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ESTRUCTURA Y ESTABILIDAD DEL COLÁGENO 1 RESUMEN El colágeno es la proteína más abundante en los animales. Esta proteína fibrosa estructural comprende un ovillo dextrógiro de tres hélices paralelas y levógiras de poliprolina tipo II. Se han realizado grandes avances para establecer la estructura de triple hélice del colágeno y las bases físico-químicas para su estabilidad. Nuevas evidencias muestras que los efectos estereoelectrónicos y su preorganización juegan un papel clave en que la estabilidad. La estructura fibrilar de colágeno de tipo I-el prototipo de fibrillas de colágeno-se ha revelado en detalle. Fibrillas de colágeno artificial que muestran algunas de las propiedades de las fibrillas de colágeno natural son accesibles a través de síntesis química y de auto-ensamblaje. Una comprensión rápidamente emergente de las propiedades mecánicas y estructurales de las fibrillas de colágeno nativas guiará aún más el desarrollo de materiales de colágeno artificiales para la biomedicina y la nanotecnología. INTRODUCCIÓN El colágeno es una proteína estructural abundante en todos los animales. En los seres humanos, el colágeno comprende el equivalente a un tercio de las proteínas totales, representa tres cuartas partes del peso seco de la piel, y es el componente más prevalente de la matriz extracelular (ECM). Veintiocho tipos diferentes de colágeno compuestas de al menos 46 cadenas de polipéptidos distintas han sido identificados en los vertebrados, y muchas otras proteínas contienen dominios de colágeno. Notablemente, colágeno intacto ha sido descubierto en tejidos blandos de huesos fosilizados de un fósil de Tyranosaurus rex de 68 millones de años (3, 4), por mucho es la proteína más vieja descubierta hasta el momento. La característica definitoria de colágeno es un motivo estructural en el que tres cadenas polipeptídicas paralelas en conformación helicoidal levógira de poliprolina Tipo II (PPII) se enrollan una sobre otra para formar una triple hélice dextrógira (Figura 1). El apretado embalaje de PPII hélices triples dentro de la hélice hace que cada tercer residuo sea Gly, lo que resulta en una 1 ECM: matriz extracelular PPII: poliprolina tipo II Hyp: (2S, 4R) -4 - hidroxiprolina Tropocolágeno (TC): Triple hélice de colágeno monomérico después de la proteólisis de propéptidos de colágeno Página 1

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ESTRUCTURA Y ESTABILIDAD DEL COLÁGENO1

RESUMEN

El colágeno es la proteína más abundante en los animales. Esta proteína fibrosa estructural comprende un ovillo dextrógiro de tres hélices paralelas y levógiras de poliprolina tipo II. Se han realizado grandes avances para establecer la estructura de triple hélice del colágeno y las bases físico-químicas para su estabilidad. Nuevas evidencias muestras que los efectos estereoelectrónicos y su preorganización juegan un papel clave en que la estabilidad. La estructura fibrilar de colágeno de tipo I-el prototipo de fibrillas de colágeno-se ha revelado en detalle. Fibrillas de colágeno artificial que muestran algunas de las propiedades de las fibrillas de colágeno natural son accesibles a través de síntesis química y de auto-ensamblaje. Una comprensión rápidamente emergente de las propiedades mecánicas y estructurales de las fibrillas de colágeno nativas guiará aún más el desarrollo de materiales de colágeno artificiales para la biomedicina y la nanotecnología.

INTRODUCCIÓN

El colágeno es una proteína estructural abundante en todos los animales. En los seres humanos, el colágeno comprende el equivalente a un tercio de las proteínas totales, representa tres cuartas partes del peso seco de la piel, y es el componente más prevalente de la matriz extracelular (ECM). Veintiocho tipos diferentes de colágeno compuestas de al menos 46 cadenas de polipéptidos distintas han sido identificados en los vertebrados, y muchas otras proteínas contienen dominios de colágeno.

Notablemente, colágeno intacto ha sido descubierto en tejidos blandos de huesos fosilizados de un fósil de Tyranosaurus rex de 68 millones de años (3, 4), por mucho es la proteína más vieja descubierta hasta el momento.

La característica definitoria de colágeno es un motivo estructural en el que tres cadenas polipeptídicas paralelas en conformación helicoidal levógira de poliprolina Tipo II (PPII) se enrollan una sobre otra para formar una triple hélice dextrógira (Figura 1). El apretado embalaje de PPII hélices triples dentro de la hélice hace que cada tercer residuo sea Gly, lo que resulta en una secuencia de repetición de XaaYaaGly, donde Xaa y Yaa puede ser cualquier aminoácido. Esta repetición se produce en todos los tipos de colágeno, a pesar de que se interrumpe en ciertos lugares dentro del dominio de triple hélice de colágeno no fibrilar (8). Los aminoácidos en las posiciones Xaa Yaa y de colágeno son a menudo (2S)-prolina (Pro, 28%) y (2S, 4R) - 4-hidroxiprolina (Hyp, 38%), respectivamente. ProHypGly es el triplete más común (10,5%) en colágeno (9). En los animales, triples hélices individuales de colágeno, conocidas como tropocolágeno (TC), se reúnen en una manera compleja, jerárquica que en última instancia conduce a las fibras macroscópicas y redes observadas en tejidos, hueso, y membranas basales (Figura 2).

1 ECM: matriz extracelularPPII: poliprolina tipo IIHyp: (2S, 4R) -4 - hidroxiprolinaTropocolágeno (TC): Triple hélice de colágeno monomérico después de la proteólisis de propéptidos de colágeno

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Figura 1: Revisión de la triple hélice de colágeno. (a) primera estructura cristalizada de la triple hélice de colágeno, formada de (ProHypGly)4–(ProHypAla)–(ProHypGly)5. b) Vista inferior del eje de una triple hélice de colágeno (ProProGly)10, con las tres cadenas que aparecen en las representaciones espacio-relleno (esferas), bola y varilla y cinta. c) Modelo de bola-varilla de un segmento de la triple hélice de colágeno destacando la escalera de puentes de hidrógeno intercatenarios. d) Modelo de las tres cadenas del segmento del panel c.

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Figura 2: Ruta biosintética de las fibras de colágeno (110), que son el componente principal de la piel. El tamaño y la complejidad se incrementa por modificaciones posteriores a la traducción y al autoensamblaje. La oxidación de las cadenas laterales de lisina conduce a la formación espontánea de enlaces cruzados desmosina e isodesmosina.

Las características fundamentales de las moléculas de colágeno son su longitud, su rigidez

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y su estructura helicoida trimérica en la cual tres polipéptidos de colágeno, denominados cadenas a se enrollan sobre sí mismos formando una super hélice filiforme (19-62)

Estructura de una molécula típica de colágeno. (A) Modelo de una región de una cadena a de colágena en la que cada aminoácido está representado por una esfera. La cadena contiene alrededor de 1000 residuos de aminoácidos y está estructurada como una hélice levógira de tres residuos de aminoácido por vuelta, de los que el tercero es una glicina. Por lo tanto, cada cadena a está constituida por secuencias Gly-X-Y, donde X y Y pueden ser cualquier aminoácido (aunque habitualmente X es una prolina y Y una hidroxiprolina). (B) Modelo de una zona de la molécula de colágeno en la que las tres cadenas a, cada una de ellas representada en un color distinto, están enrolladas entre si dando lugar a una triple hélice. La glicina es el único aminoácido lo bastante pequeño para ocupar la pequeña región central de la triple hélice. Sólo se muestra una pequeña parte de la molécula, ya que su longitud total es de unos 300 nm de longitud. Los colágenos son muy ricos en prolina y glicina, las cuales son importantes en la formación la hélice trimérica. Gracias a su estructura anular, la prolina estabiliza la conformación helicoidal en cada una de las cadenas a, mientras que la glicina se encuentra espaciada regularmente, cada tres residuos de aminoácido, a lo largo de la región central de las cadenas a. Al ser el aminoácido más pequeño (sólo tiene un átomo de hidrógeno como cadena lateral, la glicina favorece un denso empaquetamiento de las tres cadenas a formando la superhélice de colágena.

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Las categorías de colágeno incluyen la clásica formación fibrilar y los colágenos formadores de redes, los FACITs (colágenos asociados a fibras con triples hélices interrumpidas), MACITs (colágenos asociados a la membrana con triples hélices interrumpidas) y MULTIPLEXINAS (múltiples dominios de triple hélice e interrupciones . Los tipos de colágeno, su distribución, composición, y patologías se enumeran en la Tabla 1. Es de destacar que, a pesar de que las tres cadenas de polipéptidos en triple hélice de cada tipo de colágeno pueden ser idénticas, las triples hélices heterotriméricas son más frecuentes que las triples hélices homotriméricas.

ESTRUCTURA DE LA TRIPLE HÉLICE DE COLÁGENO En 1955, estructura triple helicoidal aceptada hoy en día, que tiene un solo puente de hidrógeno intercatenario N-H (Gly) · · · O == C (Xaa) por tripleta. (Figura 1).

Los estudios de difracción de fibra no pueden revelar la estructura de colágeno a resolución atómica. Exacerbando esta dificultad, el tamaño grande, insolubilidad, secuencia repetitiva, y la estructura jerárquica compleja de colágeno nativo frustra la mayoría de los análisis bioquímicos y biofísicos. Por lo tanto, un enfoque reduccionista usando péptidos relacionados con colágeno triple helicoidal (CRP) se han utilizado ampliamente desde finales de los años 1960.

En 1994, Berman y colaboradores (19) informaron de la primera estructura cristalina de alta resolución de ununa triple hélice de PCR (Figura 1a). Esta estructura ha confirmado la existencia de puentes de hidrógeno intercatenarios N-H (Gly) · · · O == C (Xaa) (Figura 1c, d) y proporcionó información adicional, incluido que puentes de hidrógeno entre el Cα-H (Gly / Yaa) · · · O == C (Xaa / Gly) podrían igualmente estabilizar la triple hélice (20). Usando CRP y cristalografía de rayos X, se observó el efecto estructural de una sola sustitución de Gly → Ala (19), se analizaron los efectos de los residuos vecinos cargados en una triple hélice (21), y una interacción instantánea de la de un triple-helicoidal PCR con el dominio I de la integrina α2β1 se obtuvo (Figura 3) (22).

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Figura 3. Estructuras cristalinas de las triple hélices de colágeno. (a) Impacto de una sustitución sustitución Ala → Gly en la estructura de una triple hélice de colágeno formado a partir del péptido relacionado con colágeno (PCR) (ProHypGly) 4 - (ProHypAla) - (ProHypGly) 5. Los residuos de Ala (rojo) alteran la estructura. Las mutaciones que conducen a tales irregularidades estructurales son comunes en la osteogénesis imperfecta (OI2) y pueden ser letales. (b) Representación del efecto de una sola tripleta GluLysGly en el empaquetamiento de una triple hélice de CRP vecina en forma cristalina (ProHypGly) 4 - (GluLysGly) - (ProHypGly) 5 , el escalonamiento axial de las triples hélices individuales, presumiblemente obligado por interacciones de Coulomb nocivas entre residuos cargados, es una reminiscencia de la estructura D-periódica de las fibrillas de colágeno. Interacciones similares podrían contribuir a la morfología de las fibrillas de colágeno. (c) Triple hélice de CRP que contiene el dominio de unión a integrina GFOGER en complejo con el dominio I de la integrina α2β1. Se cree que la curva en la triple hélice surge de la interacción proteína-proteína. Un residuo de Glu en la mitad de la cadena de la triple hélice se une al cobalto (II), del dominio I de la integrina α2β1.

ENTENDIMIENTO Y ESTABILIDAD DE LA ESTRUCTURA DE LA TRIPLE HÉLICELa importancia vital de colágeno como estructura de soporte en animales exige una multiplicidad de características esenciales. Estas características incluyen estabilidad térmica, resistencia mecánica, y la capacidad de participar en interacciones específicas con otras biomoléculas. La comprensión de cómo tales propiedades se derivan de la unidad estructural fundamental de colágeno-la triple hélice-exige un amplio conocimiento de los mecanismos que subyacen en la estructura de triple hélice y de su estabilidad.

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Interacciones de Puentes de HidrógenoLa ubicuidad del colágeno hace de la escalera de recurrentes enlaces de hidrógeno N–H(Gly)…O==C(Xaa) que se forman en la triple hélice (Figura 1 c,d) el más abundante enlace de hidrógeno amida-amida en el reino animal. Reemplazando un enlace amida Yaa-Gly por un éster en un CRP hospedador-huésped (Figura 4a, b) permitiendo estimar la fuerza de cada enlace de hidrógeno amida-amida en ΔGo=−2.0 kcal/mol (30). Otros autores emplearon otras técnicas experimentales para evaluar este mismo parámetro, estimando la fuerza de cada enlace de hidrógeno amida-amida dentro de un CRP poli (GlyProPro) en ΔGo =− 1.8 kcal/mol y dentro del colágeno nativo en ΔGo =−1.4 kcal/mol.

Figura 4: Importancia de los enlaces de hidrógeno intercatenarios para la estabilidad de la triple hélice de colágeno (a) Un segmento de una triple hélice (ProProGly) 10. (b) Comparación de la estabilidad de una triple hélice formada a partir de (ProProGly) 4-ProProOGly-(ProProGly) 5, en el que un enlace amida Gly-Pro se sustituye con un éster, con lo que en el panel a revela que cada enlace de hidrógeno intercatenario contribuye ΔG = -2,0 kcal / mol a la estabilidad de una triple hélice (30). (c) Estructura cristalina de una triple hélice formada a partir de un péptido relacionado con colágeno que imita una secuencia común en colágeno de tipo IV, (GlyProHyp)3 - (3S-HypHypGly) 2 - (GlyProHyp) 4, mostrando que 3S-Hyp en la posición Xaa produce una triple hélice de colágeno prototípica. (d) (2S, 3S)-3-Fluoroprolina en la posición Xaa desestabiliza una triple hélice del colágeno, tal vez mediante la retirada de la densidad electrónica desde el carbonilo Xaa proximal y reduciendo de este modo la fuerza del enlace de hidrógeno intercatenario (79).

Sustituciones de Glycina

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Numerosas enfermedades relacionadas con el colágeno se asocian con mutaciones tanto en dominios triple helicoidales como en notriple-helicoidales de varios colágenos (Tabla 1). El residuo Gly en la repetición XaaYaaGly es invariable en el colágeno natural, y se desconocen sustituciones favorables en CRP (33). Un estudio computacional sugirió que la sustitución de los residuos de Gly de colágeno con D-alanina o D-serina podría estabilizar la triple hélice (34) y que por lo tanto que los residuos de Gly en el colágeno eran sustitutos de los D-aminoácidos no naturales. Datos experimentales posteriores demostraron, sin embargo, que esta aseveración era errónea (35).

Muchas de las mutaciones más perjudiciales para los genes de colágeno dan como resultado la sustitución de un residuo Gly dentro de la triple hélice (Figura 1c, d). Tanto la identidad del aminoácido que reemplaza la Gly como la ubicación de la sustitución, puede afectar la patología, por ejemplo, la osteogénesis imperfecta (OI) (33, 36). Sustituciones de Gly en porciones ricas en prolina de la secuencia de colágeno (Figura 3a) son mucho menos perjudiciales que los de las regiones pobres en prolina, lo cual recalca la importancia de los derivados Pro para la nucleación de triple hélice (37). In vivo, triples hélices se pliegan de manera N-terminal →C-terminal (38). El tiempo entre la interrupción del plegado de la triple hélice por una sustitución de Gly y la renucleation del proceso de plegado N-terminal al sitio de sustitución, es mucho más corto que la nucleación dela triple hélice, cuando secuencias ricas en prolina están cerca al sitio de sustitución N-terminal (37). Cualquier retraso en el plegado de la triple hélice resulta en sobremodificación de las cadenas protocolágeno [en particular, la hidroxilación excesiva de residuos de Lys N-terminal a la sustitución de Gly y glicosilación excesiva de los residuos de hidroxilisina resultantes (Figura 2)], desestabilizando la estructura de triple hélice y contribuyendo a la gravedad de esta enfermedad (39). Por lo tanto, la gravedad de esta enfermedad se correlaciona con la abundancia de nucleación de triple hélice, secuencias ricas en prolina cerca al sitio de sustitución N-terminal (36).

Prolinas en posiciones Xaa y YaaEn las cadenas de colágeno humano, ~ 22% de todos los residuos son Pro o Hyp (9). La abundancia de estos residuos preorganiza las cadenas individuales en una conformación PPII, disminuyendo de ese modo el costo entrópico para el plegado de colágeno (40). A pesar de sus propiedades estabilizantes, los derivados Pro también tienen ciertas consecuencias perjudiciales para el plegado y estabilidad de la triple hélice que compensa parcialmente sus efectos favorables. Por ejemplo, Pro tiene un grupo amino secundario y forma amidas terciarias dentro de un péptido o proteína. Las amidas terciarias tienen una población significativa tanto de isómeros trans como de cis isómeros (Figura 5), mientras que todos los enlaces peptídicos en el colágeno son trans. Por lo tanto, antes de que una cadena (ProHypGly)n pueda plegarse en una triple hélice, todos los enlaces peptídicos cis deben isomerizarse a trans. N-Methylalanine (una amida acíclica, terciaria carente únicamente de Pro de Cγ) disminuye la estabilidad de triple hélice, en sustitución de Pro o Hyp en CRP, presumiblemente debido a que carece de la preorganization debido al anillo de pirrolidina de derivados Pro (41). En contraste, evitando el problema de la isomerización cistrans por completo mediante la sustitución de un enlace amida Gly-Pro con un isóstero alqueno trans-bloqueado también conlleva a la desestabilización de la triple hélice, a pesar de dejar intactos todos los enlaces de hidrógeno intercatenarios (42). Claramente, los factores que dictan la estructura y estabilidad de la triple hélice están entrelazados de una manera compleja (véase más adelante).

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Figura 5: Pro isomerización cis-trans. A diferencia de otros aminoácidos proteinogénicos, La Pro forma enlaces amida terciarios, lo que resulta en una población significativa de la conformación cis.

Residuos de Pro en la posición Yaa de tripletas protocolágeno son modificados por la prolil 4 - hidroxilasa (P4H), una enzima de hierro no hemo que cataliza la hidroxilación postraduccional y estereoselectivad de residuos Pro del carbono γ-carbono no activado en la posición Yaa de secuencias de colágeno para formar Hyp (Figura 6). Se requiere la actividad P4H para la viabilidad del nemátodo Caenorhabditis elegans y del ratón Mus musculus (43, 44). Por lo tanto, Hyp es esencial para la formación de colágeno de sonido en vivo.

Figura 6: Reacción catalizada por la prolyl 4-hydroxilasa (P4H). Residues Pro en la posición Yaa de la cadena de colágeno son convertidos a Hyp antes de la formación de la triple hélice.

Papel de HypLa hidroxilación de los residuos de Pro en posición Yaa de la triple hélice de colágeno aumenta drásticamente la estabilidad térmica de triples hélices (Tabla 2). Esta estabilización se produce cuando la Hyp resultante está en la posición Yaa (45, 46), pero no en la posición Xaa, ni cuando el grupo hidroxilo está instalado en la configuración 4S como en (2S, 4S)-4-hidroxiprolina (HYP) (Tabla 2) (47, 48). Estos hallazgos llevaron a la propuesta de que la configuración 4R de un grupo hidroxilo prolilo es privilegiada solamente por permitir la formación de enlaces de hidrógeno –agua que unen la triple hélice plegada (49). En efecto, dichos puentes de agua entre Hyp y heteroátomos de la cadena principal fueron observados por Berman y colaboradores (19, 50) en sus estudios de cristalografía de rayos X seminales de CRP. La frecuencia de Hyp en la mayoría de colágeno natural es, sin embargo, insuficiente para soportar una amplia red de puentes de agua. Por ejemplo, cuatro o más tríadas repetidas de Xaa-Hyp-Gly se producen sólo dos veces en la secuencia de aminoácidos del colágeno tipo I humano.

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Los valores de Tm dependen tanto de la concentración de CRPs como de la tasa de calentamiento. Por tanto, comparaciones detalladas requieren del conocimiento de procedimientos experimentales.

La hipótesis de que los puentes de agua observados en triple hélices cristalinas (ProHypGly) n son significativos se puso a prueba mediante la sustitución de residuos de Hyp en CRP con (2S, 4R) -4 - fluoroproline (FLP). Como los grupos fluoro no forman enlaces de hidrógeno fuertes (51), los puentes de agua no pueden jugar un papel importante en la estabilización de una triple hélice (ProFlpGly) 10. No obstante, triples hélices (ProFlpGly) 10 son hiperestable (Tabla 2) (52, 53). En consecuencia, los puentes de agua no deben ser de importancia fundamental para la estabilidad. ¿Cómo, entonces, la hidroxilación 4R de residuos de Pro en posición Yaa estabilizan la triple hélice?

3 Efecto gauche. Sustituyendo Hyp en la posición Yaa con (2S, 4S)-4-fluoroproline (FLP), un diastereómero de Flp, se previene la formación de una triple hélice (Tabla 2) (54). Este descubrimiento de que la estereoquímica de los sustituyentes electronegativos en la posición 4 del anillo de Pro es importante para la formación de triples hélices estables sugiere que FLP y Hyp en la posición Yaa estabilizan la triple hélice de colágeno a través de un efecto

3 Hyp: (2S,4S )-4-hydroxyprolineFlp: (2S,4R)-4-fluoroprolineflp: (2S,4S )-4-fluoroprolineEfecto estereoeléctrico: Relación entre estructura, conformación, energía, y reactividad que resulta del alineamiento u ocupación de orbitales electrónicos.

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estereoelectrónico, en lugar de un efecto inductivo sencillo (54 ). Pro y sus derivados prefieren uno de los dos principales pliegues cíclicos de pirrolidina, que se denominan Cγ exo-y Cγ -endo (Figura 7). [El anillo en realidad prefiere dos giros distintos, en lugar de la conformación de envoltura (55). Como Cγ experimenta un gran desplazamiento hacia fuera del plano en los anillos entrelazados, nos referimos al pliegue del anillo pirrolidina simplemente como Cγ exo-y Cγ- endo.]

La Pro en sí tiene una ligera preferencia por el pliegue Cγ-endo (Tabla 3) (56). Un atributo clave de un grupo fluoro 4R en La Pro (así como el grupo hidroxilo 4R natural) es su imposición de un pliegue Cγ-exo en el anillo de pirrolidina a través del efecto gauche (Figura 8a, b) (56-58). El pliegue del anillo Cγ-exo preorganiza los principales ángulos de torsión de la cadena (φ, C i-1-Ni-Cα i-i C; ψ, Ni-Cα i-Ci-Ni +1, y ω, i-Cα C? i-Ni +1- Cαi 1) a aquellos en la posición Yaa de una triple hélice (Tabla 4). Por lo tanto, la hidroxilación -4R de los residuos de Pro en la posición Yaa de de la triple hélice de colágeno estabiliza la triple hélice a través de un efecto estereoelectrónico. FLP es más estabilizador de Hyp porque fluorina (χF = 4,0) es más electronegativo que el oxígeno (χO = 3,5), y un grupo fluoro (FF = 0,45) manifiesta un mayor efecto inductivo que el del grupo hidroxilo (FOH = 0,33). Por lo tanto, un grupo fluoro 4R fuerza el plegamiento del anillo Cγ-exo de un derivado de Pro con más fuerza que lo que lo haría un grupo hidroxilo 4R.

Figura 7: Conformaciones en anillo de derivados Pro y Pro. La conformación Cγ-endo se favorece fuertemente por los efectos estereoelectrónicos cuando R1 = H, R2 = F (flp) o Cl (clp), y por efectos estéricos cuando R1 = Me (MEP) o SH (mcp), R2 = H. La conformación Cγ-exo se favorece fuertemente por los efectos estereoelectrónicos cuando R1 = OH (Hyp), F (flp), OMe (Mop), o Cl (Clp), R2 = H, y por efectos estéricos cuando R1 = H, R2 = Me (Mep) o SH (Mcp). La relación Cγ-endo: Cγ- exo es ~ 2 cuando R1 = R2 = H (56).

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Tabla 3 Conformación de Pro y sus derivados 4-sustituidos que prefieren la posición Xaa [φ = -75 ◦, ψ = 164 ◦ (7)] en una triple hélice del colágeno. a. A partir de cálculos DFT. b. Los valores de φ y ψ (aquí, de Ni-Cα i-c'i Oi-1) son de la estructura cristalina de Ac-Pro-OMe, que tiene un enlace peptídico cis. c. Valores de Ktrans / cis (figura 5) se determinaron en solución por espectroscopía de RMN.

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Tabla 4 Conformación de los derivados de Pro 4-sustituidos que prefieren la posición Yaa [φ = -60 ◦, ψ = 152 ◦ (7)] en una triple hélice del colágeno. a. A partir de cálculos DFT. b. Los valores de φ y ψ (aquí, de Ni-Cα i-c'i Oi-1) son de la estructura cristalina de Ac-Yaa-OMe, que tiene un enlace peptídico cis. c. Valores de Ktrans / cis (figura 5) se determinaron en solución por espectroscopía de RMN.

Para investigar además el papel de Hyp en la estabilidad del colágeno, un residuo (2S, 4R)-4-methoxyproline (Mop) se incorporó a la posición de Yaa de un CRP (ProYaaGly) 10 (59). O-metilación es quizás la más simple modificación covalente posible de un residuo Hyp y reduce el grado de hidratación sin alterar significativamente la capacidad de retirada de electrones del sustituyente 4R. En consecuencia, los residuos Mop e Hyp tienen conformaciones similares (Tabla 4). Curiosamente, la reducción de la hidratación de (ProHypGly) 10 por metilación de residuos Hyp mejora significativamente la estabilidad de la triple hélice (Tabla 2). Por otra parte, la alquilación con grupos funcionales más grandes que un grupo metilo no necesariamente perturban la estabilidad de triple hélice (60). Notablemente, residuos (2S, 4R) -4 - cloroprolina (Clp) también estabilizan la triple hélice en la posición Yaa (Tabla 2) (61). Como Flp, Clp tiene una fuerte preferencia por el anillo Cγ-exo, una triple hélice (ProClpGly) 10 es entonces más estable que una triple hélice (ProProGly) 10. Por lo tanto, una gran cantidad de datos indican que el grupo hidroxilo de Hyp estabiliza el colágeno a través de un efecto estereoelectrónico. Puentes de agua proporcionan poca (si alguna) ventaja neta termodinámico al colágeno natural (59).

Sorprendentemente, una CRP hospedador-huésped de la forma AcGly-(ProHypGly) 3-ProFlpGly-(Pro HypGly) 4-GlyNH2 en realidad forma una triple hélice menos estable que AcGly-(ProHypGly) 8 - GlyNH2 (62). Por el contrario, un CRP hospedador-huésped de la forma (GlyProHyp) 3 GlyProFlp-Gly-ValCys GlyAspLys-GlyAsnPro-GlyTrpPro-GlyAlaPro-(GlyProHyp) 4-NH2 forma una triple hélice más estable que uno que contiene Hyp en lugar de Flp (63 ). Estos resultados sugieren que un grupo fluoro podría interrumpir la hidratación inducida por una larga cadena de residuos Hyp. Kobayashi y colaboradores (64) utilizaron la calorimetría diferencial de barrido para demostrar que triples hélices (ProHypGly) 10 se estabilizan por entalpía, mientras que triples hélices (ProFlpGly) 10 se estabilizan por la entropía. Estos resultados son consistentes con que Hyp disminuye el costo entrópico para el plegado a través de la preorganización de la cadena principal, pero aumentando el costo por hidratación específica. Esta interpretación está de acuerdo con la estabilidad de triples hélices (ProMopGly) 10 que surgen de una contribución casi igual de entalpía y entropía (59).

Efecto estéricoSustituyentes electronegativos en anillos Pro no son el único medio de hacer un anillo plegado ventajoso. El anillo Pro plegado también puede ser inducido por efectos estéricos, como en (2S, 4S)-4-metilprolina (Mep) (65) y (2S, 4R)-4-mercaptoproline (Mpc) (Figura 7) (66). El sustituyente 4-metil de Mep prefiere la orientación seudoecuatorial y por lo tanto induce el anillo plegado Cγ-exo de Pro (se observaron resultados análogos para Mpc) (Tabla 4). En efecto, triples hélices formadas a partir de (ProMepGly) 7 tienen una estabilidad similar a los formados a partir de (ProHypGly) 7 (Tabla 2) (65).

Derivados de prolina en posición XaaEl anillo plegado Cγ-exo de residuos de Pro en la posición Yaa mejora la estabilidad de la triple hélice. Del mismo modo, el anillo plegado de Pro en la posición Xaa es importante para la estabilidad de la triple hélice. Típicamente, los residuos de Pro en la posición Xaa del colágeno biológico no están hidroxilados y por lo general muestran el anillo plegado Cγ-endo (67). Mediante el empleo de sustituyentes Cγ, tanto el efecto gauche como los efectos estéricos pueden estar disponibles para la preorganización del anillo plegado Cγ-endo (Figuras 7 y 8). Cuando se instalan residuos de flp, (2S,

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4S)-4-cloroprolina (clp), o (2S, 4R)-4-metilprolina (mep) (todos los cuales prefieren el anillo plegado Cγ-endo) (Tabla 3) en posición Xaa de colágeno hay estabilización a Pro, pero la instalación de Flp, Clp, o Hyp (que prefieren anillo plegado Cγ-exo) tiene efecto desestabilizador (Tabla 2) (61, 65, 68-70). Estos resultados sugieren que la preorganización del anillo plegado Cγ-endo en la posición Xaa de CRP estabiliza triples hélices. Esta conclusión es razonable porque los derivados Pro con anillo plegado Cγ-endo tienen ángulos de torsión φ y ψ de la cadena principal similares a los observados en la posición Xaa de triples hélices (Tabla 3).

En particular, reemplazando Pro en posición Xaa de (ProProGly) 10 con hyip, un derivado Pro que, como flp y clp, deberían preferir el anillo plegado Cγ-endo por efecto gauche, produce CRP que no forman triples hélices (Tabla 2) (47). Este resultado anómalo para hyp en la posición Xaa podría ser atribuible a hidratación deletérea, preferencias conformacionales idiosincráticas de residuos de hyp, o ambos (71).

El colágeno tipo IV, que es el componente principal de las membranas basales, tiene una alta incidencia de (2S, 3S)-3-hidroxiprolina (Hyp-3S) en la posición Xaa (72). Esta modificación está presente en algunos otros tipos de colágeno y en colágenos de invertebrados. 3S-Hyp, que prefiere un anillo plegao Cγ-endo (73), se introduce casi exclusivamente dentro de tripletas ProHypGly a través de la modificación postraduccional de cadenas de colágeno individuales por prolil 3-hidroxilasa (P3H), que es distinta de P4H (74). Una forma recesiva de OI se asocia con una deficiencia P3H (75, 76). Ciertas mutaciones en el gen que codifica la proteína asociada al cartílago, una proteína P3H ayudadora, previene la 3S-hidroxilación de α1 (I) Pro986, así como la 3S-hidroxilación de algún otro residuo de Pro en posición Xaa, lo que resulta en un fenotipo casi idéntico a la OI clásica. La base subyacente de la importancia de 3S-hidroxilación de α1 (I) Pro986 no es clara, pero podría implicar menores tasas de secreción de triple hélice (76). La sustitución de Pro con 3S-Hyp en la posición Xaa de CRP puede mejorar la estabilidad de la triple hélice (73, 77). Una estructura cristalina de una triple hélice que contiene sustituciones 3S-Hyp revela el mantenimiento de la estructura de triple hélice prototípica y la ausencia de interacciones estéricas desfavorables (Figura 4c) (78). En contraste, la sustitución de 3SHyp con (2S, 3S)-3-fluoroprolina desestabiliza la triple hélice notablemente, posiblemente debido a un efecto inductivo a través de enlaces que disminuye la capacidad de su oxígeno de la cadena principal para aceptar un enlace de hidrógeno (Figura 4d) (79 ).

Interacción n→π∗Un principio general en el diseño de CRP es que los residuos de Pro , ya sea con un anillo plegado Cγ - endo o Cγ - exo estabilizarán triples hélices en posiciones Xaa y Yaa , respectivamente ( Tablas 2-4 ) . El anillo plegado adecuado, inducido por efecto estereoelectrónico o estérico , preorganiza los ángulos de torsión la φ y ψ a los requeridos para la formación de una triple hélice.

Curiosamente , la estabilidad de una triple hélice ( flpProGly ) 7 o ( clpProGly ) 10 es significativamente menor que la de una triple hélice ( ProFlpGly ) 7 o ( ProClpGly ) 10, respectivamente ( Tabla 2 ) ( 61 , 68 ) . Del mismo modo , una triple hélice ( mepProGly ) 7 es menos estable que una triple hélice ( ProMepGly ) 7 ( Tabla 2 ) ( 65 ) . Dos factores contribuyen a la baja estabilidad de triples hélices formadas a partir de CRP con derivados Pro estabilizados sustituidos en la posición Xaa más que en la Yaa . En primer lugar, un anillo plegado Cγ - endo ya se ve favorecido en Pro ( 56 ) ; flp , clp , y mep apenas mejoran esa preferencia ( Tabla 3 ) . En contraste, Flp , Clp , Hyp , and Mep tienen el efecto más dramático en la inversión del anillo plegado preferido de Pro , aliviando en gran medida la falta entrópica para la formación de triple hélice ( Tabla 4 ) . En segundo lugar, Flp , Clp , y Mep en la posición Yaa causa preorganización favorable de los tres principales ángulos de torsión de la cadena ( φ , ψ , y ω ) ( Tabla 4 ) . Por el contrario, flp , clp y mep tienen una baja probabilidad de adoptar un enlace peptídico trans ( ω = 180 ◦ ) ( 54 , 61, 65 ) con respecto a Pro ( Tabla 3 ) , mitigando así el beneficio acumulado de preorganización apropiada de φ y ψ . En particular, estudios con C- RMN sobre el colágeno in

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vitro demuestran que el 16 % de enlaces Gly - Pro en el colágeno no plegado están en conformación cis, mientras que sólo el 8 % de los enlaces Xaa - Hyp son cis, una observación que confirma el efecto de sustitución Cγ en la conformación del enlace peptídico precedente ( 80 ) .

¿Cómo afecta el efecto de un sustituyente 4 -X en el anillo plegado Pro influencia la constante de equilibrio de isomerización del enlace peptídico (K trans/cis) (Figura 5 y Tablas 3 y 4)? La explicación se debe a otro efecto estereoelectrónico: una interacción n → π * (56, 81). En una interacción n → π *, el oxígeno de un enlace peptídico (Oi - 1) dona electrones desde sus pares solitarios en el orbital antienlazante del carbonilo en el enlace peptídico subsiguiente (Ci`= Oi ) ( Figura 8c , d ) . El anillo plegado Cγ -exo de un residuo de Pro proporciona una distancia más favorable Oi- 1. . . Ci `= Oi y un ángulo para interacción n → π * que el anillo plegado Cγ - endo (56 ) . Es importante destacar que, Ktrans / cis para los enlaces peptidil prolil amida es determinada por el anillo plegado de pirrolidina y en general no se ve afectada por la identidad de los sustituyentes en la posición 4 del anillo de pirrolidina ( 82 ) . Debido a que una interacción n → π * puede ocurrir sólo si el enlace peptídico que contiene Oi- 1 es trans, la interacción n → π * tiene un impacto sobre el valor de Ktrans / cis de cadenas principales con ángulos de torsión apropiados (Tabla 4). Por lo tanto, la imposición de un anillo plegado Cγ - exo en un anillo de pirrolidina en la posición Yaa de un CRP preorganiza no sólo los ángulos φ a y ψ para la formación de la triple hélice, sino también el ángulo ω. De hecho, una sola interacción n → π * puede estabilizar la conformación trans por ΔG ◦ = -0,7 kcal / mol (81, 83).

Figura 8: Efectos estereoelectrónicos que estabilizan la triple hélice del colágeno. (a) Un efecto gauche y una interacción n → π * preorganizan los ángulos de torsión de la cadena principal y mejoran la estabilidad de una triple hélice. (b) Un efecto gauche, provocada por un grupo aceptor de electrones (EWG) en la posición 4R, estabiliza el anillo plegado Cγ-exo. (c) una interacción n → π * estabiliza el isómero trans del enlace peptídico, pero es sustancial sólo cuando son derivados Pro en el anillo plegado Cγ-exo (por ejemplo, R1 = OH o F, R2 = H). (d) Representación de superposición entre orbitales de enlace naturales n y π * bonos en un residuo Pro con plegado Cγ-exo.

Hyp en posición Xaa

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En posición Xaa, un residuo Pro con plegado Cγ-endo generalmente estabiliza la triple hélice, mientras que uno con plegado Cγ-exo desestabiliza una triple hélice. Por ejemplo, triples hélices (HypProGly) n son mucho menos estables que triples hélices (ProProGly) n (Tabla 2) (84), porque Hyp prefiere el anillo plegado Cγ exo-y por lo tanto preorganiza los ángulos de torsión φ y ψ incorrectamente para la posición Xaa de una triple hélice de colágeno (Tabla 4). Sorprendentemente, triples hélices (HypHypGly) 10 son en realidad ligeramente más estables que triples hélices (ProHypGly) 10 (Tabla 2) (85, 86) a pesar de los residuos de Hyp en la posición Xaa de (HypHypGly) 10 con anillo plegado Cγ-exo en la triple hélice (87, 88). Es de destacar que las estructuras cristalinas de (HypHypGly) 10 muestran que los ángulos de torsión en la posición Xaa de la cadena principal de una triple hélice (HypHypGly) n se ajustan para acomodar un anillo plegado Cγ-exo en esa posición (87, 88).

El hallazgo de que Hyp puede estabilizar triples hélices en la posición Xaa de manera dependiente del contexto se presagiaba en un estudio realizado por Gruskin (89) con base en la sustitución global de Hyp por Pro en polipéptidos de colágeno tipo I recombinante que formaron triples hélices estables. En particular, Hyp se encuentra en la posición Xaa del colágeno de algunos invertebrados (90) y puede ser aceptable en CRP en los que el residuo en posición Yaa no es Pro (86, 91, 92). Berisio y colaboradores (93) han sugerido que triples hélices (HypHypGly) 10 podrían ser hiperestable s debido a interacciones dipolo-dipolo intercatenarias entre enlaces proximales Cγ-OH de residuos Hyp adyacentes. Kobayashi y colaboradores (87) han propuesto que la estabilidad de triples hélices (HypHypGly) 10 es atribuible al alto nivel de hidratación de las cadenas de péptidos en el estado espiral individual antes de la formación de triple hélice, lo que podría reducir el costo entrópico de formación de puentes de agua. Es probable que una combinación de estos factores sea responsable de esta anomalía.

Triples Hélices Sintéticas Heterotriméricas

Tanto flp y Flp mejoran en gran medida la estabilidad de la triple hélice cuando están en posición Xaa y Yaa , respectivamente . No obstante , ( flpFlpGly ) n forma triples hélices mucho menos estables que ( ProProGly ) n ( Tabla 2 ) ( 79 , 94 ) . En tales una hélices, los átomos de flúor de residuos FLP y Flp en hebras alternantes serían proximales, y los dipolos C - F interactuarían desfavorablemente (Figura 9a ) ( 79 ) . Estas interacciones estéricas y electrónicas negativas presuntamente comprometen la estabilidad de triple hélice a pesar de la preorganización adecuada de los ángulos de torsión de la cadena principale. Esta hipótesis fue confirmada por otros dos hallazgos. En primer lugar, una triple hélice ( clpClpGly ) 10 ni siquiera se forma a 4 ◦ C, mientras que una triple hélice ( flpFlpGly ) 10 tiene Tm = 30 ◦ C ( Tabla 2 ) ( 61 , 94 ) . El choque estérico entre átomos de cloro de residuos opuestos clp y Clp se ve agravada por el gran tamaño del cloro con respecto al flúor ( Figura 9b ) . En segundo lugar, triples hélices (mepMepGly ) 7 son más estables que los correspondientes CRP mono sustituidos , ( mepProGly ) y 7 ( ProMepGly ) 7 (Tabla 2 ) . Los grupos 4 - metilo sobresalen radialmente desde la triple hélice (Figura 9c) y por lo tanto no pueden interactuar perjudicialmente entre sí ( 65 ) .

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Figura 9: Triples hélices heterotriméricas de colágeno sintético. (a-c) Enfoque estérico. Modelos de espacio-relleno (esferas) de segmentos de triple hélice construidos a partir de la estructura de una triple hélice (ProHypGly) n [AP entrada 1cag (19)] con el programa SYBYL (Tripos, St. Louis, MO). En el panel a, rF · · · F = 2,4 Å en una triple hélice (flpFlpGly) n (79). En el panel b, rCL · · · Cl = 1,9 Å (61) en una triple hélice (clpClpGly) n. En el panel c, los grupos metilo en una triple hélice (mepMepGly) n son radiales y distales. (d) El enfoque de Coulomb. Interacciones Coulombicas favorables dirigen el ensamblaje preferencial de triples hélices que tienen una relación 1:1:1 de (ProLysGly)10 :(AspHypGly) 10: (ProHypGly) 10 (96).

Los efectos estéricos y estereoelectrónicos sobre la estabilidad de triple hélice manifestados en los CRP (flpFlpGly) 7 proporcionan, por primera vez, un medio para generar triples hélices heterotriméricas no-covalentemente unidas y con estequiometría definida. El análisis de secciones transversales de triple hélice sugirió que una triple hélice compuesta de (flpFlpGly ) 7 : ( ProProGly ) 7 , ya sea en relación de 1:2 ó 2:1 podría ser estable , en la medida en que la presencia de algunos residuos de Pro en posiciones l Xaa y Yaa eliminaría las interacciones estéricas deletéreas entre los residuos de flúor en cadenas opuestas . Una proporción (flpFlpGly ) 7 : ( ProProGly ) 7 de 2:1 dio estabilidad a las triples hélices, demostrando el primer ensamblaje heterotrimérico de hélices triples con estequiometría controlada ( 79) y sugiriendo la posibilidad de desarrollar un "código" para el ensamblaje de triples hélices siguiendo las líneas del código de Watson-Crick para el ensamblaje de ADN .

Gauba y Hartgerink ( 95 ) desarrollaron una estrategia alternativa que emplea interacciones de Coulomb para guiar el ensamblaje de triples hélices heterotriméricas . Ellos observaron que una mezcla 1:1:1 (ProArgGly ) 10 : (GluHypGly ) 10 : ( ProHypGly ) 10 producía triples hélices que contenían una cargada negativamente , otra positivamente , y un CRP neutro. Curiosamente , triples hélices (ProLysGly ) 10 : ( AspHypGly ) 10 : ( ProHypGly ) 10 tienen un valor de Tm similar a

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la de un homotrímero ( ProHypGly ) 10 , a pesar de que, como es sabido, Asp y Lys desestabilizan significativamente la triple hélice con respecto a Pro y Hyp (Figura 9d ) . Este hallazgo demuestra la utilidad de las interacciones de Coulomb para la estabilización de triples hélices (96 ) .

Heterotrímeros de colágeno sintético son imitadores atractivos de cadenas naturales de colágeno, en la medida en que la mayoría de los tipos de colágeno son en sí mismos heterotrímeros (Tabla 1). Gauba y Hartgerink (97) emplearon el método de Coulomb para generar variantes imitadoras de colágeno tipo I que llevan a la OI. En concreto, estudiaron la estabilidad de heterotrímeros triple helicoidales que contienían uno, dos, o tres sustituciones Ser →Gly. Ellos observaron que una sustitución Gly → Ser en una o dos cadenas no era tan debilitante para la estabilidad y el plegamiento de triple hélice como lo era la sustitución Gly → Ser en las tres cadenas.

Sustituciones diferentes a prolina en las posiciones Xaa y YaaBrodsky (9) determinan la frecuencia de aparición de todos los posibles tripéptidos en un conjunto de secuencias de colágeno fibrilar y no fibrilar. Sólo unos pocos de los 400 posibles tripletes formados a partir de los 20 aminoácidos naturales se observan en el colágeno. Adicionalmente, examinaron la incorporación de todos los 20 aminoácidos comunes en las posiciones el Xaa y Yaa de CRP utilizando un modelo de hospedador-huésped en el que un solo triplete XaaYaaGly se coloca dentro de un CRP (ProProGly) n o (ProHypGly) n (98 ). Estos estudios hospedador-huésped revelaron una correlación entre la propensión de un residuo particular, a adoptar una conformación PPII y su contribución a la estabilidad de una triple hélice (98). En particular, Arg en la posición Yaa confiere estabilidad de triple hélice similar a la de Hyp (99). Los residuos de aminoácidos aromáticos Trp, Phe, Tyr son fuertemente desestabilizadores de la triple hélice (98), aunque la base estructural para esta desestabilización es poco clara. Brodsky (100) utilizan sus datos en CRP hospedador-huésped para desarrollar un algoritmo que permita el cálculo a priori del efecto de sustituciones Xaa y Yaa en la estabilidad de triple hélice.ESTRUCTURA DE COLÁGENO DE ORDEN SUPERIOR4

In vivo, el colágeno tiene una estructura jerárquica (Figura 2). Monómeros de TC individuales se auto-ensamblan para formar las fibras macromoleculares que son componentes esenciales de los tejidos y los huesos. Los procesos de autoensamblaje que participan en fibrilogénesis del colágeno son de enorme importancia en patologías de la ECM y para el adecuado desarrollo de los animales (véase el recuadro "Evitando la agregación" para una discusión de cómo el autoensamblaje de colágeno podría conducir a agregación de proteínas nocivas).

Estructura fibrilar5

4 Auto-ensamblaje: Proceso en el cual, interacciones locales específicas entre los componentes desordenados conducen a una estructura organizada, sin dirección externa.Fibrilogénesis de Colágeno: Proceso de ensamblaje de monómeros de tropocolágeno en fibrillas maduras.5 D-Periodicidad: El escalonamiento axial de las moléculas adyacentes de tropocolágeno por una distancia, D, que es la suma de la brecha y regiones sobrepuestasTelopéptidos del colágeno: N-y C-terminal de dominios no triple helicoidales de 11 - a 26-residuos de cadenas de tropocolágeno involucrados en fibrilogénesis y entrecruzamientoProcolágeno: Forma hidroxilada de colágeno antes de la escisión de propéptido de colágenoPropéptidos de colágeno: N-y C-terminal de dominios no triple helicoidales de cadenas de colágeno que direccionan el plegamiento de la triple hélice antes de la fibrilogénesis

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Hay muchas clases de estructuras de colágeno en la ECM, incluyendo fibrillas, redes y dominios de colágeno transmembrana. Por razones de brevedad, nos centramos aquí en fibrillas compuestas principalmente de colágeno tipo I.

Los monómeros TC de colágeno tipo I tienen la propiedad única de estar realmente inestables a temperatura corporal (101); esto es que, la conformación espiral aleatoria es la preferida. ¿Cómo pueden estructuras tisulares estables formarse a partir de una proteína inestable? La respuesta debe ser que la fibrilogénesis de colágeno tiene un efecto estabilizador sobre las triples hélices. Además, el ensamblaje de estructuras macromoleculares fuertes es esencial para que el colágeno pueda soportar el estrés en una, dos y tres dimensiones (102). La importancia de la fibrilogénesis del colágeno se ve subrayada por la conclusión de Kadler (103) de que los principios fundamentales que subyacen a la formación de algunos tipos de fibrillas modernas de colágeno se establecieron en por lo menos 500 Mya. La fibrilogénesis de colágeno in situ se produce a través del ensamblaje de segmentos de fibrillas de tamaño intermedio, llamadas microfibrillas (Figura 2) (104). Por lo tanto, hay dos cuestiones importantes para entender la estructura molecular de la fibrilla de colágeno. En primer lugar, ¿cuál es la disposición de los monómeros individuales de TC dentro del microfibrilla? En segundo lugar, ¿Cuál es la disposición de las microfibrillas individuales dentro de la fibrilla de colágeno? Estas preguntas han sido difíciles de responder, ya que microfibrillas naturales individuales no son aislables y el gran tamaño y la insolubilidad de las fibrillas de colágeno maduro impiden el uso de técnicas de determinación estructural estándares.

Las fibrillas de colágeno formadas principalmente de colágeno tipo I (todos los tejidos fibrosos, excepto cartílago) y fibrillas formadas principalmente de colágeno tipo II (cartílago) tienen estructuras ligeramente diferentes. Aunque nos centramos únicamente en las fibrillas de colágeno de tipo I, datos recientes han permitido la determinación de la estructura fibrilar del cartílago a resolución intermedia (~ 4 nm). Esta estructura sugiere que las fibrillas de colágeno del cartílago tienen un 10 + 4 de estructura microfibrilar heterotípica - lo que significa que la superficie de fibrillas presentan diez microfibrillas igualmente espaciadas y que hay cuatro microfibrillas igualmente espaciadas en el núcleo de la fibrilla ( 105 ) .

Las fibrillas de colágeno de tipo I en el tendón son de hasta 1 cm de largo (106) y un máximo de ~ 500 nm de diámetro. Una triple hélice individual en el colágeno tipo I es <2 nm de diámetro y ~ 300 nm de longitud. Claramente, la fibrilogénesis en una escala extraordinaria es necesaria para lograr las dimensiones estructurales de las fibrillas naturales de colágeno. El rasgo más característico de las fibrillas de colágeno es que son D - periódicas con D = 67 nm. La estructura de bandas observada en imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM ) de fibrillas de colágeno se produce debido a que la longitud real de un TC monómero no es un múltiplo exacto de D, pero L = 4.46D , resulta en espacios de 0.54D y sobrelapamientos de 0.46D ( Figura 2 ) . Esta disposición regular de espacios y de regiones que se sobreponen debe tenerse en cuenta en los modelos estructurales de fibrilla y microfibrillas de colágeno.

La propuesta inicial de la estructura tridimensional de colágeno fibrilar era un modelo estructural simplificado de microfibrillas de colágeno expuestas por Hodge y Petruska (107) en 1963. Su modelo consiste en una pila de dos dimensiones en la que cinco monómeros de TC dentro de una microfibrilla se sobreponen D = 67 nm entre cadenas vecinas (Figura 2) . Este modelo ha demostrado que las moléculas de colágeno que forman las microfibrillas se sobreponen linealmente, en tal forma que dejan pequeños huecos de secuencia definida maduro (Estudios por TEM y microscopía de fuerza atómica -AFM6). Muchos grupos de investigación han intentado determinar la estructura 6 TEM: Microscopía Electrónica de Transmisión

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tridimensional de las fibras de colágeno tipo I en una resolución más alta. Numerosos modelos se han propuesto para explicar las características observadas mediante las técnicas de difracción de fibra y de TEM y AFM de dichas fibrillas ( 108-111 ) . Los investigadores en general están de acuerdo en una unidad cuasi - hexagonal con cinco monómeros de TC como base de un modelo preciso de la fibrilla de colágeno, pero los detalles importantes estaban en controversia. Hallazgos recientes indican que la estructura controversial de las fibrillas está ce. Ca de ser resuelta.

En 2001, Orgel (112, 113) reportó el primer mapa de densidad electrónica de fibras de colágeno tipo I en resolución anisotrópica molecular (axial: 5,16 Å; lateral: 11,1 Å) utilizando radiación sincrotrón (La radiación de sincrotrón es la radiación electromagnética generada por partículas cargadas (tales como electrones) que se mueven según una trayectoria curva a alta velocidad (una fracción apreciable de la velocidad de la luz) en un campo magnético. Cuanto más rápido se mueven los electrones, más corta es la longitud de onda de la radiación). Sus datos confirman que las microfibrillas de colágeno tienen una unidad celular cuasi-hexagonal. El empaquetamiento molecular de los monómeros de TC en este modelo resulta en vecinos de TC dispuestos para formar microfibrillas supertrenzadas, dextrógiras que entrelazan con las microfibrillas vecinas, dando lugar a la estructura en espiral del colágeno fibrilar maduro ( 113 ). El modelo promueve la idea de que la fibrilla de colágeno es una cuerda red a nivel de nano-escala idea también sugerida por los estudios de AFM de Bozec (111). Orgel determina la ubicación axial de la N - telopéptidos7 de colágeno N y C-terminales y encontraron que telopéptidos vecinos dentro de un monómero de TC interactúan unos con otros y son entrecruzados covalentemente después de la acción de la lisil oxidasa ( 114 ) . Los puentes pueden estar tanto dentro como entre las microfibras. Curiosamente, la naturaleza de la microfibrillas supertrenzadas de colágeno se mantiene a través de las regiones telopeptídicas no helicoidales ( 113 ) .

http://www.cosmobio.co.jp/export_e/products/molecular_biology/kou_20100601_faq.asp?entry_id=6048 Este nuevo modelo de la fibrilla de colágeno de tipo I explica el fracaso de los investigadores anteriores para aislar microfibrillas de colágeno individuales a partir de muestras de tejido: La microfibrillas se entrelazaban y reticulaban, evitando así la separación intacta entre ellas. El nuevo modelo también justifica la observación de que el CT en fibrillas

AFM: Microscopía de Fuerza Atómica7 Telopéptido: Es un péptido terminal no helicoidal de una cadena de colágeno. Los Telopéptidos tienen un grupo carboxilo (c-telopéptido) o amino (N-telopéptido) en su extremo terminal. Los Telopéptidos se unen entre sí o con péptidos de la región helicoidal de la molécula de colágeno mediante puentes de piridolina o desoxipiridolina. Su medición en orina indica resorción ósea.

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es mucho más resistente a la proteólisis de colágeno por metaloproteinasa 1 de matriz (MMP-1 ) que es TC monomérico ; la fibrilla de colágeno protege regiones vulnerables a la proteólisis por MMP1 . Se requiere proteólisis del telopéptido C-terminal de TC en una fibrilla antes de MMP1 puede tener acceso al sitio de escisión de un monómero de TC (115).

Nucleación y modulación de la fibrilogénesis de colágeno

La fibrilogénesis de colágeno requiere la realización de dos etapas de auto-ensamblaje: nucleación y crecimiento de la fibra. La fibrilogénesis del colágeno comienza sólo después de que procolágeno N-y C- proteinasas escinden los propéptidos de colágeno en cada triple hélice terminal para generar monómeros de TC. Los propéptidos C-terminales son esenciales para la formación de la triple hélice adecuada pero impiden la fibrilogénesis (116). Después de la escisión de los propéptidos, los monómeros de TC se componen de un dominio de triple hélice larga que consiste en una secuencia de repetición de XaaYaaGly rodeada por telopéptidos cortos, notriple-helicoidales (Figura 2).

Los telopéptidos C-terminales de TC son importantes para el inicio de la adecuada fibrilogénesis. Prockop y Fertala (117) sugirieron que el auto-ensamblaje de colágeno en fibrillas era impulsado por la interacción de telopéptidos C-terminales con sitios específicos de unión en los monómeros de la triple hélice. La adición de imitadores sintéticos de telopéptidos puede inhibir la fibrilogénesis del colágeno, presumiblemente mediante la prevención de la interacción entre los telopéptidos de colágeno y monómeros de TC. Triples hélices que carecen de los telopéptidos pueden, sin embargo, ensamblarse en fibrillas con morfología adecuada (118). Por lo tanto, los telopéptidos de colágeno podrían acelerar el ensamblaje de fibrillas y establecer el registro apropiado dentro de microfibrillas y fibrillas, pero pueden no ser esenciales para la fibrilogénesis.

Los telopéptidos de colágeno tienen una segunda función en la estabilización de fibrillas de colágeno maduro. Cadenas laterales de Lys en los telopéptidos son entrecruzadas después del ensamblaje de las fibrillas, formando enlaces de desmosina e isodesmosina entre Lys y residuos de hidroxilisina con la ayuda de lisil oxidasa (Figura 2) (119). El proceso de entrecruzamiento aporta a las fibrillas de colágeno maduro fuerza y estabilidad, pero no está implicado en la fibrilogénesis. Por lo tanto, a pesar de que los telopéptidos de colágeno pueden no ser esenciales para la nucleación, su ausencia debilita en gran medida las fibrillas maduras debido a la falta de enlaces cruzados dentro y entre las triple hélices (119).

PROPIEDADES MECÁNICAS DE LAS FIBRILLAS DE COLÁGENO

La naturaleza jerárquica de la estructura de colágeno teóricamente permite la evaluación de las propiedades mecánicas del colágeno en diferentes niveles de complejidad estructural, incluyendo el monómero TC, fibrillas de colágeno individuales, y las fibras de colágeno. Tal vez la mayoría de los estudios de las propiedades mecánicas del colágeno se han obtenido mediante el estudio de monómeros de CT y de las fibrillas formadas a partir de colágeno de tipo I. Los investigadores han empleado diversas técnicas biofísicas y teóricas en los últimos 20 años, y los últimos avances en la metodología AFM han permitido evaluaciones más refinadas.

En 2006, Buehler estima la resistencia a la fractura de un monómero TC en 11 GPa , que es significativamente mayor que la de una fibrilla de colágeno ( 0,5 GPa ) ( 102 ) . Esta diferencia es razonable, dado que la fractura de un monómero TC requiere desintegración de la triple hélice y en última instancia, la ruptura de enlaces covalentes, mientras que la

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fractura de una fibrilla no requiere necesariamente la ruptura de los enlaces covalentes. Para la comparación, la resistencia a la tracción del colágeno en el tendón se estima en 100 MPa ( 120 ) .

El módulo de Young (El módulo de Young o módulo de elasticidad longitudinal es un parámetro que caracteriza el comportamiento de un material elástico, según la dirección en la que se aplica una fuerza ) de un monómero de TC es E = 6-7 GPa ( 102 , 121 ) , mientras que las mediciones con AFM muestran que fibrillas deshidratadas de colágeno tipo I de tendón de Aquiles bovino ( 122 ) y de tendón de cola de rata ( 123 ) tienen E ≈ 5 GPa y E ≤ 11 GPa , respectivamente . Debido a que las fibrillas de colágeno son anisotrópicas, el módulo de torsión (que es una medida de la rigidez) es también una medida importante de la fuerza de una fibrilla de colágeno. En 2008, AFM reveló que fibrillas deshidratadas de colágeno de tipo I de tendón de Aquiles bovino tienen G = 33 MPa (124) . La hidratación de estas fibrillas reduce su módulo de torsión significativamente, mientras que la reticulación mediada por carbodiimida aumentó el módulo de torsión. Es de destacar que cierto nivel de reticulación es favorable para las propiedades mecánicas de las fibrillas de colágeno, pero excesiva reticulación resulta en fibrillas de colágeno extremadamente frágiles (102) , un síntoma común de envejecimiento .

Un análisis por Buehler ( 102 ) de las propiedades mecánicas de las fibrillas de colágeno sugiere que la naturaleza ha seleccionado una longitud para el monómero de TC que maximiza la robustez de la fibrilla de colágeno ensamblada a través de la disipación de energía eficiente . Las simulaciones indican que los monómeros TC más largos o más cortos de ~ 300 nm (que es la longitud de una triple hélice colágeno de tipo I) formarían fibrillas de colágeno con propiedades mecánicas menos favorables.

BIOMATERIALES COLAGENOSOS

Las investigaciones sobre estructura y estabilidad de triples hélices de colágeno se han centrado en triples hélices de extremos romos compuestas de (XaaYaaGly) n ≤ 10 CRP. Estas triples hélices cortas, aunque valiosas para los estudios dirigidos a la comprensión de la base físico-química de la estructura y estabilidad de la triple hélice, no son útiles para muchas aplicaciones potenciales de biomaterial debido a su pequeño tamaño, que no se acerca a la escala de las fibras de colágeno naturales (Figura 2).

El colágeno bovino es fácilmente disponible útil para algunos propósitos biomédicos, pero desafortunadamente se caracteriza por heterogeneidad, inmunogenicidad potencial, y pérdida de la integridad estructural durante el proceso de aislamiento. Una fuente recombinante o sintética eficiente de colágeno podría evitar estas complicaciones. La producción heteróloga de colágeno se hace problemática debido a la dificultad de incorporar modificaciones postraduccionales, como la que conduce a los residuos Hyp esenciales (Figura 6), y requiere de sistemas de expresión de complejos (125). Estos desafíos ponen de relieve la necesidad sintetizar fuentes de proteínas y fibrillas semejantes al colágeno.

Síntesis química de colágeno

Los primeros enfoques a largas triple hélices de colágeno sintético se basaron en la condensación (126 , 127 ) o uniones químicas de CRP cortos ( 127 ) . Curiosamente, soluciones acuosas concentradas de (ProHypGly ) 10 auto-ensamblan en fibrillas altamente ramificadas ( 128 ) . Brodsky ( 129 ) han demostrado que la tasa de auto-ensamblaje de ( ProHypGly ) 10 y la morfología de las fibrillas resultantes son dependientes de la secuencia . CRP que contienen una sola sustitución Pro → Ala o Pro → Leu muestran autoensamblaje más lento; la morfología fibrilar puede ser modificada por una

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sustitución Gly → Ser, o impedida mediante una sola sustitución Gly → Ala o sustituciones globales Hyp → Pro. En cualquier caso, las estructuras de orden superior formadas por autoensablaje de ( ProHypGly ) 10 y CRP no ensamblan fibrillas de colágeno natural .

Largas triple hélices de colágeno se han preparado mediante el uso de un diseño que aprovecha la propensión intrínseca de las hebras individuales de PCR para formar triples hélices. Específicamente, enlaces entre cistinas dentro de fragmentos cortos de colágeno se utilizaron para establecer cadenas individuales de colágeno de tal manera que terminaciones cortas y " pegajosas " preorganizadas para su posterior formación de triple hélice se evidenciaron al final de cada segmento monomérico triple helicoidal ( Figura 10a ) ( 130 , 131 ) . El auto-ensamblaje de estos fragmentos cortos de triple hélice, fue mediado por la asociación de los extremos pegajosos, resultando en conjuntos de colágeno de 400 nm - significativamente más largos que los monómeros TC naturales (131). Koide (132) utiliza este sistema para preparar geles de colágeno - con aplicaciones potenciales como biomateriales.

Maryanoff ( 133 ) desarrolló otro enfoque para triples hélices largas , uno que se basaba en la predilección de anillos de fenilo ricos en electrones de residuos fenilalanina C-terminales instalados en un PCR corto para participar en las interacciones de π -apilamiento preferencialmente con anillos pentafluorofenilo pobres en electrones de residuos pentafluorofenilalanina N-terminales ( Figura 10b ) . Su estrategia produjo fibras de triple hélice a escala micrométrica. Este enfoque de π - apilamiento se ha usado para generar fibrillas tipo colágeno - trombogénicas para aplicaciones en biomedicina (134). Además, la unión de nanopartículas de oro a estas fibrillas y posterior recubrimiento en plata electrolítica produjo nanocables a base de colágeno que conducían la electricidad ( 135 ) .

Przybyla y Chmielewski (136) utilizaron autoensamblaje desencadenado por metales para obtener fibras de colágeno a partir de CRP . Un único residuo de Hyp en Ac - (ProHypGly ) 9 - NH2 fue reemplazado con un residuo de Lys - bipiridilo modificado . La adición de Fe (II) a una solución de estos CRP activó el autoensamblaje en fibrillas morfológicamente diversas de hasta 5 m de longitud con un radio promedio de 0,5 micras.

Un avance importante en el desarrollo de CRP sintéticos ensamblados con similitud mayor a las fibrillas de colágeno fue reportado por Chaikof y col. (137). Ellos sintetizaron un CRP con secuencia ( ProArgGly ) 4 - ( ProHypGly ) 4 - ( GluHypGly ) 4 y observaron auto-ensamblaje en solución en fibrillas de 3-4 micras de longitud y 12 - 15 nm de diámetro . Después de calentar la solución de péptidos a 75 ◦ C durante 40 min y después de enfriarla a temperatura ambiente, observaron fibrillas más gruesas (~ 70 nm de diámetro). Es importante destacar que estas fibrillas exhiben dos características clave de fibrillas de colágeno naturales. En primer lugar, las fibrillas muestran puntas cónicas en sus extremos, una característica observada en las fibras de colágeno tipo I y que se consideran importantes para el crecimiento de la fibra (138). En segundo lugar, Chaikof y colaboradores observaron estructura D -periódica de fibrillas de colágeno sintético, con D ≈ 18 nm. El proceso de auto-ensamblaje se basa supuestamente en la interacción de Coulomb y enlaces de hidrógeno entre residuos cargados Arg y Glu en triples hélices individuales, axialmente activadas (Figura 10c).

Las metodologías descritas anteriormente permiten la creación de fibrillas largas triple hélice, semejantes a colágeno. A pesar de los grandes avances, las fibrillas sintéticas semejantes a colágeno carecen todavía de muchas de las características estructurales de orden superior del colágeno. Además, las propiedades mecánicas de los materiales sintéticos de colágeno no se han estudiado hasta la fecha. Colágenos sintéticos que imitan la longitud, el grosor, los patrones, las propiedades mecánicas y la complejidad de las fibrillas de colágeno natural aún no se han desarrollado, pero el rápido progreso en los últimos años engendra un gran optimismo.

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Figura 10: Estrategias para el auto-ensamblaje de largas fibrillas y triples hélices de colágeno sintético. (a) Los enlaces disulfuro obligan a una cadena con extremos “pegajosos” a autoensamblarse (131). (b) las interacciones de apilamiento entre anillos pentafluorofenílicos pobres en electrones y anillos fenilo ricos en electrones llevan a auto-ensamblaje (133,

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134). (c) fuerzas de Coulomb entre los bloques catiónicos y aniónicos promueven el autoensamblaje. Imagen de MET de una fibra resultante que muestra D-periodicidad con D = 17,9 nm (137). El colágeno natural Tipo I tiene D = 67 nm.Aplicaciones biológicas y biomédicas del colágeno sintético

Son relativamente pocos los CRP que han sido probados como biomateriales. Goodman y col. (139) mostraron que CRP que contenían peptoide tenían una notable capacidad de unirse a células epiteliales y fibroblastos, en particular cuando se encontraban en una superficie. Los CRP también son útiles para inducir la agregación plaquetaria, lo que puede ayudar al proceso de curación de heridas (140, 141).

Un paso clave para la utilización de biomateriales de colágeno con fines terapéuticos es el desarrollo de CRPs que podían adherirse o insertarse dentro del colágeno biológico. La mayoría de los esfuerzos hacia estos objetivos se han basado en la inmovilización de CRP sobre una sustancia relacionada. Yu y col. (142) prepararon CRP funcionalizados con nanopartículas de oro y demostraron la unión de las nanopartículas de oro a la región “vacía” de colágeno natural. Maryanoff y colaboradores encontraron que CRP fijados sobre nanopartículas de látex pueden estimular la agregación plaquetaria humana con una potencia similar a la del colágeno tipo I (140). En una extensión importante de este trabajo, se demostró que las fibrillas de triple hélice obtenidas a través de interacciones aromáticas tenían un nivel similar de actividad trombogénica de los CRP inmovilizados sobre nanopartículas de látex (134). Por último, cadenas simples de CRP y CRP polietilen- glicol conjugados se unen a películas de colágeno incluso sin inmovilización en nanopartículas (143) lo cual tendría uso potencial en curación de heridas. El futuro de estos enfoques parece ser especialmente brillante.

RESUMEN1. Las estructuras cristalinas de alta resolución y los enfoques biofísicos modernos han permitido el estudio

detallado de la estructura y la estabilidad de la triple hélice del colágeno. La escalera de enlaces de hidrógeno observados en estas estructuras cristalinas es esencial para formación de la triple hélice, y su ausencia en el colágeno natural conduce a una variedad de condiciones patológicas.

2. Efectos estereoelectrónicos imparten estabilidad estructural significativa al colágeno por preorganización de polipéptidos individuales para la formación de triple hélice. Por ejemplo, Hyp en la posición Yaa estabiliza la triple hélice a través de un efecto estereoelectrónico. Los efectos estereoelectrónicos también son importantes para la estructura y estabilidad de otros numerosos péptidos y proteínas.

3. Las modificaciones postraduccionales a protocolágeno son de importancia fundamental para la síntesis de una ECM estable. Estas modificaciones incluyen la hidroxilación y las reacciones de reticulación.

4. La fibrilogénesis de colágeno es un proceso esencial para la formación de andamios biológicos macromoleculares. Modelos de relativa alta resolución de fibrillas de colágeno tipo I y tipo II están ahora disponibles y, para el colágeno tipo I, muestran que las fibrillas de colágeno se pueden describir como cuerdas a nanoescala.

5. Medios simples para sintetizar largas hélices triples y fibrillas de colágeno se han hecho evidentes. Los materiales resultantes están listos para su uso en biomedicina y la nanotecnología.

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