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UE2 TD Cytosquelette (cours E. Cornillot) Protéines d’adhérence / Jonctions intercellulaires (T. Maudelonde) N. Boulle Année 2013-2014

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UE2

TD Cytosquelette (cours E. Cornillot)

Protéines d’adhérence / Jonctions intercellulaires

(T. Maudelonde)

N. Boulle Année 2013-2014

La plupart des illustrations du TD proviennent

de Molecular Biology of the Cell

Alberts, Johnson, Lewis et al.

(5ème édition)

∅ ≅ 25 nm ∅ ≅ 7 nm ∅ ≅ 10 nm

Microfilaments d’actineMF

MicrotubulesMT

Filaments intermédiairesFI

25 µm

Définition: Le cytosquelette

Globulaire Fibreux

Caractéristiques générales du cytosquelette

Cytosquelette dynamique : renouvellement ++

Permet → le changement de forme de la cellule, son mouvement, le déplacement d’organites, de molécules, l’endocytose, l’exocytose, la formation du fuseau mitotique…

Cytosquelette stable :

Impliqué dans certaines structures cellulaires: microvillosités, sarcomère, cils, flagelle…

Caractéristiques générales du cytosquelette

MF, MT:

Pas de liaison covalente entre les monomères

Renouvellement aux extrémités: polymérisation / dépolymérisation aux extrémités

Polymères orientés: + / -

Liaison ATP/GTP – ADP/GDP

Sous-unités non tissu spécifiques

FI :

Pas de liaison covalente entre les monomères

Renouvellement sur toute la longueur du filament (y compris aux extrémités)

Pas d’orientation + / -

Pas de liaison NTP/NDP

Type de FI spécifique de tissu

Croissance in vitro: Equilibre sous unités globulaires (G) / polymères (F)

Notion de concentration à l’équilibre

A l’extrémité, constantes:

kon (polymérisation)

koff (dépolymérisation)

La vitesse de polymérisation

(= Le nombre de sous unités globulaires qui s’ajoute à l’extrémité par seconde)

dépend de la concentration en sous unités [G]:

= kon x [G]

Polymérisation des sous unités globulaires (MF, MT)

! Idem actine

Polymérisation vs dépolymérisation?

- [Sous unités globulaires] > concentration à l’équilibre ([G]eq ) → polymérisation .Formation et allongement des polymères

- [Sous unités globulaires] < concentration à l’équilibre ([G]eq ) → Pas de polymères

A l’équilibre, à l’extrémité, [G]eq où :V Polyméris ation = V Dépolymérisation

kon x [G]eq = koff → [G]eq = koff / kon

Polymères (F)

ou Viscosité =

Nombre et longueur des polymères

ÉquilibreConcentration à l’équilibre : [G]eq

[G] diminue

Polymérisation des sous-unités globulaires (MF, MT)

Polymérisation des sous-unités globulaires (MF, MT)

In vivo, équilibre modulé par:

- La modification des sous unités globulaires (G) une fois polymérisées (ATP/GTP → ADP/GDP):

� Fragilise le polymère

� Les constantes cinétiques (kon et koff) ne sont pas les mêmes aux 2 extrémités (+ et -) des MF et des MT

→ Polymérisation extrémité + et dépolymérisation extr émité –

→ [G] eq différentes aux 2 extrémités

- La présence de protéines de liaison, stabilisation, nucléation, coiffe…

Polymérisation

Dépolymérisation

Zone de tapis roulantet d’instabilité dynamique

[G]

Taux d’élongation

0

+

-

[G]eq

Actine et microfilaments

∅ ≅ 7 nm

Rq: dans les cellules: [Actine G] soluble = 1000 fois [Actine G] eq → ?

QCM 1

Rq: Liaison non covalente entre monomères!

Séquestre

(- polymérisation)Echange ADP / ATP

(+ polymérisation)

Protéines liant l’actine (AAP)

Nucléation (ext +)

Cap Z

Gel → Solution (Ca++)

Séquestre

(- polymérisation)

Echange ADP / ATP

(+ polymérisation)

Dégradation (lie actine – ADP)

Fragmentent Stabilisent

Stabilisent

Nucléation (ext -)

QCM 1

Protéines à domaine FERMSpectrineDystrophine

Protéines d’ancrage

Nucléation (ext +)

A connaître!

Protéines liant l’actine (AAP)

QCM 1

Les protéines d'assemblageProtéines associées à l’actine:

Dimère de filamineMF + α-actinine MF + fimbrine

Faisceau contractile

Disposition lâche permet d’intercaler

la myosine II

Faisceau parallèleDisposition serrée ne

permet pas d’intercaler la myosine II

Réseau type gelRéseau tridimensionnel

mécaniquement résistant

Protéines liant l’actine (AAP)

QCM 1

α-actinine

filamine

Fimbrine, villineet Formine (ext +)

Contacts Focaux

(intégrines)

Fibres de stress = Fibres de tension

Protéines liant l’actine (AAP)

Lamellipode

lamellipode

QCM 1

Arp2/3 à la périphérie

Réseau de type gel: filamine

Actine et microfilaments

2.2. Protéines associées et leurs fonctions

+ La globule rouge

- Spectrine- Bande 4.1

-> domaine FERM- Glycophorine

-> Glycosylations- …

Glycophorine

Bande 4.1

Spectrine (tétramère)

Spectrine

Domaines de fixation à l’actine

ActineBande 4.1

α

α

β

β

N

C C

N

TM

TM

Protéines d’ancrage: Les protéines à domaine FERM

QCM 1 Actine et microfilaments

Le cytosqueletteQCM 2

Coiffe de GTP

Tubuline liée au GDP

croissance « catastrophe »

Instabilité dynamique

Microtubules > microfilaments

Cf Fuseau mitotique

→ Alternance de phases de polymérisation / dépolymérisation

→ Touche en général l’extrémité +

Filament bipolaire de Myosine II

MF

Alpha-actinine

Jonctiond’adhérence

Ceinture d’adhérence

Jonctiond’adhérence

Cadhérine

Zone d’adhérence

Filament bipolaire de Myosine II

MF

Alpha-actinine

Jonctiond’adhérence

Ceinture d’adhérence

Jonctiond’adhérence

Cadhérine

Zone d’adhérence

Actine et microfilamentsQCM 2

Dans les cellules non musculaires

Zonula adherens ou ceinture d’adhérence (cellules épithéliales)

Microvillosités: MF stables!

ListeriaVésicule endocytose

Arp2/3

Remarque: Endocytose:

Polymérisation d’actine (Arp 2/3): propulsion sans moteur (« comète » d’actine)

QCM 2

Idem virus de la vaccine

Actine et microfilamentsQCM 2

titineDisque Z

Extrémité +Extrémité - Actine (filament fin)

Myosine (filament épais)Ligne MDisque Z

sarcomère

Cap Z

Contraction musculaire:

- Ca++

- Déplacement des filaments fin d’actine sur les filaments épais de myosine

QCM 3 Protéines motrices: myosines /kinésines

Myosines (microfilamentsd’actine)

Kinésines (microtubules)

- Hydrolyse de l’ATP → changement conformationnel → mouvement

NB: Dynéine: famille différente

Domaine moteur

(ATPase)

Domaine moteur

(ATPase)

Exercice 1

5 µ

m

Photo-activation

5 µ

m

Photo-activation

+

-

Actine G photoactivable

Lumière

QCM 4-5

Polymère d’actine

Lumière

Temps

T0

Tapis roulant:

la concentration en sous-unités libres est telle que:

vitesse de croissance (ext +) = vitesse de dépolymérisation (ext -)

Polymère de longueur constante

= Tapis roulant (« treadmilling » )

Le cytosquelette / Tapis roulantQCM 4-5

+-

Hydrolyse ATP (actine) → Constante cinétiques différentes aux 2 extrémités

→ Polymérisation ext + / Dépolymérisation ext -

5 µ

m

Photo-activation

5 µ

m

Photo-activation

+

-

+

-

Myosine I

Instabilité dynamique

(polymérisation, v variable)

Flux rétrograde 1 µm/min

(v constante)

Exercice 1

Filopode

« Traction»

∅ ≅ 25 nm

Microtubules

Microtubules

Microtubules en rouge

Golgi en vert (centre de la cellule)

Destruction des microtubules

Tubuline et Microtubules

- Tubuline β

- Vers la membrane plasmique

- Tubuline α

- Vers le centre de la cellule

→ Vitesse de polymérisation extrémité + > extrémité -

+-

Séquestre la tubuline

(Activité régulée par phosphorylation)

MAP = Microtubules Associated Protein

Tubuline et Microtubules

13 protofilamentsαα αα

GT

Pββ ββ

GT

P

! Pas de liaisons covalentes

QCM 6

ββββ: activité GTPase

Les 2 types de Microtubules

• MT labiles:

MT cytosoliques ,Sensibles au froid (0-4°C) et aux agents chimiques (Colchicine, Vinblastine, Taxanes )Instabilité intrinsèque � extrêmement dynamiques

� Adaptabilité

• MT stables:

Stabilisés par des protéines spécifiquesInsensibles aux agents physiques ou chimiques : ils ne dépolymérisent jamais

Forment des structures pluritubulaires :� Centriole, corpuscule basal� Axonème

Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Corpuscule basal de protozaire

QCM 6

QCM 6Centrosome: COMT = Centre Organisateur des Microtub ules

Centrosome = principal COMT des cellules animales

���� Les microtubules croissent à partir des sites de nu cléation (anneaux de tubuline γγγγ) (pas des centrioles!)

Centrioles

9 triplets de microtubules (A, B, C) dont seul A est complet

Ponts de nexine entre les triplets

Structure protéique "en rayons de roue" relie les microtubules A

~ Corpuscule basal (cils, flagelles)

! Triplets

QCM 6 Tubuline et Microtubules

Centriole: appartient au centrosome

nexine

QCM 6 Structure des cils / Flagelles

- Corpuscule basal (~ centriole) – 9 triplets de microtubules qui se prolongent dans l’axonème

- Axonème = 9 paires de microtubules entourés de membrane plasmique ± 2 microtubules centraux (9+0; 9+2) + nexine, dynéine...

! paires

Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)Paire de microtubule périphérique

Membrane plasmique

Microtubule central (simple)

Bras de dyné ine externe

Bras de dyné ine interne

nexine

Gaine interne

rayon

Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)Paire de microtubule périphérique

Membrane plasmique

Microtubule central (simple)

Bras de dyné ine externe

Bras de dyné ine interne

nexine

Gaine interne

rayon

Racine ciliaire

Corpuscule basal

+ + +

Axonème=

MT périphérique

+Paire centrale

MT

Paire centrale de MT

Doublet de MT périphériques

Racine ciliaire

Corpuscule basal

+ + +

Axonème=

MT périphérique

+Paire centrale

MT

Racine ciliaire

Corpuscule basal

+ + +

Axonème=

MT périphérique

+Paire centrale

MT

Paire centrale de MT

Doublet de MT périphériques

⊝⊝⊝⊝

KINESINES

DYNEINES

Microtubule ⊕⊕⊕⊕

vésicule

vésicule

Moteurs moléculaires des microtubules

QCM 6

(~ myosines)

Tubuline et Microtubules

Endocytose,

Mouvements des cils, flagelles

Exocytose, Membrane plasmique

- Flux vectoriel permanent- Flux rétrograde : Golgi vers le RE

Le cytosqueletteQCM 6

Nexine

ATP → ADP

Dynéine

Hydrolyse de l’ATP (dynéine) = mouvement vers -

Cils et flagelles

Exercice 2

mélanophore

mélanosome

QCM 8

DispersésAgrégés

Dynéine + protéines stabilisatrices

kinésine

Mélanosomes

Dynéines actives

Kinésines inactives

Dynéines inactives

Kinésines actives

PKA

PP2A

QCM 8

Filaments intermédiairesQCM 9

∅≅ 10 nm

~ corde

Filaments intermédiairesQCM 9

Mise en évidence du renouvellement des sous-unités d’un FI par FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)

Renouvellement des sous-unités:- latéral - homogène le long du filament

Filaments intermédiairesQCM 9

6 groupes selon type de sous-unité

Homodimères ou hétérodimères:- ex: kératine basique + kératine acide- desmine, vimentine

Type Protéine

I Cytokératines acides �II Cytokératines neutres �

ou basiquesIII Vimentine �

Desmine �Protéines fibrillaires

acides gliales (GFAP)IV Protéines de

neurofilaments �V Lamines nucléaires �

VI Nestine

Localisation / type cellulaire

Cellules épithélialesCellules épithéliales

Cellules mésenchymateusesCellules musculaires

Cellules gliales

Astrocyte et certaines cellules de SchwannNeurones

NoyauCellules souches neuronales

et neurones immatures

! Utilisé en anatomopathologie pour identifier l’or igine d’une tumeur

QCM 9

Figure “Cours de Biologie Cellulaire, Edition 4”, P Cau & R Seite, Ed. ellipses

+ Collaboration entre différents éléments du cytosquelette

- Dystrophine

-> MF actine (actine du cortex cel.)

- Desmine

-> FI de desmine (actine sarcomère)

Ancrage à la membrane (sarcolemme)

4.2. Différents types de filaments intermédiaires

+ Les neurofilaments (Type IV)

- Association avec MT axone et dendrites

Rigidité, souplesse axone

Diamètre axone

- Sclérose Latérale AmyotrophiqueAxone

Noyau

++

Neurone

QCM 9

MAP?

Figure “Cours de Biologie Cellulaire, Edition 4”, P Cau & R Seite, Ed. ellipses

QCM 11

Bruno SAUBAMEAEA3621 –Service de Biologie CellulaireService Commun d’Imagerie Cellulaire et MoléculaireUniversité Paris Descartes

http://www.etsl.fr/Doc_pdf/Imagerie_confocale_09.pdf

Marquage du cytosquelette d’actine par la phalloïdine-AF680 (gris)

Phalloïdine: Stabilisatrice

Idem Jasplakinolide

Cytochalasine B

Latrunculine

CytosqueletteFonctions et organisation:

Microfilaments (actine):

SU globulaireFilament polarisé

Liaison ATP/ADP

Protéines de coiffeProtéines motricesProtéines de coupure

Séquestration des monomèresProtéines stabilisatrices

Filaments intermédiaires :

SU fibreuseFilament non polarisé

Pas de liaison aux nucléotides

Pas de protéines de coiffe, motrices ou de coupure

Pas de séquestration des monomèresProtéines stabilisatrices

Microtubules (tubuline):

SU globulaireFilament polarisé

Liaison GTP/GDP

Protéines de coiffeProtéines motricesProtéines de coupure

Séquestration des monomèresProtéines stabilisatrices

Pas dans le noyau!

Protéines d’adhérence – Jonctions

Cours T. Maudelonde

Jonctions cellulaires → Actine / Filaments intermédiaires

Actine (jonctions adhérentes)

Filaments intermédiaires (desmosomes)

QCM 12

Cadhérines

IntégrinesContacts focaux

QCM 12 Protéines d’adhérence

Les protéines d’adhérence:

3- Famille des Cadhérines

Ex: E-Cadhérine, Desmoglein

4- Famille des Integrines

Ex: α5β1

2- Famille des Sélectines

Ex: L - E - P- Sélectines

1- Famille des Immunoglobulines

Ex: N-CAM

QCM 13-14

1- Les ImmunoglobulinesQCM 13

1- Les Immunoglobulines

homophiliques

Dans les jonctions

hétérophiliques+++

CAM

Intégrine

(Immunoglobuline)

QCM 13

Leucocyte

Cellule endothéliale (vaisseaux)

2- Les Sélectines:

Glycoprotéines membranaires - Toujours hétérophilique

Se lient aux sucres (via domaine lectine)

Cellules spécialisées:

E- endothéliales

P- Plaquettes

L- Leucocytes

QCM 13

Leucocyte Cellule endothéliale

1- Sucres 2- E-Sélectine Rolling (liaison faible)

3- Integrine activée 4- Ig-CAM Ouverture jonctions

Rôle des sélectines et des Ig CAM dans les Mouvemen ts du leucocyte

sucres

E-Selectine

leucocyte

Cellule endothéliale

3- Les cadhérinesDistribution des domaines dans différentes cadhérines ����

QCM 14

Cadhérine EDomaine CAD

Cadhérine T

RET

Desmocolline-1a

Desmogléine-1

Glycosylphosphatidylinositold’ancrage (GPI)

Tyrosine kinase

ICS

ICS

ICS

Fixation de la caténine

Interaction avec lesfilaments intermédiaires

3- Les Cadhérines

→ Interactions cellule / cellule

Interactions homophiliques

QCM 14

3- Cadhérines et jonction adhérente (Actine)

(Ceinture d’adhérence / zonula adherens)

Actine

αααα- catenine

QCM 14

Filament bipolaire de Myosine II

MF

Alpha-actinine

Jonctiond’adhérence

Ceinture d’adhérence

Jonctiond’adhérence

Cadhérine

Zone d’adhérence

Filament bipolaire de Myosine II

MF

Alpha-actinine

Jonctiond’adhérence

Ceinture d’adhérence

Jonctiond’adhérence

Cadhérine

Zone d’adhérence

3- Cadhérines et desmosomes (filaments intermédiaires)

Filaments intermédiaires(ex: cytokératine des cellules épithéliales)

« boutons »Protéines d’ancrage

QCM 14

4- Les Intégrines:

Dimère α/β –Toujours hétérophilique

Interactions :

- Cellule / Cellule- Cellule / Matrice extracellulaire +++

- 18 chaine α- 8 chaines β

QCM 14

4- Les Intégrines:

Interactions Cellule / Cellule

hétérophiliques

CAM

Intégrine

(Immunoglobuline)

QCM 14

Leucocyte

Cellule endothéliale (vaisseaux)

Actine et microfilamentsQCM 1 / QCM 14

Contacts Focaux

(Intégrines)

Fibres de stress = Fibres de tension

Interactions Cellule / Matrice extracellaire

4- Les Intégrines:

Dimère α/β – Activation

« pince »

QCM 14

4- Les Intégrines:

Contacts focaux / Actine

Fibronectine

Appartient à la matrice extracellulaire

Séquence RGD

fibronectine

Signaux cellulaire (cycle cellulaire…)

Actine

Intracellulaire

Extracellulaire

QCM 14

4- Les Intégrines:

Hémidesmosomes / Filaments intermédiaires

Lame basale

Cellule épithéliale

Cytokératine (FI)

HemidesmosomeCytokératine (FI)

Protéines d’Ancrage

Intégrines

QCM 14

Jonctions intercellulaires

Jonctions intercellulaires

Importance des interactions:

Cellule / cellule

Cellule / matrice extracellulaire

Jonctions → signaux intracellulaires

Survie, division…

La cellule cancéreuse « s’affranchit » de ses jonctions

→ perturbations +++ des molécules d’adhérence

Exemple: perte de E-cadhérine

Les jonctions dans la cellule épithéliale

actine

Filament intermédiaire

Jonction étanches (occludines / claudines)

Jonction adhérente

Desmosome

(en « bouton »)

Jonction communicante (connexons)

Hemi-desmosome

Complexe de jonction: cellule épithéliale polarisée

Contacts focaux

Jonction Étanche (serrée)

Jonction adhérente

Desmosome

Les jonctions dans la cellule épithéliale

Espace étroit: Les jonctions étanches

Définit la polarité cellulaire

Protéines « spécifiques »: occludines / claudines

tout autour de la cellule

Jonctions étanches (serrées)

QCM 15

Espace étroit: Les jonctions étanches

Définit la polarité cellulaire

Protéines « spécifiques »: occludines / claudines

QCM 15

QCM 15 Les jonctions communicantes

Protéines « spécifiques »: connexines

Communication entre deux cellules électro-chimique / méta bolique

Espace inter-cellulaire

Membranes cellules adjacentes

Membranes plasmique

Fermé

Ouvert

Protéines de connexine

Connexon composé de 6 connexines

Canal

Membranes plasmiques des

2 cellules

2 Connexons formant 1 canal aqueux entre

les 2 cellules

���� Ouverture jonctions communicantes régulée: Ca ++, H+, DDP…

���� Mort cellulaire → Entrée de Ca ++ → Fermeture des jonctions communicantes

QCM 15 Les jonctions communicantes

Protéines « spécifiques »: connexines

Communication entre deux cellules électro-chimique / méta bolique

Jusqu’à 1 kD!

Connexine : 4 hélices transmembranaires

Connexon

Les molécules d’adhérence

Cadhérines « classiques »

Dépendance Ca++

Interactions Homophilic ou hétérophilique

Cytosquelette Jonctions cellulaires

Ex

E-Cadhérine Oui Filaments d’actine via les catenines (αet β)

Jonction adhérente

Cadhérines des desmosomes

Desmoglein, desmocollin

OuiFilaments

intermédiaires (cytokératine....)

Desmosomes

Immunoglobulines N-CAM… Non Les 2Jonctions serrées, Desmosomes …

Sélectines Cellules spécialisées:

L-E- et P-sélectines

Oui Hétérophiliques Filaments d’actine

Adhésion cellule / cellule

Adhésion cellule / matrice

Intégrines α5β1… Oui HétérophiliquesFilaments d’actine via talin, vinculin, α-actinin…

Contacts focaux

Intégrines Oui Hétérophiliques Filaments intermédiaires

Hemi-desmosomes

Homophiliques

Homophiliques

Les Jonctions

Cadhérines « classiques »

CytosqueletteJonctions cellulaires

Molécules d’adhérence

Filaments d’actine viales caténines (α et β)

Cadhérines des desmosomes (desmoglein, desmocollines…)

Filaments intermédiaires

(cytokératine....)

Desmosomes

Filaments d’actine

Adhésion cellule / cellule

Adhésion cellule / matrice

Intégrines

α5β1…

Filaments d’actine via talin, vinculin, α-actinin…

Points d’adhésion focaux

Intégrines

Filaments intermédiaires

Hemi-desmosomes

Jonction adhérente

Jonctions étanches Occludines, Claudines,

Jonctions communicantes

Connexines

Autres Selectine / CAM Ig / IntegrineLeucocyte / endothélium (des vaisseaux) ; immunité…