Dr. sc. Radovan Fuchs Institut za medicinska istraživanja

TOKSIKOLOGIJA

Sječanj 2013

Riječ toksikologija sadrži u sebi prefiks toksic koji dolazi od grčke riječi toks a

znači luk.

• Brojnost mogućih štetnih učinaka različitih kemijskih supstanci kojima smo okruženi i izloženi, te brojnost različitih mehanizama njihovog djelovanja, čine toksikologiju vrlo širokom znanošću.

• Toksikologija je znanost o otrovima ili izučavanje štetnih

učinaka kemijskih i fizikalnih noksi na biološke sustave.

Toksikolozi su osobe posebno školovane i trenirane da bi istraživale prirodu štetnih učinaka neke supstance na žive organizme i procjenjivale mogućnost njihove pojave.

Što je toksikologija?

Međutim toksikologija je do danas ostala svojevrsni paradoks!

• Zato što su sve supstance otrov

• Samo je pitanje doze dali je nešto otrov ili ne

Što je otrov ?

• Otrov je za neko živo biće svaka tvar ili smjesa tvari koja kod određene jednokratne doze ili kod kroničnog uzimanja određenih doza tijekom nekog perioda, izaziva bilo kakva štetna, prolazna ili neprolazna, oštećenja tog organizma.

Iako je u načelu točna ova definicija nije u potpunosti univerzalna zbog razlika među

vrstama.

• Moderna toksikologija je stoga usmjerena na određivanje takozvane SIGURNE DOZE ili doze bez štetnog učinka.

• Da bi to mogli moramo jasno razumjeti biološke mehanizme i dostupne metode istraživanja.

• Na osnovu takvih egzaktnih podataka uz jasno definirane postupke evaluacije i interpretacije rezultata moguće je odrediti DOZU BEZ UČINKA.

Najstariji pisani tragovi • Papirus Ebers iz 1552. godine prije Krista nađen u Egiptu

smatra se najstarijim pisanim dokumentom toksikološkog sadržaja.

• Sadrži brojne recepte o otrovima (olovo, bakar, opium, terpentin i druge)

• U starom Egiptu u doba faraona koriste otrov u pravne svrhe za dokazivanje nečije krivice ili nevinosti.

(pripravak ekstrakta koštice od breskve koji sadrži hidrocijanidnu kiselinu)

• Kleopatra 69.- 30. p.n.e. – eksperimentirala strihninom na zatvorenicima

Mithridates kralj Pontusa

100 p.K. imao je reputaciju najvećeg

poznavatelja otrova i protuotrova svog vremena.

Mitridatum je njegov univerzalni antidot

Testirao je otrove na robovima, kriminalcima i zatvorenicima

Iskoristio svoje znanje o otrovima u ratu sa rimskim generalom Pompejem 67.p.K., namamivši ga na obalu Crnog mora do grada Trabzona. Područje u kojem raste jedna vrsta rododendrona koji sadrži grajanotoksin.

Rimsko Carstvo

• Obožavali su otrove. • U 1.stoljeću imperatori su se intenzivno služili otrovima • Poznate su 3 slavne trovačice: Canidia Martina Lacusta Car Klaudije je Lacustu osudio na smrt ali je umro! Neron ju je potom angažirao da se riješi svojih neprijatelja

uključujući brata Britanicusa. Postaje službeni Neronov savjetnik za otrove.

• Raspadom Rimskog Carstva u 5.stoljeću Europa gubi vezu sa svojim medicinskim nasljeđem.

• Crkvene dogme vraćaju stanje u vrijeme prije Hipokrata.

• Bolest je kazna božja i djelovanje nadnaravnih sila i bića.

U vrijeme renesanse otrovi se uglavnom koriste u borbama za vlast, dakle eliminaciji protivnika i suparnika

• Obitelj Borgia (1400) je sinonim u upotrebi otrova u te svrhe.

• Zanat profesionalnih trovača cvate. • Gulia Toffina oko 1700 je najpoznatija i ima

dokazanih oko 600 trovanja (uglavnom muževa) (prodaje otrovni pripravak - Aqua Toffina)

Renesansa ipak nije sa aspekta toksikologije jedino iznjedrila Borgije kao sinonim uspješnih trovača u borbi za postizanje političkih ciljeva i borbi za vlast

1492. – 1541. živi toksikolog najdužeg imena

Philippus Theopharastus Aureolus Bonapartus von Hohenheim

Napisao je brojna kapitalna medicinska djela, a najpoznatiji je po tome što je postavio do danas važeći temeljni princip toksikologije

“Sve su supsatance otrovi, nema nijedne koja nije otrov. Samo prava doza razlikuje što je otrov, a što lijek” Prvi je uočio da je toksičnost relativna pojava koja ne ovisi

samo o toksičnim svojstvima tvari nego i o uporabljenoj dozi. Odnos između doze tvari i učinka.

PARACELSUS

Ocem moderne toksikologije smatra se Matthieu Joseph Bonaventura Orfila 1787. – 1853. porijeklom španjolac, školovao

studirao kemiju i medicinu u Valenciji, Barceloni i Parizu. Bio je Prof. na Sorboni. 1814. objavio je knjigu Traite des poisons koja je prva knjiga o općoj toksikologiji.

PODJELA TOKSIKOLOGIJE

Postoji veliki broj različitih podjela u toksikologiji

Najprimjereniji podjela je prema:

1) PRISTUPU 2) PODRUČJU 3) PROFESIJI

Prema PODRUČJU

• Forenzička - hibrid analitičke kemije i fundamentalnih toksikoloških principa.

• Klinička - usmjerena je u prvom redu na dijagnostiku i terapiju otrovanja.

• Ekotoksikologija - izučava učinke zagađenja na divlje

životinje i ekosustave.

Prema PRISTUPU

• Deskriptivna – (najstarija) - bavi se toksikološkim

testiranjima i daje podatke za regulatorne svrhe.

• Analitička – laboratorijske tehnike i metode.

• Molekularna – izučava djelovanje štetnih tvari na molekularnoj razini.

Prema PROFESIJI

• Deskriptivna - najstarija - bavi se toksikološkim testiranjima i daje podatke za regulatorne svrhe.

• Mehanistička - istražuje mehanizme djelovanja otrova na žive organizme, nove metode i modele testiranja, nove terapijske pristupe.

• Regulatorna - donosi preporuke (odluke) na osnovu podataka deskriptivne toksikologije o prihvatljivosti rizika uvažavajući vrlo široki spektar činjenica i podataka.

POJMOVI U TOKSIKOLOGIJI

• KSENOBIOTICI - vanjski, prirodni ili proizvedeni uzročnici uključujući lijekove, pesticide, industrijske proizvode ili otpadne tvari

• TOKSOIDI - toksini nastali djelovanjem čovjeka kao posljedica kontroliranih reakcija u proizvodnji npr. Sredstava za čišćenje, pesticida, umjetnih gnojiva

• BIOLOŠKI TOKSINI - otrovi različitih živih organizama biljnih, životinjskih uključujući plijesni i bakterije

• ANTIDOT - od grčke riječi anti – protiv i didani – dati, označava specifično sredstvo koje djeluje kao protuotrov

• TOKSIKOKINETIKA – matematički model kojim se opisuje i predviđa ponašanje ksenobiotika tijekom apsorpcije, distribucije, metabolizma i ekskrecije

• TOKSIKODINAMIKA – odnos koncentracije ksenobiotika naspram uočenog kliničkog učinka

• INTERAKCIJA OTROVA –kod izloženosti 2 ili više ksenobiotika štetni učinci mogu se pojačavati ili čak nastajati neki novi. Može biti:

aditivna x + y = xy sinergistička x + y = veće od xy potencirajuća x + y = puno veće od x

ANTAGONIZAM – učinak 2 ili više kemikalija ali u toksikološki pozitivnom smislu i dovodi do smanjenja ili nestajanja štetnog učinka. – funkcionalni – tvari imaju suprotan učinak ( konvulzivi –

antikonvulzivi) – kemijski – inaktivacija jedne tvari drugom (teški metali – kelirajuće

tvari) – dispozicijski – mijenja se toksikodinamika (adsorbensi, diuretici) – receptorski – dvije tvari vežu se za isti receptor ali različitim

afinitetom (atropin – acetilkolin)

FREKVENCIJA IZLOŽENOSTI – kod jednokratnog unosa otrova doza ima presudnu ulogu ali kod višekratnog ulaska u organizam (uvijek manjih doza od letalne) frekvencija izloženosti je bitan čimbenik u procjeni rizika za pojavu nekog štetnog učinka npr. pojava tumora.

Akutna – jednokratna izloženost Subakutna – do mjesec dana Subkronična – 3 mjeseca Kronična – dulje od 3 mjeseca

Kod procjene rizika u zadnja 3 slučaja mora se uzeti u obzir i činjenicu da

izloženost u tim vremenskim intervalima može biti stalna i povremena.

• TOKSIDROM – skup simptoma koje uzrokuje specifični otrov ili grupa otrova

Antikolinergični - antihistaminici, amandatin, kurare Kolinergični - OP-spojevi, karbamati, neke gljive Simpatomimetički - kokain, amfetamini, efedrin Opioidni - prirodni opijati, morfij i sintetski

analozi Benzadiazepinski - valium

TOKSIDROM-Antikolinergični

• suhoća mukoznih membrana • rumenilo kože • retencija urina • poremećen mentalni status • proširene zjenice • ciklopegija • smanjena motorika crijeva

(antihistaminici, triciklički antidepresivi, antipsihotički lijekovi,

mišićni relaksanti, amantadin)

• Ova skupina otrova blokira muskarinske acetilkolinske receptore

TOKSIDROM-Kolinergički

• mioza, bradikardija, bronhospazam i plućni edem, povraćanje, proljev, suzenje, inkontinencija urina – (muskarinski simptomi)

• midrijaza, tahikardija, bronhodilatacija, hipertenzija, slabost –

(nikotinski simptomi) • nemir, konfuzija, letargija, koma, moždani udar, smrt – (centralni

simptomi) (organofosforni spojevi, karbamati, neke otrovne gljive, sarin)

TOKSIDROM -Simpatomimetički

• povećan tlak, tahikardija, tremor, povećana aktivnost, proširene zjenice

(kokain, amfetamini, efedrin)

TOKSIDROM-Opioidni

depresija CNS-a, mioza,depresija disanja, bradikardija, hipotenzija, smanjena motorika crijeva

( prirodni opijati - morfij i sintetski analozi )

POJMOVI U TOKSIKOLOGIJI

• LD50 doza – jednokratna ili frakcionirana doza unutar 24 sata od koje ugiba 50% životinja

• Compartment model - otrovi se u svojoj kinetici mogu ponašati po principu jednostrukog ili dvostrukog odjeljka unutar organizma.

APSORPCIJA

CENTRALNI COMPARTMENT

ELIMINACIJA

DISTRIBUCIJA

APSORPCIJA CENTRALNI

COMPARTMENT

ELIMINACIJA

DISTRIBUCIJA

PERIFERNI COMPARTMENT

O vezivanju toksina na proteine u plazmi ovisi da li se toksikokinetika odvija prema jednostrukom ili dvostrukom „compartment” modelu.

POJMOVI U TOKSIKOLOGIJI

• NOEL – No Observed Effect Level

• MTD – Maksimalno Tolerirajući Doza

• ADI – Acceptable Daily Intake (za pojedini medij)

• MDDD – Maksimalno Dopuštena Dnevna Doza (za sve medije)

• MDK – Maksimalno Dopuštena Koncentracija

• Rizik – mogućnost da će neka tvar ili kemikalija prouzročiti štetu pod određenim uvjetima

• Sigurnost – obrnuto od rizika, mogućnost da se šteta neće pojaviti pod određenim uvjetima

RIZIK

Što je za neku kemikaliju ili neki lijek prihvatljiv rizik je upravo stvar prave prosudbe koja u pojedinim zemljama ne mora biti ista.

• Koje su koristi • Postoje li druga alternativna sredstva istog pozitivnog učinka • Predvidivi obim upotrebe • Zapošljivost stanovništva • Gospodarski učinci • Utjecaj na okoliš • Prirodni resursi • Itd. Primjeri: upotreba DDT-a i Chloranphenicola

Da bi otrov, odnosno toksična supstanca, mogla ispoljiti štetno djelovanje prvo mora ući u organizam.

• Oralno • Inhalatorno • Dermalno • Parenteralno

APSORPCIJA

brza ili spora

Nakon oralnog ulaska moguća je apsorpcija u cijelom ili samo dijelu probavnog trakta.

Brzina i mjesto apsorpcije ovisi i o karakteru supstance:

• Ph (kisele u želucu, lužnate u crijevima) • Molekularnoj težini (mali brže) • Koncetracijskom gradijentu • Liposolubilna ili topiva u vodi • Postojanje aktivnog transporta • Saturacijski gradijent (proteini u krvi se mogu saturirati

pa dolazi do akumulacije supstance u centralnom compartmentu)

Odnos doza – toksični učinak

• Razlikujemo: “sve ili ništa” efekt smrt ili stupnjevani učinak (npr. Inhibicija enzima ili patološka oštećenja – promjene na razini markera)

• Oba pristupa pokazuju tipični odnos doza – učinak

• U oba slučaja biti će doza(e) kod koje je “nemjerljiv”

efekt i viša doza s najvišim toksičnim učinkom

• Najjednostavnije je odrediti smrtnost, ali to je najgrublji parametar.

• Drugi parametar toksičnog učinka je prisutnost patoloških lezija, npr. Nekroza stanica jetre.

• Preciznija mjerenja patološkog učinka su praćenja biokemijskih promjena.

Toksični efekt

Toksični efekt

Postoje različiti stupnjevi akutne oralne toksičnosti 1)”ekstremno toksični” spojevi – nekoliko µg/kg t.m 2) “vrlo toksični” spojevi – nekoliko mg/kg t.m. 3) “umjereno toksični” spojevi –par stotina mg/kg t.m. 4) “slabo toksični” spojevi – nekoliko gr/kg t.m. 5) “ne toksični” spojevi – 5 gr i više / kg t.m.

Praktično značenje u grupiranju otrova

GRANICA SIGURNOSTI

A

B

MO

RTAL

ITET

DOZA

LD

Subletalni efekt

Industrija – otpadne vode,plinovi Izazivaju mikro količine otrovnih tvari iz biosfere (neprekidno, duže

vrijeme dospijevaju u organizam) Poljoprivreda – pesticidi Promet – sagorijevanje goriva Otpaci iz kućanstva Uzrokuju suptilne biokemijske lezije u organima Smanjuju obrambenu sposobnost organizma Djeluju na reprodukciju Mijenjaju genetičke faktore Djeluju mutageno, teratogeno, kancerogeno

Novo područje toksikologije - nanotoksikologija

Toksičnost i rizik

• Za ocjenu otrovnosti vrijednosti akutne toksičnosti nisu dostatne

• Hazard (opasnost) i rizik – Vjerojatnoća pojave otrovanja – Vjerojatnoća izloženosti i uvjeta pod kojim se odvija – Spojevi iz 1. skupine – najveća kontrola primjene – Ljudski faktor – obučenost osoba koje ga koriste Testovi na životinjama nezamjenjivi u procjeni

„hazarda”!

TESTOVI TOKSIČNOSTI I PROCJENA RIZIKA

TESTOVI TOKSIČNOSTI

• U većini industrijaliziranih zemalja; lijekovi,aditivi, industrijske kemikalije, pesticidi, kozmetički preparati i slično obavezno se moraju testirati.

• Postoje razlike u zakonskoj regulativi među pojedinim zemljama.

• Mogu se tražiti određena dodatna testiranja – ovisno o vrsti spoja, uporabi,nacionalnim propisima za registraciju.

• Izlažu se test-supstancama pokusne životnije ili biljke.

• Epidemiološki podaci – vrlo važni.

• Ekotoksikologija primjenjuje mnogo točnije određivanje rezidua u okolišu.

• Ispituje se perzistentnost i ponašanje supstance unutar lanca prehrane.

• Utjecaj na “korisne” životinjske vrste (pesticidi-pčele).

• Utjecaj na vodene organizme.

Prije početka ispitivanja toksičnosti treba odgovoriti na niz pitanja:

• Radi li se o potpuno novom spoju ili o kemikaliji sa “dugom povijesti upotrebe” ?

• Hoće li se koristiti u okolišu ? • Da li će biti dodavan u hranu ? • Koja je djelatna doza primjene ? • Koja je starosna skupina najeksponiranija ? • Može li se očekivati izloženost trudnica i djece? • Itd.

Osnovna biološka pitanja pri dizajnu testiranja toksičnosti

• Najpogodnije vrste životinja ? • Najpogodniji soj pokusnih životinja ? • Uvjeti i način držanja životinja ? • Prehrana ? • Sličnost u metabolizmu prema ljudima ? • Put aplikacije ? • Trajanje testiranja ? • Broj životinja u pokusu ? • Pozitivne i negativne kontrolne skupine ?

Kategorije ispitivanja toksičnosti

Testovi na pokusnim životinjama s obzirom na duljinu izlaganja:

• Akutna toksičnost (1 doza) • Subakutna t. (više doza do 1 mj.) • Subkronična t. (više doza od 1- 3 mj.) • Kronična t. (više doza od 3 mj. do 2 god.)

Testovi na životinjama

• Određivanje akutne toksičnosti (LD50) oralno dermalno • Procjena subkronične toksičnosti (90 dana) • Procjena kronične toksičnosti, najmanje 3 doze (MTD;

1/2MTD i 1/4MTD) • Utvrđivanje karcinogenog potencijala • Reprodukcijska toksičnost • Teratogenost i embriotoksičnost • Genotoksičnost • Istraživanje metabolizma i toksikokinetike • Specifično usmjerena istraživanja za bolje pojašnjenje mehanizma djelovanja (ako treba)

Testovi teratogenosti i reprodukcije

Plodnost i reprodukcija (Faza I)

• 2-3 doze – 20 životinja / dozi / spolu

• Mužjaci 60 dana prije parenja

• Ženke 14 dana prije parenja, tijekom graviditeta i laktacije

• Prati se: broj gravidnih ženki, živo i mrtvo rođene mladunčadi, težina, rast, preživljavanje, zdravstveno stanje mladunčadi u prva 3 tjedna života

Testiranje na teratogeni potencijal (Faza II)

• Prate se malformacije nastale za vrijeme razvoja ploda – od začeća do poroda

• Obavezna ekspozicija u vrijeme organogeneze

– minimum 12 kunića / grupi, 20 štakor ili miševa / grupi. – po 3 različite doze u kritičnom vremenu gestacije (kunić od 6-

18 dana, štakor od 6-15 dana) – vađenje fetusa dan prije okota (kunić 31. dan, štakor 21. dan) – vaganje uterusa – broj živih, mrtvih i resorbiranih fetusa – Živi fetusi: težina, abnormalnosti konstitucije, anomalije u

tkivima i organima

Predporođajna i postporođajna toksičnost

(Faza III)

• Tretiranje ženki od 15. dana graviditete do poroda i

tijekom laktacije - prirast mladu mladunčadi - preživljavanje mladunčadi - rast mladunčadi tijekom prva 3 tjedna

Multigeneracijski testovi toksičnosti na reprodukciju

Najmanje 3 različite doze

Grupe po 25 ženki i 25 mužjaka (30-40 dana starosti) - F0 generacija – tretman tijekom parenja, graviditeta,

laktacije mladunčad (F1 generacija ) tretirana in utero, tijekom

laktacije nastavlja se tretirati u hrani - F1 generacija (140 dana starosti) parenje 25ž/25m - F2 generacija – nastavak tretmana, isti dizajn

• Prati se: – Postotak gravidnih ženki F0 i F1 generacije – Broj uspješnih graviditeta (dovedeni do okota) – Broj mrtvo i živo rođenih – Preživljavanje – Težina mladunčadi 4., 7., 14. i 21. dan – Histopatologija mladunčadi F0 i F1 generacije

posebno reproduktivnih organa

Posebni testovi toksičnosti

• Na očnu i kožnu iritaciju

• Imunotoksičnost

• Neurotoksičnost

• Toksikokinetički parametri

• Toksikodinamički parametri

Akutna toksičnost 56.5 tisuća $ Višekratne doze: 14 dana štakor 40. 0 90 dana štakor 100.0 1. god. p/o štakor 260.0 2. god. p/o štakor 600.0 Testovi reprodukcije: F1 30.0 F2 20.0 F3 22.0 In vitro testovi: mikroorganizmi 1.5 kulture stanica 1.5

cca: Cijena testiranja jednog spoja od 5 do 10 m$

Ekstrapolacija rezultata na čovjeka

• Odrediti graničnu dozu -najveću dozu koja ne uzrokuje štetne efekte – NOAEL

To je polazište za određivanje dnevne doze rezidua u hrani. • Faktor sigurnosti – maksimalno netoksična doza u kroničnim

studijama toksičnosti umanjena za 100 i više puta

(10 x zbog ekstrapolacije rezultata animalnih testova na čovjeka – više kvantitativne nego kvalitativne razlike; i 10 x zbog razlike među ljudima)

Dozvoljena razina ksenobiotika u hrani

• ADI u mg / kg t.m. čovjeka / dan je količina (vrijednost)

ksenobiotika koja pri dugotrajnom dnevnom unošenju ne predstavlja opasnost po zdravlje potrošača

ADI

Donosi se na osnovu: – Kemijskih i toksikoloških podataka – Kroničnih eksperimenata na životinjama – NOAEL vrijednost je temelj za određivanje ADI – Primjene faktora sigurnosti (najmanje 100x)

ADI = NOAEL / faktor sigurnosti mg/kg t.m./dan

Dozvoljena razina rezidua u hrani MRL

• Temelji se na podacima za : – ADI – Prosječnoj količini hrane koja se dnevno konzumira (

Q ) – Prosječna težina osobe (60 kg) – Dozvoljena količina rezidua u svakoj pojedinoj vrsti

namirnice ( K ) K = ADI x 60 x 1000 / Q mg/kg t.m. ( K vrijednost je toksikološka granica, veće vrijednosti od K mogu

biti štetne po zdravlje)

Epidemiološki podaci

• Retrospektivne epidemiološke studije na radnicima u proizvodnji i primjeni, općoj populaciji izloženoj dulje vrijemem na niskim koncentracijama

• Akcidentalna trovanja

• “Otvorena literatura”

PROCJENA RIZIKA

Interpretacija toksikoloških podataka

RIZIK

• “Rizik je mjera vjerojatnosti da će doći do neželjenih učinaka”

– Apsolutni rizik – ovisno o izlaganju (npr. profesionalna

izloženost) – Relativni rizik – koji je odnos rizika pri izlaganju i ne

izložene populacije Osnovni problem s toksikološkim podacima je

procjena rizika i kalkulacija rizika te ocjena rizika u odnosu na dobit.

Rizik

Rizik = hazard x vjerojatnost izloženosti Za kemikaliju za koju se smatra da je toksična i “hazardna” rizik je očekivana frekvencija neželjenih učinaka nastalih zbog izlaganja kemikaliji i funkcija je toksičnosti i doze ili “razini izlaganja.” “Razina izlaganja” je određena duljinom, frekvencijom i jačinom izlaganja (ovisi o uvjetima pri izlaganju u određenom okolišu).

Kalijev cijanid KCN (visoko hazardna kemikalija) može¸imati vrlo mali rizik ako smo izloženi izrazito niskim koncentracijama.

Popiti 1x10-8 M KCN višekratno, povremeno kroz dulji period praktički je bezopasno (niski rizik) ali jednokratno uzimanje 1x10-1 M je smrtonosno unutar jedne minute. Insekticidi u uzgoju cvijeća – zatvoreni prostor, vlaga, visoke koncentracije – radnici izloženi, potrošači ne.

• Procjena izlaganja i doza su ključni u procjeni rizika • Teško odredivi unutar ukupne populacije

– na izloženost utječu brojni često specifični faktori

način života običaji

stupanj razvijenosti društva

Dileme pri donošenju procjene

• Karcinogeni i teratogeni potencijal neke kemikalije izuzetno je osjetljivo pitanje – teoretski jedno izlaganje ili reakcija spoja ili njegovih metabolita na dijelu DNA molekule može biti dovoljno za pokretanje kancerozne promjene

• AMES test nije dovoljno pouzdan za procjenu moguće pojave mutagenih promjena

• In vitro testovi nikako ne mogu zamijeniti in vivo testove, barem ne za sada

Procjena rizika

• Uvijek uključuje i upravljanje rizikom “risk management” dobrobit – šteta šteta – profit Politika na globalnoj i lokalnoj razini imaju utjecaja na donošenje odluka