Traducción: Síntesis y procesamiento de proteínas Traducción

Enrique Castro, 2003

1© 2011 Enrique Castro

Traducción: Síntesis y procesamiento de proteínasTraducción: Síntesis y procesamiento de proteínas

➢Código genéticoEl proceso general: adaptadoresCaracterísticas del código

➢tRNA y aa-tRNA-sintetasasEstructura de tRNAsaa-tRNA sintetasas: mecanismo y tipos

Interacción codón-anticodón: Hipótesis del balanceo

➢Estructura de los ribosomasPapel del rRNATipos y mecanismos generales

➢Síntesis ribosomal de proteínasiniciaciónelongación

terminación

regulación

➢Procesamiento post-traduccionalPlegamiento

Modificaciones covalentesDistribución de proteínas a orgánulos.

➢Recambio y degradaciónUbiquitinación y proteasomaLisosomas

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Descodificación: adaptador tRNADescodificación: adaptador tRNA

Papeles del RNA• mRNA• rRNA• tRNA

Características del código • tripletes• no solapado• no puntuado• degenerado• universal



El código genéticoEl código genético Degeneración

• origen evolutivo• no aleatoria

Señales de control• Codones inicio• Codones stop

ventajas de la degeneración• resistencia a mutaciones• independencia secuencia/composición

•2 primeras bases significativas•tercera posición hipervariable



Marcos de lecturaMarcos de lectura

Mutaciones de cambio del marco de lectura



Mutaciones: cambios de basesMutaciones: cambios de bases



Variaciones del código mitocondrialVariaciones del código mitocondrial




➢Código genético

El proceso general: adaptadores

Características del código

➢tRNA y aa-tRNA-sintetasasEstructura de tRNAs

aa-tRNA sintetasas: mecanismo y tipos


➢Estructura de los ribosomas

Papel del rRNA

Tipos y mecanismos generales

➢Síntesis ribosomal de proteínas

iniciación

elongación

terminación

regulación

➢Procesamiento post-traduccional

Plegamiento

Modificaciones covalentes

Distribución de proteínas a orgánulos.

➢Recambio y degradación

Ubiquitinación y proteasoma

Lisosomas



La traducción es una descodificación bifásicaLa traducción es una descodificación bifásica Reconocimiento del tRNA

• Formación del aminoacil-tRNA• Aminoacil-tRNA sintetasas

Reconocimiento del codón• Apareamiento codón-anticodón



Estructura del tRNAEstructura del tRNA



Balanceo: apareamientos exóticos en 3ª baseBalanceo: apareamientos exóticos en 3ª base

Lodish, Figure 4-27



Funciones de la aminoaciltRNA sintetasasFunciones de la aminoaciltRNA sintetasas

Reconocimiento del tRNA• brazo aceptor• brazo anticodón/microhélice/brazo DHU

Correción• hidrólisis mal-esterificado

activación aa• Enlace anhídrido

TodosVariosUno



AminoaciltRNA sintetasas: activación y uniónAminoaciltRNA sintetasas: activación y unión

Figure 429

Each tRNA molecule is recognized by a specific aminoacyltRNA synthetase







➢tRNA y aa-tRNA-sintetasas

Estructura de tRNAs



➢Estructura de los ribosomasPapel del rRNA



iniciación

elongación

terminación

regulación


Plegamiento





Lisosomas



Ribosome structure in prokaryotes & eukaryotesRibosome structure in prokaryotes & eukaryotes

Figure 432



Estructura de ribosomas: RNA vs. proteínaEstructura de ribosomas: RNA vs. proteína

rRNA• bases exóticas• alta estructura secundaria• catalítico

Proteina• pequeña• estructurales

L19 (50S)

rRNA 16S (30S)



Image reconstruction of an E. coli ribosomeImage reconstruction of an E. coli ribosome

Figure 434



Sitios de unión de tRNA en el ribosomaSitios de unión de tRNA en el ribosoma








Estructura de tRNAs




Papel del rRNA


➢Síntesis ribosomal de proteínasiniciaciónelongación

terminaciónregulación


Plegamiento





Lisosomas



Iniciación en procariotasIniciación en procariotas

GDP + Pi

Selección codón inicio (procariotas)• AUG internos (múltiples, policistrónico)• AUG precedido Shine-Dalgarno

Shine-Dalgarno



Factores de iniciaciónFactores de iniciación



Etapas de la elongación de la cadena polipeptídicaEtapas de la elongación de la cadena polipeptídica



Entrada del aatRNA: función de EFTu/EFTsEntrada del aatRNA: función de EFTu/EFTs



Formación del enlace peptídicoFormación del enlace peptídico

rRNA=peptidil-transferasa• Alta conservación rRNA• Actividad PT tras inactivar proteínas• Mutaciones de resistencia a antibióticos ocurren

en rRNA, no proteínas

• Reacción espontánea (éster -> peptídico)• ΔG invertido en especificar secuencia



Translocación: papel de EFGTranslocación: papel de EFG



Terminación de la traducciónTerminación de la traducción



Antibioticos (1)Antibioticos (1)

Bloquea unión del aa-tRNA al sitio A

[baja]: impide comprobación bases 1-2 del codón

[alta]: bloquea C. iniciación

Bloquea translocación



Antibioticos (2)Antibioticos (2)

Inhibe peptidil-transferasa Terminación prematura: reemplaza a aa-tRNA

OH

OHH3C N

CH3H3C

OH

OH

CONH2OH

CH2OH

HH

HO

H

H3CN

OH H

O

H

H2N C

H2+N

NH

OH

NH

OHO

OH

H

N

NN

N

N

HH

OHNH

OCH2

HH

OH

C O

C HH2N

CH2

O

CH3

Puromicina

CH3H3C

HCHO

OHO

OH

HH3C

Estreptomicina

C NH2

N+H2

CH CH

NH C CHCl2

O

OH CH2

OH

O2N

Cloranfenicol

O O

Tetraciclina

CH3

CH3H3C

HO

H3C

HO

OH

O

CH3

CH3

O

H2C

H3C

O

O

O

HO

NCH3

H3C

CH3O

CH3O

O

CH3

CH3

OH

Eritromicina

CH2

C HHO

O

CH3H3C

NH

OO

Cicloheximida

Procariotas, 50S

Eucariotas, 60S



Factores de iniciaciónFactores de iniciación



Procesos esenciales en iniciación de eucariotasProcesos esenciales en iniciación de eucariotas

Formación del PIC 43S:unión subunidad pequeña y complejo ternario

“Activación” del mRNA:unión de caperuza / poliA

Reconocimienro del inicio:unión AUG-tRNAiGTPasa de eIF2

Reclutamiento de 60S:GTPasa eIF5B

Formación de PIC 48S:reclutamienro del mRNA “activado”escaneo 5'UTR



Formación del PIC 43SFormación del PIC 43S

Ayuno/hambreEstrésVirus

recycled



Reconocimiento del mRNAReconocimiento del mRNANutrientesInsulina

eIF4F =• eIF4E (unión 5'Cap)• eIF4A (helicasa)• eIF4G (andamio)

mRNA circularizado(iF4E-5' / PAB-3')

Regulación• eIF4-BP inactivado por fosforilación (mTOR)• eIF4E activado por fosforilación (MNK1)

Actividad helicasa eIF4A/eIF4Belimina Est. secundaria 5'UTRavance 50-100 nt



Del PIC 48S al complejo de elongación 80SDel PIC 48S al complejo de elongación 80S

Actividad helicasa eIF4A/eIF4B

elimina Est. secundaria 5'UTRavance 50-100 nt Reconocimiento AUG (Kozack)

Primer AUG desde 5'CAP, KozackIRES internos

eIF5 estimula GTPasa eIF2alivia inhibición eIF1 liberación Pi

doble comprobación de apareamiento

GCCA/GCCAUGGsecuencia de Kozack

-3 +1

eiF5B recluta 60SeIF5B reclutado tras eiF2·GDPeIF5B es GTPasa (60S=GAP)



Elongación y terminación en eucariotasElongación y terminación en eucariotas

Elongación• EF1(αβγ) = EF-Tu (α) + EF-Ts (βγ)• EF2 = EF-G

Terminación• único eRF1 reconocimiento de codón (=RF1+RF2). GTPasa.

• eRF3: unión a eIF4G (circularización)• eRF3 (disociación)

EF2 inactivado por fosforilación

Traducción múltiple simultánea y reciclado rápido son las claves de sintesis eficiente de proteínas



Toxinas inhibidoras de Trad. eucariotaToxinas inhibidoras de Trad. eucariota

T. diftérica• A (catalítico) B (transporte)• ADPribosilación de EF2• Bloqueo de translocación (eucariotas)

Ricina• Despurinación A en 23 S (catalítica)

• Inactivación de 60S

EF2 + NAD+ — nicotinamida + E2F-ADPR

Cicloheximida• Inhibición peptidil- tranferasa








Estructura de tRNAs




Papel del rRNA



iniciación

elongación

terminación

regulación

➢Procesamiento post-traduccionalPlegamientoModificaciones covalentes




Lisosomas



Plegamiento asistidoPlegamiento asistido

Chaperonas• unen zonas hidrofóbicas• evitan agregación/plegamiento prematuro

• HSP70 ubicuo (citosol/RE)• HSP 90 (citosólico)

Chaperoninas• Complejo con cavidad de plegado• Dependiente de ATP

• complejo HSP60 (exclusivo citosol)

Enzimas auxiliares• Proteina-disulfuro-isomerasa (PDI) (exclusivo ER)• Proteina-prolil-isomerasa (PPI)



Procesamiento PT: modificaciones covalentesProcesamiento PT: modificaciones covalentes

Generación de extremos• N-terminal: eliminación Met (+hidrólisis)• N-terminal: acetilación (50%)• C-terminal: hidrólisis

Anclaje a membrana (citosol)• miristoilación N-terminal• palmitoilación Cys• prenilación C-terminal (Cys)

Procesamiento ER/Golgi• Eliminación Secuencia señal• Glucosilación (N-, O-)• Inserción en membrana• Puentes disulfuro• Proteolisis/maduración

Unión de cofactores• Enzimas

Modificaciones funcionales• Fosforilación constitutiva (caseína)• Hidroxilación Pro, Lys (colágeno, desmosinas)• Metilación Lys, Glu• γ-carboxilación Glu (F. coagulación)



Distribución de proteínas sintetizadasDistribución de proteínas sintetizadas

Ruta citosólica

Ruta secretora



Papel del RE/Golgi en la síntesis de proteínasPapel del RE/Golgi en la síntesis de proteínas

Plegamiento• plegamiento inducido por chaperonas• formación de puentes disulfuro

Inserción en membrana• todas las transmembrana

Glucosilación• ER: N-glucosilación estándar• Golgi: O-glucosilación, específica

Maduración proteolítica• Golgi y gránulos de secreción

Ensamblaje de complejos multiproteicos••



Secuencia señal: Destino RESecuencia señal: Destino RE

•Longitud: 13-36 aa•1 básico (+) en lado N-terminal•Tramo central hidrofóbico (10-15 aa)•Corte: R pequeña, neutra (opcional)

• Señal N-terminal con corte: proteína N-terminal extracitosólico (secreción)

• Señal interna sin corte: segmentos transmembrana

SRP• RNP• poli-Met en p54

Señal reconocida por partícula de reconocimiento de la señal



Importación al RE: SRPImportación al RE: SRP

peptidasade señal

SRP-R• Reconocimiento SRP• GTPasa. GTP hidrolizado

Translocón• Une secuencia señal (N)• Transferencia ATP-dependiente



Inserción de proteínas de membranaInserción de proteínas de membrana

Señales topogénicas• secuencia señal N-terminal • secuencia señal interna• secuencia de parada de transferencia

secuencia señal:Básico + 10-15 hidrófobos

parada de transferencia: 20-25 hidrófobos (transmembrana)



Plegamiento asistido de proteínas en ERPlegamiento asistido de proteínas en ER

Asistentes de plegado• chaperonas: HSP, calnexina, calreticulina

(retención en ER)• Proteína-disulfuro isomerasa• Prolil-isomerasa (cis/trans)

Control de calidad:Sólo proteínas plegadas correctamente abandonan el ER

(luminal)

(anclada a membrana)



Glicosilación estándardGlicosilación estándard•Oligosacárido estereotipado•Construido íntegramente sobre Dolicol-P•Tranferido íntegro sobre N-Asn•Bloqueable por tunicamicina

-N-X-S/T-



Maduración por proteolisis Maduración por proteolisis

vía de secreción constitutiva vía de secreción regulada

en el Golgi

en gránulos de secreción

Proalbúmina

Albúmina

Proinsulina

Insulinacirculante








Estructura de tRNAs




Papel del rRNA



iniciación

elongación

terminación

regulación


Plegamiento



➢Recambio y degradaciónUbiquitinación y proteasoma

Lisosomas



Mecanismos de degradación de proteínasMecanismos de degradación de proteínas

Citosólico• Ubiquitina/proteasoma• Dependiente de ATP• Regulado por señales en sustratos

sustratos:•Proteínas T

1/2 corto (señales)

•Proteínas defectuosas

Lisosomal• Hidrolasas lisosomales (acídicas)• Independiente de ATP• Muerte por necrosis

Ca2+-proteasas• Citosólico• Muerte por necrosis

sustratos:•Proteínas T

1/2 largo

•Proteínas de membrana•Proteínas extracelulares

sustratos:•inespecífico



Recambio regulado de proteínas: ubiquitinaRecambio regulado de proteínas: ubiquitina

• pequeña, 76 aa• muy conservada• 7 Lys (aceptoras)

C-terminal Ub se une a ε-N-Lys

Ubiquitina= etiqueta de destrucción

Genes de Ub:• Fusión (Ub-L40, Ub-S27)• Locus poli-Ub

• proteasa de procesamiento

poli-Ubiquitinación:•Ub-COOH --> N-Lys-Ub



Mecanismo de ubiquitinaciónMecanismo de ubiquitinaciónUna E1 (enzima activadora de ubiquitina)Pocas E2 (UBC enzima conjugante de ubiquitina)Muchas E3 (proteína-Ub ligasas)(reconocimiento del sustrato)

E1:• activa Ub (AMP)•Transfiere a E2 (SH)

E2:• reserva de Ub activada• Donador de Ub

E3:• Transferencia al sustrato• Determinante de especificidad de sustrato(reconocimiento de señales)



Señales de ubiquitinación: especificidad E3Señales de ubiquitinación: especificidad E3 N-Terminal

• mecanismo básico (procariotas)

•

D-box• ciclinas

KEN-box• Securinas

Secuencias PEST• F. transcripción homeóticos• Enzimas metabólicas• Proteínas de señalización

Daño molecular• Oxidación/desplegado

Señales leídas por E3(especificidad de unión)



Proteasoma 26S: degradador de proteínasProteasoma 26S: degradador de proteínas

Complejo 26S:• Barril 20S: catalítico• Tapa 19S: reguladora

19S:• impide acceso inespecífico• Unión poli-Ub• Isopeptidasa (liberación Ub)• ATPasa: transferencia a cavidad

20S:• Centro activo interno (N-terminal de beta)

• Procesiva, intermedios no liberados

• Producto:péptidos 7-9

nucleofilo interno: previene ataque inespecífico

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