipar antara 150-200 ppt.32

Tabel 2.2. Modalitas reproduksi Artemia salina

Reproduksi

Ovipar Ovovivipar

Kandungan O2 rendah (seperti

dalam kadar garam/salinitas tinggi)

Kandungan O2 tinggi (seperti dalam

kadar garam/salinitas rendah)

Fluktuasi O2 kuat Fluktuasi O2 rendah

Pangan kaya Fe (seperti alga hijau) Pangan rendah Fe (seperti debris

organik)

Sumber: Dumitrascu M, 2011

Pada reproduksi ovipar, setelah kopulasi, telur yang sudah difertilisasi

berkembang menjadi tahap gastrula dan dikelilingi oleh kulit cokelat yang kuat,

berisi kitin, lipoprotein, dan lain-lain. Kista yang terbentuk kemudian dilepaskan

ke dalam air. Kista menjadi larva bebas ketika proses pengeringan awal terjadi.32

20

Pada reproduksi ovovivipar, telur yang difertilisasi berkembang menjadi

gastrula, lalu gastrula berdiferensiasi menjadi tubuh betina yang disebut nauplia.

Telur menetaskan nauplia akan berwarna putih dan bersirip.32

Kista (0,2-0,3 mm) menjadi nauplia (0,45 mm) dalam waktu 24-36 jam.

Hidrasi lengkap kista membutuhkan waktu 1 jam. Nauplia kemudian menjadi

kista dewasa (maksimal 13 mm) dalam waktu 3 minggu tergantung ketersediaan

pangan. Kista dapat bertahan hidup pada kondisi ekstrim hingga mencapai suhu

80°C. Kista terhidrasi mati pada suhu dibawah 0°C dan di atas 40°C. Kista

terhidrasi berukuran 200-270 μm dan berat 3,5 μg. Kista juga memiliki

kemampuan bertahan ketika berkontak dengan cairan agresif, kondisi kering yang

ekstrim, kekurangan oksigen dan pengaruh pestisida. Kista tidak akan menetas

jika salinitas yang lebih tinggi dari 70 ppt. Pada salinitas kurang dari 5 ppt kista

akan menetas, tapi nauplia akan mati dengan cepat. Analisis karbon menunjukkan

bahwa umur kista radiaktif dapat mencapai 10.000 tahun.32

Nauplia tumbuh optimal pada 28°C dan 35 ppt. Sedangkan suhu letal yang

menyebabkan kematian nauplia yaitu 0°C dan 37-38°C. Nauplia mempunyai 1

mata (fotoreseptor) yang akan berkembang menjadi 3 mata. Nauplia berenang

melalui kolom air (fototaksis) menggunakan antena. Namun Artemia salina

dewasa tidak bersifat fototaksis. Rahang nauplia digunakan untuk menyaring air

dan fitoplankton.32

Gambar 2.6. Karakteristik anatomi nauplia Artemia salina

Sumber: Dumitrascu M, 2011

Larva (nauplia) akan mengalami 15 kali metamorfosis. Larva tingkat 1

dinamakan instar I, larva tingkat 2 dinamakan instar II, demikian seterusnya

21

sampai instar XV. Larva yang baru saja menetas atau instrar I berbentuk bulat

lonjong dengan panjang sekitar 400 μm dan berat 15 μg. Instar II panjangnya

sekitar 600 μm, sedangkan instar III sudah sepanjang 700 μm. Pada awalnya

nauplia berwarna kemerah-merahan karena masih banyak mengandung cadangan

makanan. Selain itu, pada fase tersebut, mulut dan anusnya belum terbentuk

sempurna sehingga larva pada fase instar I tidak makan. Setelah 24 jam menetas

larva akan berubah menjadi instar II dimana pada fase ini larva akan memulai

mencari makanan untuk memenuhi cadangan makanan yang mulai berkurang.

Pada tingkat instar II, larva sudah memiliki mulut dan saluran pencernaan.33,34

Artemia salina dewasa berenang menggunakan anggota badan. Artemia

salina dewasa mempunyai 1 mata di bagian tengah, 2 mata lateral, otak sederhana

berbentuk seperti cincin yang mengelilingi mulutnya. Selain itu, Artemia salina

dewasa memiliki satu mata di bagian tengah disertai dua mata di bagian lateral,

panjang jantan 8-10 mm dan panjang betina 10-12 mm serta memiliki warna yang

bervariasi tergantung pada konsentrasi garam dalam air dari green tored (merah

pada konsentrasi tinggi).32

Gambar 2.7. Karakteristik anatomi Artemia salina dewasa

Sumber: Dumitrascu M, 2011

2.1.7.5. Alasan Penggunaan Artemia salina Leach sebagai Hewan Uji

Artemia salina Leach sangat rentan terhadap toksin pada fase awal

pertumbuhannya, terutama saat fase instar I dan II.35

Artemia salina Leach

digunakan sebagai hewan uji dalam BSLT karena memiliki respon terhadap

senyawa kimia yang mirip dengan mamalia, misalnya DNA-dependent RNA

polymerase dan organisme ini memiliki sebuah ouabaine-sensitive Na+ dan K

+

dependent ATPase. DNA-dependent RNA polymerase berguna dalam pemisahan

kedua untai DNA dan menggabungkan nukleotida-nukleotida RNA saat

22

membentuk pasangan basa di sepanjang cekatan DNA. Jika suatu senyawa

menghambat proses ini, maka DNA tidak dapat mensintesis RNA sehingga

sintesis protein terganggu. Jika protein tidak terbentuk, maka metabolisme sel

tidak berlangsung sehingga menyebabkan kematian Artemia.36

Sedangkan Na+

dan K+

dependent ATPase merupakan enzim yang menghidrolisis ATP menjadi

ADP dan menggunakan energi untuk mengeluarkan 3 Na+ ke luar sel dan

mengambil 2 K+ ke dalam sel. Ouabaine memiliki fungsi menginhibisi dari Na

+

dan K+ dependent ATPase dan berperan dalam proliferasi sel. Apabila ada

senyawa yang mempengaruhi oubaine, maka dapat menyebabkan proliferasi sel

terganggu sehingga dapat menyebabkan kematian sel dari Artemia salina

Leach.37,38

Artemia salina Leach memiliki respon stress yang sama dengan manusia.

Respon terhadap situasi yang penuh tekanan (stressful) memberikan keuntungan

pada kemampuan bertahan, reproduksi, perilaku pada hewan. Jumlah stressor dan

pengaruh stress pada Artemia relatif sederhana, walaupun begitu, Artemia

memiliki lingkungan yang multidimensi. Lingkungan fisik dan budaya manusia

memiliki perkembangan yang lebih cepat daripada adaptasi mereka, sehingga

respon maladaptif atau penyakit terjadi. Seperti Artemia, otak memiliki peran

merespon stressor perilaku dan fisiologis. Artemia juga memiliki kemampuan

mengenali dan memilih teman untuk menjaga adaptasi ekologi, seperti yang

terlihat pada manusia.39

Selain itu fisiologi Artemia salina Leach yaitu sistem saraf pusat, sistem

pencernaan, mata, dan sistem vaskular mirip dengan yang dimiliki oleh manusia.40

Artemia juga memiliki membran kulit yang tipis sehingga kematian akibat

sitotoksik dari senyawa bioaktif dianalogikan dengan kematian sel dalam

organisme.41

Artemia salina Leach digunakan secara luas untuk uji toksisitas karena

ketersediaan telur dorman (kista) dapat dipanen dalam jumlah besar di danau

garam.42

Telur ini dapat hidup dalam kondisi kering selama bertahun-tahun, dan

mudah menetas dalam 48 jam.43

23

2.1.8. Pelarut

Metanol, etanol, tween 20, dan DMSO (dimethyil sulfoxide) adalah pelarut

yang digunakan secara luas untuk BSLT. DMSO digunakan secara luas sebagai

pelarut ekstrak tumbuhan. Metanol dan etanol juga digunakan untuk melarutkan

sejumlah besar senyawa kimia pada produk alam. Namun albumin, sukrosa,

lemak, dan minyak tidak terlarut dalam metanol dan etanol. Tween 20 sangat

berguna untuk melarutkan minyak atsiri dan substansi minyak lain dalam ekstrak

tumbuhan.44

Kematian larva Artemia salina awalnya terlihat pada konsentrasi 2,5 %

pada DMSO dan metanol, 1,25 % pada etanol, dan 3,125 % pada Tween 20. Jika

konsentrasi ditambah, maka semua larva akan mati secepatnya. Hal ini terjadi saat

konsentrasi 2,5 % pada Tween 20 dan etanol, 5 % pada metanol, dan 10 % pada

DMSO. Konsentrasi tinggi dari pelarut tersebut mungkin toksik bagi hewan uji

sehingga menimbulkan hasil positif palsu. LC50 untuk masing-masing pelarut

yaitu 8,5 % (DMSO), 6,4 % (metanol), 3,4 % (etanol), dan 2,5 % (Tween 20).

Tingkat toksisitas berdasarkan hasil tersebut diurutkan menjadi: Tween 20 >

etanol > metanol > DMSO. DMSO merupakan pelarut yang lebih aman

dibandingkan dengan pelarut lain, sedangkan Tween 20 merupakan pelarut paling

keras diantara 3 pelarut lain.44

Konsentrasi toleransi maksimum untuk melarutkan sampel uji yaitu 1,25%

untuk DMSO, metanol dan etanol serta 0,16% untuk Tween 20. Menggunakan

pelarut di bawah konsentrasi toleransi maksimum tidak memberikan hasil positif

palsu.44

24

2.2. Kerangka Teori

Ekstrak metanol daun sirsak (Annona muricataL) L)

Mengandung annonaceous acetogenin

Menghambat

oksidase dari

NADH

Menghambat

kompleks I

dalam system

transport

electron dan

fosforilasi

oksidatif

Mengistirahat-

kan siklus sel

pada fase G1

Memicu

apoptosis

sel

ATP yang

dihasilkan ↓

↑ ekspresi

Bax dan

Bad

Pertumbuhan sel terhambat

Kematian sel

Kematian larva

Artemia salina Leach

Diketahui dengan menggunakan

pengujian toksisitas

Uji toksisitas

akut

Uji toksisitas

subkronis

Uji toksisitas

kronis

Menggunakan

metode BSLT Menggunakan hewan uji yang lebih

besar dari larva Artemia salina

Leach, antara lain tikus atau mencit

25

2.3. Kerangka Konsep

Ekstrak metanol daun sirsak (Annona muricataL) L)

Memiliki senyawa yang berpotensi bioaktivitas

Uji toksisitas akut dengan metode BSLT

Kematian larva Artemia salina Leach setelah

perlakuan 24 jam

Nilai LC50

26

2.4. Definisi Operasional

No. Variabel Definisi Cara Ukur Alat

Ukur

Skala Ukur Hasil

Ukur

1. Konsentrasi

ekstrak

metanol daun

Annona

muricata L

Konsentrasi

ekstrak dalam

ppm (1 μg/ml)

V1M1= V2M2 - Numerik 15 ppm

10 ppm

5 ppm

2,5 ppm

2. Persentase

mortalitas

larva Artemia

salina Leach

Hasil

perhitungan

total larva

yang mati

dibagi jumlah

larva awal

dikali 100%

untuk tiap

replikasi

Jumlah larva

mati dibagi

jumlah larva

awal dikali

100%

- Numerik Persen-

tase

kematian

larva

3. LC50 Konsentasi

yang diberikan

sekali

(tunggal) atau

beberapa kali

dalam 24 jam

dari suatu zat

yang secara

statistik dapat

mematikan

50% hewan uji

Dihitung dari

persamaan

garis lurus

y=mX+b

dengan

memasukkan

nilai 5 (probit

dari 50%

kematian

hewan uji)

sebagai y

sehingga

dihasilkan x

sebagai nilai

log konsentrasi

- Kategorik LC50 <

1000

ppm

maka

senyawa

toksik.

LC50 >

1000

ppm

maka

senyawa

tidak

toksik

27

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan pendekatan

post test-only control group design untuk menguji toksisitas akut ekstrak

metanol daun sirsak (Annona muricata L) terhadap larva Artemia salina

Leach menggunakan metode BSLT.

3.2. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari 2015 sampai bulan

Agustus 2015 di Laboratorium Penelitian 1, Laboratorium Fakmakognosi &

Fitokimia, Laboratorium Biologi, dan Laboratorium Farmakologi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3.3. Populasi dan Sampel

3.3.1. Populasi

Populasi penelitian ini adalah larva Artemia salina Leach.

3.3.2. Sampel

3.3.2.1. Kriteria Inklusi:

Larva Artemia salina Leach hidup, berumur 48 jam, dan bergerak

aktif sebagai hewan uji.

3.3.2.2. Kriteria Eksklusi:

Larva Artemia salina Leach yang tidak menunjukkan aktivitas

pergerakan sebelum perlakuan.

3.3.3. Besar Sampel

Larva Artemia salina Leach yang digunakan berjumlah 10 ekor

tiap konsentrasi ekstrak. Pada penelitian ini dibuat empat konsentrasi

ekstrak metanol daun sirsak (Annona muricata L) dan satu kontrol negatif.

Setiap konsentrasi dan kontrol negatif dilakukan triplo. Jadi, jumlah total

28

sampel yang diperlukan adalah 150 ekor larva Artemia salina Leach tiap

kali perlakuan.

3.3.4. Cara Pengambilan Sampel

Cara pengambilan sampel pada penelitian ini adalah dengan

purposive random sampling terhadap larva Artemia salina Leach. Larva

Artemia salina Leach mempunyai kesempatan yang sama untuk diseleksi

sebagai sampel karena populasinya telah homogen, cara dan jenis

penyediaannya sama.

3.4. Determinasi Tanaman

Identifikasi terhadap daun sirsak (Annona muricata L) untuk

mengetahui identitas taksonominya di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun

Raya Bogor, LIPI.

3.5. Bahan yang Diuji

Bahan yang diuji adalah daun sirsak (Annona muricata L) yang

didapatkan dari kebun rumah warga di desa Tinggarjaya, kecamatan

Jatilawang, Banyumas, Jawa Tengah yang akan diekstraksi dengan

menggunakan pelarut metanol.

3.6. Alat dan Bahan Penelitian

3.6.1. Alat Penelitian

a. Neraca analitik

b. Tabung reaksi

c. Erlenmeyer

d. Gelas beker

e. Mikropipet

f. Rotary evaporator

g. Corong kaca

h. Pipet tetes

i. Cawan penguap

29

j. Bejana kaca maserasi

k. Batang pengaduk

l. Spatula

m. Oven

n. Hot plate stirrer

o. pH indicator paper

p. Seperangkat alat penetasan udang (wadah plastik, lakban hitam,

sterofoam, aluminium foil, lampu)

q. Well plate

3.6.2. Bahan Penelitian

a. Air laut

b. Akuades

c. Daun basah Annona muricata L

d. Pelarut metanol

e. Kertas saring

f. Telur Artemia salina Leach

g. DMSO

3.7. Cara Kerja Penelitian

3.7.1. Persiapan dan Pembuatan Simplisia

Daun sirsak yang didapatkan dari kebun warga daerah di desa

Tinggarjaya, kecamatan Jatilawang, Banyumas, Jawa Tengah dilakukan

determinasi dahulu di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor,

LIPI untuk mengetahui spesiesnya. Setelah itu, 2 kg daun sirsak diambil,

disortir, serta dibersihkan. Daun sirsak yang telah dibersihkan kemudian

dibawa ke Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (Balitro) untuk

dikeringkan dan dihaluskan menjadi serbuk simplisia halus yang beratnya

572 gram. Serbuk simplisia disimpan pada suhu kamar (15-30°C).5

3.7.2. Pembuatan Ekstrak Daun Sirsak (Annona muricata L)

Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah

maserasi. Serbuk simplisia halus 572 gram dimasukkan ke dalam bejana

30

kaca maserasi, lalu direndam dalam pelarut metanol yang sebelumnya

didestilasi. Perendaman ini dilakukan selama 3 hari. Sesekali dilakukan

pengadukan dan pengocokkan agar pelarut masuk ke seluruh permukaan

serbuk simplisia. Setelah 3 hari, hasil rendaman kemudian disaring dengan

menggunakan kertas saring. Hal ini dilakukan untuk memisahkan filtrat

dan ampasnya. Selanjutnya filtrat diambil dan ditampung. Ampas daun

dimaserasi kembali, hingga larutan daun sirsak menjadi agak bening.34

Filtrat kemudian ditampung dan dipekatkan dengan rotary evaporator pada

suhu 45°C sehingga didapatkan ekstrak metanol daun sirsak. Setelah 10

kali proses maserasi, didapatkan ekstrak metanol. Untuk memperoleh

ekstrak yang benar-benar kental, maka dikeringkan menggunakan oven

dengan suhu 40°C selama 7 hari45

sehingga didapatkan ekstrak kental

sebanyak 57 gram.

3.7.3. Penetasan Larva Udang

Penetasan larva udang dilakukan di dalam wadah plastik.

Sebelumnya, wadah plastik dibagi menjadi bagian terang dan gelap, lalu

diberi pembatas berupa sterofoam yang tepi bawahnya telah dilubangi agar

telur yang menetas bisa keluar dari lubang tersebut. Wadah lalu diisi

dengan air laut hingga kedua lubang pada sterofoam tersebut terendam.

Pada ruang gelap, diisi 1 sendok telur, kemudian ditutup dengan

menggunakan lakban hitam dan aluminium foil. Pada ruang terang diberi

penerangan menggunakan cahaya lampu neon untuk merangsang

penetasan. Selain itu, pada ruang terang juga dipasang aerator untuk

memberikan oksigen pada telur yang menetas menjadi larva dan berpindah

ke ruang terang. Setelah telur menetas menjadi larva yang berusia 24 jam,

kemudian dipindahkan ke wadah lain hinga berusia 48 jam. Larva yang

berusia 48 jam dapat dijadikan sebagai hewan uji dalam percobaan BSLT.29

31

3.7.4. Persiapan Larutan Sampel yang Akan Diuji

Sebelum menentukan konsentrasi ekstrak yang efektif untuk

membunuh Artemia salina Leach, uji orientasi (trial) dilakukan terlebih

dahulu. Uji orientasi bertujuan untuk menentukan presentase kematian 10

%-90 % kematian hewan uji, dengan konsentrasi 1000 ppm, 500 ppm, 250

ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, dan 10 ppm.45

Larutan induk dibuat dari

200 mg ekstrak yang ditimbang menggunakan neraca analitik. Lalu

dilarutkan dengan DMSO 2 mL dan ditambah akuades hingga volumenya

mencapai 100 mL sehingga didapatkan konsentrasi larutan induk 2000

ppm. Larutan diaduk dengan menggunakan hot plate strirrer agar

homogen.

Setelah didapatkan larutan induk 2000 ppm, dilakukan

pengenceran untuk mendapatkan larutan uji dengan konsentrasi 1000 ppm,

500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, dan 10 ppm. Setelah

didapatkan konsentrasi dengan presentase kematian 10 %-90 %, dilakukan

pembuatan larutan uji sebenarnya dengan konsentrasi 30 ppm, 20 ppm, 10

ppm dan 5 ppm. Rumus pengencerannya sebagai berikut:

V1M1 = V2M2

V1 = volume awal

M1 = konsentrasi awal

V2 = volume akhir

M2 = konsentrasi akhir

3.7.5. Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT

Masing-masing well plate diisi dengan 1 mL larutan uji dan 1 mL

air laut dengan menggunakan mikropipet sehingga volumenya menjadi 2

mL. Karena ditambahkan air laut 1 mL, konsentrasi dalam well plate

menjadi setengah kalinya, yaitu 15 ppm, 10 ppm, 5 ppm, dan 2,5 ppm. 10

larva Artemia salina Leach dimasukkan pula pada masing-masing well

plate. Kontrol negatif berisi 2 mL air laut dan 10 larta Artemia salina

Leach, tanpa larutan uji. Untuk setiap larutan uji dan kontrol negatif

dilakukan triplo (3 kali pengulangan).28

32

Tabel 3.1. Data konsentrasi ekstrak pada well plate

Konsentrasi 15

ppm

Konsentrasi 10

ppm

Konsentrasi 5

ppm

Konsentrasi 2,5

ppm

Kontrol

negatif

1. 1 mL ekstrak

30 ppm+1 mL

air laut+10

larva

1 mL ekstrak

20 ppm+1 mL

air laut+10

larva

1 mL ekstrak 10

ppm+1 mL air

laut+10 larva

1 mL ekstrak 5

ppm+1 mL air

laut+10 larva

2 mL air

laut+10 larva

2. 1 mL ekstrak

30 ppm+1 mL

air laut+10

larva

1 mL ekstrak

20 ppm+1 mL

air laut+10

larva

1 mL ekstrak 10

ppm+1 mL air

laut+10 larva

1 mL ekstrak 5

ppm+1 mL air

laut+10 larva

2 mL air

laut+10 larva

3. 1 mL ekstrak

30 ppm+1 mL

air laut+10

larva

1 mL ekstrak

20 ppm+1 mL

air laut+10

larva

1 mL ekstrak 10

ppm+1 mL air

laut+10 larva

1 mL ekstrak 5

ppm+1 mL air

laut+10 larva

2 mL air

laut+10 larva

Setelah 24 jam, dihitung jumlah larva yang mati pada masing-

masing well plate.28

Penghitungan dilakukan dengan menggunakan lup,

digital colony counter, atau dibawah penerangan lampu. Larva yang mati

diketahui dari tidak adanya pergerakan selama pengamatan.45

33

3.8. Alur Penelitian

Gambar 3.1. Bagan Alur Penelitian

Determinasi tanaman

2 kg daun Annona muricata L

572 gram simplisia halus daun

Annona muricata L

10 kali maserasi dengan pelarut metanol

yang sebelumnya didestilasi

57 gr ekstrak kental metanol daun

Annona muricata L

Larutan induk 2000 ppm (200 mg ekstrak kental

Annona muricata L dilarutkan dalam 2mL

DMSO+98 mL akuades)

Penetesan larva Artemia

salina Leach

Larva Artemia salina Leach

yang berumur 48 jam

Pengambilan larva

secara random

Uji orientasi dengan konsentrasi 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50

ppm, 25 ppm, 10 ppm, dan kontrol negatif

Setiap konsentrasi dilakukan 3 kali replikasi (triplo)

Setelah 24 jam pemberian ekstrak, dilakukan perhitungan dan persentase larva yang mati

Pembuatan larutan uji yang sebenarnya dengan konsentrasi 15

ppm, 10 ppm, 5 ppm, dan 2,5 ppm

Ulangi langkah sebelumnya (dilakukan triplo dan perhitungan larva yang mati)

Perhitungan nilai LC50 dengan analisis probit

34

3.9. Pengolahan dan Analisis Data

Menentukan presentase kematian larva untuk setiap konsentrasi

dengan cara sebagai berikut:

Pada metode analisis probit manual, nilai probit diketahui dengan

mengkonversi nilai persen kematian larva tiap konsentrasi ke nilai probit

dalam tabel. Dilanjutkan dengan menentukan log konsentrasi dan membuat

persamaan garis lurus y = mx+b, dengan y adalah nilai probit dan x adalah log

konsentrasi.46

Nilai m (slope) dihitung menggunakan rumus:

–

Nilai b (intersept) dihitung menggunakan rumus:

Metode analisis dapat juga menggunakan Microsoft Office Excel

dengan membuat grafik persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit

dengan log konsentrasi. Nilai LC50 dapat dihitung dari persamaan garis lurus

itu dengan memasukkan nilai 5 sebagai y. Nilai 5 didapatkan berdasarkan nilai

probit 50 % kematian hewan uji. Lalu dihasilkan nilai x sebagi log

konsentrasi. Nilai LC50 merupakan antilog nilai x tersebut.46

35

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Ekstraksi Daun Annona muricata L

Penelitian ini menggunakan daun Annona muricata L. Sebelumnya daun

tersebut dideterminasi terlebih dahulu untuk menghindari kesalahan dalam

pengambilan spesies tanaman. Dari hasil determinasi, diperoleh bahwa spesies

yang digunakan oleh peneliti sudah benar. Daun yang digunakan diperoleh dari

kebun seorang warga di desa Tinggarjaya, kecamatan Jatilawang, Banyumas,

Jawa Tengah sebanyak 2 kg basah. Daun yang sudah disortir dan dikeringkan,

kemudian dihaluskan sehingga didapatkan serbuk simplisia halus. Semakin halus

serbuk simplisia, maka semakin mudah proses ekstraksi. Sehingga lebih mudah

dalam penarikan zat aktif dalam pengambilan simplisia tersebut. Namun tingkat

kehalusan yang terlalu tinggi menyebabkan proses pemisahan antara ekstrak dan

pelarut semakin sulit.25

Serbuk simplisia yang didapatkan dari pengeringan dan penghalusan

dengan berat 572 gram kemudian digunakan untuk proses maserasi. Ekstraksi

dilakukan dengan metode maserasi. Maserasi dipilih karena mudah dilakukan dan

dalam tahapannya tidak melalui proses pemanasan sehingga menghindari

kerusakan dari zat aktif yang dikandung oleh simplisia.34

Ketika simplisia

terendam dalam pelarut metanol, penyari akan menembus dinding sel dan masuk

ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif sehingga zat aktif menjadi larut.

Hal ini dikarenakan adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam dan di

luar sel. Bejana kaca maserasi harus terlindung dari cahaya untuk mencegah

reaksi yang dikatalisis cahaya atau terjadi perubahan warna dan tertutup sempurna

agar cairan penyari tidak menguap sehingga penyarian dapat maksimal.47

Pelarut yang digunakan pada penelitian ini adalah metanol. Metanol yang

digunakan sebelumnya didestilasi terlebih dahulu untuk mengurangi faktor

pengotor sehingga yang digunakan untuk merendam simplisia dalam proses

maserasi adalah metanol murni dari hasil destilasi. Metanol sangat mudah

36

menguap pada titik didihnya yaitu 64,7°C48

sehingga saat filtrat dievaporasi,

metanol akan menguap dan terpisah dengan zat aktif daun sirsak yang ditarik saat

perendaman. Ekstrak kental metanol daun Annona muricata L diperoleh dari

filtrat maserasi yang dipekatkan menggunakan rotary evaporator, lalu diuapkan di

dalam oven dengan suhu 40°C selama 7 hari. Hal ini dilakukan untuk

menghilangkan pelarut yang masih tersisa.

Ekstrak kental metanol daun Annona muricata L didapatkan sebanyak 57

gram setelah melalui 10 kali proses maserasi. Dari ekstrak kental tersebut dibuat

larutan konsentrasi ekstrak untuk uji BSLT. Lautan pertama yang dibuat adalah

larutan induk dengan konsentrasi 2000 ppm sebanyak 100 mL. Ekstrak kental

yang dibutuhkan dalam sekali pembuatan larutan induk adalah 0,2 gram atau 200

mg. Untuk mempermudah melarutkan ekstrak dalam akuades, ditambahkan

DMSO ( dimetilsulfoksida) sebanyak 2 mL. Pemilihan DMSO untuk membantu

kelarutan ekstrak dalam akuades karena DMSO sifatnya tidak terlalu toksik.49

Kematian larva Artemia salina Leach mulai terlihat pada konsentrasi 2,5 % untuk

DMSO,44

sedangkan pada penelitian ini digunakan DMSO dengan kadar 2 %.

Sehingga pada penelitian ini, kematian larva tidak dipengaruhi oleh konsentrasi

DMSO.

4.2. Hasil Uji Toksisitas Akut dengan Metode BSLT

Uji toksisitas dengan menggunakan metode BSLT merupakan uji

toksisitas akut dimana efek toksik dari suatu senyawa dapat ditentukan dalam

waktu singkat, yaitu rentang waktu 24 jam setelah pemberian dosis.9 Metode

BSLT dipilih karena efek toksik dari suatu senyawa dapat ditentukan dalam waktu

singkat, mudah dikerjakan, murah, cukup akurat, hanya membutuhkan sejumlah

kecil material uji,9,10

hasilnya memiliki korelasi dengan aktivitas antikanker, dan

memiliki tingkat kepercayaan hingga 95 %.8

Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini yaitu larva Artemia salina

Leach yang berusia 48 jam karena memiliki saluran pencernaan yang terbentuk

lengkap sehingga peka terhadap suatu zat yang dimasukkan.33

Artemia salina

Leach digunakan sebagai hewan uji dalam BSLT karena memiliki respon terhadap

37

senyawa kimia yang mirip dengan mamalia, misalnya DNA dependent RNA

polymerase dan organisme ini memiliki sebuah ouabaine-sensitive Na+ dan K

+

dependent ATPase.36

Proses penetasan telur menjadi larva membutuhkan lampu

agar larva bergerak ke tempat yang terang sebab larva bersifat fototaksis. Selain

itu, proses penetasan juga membutuhkan aerator sebagai sumber oksigen.50

Untuk mencari nilai LC50 yang akurat, perlu dipilih beberapa dosis yang

mematikan sekitar 50 %, lebih dari 50 %, dan kurang dari 50 %. Oleh karena itu,

uji orientasi (trial) dilakukan terlebih dahulu untuk menentukan konsentrasi

larutan uji sebenarnya yang akan digunakan. Setelah uji orientasi dilakukan,

diperoleh konsentrasi larutan uji yang digunakan yaitu 30 ppm, 20 ppm, 10 ppm,

dan 5 ppm. Selain itu dibuat kontrol negatif berupa air laut dan larva udang tanpa

adanya penambahan ekstrak untuk menguji pengaruh air laut maupun faktor lain

yang berpengaruh terhadap kematian larva. Sehingga dapat dipastikan bahwa

kematian larva hanya karena pengaruh ekstrak yang ditambahkan.

Penelitian ini dilakukan dengan 3 kali pengulangan (triplo) untuk

mendapatkan data yang lebih baik dan lebih akurat. Masing-masing konsentrasi

dan kontrol negatif diisi 10 ekor larva, sehingga larva yang digunakan seluruhnya

berjumlah 150 ekor untuk setiap kali perlakuan. Karena penambahan 1 mL air laut

pada well plate, maka konsentrasi ekstrak yang diuji BSLT menjadi setengah kali

dari konsentrasi awal, yaitu 15 ppm, 10 ppm, 5 ppm, dan 2,5 ppm.

Berikut ini adalah hasil penelitian dari berbagai konsentrasi ekstrak

metanol daun Annona muricata L terhadap larva Artemia salina Leach.

Tabel 4.1. Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol daun Annona muricata

L terhadap larva Artemia salina Leach

Konsentrasi

(ppm)

Perlakuan Total

kematian

Rata-rata

kematian ±

standar deviasi

Persen

kematian

(%) Well

plate 1

Well

plate 2

Well

plate 3

0 0 0 0 0 0 0

2,5 4 2 2 8 2,667 ± 1,155 26,67

5 6 5 5 16 5,333 ± 0,577 53,33

10 9 9 7 26 8,667 ± 1,155 86,67

15 10 9 10 29 9,667 ± 0,577 96,67

38

Gambar 4.1. Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol daun Annona

muricata L terhadap larva Artemia salina Leach

Pada tabel 4.1 dan gambar 4.1 di atas, dapat dilihat kematian larva

tertinggi pada konsentrasi 15 ppm dan terendah 2,5 ppm. Selain itu, terdapat

peningkatan kematian larva Artemia salina Leach yang selaras dengan

peningkatan konsentrasi ekstrak metanol daun Annona muricata L. Pada kontrol

negatif tidak didapatkan larva yang mati, sehingga kematian larva murni karena

ekstrak yang diberikan bukan karena pengaruh air laut. Standar deviasi untuk

masing-masing kematian juga masih dalam batas normal yaitu kurang dari 2.45

4.3. Nilai LC50

Tabel 4.2. Perhitungan Nilai LC50 dengan Metode Probit

Konsentrasi

(ppm)

Log

konsentrasi

(X)

% mati Probit

(Y)

X2

Y2

XY

0 0 0 0 0 0 0

2,5 0,39 26,67 4,3750 0,1521 19,140625 1,70625

5 0,69 5333 5,0828 0,4761 25,83485584 3,507132

10 1 86,67 6,1077 1 37,30399929 6,1077

15 1,18 96,67 6,8260 1,3934 46,594276 8,05468

Jumlah (∑) 3,26 263,34 22,3915 3,0216 128,87375613 19,375762

26.67

53.33

86.67 96.67

0

20

40

60

80

100

120

2.5 5 10 15

Persen kematian (%)

Konsentrasi (ppm)

Per

sen

kem

ati

an

(%

)

39

Penentuan nilai LC50 dengan metode manual menggunakan rumus sebagai

berikut:

Nilai slope (m)=

– = 3,0893

Nilai intersept (b)=

= 3,080

Dari hasil di atas didapatkan persamaan garis lurus hubungan antara Y

(nilai probit dari persentase kematian) dan X (log konsentrasi) yaitu Y = 3,0893X

+ 3,080, sehingga nilai LC50 = 4,183 ppm.

Berdasarkan perhitungan manual diperoleh nilai LC50 sebesar 4,183 ppm.

Perhitungan LC50 juga bisa didapatkan menggunakan aplikasi Microsoft Office

Excel dengan membuat persamaan garis lurus Y=mX+b.

Gambar 4.2. Grafik regresi linier ekstrak metanol daun sirsak (Annona muricata

L) terhadap nilai probit

Dari grafik di atas, didapatkan persamaan Y= 3,097X + 3,073, sehingga nilai LC50

sebesar 4,187 ppm.

Nilai LC50 ekstrak daun sirsak (Annona muricata L) yang didapatkan dari

persamaan garis lurus menggunakan aplikasi Microsoft Office Excel yaitu 4,187.

Sedangkan dari perhitungan manual didapatkan nilai LC50 sebesar 4,183. Nilai

y = 3.0979x + 3.0731 R² = 0.9891

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 0.5 1 1.5

Log konsentrasi

Nil

ai

pro

bit

−−−− Linier (Nilai probit)

♦ Nilai probit

40

LC50 dari kedua metode tersebut tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan.

Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun Annona muricata L

bersifat toksik dan berpotensi sebagai antikanker, karena LC50 kurang dari 1000

ppm.29

Nilai LC50 yang dipakai dalam penelitian ini adalah yang didapatkan dari

perhitungan menggunakan aplikasi Microsoft Office Excel untuk menghindari

human error. Uji toksisitas akut daun Annona muricata L pada penelitian

sebelumnya yang dilakukan oleh R. Juliani dan Monica Wijaya didapatkan nilai

LC50 masing-masing sebesar 0,85 dan 3,062 ppm.6,7

Hasil dari kedua penelitian ini

memiliki perbedaan dengan hasil yang didapatkan pada penelitian ini. Hal ini bisa

disebabkan oleh perbedaan metode ekstraksi yang dilakukan. Pada penelitian R.

Juliani, selain menggunakan maserasi sebagai metode ekstraksi, juga dilakukan

ultrasonikasi. Gelombang ultrasonik yang digunakan pada metode tersebut dapat

menggetarkan sampel sehingga senyawa kimia yang ada pada daun sirsak akan

keluar dan larut dalam pelarut yang digunakan, ini bertujuan untuk memperbesar

kelarutan senyawa kimia ke dalam pelarut.7 Sehingga ekstrak yang didapatkan

mengandung lebih banyak senyawa aktif.

Sedangkan di penelitian Monica Wijaya, digunakan maserasi dan

fraksinasi untuk mendapatkan ekstrak kental metanol daun Annona muricata L.

Hal ini bertujuan untuk mendapatkan zat aktif berupa annonaceous acetogenin

yang sedikit polar.4 Kedua penelitian sebelumnya tersebut menghasilkan nilai

LC50 yang lebih toksik karena menggunakan metode ekstraksi yang lebih banyak

menarik zat aktif pada daun Annona muricata L.

Faktor yang mempengaruhi perbedaan LC50 antara penelitian sebelumnya

dan penelitian ini dapat dilihat dari faktor biologi dan faktor kimia. Kuantitas dan

kualitas senyawa aktif yang berbeda dikategorikan dalam faktor kimia. Sedangkan

faktor biologi yang berperan antara lain perbedaan lokasi asal daun sirsak yang

mempengaruhi lingkungan tumbuh (kualitas tanah, atmosfer), interaksi dengan

energi (cuaca, temperatur, dan cahaya) dan materi (kadar air, senyawa organik,

dan anorganik), serta perbedaan usia daun sirsak yang digunakan dalam

penelitian.24

Penelitian sebelumnya menggunakan daun Annona muricata L yang

41

masing-masing berasal dari Pekanbaru dan Depok, sedangkan penelitian ini

menggunakan daun yang berasal dari desa Tinggarjaya, kecamatan Jatilawang,

Banyumas, Jawa Tengah. Karena lokasi asal berbeda, maka kualitas tanah, cuaca,

temperatur, kadar air, dan usia tanaman juga bisa berbeda.24

Dari perhitungan nialai LC50 diketahui bahwa ekstrak metanol daun

Annona muricata L berpotensi sebagai antikanker. Potensi antikanker ini karena

daun sirsak memiliki berbagai kandungan senyawa-senyawa metabolit sekunder

yang bersifat toksik, misalnya annoneous acetogenins. Mekanisme sitotoksik

acetogenins melalui: 1) Menghambat oksidase dari NADH di membran plasma

pada sel kanker sehingga ATP yang dihasilkan akan menurun; 2) Menghambat

komplek I (NADH : ubiquimone oxidoreduktase) dalam system transport electron

di mitokondria dan menghambat fosforilasi oksidasi sehingga pertumbuhan sel

kanker terhambat; 3) Menghambat sel kanker yang multidrug resistant dengan

meningkatkan ekspresi dari plasma membrane pump, P-glycoprotein yang

berkontribusi terhadap multidrug resistant; 4) Sel kanker pada siklus sel fase S

lebih rentan terhadap acetogenin annonacin.; 5) Acetogenin annonacin memicu

apoptosis sel dengan cara meningkatkan ekspresi Bax dan Bad, tetapi tidak Bcl-2

atau Bcl-xL.22

Penelitian ini memiliki keterbatasan yaitu tidak dilakukan perbandingan

toksisitas antara ekstrak metanol daun Annona muricata L dan obat antikanker,

contohnya methotrexate atau doxorubicin sebagai kontrol positif.

42

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan

Ekstrak metanol daun Annona muricata L memiliki potensi toksisitas akut

terhadap larva Artemia salina Leach karena hasil perhitungan LC50 kurang dari

1000 ppm, yaitu 4,187 ppm.

5.2. Saran

a. Perlu dilakukan uji toksisitas akut daun Annona muricata L menggunakan

pelarut lain, seperti DMSO dan Tween 20.

b. Perlu dilakukan uji toksisitas kronik dari daun Annona muricata L.

c. Perlu dilakukan penelitian yang bertujuan melakukan isolasi senyawa yang

memiliki potensi toksik dalam ekstrak metanol daun Annona muricata L.

d. Perlu dilakukan perbandingan toksisitas antara senyawa isolat dari daun

Annona muricata L yang berpotensi sitotoksik dengan obat antikanker seperti

methotrexate, siklosporin, doxorubicin, dan lainnya.

43

DAFTAR PUSTAKA

1. WHO. International Agency for Research on Cancer (IARC). Latest world

cancer statistics. Global cancer burden rises to 14,1 million new cases in 2012:

Marked increase in breast cancer must be addressed. France: IARC; 2013.

2. Kementerian Kesehatan RI. Profil kesehatan Indonesia tahun 2013. Jakarta:

Kementerian Kesehatan RI; 2014.

3. Kementerian Kesehatan RI. Buletin jendela data dan informasi kesehatan

penyakit tidak menular. Jakarta: Kementerian Kesehatan RI; 2012.

4. Wijaya M. Ekstraksi Annonaceous acetogenin dari daun sirsak, Annona

muricata, sebagai senyawa bioaktif antikanker. [Skripsi]. Jakarta: Universitas

Indonesia; 2012.

5. Agoes G. Teknologi bahan alam. Bandung: Penerbit ITB; 2007.

6. Giawa PN, Yuharmen, Teruna HY. Identifikasi dan uji toksisitas ekstrak n-

heksan dari kulit biji tanaman sirsak (Annona muricata L). Pekanbaru:

Universitas Riau; 2013.

7. Juliani R, Yuherman, Teruna HY. Identifikasi dan uji toksisitas ekstrak

metanol dari daun tanaman sirsak (Annona muricata L). Jurnal Online

Mahasiswa (JOM) Bidang Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. 2014; 1

(1)

8. Siemuri EO, Akintunde JK, Bello IJ, Dairo KP. Assesment of cytotoxic

effects of methanol extract of Calliandra portoricensis using brine shrimp

(Artemia salina) lethality bioassay. GJBB. 2012; 1 (2): 257-60.

9. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, et al. Brine Shrimp: A convenient

general bioassay for active plant constituent. Planta Medica. 1982; 45: 31-34.

10. Pisutthanan S, Plianbangchang P, Pisutthanan N, et al. Brine shrimp lethality

activity of thai medicinal plants in the family Meliaceae. Naresuan University

Journal. 2014; 12(2): 13-8.

11. Dewoto HR. Pengembangan obat tradisional Indonesia menjadi fitofarmaka.

Majalah Kedokteran Indonesia. Juli 2007; 57 (7): 205-11.

44

12. Departemen Kesehatan RI, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan

Makanan, Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. Pedoman pelaksanaan uji

klinik obat tradisional. Jakarta: Departemen Kesehatan RI; 2000.

13. Badan Pengawasan Obat dan Makanan. Peraturan kepala badan pengawas

obat dan makanan nomor: HK.00.05.41.1384 tentang kriteria dan tata laksana

obat tradisional, obat herbal terstandar dan fitofarmaka. Jakarta: Badan

Pengawas Obat dan Makanan; 2005.

14. Pramono S. Kontribusi bahan obat alam dalam mengatasi krisis bahan obat

Indonesia. Jurnal Bahan Alam Indonesia. Januari 2002; 1 (2). 18-20.

15. Sunarjono HH. Seri agribisnis sirsak & sirkaya: Budi daya untuk

menghasilkan buah prima. Bogor: Penebar Swadaya Wisma; 2005.

16. Putra AA. Pengaruh ekstrak etanol daun sirsak (Annona muricata) terhadap

ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa. [Skripsi].

Fakultas Kedokteran Universitas Islam Bandung; 2012.

17. Suranto A. Dahsyatnya sirsak tumpas penyakit. Jakarta: Pustaka Bunda; 2011.

18. Wullur AC, Schaduw J, Wardhani ANK. Identifikasi alkaloid pada daun

sirsak (Annona muricata L.). Farmasi Poltekes Kemenkes Malang; 2013.

19. Raintree Tropical Plant Database. Graviola. [Internet]. 2005. [cited 2015 31

August]. Available from: http://rain-tree.com/graviola.htm.

20. Kojima N, Tanaka T. Medicinal chemistry of annonaceous acetogenins:

design, synthesis, and biological evaluation of novel analogues. Molecules.

2009.

21. Alali FQ, Xiao XL, Mclaughin JL. Annonaceous acetogenins: Recent

progress. J. Nat. Prod. American Chemical Society and American Society of

Pharmacognosy; 1999.

22. Raintree Nutrition. Monograph Graviola Annona Muricata. Carson city. 2004.

23. Taylor L. Technical Data Report for Graviola Annona Muricata. Herbal secret

of the Rainforest. 2nd ed. 2002.

24. Departemen Kesehatan RI Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan

Makanan. Parameter standar umum ekstrak tumbuhan obat. Jakarta:

Departemen Kesehatan; 2000.

25. Harmita, Radji M. Buku ajar analis hayati. Jakarta: EGC; 2008.

45

26. Staf Pengajar Departemen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas

Sriwijaya. Kumpulan kuliah farmakologi. Ed. 2. Jakarta: EGC; 2009.

27. Kuete V. Medicinal plant research in Africa: Pharmacology and chemistry.

USA: Elsevier; 2013.

28. Colegate SM, Molyneux RJ. Bioactive natural product: Detection, isolation,

and structural determination. 2nd ed. Francis: CrC Press; 2008.

29. Lisdawati V, Wiryowigdagdo S, Kardono LB. Brine shrimp lethality test

(BSLT) dari berbagai ekstrak daging buah dan kulit biji mahkota dewa

(Phaleria macrocarpa). Bul. Penelitian Kesehatan. 2006; 34 (3).

30. Thomas G. Medical chemistry: An introduction. 2nd ed. England: John Wiley

and Sons Ltd; 2007.

31. Carballo JL, et al. A comparison between two brine shrimp assays to detect in

vitro cytotoxicity in marine natural products. BMC Biotechnology. 2002.

32. Dumitrascu M. Artemia salina. Balneo-Research Journal. 2011; 2(4):119-22.

33. Panjaitan RB. Uji toksisitas akut kulit batang pulasari (Alyxiae cortex) dengan

metode brine shrimp lethality test (BST). [Skripsi]. Yogyakarta: Universitas

Sanata Dharma; 2011.

34. Ramdini RN. Uji toksisitas terhadap Artemia salina Leach dan toksisitas akut

komponen bioaktif Pandanus conoideus var. conoideus Lam sebagai kandidat

antikanker. [Skripsi]. Surakarta: Universitas Sebelas Maret; 2010.

35. Sorgeloos P, Remiche VDWC, Persoone G. The use of Artemia nauplii for

toxicity tests-a critical analysis. Ecotoxicol Env Safety. 1978; 2: 249–55.

36. Solis PN, et al. A microwell cytotoxicity assay using Artemia salina (brine

shrimp). Planta Med. 1993 Jun; 59(3): 250-52.

37. Campbell HA, Reece JB. Biologi jilid I. Ed. 8. Jakarta: Penerbit Erlangga;

2010.

38. Barrett KE, Barman SE, Boitano S, Brooks HL. Ganong’s review of medical

physiology. 23th ed. USA: The McGraw-Hill Companies; 2010.

39. Gajardo GM, Beardmore JA. The brine shrimp Artemia: Adapted to clinical

life conditions. Frontiers in Physiology. June 2012; (3): 1-8.

40. Hayden C. When nature goes public: the making and unmaking of

bioprospecting in Mexico. Oxfordshire: Princeton University Press; 2003.

46

41. Fenton JJ. Toxicology: A case-oriented approach. Taylor and Francis; 2001.

42. Mayorga P, et al. Comparison of bioassays using the anostracan crustaceans

Artemia salina and Thamnocephalus platyurus for plant extract toxicity

screening. Brazilian Journal of Pharmacognosy. Dec 2010; 20(6).

43. Kurniawan A. Aktivitas antioksidan dan potensi hayati dari kombinasi ekstrak

empat jenis tanaman obat Indonesia. [Skripsi]. Bogor: Institut Pertanian

Bogor; 2011.

44. Geethaa S, Thavamany PJ, Chiew SP, Thong OM. Interference from

ordinarily used solvents in the outcomes of Artemia salina lethality test.

Journal of Advanced Pharmaceutical Technology and Research. 2013 Oct-

Dec; 4(4): 179-82.

45. Sepadan A. Uji Toksisitas akut ekstrak etanol 96% biji buah alpukat (Persea

americana Mill.) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine

Shrimp Lethality Test (BSLT) [Skripsi]. Jakarta: Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta; 2014.

46. Priyanto. Toksikologi: Mekanisme, terapi antidotum dan penilaian risiko.

Depok: Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi Indonesia; 2009.

47. Kurniawan H. Uji toksisitas akut ekstrak metanol daun kesum (Polygonum

minus Huds) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode brine shrimp

lethality test (BSLT). [Skripsi]. Pontianak: Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Tanjungpura; 2009.

48. Material Safety Data Sheet Methanol. [Internet]. 2006. [cited 2015 11 Sept].

Available from: http://kni.caltech.edu/facilities/msds/methanol.pdf.

49. Rahmawati N, Handayani D, Mulyanti N. Skrining aktivitas sitotoksik ekstrak

dan fraksi beberapa jenis spons laut asal pulau Mandeh Sumatera Barat.

Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau Pekanbaru. 2011.

50. Wulandari F. Uji toksisitas ekstrak metanol daun mahkota dewa (Phaleria

macrocarpa [Scheff.] Boerl.) terhadap larva Artemia salina Leach dengan

metode brine shrimp lethality test (BSLT). [Skripsi]. Jakarta: Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta; 2014.

47

LAMPIRAN

Lampiran 1

Perhitungan konsentrasi ekstrak metanol daun Annona muricata L dan nilai LC50

1. Larutan induk konsentrasi 2000 ppm

Konsentrasi =

=

=

= 2000 μg/mL

= 2000 ppm

2. Kadar DMSO pada larutan induk

Kadar DMSO =

=

= 2 %

3. Larutan konsentrasi uji

a. Konsentrasi 30 ppm

M1.V1 = M2.V2

2000 μg/mL x V1 = 30 μg/mL x 6 mL

V1 =

V1 = 0,09 mL = 90 μL

Jadi diambil 90 μL dari larutan induk 2000 ppm + 5910 μL akuades,

kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

b. Konsentrasi 20 ppm

M1.V1 = M2.V2

2000 μg/mL x V1 = 20 μg/mL x 6 mL

V1 =

V1 = 0,06 mL = 60 μL

48

(lanjutan)

Jadi diambil 60 μL dari larutan induk 2000 ppm + 5940 μL akuades,

kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

c. Konsentrasi 10 ppm

M1.V1 = M2.V2

2000 μg/mL x V1 = 10 μg/mL x 6 mL

V1 =

V1 = 0,03 mL = 30 μL

Jadi diambil 30 μL dari larutan induk 2000 ppm + 5970 μL akuades,

kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

d. Konsentrasi 5 ppm

M1.V1 = M2.V2

2000 μg/mL x V1 = 5 μg/mL x 6 mL

V1 =

V1 = 0,015 mL = 15 μL

Jadi diambil 15 μL dari larutan induk 2000 ppm + 5815 μL akuades,

kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

Larutan dengan konsentrasi dalam tabung reaksi tersebut kemudian dimasukkan

ke dalam well plate masing-masing 1 mL, sehingga konsentrasi larutan uji pada

well plate menjadi ½ kalinya karena penambahan air laut sebanyak 1 mL.

4. Perhitungan nilai LC50

a. Menggunakan cara manual

Nilai m(slope) digitung menggunakan rumus:

m =

– = 3,0893

=

–

=

–

=

= 3,0893

49

Nilai intersept (b) dihitung menggunakan rumus:

b =

= 3,080

= –

–

=

–

=

= 3,080

Y = mX + b, dengan memasukkan nilai 5 sebagai Y karena nilai probit

dari 50 % kematian larva Artemia salina L.

Y = 3,0893X + 3,080

5 = 3,0893X + 3,080

X = –

= 0,6215

LC50 = Antilog X

= Antilog 0,6215

= 4,183 ppm

b. Menggunakan aplikasi Microsoft Office Excel

Y = mX + b

5 = 3,097X + 3,073

X = –

X = 0,622

LC50 = Antilog X

= Antilog 0,622

= 4,187 ppm

50

Lampiran 2

Surat Keterangan Determinasi Tanaman

Gambar 6.1. Surat Keterangan Determinasi Tanaman

51

Lampiran 3

Alat dan Bahan Penelitian

Gambar 6.2. Daun Annona muricata L

sebelum dikeringkan

Gambar 6.3. Serbuk simplisia daun

Annona muricata L sebanyak 572

gram

Gambar 6.4. Proses maserasi daun

Annona muricata L

Gambar 6.5. Penyaringan filtrat

hasil maserasi

52

(lanjutan)

Gambar 6.6. Destilasi pelarut metanol Gambar 6.7. Hasil destilasi

metanol

Gambar 6.8. Filtrat maserat yang telah

disaring

Gambar 6.9. Evaporasi

menggunakan rotary evaporator

53

(lanjutan)

Gambar 6.10. Ekstrak kental metanol

daun Annona muricata L sebanyak 57

gram

Gambar 6.11. Larutan induk 2000

ppm dihomogenkan menggunakan

hot plate stirrer

Gambar 6.12. Penetasan larva Artemia

salina Leach

Gambar 6.13. Konsentrasi ekstrak

metanol daun Annona muricata L

Gambar 6.14. Uji BSLT

54

Lampiran 4

Tabel Transformasi Persen-Probit

Tabel 6.1. Tabel Transformasi Persen-Probit

55

56

Lampiran 5

Riwayat Penulis

Nama : Nur Zaki Hanifah

Jenis Kelamin : Perempuan

Tempat, Tanggal Lahir : Banyumas, 19 Maret 1993

Agama : Islam

Alamat : Tinggarjaya RT 01/RW 05, Jatilawang, Banyumas,

Jawa Tengah

No hp : 085726562539

Email : nurzakihanifah@gmail.com

Riwayat pendidikan :

1. 1999-2005 : SD N 1 Tinggarjaya

2. 2005-2008 : SMP N 1 Jatilawang

3. 2008-2011 : SMA N Jatilawang

4. 2011-sekarang : PSPD FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta