1030 - - tion est situd 3, 123O sous 2 mm. et qui fournit In me'thyl-citronelZyZ- ce'tone (X), liquide incolore, dou6 d'odeur sgr6d.de, dont le point d'6bullition est situ6 a 83O sous 2 mm. et h 241O sous 733 mm. Dz,," = 0,8518, n, = 1,4505. no0

4,525 mgr. subst. ont donne 13.125 mgr. CO, e t 4,955 mgr. H,O Cl2H,,O Calcul6 C 79,04 H 12,18:/,

Trouv6 ,, 79,10 ,, 12,OS%

Genkve (Vernier), Labomtoires scientifiques des Usines I;. Giuaudun & G ~ F .

116. Uber die Aktivatoren der Arginase von F. Leuthardt und F. Koller.

(22. VII. 31)

Es sind eine AnzahI verschiedenartiger Stoffe bekannt, die unter bestimmten Bedingungen die Wirkung der Arginase zu s teigern vermogen. Als wichtigste sind zu nennen : Cystein, Glutathion, Ascorbinsaure, Eisensslze. Besonders die beiden ersten und neuer- dings such die Ascorbinsiiure haben dss Interesse der physiologischen Chemiker erweckt. &Ian hat sogar angenommen, dass die Sulfhydryl- verbindungen eigentliche Kofermente der Arginase sind :

,,Fur die Arginase ist nachgewiesen, dass ihre Aktivitilt von der Gegenwart von Sulfhydryl-Metallkomplexen abhangt, beispielsweise yon SH-Glutathion mit Eiwn oder Kupfer. Ohne diese ist Arginase wirkungslosl)."

Wir mochten im folgenden die Frsge der Arginase-Aktivierung auf Grund unserer bisherigen Erfahrungen zussmmenfassend be- sprechen, wobei wir an friihere Untersuchungen dieser Reihe an- kniipfen2). Es sei zum vornherein betont, dass beziiglich der Aktivier- bsrkeit die Fermente verschiedener Herstellungsart und Herkunft sich weitgehend unterscheiden. Aus diesem Umstand erkliiren sich wohl verschiedene widersprechende Angaben der Literatur.

I. JIechanismus der Aktivierung. Alle Aktivatoren der Arginase haben reduzierende Eigenschaften.

Man nimmt an, dass Glutsthion und uberhsupt die Sulfhydrylver- bindungen in der Zelle sogensnnte ,,Oxydoreduktionssysteme" bilden, d. h. dass sie je nsch den herrschenden Bedingungen oxydiert und wieder reduziert werden konnen. Viele Beobachtungen legen es

I) Waldschmidt-Leilz. Wed und Purr, Z. physiol. Ch. 215, 64 (1933). 2, Edlbacher, Kraus und Leuthardt, Z. physiol. Ch. 217, 89 (1933).

1031 - - nahe, die Fahigkeit zur Aktivierung der Arginase in Busammenhang mit dieser Eigenschaft zu bringen, so z. B. auch die Beobachtung von Klein, dass Hydrazinhydrat, ein durchaus unphysiologischer Kiirper, die Arginase aktiviert.

Von der Beobachtung ausgehend, dass die Leberarginase ge- wisser Tierarten Sauerstoff-empfindlich ist, haben Edlbucher, Kraus und Leuthurdtl) die Aktivierung durch Cystein (bei schwach alkalischer Reaktion) dadurch zu erklaren gesucht, dass das Cystein durch seine Fahigkeit, molekularen Sauerstoff zu binden, in der Losung anaerobe Bedingungen schafft (vgl. Abschnitt 111). Fur eine derartige Schutz- wirkung des Cysteins durch Sauerstoffabfang spricht abch der Vergleich des zeitlichen Verlaufs der Argininspaltung bei Gegenwart von Cystein und unter anaeroben Bedingungen. In beiden Fallen zeigt es sich, dass die prozentuale Aktivierung (Aktivierung gleich aufgehobene Hemmung!) mit der Zeit zunimmt, wie das zu erwarten ist, wenn eine mit der Zeit eintretende Schadigung aufgehoben oder verlangsamt wird (vgl. Abschnitt I1 und 111). Man kann diese Vorstellung dahin erweitern, dass auch in denjenigen Fallen, in denen das Ferment gegen molekularen Sauerstoff unempfindlich ist, diese reduzierenden Aktivatoren die dehydrierende oder oxy- dierende Wirkung begleitender Stoffe vom Fermentsystem ablenken. Unsere gegenwartigen Erfahrungen reichen nicht aus, diese erweiterte Vorstellung niiher zu priifen. Der Umstand, dass die Sulfhydryl- korper nur in ihrer reduzierten Form wirksam sind, spricht jeden- falls dafur, dass ihr Reduktionsvermogen eine conditio sine qua non fiir ihre Wirksamkeit ist.

Unsere Erfahrungen beim Cystein sprechen nicht dafiir, dass derartige Verbindungen als Koferment der Arginase anzusehen sind, denn ein wesentlicher Teil der Wirkung setzt erst allmahlich im Verlauf der Spaltung ein, wahrend von einem eigentlichen Koferment zu erwarten ist, dass es von Anfang an die Spaltung in voller Starke beeinfluss t .

I I . Die Zeit-Spaltungskurven der Arginase. Wir haben (bei pH 9,2 und einer Temperatur von 38O) den

zeitlichen Verlauf der Arginasespaltung untersucht. ( Glycerin- extrakt aus frischer Rattenleber, Extrakte aus Schweineleber-Trocken- pulver.) Die Spaltung folgt nicht dem Gesetz der monomolekularen Reaktion und verlauft nie vollstandig. Es handelt sich aber nicht um die Einstellung eines Gleichgewichts, sondern das Ferment wird im Verlauf der Reaktion i n a k t i v i e r t. Die Inaktivierung scheint in Extrakten aus Trockenpraparaten etwas schneller zu erfolgen als in solchen aus frischen Organen. Zwischen Spaltungsgeschwindig- keit und Fermentmenge lasst sich keine einfache Beziehung auf - --

l) Z. physiol. Ch. 217, 89 (1933).

- 1033 - stellen, sei es, dass man die hydrolysierten Mengen Arginin nach bestimmter Zeit vergleicht, sei es, dass man die Zeiten bestimmt, die zur Erreichung eines bestimmten Spaltungsgrades notig skd , wie es bei monomolekular verlaufenden Fermentreaktionen ublich ist. Am ehesten folgt die Spaltung (nach bestimmter Zeit gemessen) einem Quadratwurzelgesetz ahnlich der Xchiitx’schen Regel.

60 120 180 240

F i g u r 1: A b h i i n g i g k e i t d e r A r g i n a s e w i r k u n g v o n d e r F e r m e n t -

k o n z e n t r a t i o n . Extrakt aus Schweineleber-Trockenpulver. 1 g Trockenpulver mit 50 cm3 Glyko-

Kurve I: 20 om3 Extrakt; Kurve 11: 10 cm3; Kurve 111: 5 om3, iiberall

Abszisse : Zeit in Minuten, Ordinate : Prozent Spaltung.

kollpuffer 15 Minuten leicht geschiittelt und zentrifugiert.

+ 30 em3 0,l-m. Agininlosung von pH 0,3 + Glykokollpuffer ad 100 em3.

Infolge dieser unubersichtlichen Verhaltnisse konnen bei der Arginase Fermentmenge oder Aktivierungsgrad nicht auf rationeller Grundlage verglichen werden. Wir beniitzen zum Vergleich, wie iiblich, die nach Ablauf einer bestimmten Zeit gemessene Spaltung. Es sind auch fur die Feststellung des pH-Optimum stets diese Spal- tungswerte verwendet worden und nicht die Anfangsgeschwindig- keiten der Reaktion. Fur die meisten Zwecke geniigt dies, doch konnen sich Schwierigkeiten ergeben. Die Untersuchungen von Edlbacher und KoZZer I) zeigen, dass ein derartig definiertes pE-Opti- mum von der Lange der Spaltungszeit abhangen kann, da es durch die sekundaren Veranderungen des Fermentsystems mitbestimmt wird. (8. B. Schadigung des Ferments bei langer Versuchszeit. Das pB-Optimum kennzeichnet in diesem Fall eher die Abhtingigkeit der Schadigung als die der Spaltungsgeschwindigkeit von der Re- aktion.)

l) Z. physiol. Ch., im Druck (1934).

- 1033 -

-- Zeit . . . . 10 20 40 60 90 120 180Minuten

Hemmung . 11 13 18 23 30 32 35%

80 -%

60 120

80 -%

F i g u r 2: S t e i g e r u n g d e r A r g i n a s e w i r k u n g d u r c h C y s t e i n u n d

S a u e r s t o f f a u s s c h l u s s . Glycerinextrakt aus frischer Rattenleber. 30 cm3 0,l-m. Aginin, 10 om3 0,l-m.

Cystein-chlorhydrat (neutralisiert). Kurve I: ohne Zusatz; Kurve I1 : mit Cystein; Kurve 111: in Wasserstoff-Atmosphare.

Die Ssuerstoffempfindlichkeit der Leberarginase ist bei ver- schiedenen Tierarten sehr verschieilen. Beim Meerschweinchen ist sie sehr gering (Tab. 6, Vers. I11 und IV), ebenso beim Schwein (Tab. 6), bei der Maus und der Ratte kann der Unterschied zwischen anaerober und aerober Spaltung betrachtlich sein (30-50 % Steige- rung). Es scheint, dass auch das Alter und der Zustand der Tiere von Einfluss ist ; ausserordentlich gross ist der Unterschied zwischen aerober und anaerober Spaltung im nekrotischen Tumorgewebe (Edrlbacher und KoZZer, 1. c . ) . Die Arginase der Rattenleber behalt ihre Sauerstoffempfindlichkeit beim Trocknen mit Aceton bei und busst such absolut an Wirksamkeit nur wenig ein (vgl. Fig. 3 ) .

100-

80

l) Z. physiol. Ch. 222, 191 (1934).

~

- 1036 -

wurden ; doch deuten gewisse Beobachtungen darauf hin, dass noch andere Mechanismen der Cysteinwirkung vorhsnden sind und unter geeigneten Bedingungen sichtbar werden. In Extrakten aus frischen Organen spielt nach unseren Erfahrungen der ,,Sauerstoffabfang" die Hauptrolle, und die hier herrschenden Bedingungen sind wohl am ehesten den natiirlichen vergleichbar.

Die Spaltung in Gegenwart von Cystein ist nie grosser als unter anaeroben Bedingungen; gewohnlich ist sie etwas kleiner. An der Oberflache der Losung wird durch den Luftsauerstoff dss Cystein rasch osydiert und dementsprechend ist hier die Spaltung geringer ; das druckt sich in einer Herabsetzung der Gesamtaktivierung sus. Besonders gut erkennt man die Wirkungsart des Cysteins aus den Zeit-Spaltungskurven (Fig. 2). Die Kurve bei Gegenwart von Cystein ist zu Beginn fast identisch mit der anaeroben, entfernt sich dann aber in dem Masse von ihr, als das Cystein oxydiert wird. Auch hier nimmt die prozentuale Aktivierung im Verlauf der Reaktion zu. Die mechanischen Verhaltnisse (Schutteln, Grosse der Fliissig- keitsoberflache) spielen dabei eine Rolle.

In Extrakten aus Acetontrockenpulver der Schweineleber findet man das Cystein unwirkssm, entsprechend der Tatsache, dass hier das Ferment auch gegen Sauerstoff unempfindlich ist . Die in Fig. 4 eingezeichneten Werte liegen praktisch auf ein und derselben Kurve. Die Wirkung der Arginase aus frischer Schweine- leber wird durch anaerobe Bedingungen kaum gesteigert (Tab. 6). Cystein scheint eher etwas zu hemmen!

F i g u r 4: A r g i n as e w i r k u ng S c h \v e i n e 1 e b e r - T r o c k e n p u 1 v e r (k e i n e

E t e i g e r u n g d u r c h C y s t e i n u n d S a u e r s t o f f a u s s c h l u s s ) : o ohne Zusatz, '? rnit Cystein, -0 anaerob. 1 g Trockenpulver mit 50 cm3 Glykokollpuffer 20 Minuten leicht gesehiittelt und filtriert. Da der wassrige Extrakt beim Evakuieren sehr stark schaumt, wird er noch mit der gleichen Menge Glycerin versetzt. Ansatz: 30 cm3 Arginin, 60 cm3 Glykokollpuffer und 10 01113 Fermentlosung resp. 10 om3 0,l-m. Cystein und 50 cm3 Glykokollpuffer.

v o n

Calciumsalze (0,001-m. CaC1,) steigern die Wirkung des Cysteins in Rattenleberfrischextrakt (Tab. 2).

1036 - -

Die Aktivierbarkeit der Arginase durch Cystein in den Organen verschiedener Tierarten geht parallel mit der Sauerstoffempfindlich- keit. Das Ferment aus Meerschweinchenleber und Schweineleber wird nicht aktiviert, dasjenige aus Rotten- und Mauseleber dagegen stark (vgl. Tab. 2, 3, 6, 7). Diese Tatsache spricht sehr im Sinne einer Schutzwirkung des Cysteins.

I n einigen Fallen (frische Rattenleber) haben wir beobachtet, dass die Spaltung unter anaeroben Bedingungen durch Zusatz von Cystein noch etwas erhoht wird. Da unsere Ansatze praktisch Sauerstoff-frei waren, die Wirkung des Cysteins also nicht durch die Entfernung letzter Sauerstoffreste erklart werden lcann, deutet dies auf einen anderen noch unbekannten Mechanismus der Cystein- wirkung hin, der mit der Autoxydation direkt nicht zusammenhangt (aber trotzdem durch die reduzierenden Eigenschaften des Cysteins bedingt sein kann). Auch wenn man den Leberbrei nach I!3ein1) 30 Minuten auf 70° erwarmt, findet man andere Verhaltnisse. Die &us diesem Brei extrahierbare Arginase ist, wie Klein angibt, durch Cystein aktivierbar j es scheint aber (nach einer einzelnen Beobachtung zu schliessen), dass sie nicht sauerstoffempfindlich ist, und dass die Aktivierung durch Cystein unter anaeroben Bedingungen nicht eintritt !

Es ist also moglich, die Wirkungsart des Cysteins abzuanderr, oder andere Mechanismen in Erscheinung treten zu lassen. Dies geht deutlich auch daraus hervor, class Cystein bei saurer Reaktion (pH 6,5) hemmend wirkt. Nach Ii-Zein wird die durch Adsorption an Aluminiumhydroxyd gereinigte Arginase auch bei alkalischer Reaktion gehemmt (1. c.). Wir haben an Arginasepraparaten, die durch Adsorption an Tonerde gereinigt waren, diese Beobachtung bestatigt, doch sind unsere Erfahrungen mit solchen Praparaten nicht sehr umfangreich.

V. Einflzcss der AscorbinsGure. Als erste haben li'arrer und Zehender2) gezeigt, dass durch das

Vitamin C, die Ascorbinsaure, ein Ferment aktiviert wird, niimlich das Kathepsin der Leber. I m Anschluss daran haben EdZbacher und Leuthnrdt festgestellt, dass die Ascorbinsaure unter bestimmten Bedingungen auch die Wirkung der Arginase steigert3). I m frischen Rattenleberextrakt ist die Saure unwirksam; es miissen kleine Mengen Kupferverbindungen gegenwartig sein, wenn sie das Ferment beeinflussen soll. I m Tumorextrakt dagegen ist die Ascorbinsaure auch ohne Kupferverbindungen wirksam (Edlbacher und KoZZer, 1. c.), vielleicht auch in der Meerschweinchen-Leber (Tab. 6, Versuch 11).

l) Z. physiol. Ch. 222, 198 (1934). ?) Helv. 16, 701 (1933). 3, Klin. Woch.-schr. 12, 1843 (1933); vgl. auch Pzrrr, Bioch. J. 27, 1703 (1933).

,

- 1037 -

Die Resultate sind etwas schwankend ; vielleicht hangt dies mit dem Kupfergehalt der Organe zusammen. Der Kupfergehalt des Tumorgewebes ist von derselben Grossenordnung wie clerjenige der Leber und entspricht ungefahr den Zusatzen, wie wir sie verwendet heben (0,002 mg pro cm3 Ansatz). Ob dieser Gehalt im Tumorgewebe zur vollen Aktivierung bereits genugt, etwa infolge besonderer Rindungsart des Metalls oder ob hier andere Stoffe vorhanden sind, die ahnlich wirken wie Kupfersalze, entzieht sich unserer Kenntnis. I n mit Aceton getrockneter Schweineleber fanden wir auch Ascorbin- saure mit Kupferverbindungen unwirksam (Tab. 1 b).

Nach Euler, X y r b & k und Larsson I ) steigert ein Kupferzusstz von 2 y die Autovydationsgeschwindigkeit der Ascorbinsaure unge- fahr um das 10-fache. Da dieser Zusatz in der frischen Rattenleber notig ist, demit die SBure a1s Aktivator wirkt, erscheint es moglich, dass auch hier die Erhohung der Spaltung teilweise auf dem durch den Sauerstoffverbrauch des Aktivators bedingten Schutz des Ferments beruht ; doch geht die Aktivierbarkeit durch Ascorbinsaure nicht der Sauerstoffempfindlichkeit parallel wie beim Cystein, sodsss wir hier einen anderen Mechanismus annehmen mussen.

Wir haben manometrisch die Sauerstoffaufnahme in unseren dscorbinsaure- und Cystein-haltigen Ansatzen untersucht. Die Aut- oxydationsgeschwindigkeit der Ascorbinsaure ist ungefahr von der- selben Grossenordnung wie in den Versuchen von Ezlber, Myrbuc7c und Lursson (1. c.), die in reiner Losung ausgefuhrt wurden, und vie1 grosser als beim Cystein. Wie Fig. 5 zeigt, verlauft die Oxy- dation bis fast zum volligen Verbrauch der Siiure proportional der Zeit. Diese hohe Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme im Ver- gleich zu aquimolekularen Mengen Cystein scheint eine Erklarung dafur zu bieten, warum die Ascorbinsaure, trotzdem sie das starkere Reduktionsmittel ist, nicht starker aktiviert als das Cystein, oft sogar etwas weniger : Sie wird zu rasch aufgebraucht. Es gibt offenbar bei gegebener Menge des Aktivators eine optimale Oxydations- geschwindigkeit : Sie muss gross genug sein, um unter den gegebenen mechanischen Redingungen (Schutteln, Oberflache) den Sauerstoff zu entfernen oder xu ubertragen ; sie darf andererseits nicht so gross sein, dass schon wahrend einer im Verhaltnis zur Versuchsdauer kurzen Zeit der Aktivator aufgebraucht ist. Sofern nicht spezifische Unterschiede der Aktivatoren hinzukommen, durfte vielleicht auf iihnliche Weise das Missverhiiltnis erklart werden konnen, das nach Euber, Karrer und Zehelzder2) zwischen der Reduktionskraft der Korper der Reduktongruppe und ihrer aktivierenden Wirkung auf kathep- tische Fermente besteht.

1) 2. physiol. Ch. 217, 1 (1933). 2, Helv. 17, 157 (1934).

1038 - -

A u t o x y d a t i o n von C y s t e i n u n d A s c o r b i n - s a u r e i n d e n L e b e r e x t r a k t e n .

Die Sauerstoffaufnahme wird im Warburg’schen Manometer bestimmt. Der Hauptraum der Cefasse enthalt :

a) 4 cm3 einer Losung bestehend aus: 2 cm3 Ratten- leber-Glycerinextrakt, 3,7 cm3 0,l-n. NaOH, 6,O cmJ 0,l-m. Arginin, 8,3 cm3 Glyliokollpuffer (p, 9,24 bei 40°) ;

b) 4 om3 einer Losung bevtehend aus: 2,O cn13 Glycerinextrakt, 2 cm3 0,l-n. NaOH, 6,O cm3 0,l-m. Arginin, 10,O om3 Glykokollpuffer, 0,4 cn13 0,0033-ni.

Im Anhang a) 0,4 om3 0.1-m. Cystein-hydro- chlorid; b) 0,4 cm3 0,l-m. Ascorbinvaure, nach Tempe- raturausgleich eingelrippt.

Abszisse: Zeit in Minuten, Ordinate: mm3 Sauer- stoff.

cuso,.

F igur 5.

Die anaerobe Spaltung wird durch Ascorbinsaure + Kupfer- verbindungen in der Regel noch vergrossert. Wir haben auch mehr- mals die Spaltung bei Gegenwart von Ascorbinsaure grosser ge- funden als in Stickstoffatmosphare. Die Arginase aus Meerschwein- chenleber, die durch anaerobe Bedingungen und Cystein fast gar nicht beeinflusst wird, lasst sich durch Aseorbinsiiure aktivieren (Tab. 6). Diese Beobachtungen sprechen nicht im Sinne einer Akti- vierung durch Ssuerstoffabfang.

V I . Wirkung der Eisensalze. Ferrosslze bewirken in einer Konzcntration von 0,003-m. eine

starke Aktivierung der Arginase (Snlaskin und Solowjewl), Wald- schmidt-Leitz, Schnrikowa und Schizffner ”)). In Frischextrakten aus Rattenleber betragt die Steigerung in der Regel 50-100%, in Praparaten, die durch Adsorption an Tonerde gereinigt waren, hsben wir Aktivierung his auf das 8-fache beobachtet. Alle Pra- parate, die wir in den Handen gehabt haben, waren durch Ferrosalze aktivierbsr. Mit abnehmender Konzentration sinkt die Wirkung sehr rasch und ist schon bei etwa 0,0003-m. FeSO, ksum mehr be- merkbar. Wir fanden, wie auch Knrrer und Zehender3), Ferrisalze ebenfalls wirksam, jedoch schwacher als Ferrasalze (vgl. Tab. 3b). Oh tatsachlich die Ferriionen ebenfalls wirksam sind, lasst sich schwer entscheiden, denn die Extrakte enthalten stets Stoffe, die das drei- wertige Eisen reduzieren konnen.

l ) Bioch. Z. 250, 503 (1932). 2, Z. physiol. Ch. 214, 75 (1933). Helv. 17, 737 (1934).

1039 - -

WaZdschmidt-Leitz, WeiZ und Purr1) nehmen einen Sulfhydryl- ;\lletallkomplex als eigentlichen Aktivator der Arginase an. Die violette Farbe, die beim Mischen von Cystein und einer Ferrosulfat- losung entsteht, kommt durch e k e Komplexbildung des stets vor- hsndenen Ferrieisens mit dem Cystein zustande. Sie verschwindet beim ruhigen Stehen der Losung, weil das Ferrieisen durch das Cystein reduziert wird und Ferroeisen keine Farbung gibt. Diese Reaktion war schon E. Baumann, dem Entdecker des Cysteins, bekannt ”. Harris hat eine ganze Reihe solcher auf Komplexbildung beruhender Reaktionen des Cysteins mit andern Metallionen be- schrieben 3).

Bei Gegenwart von Cystein ist in der Tat die Aktivierung der Arginase durch Ferroeisen noch gesteigert. Man kann sogar in Extrakten, die weder durch Cystein (0,Ol-m.), noch durch kleine Mengen Ferrosulfat (0,0002-m.) aktiviert werden, durch gleich- zeitigen Zusatz der beiden Stoffe in derselben Konzentration die Arginasewirkung verdoppeln (Tab. 3 a). Es scheint also, dass hier eine gewisse Massenwirkung vorliegt : Bei kleinen Mengen Fe.. ist die Konzentration der im Extrakt vorhandenen (durch Natrium- nitroprussiat nachweisbaren) Sulfhydrylverbindungen zu klein, urn den Komplex in geniigender Konzentration entstehen zu lassen; man muss Cystein zusetzen. Bei grosseren Fe.--Konzentrationen geniigt die Konzentration der schon vorhandenen Sulfhydrylkorper. Bei der Beurteilung dieser Beobachtungen muss man aber beruck- sichtigen,

1. dass das Cystein das Ferroeisen vor der Oxydation schutzt und das in.den Anslitzen sich stets bildende Ferrieisen wieder re- duziert,

2. dass das Cystein das Fe(OH), in Losung hlilt. Die Cystein-haltigen Ansatze bleiben wlihrend des Versuchs

vollstandig klar j in den Cystein-freien dagegen scheiden sich reich- liche Mengen Eisen(II1)hydroxyd aus. Das Loslichkeitsprodukt p des Ferrohydroxyds wird in unsern Ansatzen stets uberschritten (wenn wir q ca. 10-14 setzen*), so ist bei pH 9,5 (OH’)2 = und (Fe-) = wlihrend wir gewohnlich 2 x Mol zugesetzt. haben). Es ist also bei Gegenwart van Cystein stets sehr vie1 mehr zweiwer t iges Eisen i n Losung als ohne Cystein und deshalb kann man aus diesen Befunden nicht ohne weiteres auf eine besonders hohe spezifische Wirkssmkeit des Fe**-Cystein-Komplexes schliessen. Von wesentlicher Bedeutung sind die Metallionen fur die Wirkung des Cysteins insofern, als sie dessen Autoxydation bedingen. -

l) Z. physiol. Ch. 215, 64 (1933). 2, Z. physiol. Ch. 8, 301 (884). 3, Bioch. J. 16, 739 (1922). 4, Vgl. Gmelin’s Handb. anorg. Ch., Teil 59 B, Eisen, Lfg. 1, s. 119.

1040 -

Knrrer uncl Zeheider’) hahen kurzlich mitgeteilt, dass Calcium- sslxe schon bei einer Konzentration von 0,001 3101 im Liter bei Gegenwart von Cystein (0,01-m.) die Arginase vollstandig hemrnen (Glycerinextrakt aus Acetontrockenpulver von Schweineleber). Wir haben in frischer Rattenleber eine deutliche Aktivierung gefunden (Tab. 2). Der Unterschied dieser Befunde ist wohl darin begriindet, dass die genannten Autoren vor dem Zusatz des Substrats eine Inkubationszeit von 1 Stunde einschalten. Ohne diese Inkubation finden sie Calciumsalze wirkungslos. Unsern Erfahrungen zufolge wird das Ferment beim Stehen in wkssriger Losung (insbesonderes in Extrakten aus Trockenpriiparaten) rasch inaktiviert. Wir sind daher der Meinung, dass die Befunde der genannten Autoren teilweise durch eine verschieden schnelle Inaktivierung der Arginase in den einzelnen Ansiitzen whhrend der Inkubation zu erklaren sind, eine an sich sehr bemerkenswerte Erscheinung, nicht aber ah Hemmung der Fermentwirkung gedeutet werden durfen.

V I I . Versuche mit Gewebeschnitten.

-

Die variahlen Eigenschsften der Arginase je nach Art des verwendeten Fermentpraparats lassen es wunschenswert erscheinen, das Ferment unter moglichst naturlichen Bedingungen zu unter- suchen, damit man Ruckschlusse auf sein physiologisches Verhalten ziehen kann. Die iibliche Methode der Gewebeschnitte ist aber fur nicht strukturgebundene Fermente n i c h t v e r w e n d b a r , denn die Arginase geht aus den Leberschnitten sehr rasch in Losung, sodass diese Methode nicht nur keine Vorteile gegenuber dem Arbeiten mit Extrakten aus dem frischen Organ bietet, sondern iiberhaupt fur quantitative Versuche u n b r a u c h b a r ist. Dagegen lassen sich, wenn man das in Losunggehen des Ferments etwas genauer verfolgt, einige Anhaltspunkte uber seinen Zustand in der Belle gewinnen. Wir benutzten in diesem Fall die von Krebs und Henseleit2) ange- gebene manometrisehe Methode.

I n Parallelversuchen lassen sich auch mit Schnitten, die aus ein und demselben Teil des Organs (Rattenlebern) hergestellt sind, keine reproduzierbaren Werte erzielen, sei es, dass man die Spaltung su f die Gewichtseinheit, sei es, dass man sie auf die Flacheneinheit bezieht. Die Analyse der Faktoren, die dieses Verhalten bedingen, hat folgendes ergeben : Von grossem Einfluss ist die Schnittdicke. I m allgemeinen spalten (auf die Gewichtseinheit bezogen) dunne Schnitte mehr als dickere. (Die Schnittdicke lag bei unseren Ver- suchen zwischen 0, l und 0,3 mm.) Dies weist darauf hin, dass an der Spaltung wohl hauptsachlich die an der Oberflache liegenden Zellen beteiligt sind, deren Zahl im Verhiiltnis zur Gesamtzahl im diinnen Schnitt relativ grosser ist. Dass dabei auch die relativ grossere

l) Helv. 17, 737 (1934). 2, Z. physiol. Ch. 210, 33 (1932).

- 10'11 -

Zahl der verwundeten Zellen in den diinneren Schnitten eine Rolle spielt, geht daraus hervor, dass schlechte, zerfetzte Schnitte meistens relativ starker spalten als gute, nicht zerrissene. In den verwundeten Zellen treten wohl rasch autolytische Vorgange ein, die auch zur Freilegung von solchen Fermentanteilen fiihren, die in der normalen Zelle an das Protoplasma gebunden sind.

Doch auch im intakten Gewebe scheinen beim Schiitteln mit Ringer-Losung derartige autolytische Vorgiinge einzutreten. Durch mehrmaliges Schiitteln (3mal je 1 Stunde bei 38O) lasst sich namlich der Schnitt nicht erschopfen, auch nach dreistiindigem Schiitteln im Warburg'schen Manometer sind die Leberschnitte noch weirksam (Tab. 8). Die in Losung gehende Arginase ist wohl nur zum kleinen Teil ,,Lyo-Ferment" im Sinne WiZZsttilter'sl), sondern ,,Endo"- oder ,,Desmo-Arginase", welche durch die autolytischen Fermente allmahlich in Freiheit gesetzt wird. Wir haben beobachtet, dsss oft die Schnitte nach zweistundigem Schiitteln nach anfiinglicher Abnahme der Wirksamkeit wieder starker zu spalten beginnen (Tab. 7) . W e diese Aktivierung zustande kommt, ist uns unbekannt (Auswaschen von Hemmungskorpern, Aufschliessen des Enzyms fur Aktivatoren 1). Die Aktivierung scheint den zellgebundenen Anteil der Arginase zu betreffen, da wir sie in den Extrakten (er- halten durch je einstiindiges Schiitteln der Schnitte in Ringer- Losung ohne Substrat) nie beobachten konnten.

V I I I . Physiologische Bemerkungen. Die Konzentration der untersuchten Aktivatoren ist in- den

Geweben des Korpers viel geringer als den im Versuch wirksamen Mengen entspricht. Da in der lebenden Zelle aber sauerstoff- oder wasserstoffiibertragende Mechanismen vorhanden sind, die mit der Zerstorung der Struktur unwirksam werden, ist es sehr wohl moglich, class im Extrakt die reduzierenden Aktivatoren das Endglied einer Kette sind, die in der Zelle weiterlauft; sie werden im Reagensglas verbraucht, wahrend sie in der Zelle immer wieder reduziert werden konnen. Es lasst sich nstiirlich auch schwer abschatzen, in welchem Ausmass diese Stoffe innerhalb cier Zelle als Aktivatoren der Arginase wirken und wie stark hier das Ferment durch Sauerstoff geschadigt wird. Im Tumorgewebe scheint ein deutlicher Zusammen- hang zwischen der Menge der reduzierenden, mit dem Farbstoff 3,6-Dichlorphenol-indophenol titrierbaren Substanzen und der Akti- vierbarkeit zu bestehen, wie EdZbacher und KoZZer mit Jung gezeigt haben2). Das nekrotische Gewebe, das sehr viel weniger reduzierende Substanzen enthalt als das normale Tumorgewebe (Jensen'sches Rattensarkom) ist viel starker aktivierbar als letzteres.

I) Z. physiol. Ch. 209, 38 (1932). 2) Edlbacher und Koller, Edlbaeher und Jztng, Z . physiol. Ch., im Druck (1934).

66

1042 -

Die Tatsache, dass chemisch so verschiedene Stoffe wie Cystein, Ascorbinsaure und gar Hydrazinhydrat die Arginase aktivieren konnen, macht eine chemisch-spezifische Wirkung der einzelneii Korper nicht gerade wahrscheinlich, sondern lasst eher vermuten, dass die reduzierenden Eigenschaften dieser Verbindungen, gleich- gultig an welche Molekelstruktur sie gebunden sind, ihre Fahigkeit zur Aktivierung bedingen. Die sehr starke Wirkung der Ferro-Salze beruht wohl auf einem ahnlichen Mechanismus. Ob die Verbindungen der Metalle rnit Sulfhydrylkorpern spezifische, besonders wirksame -4ktivatoren der Arginase sind und welche Rolle iiberhaupt den Metallionen bei der Aktivierung unter physiologischen Bedingungen zukommt, ist noch nicht geniigend geklart.

-

E x p e r i m e n t e l l e r T e i l . Der aus dem Arginin abgespaltene Harnstoff wurde nach FoZirz

durch Zerlegung rnit Urease bestimmt. In Ansatzen, die gleich- zeitig Ascorbinsaure und Kupfersalze enthalten, ist die Methode nicht brauchbar ; wir bestimmen dort den Harnstoff durch Fallung mit Xanthpdrol. Alle im folgenden beschriebenen Versuche sind bei op timaler Wasserstoffionenkonzentration ( Glykokollpuffer nach Saerensen: 7 Teile 0,l-n. Glykokoll : 3 Teilen 0,l-n. NaOH, pH 9,3 bei 370) ausgefuhrt. Temperatur 38O. Weitere Einzelheiten vgl. Edlbacher, Kraus und Zeuihardt').

Die E x t r a k t e a u s d e n f r i s chen Organen wurden stets in der Weise hergestellt, dass eine gewogene Menge des frisch ent- nommenen Organs erst rnit der Schere etwas zerkleinert, dann unter allm&hlicher Zugabe der 4fachen Menge reinen Glycerins rnit Quarz- sand gut zerrieben wurde. Der Brei wurde koliert und rnit Glycerin aufs lOfache verdiinnt. Der so hergestellte Extrakt enthalt noch cine grosse Menge Zelltrummer. Er wurde immer sofort verwendet.

Zur Herstellung des S c h w e inele b e r - T r o c k e n p u lve r s wurde eine aus dem Schlachthaus frisch bezogene Schweineleber durch die Hackmaschine gelassen und 3mal rnit 100-proz. Aceton (3-4fache Menge) entwassert, wobei das Pulver immer wieder rnit dem Pistill moglichst gut zerdruckt wurde. Es folgte eine zweimalige Behandlung rnit Aceton-Ather zu gleichen Teilen und schliesslich rnit Ather Das Xaterial wurde nun in der Kugelmuhle fein gemahlen; (dabei werden besonders die zahen Bindegewebefasern vom ubrigen Gewebe getrennt); das staubende Pulver wurde noch durch ein Haarsieb getrieben. Wegen der raschen Inaktivierung des Ferments in wass- riger Losung mussen Extrakte, die verglichen werden sollen, genau gleich behandelt werden (gleiche Extraktionszeit, gleichzeitiger Versuchsbeginn).

l) Z. physiol. Ch. 217, 89 (1933).

1043 - - Bestimmung der Zeit-Spultun.gskzirue?a.

Ferment und Substrat (+ Zusiitze) werden getrennt vorgewarnit und bei Versuchsbeginn rasch zusammengemischt. Nach bestimmten Zeitintervallen, die an der Stoppuhr abgelesen werden, entnimmt man dem Ansatz .mittels rasch auslaufender Pipetten Proben von je 5 em3 und laisst sie in hohe Glaser einlaufen, die 10 cm3 Phosphat- puffer enthalten (125 g Na,HPO, e 12 H,O und 40 g KH,PO, im Liter), und moglichst tief in einem siedenden Wasserbad stehen. Dadurch, class man die Flussigkeit in dunner Schicht der heissen Wand entlang laufen Iasst, wird die Fermentwirkung augenblicklich unterbrochen. Die anaeroben Spaltungen haben wir in einem besonders konstruierten Gefiiss ausgefuhrt, das gestattet, die Proben ohne Zutritt yon Sauer- stoff zu entnehmen, dadurch dass die Flussigkeit durch einen Stick- stoff- oder Wasserstoffstrom in einer Pipette hochgedriickt wird. Wir haben der grossern Bequemlichkeit wegen gewohnlich Wasser- stoff verwendet. Wenn man denselben durch Leiten uber gluhendes Kupfer ssuerstoff-frei macht, bleibt dss letztere dauernd blank, wahrenddem bei Verwendung von Stickstoff das Kupfer immer wieder reduziert werden muss. Die Fermentlosung wird in einer seitlich eingeschliffenen Retorte vorgewarmt und bei Versuchs- beginn durch Drehen derselben eingekippt. Das pH wurde meist am Schluss' des Versuchs elektrometrisch kontrolliert (9,3 bis 9,4 bei Zimmertemperatur, also bei der Spaltungstemperatur etwas saurer. Puffergemische rnit Aminogruppen sind sehr vie1 mehr temperatur- abhangig als solche mit Carboxylgruppen, was durch die hohere Ionisierungswbme der NH,-Gruppe bedingt ist. Die p,-Abhangig- keit der Arginase ist in diesem Bereich nicht gross.)

Die Figuren 1 bis 4 rnit ihren Erklarungcn geben einigc Bei- spiele solcher Spaltungskurven (s. 0.).

Versuche rnit Ascorb insau re : Die Ansatze enthalten: 3 em3 Arginin, 1 cm3 0,l-m. Ascorbin-

saure (neutralisiert), 0,l em3 0,0033-m. CuSO, (entsprechend 2 y Cue. im cm3 Ansatz), 1 cm3 Fermentlosung rnit Glykokollpuffer ad 10 em3.

Bestimmung des Harnstoffs : Der im siedenden Wasserbad (bei grossem Eiweissgehalt unter Zusatz von 2 Tropfen Eisessig) inaktivierte Ansatz wird filtriert, mit 3 em3 Wasser nachgewaschen, das Filtrat mit 15 cm3 Eisessig versetzt, 2 cm3 10-proz. methyl- alkoholisches Xanthydrol zugegeben, uber Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wird in Jenenser Glasfiltertiegeln abgesaugt,, dreimal unter grundlichem Durchruhren rnit Methanol, das mit Xanthydrol-harnstoff gesiittigt ist, nachgewaschen. Trocknen und Wagung. Es hat sich die merkwiirdige Tatsache ergeben, dass AscorbinsLure und Kupfersalze in Konzentrationen, die einzeln die

1044 - - Ureasewirkung in keiner Weise beeinflussen, zusammen die Urease fast vollstandig hemmen. Wir erhielten z. B. (Spaltung ausgedriickf in em3 O,Of--n. NH,):

in Luft . . . in Stickstoff . in Luft . . . in Stickstoff .

Ohne Zusatz ~ mit 2 y Cu.. ImitAscorbins. ___ __. .. - I- 8,30 / 8,17 1 1 0,40 0,60

1 9,15 I

T,16 7,47 10,9 10,ll) 9,05 9,86 13,4 13,7?)

6,33 6,Ol 9,34 9,672) 11,6 10,2 12,5 13,O

Wir haben uns vergewissert, dass die verwendete Cu**-Konzen- tration die Arginase nicht schadigt. Wir fanden z. B. Spaltung ohne Zusatz 11,95,12,45 em3 0,02-n. NH,; mit 8 y Cu-* 10,05,11,70 cm3 in Rattenleber. Die Empfindlichkeit des Ferments scheint &+-as zu schwsnken.

Tabelle 1. 11' i r k u ng d e r As c o r b i n s a u r e a u f R a t t e n 1 e be r a r g i n D se.

(Spaltung ausgedruckt in mg Harnstoff, 2 Stunden 30 Minuten bei 40O).

in Luft . . . 4,89 4,71 4,62 4,58 1 9,43 1 9,57 9,29 I

Tabelle 2. E inf luss von Cal c iu msalze n a u f R a t t e n l e be rarginase.

Ansatz: 3 cm3 0,l-m. Arginin, 1 om3 0,l-m. Cystein resp. 1 cm3 0,Ol-m. CaC1, resp. 1 om3 0,l-m. Cystein + 1 om3 0,l-m. CaCI,, 1 cm3 Leber-Glycerinextrakt niit Glykokoll- puffer ad 10 cm3.

Spaltung ausgedruckt in cm3 0,02-n. NH, (2 Stunden bei 38O).

ohne Zusatz

1) 2 y cu-. 2) 4 y CU.. . 3, 4 y Cu.. und 3 Tropfen 10-proz. CaCI,.GH,O pro. 10 cm3 Ansatz. Calciumsalze

erhohen nach Elder, J l yrbdck und Larsson (1. c.) die Autouydations-Geschwindigkeit der Ascorbinsaure.

Luft . . .

Tabelle 3a. E i n f l u s s v o n C y s t e i n u n d Fer rosu l fa t .

Fermentlosung: 0,5 g Schweineleber-Trockenpulver mit 25 om3 Glykokollpuffer 10 Minuten extrahiert und zentrifugiert. Ansatz wie oben. Spaltungszeit 90 Minuten.

19,9 12,8 I 1592

ohne Zusatz

0,0001-m.

13,6 13,7 14,3 14,2

Tabelle 3b. Vergleich d e r W i r k u n g v o n E i u e n ( I 1 ) - u n d E i s e n ( I I 1 ) - S a l z e n .

Snsatze wie oben. (Die untereinander oder nebeneinander stehenden Zahlen sind Parallelwerte). cm3 0,02-n. NH,.

0,00001-m.

13,s 13,4

1046 - -

Tabelle 4. G l y c e r i n e x t r a k t a u s f r i s c h e r Meerschweinchcn-Leber .

Ansitze wie oben, Spaltung ausgedriickt in mg Harnstoff.

ohne Zusntz -1 anaerob -___

7,4? 6,82)

Tabelle 5. G 1 y ce r i n e x t r a k t au s f r is c h e r 31 a u s e le be r.

Ansatze wie oben. Spaltung ausgedriickt in nix Harnstoff.

-__

anaerob .

I Ascor binsaure

Tabelle 6. E i n f l u s s v o n C y s t e i n u n d S a u e r s t o f f a u s s c h l u s s auf f r i sche Schweine leber -

Arginase. 3 cm3 0,l-m. Arginin, 1 em3 Glycerinextrakt (1:40), 6 em3 Puffer; resp. 1 cm3

0,l-m. Cystein und 5 cm3 Puffer.

1 ohne Zusatz niit Cystein I Luft 1 anaerob

Arg inasewi rkung v o n R a t t e n l e b e r s c h n i t t e n . Die Bestimmung der Arginasewirkung erfolgte nach Krebs und

HenseZeit3). Das Spaltungsgemisch wird im Manometergefass mit konzentriertem Acetatpuffer versetzt, nach Temperaturausgleich wird &us dem Anhang Sojamehlextrakt eingekippt und das aus der Zerlegung des Harnstoffs entstehende Kohlendioxyd manometrisch bestimmt. Wir verwendeten des von den Autoren angegebene Salzgemisch.

-4rgininlosung: 1,7 g Arginin-hydrochlorid + 45 cms 0,l-n. NaOH ad 50 em3. Davon 1 Teil auf 5 Teile Salzgemisch.

l) 2 Stunden Spaltung. 2, 1 Stunde 30 Minuten Spaltung. 3, loc. cit.

- 1047 - Tabelle 7.

Rattenlebenchnitte mit argininhaltiger Salzlosung je 1 Stunde bei 10° geschuttelt, dann in neue Losung ubertragen.

mm3 CO, pro mg Frischgewicht nach der 1. Stunde 1 2. Stunde 1 3. Stunde

Schnittdicke I 38 61 1 50

I O J ~ mm . . . .

I 0,11 mni . . . . i 0,16 mm . . . . , 47

65

Tabelle 8. Spaltung in den Losungen, die (ohne Arginin) mit Leberschnitten geschuttelt

wurden. Die Losung enthielt anstelle von Arginin 1 Teil 0,3-m. Glykokoll auf 5 Teile Salzgemisch, um ahnliche Extraktionsbedingungen zu haben. p, 6, l (wenig gepuffert!). Kach Entfernen des Schnitts wurden in den Hauptraum des Manometergcfasses, der 2.5 om3 Losung enthielt, 0,5 om3 der Argininlosung und 1 cm3 konz. Acetatpuffer zugesetzt.

I Schnitt-

diclie I mm3C0, pro mg Frischgewicht 1 Spaltung durch den nach der

Schnitt nach

I 1.

Frl. G . Debrunner und Frau L. JVihnann sagen wir fur ihre Hilfe bei der Durch- fuhrung der Versuche besten Dank.

Basel, Physiologisch-chemische Anstalt der Universitat.

117. Uber das Lichtbrechungsvermogen der Cellulose und ihrer Derivate.

1. Der Einfluss von nativen, nicht-celluloseartigen Begleitstoffen auf das Lichtbrechungsvermogen von Cellulosefasern

yon Kisou Kanamarul). (21. VII. 31.)

Die Rontgenanalyse liefert fiir native Cellulosen der verschie- densten Herkunft identische Spektren. Es ist daher zu erwarten, dass die Cellulosekrystallite oder Micellen verschiedener pflanzlicher Zellwande, ihrem gleichartigen Raumgitter entsprechend, auch konstante optische Eigenschaften aufweisen. Die Prufung dieser Frage bietet dadurch ein besonderes Interesse, weil die Cellulose-

*) Aus Tokio, z. Zt. in Zurich.