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Aus der Strahlenklinik der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau
“Tumor-infiltrierende Lymphozyten beim Glioblastoma multiforme”
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Christian Beyer
aus
Hersbruck
Gedruckt mit Erlaubnis derMed izi n ischen Faku ltät der Fri edri ch -Alexander-U n iversität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Referent:
Korreferent:
Tag der mündlichen Prüfung:
Prof. Dr. J. Schüttler
Prof. Dr. G. G. Grabenbauer
Prof. Dr. R. J. Fietkaus
10. Februar 2010
3
1. Zusammenfassung.............................................................................................. 5
1.1. Englisch........................................................................................................ 5
1.2. Deutsch ........................................................................................................ 8
2. Einleitung ....................................................................................................... 11
2.1. Das Glioblastoma multiforme - Epidemiologie, Therapie und Prognose. 11
2.2. Tumor-infiltrierende, inflammatorische Zellen im GBM........................... 12
2.3. Lokale und globale Immunsuppression in Patienten mit GBM................ 16
2.4. Ziele der Untersuchungen ...................................................................... 20
3. Material und Methoden...................................................................................... 22
3.1. Immunhistochemische Untersuchungen .................................................... 22
3.1.1. Auswahl des Patientenkollektivs ......................................................... 22
3.1.2. Anfertigung der Tissue Micro Arrays® ................................................. 22
3.1.3. Färbung relevanter Lymphozytensubpopulationen ............................. 24
3.1.4. Bildanalytisch-gestützte Auswertung mit BIOMAS® ............................ 25
3.1.5. Statistische Analyse ............................................................................ 28
3.2. Chemokinetischer Migrations-Assay .......................................................... 29
3.2.1. Das Prinzip der 2-dimensionalen Boyden-Chamber ........................... 29
3.2.2. Isolation der Lymphozytensubpopulationen ........................................ 37
3.2.3. Herstellung der Tumorüberstände....................................................... 39
4. Ergebnisse ........................................................................................................ 42
4.1. Immunhistochemische Untersuchungen .................................................... 42
4.1.1. Auswertung der klinischen Daten........................................................ 42
4.1.2. Anzahl und Lokalisation Tumor-infiltrierender Lymphozyten im GBM. 49
4.1.3. Prognostische Bedeutung der Tumor-infiltrierenden Lymphozyten..... 55
4.2. Ergebnisse aus Chemotaxis-Untersuchungen ........................................... 67
4.2.1. Konzentrationsausgleich in der Boyden-Chamber .............................. 67
4.2.2. Charakterisierung der Primärzelllinien ................................................ 67
4.2.3. Calcein zur Detektion migrierter Zellen ............................................... 71
4.2.4. Einfluss der Migrationszeit auf die Migration....................................... 73
4.2.5. Einfluss des Kulturmediums auf die Migration..................................... 75
4.2.6. Migration auf A172- und LN18-Überstände......................................... 79
4.2.7. Migration auf Primärüberstände .......................................................... 80
5. Diskussion ......................................................................................................... 86
6. Abkürzungsverzeichnis...................................................................................... 95
4
7. Literaturverzeichnis ........................................................................................... 96
8. Danksagung .....................................................................................................102
9. Curriculum vitae ...............................................................................................103
5
1. Zusammenfassung
1.1. Englisch
Scientific background: In the early 70’s of the last century, researchers
identified different subtypes of tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) with diffuse
and perivascular infiltration patterns in malignant gliomas (MG). Subsequent
studies investigated the role of TIL as prognostic biomarkers in patients with MG.
Since the results of these studies were conflicting, the prognostic value of
lymphocytic tumour infiltration in MG remained unknown: Some researchers
showed that TIL were positive prognostic markers, while others demonstrated that
increased lymphocytic tumour infiltration was associated with poor prognosis. Few
studies did not observe any prognostic role of TIL in MG at all.
The discovery of the FoxP3+ regulatory T-cells (Treg) and their key role in tumour
immunology prompted us and other researchers to re-evaluate the prognostic role
of TIL in MG. First results demonstrated that Treg might be involved in the
defective cellular immune system of patients with MG. Thus, by causing local
immunosuppression in the tumour side, Treg could promote tumour progression
and worsen the prognosis of patients with MG. In this context, differences in
numbers of Treg might explain the conflicting results of the early studies on TIL in
MG, when Treg had still been unknown. Therefore, we wanted to re-evaluate the
prognostic impact of Treg in MG and identify mechanisms of Treg and TIL attraction
by MG tumour cells, which might escape the anti-tumour immune response with
the help of immunosuppressive Treg.
Methods: The Tissue Micro Array® (TMA®)-technique was performed for
immunhistochemistry analysis of 77 patients with glioblastoma multiforme (GBM),
the WHO-grade IV-variant of MG. TMA®-slices were stained against CD3, CD8,
CD20, CD34, CD68, FoxP3, and MIB1. Slices were evaluated with computer-
assisted microscopy; data on tumour cell counts, numbers of TIL and tissue
vascularisation were collected for each patient. In addition to cell counts,
distances from cells to vessels were evaluated.
The Tumorzentrum (TUZ) Erlangen provided clinical data, including information
about overall survival, age, and ECOG-index of patients at diagnosis. Cox’s
6
regression and Kaplan-Meier-estimator with log rank test were performed to study
the prognostic role of TIL and tumour vascularisation for the overall survival of
patients.
In addition to the immunhistochemistry analysis, migration of peripheral blood
mononuclear cells (PBMC), CD8+ T-cells and Treg towards supernatants from
GBM tumour cells was studied in a modified Boyden chamber. Migrating immune
cells were isolated from the peripheral blood of healthy individuals and separated
with Miltenyi Biotech MicroBeads®. Tumour supernatants were produced by
established GBM cell lines as well as by primary GBM tumour cell lines.
Furthermore, tumour cells were treated with radiation and/or temozolomide during
the production of supernatants to examine the impact of anti-neoplastic therapy
on tumour infiltration by TIL.
Results: The number of neither Treg nor CD3+, CD8+, and CD20+ TIL were
important prognostic markers for the overall survival of patients with GBM. In
contrast, high numbers of CD68+ microglia/macrophages were associated with a
prolonged survival of patients. Interestingly, the Treg/CD68-ratio was of prognostic
relevance and prolonged survival occurred with high Treg/CD68-ratios. Dense
tumour vascularisation was a positive prognostic marker for patients’ survival,
whereas high tumour cell counts were associated with a poor prognosis in
patients with GBM. Distances of TIL to blood vessels did not show any prognostic
importance.
In the Boyden chamber assay, migration of lymphocytes towards supernatants of
established tumour cells was inconsistent and dependent on the TIL
subpopulation and the supernatant. In primary cell lines, migration depended on
the specific tumour supernatant of treated or untreated tumour cells. Tumour
supernatants from primary tumour cells that were pre-treated with radiation and
temozolomide generally enhanced lymphocytic migration.
Conclusion: The findings from both immunohistochemistry analysis and Boyden
chamber assays suggest that Treg and TIL might play an important role in tumour
progression and could help to establish the prognosis of patients with GBM. Many
7
results of this study, however, seem to be conflicting, which may be due to the
complex nature of tumour immunology in MG and GBM. To further elucidate the
role of Treg and TIL in MG, future studies need to mimic the tumour
microenvironment in detail.
8
1.2. Deutsch
Wissenschaftlicher Hintergrund: Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) in
malignen Gliomen (MG) wurden seit den frühen 70er Jahren des vergangenen
Jahrhunderts intensiv beforscht. Dabei zeigte sich, dass TIL diffus im
Tumorgewebe oder dicht um die Gefäße lokalisiert sind. Nachfolgende Studien
untersuchten das Überleben von Patienten mit MG in Abhängigkeit von der
Infiltration des Tumors durch Lymphozyten. Da die Ergebnisse strittig waren, blieb
die prognostische Bedeutung der TIL in MG weitestgehend unbekannt. TIL in MG
erwiesen sich in unterschiedlichen Studien sowohl als positive als auch als
negative prognostische Faktoren für das Überleben der Patienten. Einige Autoren
kamen zu dem Ergebnis, dass TIL keine prognostische Bedeutung für das
Gesamtüberleben der Patienten hätten.
Mit der Entdeckung der FoxP3+, regulatorischen T-Zellen (Treg) und ihrer
bedeutenden Rolle in der Tumorimmunologie, mussten die bisherigen
Beobachten zu TIL in MG neu bewertet werden. Erste Studien wiesen nach, dass
Treg an der eingeschränkten zellulären Immunantwort von Patienten mit MG
beteiligt sind. Da Treg auch eine lokale Immunantwort im Tumor verursachen,
könnten sie zur Tumorprogression beitragen und die Prognose der Patienten
verschlechtern. Des Weiteren könnten Unterschiede in der Anzahl der Treg die
strittigen Ergebnisse der frühen Studien, als Treg noch unbekannt gewesen waren,
erklären. Folglich war das Hauptaugenmerk der vorliegenden Arbeit, die
prognostische Bedeutung der TIL in MG nochmals zu untersuchen. Außerdem
sollten Mechanismen erforscht werden, die zur chemotaktischen Anlockung von
TIL und Treg durch Tumorzellen maligner Gliome führen und damit den
Tumorzellen ein Immunprivileg verschaffen könnten.
Methoden: Die immunhistochemische Untersuchung der Tumorproben von 77
Patienten mit Glioblastoma multiforme (GBM), der WHO-Grad 4-Variante
maligner Gliome, wurde mittels Tissue Micro Array (TMA)®-Verfahren
durchgeführt. Die TMA® wurden gegen CD3, CD8, CD20, CD34, CD68, FoxP3
und MIB1 gefärbt. Mittels computer-gestützter Bildanalyse wurden die Anzahl der
Tumorzellen, die Anzahl der TIL sowie die Tumorvaskularisierung für jeden
9
Patienten erfasst. Zudem wurden die Distanzen von Tumorzellen und TIL zu den
Gefäßen ermittelt.
Die klinischen Patientendaten, inklusive des Gesamtüberlebens, Alters und
ECOG-Index zum Diagnosezeitpunkt, wurden vom Tumorzentrum (TUZ) des
Universitätsklinikums Erlangen zur Verfügung gestellt. Die prognostische
Bedeutung der TIL und der Tumorvaskularisierung für das Gesamtüberleben der
Patienten wurde mittels Cox Regression und Kaplan-Meier-Schätzer statistisch
überprüft.
Neben den immunhistochemischen Untersuchungen, wurde in einer modifizierten
Boyden Chamber die Migration peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC),
CD8+ T-Lymphozyten und regulatorischer T-Zellen auf Überstände von GBM-
Tumorzellen untersucht. Die Immunzellen wurden aus dem peripheren Blut
gesunden Probanden isoliert und mit MicroBeads® isoliert. Tumorüberstände
wurden von etablierten GBM-Zelllinien und von GBM-Primärkulturen
abgenommen. Zudem wurden Tumorzellen mit Bestrahlung und/oder
Chemotherapie mit Temozolomid vorbehandelt, um einen möglichen Einfluss der
Tumortherapie auf die lymphozytäre Tumorinfiltration herauszufinden.
Ergebnisse: Tumor-infiltrierende Treg, CD3+, CD8+, und CD20+ Lymphozyten
waren nicht von prognostischer Bedeutung für das Überleben der GBM-Patienten.
Dagegen war eine hohe Anzahl Tumor-infiltrierender CD68+
Mikroglia/Makrophagen mit einem verlängerten Überleben der Patienten
assoziiert. Erstaunlicherweise war der Treg/CD68-Quotient von prognostischer
Bedeutung. Ein hoher Treg/CD68-Quotient war mit einem verlängerten Überleben
assoziiert. Eine erhöhte Tumorvaskularisierung war ein positiv prognostischer
Faktor für das Überleben der Patienten, wohingegen sich eine erhöhte
Tumorzelldichte negativ auf die Prognose der Patienten auswirkte. Abstände von
TIL und Blutgefäßen waren ohne Bedeutung für die Prognose der Patienten.
Die Migration von Lymphozyten auf Tumorüberstände in der Boyden chamber
war nicht einheitlich, sondern abhängig von der TIL-Subpopulation und den
verwendeten Überständen. Bei den Überständen von Primärkulturen schien die
10
Migration in erster Linie von der Tumorzelllinie und deren Behandlung abhängig,
aber unabhängig von den migrierenden Immunzellen. Nach
Kombinationsbehandlung der Tumorzellen mit Bestrahlung und Temozolomid war
die Migration auf den entsprechenden Tumorüberstand üblicherweise erhöht.
Schlussfolgerung: Die Erkenntnisse aus den immunhistochemischen
Untersuchungen und den Migrationsversuchen lassen vermuten, dass die Treg
und TIL die Tumorprogression und damit das Überleben von Patienten mit GBM
wesentlich beeinflussen können. Dennoch scheinen einige Ergebnisse dieser
Studie widersprüchig, was an den komplexen Zusammenhängen in der
Tumorimmunologie von MG und GBM liegen könnte. Zukünftige Studien sollten
deshalb versuchen, das Tumormilieu noch detailgetreuer nachzustellen, um die
Rolle der Treg und der TIL in malignen Gliomen weiter aufklären zu können.
11
2. Einleitung
2.1. Das Glioblastoma multiforme - Epidemiologie, Therapie und Prognose
Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der häufigste und zugleich bösartigste
Tumor astrozytären Ursprungs. Mehr als 50 % aller Gliome und 10 bis 12 % aller
primären Hirntumore des Erwachsenenalters sind Glioblastome. Die Inzidenz für
Nordamerika und Europa beträgt zwei bis drei pro 100 000 (Deckert et al. 2001).
Die Behandlung von Glioblastompatienten erfolgt interdisziplinär und umfasst
Chirurgie, Strahlen- und Chemotherapie. Im Anschluss an die Resektion des
Tumors erhalten Glioblastompatienten eine simultane und adjuvante
Radiochemotherapie. Patienten mit nicht resektablen GBM werden primär
radiochemotherapiert. Der Therapiestandard für die Radiochemotherapie wurde
in einer großen Multicenter-Studie von Stupp etabliert (Stupp et al. 2006; Stupp et
al. 2005). Die lokale Gesamtdosis der Radiotherapie beträgt dabei 60 Gy, die
normofraktioniert in 30 Einzelbestrahlungen, zu je 2 Gy, mit wöchentlich fünf
Bestrahlungstagen, über sechs Wochen appliziert wird.
Das Alkylans Temozolomid (Temodal®) ist Mittel der Wahl bei der simultanen und
adjuvanten systemischen Therapie. Die individuelle Dosierung wird über die
Körperoberfläche des Patienten berechnet. Während der Strahlentherapie
erhalten die Glioblastompatienten täglich 75 mg Temozolomid, an allen sieben
Tagen pro Woche. Nach Beendigung der simultanen Radiochemotherapie folgen
im Einmonatsabstand sechs Zyklen adjuvante Chemotherapie mit jeweils 150 bis
200 mg Temozolomid an fünf Tagen.
Temozolomid (TMZ) ist ein Prodrug, das spontan in seine Wirkform 5-(3-
methyltriazen-1-yl)imidazole-4-carboxamide (MTIC) hydrolysiert. Es wird oral
appliziert und besitzt eine Bioverfügbarkeit von nahezu 100 % (Weller et al.
2005). Temozolomid kann die Blut-Hirn-Schranke gut passieren und die
Konzentration im Liquor beträgt circa 20 % der Plasmakonzentration (Ostermann
et al. 2004). Seine antineoplastische Wirkung beruht auf der Alkylierung der DNS
an der O6-Position des Guanins. Gesunde Körperzellen wie auch Tumorzellen
können mit Hilfe des DNS-Reparaturenzyms O6-Methylguanin-DNS-
Methyltransferase (MGMT) diese Läsion reparieren. Der Therapieerfolg bei der
12
Behandlung mit Temozolomid ist daher von der MGMT-Aktivität in den
Tumorzellen abhängig, wobei eine niedrige MGMT-Aktivität in den
Glioblastomzellen ein besseres Ansprechen auf Temozolomid ermöglicht. Als
klinischer Biomarker wurde die Bestimmung des MGMT-Promotor-
Methylierungsstatus am resezierten GBM-Gewebe etabliert. Ist der MGMT-
Promotor wie bei circa 20 bis 30 % aller GBM-Patienten methyliert, dann spricht
das für eine niedrige MGMT-Aktivität in den Tumorzellen, ein gutes Ansprechen
auf Temozolomid und eine bessere Prognose (Stupp 2006; Stupp 2005).
Glioblastomzellen infiltrieren diffus in das umgebende, gesunde Gewebe, weshalb
das GBM nicht im Gesunden reseziert werden kann und letztendlich jeder Patient
ein Rezidiv erfährt. Bei adjuvanter Radiochemotherapie mit Temozolomid beträgt
das mittlere Überleben 14,6 Monate, das Zweijahresüberleben 26,5 % (Stupp
2005). Die Einführung von Temozolomid verbesserte insbesondere das
Zweijahres- sowie das Langzeitüberleben. Als Langzeitüberleber werden beim
GBM diejenigen Patienten bezeichnet, die drei Jahre nach Diagnosestellung noch
am Leben sind.
Circa 3 bis 5 % aller Glioblastompatienten sind Langzeitüberleber. Bisher sind
drei prognostisch Faktoren bekannt, die Langzeitüberleber auszeichnen: Ein
junges Lebensalter (< 40 Jahre), ein hoher Karnofsky Performance Score
(Median = 80) und die Methylierung des MGMT-Promotors (Hegi et al. 2005; Krex
et al. 2008). Das Langzeitüberleben wird durch diese drei Prognosefaktoren
jedoch nicht hinreichend erklärt. Beispielsweise zeichnen sich nicht alle
Langzeitüberleber durch einen methylierten MGMT-Promotor aus. Umgekehrt
sprechen manche Patienten mit inaktiviertem Reparaturenzym schlecht auf die
Therapie mit Temozolomid an (Krex and Schackert 2008). Es muss also weitere
biologische Faktoren geben, die den Therapieverlauf günstig beeinflussen und
das Überleben von GBM-Patienten verlängern.
2.2. Tumor-infiltrierende, inflammatorische Zellen im GBM
Bereits zu Beginn des letzten Jahrhunderts erkannte William Coley, ein Chirurg
aus New York, dass das menschliche Immunsystem einen kritischen Einfluss auf
13
die Entwicklung neoplastischer Erkrankungen nehmen kann (Old 1996). Er
beobachtete bei einigen seiner Patienten die spontane Regression von Sarkomen
nach vorausgegangener bakterieller Infektionserkrankung (Coley 1991). Im Jahr
1929 stellte Pearl an Autopsien am Johns Hopkins Hospital fest, dass Patienten,
die unter Lebzeiten an Tuberkulose litten, seltener an Krebs erkrankten (Pearl
1929). Erste Versuche der Tumorvakzinierung mit dem Bacille de Calmette et
Guérin (BCG), das damals bereits verfügbar war, blieben jedoch erfolglos (Guerin
1957). Erst 1976 gelang es BCG zur Tumorimmuntherapie erfolgreich
einzusetzen. Morales provozierte mittels intravesikaler BCG-Instillation eine lokale
Immunreaktion, die die Rezidivrate des Blasenkarzinom nachhaltig zu senken
vermochte (Morales et al. 1976).
Wenige Jahre vorher hatte man schon erste detaillierte Studien an der
Tumorimmunologie verschiedener neoplastischer Läsionen, so auch maligner
Gliome (MG), durchgeführt. In diese Studien waren neben Glioblastomen auch
anaplastische Astrozytome eingeschlossen worden, Tumore astrozytären
Ursprungs, aus denen sich ein GBM entwickeln kann (Wen et al. 2008). Diese
ersten Untersuchungen beschäftigten sich überwiegend mit der histologischen
Analyse Tumor-infiltrierender, inflammatorischer Zellen (Bertrand I 1960). Obwohl
es sich bei den Tumor-infiltrierenden, inflammatorischen Zellen nicht
ausschließlich um Immunzellen lymphozytären Ursprungs handelt, hat sich
dennoch der Begriff Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) etabliert. Die
lymphozytäre Infiltration des Tumorgewebes und die gegen die Tumorzellen
gerichtete Immunantwort stellen die Endstrecke einer mehrstufigen antigen-
spezifischen Immunantwort in einem peripheren Gewebe dar (Banchereau et al.
1998).
Die Untersuchung antigen-spezifischer Immunantworten im Gehirn erfordert die
Berücksichtigung einiger immunologischer Besonderheiten, wie zum Beispiel der
Bedeutung der Mikroglia, der Barrierefunktion der Blut-Hirn-Schranke oder dem
Fehlen von Lymphgefäßen und lymphatischen Organen (Mrass et al. 2006).
Dennoch scheint die antigen-spezifische Immunantwort bei malignen Hirntumoren
gleichen Prinzipien wie in anderen peripheren Organen zu gehorchen:
Antigenpräsentierende, dendritische Zellen nehmen tumorspezifische Antigene
14
auf. Die antigenbeladenen, dendritischen Zellen gelangen über den
Subarachnoidalraum entlang der Hirnnerven und durch die Lamina cribriforme zur
Nasenschleimhaut, wo sie sich dem lymphatischen System anschließen. In den
Halslymphknoten präsentieren sie die Tumorantigene und bewirken die
Aktivierung naiver Immunzellen zu Effektorzellen. Die aktivierten Effektorzellen
gelangen schließlich über verschiedene Wege ins Hirngewebe. Intraparenchymal
finden sich anschließend sowohl zelluläre als auch humorale Abwehrreaktionen
des adaptiven Immunsystems gegen die Tumorzellen maligner Gliome. Das
angeborene Immunsystem scheint ebenfalls in die immunologische Tumorabwehr
maligner Gliome involviert. Eine detaillierte Übersicht über die zahlreichen
Untersuchungen, die zur Aufdeckung antigenspezifischer Immunantworten bei
den MG beitrugen wurde von Dunn erstellt (Dunn et al. 2007).
Zahlreiche Studien beschäftigten sich bereits mit der histologischen und
immunhistochemischen Charakterisierung der TIL im Glioblastoma multiforme
und in malignen Gliomen. Die TIL sind häufig um die zahlreichen Blutgefäße
lokalisiert, ein diffuses Verteilungsmuster ist selten (Ridley et al. 1971). 28 bis 37
% aller malignen Gliome zeichnen sich durch perivaskuläre, lymphozytäre
Infiltrate aus (Bertrand et al. 1960; Ridley and Cavanagh 1971; Takeuchi et al.
1976). Die Ergebnisse zur phänotypischen Charakterisierung der TIL in malignen
Gliomen divergieren stark, was auf methodische Unterschiede in den
verschiedenen Studien zurückzuführen ist (Dunn 2007). Hitchcock und Morris
fanden in 15 MG durchschnittlich 4 % cluster of differentiation (CD)4+ und 10 %
CD8+ Lymphozyten, sowie über 20 % Makrophagen, gemessen an der
Gesamtzahl der analysierten Zellen (Hitchcock et al. 1988). Farmer detektierte
42 % CD4+ und 41 % CD8+ Zellen innerhalb der TIL von neun MG (Farmer et al.
1989). Die Ergebnisse aus weiteren Untersuchungen waren ebenfalls inkonsistent
(Paine et al. 1986; Phillips et al. 1982; Saito et al. 1988; Yasuda et al. 1983; Yu et
al. 2003).
Makrophagen und Mikroglia stellen den größten Anteil an Immunzellen in MG,
jedoch ist ihre Bedeutung für die Tumorimmunologie noch unklar (Dunn 2007).
Ältere Studien fanden 20 bis 30 % Makrophagen und Mikroglia gemessen an der
Gesamtzellzahl (Hitchcock and Morris 1988; Morimura et al. 1990; Nishie et al.
15
1999; Roggendorf et al. 1996). Hussain konnte mittels flußzytometrischer
Untersuchungen durchschnittlich 0,825 % CD45+, CD11b+ und CD11c+ Mikroglia
und Makrophagen in Resektionspräparaten detektieren (Hussain et al. 2006). Der
zu den älteren Studien vergleichsweise niedrige Anteil an Mikroglia und
Makrophagen ist am ehesten auf methodische Unterschiede zurückzuführen: Die
gleichzeitige, flußzytometrische Detektion mehrere für Mikroglia und
Makrophagen spezifischer Oberflächenantigene führte zu einer restriktiven
Selektion positiver Zellen.
Die prognostische Bedeutung der TIL in malignen Gliomen wurde bereits intensiv
beforscht, jedoch sind die Ergebnisse nicht konsistent (Dunn 2007). In den
Untersuchungen von Brooks korrelierten perivaskuläre Infiltrate mit einem
längeren Überleben von Patienten mit GBM oder anaplastischen Astrozytom
(Brooks et al. 1978). Patienten, deren Hirntumore perivaskuläre Infiltrate
aufwiesen, überlebten durchschnittlich zwei bis vier Monate länger. Diffuse
Infiltration des Hirntumors hatte hingegen keinen signifikanten Effekt auf das
Überleben (Brooks 1978).
Zwei weitere Studien von Palma und von Böker konnten den prognostisch
günstigen Effekt der TIL im GBM bestätigen (Boker et al. 1984; Palma et al.
1978). Palma teilte 200 Patienten in drei Gruppen, nämlich Patienten deren MG
deutliche (23 / 200), schwache (46 / 200) oder keine (131 / 200) perivaskulären,
lymphozytären Infiltrate zeigten. Patienten mit deutlich ausgeprägten
perivaskulären Infiltraten überlebten signifikant länger (p < 0,01). Fünf Patienten
aus dieser Gruppe waren sechs Jahre nach der Operation noch am Leben,
während in den beiden anderen Gruppen kein Patient so lange überlebte (Palma
1978). Diese Studie wurde 1978 veröffentlicht, als die Bedeutung von
Temozolomid und MGMT noch nicht bekannt war. Sie könnte ein wichtiger
Hinweis dafür sein, dass neben dem MGMT-Promotor-Methylierungsstatus die
Infiltration des GBM durch TIL ebenfalls eine wichtige Rolle bei
Langzeitüberlebern spielt. In weiteren Untersuchungen konnte Schiffer keine
Korrelation zwischen der Infiltration maligner Gliome durch TIL und dem
Überleben der Patienten feststellen (Schiffer et al. 1979). Zu einem ähnlichen
Schluss kam Rossi, der intraparenchymale und perivaskuläre CD8+ und CD4+
16
Lymphozyten sowie makrozytäre Infiltrate untersuchte und keinen
Zusammenhang mit dem Überleben der Patienten erkennen konnte (Rossi et al.
1989).
In den beiden größten Studien zu TIL und ihrer prognostischen Bedeutung für die
GBM-Patienten wies Safdari einen negativen Einfluss der TIL für die Patienten
nach (Safdari et al. 1979, 1985). In 342 Patienten wurden verschiedene
Tumorareale, nämlich zellreiches, peripheres, hypervaskularisiertes und
nekrotisches Tumorgewebe sowie Normalgewebe auf Anwesenheit von TIL
untersucht. In 35 % der Patienten zeigten sich TIL im zellreichen Tumorgewebe,
bei 29 % konnten TIL in peripheren Arealen festgestellt werden, im
Normalgewebe fanden sich jedoch nur bei 4 % der Patienten Lymphozyten.
Patienten mit lymphozytären Infiltraten überlebten im Mittel 8,4 Monate,
wohingegen Patienten ohne TIL noch 11,9 Monate nach Diagnose überlebten.
Die negativ-prognostische Bedeutung der TIL bestätigte sich auch, wenn sich die
TIL überwiegend in hypervaskularisierten oder nekrotischen Arealen befanden.
Die bisherigen Studien lassen keinen eindeutigen Schluss über die prognostische
Bedeutung der TIL in malignen Gliomen zu. Methodische Unterschiede in der
Erfassung des Phänotyps, der Anzahl und der Lokalisation der TIL könnten die
Ursache für die gegensätzlichen Ergebnisse sein. Außerdem erfolgten die
Untersuchungen vor der Entdeckung der regulatorischen T-Lymphozyten (Treg)
(Sakaguchi et al. 1995), deren entscheidende Rolle für die Tumorimmunologie in
einer bahnbrechenden Arbeit von Curiel vor wenigen Jahren das erste Mal belegt
wurde (Curiel et al. 2004).
2.3. Lokale und globale Immunsuppression in Patienten mit GBM
Mitte der 70er Jahre des vergangen Jahrhunderts, nahezu zeitgleich mit der
Erforschung der TIL in malignen Gliomen, beschrieben zahlreiche Studien
Defekte in der zellulären Immunität bei Patienten mit malignen Hirntumoren.
Weiterführende Untersuchungen zeigten eine beeinträchtigte Funktion der T-
Lymphozyten. Beispielsweise ließen sich periphere mononukleäre Lymphozyten
nur eingeschränkt durch T-Zell-Mitogene, Anti-CD3-Antikörper oder T-Zell-
17
abhängige B-Zell-Mitogene stimulieren (Ashkenazi et al. 1997; McVicar et al.
1992). Die Patienten litten häufig an einer Lymphopenie und im Patientenserum
fanden sich etliche immunsupprimierende Faktoren, wie zum Beispiel Interleukin
(IL)-10 (Dummer et al. 1995; Gastl et al. 1993; Nitta et al. 1994; Vieira et al.
1991), Prostaglandin E2 (Anastassiou et al. 1992; Castelli et al. 1989; Couldwell
et al. 1991; Elliott et al. 1993) oder Tumor growth factor β (Fontana et al. 1984;
Olofsson et al. 1992; Sasaki et al. 1995; Weller et al. 1994; Weller et al. 1995).
Lymphopenie und immunsuppressive Faktoren im Serum konnten die
Immunsuppression der Gliompatienten jedoch nur unzureichend erklären.
Isolierte man T-Lymphozyten aus dem Patientenserum und kultivierte diese in
frischen Kulturmedium, so ließen sie sich weiterhin nur eingeschränkt stimulieren
(Morford et al. 1997; Roszman et al. 1980). Die T-Zell-Dysfunktion schien folglich
nicht durch exogene Faktoren bedingt, sondern die Ursachen mussten innerhalb
des T-Zell-Kompartiments zu finden sein. Da vorwiegend T-Helferzellfunktionen
beeinträchtigt waren, war die Ursache für die defekte Immunabwehr von
Gliompatienten in der CD4+ T-Zell-Subpopulation zu suchen (Roszman et al.
1985). CD4+ T-Lymphozyten von Gliompatienten sezernierten eine verminderte
Menge an TH1-Zytokin Interleukin 2 (Ausiello et al. 1991; Elliott et al. 1984). Die
Sekretion weiterer TH1-Zytokine war ebenfalls vermindert, wohingegen erhöhte
Konzentrationen von TH2-Zytokinen zu finden waren (Ott et al. 2005; Roussel et
al. 1996; Zou et al. 1999). In einer Übersichtsarbeit aus dem Jahr 1999 stellte Dix
die bis dato gewonnen Erkenntnisse zur Immunsuppression bei MG detailliert dar.
Ein zentraler pathophysiologischer Faktor war noch nicht auszumachen (Dix et al.
1999) (Abb. 1).
18
Auf der Suche nach zentralen Faktoren für die Immunsuppression bei Patienten
mit MG, gelang der Arbeitsgruppe von Fecci wenige Jahre nach der
Veröffentlichung Dixs umfassender Übersichtarbeit ein entscheidender Schritt.
Die Forscher beobachteten, dass sich die im Zusammenhang mit der
Immunsuppression von Gliompatienten bekannten Effekte gut mit dem
Wirkungsspektrum von CD4+ CD25+ Forkhead box P3-positiven (FoxP3+)
regulatorischen T-Lymphozyten in Deckung bringen ließen (Fecci et al. 2006).
Treg hemmen die Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten, unter anderem
durch Hemmung der IL-2-Produktion in den Zielzellen (Thornton et al. 1998), ein
Effekt, der wesentlich an der T-Zell-Dysfunktion von Gliompatienten beteiligt
schien (Ausiello 1991; Elliott 1984). Treg bewirken zudem einen Zytokinshift von
einer TH1-basierten, zellulären zu einer TH2-basierten, humoralen Immunantwort
(Dieckmann et al. 2002) und inhibieren die Interferon-γ-Sekretion (Camara et al.
2002; Piccirillo et al. 2001) (Abb. 2).
Dix et al., 1999
IL-2-Sekretion↓
TH1 TH2
IFNγ-Sekretion↓
T-Zell-Aktivierung & Proliferation ↓
?Dix et al., 1999
IL-2-Sekretion↓
TH1 TH2
IFNγ-Sekretion↓
T-Zell-Aktivierung & Proliferation ↓
?IL-2-Sekretion↓
TH1 TH2
IFNγ-Sekretion↓
T-Zell-Aktivierung & Proliferation ↓
IL-2-Sekretion↓
TH1 TH2
IFNγ-Sekretion↓
T-Zell-Aktivierung & Proliferation ↓
??
Abb. 1: Immunsuppression in malignen Gliomen nach Dix et al.
19
Man geht davon aus, dass Treg die gegen neoplastische Läsionen gerichtete
Immunreaktion hemmen können. Die Treg-Fraktion, das heißt der prozentuale
Anteil regulatorischer T-Lymphozyten an der Gesamtzahl der Immunzellen, ist im
Blut und im Tumor zahlreicher Krebspatienten erhöht (Curiel 2004; Ichihara et al.
2003; Liyanage et al. 2002; Woo et al. 2001). Treg scheinen ein wesentlicher
Bestandteil der immunologischen „tumour-escape“ beziehungsweise der
„immunosubversion“ zu sein (Zitvogel et al. 2006). Der Tumor scheint mit Hilfe der
Treg das Immunsystem aktiv umgehen zu können. In der Studie von Fecci fand
sich eine vergrößerte Treg-Fraktion innerhalb des CD4+-Kompartiment von
Patienten mit malignen Gliomen, wobei die Gesamtzahl der CD4+ Lymphozyten
sowie der Treg erniedrigt war. Depletion der Treg mit einem anti-CD25-Antikörper in
vitro machte den Zytokinshift von TH1 nach TH2 rückgängig. Ebenso zeigten die
restlichen CD4+-Zellen eine vermehrte Proliferation nach Stimulation mit anti-
CD3-Antikörper (Fecci 2006). Im GBM-Mausmodell führte die Depletion der Treg
zur spontanen Remission von Tumoren und verlängerte das Überleben der
Mäuse (El Andaloussi et al. 2006a; Fecci 2006).
Weitere Studien konnten die Bedeutung der Treg in MG bestätigen. El Andaloussi
beschrieb sowohl eine vergrößerte Treg-Fraktion als auch eine erhöhte Treg-
Gesamtzahl im Blut und im Tumor von GBM-Patienten (El Andaloussi et al.
2006b). In einer Vergleichsstudie von Gliomen unterschiedlicher Malignität wurde
die größte Treg-Fraktion bei den hochmalignen Grad IV Gliomen (11,54 +/- 1,95
Dix et al., 1999 Fecci et al., 2006
IL-2-Sekretion↓
TH1 TH2
IFNγ-Sekretion↓
T-Zell-Aktivierung & Proliferation ↓
Regulatorische T-Zelle
Dix et al., 1999 Fecci et al., 2006
IL-2-Sekretion↓
TH1 TH2
IFNγ-Sekretion↓
T-Zell-Aktivierung & Proliferation ↓
Regulatorische T-Zelle
IL-2-Sekretion↓
TH1 TH2
IFNγ-Sekretion↓
T-Zell-Aktivierung & Proliferation ↓
IL-2-Sekretion↓
TH1 TH2
IFNγ-Sekretion↓
T-Zell-Aktivierung & Proliferation ↓
Regulatorische T-Zelle
Regulatorische T-Zelle
Abb. 2: Mögliche Rolle der Treg in MG nach Fecci et al.
20
%) festgestellt, während in Grad III (6,74 +/- 0,19 %) und II (2,53 +/- 0,11 %)
Gliomen die Treg-Fraktion deutlich kleiner war (El Andaloussi et al. 2007).
Schließlich zeigte Jordan, dass GBM-Tumorzellen durch Sekretion des CC-
ligands (CCL) 2 regulatorischen T-Zellen anlocken können (Jordan et al. 2008).
Der dazu korrespondierende CC-receptor (CCR) 4 auf den Treg war bei den
Gliompatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen vermehrt exprimiert.
Tumorzellen maligner Gliome und insbesondere Glioblastomzellen scheinen der
immunologischen Tumorabwehr zu entgehen, indem sie die immunsuppressiven
CD4+CD25+FoxP3+ Treg selektiv anlocken. Im Tumor hemmen Treg
Immuneffektorzellen, die die immunologische Tumorabwehr ausführen könnten.
Die Tumorzellen könnten so der immunologischen Tumorabwehr entgehen.
Verschiedene Veröffentlichungen beschreiben die Expression von FoxP3+ auch in
diversen Tumorzellen, so zum Beispiel GBM-Zellen, (Ebert et al. 2008; Hinz et al.
2007; Zuo et al. 2007) und legen nahe, dass die Tumorzellen selbst
immunsupprimierende Wirkung auf immunologische Effektorzellen ausüben
könnten. Ursprünglich war man davon ausgegangen, dass FoxP3+ ausschließlich
in Treg exprimiert werden (Brunkow et al. 2001; Fontenot et al. 2005; Liston et al.
2007).
2.4. Ziele der Untersuchungen
Das Langzeitüberleben beim Glioblastoma multiforme ist ein bislang
weitestgehend ungeklärtes Phänomen (Krex and Schackert 2008). Eine günstige
immunologische Ausgangssituation könnte eine effektive Tumorabwehr bewirken
und die Tumorprogression bei GBM-Patienten wesentlich vermindern. Dies
wiederum würde die Prognose der Glioblastompatienten deutlich verbessern und
ein Langzeitüberleben ermöglichen. Die Korrelation zwischen ausgeprägter
lymphozytärer Infiltration des GBM und guter Prognose, wie sie in der Studie von
Palma beschrieben wurde, würde diese Hypothese stützen (Palma 1978). Jener
Zusammenhang konnte von anderen Arbeitsgruppen jedoch nicht eindeutig
bestätigt werden (Boker 1984; Rossi 1989; Safdari 1979; Schiffer 1979).
Unterschiede in der Erfassungsmethodik der TIL sowie fehlende Kenntnisse über
21
immunsupprimierende Treg könnten die Diskrepanzen zwischen den
verschiedenen Studien erklären.
Um die Diskrepanzen der vorausgegangen Studien zu egalisieren, wurden in
diesen Untersuchungen unterschiedliche Lymphozytensubpopulationen, inklusive
der CD4+CD25+FoxP3+ regulatorischen T-Zellen im Hinblick auf Anzahl und
Lokalisation in immunhistochemischen Präparaten quantitativ erfasst. Das
komplexe immunologische Tumorgeschehen im GBM sollte möglichst genau
rekonstruiert werden. Der Abgleich mit klinischen Daten sollte Auskunft über die
Bedeutung der TIL für die klinische Prognose geben. Mittels
Migrationsuntersuchungen sollte zudem geklärt werden, ob das GBM selektiv
immunkompetente Zellen anlocken kann. Würden Glioblastomzellen gezielt
immunsuppressive Treg anlocken, die die Immunreaktion supprimieren?
22
3. Material und Methoden
3.1. Immunhistochemische Untersuchungen
3.1.1. Auswahl des Patientenkollektivs
In die immunhistochemischen Untersuchungen wurden 77 Patienten mit GBM
eingeschlossen, die zwischen 2003 und 2007 in der Neurochirurgischen Klinik
des Universitätsklinikums Erlangen operativ behandelt worden waren. Die
histopathologische Diagnose war durch das Neuropathologische Institut des
Universitätsklinikums Erlangen gesichert worden. Ein Teil der Patienten hatte
in der Strahlenklinik des Universitätsklinikums Erlangen eine adjuvante
Strahlen- und Chemotherapie erhalten. Die Patientendaten, einschließlich der
Daten von den Tumornachsorgeuntersuchungen, waren vom Tumorzentrum
des Universitätsklinikums Erlangen akquiriert und für diese Untersuchungen
zur Verfügung gestellt worden. Fehlende Daten konnten aus den Arztbriefen
der Neurochirurgischen Klinik und der Strahlenklinik des Universitätsklinikums
Erlangen entnommen und ergänzt werden.
3.1.2. Anfertigung der Tissue Micro Arrays®
Die in Paraffin gegossenen Tumorproben wurden von der Neuropathologie zur
immunhistochemischen Aufarbeitung mittels Tissue Micro Array® (TMA®)-
Verfahren bereitgestellt. Die TMA®-Technik ermöglicht eine effiziente
immunhistochemische Untersuchung zahlreicher Patienten (Kononen et al.
1998). Aus einem Spenderblock, der das in Paraffin gegossene Tumorgewebe
enthält, wird eine repräsentative, zylinderförmige Stanze gewonnen. Diese
wird in einen „leeren“ Paraffinempfängerblock übertragen. Da der
Empfängerblock zahlreiche Stanzen aus verschiedenen Spenderblöcken
aufnehmen kann, können zahlreiche Tumorproben gleichzeitig
immunhistochemisch untersucht werden. Nachdem alle Stanzen in den
Empfängerblock übertragen sind, werden sie durch Erwärmen des Paraffins
(10 min; 43°C) im Empfängerblock fixiert (AlphaMetrix 2005). Danach können
vom Empfängerblock Leerschnitte gewonnen und anschließend gefärbt
werden (Abb. 3).
23
Der Durchmesser eines Stanzzylinders beträgt 2 mm und repräsentiert nur
einen kleinen Ausschnitt des gesamten Tumors. Dementsprechend sorgfältig
muss die Lokalisation der Stanze im Spenderblock beziehungsweise im
Tumorgewebe vorab gewählt werden. In dieser Studie wurden mit Hilfe von
Hämatoxylin-Eosin (HE)-Schnitten der Spenderblöcke repräsentative
Tumorbereiche aufgesucht. Diese Bereiche wurden auf den Spenderblöcken
markiert, um dort genau definiert die Stanzen zu gewinnen. Zur Anfertigung
der TMA® diente der Manuelle Tissue Arrayer (MTA)-1 (Beecher Instruments,
Wisconsin, USA). Pro Untersuchungsfall wurden mindestens zwei Stanzen
aus der sehr zelldichten Tumorhauptmasse untersucht sowie eine weitere im
Infiltrationsbereich, wo die Tumorzellen das Normalgewebe infiltrieren. Eine
eindeutige Infiltrationszone konnte jedoch nicht für alle Tumorproben bestimmt
werden. Die Stanzen wurden fern von nekrotischen Arealen gewonnen. Pro
Patient wurden drei Stanzen angefertigt, gefärbt und ausgewertet (Abb. 4).
Abb. 3: TMA-Anfertigung mit dem Beecher MTA-1. Grafik entnommen aus der deutschsprachigen Bedienungsanleitung für den Manuellen Tissue Arrayer (MTA)-1 (AlphaMetrix Biotech GmbH).
24
3.1.3. Färbung relevanter Lymphozytensubpopulationen
In der folgenden Tabelle (Tab. 1) findet sich eine Zusammenstellung der
untersuchten Lymphozytensubpopulationen sowie der verwendeten
Antikörper.
Tab. 1: Untersuchte Antigene und verwendete Antikörper bei den
immunhistochemischen Untersuchungen.
Lymphozytensubpopulation Spezifisches Merkmal, Oberflächenantigen
Verwendeter Antikörper Verwendete Konzentration
T-Lymphozyten CD3 Abcam, mouse-anti-
human CD3 1 : 100
Zytotoxische T-Lymphozyten CD8 DAKO Cytomation, 1 : 200
Abb. 4: Fertiger TMA® nach anti-CD3-Färbung und ein Untersuchungsfeld in verschiedenen Vergrößerungen.
25
mouse- anti-human CD8
B-Lymphozyten CD20 DAKO Cytomation,
mouse-anti-human CD20 1 : 500
Makrophagen und Mikroglia CD68 DAKO Cytomation,
mouse-anti-human CD68 1 : 200
Regulatorische T-Zellen FoxP3 Abcam, mouse anti-
human FoxP3 1 : 100
Gefäßmarker CD34 DAKO Cytomation;
mouse-anti-human CD34 1 : 200
Die Schnitte wurden mit einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert, in der
Mikrowelle thermisch vorbehandelt und mit der Biotin-Streptavidin-Komplex-
Methode entsprechend der Protokolle der Hersteller gefärbt. Bei FoxP3 kam
eine Verstärkung mit Tyramin zum Einsatz.
3.1.4. Bildanalytisch-gestützte Auswertung mit BIOMAS®
Die Auswertung der TMA erfolgte mit einem bildanalytisch-gestützten
Verfahren. Die 2 mm-Stanzen wurden in 200-facher Vergrößerung als
Serienbild mit dem Leica DM 6000 B Mikroskop (Leica, Wetzlar)
aufgenommen. Damit war die Begutachtung einer Stanze im Ganzen möglich.
Das Serienbild wurde mit der BIOMAS®-Software ausgewertet (MSAB,
Erlangen). Zunächst wurden die Vaskularisierung und die Gesamtzellzahl
erfasst. Grundlage waren die mit dem Gefäßmarker CD34 gefärbten TMA. Die
Gefäßinnenwände wurden markiert, womit BIOMAS® die Gefäßfläche jedes
einzelnen Gefäßes und die Gesamtgefäßfläche berechnete. Die durch die HE-
Färbung blau gefärbten Zellkerne wurden ebenfalls markiert und von
BIOMAS® gezählt. Zusätzlich ermittelte BIOMAS® den jeweils kürzesten
Abstand von den markierten Zellen zur Gefäßinnenwand. Die Daten zur
Vaskularisierung und Gesamtzellzahl wurden durch die ausgewertete Fläche
(Region of interest; ROI) dividiert, so dass die Ergebnisse auf
Flächeneinheiten bezogen werden konnten (Abb. 5).
26
Abb. 5: Anti-CD34-Färbung zur Erfassung von Gesamtzellzahl und Vaskularisierung. Rot unterlegt sind markierte Gefäße. Die blauen Sternchen kennzeichnen Zellkerne in HE-Färbung für die Gesamtzellzahlbestimmung.
27
In einem zweiten Schritt erfolgte die Auswertung der TIL. Hierzu wurden
neben den Lymphozyten wiederum die Gefäßinnenwände markiert, um den
Abstand zwischen Lymphozyt und dem nächstgelegenen Gefäß erfassen zu
können. Durch Markierung der ROI war wiederum der Bezug zu einer
Flächeneinheit möglich. Die Anzahl der TIL wurde durch die zuvor ermittelte
Gesamtzellzahl dividiert, um den relativen Anteil der TIL im Tumorgewebe
ermitteln zu können (Abb. 6).
Abb. 6: Erfassung der Lymphozytenanzahl sowie der Abstände der Lymphozyten zum jeweils nächstgelegenen Gefäß am Beispiel einer CD8+-Färbung. Rot unterlegt sind Gefäße. Die Grüne Pfeile markieren das Lot der CD8+ TIL auf das nächstgelegene Gefäß. Die orangefarbenen Pfeile zeigen den Abstand eines Lymphozyts zum nächstgelegenen Lymphozyten.
28
3.1.5. Statistische Analyse
Am Ende der Auswertung der TMA® lagen pro Tumorprobe folgende
Datensätze vor:
- Gesamtzellzahl pro Tumorfläche
- Gefäßfläche in Relation zur Gesamtfläche
- Anzahl der TIL relativ zur Gesamtzellzahl
- Abstände der TIL zum nächstgelegenen Gefäß
Die aus den immunhistochemischen Untersuchungen gewonnen Daten
wurden zusammen mit den dazugehörigen klinischen Daten aus dem Erlanger
Tumorzentrum in das Statistikprogramm SPSS (SPSS Software GmbH,
München) übertragen. Die statistische Überlebenszeitanalyse erfolgte mit der
Cox-Regression und dem Kaplan-Meier-Schätzer. Endpunkt der Analyse war
der Tod der Patienten. Der Beobachtungszeitraum erstreckte sich folglich vom
Tag der neurochirurgischen Operation bis zum Tod des Patienten. Die
Abhängigkeit des Gesamtüberlebens von den verschiedenen
immunhistochemischen Charakteristika wurde mit dem Logrank-Test geprüft.
Für die Überlebenszeitanalyse wurden die Patienten anhand der
immunhistochemischen Daten jeweils in zwei Gruppen aufgeteilt.
Die Trennung erfolgte entweder am Median oder an der 66 %-Perzentile der
immunhistochemischen Datensätze. Bei annähernder Normalverteilung der
Datensätze wurde die Trennung am Median durchgeführt, dagegen wurden
die Datensätze an der 66 %-Perzentile getrennt, wenn im oberen Drittel der
Verteilung ein ausgeprägter Peak zu erkennen war. Eine Auswertung des
progressionsfreien Überlebens mit dem Endpunkt der Tumorprogression war
nicht möglich, da die klinischen Daten hierfür lückenhaft waren. Neben der
Analyse der immunhistochemischen Daten, wurde der mögliche Einfluss von
Patientenalter und Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG)-Index (Oken
et al. 1982) auf das Gesamtüberleben der Patienten untersucht.
Patientenalter, Karnofsky-Index und MGMT-Promotor-Status sind die
einzigen, beim GBM etablierten prognostischen Faktoren. Da der Karnofsky-
Index vom Tumorzentrum für diese Studie nicht erfasst worden war, wurde der
29
ECOG-Index ersatzweise untersucht. Daten über den MGMT-Promotor-Status
der Patienten standen nicht zur Verfügung, da dessen routinemäßige
Bestimmung erst 2008 in Erlangen eingeführt wurde.
3.2. Chemokinetischer Migrations-Assay
3.2.1. Das Prinzip der 2-dimensionalen Boyden-Chamber
Zahlreiche verschiedene Methoden zur Analyse von Zellmigration wurden
bereits etabliert (Entschladen et al. 2005). Der 2-dimensionale Filter-Assay
wurde 1962 von Boyden erstmalig beschrieben (Boyden 1962). Eine obere
Kammer wird durch einen Filter mit definierter Porengröße von einer unteren
Kammer getrennt. Um Chemotaxis und Migration an Immunzellen zu
untersuchen, werden in die obere Kammer Immunzellen und in die untere ein
Lockstoff gegeben. Die obere Kammer ist partiell in die untere Kammer
eingetaucht. Der Lockstoff kann nun über die Membran in die obere Kammer
diffundieren, die Immunzellen in die untere Kammer migrieren (Abb. 7).
30
Da der Diffusionsprozess sehr schnell vonstatten geht, kann man mit der
„klassichen“ Boyden-Chamber zwar Chemokinetik jedoch nicht Chemotaxis
analysieren. Chemotaxis beschreibt die gerichtet Migration an einem
Konzentrationsgradienten, Chemokinetik hingegen die ungerichtete Migration,
die durch Chemokine gesteigert werden kann. Der rasche
Abb. 7: Prinzip der modifizierten Boyden Chamber: Nach Probengewinnung (Lymphozyten und Tumorüberstände) folgt die Migration in der Boyden Chamber. Die migrierten Lymphozyten können mit Hilfe verschiedener Meßverfahren (Mikroskopie, Multi-Assay-Reader, Flußzytometrie) detektiert werden.
31
Konzentrationsausgleich wurde für das in dieser Studie verwendete 96-well
Millipore-MultiScreen®-System mit Hilfe des Farbstoffes Toluolblau
nachgewiesen. In die unteren Kammern wurde statt des Lockstoffes in Wasser
gelöstes Toluolblau gegeben. In den oberen Kammern befand sich
ungefärbtes destilliertes Wasser. Die Konzentrationen von Toluolblau in den
oberen Kammern wurden nach definierten Zeiten photometrisch bestimmt.
In die obere Kammer des Versuchsystems nach Boyden werden Lymphozyten
im Überschuss gegeben. Man geht von einer Migrationsfraktion von circa
10 % der vorgelegten Zellen aus (Entschladen 2005). Abhängig von der
Größe und der Migrationsgeschwindigkeit stimulierter und unstimulierter
Zellen muss zunächst das passende System, in erster Linie der passende
Filter beziehungsweise die passende Membran, gefunden werden. Zu
beachten sind Unterschiede im Membranmaterial, in der Membrandicke, in
Porengröße und Porendichte (NeuroProbe 2006).
Für diese Versuche kam das 96-well MultiScreen®-System von Millipore
(Millipore, Billerica, MA, USA) mit einem Porendurchmesser von 3 µm zur
Anwendung. Die relativ dünnen Millipore-Membranen eignen sich gut für die
Detektion migrierter Lymphozyten an der Membranunterseite mittels
Immunofluoreszenzfärbung- und Mikroskopie. Dickere Filter, zum Beispiel die
ThinCertTM-Membran (Greiner BIO-ONE GmbH, Frickenhausen), führen bei
der Mikroskopie zu einem stärkeren Hintergrund (Abb. 8). Die Porengröße von
3 µm wird vom Hersteller für Migrationsuntersuchungen an Lymphozyten
empfohlen, jedoch können auch 5 µm Poren bei verkürzter Migrationszeit
eingesetzt werden (Ott 2005).
32
Zur Detektion der migrierten Zellen kommen üblicherweise drei Verfahren zum
Einsatz, die auch bei Etablierung der Migrations-Assays im Vorfeld dieser
Studie getestet worden waren:
1) Bildanalytische Erfassung der migrierten Lymphozyten an der
Membranunterseite nach Fixierung und DAPI- Färbung
2) Bestimmung der in die untere Kammer gewanderten Lymphozyten mittels
Flußzytometrie
3) Detektion der in die untere Kammer migrierten Lymphozyten mit Hilfe
eines Multi-Assay-Readers nach Fluoreszenzfärbung mit in vivo-
Farbstoffen
Bei der bildanalytischen Erfassung der migrierten Lymphozyten wurden die
Lymphozyten an der Membranunterseite am Ende der Migrationszeit mit 4 %
Formaldehydlösung für 15 min fixiert, mit 0,1 % Triton-X-Lösung für 10 min
permeabilisiert und mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, USA) gefärbt. Dazu wurden 0,3 µl DAPI in 1 ml Standard saline
citrate (SSC) / Tween (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) verdünnt. Die
Membran wurde auf einen Objektträger gelegt, mit Vectashild® (Vector
Laboratories Inc., Burlingame, CA) eingedeckt und dann als Serienbild mit
dem Leica DM 6000 B Mikroskop (Leica, Wetzlar) aufgenommen. Die mit dem
Abb. 8: ThinCert®- (links) und MultiScreen®- (rechts) Membran bei Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop.
33
Fluoreszenzfarbstoff DAPI gefärbten Lymphozyten wurden mit dem
Bildanalyse-Programm BIOMAS® (MSAB, Erlangen) erfasst (Abb. 9).
Detektionsverfahren dieser Art können die Lymphozytenanzahl an der
Membranunterseite sehr genau ermitteln. Lymphozyten, die sich von der
Membranunterseite abgelöst haben und am Grund der unteren Kammer
liegen, können jedoch nicht erfasst werden. Man kann mit diesem Verfahren
also nur eine Momentaufnahme erstellen. Die Lymphozyten durchwanderten
die dünne Millipore Membran sehr schnell und waren nach wenigen Minuten
an der Membranunterseite zu finden. Daraufhin lösten sie Sie sich von der
Membran. Nur bei einem günstig gewählten Migrationsstopp konnte man
davon ausgehen, dass die Lymphozytenzahl an der Membranunterseite mit
dem chemokinetischen Verhalten der Lymphozyten korrelierte.
Abb. 9: Auswertung einer Millipore-MultiScreen®-Membran mit der Bildanalyse-Software BIOMAS®.
34
Mit Hilfe der Flußzytometrie konnten die Zellen, die die Membran
durchwandert und sich von dieser gelöst haben, quantifiziert werden. Die für
die Flußzytometrie benötigten Zellzahlen waren relativ hoch.
Dementsprechend erwies die flußzytometrische Auswertung nach Migration im
96-well-System, das mit einer geringen Anzahl an Lymphozyten pro Well
arbeitet, als weniger gut geeignet. Durch Zusammenfassen mehrerer Wells,
um die zu analysierende Zellzahl zu steigern, konnte die Flußzytometrie als
zusätzliches Kontrollverfahren dennoch genutzt werden. Neben Größe und
Granularität wurden die Calcein-Fluoreszenz zur Erfassung der Lymphozyten
genutzt. Die Messungen erfolgten an einem Beckman Coulter Epics XL-MCL
(Beckman Coulter GmbH, Krefeld).
Die Detektion mittels Multi-Assay-Reader HTS 7000 (Perkin Elmer Inc.,
Wellesley, MA, USA) nach Färbung der Lymphozyten mit einem in vivo-
Fluoreszenzfarbstoff erwies sich im Zusammenspiel mit dem 96-well
MultiScreen®-System von Millipore am praktikabelsten. Calcein-
Acetoxymethylester (Calcein-AM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) war ein
geeigneter intrazytoplasmatischer Fluoreszenzfarbstoff, der im Vergleich zu
Höchst 33342 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ein deutlicheres Signal
emittierte. Calcein-AM wird von intakten Lymphozyten aufgenommen und die
Acetoxymethylgruppe wird von Esterasen im Zytoplasma der Lymphozyten
abgespalten. Es entsteht Calcein, das intrazytoplasmatisch an Calcium bindet.
Dieser Komplex kann nicht mehr aus der Zelle entweichen. Er kann mit Licht
der Wellenlänge 495 nm angeregt werden, woraufhin er grünes
Fluoreszenzlicht von 515 nm emittiert (Parish 1999).
Entsprechend des Protokolls von Millipore wäre die Färbung der Lymphozyten
erst nach der Migration durch Zugabe von Calcein-AM zur
Lymphozytensuspension in den unteren Kammern erfolgt
(MilliporeCorporation 2008). Deutlich bessere Ergebnisse ließen sich jedoch
dann erzielen, wenn zunächst die Lymphozyten vor der Migration mit Calcein-
AM gefärbt wurden und danach der restliche Farbstoff ausgewaschen wurde.
Der Hintergrund war bei diesem Messverfahren geringer. Der mögliche
Einfluss von Calcein auf die Migration der Lymphozyten war zuvor
35
ausgeschlossen worden. Um den Hintergrund weiter zu minimieren, wurden
die Zellsuspensionen nach der Migration und vor der Messung mit dem Multi-
Assay-Reader aus der 96-well Millipore Receiver Plate® in eine schwarze,
Floureszenz-absorbierende Nunc F96 MicroWellTM Plate (Nunc GmbH & Co.
KG, Langenselbold) überführt.
Die Migrationsmessungen wurden als Triplette angelegt. Für das
Detektionsverfahren mittels Multi-Assay-Reader wurde pro Triplett in einem
vierten Well ein dazugehöriger Hintergrund bestimmt, wohinein ungefärbte
Lymphozyten auf den gleichen Tumorüberstand migrierten. Um die
Ergebnisse aus der Fluoreszenzmessung zu quantifizieren, wurde für jeden
Versuch eine Standardkurve ermittelt. Dafür wurden definierte Anzahlen
Calcein-gefärbter Lymphozyten in die unteren Kammern der 96-well-Platte
pipettiert. Die Beziehung zwischen Lymphozytenanzahl und gemessener
Fluoreszenz konnte in einem Steigungsdreieck abgebildet werden. Die
ermittelte Steigung ermöglichte die Umrechnung eines Fluoreszenzwertes in
die entsprechende Anzahl migrierter Lymphozyten (Abb. 10, 11).
36
Abb. 10: Einteilung eines 96-well Millipore MultiScreen®-Systems für Migrations-Assays.
Abb. 11: Standardkurve: Fluoreszenz zu Lymphozytenanzahl.
37
Um die Migration unabhängig vom verwendeten 96-well Millipore System
darzustellen wurde der Migrationsindex für die Migration auf die
Tumorüberstände ermittelt. Die Migration auf frisches Dulbecco's Modified
Eagle Medium (DMEM; Biochrom AG, Berlin) mit 2 % fötalem, bovinem Serum
(FBS) diente als Kontrolle und stellte die basale Migration dar. Die Migration
auf die verschiedenen Tumorüberstände wurde auf die basale Migration
bezogen, die basale Migration selbst wurde gleich 1 beziehungsweise 100 %
gesetzt. %100_
.)(⋅=
MigrationbasaletTumorübersMigrationIndexMigrations
3.2.2. Isolation der Lymphozytensubpopulationen
Aus 100 ml peripher-venösem Blut gesunder Spender wurden mittels eines
Bicoll®-Dichtegradientens periphere mononukleäre Zellen (peripheral blood
mononuclear cells; PBMC) isoliert. Spenderblut wurde 1 : 1 mit 1xPhosphate
buffer saline (1xPBS) verdünnt, auf das Bicoll® aufgetragen und bei 1000 g für
20 min zentrifugiert. Die Bremse der Zentrifuge wurde abgeschaltet. Nach
dem Zentrifugieren wurde der Buffy Coat mit den PBMC abgenommen und in
1xPBS aufgefangen. Es folgten zwei Waschschritte mit 1xPBS. Mit Hilfe von
Magnetic cell separation® (MACS®)-CD4- und CD8-MicroBeads® (Miltenyi
Biotec GmbH, Bergisch Gladbach) wurden CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten
positiv selektioniert. Die „magnetischen“ MACS® richteten sich gegen die
Oberflächenantigene CD4 beziehungsweise CD8, der daraus resultierende
„magnetische“ Antigen-Antikörper-Komplex konnte mit Hilfe eines
Ferromagneten separiert werden.
Die Selektion der CD4+CD25+ Treg erfolgte mit dem MACS® CD4+CD25+
Regulatory T Cell Isolation Kit, wobei die CD4+ T-Lymphozyten zunächst
negativ selektioniert und daraus die CD25+-Lymphozyten mittels
Positivselektion gewonnen wurden. Bei der negativen Selektion waren die
„magnetischen“ Antikörper gegen CD4- T-Lymphozyten gerichtet, die nicht
markierten CD4+ T-Zellen blieben nach Anwendung des Ferromagneten
zurück. Mittels CD25-MicroBeads wurden aus dem CD4+ Kompartiment, die
38
Subpopulation der CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen mittels
Positivselektion gewonnen (Abb. 12).
Vor dem unmittelbaren Auftragen auf die 96-well-Platten wurden die CD4+,
CD8+, CD4+CD25+ Lymphozyten sowie die PBMC nochmals mit 1xPBS
gewaschen, abzentrifugiert und mit frischem, serumfreien Roswell Park
Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium (Biochrom AG, Berlin) resuspendiert.
Die Konzentration der Lymphozyten wurde auf 1 Mio/ml adaptiert. Dadurch
befanden sich alle Lymphozyten in unverbrauchten, nicht konditionierten
Medium. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt mit Hilfe des CASY®-
Messgerätes (innovatis AG, Reutlingen), das Zellzahlen mittels elektrischer
Abb. 12: Isolation und Separation der Lymphozyten mit MicroBeads®.
39
Impedanz misst. In die oberen Kammern des 96-well-Systems wurden 50 µl
Zellsuspension und damit 50.000 Lymphozyten gegeben.
3.2.3. Herstellung der Tumorüberstände
Zellüberstände aus etablierten GBM-Zelllinien sowie Überstände aus
Primärkulturen dienten als Lockstoffe. Die Tumorzellen wurden in hoher
Konzentration von 1 Mio/ml für 72 h in 2 % DMEM mit 1 % Glutamin und 1 %
Penicillin-Streptomycin (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) kultiviert und dann
abgenommen. Zellbestandteile wurden abzentrifugiert und die Überstände
wurden entweder für spätere Verwendung in flüssigem Stickstoff tief gefroren
oder sofort für Migrationsversuche verwendet.
Als etablierte Zelllinien dienten A172 und LN18 Glioblastomzellen, die von
Weller bereits charakterisiert worden waren (Weller et al. 1998). Um das in
vivo-Tumormilieu möglichst gut nachzustellen, wurden GBM-
Primärzellkulturen etabliert. Die Zustimmung des Erlangener Ethikrates lag
vor. Die Primärzellkulturen wurden aus Tumorfrischgewebe aus der
Neurochirurgie mit Hilfe des MACS® Neural Tissue Dissociation Kit (Miltenyi
Biotec, Bergisch Gladbach) gewonnen.
Hierfür wurde das Tumorgewebe in 1xPBS aufgenommen und mehrere Male
mit 1xPBS gewaschen. Das Tumorgewebe wurde in circa 0,25 mm x 0,25 mm
große Stückchen mit dem Skalpell zerkleinert, so dass es mit Hilfe einer
10 ml-Plastikpipette aufgenommen werden konnte. Daraufhin erfolgte nach
Protokoll ein 20-minütiger Gewebeverdau mit Papain. Die Papainwirkung
wurde mit einer Inhibitor-Lösung gestoppt. Das verdaute Gewebe wurde auf
einen Filter mit 40 µm Porendurchmesser aufgetragen und die Zellen in ein 50
ml-Zentrifugenröhrchen bei 300 g über 2 min abzentrifugiert. Um Zellen weiter
von Myelin, Faser- und Bindegewebe zu trennen, waren weitere
Zentrifugationsschritte notwendig. Die hieraus gewonnene Zellsuspension
wurde auf 1 Mio/ml verdünnt und in Zellkulturflaschen überführt. Die
Bestimmung der Zellkonzentration erfolgte mit dem CASY® Messgerät. Nach
72 h konnten die Primärüberstände abgenommen werden. Die zellulären
40
Bestandteile wurden abzentrifugiert, die Überstände tief gefroren (- 80°C) oder
sofort verwendet. Die adhärenten Tumorzellen wurden zur Charakterisierung
noch einige Male passagiert.
Die Diagnose „Glioblastoma multiforme“ wurde durch die Neuropathologie des
Universitätsklinikums Erlangen gesichert. Um darüber hinaus sicherzustellen,
dass es sich bei den aus dem Gewebeverdau gewonnen Zellen überwiegend
um GBM-Zellen handelte, wurden glial fibrillary acidic protein (GFAP), p53
sowie das morphologische Bild unter dem Lichtmikroskop erfasst und
bewertet. GFAP ist ein zytoplasmatisches Protein, das hochspezifisch für
Zellen astroglialen Ursprungs ist (Reeves et al. 1989). GFAP wurde mittels
Immunofluoreszenzfärbung bestimmt. Der verwendete Antikörper war anti-
GFAP-Maus-Antikörper (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); als
Sekundärantikörper wurde ein Alexa 488 anti-Mouse-Antikörper (Invitrogen
GmbH, Karlsruhe) benutzt.
Der p53-Status wurde im Western Blot erfasst. Dafür wurden die Tumorzellen
in ausreichender Menge vermehrt. Neben einer Kontrolle, wurden für jede
Zelllinie zwei weitere Proben mit 2 Gy an einer Seifert Isovolt Titan
Röntgenröhre (General Electrics, Ahrensburg) bestrahlt und den Zellen 1 h
beziehungsweise 24 h Reparaturzeit gegeben. Danach wurden die Zellen
lysiert, Proteine isoliert und der Western Blot durchgeführt. Neben dem p53-
Gesamtprotein, wurde zusätzlich die Phosphorylierungsstelle am Serin-15
untersucht. Bei der lichtmikroskopischen Begutachtung der Zellen galten
ungehemmtes Wachstum, Wachstum in Zellklumpen und
Übereinanderwachsen in mehreren Zelllagen als Malignitätskriterien.
Die LN18-, A172- und Primärkulturen wurden 24 h nach Aussäen der
Tumorzellen mit Bestrahlung und/oder Temozolomid behandelt. Die
Bestrahlungsdosis lag bei 2 Gy, Temozolomid wurde in einer Konzentration
von 10 µM appliziert. 40,3 mg Kapselinhalt einer Temodal®-Kapsel mit 20 mg
Wirkstoff wurden in 5,15 ml sterilem Dimethyl-Sulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO, USA) gelöst. Das in DMSO gelöste Temodal® wurde dem
Kulturmedium zugegeben, so dass sich eine Zielkonzentration von 10 µM
41
ergab. Die mittlere inhibitorische Konzentration von Temozolomid in vitro,
gemessen an U87-Glioblastomzellen, beträgt 150 µM (Su et al. 2004).
42
4. Ergebnisse
4.1. Immunhistochemische Untersuchungen
4.1.1. Auswertung der klinischen Daten
Vom Tumorzentrum des Universitätsklinikums Erlangen waren zahlreiche
klinische Daten für das Erlanger Patientenkollektiv zur Verfügung gestellt
worden. Für den Abgleich mit den immunhistochemischen Ergebnissen
wurden davon nur einige ausgewählte Faktoren untersucht. Die klinischen
Daten aus der großen Multicenter-Studie von Stupp mit insgesamt 573
Patienten, die zur Etablierung der simultanen und adjuvanten
Radiochemotherapie mit Temodal® als Therapiestandard beim GBM geführt
hatte, dienten als Referenzwerte (Stupp 2005). Daran ließ sich das Erlanger
Patientenkollektiv klinisch gut bewerten.
Das mittlere Alter der untersuchten Erlanger Patienten betrug
60,0 ± 11,3 Jahre zum Zeitpunkt der Operation und Histologiegewinnung. Der
Median lag bei 61 Jahren. Der jüngste Patient war zu Beginn der Therapie
40 Jahre alt und die älteste Patientin 81 Jahre (Abb. 13).
43
59,7 % der Patienten waren männlich; der Anteil der Patientinnen lag bei 40,3
%. Dem Großteil der Patienten wurde zum Zeitpunkt der Operation ein leicht
eingeschränkter Allgemeinzustand als Stufe 1 der ECOG-Klassifikation
bescheinigt. Zum Zeitpunkt der Datenauswertung waren bereits 71 der 77
Patienten verstorben (Tab. 2). In Bezug auf Alter, Geschlechtsverteilung und
Allgemeinzustand war das Erlanger Patientenkollektiv dem großen Kollektiv
der „Stupp-Studie“ sehr ähnlich. In den beiden Armen der Studie von Stupp
betrug das mediane Patientenalter 57 Jahre beziehungsweise 56 Jahre, der
Männeranteil war 61 % und 64 % groß. Der Großteil der Patienten beider
Studienarme zeichnete sich durch einen uneingeschränkten oder leicht
eingeschränkten, klinischen Allgemeinzustand aus (Stupp 2005).
Mittelwert 60,0 Median 61,0
Alter (a)
Standardabweichung 11,3 Abb. 13: Alter der Patienten in Jahren (Histogramm).
44
Bei allen Patienten des Erlanger Patientenkollektivs wurde histologisch ein
Glioblastoma multiforme des WHO-Grades IV diagnostiziert. 85,7 % der
Patienten wurden erstmalig an einem primären, de novo entstandenen GBM
behandelt. 7,8 % der Patienten erhielten eine Primärbehandlung eines
sekundären GBM, das sich aus einem niedriggradigen Gliom entwickelt hatte.
Bei 6,5 % der Patienten, die nach auswärtiger Primärtherapie eine
Rezidivtherapie am Universitätsklinikum Erlangen erhielten, war die Ätiologie
aufgrund fehlender Daten nicht nachzuvollziehen. Vier der 77 Patienten litten
neben dem GBM an einem Zweittumor (Tab. 3). Patienten mit
Rezidivbehandlung oder Zweittumor waren in der Studie von Stupp nicht
eingeschlossen worden, eine Differenzierung von Patienten mit primärem und
sekundärem GBM war nicht erfolgt (Stupp 2005).
Tab. 2: Allgemeine klinische Daten des Erlanger Patientenkollektivs. N (%) Faktor Alle Patienten 77 (100)
Männlich 46 (59,7) Geschlecht Weiblich 31 (40,3) 0 = normale Leistungsfähigkeit 0 (0) 1 = ambulante Betreuung, leichte Arbeiten möglich
61 (79,2)
2 = weniger als 50% am Tage bettlägerig, Selbstversorgung möglich, aber nicht arbeitsfähig
9 (11,7)
3 = mehr als 50% am Tage bettlägerig, begrenzte Selbstversorgung noch möglich
5 (6,5)
4 = ständig bettlägerig 2 (2,6)
ECOG-Index
5 = tot 0 (0) Verstorben 71 (92,2) Lebend mit Hirntumor 4 (5,2)
Patientenstatus
Keine Angabe 2 (2,6)
45
Eine Resektion des GBM erfolgte bei 96,1 % der Patienten des Erlanger
Kollektivs. Drei der 77 Patienten wurden zum Zwecke der Diagnosesicherung
ausschließlich biospsiert. Bei der Tumorresektion wurde das GBM nach
makroskopischen Kriterien zumeist total oder subtotal mit einem
Resektionsausmaß größer als 90 % des ursprünglichen Tumorvolumens
entfernt. Eine R0-Situation, wie sie vom Pathologen bei anderen
Tumorerkrankungen beschrieben wird, ist beim Glioblastom aufgrund der
lokalen Mikrometastasierung nicht möglich. Schließlich blieb bei 5,4 % der
Erlanger Patienten ein makroskopischer Tumorrest von größer als 50 % des
Ausgangsvolumen in situ zurück.
Eine radioonkologische Nachbehandlung nach neurochirurgischer Intervention
erhielten 75,3 % der Patienten. Die große Mehrheit wurde mit konventioneller
Technik am Linearbeschleuniger mit einer Enddosis von 57,75 Gy oder 60 Gy
bestrahlt. Die Enddosis von 57,75 Gy wurde dabei in einem
hyperfraktionierten Studienkonzept erreicht, wohingegen die Gesamtdosis von
60 Gy normofraktioniert in 30 Einzeldosen à 2 Gy appliziert wurde. Ein kleiner
Tab. 3: Tumorspezifische klinische Daten des Erlanger Patientenkollektivs. N (%) Faktor Alle Patienten 77 (100) Histologie Glioblastoma multiforme 77 (100) WHO-Klassifikation WHO-Grad IV 77 (100)
Neuerkrankung (primäres GBM) 66 (85,7) Lokales Rezidiv nach auswärtiger Ersttherapie
5 (6,5) Tumorentwicklung
Entwicklung aus niedrig-gradigem Gliom (sekundäres GBM)
6 (7,8)
Ja 4 (5,2) Zweittumor Nein 73 (94,8) Rechts 48 (62,3) Links 27 (35,1)
Seitenlokalisation
Zentral 2 (2,6) Frontallappen 24 (31,2) Temporallappen 24 (31,2) Parietallappen 7 (9,1) Okzipitallappen 3 (3,9) Cerebellum 1 (1,3)
Tumorlokalisation
Überlappende Lokalisation 18 (23,4)
46
Anteil von Patienten mit Tumorrezidiv wurde nach einer Zweitoperation
stereotaktisch radiotherapiert. 41,6 % der Patienten erhielten eine
Chemotherapie, üblicherweise simultan und adjuvant zur Strahlentherapie
(Tab. 4).
Im Gegensatz zu den zahlreichen, teils individuell modifizierten
Therapiekonzepten des untersuchten Erlanger Patientenkollektivs, wurden die
Patienten aus der „Stupp-Studie“ auf zwei verschiedenen Armen
studiengemäß behandelt: Die alleinige Radiotherapie bis 60 Gy wurde als
bisherige Standardtherapie mit der simultanen und adjuvanten
Radiochemotherapie mit Temodal® verglichen. Die Strahlentherapie im
experimentellen Arm war der Bestrahlung im Standardarm gleich.
Das mediane Gesamtüberleben im experimentellen Arm der „Stupp-Studie“
erwies sich mit 14,6 Monaten im Gegensatz zu 12,1 Monaten mit dem
Standardregime als signifikant besser, das Zweijahresüberleben betrug
26,5 % beziehungsweise 10,1 %. Das Protokoll des experimentellen Armes
Tab. 4: Therapie der Erlanger Patienten. N (%) Faktor Alle Patienten 77 (100)
ja 74 (96,1) Resektion nein (nur Biopsie) 3 (3,9) Tumorrest größer als 50 % des Ausgangsvolumens
4 (5,4)
Tumorrest kleiner als 50 % des Ausgangsvolumens
18 (24,3)
Subtotale Resektion 15 (20,3) Totale Resektion 25 (33,8)
Resektionsausmaß bei N = 74
keine Angabe 12 (16,2) ja 58 (75,3) nein 16 (20,8)
Strahlentherapie
keine Angabe 3 (3,9) Konventionell 53 (91,4) Methode der
Strahlentherapie N = 58
Stereotaktisch 5 (8,6)
ja 32 (41,6) nein 38 (49,4)
Chemotherapie
keine Angabe 7 (9,1)
47
der „Stupp-Studie“ wurde aufgrund dieser guten Ergebnisse zum aktuellen
Therapiestandard in der Primärtherapie des GBM (Stupp 2006). Das mittlere
Überleben der Erlanger Patienten ausgehend vom Zeitpunkt der Operation
betrug 14,5 ± 13,5 Monate (410 ± 371 Tage), das mediane Überleben 11,5
Monate (334 Tage) und das Zweijahresüberleben 12,5 % (Abb. 14).
Der Anteil der Langzeitüberleber an den bereits zum Zeitpunkt der
Auswertung verstorbenen Patienten war 4,2 %. Diese Patienten lebten mehr
als drei Jahre nach Diagnosestellung. Das Gesamtüberleben im Erlanger
Patientenkollektiv war damit dem Standardarm der Studie von Stupp ähnlich
und schlechter als im experimentellen Arm. Wären Patienten mit Rezidiv oder
Mittelwert 14,5 Median 11,5
Gesamtüberleben (m)
Standardabweichung 13,5 Zweijahresüberleben (%) 12,5 Abb. 14: Gesamtüberleben ab Operation in Monaten (Histogramm).
48
Zweitumoren aus dem Erlanger Kollektiv ausgeschlossen worden, wäre das
Gesamtüberleben womöglich besser gewesen.
Wie schon in der Literatur beschrieben, erwies sich das Patientenalter auch im
Erlanger Patientenkollektiv als prognostisch bedeutender Faktor für das
Gesamtüberleben (Krex and Schackert 2008). In der Logrank-Analyse, nach
Gruppierung der Patienten am Median von 61 Jahren, zeigte die Gruppe der
jüngeren Patienten ein signifikant besseres Überleben als die Patienten mit
höherem Lebensalter (Abb. 15). Der Allgemeinzustand zum Zeitpunkt der
Operation als zweiter wichtiger prognostischer Faktor bei Patienten mit GBM
konnte im Erlanger Kollektiv hingegen nicht bestätigt werden (Abb. 16).
Abb. 15: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit vom Patientenalter in Jahren.
49
4.1.2. Anzahl und Lokalisation Tumor-infiltrierender Lymphozyten im GBM
Die Häufigkeit der Lymphozyten verschiedener Subpopulationen in den
Histologiepräparaten des Erlanger Patientenkollektivs variierte sowohl im
Tumorhauptbereich als auch in der Tumorinfiltrationszone, wo der Tumor nach
histologischen Kriterien ins intakte Gewebe infiltrierte, sehr stark (Tab. 5). Die
CD68+ ortsständigen Mikroglia/Makrophagen waren die mit Abstand am
häufigsten vertretenen Immunzellen. Gemessen an der Gesamtzellzahl waren
im Mittel 30,3 % der Zellen im Tumorhauptbereich positiv für CD68, in der
Infiltrationszone 18,7 %.
Der Anteil der CD3+ Lymphozyten betrug dagegen nur 2,64 % im
Tumorhauptbereich, beziehungsweise 1,02 % in der Tumorinfiltrationszone.
Die CD8+-Zellen waren ähnlich häufig. FoxP3+ Zellen machten schließlich nur
0,19 %, beziehungsweise 0,12 % jeweils gemessen an der Gesamtzellzahl
Abb. 16: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit vom ECOG-Index.
50
aus. Die Standardabweichungen dieser Messungen waren sehr groß und die
Mediane wichen oft erheblich von den dazugehörigen Mittelwerten ab, sowohl
in Bezug auf die Infiltration im Tumorhauptbereich als auch in der
Tumorinfiltrationszone ab. Einige Tumorproben waren durch eine überaus
starke lymphozytäre Infiltration charakterisiert, was die statistischen Parameter
entsprechend beeinflusste (Tab. 5).
Tab. 5: Anzahl der TIL pro mm² Tumorfläche im Tumorhauptbereich und in der Infiltrationszone.
Mittelwert, Median und Standardabweichung pro mm²
Mittelwert, Median und Standardabweichung bezogen auf Gesamtzellzahl
Zelltyp
Tumor Infiltrationszone Tumor Infiltrationszone Gesamt-Zellzahl
2902,9 2777,1 ± 1506,9
1019,3 871,7 ± 753,5
1 1
MIB-1 262,3 131,3 ± 365,2
196,0 30,9 ± 449,0
9,18E-02 6,07E-02 ± 1,10E-01
3,91E-02 7,98E-03 ± 5,67E-02
CD3 30,0 12,1 ± 41,2
17,6 11,0 ± 19,8
2,64E-02 5,69E-03 ± 1,15E-01
1,02E-02 8,88E-03 ± 7,63E-03
CD8 34,7 16,6 ± 42,4
17,8 7,5 ± 20,0
2,50E-02 6,00E-03 ± 8,40E-02
2,33E-02 8,56E-03 ± 3,77E-02
CD20 2,0 1,4 ± 2,4
1,7 1,6 ± 1,4
1,64E-03 5,59E-04 ± 4,16E-03
2,09E-03 1,50E-03 ± 1,83E-03
CD68 338,0 321,6 ± 227,6
227,3 199,4 ± 153,4
3,03E-01 1,12E-01 ± 1,09E-01
1,87E-01 1,71E-01 ± 1,17E-01
FoxP3 3,6 1,7 ± 6,8
1,5 0,0 ± 1,2
1,86E-03 6,28E-04 ± 4,29E-03
1,17E-03 1,05E-03 ± 9,09E-04
Gefäßfläche prozentual an Gesamtfläche in % mit Mittelwert, Median und Standardabweichung Tumor Infiltrationszone 6,26E-02 4,92E-02 ± 4,25E-02
4,75E-02 2,98E-02 ± 5,02E-02
51
Starke interindividuelle Schwankungen ließen sich auch in der Anzahl der
MIB1+-Zellen sowie in der Vaskularisierung von Tumorhauptbereich und
Infiltrationszone beobachten. Im Mittel waren im Tumorhauptbereich 9,18 %
und in der Infiltrationszone 3,91 % aller Zellen positiv für den
Proliferationsmarker MIB1. 6,26 % der Gesamtfläche des
Tumorhauptbereiches waren durch Gefäß- und Gefäßmalformationen besetzt.
Im Infiltrationsbereich betrug die Gefäßfläche bemessen an der Gesamtfläche
3,91 % (Tab. 5).
Bei der Begutachtung der mittels Immunhistochemie gefärbten Tumorschnitte
fiel auf, dass die TIL vermehrt um die Gefäße lokalisiert waren. Diese
Beobachtung war bereits vielfach in der Literatur beschrieben und dort als
„perivascular cuffs“ oder perivaskuläre Infiltrate bezeichnet worden. Zur
genaueren Quantifizierung der perivaskularen Infiltrate wurden mittels
Computer-gestützter Bildanalyse der jeweils kürzeste Abstand eines TIL zum
nächst gelegenen Gefäß ermittelt (Tab. 6).
52
Aus diesen Abständen ließ sich für jeden Patienten eine Verteilung der TIL in
Abhängigkeit vom Abstand zum Gefäß bilden und graphisch darstellen (Abb.
17). Eine mittlere, standardisierte Verteilung über alle Patienten zeigte, dass
die CD3+, die CD8+ und die CD20+-Lymphozyten vermehrt in einem Bereich
von bis zu 30 µm um das Gefäß lokalisiert waren (Abb. 18).
Tab. 6: Abstände „Zelle zu Gefäß“ in µm in Abhängigkeit vom Zelltyp
Anteil der Zellen in Abhängigkeit vom Abstand zum Gefäß (µm)
Zelltyp Mittelwert, Median und Standardabweichung in µm
0 bis 30 30 bis 60
60 bis 90
> 90
Alle Zellen
48,87 35,28 ± 20,635
0,426 0,397 ± 0,231
0,308 0,322 ± 0,108
0,139 0,145 ± 0,093
0,127 0,040 ± 0,176
MIB1 29,74 26,70 ± 10,03
0,591 0,573 ± 0,183
0,324 0,333 ± 0,145
0,071 0,050 ± 0,070
0,015 0,000 ± 0,037
CD68 28,23 22,86 ± 8,68
0,646 0,639 ± 0,202
0,262 0,270 ± 0,135
0,067 0,043 ± 0,078
0,025 0,000 ± 0,056
CD3 24,86 18,10 ± 19,21
0,712 0,750 ± 0,252
0,219 0,174 ± 0,224
0,049 0,000 ± 0,119
0,020 0,000 ± 0,057
CD8 21,99 16,37 ± 9,11
0,749 0,758 ± 0,209
0,190 0,158 ± 0,170
0,048 0,000 ± 0,095
0,013 0,000 ± 0,072
CD20 23,17 15,55 ± 31,17
0,733 0,852 ± 0,320
0,252 0,143 ± 0,309
0,014 0,000 ± 0,087
0,001 0,000 ± 0,007
FoxP3 25,66 18,65 ± 18,93
0,713 0,750 ± 0,280
0,206 0,178 ± 0,228
0,065 0,000 ± 0,151
0,016 0,000 ± 0,067
53
Abb. 18: Relative Verteilung der Zellen in Abhängigkeit des Abstandes zum jeweils nächsten Gefäß in µm.
Abb. 17: Relative Verteilung der CD8+-Lymphozyten in Abhängigkeit des Abstandes (in µm) zum jeweils nächsten Gefäß für die Ermittlung des Cutoff-Wertes.
54
Mehr als 70 % der dieser TIL Subpopulationen befanden sich innerhalb der
30 µm-Zone um das nächstliegende Gefäß. Als Referenz diente eine für alle
im Tumor befindlichen Zellen ermittelte Verteilung. Die mittlere
Gesamtzellverteilung konnte näherungsweise als eine Verteilung der
Tumorzellen betrachtet werden, da die Tumorzellen mit Abstand den größten
Anteil aller Zellen im GBM ausmachten. Danach lagen nur 42,6 % der
Tumorzellen innerhalb der 30 µm-Zone des nächst gelegenen Gefäßes.
Die CD68+ Mikroglia/Makrophagen, von denen bekannt ist, dass sie sich in
einer genau definierten räumlichen Distanz zueinander im Hirngewebe
anordnen, zeigten eine geringere Affinität zu den nächstliegenden Gefäßen
als die Lymphozyten. 64,6 % der gegen CD68 gefärbten Zellen war innerhalb
der ersten 30 µm vom Gefäß lokalisiert. Schließlich befanden sich die MIB-1+
Zellen ebenfalls vermehrt in der Nähe des nächstliegenden Gefäßes. Dabei
blieb unklar, ob diese Beobachtung als Confounding-Effekt gewertet werden
sollte, da aktivierte Immunzellen ebenfalls vermehrt den Proliferationsmarker
MIB1 exprimieren. Tumorzellen in unmittelbarer Nähe zu den Gefäßen
könnten aber auch eine erhöhte MIB1-Expression vorweisen, da sie in
Gefäßnähe eine bessere Versorgung mit Sauerstoff, Nährstoffen und
endokrine Botenstoffen vorfinden (Tab. 5).
In der graphischen Aufarbeitung der mittleren, standardisierten Verteilungen
von TIL und Tumorzellen (Abb. 18) zeigte sich ein Schnittpunkt zwischen der
Verteilungslinie der TIL (bunt) und der Gesamt-/Tumorzellen (schwarz) bei
etwa 30 µm Abstand zum Gefäß. Innerhalb der ersten 30 µm war der
standardisierte Anteil der TIL größer, außerhalb der 30 µm-Zone waren
vermehrt Tumorzellen lokalisiert. Diese Beziehung zeigte sich auch, wenn
anstatt der mittleren Gesamtverteilungen von TIL und Gesamt-/Tumorzellen,
die patientenspezifischen, standardisierten Verteilungen, zum Beispiel für die
CD8+ Lymphozyten, auftragen wurden (Abb. 17). Die perivaskuläre 30 µm-
Zone erwies sich somit als geeigneter Parameter, um die Verteilungen der
verschiedenen Lymphozytensubpopulationen zu vergleichen sowie
interindividuelle Unterschiede in den TIL-Verteilungen zu charakterisieren und
55
hinsichtlich ihrer prognostischen Bedeutung für das Patientenüberleben zu
untersuchen.
4.1.3. Prognostische Bedeutung der Tumor-infiltrierenden Lymphozyten
Zur Überlebenszeitanalyse mit Hilfe der Cox-Regression sowie des Kaplan-
Meier-Schätzers wurden die Patienten anhand der immunhistochemischen
Daten gruppiert. Die Aufteilung in zwei Gruppen erfolgte bei der Untersuchung
des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit von Gesamt-/Tumorzellzahl, MIB1+-
Zellzahl und Gefäßfläche jeweils am Median. Bei der Analyse der Ergebnisse
aus den Abstandsmessungen erfolgte die Trennung ebenfalls am Median. Die
verschiedenen Datensätze waren dabei näherungsweise normalverteilt
(Abb. 19).
Mittelwert 2902 Median 2777 Standardabweichung 1507
Gesamtzellen pro mm² im Tumorhauptbereich
66 %-Perzentile 3553 Abb. 19: Anzahl der Gesamtzellen pro mm² Tumorfläche im Tumorhauptbereich (Histogramm).
56
Bei der Analyse des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit von der Anzahl der
TIL erfolgte die Trennung des Patientenkollektivs hingegen an der 66 %-
Perzentile. Der Grund dafür waren Peaks im oberen Drittel der TIL-
Verteilungen (Abb. 20). Zudem schien die Trennung an der 66 %-Perzentile
besser geeignet, das Langzeitüberleben in Abhängigkeit von der Anzahl der
TIL zu untersuchen. Die kleine Gruppe der Langzeitüberleber könnte, so die
Vorstellung, durch eine 1/3- zu 2/3-Trennung des Patientenkollektivs besser
erfasst werden. Die Überlebenszeitanalyse in Abhängigkeit der
immunhistochemischen Charakteristika erfolgte nur für den
Tumorhauptbereich. Der Tumorinfiltrationsbereich wurde nicht ausgewertet,
da er nicht für alle Tumorproben eindeutig definiert werden konnte.
Die Cox-Regressions-Analyse des Gesamtüberlebens in Abhängigkeit der
verschiedenen immunistochemischen Variablen, ließ lediglich auf eine
Mittelwert 34,7 Median 16,6 Standardabweichung 42,4
CD8+-Lymphozyten pro mm² im Tumorhauptbereich
66 %-Perzentile 27,6 Abb. 20: Anzahl der CD8+-Lymphozyten pro mm² Tumorfläche im Tumorhauptbereich (Histogramm).
57
prognostische Bedeutung der CD68+ Mikroglia/Makrophagen schließen. Mit
einem Hazard Ratio von 0,49 bei einem 95 %-Konfidenzintervall von 0,25 bis
0,95 erwiesen sich die CD68+ als prognostisch günstig. Eine vermehrte
Infiltration mit CD68+-Zellen ging mit einem längeren Überleben der Patienten
einher, was in der Kaplan-Meier-Überlebenskurve veranschaulicht wurde
(Tab. 7).
Die prognostische Bedeutung der CD68+ Mikroglia/Makrophagen bestätigte
sich bei Anwendung des Logrank-Tests (Abb. 21). Bei der Cox-Regression
deutete sich eine prognostische Bedeutung der CD3+-TIL sowie der relativen
Gefäßfläche im Tumor an, ohne dass eine Signifikanz mit 5 %-
Signifikanzniveau abgeleitet werden konnte.
Tab. 7: Hazard Ratio und 95 %-Konfidenzintervall aus der Cox-Regressions-Analyse von Gesamtüberleben in Abhängigkeit der TIL.
95 %-Konfidenzintervall Zelltyp Hazard
Ratio Unteres Oberes
Gruppiert nach
MIB-1 1,01 0,58 1,78 Median
CD3 0,54 0,29 1,02 66 %-Perzentile
CD8 0,65 0,35 1,22 66 %-Perzentile
CD20 0,64 0,34 1,21 66 %-Perzentile
CD68 0,49 0,25 0,95 66 %-Perzentile
FoxP3 0,62 0,34 1,16 66 %-Perzentile
Gesamt 1,35 0,80 2,29 Median
Gefäße 0,58 0,34 1,00 Median
58
In der Überlebenszeitanalyse mit Kaplan-Meier-Schätzer und Logrank-Test
hatte die Tumorzelldichte für das Gesamtüberleben der Patienten eine
prognostische Bedeutung. Eine Tumorzelldichte von größer als
2794 Zellen/mm² war ein prognostisch negativer Faktor für das
Gesamtüberleben, wenn auch, bei einem p-Wert von 0,048, von schwacher
Signifikanz (Abb. 22). Dennoch scheint es plausible, dass eine hohe Zelldichte
ein hochmalignes Geschehen mit hoher Wachstums- und
Ausbreitungstendenz repräsentieren könnte.
Abb. 21: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit der CD68+-Zellen bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich.
59
Eine erhöhte Tumorvaskularisierung ging mit einer verbesserten Prognose der
Patienten einher. Patienten mit einer Gefäßfläche von mehr als 4,9 % der
Gesamtfläche überlebten signifikant länger (p = 0,049) im Vergleich mit
Patienten mit geringerer Tumorvaskularisierung (Abb. 23). Über mögliche
Ursachen lässt sich nur spekulieren. Dabei könnte eine erhöhte
Sauerstoffversorgung eine entscheidende Rolle spielen, da eine ausreichende
Tumoroxygenierung eine Voraussetzung für eine wirkungsvolle Therapie mit
ionisierender Strahlung und Antineoplastika ist.
Tumorhypoxie, hervorgerufen durch eine verringerte Sauerstoffversorgung
des Tumors, könnte dagegen die Proliferation von Tumorzellen stimulieren.
Beispielsweise stimuliert HIF-1α, der zentrale Mediator der zellulären Antwort
auf Hypoxie, Zellproliferation- und Überleben (Vaupel et al. 2007). Eine
geringe Tumorvaskularisierung würde eine verminderte Sauerstoffversorgung
Abb. 22: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit von der Zelldichte im Tumorhauptbereich pro mm² Tumorfläche.
60
des Gewebes bedingen, was in den Tumorzellen Proliferations- und
Überlebenssignale aktiviert. Dies wiederum könnte das Tumorwachstum
beschleunigen und die Prognose der Patienten letztendlich verschlechtern.
Beide Hypothesen ließen sich mit den Ergebnissen aus den
immunhistochemischen Untersuchungen jedoch nicht belegen. Die
immunhistochemische Markierung der Gefäße mit CD34 sowie die
bildmorphologischen Kriterien ermöglichten keine eindeutige Unterscheidung
zwischen funktionellen Gefäßen und Gefäßmalformationen.
Gefäßmalformationen, die Ausdruck der dysregulierten Angiogenese und
Vaskulogenese im GBM sind, tragen schließlich kaum zu einer ausreichenden
Blutversorgung des Tumorgewebes bei.
Abb. 23: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit von der Gefäßfläche bezogen auf die Tumorgesamtfläche.
61
Die Marker MIB-1, CD3, CD8 und CD20 erwiesen sich nicht als prognostische
bedeutende Faktoren für das Überleben der Patienten. Lediglich bei den CD3+
T-Lymphozyten war eine vermehrte Infiltration tendenziell mit einen
verlängerten Überleben verbunden (Abb. 24). Die mögliche prognostische
Bedeutung der FoxP3+ TIL war die Hauptfragestellung der
immunhistochemischen Untersuchungen am Erlanger Patientenkollektiv. In
anderen Tumorerkrankungen war den immunsupprimierenden FoxP3+ TIL
eine prognostisch negative Bedeutung, im Sinne einer
Überlebenszeitverkürzung zugeschrieben worden. Man nahm an, dass
Tumorzellen die FoxP3+-TIL gezielt anlocken und sich damit ein Immunprivileg
verschaffen könnten (Zitvogel 2006).
Zuletzt war in einigen Tumorentitäten auch die Expression von FoxP3+ durch
die Tumorzellen selbst beschrieben worden (Ebert 2008; Hinz 2007; Zuo
2007). Bei den Untersuchungen des Erlanger Patientenkollektivs zeigten die
mit FoxP3 gefärbten Zellen ausschließlich histomorphologische Kriterien von
Lymphozyten. Die mit FoxP3 gefärbten Zellkerne waren klein, dicht und rund.
Der Zytoplasmasaum der FoxP3 gefärbten Zellen war sehr schmal. Insgesamt
waren die FoxP3 gefärbten Zellen deutlich kleiner als die Tumorzellen. Damit
zeigte sich im Erlanger Patientenkollektiv mit den oben beschriebenen
immunhistochemischen Methoden keine Expression von FoxP3 in den
Tumorzellen, sondern nur in den Treg.
62
Die Anzahl der FoxP3+ Treg war, wie oben beschrieben, sehr gering und betrug
im Tumorhauptbereich 0,19 % aller Zellen und 7,04 % aller CD3+-T-
Lymphozyten. Diese Resultate entsprachen den Angaben aus der Literatur (El
Andaloussi and Lesniak 2006b). Im Gegensatz zu vorangegangenen Studien
(El Andaloussi 2006a; Fecci 2006) bestätigte sich die negativ prognostische
Bedeutung der Treg im Erlanger Patientenkollektiv jedoch nicht (Abb. 25). In
der Kaplan-Meier-Analyse des Erlanger Kollektivs zeigten Patienten mit
erhöhter Infiltration durch Treg ein verlängertes Überleben. Der Unterschied zu
den Patienten mit weniger Treg im Tumorhauptbereich war mit p = 0,130
jedoch nicht signifikant.
Abb. 24: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit der MIB-1+-Zellen (links oben), CD20+ Lymphozyten (links unten), CD3+ Lymphozyten (rechts oben) und CD8+ Lymphozyten (rechts unten) jeweils bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich.
63
Um die Bedeutung möglicher Interaktionen der TIL für das Gesamtüberleben
der Patienten zu untersuchen, wurden Verhältnisse verschiedener TIL
Subpopulationen zueinander bestimmt. Dabei fiel besonders die
prognostische Bedeutung des Quotienten aus Treg zu CD68+
Mikroglia/Makrophagen auf. Ein großer FoxP3/CD68-Quotient war mit einem
signifikanten (p = 0,037) Überlebensvorteil assoziiert (Abb. 26). Somit war das
Überleben der Patienten bei hoher Treg-Anzahl und/oder niedriger Anzahl der
Mikroglia/Makrophagen verlängert. Dieses Resultat war erstaunlich, da die
hohe Anzahl von Mikroglia/Makrophagen unabhängig von der Anzahl der Treg
prognostisch günstig war. Eine Erklärung für diesen Widerspruch ließ sich aus
den vorliegenden Ergebnissen nicht schließen. Im Gegensatz zum
FoxP3/CD68-Quotienten hatten die Verhältnisse von CD3+ T-Lymphozyten zu
Abb. 25: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit der FoxP3+-Lymphozyten bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich.
64
CD68+ Mikroglia/Makrophagen sowie der Anteil der Treg im CD3+ T-
Zellkompartiment keine prognostische Bedeutung (Abb. 26).
Abb. 26: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit von den Verhältnissen der FoxP3+ zu CD68+ Zellen (Mitte oben), der FoxP3+ zu CD3+-Lymphozyten (links unten) und der CD3+ zu CD68+ Zellen (rechts unten) jeweils im Tumorhauptbereich.
65
Die Lokalisation der Treg im Tumorhauptbereich war ebenfalls ohne
prognostische Relevanz. Das Überleben wurde in Abhängigkeit von der
Häufigkeit der Treg innerhalb der 30 µm-Zone um das nächstgelegene Gefäß
getestet. Patienten, wo sich mehr als 73 % aller Tumor-infiltrierenden Treg
innerhalb der 30 µm-Zone befanden, zeigten nahezu das gleiche
Gesamtüberleben wie Patienten, bei denen kleiner oder gleich 73 % aller
FoxP3+-Zellen innerhalb der 30 µm-Zone lokalisiert waren (Abb. 27).
Das Überleben der Patienten war außerdem unabhängig von der Lokalisation
der MIB1+ Zellen, der CD3+ T-Lymphozyten, der CD20+ B-Lymphozyten sowie
Abb. 27: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit vom Abstand der FoxP3+ Lymphozyten zum Gefäß.
66
der CD68+ Mikroglia/Makrophagen (Abb. 28). Das Versuchsvorgehen war
dabei stets gleich. Untersucht wurde die Häufigkeit der verschiedenen
Zelltypen innerhalb der 30 µm-Zone zum nächstgelegenen Gefäß. Die
Gruppierung der Patienten erfolgte jeweils am Median der
Häufigkeitsverteilung und die statistische Testung erfolgte mittels Logrank-
Test. Die teils deutlichen Unterschiede in der Lokalisation der TIL, die weiter
oben beschrieben sind, hatten allesamt keine prognostische Bedeutung für
das Gesamtüberleben im Erlanger Patientenkollektiv.
Abb. 28: Gesamtüberleben in Tagen in Abhängigkeit vom Abstand der MIB1+-Zellen (links oben), der CD20+ B-Lymphozyten (links unten), der CD3+ T-Lymphozyten (rechts oben) und der CD68+ Mikroglia/Makrophagen (rechts unten) zum Gefäß.
67
4.2. Ergebnisse aus Chemotaxis-Untersuchungen
4.2.1. Konzentrationsausgleich in der Boyden-Chamber
Der Konzentrationsausgleich zwischen oberer und unterer Kammer erfolgte
nach Zugabe von Phenolrot in die untere Kammer sehr rasch. Nach circa 30
bis 40 min erreichte die Konzentration in der oberen Kammer ein konstantes
Plateau, der Konzentrationsausgleich war damit abgeschlossen. Zwar kann
man davon ausgehen, dass die kleinen Phenolrot-Moleküle (Molekulargewicht
= 354,38 g/mol) rascher diffundieren als Chemokine (Molekulargewicht = 8000
bis 14000 g/mol), dennoch dürfte sich auch bei den Chemokinen rasch ein
Konzentrationsausgleich eingestellt haben (Entschladen 2005) (Abb. 29).
4.2.2. Charakterisierung der Primärzelllinien
GFAP ist ein hochspezifischer, zytoplasamatischer Marker für astrogliale
Zellen. Nach längerer in vitro-Kultivierung kann die GFAP-Produktion
vermindert sein, was sich an den LN18 und A172 Zelllinien zeigte. Die selbst
etablierten Primärzelllinien zeigten im Immunostaining allesamt eine
ausgeprägte Anfärbung mit dem anti-GFAP-Antikörper. Im Gegensatz zu den
Abb. 29: Diffusion von Phenolrot durch MultiScreen®-Membran mit 3 µm-Porendurchmesser in Abhängigkeit von der Diffusionszeit in Minuten.
68
LN18 und A172 Zellinien, war die GFAP-Färbung innerhalb der einzelnen
Primärzelllinien sehr polymorph (Abb. 30).
Die Primärkulturen beinhalteten wahrscheinlich verschiedene Tumorzellklone
und nicht-tumoröse Zellen astroglialen Ursprungs. Zur Produktion der
Tumorüberstände war der polymorphe Charakter der Primärzelllinien als
positiv anzusehen. Die Primärzellinien waren dem komplexen Tumormilieu
ähnlicher als die monoklonalen A172 und LN18 Glioblastomzelllinien. In
früheren Untersuchungen von Wagner nahmen die IL-10-Spiegel während der
Abb. 30: Doppelfärbung von Glial fibrillary acid protein (GFAP; grün) und DAPI-Färbung (Kern; blau) bei primären und sekundären Glioblastoma multiforme-Zellkulturen (primär: KD, BS, BT, RA und RE2; sekundär: A172 und LN18).
69
Etablierung und weiteren Kultivierung von Glioblastomzellkulturen stark ab.
Vermutlich führte die Abnahme der CD68+ Mikroglia und Makrophagen, die als
Hauptproduzenten für IL-10 im GBM-Tumormilieu identifiziert werden konnten,
zum Abfall der IL-10-Spiegel nach Etablierung und Kultivierung der (Wagner et
al. 1999).
Das Wachstum der Primärkulturen wurde beim Passagieren
lichtmikroskopisch beobachtet. In den Primärkulturen fanden sich häufig
übereinander wachsende Zellen und ausgeprägte Zellklumpen, was als
Zeichen unkontrollierten Wachstums bewertet wurde (Abb. 31). Im Gegensatz
dazu würden nicht-neoplastische Zellen, zum Beispiel Hautfibroblasten,
Wachstum und Teilung durch Kontaktinhibition einschränken, nachdem der
Flaschenboden vollständig bedeckt ist.
70
Abb. 31: Primärkultur BRA: verschiedene Bereiche in Zellkulturflasche.
71
4.2.3. Calcein zur Detektion migrierter Zellen
Calcein und Höchst 33342 sind Fluoreszenzfarbstoffe für in vitro- und in vivo-
Migrationsuntersuchungen an Lymphozyten. Während Höchst 33342 ähnlich
wie DAPI an Adenosin-Thymidin-reiche Regionen der DNS bindet, verbleibt
Calcein nach Bindung an Proteine im Zytoplasma der Lymphozyten (Parish
1999). Calcein erwies für diese Untersuchungen als geeigneter. Die
Differenzen zwischen den Messpunkten waren bei beiden Farbstoffen ähnlich,
der Hintergrund nach Calceinfärbung und Messung mit dem HTS 7000 Multi-
Assay-Reader jedoch geringer (Abb. 32).
Verschiedene Studien hatten belegt, dass Calcein auch in hohen
Konzentrationen keinen Einfluss auf zelluläre Funktionen ausübt (Parish
1999). In einer in vivo-Studie wurde jedoch gezeigt, dass eine bestimmte
Lymphozytensubpopulation besonders viel Calcein aufnehme und dass bei
dieser Subpopulation das homing über die high endothelial venules
eingeschränkt ist (Weston et al. 1992). In einer weiteren Veröffentlichung war
zudem beschrieben worden, dass die Migration von Monozyten durch Calcein
gehemmt werden kann (Czepluch et al. 2007). In dieser Studie waren die
Monozyten für 30 min mit 8,03 µM Calcein-Lösung inkubiert worden.
Abb. 32: Detektion der Lymphozyten mittels Multi-Assay-Reader nach Calcein- oder H33342-Färbung.
72
In den eigenen Untersuchungen übte Calcein jedoch keinen Einfluss auf die
Migration von Lymphozyten aus. Die Lymphozyten wurden 45 min mit 0,5 µM
Calcein gefärbt, das überschüssige Calcein, das noch nicht in die Zellen
aufgenommen worden war, mit 1xPBS ausgewaschen und die Zellen nach
Zentrifugation in RPMI-Medium plus 0,2 % BSA für die Migration
resuspendiert (Abb. 32-35).
Abb. 33: Detektion der Lymphozyten mittels Multi-Assay-Reader nach Calcein- Färbung mit und ohne Auswaschen des überschüssigen Calceins.
73
4.2.4. Einfluss der Migrationszeit auf die Migration
Die Migrationszeit sollte so gewählt werden, dass die Unterschiede zwischen
stimulierten und unstimulierten Lymphozyten möglichst gut zur Darstellung
kamen. Bei Verwendung der Millipore MultiScreen®-Membranen mit 3 µm
Porendurchmesser erwies sich für die Migration eine Zeitspanne von 3 h als
günstig. Bereits nach 5 min waren erste Lymphozyten an der
Abb. 34: Ermittlung einer möglichst niedrigen Calcein-Konzentration (in µM).
Abb. 35: Einfluss von Calcein auf die Migration.
74
Membranunterseite mittels Immunofluoreszenzfärbung und -mikroskopie
detektierbar. Mit dem Multi-Assay-Reader-Verfahren zeigten sich nach
spätestens 1 h deutliche Unterschiede im chemokinetischen Verhalten der
Lymphozyten. Bei längeren Migrationszeiten fielen die Unterschiede meistens
deutlicher aus. Bei Verwendung der Millipore MultiScreen®-Membranen mit
5 µm Porendurchmesser, wanderten die Lymphozyten schneller in das untere
Well (Abb. 36-38).
Abb. 36: Detektion von Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) an der Membranunterseite.
Abb. 37: Einfluss der Migrationszeit auf den Migrationsindex.
75
4.2.5. Einfluss des Kulturmediums auf die Migration
Fötales, bovines Serum (FBS) enthält zahlreiche Wachstums- und
Botenstoffe. Es kann als einfacher und sicherer Lockstoff zur Etablierung von
Migrationsassays eingesetzt werden. Zur Etablierung der Migrationsversuche
wurde DMEM mit 10 % FBS als Lockstoff eingesetzt. Serumfreies DMEM und
1xPBS mit jeweils 0,2 % BSA dienten als Negativkontrollen (Abb. 39).
Abb. 38: Verwendung von Millipore MultiScreen Membranen mit 3 µm und 5 µm Porendurchmesser im Vergleich. Migration von Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) mit Migrationszeiten von 2 und 4 h.
76
Aufgrund der chemotaktischen Wirkung von FBS wurde bei der Gewinnung
der Tumorüberstände aus den GBM-Zelllinien DMEM mit 2 % FBS zur
Kultivierung eingesetzt. Damit sollte den Zellen ausreichend
Wachstumsfaktoren zur Verfügung gestellt werden, aber gleichzeitig ein zu
großer Einfluss des FBS auf die späteren Migrationsversuche vermieden
werden. In den Migrationsversuchen diente frisches DMEM mit 2 % FBS als
Kontrolle.
Eine interessante Beobachtung war schließlich, dass die Zeit, die die
Lymphozyten im Medium verbrachten, erheblichen Einfluss auf die Migration
hatte. In einem Vergleichsversuch wurden in einem Ansatz Lymphozyten nach
Isolation, Waschen und Zugabe frischen Mediums zum Zeitpunkt 0, 2 und 4 h
in die 96-well Platte aufgetragen und die Migration zum Zeitpunkt 6 h
gestoppt. Die Lymphozyten waren damit 2, 4 beziehungsweise 6 h gewandert.
Das Medium aller Lymphozyten wurde einmalig zum Zeitpunkt 0 h
ausgetauscht. Die Ergebnisse fielen überraschend aus. Die meisten
Lymphozyten waren nicht nach 6-stündiger Migration, sondern nach 2 h
Migrationszeit gewandert. Die Wiederholung des Versuchs bestätigte dieses
Ergebnis (Abb. 40).
0
5000
10000
15000
20000
25000
PB
S+0
,2%
BS
A
RP
MI+
0,2%
BS
A
RP
MI+
10%
FBS
PB
S+0
,2%
BS
A
RP
MI+
0,2%
BS
A
RP
MI+
10%
FBS
PB
S+0
,2%
BS
A
RP
MI+
0,2%
BS
A
RP
MI+
10%
FBS
PBMC CD8+ CD4+
Lym
phoz
yten
pro
wel
l (15
0 µl
)
Abb. 39: RPMI plus 10 % FBS als Chemoattractant.
77
Im zweiten Ansatz betrugen die Migrationszeiten ebenfalls 2, 4 und 6 h.
Jedoch wurden alle Lymphozyten nach Waschen, Zentrifugation und
Resuspension in frischem Medium zum Zeitpunkt 0 h ausgesät und die
Migration entsprechend nach 2, 4 und 6 h gestoppt. Wie erwartet wanderten
bei 6 h Migrationszeit die meisten Lymphozyten, bei 2 h am wenigsten (Abb.
41).
Abb. 40: 2, 4, 6-stündige Migration von Lymphozyten mit Auftragen nach 0, 2 und 4 h und gemeinsamen Stopp nach 6 h.
78
Auf den ersten Blick scheinen beide Versuche identisch. Die unterschiedlichen
Ergebnisse sind vermutlich auf folgenden, entscheidenden Unterschied
zurückzuführen: die Lymphozyten aus dem ersten Ansatz, die zu den späteren
Zeitpunkten ausgesät wurden, verblieben für 2 h beziehungsweise 4 h im
Medium und sezernierten Boten- und Wachstumstoffe. Das Medium wurde
unmittelbar vor dem Aussäen nicht mehr ausgetauscht, die Lymphozyten
wurden in dem konditionierten Medium aufgetragen. Dadurch wurde das
Migrationsverhalten nachhaltig beeinflusst. Für die darauf folgenden
Versuchen war es deshalb umso wichtiger, alle Lymphozyten unmittelbar vor
dem Auftragen auf die 96-wells (Zeitpunkt: 0 h) durch einen zusätzlichen
Waschvorgang und Zugabe von frischen Medium in die gleiche
Ausgangsposition zu bringen, zumal das Isolieren der verschiedenen
Lymphozytensubpopulationen unterschiedlich lange dauerte und die
Lymphozyten bis zum Versuchsbeginn unterschiedlich lange in ihrem Medium
verweilten.
Abb. 41: 2, 4, 6-stündige Migration von Lymphozyten mit gemeinsamen Auftragen und Stopp nach 2, 4 und 6 h.
79
4.2.6. Migration auf A172- und LN18-Überstände
Unabhängig von der Behandlungsmodalität (Tumor unbehandelt, 2 Gy, TMZ,
2 Gy + TMZ), zeigten PBMC und CD8+ Lymphozyten auf Überstände der
beiden etablierten Zelllinien A172 und LN18 eine verstärkte Migration
(Abb. 42).
Die Migration der Treg wurde dagegen nur durch Überstände der LN18-
Tumorzellen verstärkt. CD4+ sowie CD4+CD25- Lymphozyten wurden weder
durch die Tumorüberstände von A172 noch durch die Überstände von LN18
angelockt. Die Migration der CD4+ sowie der CD4+CD25- Lymphozyten auf die
Tumorüberstände war im Vergleich zur Migration auf das Kontrollmedium
sogar vermindert. Es konnte kein konstanter, von den Tumorzelllinien
unabhängiger Einfluss einzelner Behandlungsmodalitäten auf die
chemotaktische Wirkung der Tumorüberstände festgestellt werden. Die
Abb. 42: Migration von Spenderlymphozyten (PBMC) auf verschiedene Kontrollen und Tumorüberstände.
80
Migration der verschiedenen Lymphozytensubpopulationen wurde im Mittel
allenfalls durch Überstände aus der Kombinationsbehandlung von 2 Gy + TMZ
verstärkt aktiviert.
Dabei könnte die Kombinationsbehandlung von 2 Gy + TMZ die höchsten
Apoptose- und Nekroseraten in den Tumorzelllinien hervorgerufen haben. Die
daraus resultierende Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren
könnte wiederum die verstärkte Migration besonders der CD8+ Lymphozyten
verursacht haben. Die Migration der CD8+ Lymphozyten war um die Faktoren
1,4 (A172) beziehungsweise 2,1 (LN18) nach Kombinationsbehandlung der
Tumorzellen mit 2 Gy plus TMZ im Vergleich zur Wanderung auf das
Kontrollmedium verstärkt.
4.2.7. Migration auf Primärüberstände
Die Migration auf die verschiedenen Überstände aus den Primärkulturen war
sehr unterschiedlich. Ein eindeutiges Muster war nur schwer auszumachen.
Bei genauer Betrachtung der Ergebnisse, insbesondere der Migration bei
Verwendung der Tumorüberstände von KD- und BS-Primärkulturen, schien
die Migration abhängig von der Behandlungsform der Tumorzellen, aber
unabhängig von der verwendeten Lymphozytensubpopulation (PBMC, CD8+
und Treg). Die lymphozytäre Migration auf die unbehandelten und die mit 2 Gy
plus TMZ kombiniert behandelten Überstände von KD und BS war erhöht.
Eine Behandlung mit entweder 2 Gy oder TMZ steigerte die Migrationsrate im
Vergleich zur Kontrolle mit Medium jedoch nicht (Abb. 43, 44).
81
Abb. 43: Migrationsindex: Spenderlymphozyten (PBMC, CD8+, CD4+) auf KD-Tumorüberstände (Kontrolle Tumor, 2 Gy, 10 µM TMZ, 2 Gy + 10 µM TMZ).
82
Ein ähnliches Migrationsverhalten zeigte sich bei den Überständen von RA
und RE2 (Abb. 45, 46). Wie schon andeutungsweise bei der Migration auf die
Überstände der etablierten A172- und LN18-Tumorzelllinien zu erkennen war,
bewirkte insbesondere die Kombinationsbehandlung mit 2 Gy und TMZ bei
den Primärkulturen eine gesteigerte Migrationsrate. Insbesondere bei
Überständen von BS- und RE2-Primärkulturen zeigte sich der Effekt der
Kombinationsbehandlung deutlich.
Abb. 44: Migrationsindex: Spenderlymphozyten (PBMC, CD8+, CD4+) auf BS-Tumorüberstände (Kontrolle Tumor, 2 Gy, 10 µM TMZ, 2 Gy + 10 µM TMZ).
83
Abb. 45: Migrationsindex: Spenderlymphozyten (PBMC, CD8+, CD4+) auf RA-Tumorüberstände (Kontrolle Tumor, 2 Gy, 10 µM TMZ, 2 Gy + 10 µM TMZ)
84
Davon abweichend war die Migrationsrate bei Überständen der BT-
Primärkultur bei alleiniger Vorbehandlung mit Chemotherapie erhöht (Abb.
47). Insgesamt waren die Migrationsindices eher klein, sowohl bei
Verwendung von A172- und LN18-Überständen als auch bei der Migration auf
Überstände aus den Primärkulturen. Selten überschritt die Migration auf die
Tumorüberstände im Verhältnis zur Migration auf das Kontrollmedium den
Faktor 2.
Abb. 46: Migrationsindex: Spenderlymphozyten (PBMC, CD8+, CD4+) auf RE2-Tumorüberstände (Kontrolle Tumor, 2 Gy, 10 µM TMZ, 2 Gy + 10 µM TMZ).
85
Abb. 47: Migrationsindex: Spenderlymphozyten (PBMC, CD8+, CD4+) auf BT-Tumorüberstände (Kontrolle Tumor, 2 Gy, 10 µM TMZ, 2 Gy + 10 µM TMZ).
86
5. Diskussion
Curiels Arbeit über die Rolle der regulatorischen T-Lymphozyten im
Ovarialkarzinom war für die Tumorimmunologieforschung bahnbrechend (Curiel
2004). Erstmals war der Blick auf diese kleine Lymphozytensubpopulation mit
immunsuppressiven Eigenschaften gerichtet, die eine entscheidende Bedeutung
für die Progression einer Tumorerkrankung und damit für die Prognose der
Patienten hatte.
Fecci übertrug die Erkenntnisse von Curiel auf die Tumorimmunologie beim GBM
und schien damit die bereits lange bekannte lokale und globale
Immunsuppression in Patienten mit malignen Gliomen erklären zu können (Fecci
2006). Die Arbeitsgruppe von Fecci beobachtete eine vergrößerte Treg-Fraktion
innerhalb des CD4+-Kompartiment von Patienten mit malignen Gliomen.
Depletion der Treg mit einem anti-CD25-Antikörper in vitro konnte die im CD4+-
Kompartiment beobachteten immunsuppressiven Effekten der Treg egalisieren
(Fecci 2006). In einem kleinen Kollektiv von zehn Glioblastompatienten
beobachtete El Andaloussi eine erhöhte Anzahl von Treg im Tumorgewebe und in
der Zirkulation (El Andaloussi and Lesniak 2006b).
In weiteren Untersuchungen an einem GBM-Mausmodell führte die Depletion der
Treg zur spontanen Remission von Tumoren und verlängerte das Überleben der
Mäuse (El Andaloussi 2006a; Fecci 2006). Zudem wurde gezeigt, dass GBM-
Tumorzellen durch Sekretion des CC-ligands (CCL) 2 regulatorischen T-Zellen
anlocken können (Jordan 2008). Man vermutete, dass sich die GBM-Tumorzellen
durch Anlockung der immunsuppressiven Treg aktiv der immunologischen
Tumorabwehr entziehen könnten.
In den bisherigen Studien über Tumor-infiltrierende Treg im Glioblastoma
multiforme wurde die prognostische Bedeutung der Treg für die Patienten noch
nicht dezidiert untersucht. Der möglich, negative Effekt der Treg für der Prognose
der Patienten wurde von den in vitro-Daten und den Erkenntnissen aus den
Mausmodellen abgeleitet. Die bisherigen Untersuchungen an menschlichen
Tumorproben waren deskriptiv und umfassten nur kleine Patientenkollektive. Der
87
direkte Vergleich mit der Anzahl und prognostischen Bedeutung anderer TIL-
Subpopulationen erfolgte bisher nicht.
Ziel dieser Untersuchungen war es deshalb in einem größeren Patientenkollektiv
von insgesamt 77 Patienten die Anzahl, Lokalisation und prognostische
Bedeutung der Tumor-infiltrierenden Treg genauer zu bestimmen, eine mögliche
Bedeutung für die Prognose der Patienten abzuleiten und Beziehungen zu
anderen TIL-Subpopulationen zu untersuchen. Die Migrationsuntersuchungen
sollten zudem Aufschluss darüber geben, ob GBM-Tumorzellen Treg im Vergleich
zu anderen Lymphozytensubpopulationen selektiv anlocken können und sich
somit ein Immunprivileg verschaffen könnten.
In Bezug auf Alter, Geschlechtsverteilung und Allgemeinzustand war das
ausgewählte Patientenkollektiv dem Kollektiv der großen „Stupp-Studie“ sehr
ähnlich (Stupp 2005) und konnte damit als repräsentativ betrachtet werden. Das
Gesamtüberleben der Erlanger Patienten entsprach in etwa dem des
Radiotherapiearmes der „Stupp-Studie“. Es war schlechter als das Überleben im
experimentellen Arm mit Radiochemotherapie, obwohl bereits viele Erlanger
Patienten entsprechend dieses Protokolls behandelt worden waren.
Mögliche Ursachen für das kürzere Gesamtüberleben im Vergleich zum
experimentellen Arm der „Stupp-Studie“ waren neben unterschiedlichen
Therapiekonzepten auch verschiedene Einschlusskriterien. In dem untersuchten
Erlanger Patientenkollektiv waren im Gegensatz zur „Stupp-Studie“ Patienten mit
Rezidiv und Zweittumoren, aber nicht Patienten mit prognostisch günstigeren
Anaplastischen Astrozytomen eingeschlossen. Unter ähnlichen
Einschlusskriterien wie die der „Stupp-Studie“ wäre das Gesamtüberleben des
Erlanger Patientenkollektives womöglich besser gewesen. Trotz der weniger
restriktiven Einschlusskriterien schien das Erlanger Patientenkollektiv gut
geeignet, um die Bedeutung der TIL im GBM zu untersuchen.
Patientenalter, Karnofsky-Index und MGMT-Methylierungsstatus sind die bisher
einzig etablierten, prognostisch bedeutsamen Faktoren beim GBM (Hegi 2005;
Krex and Schackert 2008). Im Erlanger Patientenkollektiv erwies sich das
88
Patientenalter als prognostisch wichtiger Faktor. Ältere Patienten hatten ein
signifikant schlechteres Überleben als junge Patienten.
Da der Karnofsky-Index der Erlanger Patienten nicht routinemäßig bestimmt
worden war, wurde die Abhängigkeit des Gesamtüberlebens vom ECOG-Index
untersucht. In der statistischen Analyse zeigte sich jedoch keine prognostische
Relevanz des ECOG-Index für das Gesamtüberleben. Dies könnte daran liegen,
dass der fünf-stufige ECOG-Index den Allgemeinzustand weniger genau erfasst
als der 100-Punkte-Karnofsky-Index. Ein Großteil der Patienten im untersuchten
Erlanger Patientenkollektiv war als ECOG 1 eingestuft worden. Der
durchschnittliche Allgemeinzustand war also recht gut. Auch deshalb könnte der
Allgemeinzustand im Erlanger Patientenkollektiv keine signifikante Bedeutung für
das Überleben gehabt haben.
Die quantitative Erfassung der TIL zeigte, dass die CD68+ Mikroglia/Makrophagen
mit 30,3 % aller Zellen im Tumor das Gros der Immunzellen darstellten. Dieses
Ergebnis deckte sich mit den Beobachtungen aus zahlreichen anderen Studien
(Hitchcock and Morris 1988; Morimura 1990; Nishie 1999; Roggendorf 1996). Die
Sonderstellung der Mikroglia/Makrophagen im GBM ist ein wesentlicher
Unterschied zur Tumorimmunologie in anderen Tumorerkrankungen, wo
Makrophagen oft nur eine Nebenrolle einnehmen.
Bis zu 3 % aller Zellen im GBM waren CD3+ und/oder CD8+, ein deutlich
geringerer Anteil als vorangegangene Studien ermittelt hatten (Farmer 1989;
Hitchcock and Morris 1988). Der Anteil der FoxP3+-Zellen betrug nur 0,19 % im
Tumorhauptbereich und 0,12 % in der Tumorinfiltrationszone. Im
Tumorhauptbereich befand sich also eine erhöhte Infiltration mit TIL im Vergleich
zur Tumorrandzone. Der Anteil der FoxP3+ Zellen an der Gesamtzahl aller CD3+
T-Lymphozyten betrug im Tumorhauptbereich durchschnittlich 6,9 %.
Aussagekräftige Vergleichswerte aus anderen Studien existierten nicht, da diese
mit anderen Meßmethoden, zum Beispiel flußzytometrischen Verfahren,
arbeiteten (El Andaloussi and Lesniak 2006b).
89
Die TIL waren diffus sowie perivaskulär im GBM lokalisiert, wie es bereits von
zahlreichen Autoren beschrieben worden war (Bertrand and Mannen 1960; Ridley
and Cavanagh 1971; Takeuchi and Barnard 1976). Die Abstände zwischen TIL
und Gefäßen waren bisher nicht quantifiziert worden. Mit der Bestimmung des
jeweils kürzesten Abstandes der TIL zum nächstgelegenen Gefäß, konnte in
dieser Studie die Lokalisation der verschiedenen TIL-Subpopulationen für jeden
Patienten ermittelt werden.
Als charakteristischer Marker wurde der Anteil der TIL innerhalb der 30 µm-Zone
zum nächsten Gefäß definiert. Über das gesamte Patientenkollektiv betrachtet
hatten mehr als 70 % der CD3+, der CD8+, der CD20+ und der FoxP3+
Lymphozyten einen Abstand von weniger als 30 µm zum nächsten Gefäß. Als
Referenz diente die Verteilung aller Zellen, die näherungsweise als Verteilung der
Tumorzellen betrachtet werden konnte. Danach hatten 42,6 % aller Tumorzellen
einen Abstand von weniger als 30 µm zum nächsten Gefäß. Die Immunzellen
zeigten somit eine ausgeprägte Affinität zu den Gefäßen. Diese Affinität war
unterschiedlich stark ausgeprägt. Die CD68+ Mikroglia/Makrophagen waren mit
64,6 % weniger innerhalb der 30 µm-Zone lokalisiert als die oben beschriebenen
TIL-Subpopulationen.
Erstaunlicherweise zeigten auch die MIB1+ Zellen mit durchschnittlich 59,1 % eine
deutliche Affinität zu den Gefäßen, obwohl eine Verteilung nahe der Verteilung
der Tumorzellen erwartet worden war. Die Lokalisation der MIB1+ Zellen nahe
den Gefäßen könnte damit erklärt werden, dass aktivierte Immunzellen, die
vermehrt um die Gefäße lokalisiert sind, MIB1+ exprimieren. Daneben könnten
aber auch Tumorzellen in unmittelbarer Nähe zu den Gefäßen vermehrt MIB1+ als
Zeichen gesteigerter Zellaktivierung- und Proliferation exprimieren. In der Nähe
von Gefäßen ist nämlich eine gute Versorgung mit Sauerstoff, Nährstoffen und
endokrinen Botenstoffen zu erwarten.
Eine prognostische Bedeutung der Anzahl Tumor-infiltrierender Treg im GBM ließ
sich nicht feststellen. Das Gesamtüberleben der Patienten war unabhängig von
der Anzahl der Treg bezogen auf die Gesamtzellzahl im Tumorhauptbereich.
Lediglich ein hoher FoxP3/CD68-Quotient ging mit einem längeren Überleben der
90
Patienten einher. Dieses Resultat war erstaunlich, da sich die CD68+
Makrophagen/Mikroglia in der Auswertung der Einzelfaktoren als prognostisch
günstig erwiesen. In Zusammenhang mit dem FoxP3/CD68-Quotienten war
dagegen eine geringe Anzahl CD68+-Zellen und/oder eine hohe Anzahl FoxP3+-
Lymphozyten mit einem längeren Überleben der Patienten verbunden. Die
prognostische Bedeutung des FoxP3/CD68-Quotienten führte indirekt zur
Verwerfung der ursprünglichen Arbeitshypothese, wonach eine verstärkte
Infiltration des GBM mit den immunsupprimierenden Treg in einem schlechteren
Gesamtüberleben resultieren würde. Diese Vermutungen, die auf den Daten aus
in vitro- und Mausmodellen basierten (El Andaloussi and Lesniak 2006b; Fecci
2006), ließen sich im Erlanger Patientenkollektiv nicht bestätigen.
Neben der prognostischen Bedeutung der CD68+ Mikroglia/Makrophagen, waren
sowohl die Gesamtzellzahl als auch die Vaskularisierung im Tumorhauptbereich
von prognostischer Relevanz. Es zeigte sich, dass eine vermehrte
Gesamtzellzahl pro Tumorfläche ein prognostischer Marker für ein verkürztes
Gesamtüberleben der Patienten war. Möglicherweise weist ein besonders
zellreicher Tumor eine höhere Progression als Tumoren mit einer geringeren
Zelldichte auf.
Eine große Gefäßfläche in Relation zur Tumorgesamtfläche war ein prognostisch
günstiger Marker für die Patienten. Die Erklärungsmöglichkeiten sind
mannigfaltig. Zum Beispiel könnte eine ausgeprägte Tumorvaskularisierung den
Blutfluss im und damit die Sauerstoffversorgung des Tumorgewebes verbessern.
Eine hohe Sauerstoffsättigung wäre wiederum Voraussetzung für eine gute
Wirksamkeit der Strahlentherapie, deren zytotoxische Effekte auf die Bildung von
Sauerstoffradikalen und deren schädigende Wirkung für die DNS zurückzuführen
sind. Eine ausgeprägte Tumorvaskularisierung könnte also ein besseres
Ansprechen der Strahlentherapie ermöglichen.
Ebenso wäre es denkbar, dass eine schlechte Sauerstoffversorgung aufgrund
einer geringen Tumorvaskularisierung Stress- und Gefahrsignalkaskaden in den
Tumorzellen aktiviert. Die Ausschüttung von Angiogenese- und
Proliferationsmediatoren als Antwort auf die Sauerstoffunterversorgung des
91
Tumorgewebes könnte unspezifisch das Tumorzellwachstum ankurbeln (Vaupel
and Mayer 2007). Diese Hypothesen ließen sich mit den Ergebnissen aus den
immunhistochemischen Untersuchungen jedoch nicht belegen. Die
immunhistochemische Markierung mit dem Endothelmarker CD34 sowie die
bildmorphologischen Kriterien ermöglichten keine eindeutige Unterscheidung
zwischen funktionellen Gefäßen und Gefäßmalformationen und ließen damit
keinen exakten Rückschluss auf die Gewebeperfusion zu.
Das Gesamtüberleben der Patienten zeigte keine Abhängigkeit von der Anzahl
der CD3+, der CD8+ und der CD20+ TIL in den Tumorproben. Dieses Ergebnis
entsprach den Studien von Schiffer und von Rossi, die ebenfalls keine
prognostische Bedeutung dieser TIL-Subpopulationen fanden (Rossi 1989;
Schiffer 1979). Das Gesamtüberleben war auch unabhängig von der Lokalisation
der TIL im GBM. Weder eine vermehrte perivaskuläre Infiltration, welche durch
einen hohen Anteil der TIL innerhalb der 30 µm-Zone um die Gefäß
wiedergegeben wurde, noch der diffuse Infiltrationstyp mit einem geringen Anteil
von TIL innerhalb der 30 µm-Zone hatten einen Einfluss auf das Überleben der
Patienten. Bei keiner der untersuchten Lymphozytensubpopulationen konnte eine
prognostische Relevanz hinsichtlich ihrer Lokalisation im Tumor nachgewiesen
werden. Zu einer ähnlichen Erkenntnis waren auch Schiffer und Rossi gelangt
(Rossi 1989; Schiffer 1979), wobei andere Studien gegenteiliges beschrieben und
sowohl eine positive (Boker 1984; Brooks 1978; Palma 1978) wie auch negative
(Safdari 1979, 1985) prognostische Bedeutung der TIL in Abhängigkeit ihrer
Lokalisation zu den Gefäßen fanden.
Bei der immunhistochemischen Untersuchung der Lokalisation von TIL im GBM
wird stets nur eine Momentaufnahme des Tumorgeschehens abgebildet. Der
Infiltrationsprozess per se kann immunhistochemisch kaum erfasst werden. In
vivo-Untersuchungen der TIL im Tiermodell, beispielsweise mit
fluoreszenzmarkierten Lymphozyten, könnten genauere Aufschlüsse über die
Lokalisation der TIL im GBM und dessen prognostische Bedeutung liefern.
Mit den Migrationsuntersuchungen in der Boyden-Chamber konnte der komplexe
Prozess der lymphozytären Tumorinfiltration in vivo zumindest teilweise
92
rekonstruiert werden. Mit Hilfe der Migrationsuntersuchungen wurde überprüft, ob
Tumorzellen lösliche Botenstoff sezernieren, die die Wanderungsgeschwindigkeit
(Chemokinetik) bestimmter Lymphozytensubpopulationen erhöht. Die eigentliche
Anlockung der Lymphozyten durch die Tumorzellen (Chemotaxis) konnte in der
Boyden chamber nicht bestimmt werden. Dennoch erschien es wahrscheinlich,
dass Konzentrationsgradienten der chemokinetischen Botenstoffe von den
Tumorzellen auch eine gerichtete Wanderung der Lymphozyten ermöglichen.
Da die rege Interaktion der Tumorzellen mit ihrem Mikromilieu die Sekretion von
Botenstoffen beeinflussen könnte, wurden neben den bereits etablierten GBM-
Zelllinien LN18 und A172 auch Tumorprimärzelllinien zur Herstellung der
Überstände für die Migrationsuntersuchungen verwendet. Die Tumorzellen
wurden nach dem Gewebeaufschluss nicht extrahiert, womit sich neben den
Tumorzellen auch andere zelluläre Bestandteile des Tumormikromilieus in den
Primärkulturen befanden. Die Primärkulturen in der ersten Passage gaben, so die
Vorstellung, das Geschehen im Tumor besser wieder, als die bereits vielfach in
vitro passagierten LN18- und A172-Zellen. Diese Vorstellung beruhte unter
anderem auf den Ergebnissen von Wagner, der rasch abfallende IL-10-Spiegel
während der ersten Passagen von GBM-Primärkulturen beobachtete und CD68+
Mikroglia/Makrophagen als Hauptproduzenten von IL-10 identifizieren konnte
(Wagner 1999). Mikroglia/Makrophagen waren in den Primärkulturen von Wagner
nach wenigen Passagen von den Tumorzellen verdrängt worden. Die
Bestimmung von GFAP, p53 und MGMT sollte sicherstellen, dass sich in den
Primärkulturen ausreichend Tumorzellen astrozytären Ursprungs fanden. Die
histopathologische Diagnose wurde von der Neuropathologie der FAU Erlangen-
Nürnberg gestellt.
Zur Quantifizierung der Migrationsuntersuchungen in der Boyden Chamber wurde
die Lymphozytenbestimmung mittels Fluoreszenzmessung etabliert. Die
Lymphozyten wurden bereits vor der Migration mit dem Farbstoff Calcein gefärbt,
ein Farbstoff, der in Tierversuchen auch in vivo Anwendung findet (Parish 1999).
Vorversuche zeigten, dass die Färbung mit Calcein keinen Einfluss auf das
Migrationsverhalten der peripheren mononukleären Zellen hatte.
93
Dagegen war der Einfluss des Kulturmediums auf die Migration von
entscheidender Bedeutung. Insbesondere der Zusatz von fötalen, bovinen Serum
(FBS) sowie die Konditionierung des Mediums durch die Lymphozyten nahmen
großen Einfluss auf den Versuchsablauf. Folglich wurde dem Medium anstatt FBS
stets bovines Serumalbumin (BSA) zugesetzt, außer FBS wurde als
Positivkontrolle genutzt. Zudem wurde das Medium der Lymphozyten unmittelbar
vor der Migration in der Boyden Chamber nochmals ausgetauscht, um der
Konditionierung des Mediums durch die Lymphozyten entgegenzuwirken.
Bei der Migration von PBMC, CD8+ T-Lymphozyten und Treg auf die Überstände
der etablierten LN18- und A172-Tumorzelllinien war keine eindeutige, selektive
Migration erkennbar. PBMC und CD8+ T-Zellen wanderten verstärkt sowohl bei
LN18- als auch bei A172-Tumorüberständen, wohingegen die Migrationsrate der
Treg nur von LN18-Tumorüberständen erhöht wurde. Interessanterweise war eine
vermehrte Migration nach einer Kombinationsbehandlung der Tumorzellen mit
2 Gy plus Temozolomid vor der Probengewinnung festzustellen. Folglich
enthielten die Tumorüberstände nach Kombinationsbehandlung eine erhöhte
Konzentration chemokinetische Signalstoffe, die die Migrationrate der
Lymphozyten steigerte. Möglicherweise hat die Kombinationsbestrahlung zu einer
vermehrten Tumorzellschädigung mit konsekutivem Zelltod geführt. Sowohl die
Sekretion von Botenstoffen während des geregelten Zelltodes als auch die
Freisetzung von zellulären Bestandteilen im Zuge der Nekrose könnten das
gesteigerte Migrationsverhalten in der Boyden Chamber bewirkt haben.
Bei den Migrationsuntersuchungen auf Überstände von Primärzellkulturen schien
die Migration abhängig von spezifischen Überstanden jedoch nahezu unabhängig
von der wandernden Lymphozytensubpopulation. Ähnlich wie bei den
Überständen der etablierten Tumorzelllinien, war die Migration auf Überständen
von den Primärkulturen nach Kombinationsbehandlung mit 2 Gy und TMZ erhöht.
Da die alleinige Behandlung mit entweder Bestrahlung oder Chemotherapeutikum
die Migration im Vergleich zur Kontrolle nicht erhöhte, konnte kein additiver Effekt
der Kombinationsbehandlung abgeleitet werden. Die Wanderung der
Lymphozyten auf die unbehandelten Überstände der KD-, BS-, RA- und RE2-
Primärkulturen war gegenüber der Migration auf Überstände nach alleiniger
94
Behandlung mit 2 Gy oder TMZ erhöht. Eine schlüssige Erklärung für diese
Resultate ließ sich nicht finden.
Eindeutige Ergebnisse, wie sie Jordan in seinen Migrationsversuchen mit GBM-
Tumorüberständen ermittelten konnte, wurden nicht beobachtet. Es blieb
ungeklärt, ob GBM-Tumorzellen selbst oder via parakriner Mechanismen die
Anlockung von und die Infiltration durch Tumor-infiltrierende Lymphozyten selektiv
bewirken können. Vielleicht repräsentierten weder die etablierten noch die
Primärkulturen das Tumormilieu ausreichend gut. Während des
Gewebeaufschluss zur Gewinnung der Primärkulturen wurden die Zellen
massiven Stress ausgesetzt, was vermutlich eine extrem erhöhte Sekretion von
Signal- und Gefahrstoffe provoziert hatte. Die Kokultivierung von Tumorzellen und
Immunzellen zur Herstellung der Tumorüberstände wäre eine gute Alternative,
dem Tumormilieu ohne vorangehenden Gewebeverdau näher zu kommen.
In zukünftigen immunhistochemischen Untersuchungen der TIL sollte ebenfalls
versucht werden, dem komplexen Tumormilieu des GBM gerecht zu werden. Bei
der Probenauswahl könnten neben Tumorhauptbereich und Infiltrationszone
eventuell auch Randbereiche mit nekrotischen Arealen und hypervaskularisierte
Areale berücksichtigt werden. Aufgrund des bunten histomorphologischen Bildes
des Glioblastoma multiforme, erfordert Analyse der TIL in GBM-Paraffinschnitten
ein sorgfältig geplantes Vorgehen. Die Resultate dieser Untersuchungen
schließen sich nahezu nahtlos an die Ergebnisse früherer Studien an und liefern
neue Hinweise für die Bedeutung der Tumorvaskularisierung und des
Zusammenspiels von FoxP3+ regulatorischen T-Zellen mit CD68+
Mikroglia/Makrophagen.
95
6. Abkürzungsverzeichnis
BCG: Bacille de Calmette et Guérin
BSA: Bovines Serumalbumin
Calcein AM: Calcein-Acetoxymethylester
CD: Cluster of differentiation
DAPI: 4',6-Diamidino-2-phenylindol
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO: Dimethylsulfoxid
DNS: Desoxyriboneucleinsäure
FAU: Friedrich-Alexander-Universität
FBS: Fötales bovines Serum
FoxP3: Forkhead box P3
GBM: Glioblastoma multiforme
GFAP: Glial fibrillary acid protein
HE: Hämatoxylin-Eosin
IL: Interleukin
MACS®: Magnetic cell separation®
MG: maligne Gliome
MGMT: O6-Methylguanin-DNS-Methyltransferase
MTA-1: Manueller Tissue Arrayer-1
MTIC: 5-(3-methyltriazen-1-yl)imidazole-4-carboxamide
PBMC: Peripheral blood mononuclear cells
PBS: Phosphate buffer saline
PCR: Polymerase-chain-reaction
PML: periphere mononukleäre Zellen
ROI: Region of interest
RPMI 1640-Medium: Roswell Park Memorial Institute 1640-Medium
TH1: T-Helferzellen vom Typ 1
TH2: T-Helferzellen vom Typ 2
TIL: Tumor-infiltrierende Lymphozyten
TMA: Tissue-micro-array
TMZ: Temozolomid
96
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102
8. Danksagung
Mein Dank gilt allen, die mich bei meiner wissenschaftlichen Arbeit unterstützt und zu
ihrem Gelingen beigetragen haben.
Zunächst möchte ich mich bei meinen Betreuern Dr. L. Distel und Prof. Dr. G. G.
Grabenbauer bedanken, die diese Arbeit initiiert und stetig mit neuen Ideen
bereichert haben. Besonders gerne denke ich an die gemeinsamen
wissenschaftlichen Diskussionen zurück.
Zu großen Dank bin ich den Herren PD Dr. O. Ganslandt und PD Dr. R. Voll
verpflichtet, meinen Betreuern seitens des Interdisziplinären Zentrums für Klinische
Forschung (IZKF) Erlangen. Das IZKF Erlangen bot mir zudem finanzielle und
wissenschaftliche Unterstützung bei der Durchführung meines Projektes.
Die Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern der Neurochirurgischen Klinik
und des Neuropathologischen Institutes des Universitätsklinikums Erlangen war stets
hervorragend. Besonderer Dank gilt Herrn Dr. R. Coras aus der Neuropathologie und
ein weiteres Mal Herrn PD Dr. O. Ganslandt, meinem Ansprecherpartner in der
Neurochirurgie.
Zuletzt danke ich Herrn Prof. Dr. R. Fietkau, Direktor der Strahlenklinik des
Universitätsklinikums Erlangen, der die finanziellen und wissenschaftlichen
Rahmenbedingungen zur Durchführung dieser Arbeit in der Strahlenbiologie
Erlangen geschaffen hat.
103
9. Curriculum vitae
PERSÖNLICHE DATEN
Christian Beyer
Schuhstraße 52
91052 Erlangen
0171 4171806
* 14.09.1983, Hersbruck
AUSBILDUNG
10/2009 - 12/2009 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung nach ÄAppO 2002
08/2008 - 06/2009 Praktisches Jahr mit folgenden Tertialen: Strahlentherapie (Universitätsklinikum Erlangen) Chirurgie (Universitätsklinikum Erlangen) Rheumatologie (Duke University, North Carolina)
10/2005 - 07/2008 Klinischer Ausbildungsabschnitt an der Friedrich-
Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
10/2003 - 09/2005 Vorklinischer Ausbildungsabschnitt an der Friedrich-
Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Abschluss mit dem Ersten Abschnitt der Ärztlichen Prüfung nach ÄAppO 2002
Note: 1,0
09/1994 - 06/2003 Gymnasium Eschenbach
Abiturnote: 1,0
FORSCHUNG
seit 08/2008 „Tumor-infiltrierende Lymphozyten beim Glioblastoma multiforme“
Promotionsarbeit bei Prof. Grabenbauer und Dr. Distel im Rahmen des D4-Projekts des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung (IZKF), Erlangen
seit 07/2009 Murine Fibrose-Modelle in der Sklerodermie
Forschungsarbeit in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Distler, Medizinische Klinik 3 des Universitätsklinikums Erlangen
104
AUSZEICHNUNGEN
06/2003 Buchpreis der Deutschen Physikalischen Gesellschaft
06/2003 Appolinaire-Preis der Robert Bosch Stiftung
06/2003 Vorschlag für die Stiftung Maximilianeum
09/2007 Aufnahme in das Erlanger Leonardo-Kolleg (Exzellenz-Initiative der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg)
02/2008 Aufnahme in die Studienstiftung des Deutschen Volkes
08/2008 Doktorandenstipendium des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung (IZKF) Erlangens
REVIEWTÄTIGKEITEN
Associate Member of Faculty 1000 Medicine, Section: Etiology, Pathogenesis and Animal Models of Rheumatic Disease
Arthritis Research and Therapy
KONGRESSBEITRÄGE
„CD4+CD25+, regulatorische T-Lymphozyten werden in vitro im Vergleich zu peripheren mononukleären Zellen durch Glioblastoma-Tumorzellen nicht selektiv angelockt.“ Postervortrag auf der Jahrestagung der Deutschen und Österreichischen Gesellschaft für Radioonkologie (DEGRO und ÖGRO), Wien 2008
„Lokalisation Tumor-infiltrierender Lymphozyten im Glioblastoma multiforme.“ Poster am Doktorandenworkshop des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung, Erlangen 2008
PUBLIKATIONEN
Beyer C, Schett G, Gay S, Distler O, Distler JH. Hypoxia. Hypoxia in the pathogenesis of systemic sclerosis. Arthritis Res Ther 2009;11(2):220
Beyer C, Abraham D, Distler JH, Distler O. The pathogenesis of systemic sclerosis. In: Distler O, editor. Scleroderma - modern aspects of pathogenesis, diagnosis and therapy. Bremen: UNI-MED Verlag AG; 2009.
Distler JH, Beyer C, Schett G, Luscher TF, Gay S, Distler O. Endothelial progenitor cells: Novel players in the pathogenesis of rheumatic diseases. Arthritis Rheum 2009;60(11):3168-3179.
Beyer C, Pisetsky DS. Microparticles in rheumatologic diseases. Nature Reviews Rheumatology 2009;in press.
Erlangen, 6. November 2009
![Untersuchung von Kalziumsignalen in T-Lymphozyten der ... · PDF file3.1.2 Präparation von Biopsien aus Kolon und Rektum zur Untersuchung gewebsständiger LP Lymphozyten 21 ... [Ca2+]](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/5a74cbe17f8b9a63638bf97d/untersuchung-von-kalziumsignalen-in-t-lymphozyten-der-a-312-praparation.jpg)
![Update der Lymphozyten- differenzierung – Hilfreich … · zu 55–83% um naive T-Lymphozyten, zu 6–19% um naive B-Lymphozyten sowie zu 7–31% um NK- Zellen [8]. Naiv bedeutet](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/5b9fe5b509d3f2857a8bdf36/update-der-lymphozyten-differenzierung-hilfreich-zu-5583-um-naive-t-lymphozyten.jpg)
