18
ACADEMIA ROMANA INSTITUTUL DE BIOLOGIE SI PATOLOGIE CELULARA „ NICOLAE SIMIONESCU” TEZA DE DOCTORAT Mecanisme celulare si moleculare responsabile de alterarile morfo-functionale ale glomerulului renal in imbatranire si hipertensiunea arteriala Conducator stiintific: ACAD. MAYA SIMIONESCU Doctorand: MADALINA DUMITRESCU 2013

TEZA DE DOCTORAT Mecanisme celulare si … teza M...sau alterari celulare datorate stresului de curgerea sangelui determina disfunctia acestor celule, cu consecinte negative asupra

Embed Size (px)

Citation preview

ACADEMIA ROMANA

INSTITUTUL DE BIOLOGIE SI PATOLOGIE CELULARA

„ NICOLAE SIMIONESCU”

TEZA DE DOCTORAT

Mecanisme celulare si moleculare responsabile

de alterarile morfo-functionale ale glomerulului renal

in imbatranire si hipertensiunea arteriala

Conducator stiintific:

ACAD. MAYA SIMIONESCU

Doctorand:

MADALINA DUMITRESCU

2013

CUPRINS

INTRODUCERE

PARTEA I - STADIUL ACTUAL AL CUNOSTINTELOR

Capitolul I. Aspecte morfo-functionale ale glomerulului renal in conditii fiziologice

I.1. Notiuni generale de anatomie si fiziologie renala

Structura anatomica si functionala a nefronului

Vascularizarea rinichiului

I.2. Structura si functia glomerulul renal

Mecanismul ultrafiltrarii glomerulare

Membrana sau bariera de filtrare glomerulara

Endoteliul capilar

Membrana bazala glomerulara

Epiteliul visceral

Rata de filtrare glomerulara

Capitolul II. Mecanisme fiziopatologice care contribuie la disfunctia celulelor

glomerulare in imbatranire si hipertensiunea arteriala

II.1. Modificari patologice ale celulelor glomerulului renal in disfunctia glomerulara

II.1.1 Disfunctia celulelor endoteliale glomerulare

Modificarea dimensiunilor celulelor endoteliale glomerulare

Pierderea fenestrelor celulelor endoteliale glomerulare

Alterari ale glicocalixului

Alterari ale celulelor endoteliale datorate stresului de curgere a sangelui

II.1.2. Modificari structurale ale membranei bazale glomerulare

II.1.3 Alterari structurale si functionale ale podocitelor

Hipertrofia podocitelor

Fuziunea pedicelelor

Podocitopenia

II.1.4 Alterari morfo-functionale ale componentelor mezangiului

Proliferarea celulelor mezangiale

Apoptoza celulelor mezangiale

II.2 Alterari morfo-functionale ale glomerulilor renali in imbatranire si in hipertensiune

Mecanismele imbatranirii la nivelul glomerulului renal

Senescenta celulara - marker al imbatranirii la nivel renal

Disfunctia glomerulara in hipertensiunea arteriala

Modificari ale arhitecturii membranei bazale glomerulare in imbatranire

Modificari structurale si functionale ale podocitelor in imbatranire si hipertensiune

Alterari morfo-functionale ale componentelor mezangiale in imbatranire si in

hipertensiunea arteriala

Capitolul III. Mecanisme moleculare implicate in senescenta celulelor glomerulare

renale

III.1. Caracteristici morfologice si functionale ale celulelor senescente

III.2. Markeri si inductori ai senescentei celulare

Markeri de senescenta celulara

Inductori ai senescentei celulare

Cai de semnalizare implicate in senescenta celulara

Calea de semnalizare intracelulara mediata de p53.

Calea de semnalizare intracelulara mediata de p16-pRb.

Rolul autofagiei in senescenta celulara

III.3 Relevanta senescentei celulare in imbatranire

PARTEA A II-A - CONTRIBUTII ORIGINALE

I. Mecanisme celulare si moleculare implicate in senescenta celulara la nivelul

glomerulului renal in imbatranire

1. INTRODUCERE

2. METODOLOGIE EXPERIMENTALA

Determinarea biochimica a parametrilor plasmatici

Procesarea tesutului renal pentru microscopie optica

Coloratii histologice

Determinarea SA- β–Gal

Imunofluorescenta

Microscopie electronica

Determinarea activitatii NADPH oxidazelor

Detectia speciilor reactive de oxigen

Analiza Western-blot

Analiza statistica

3. REZULTATE

3.1. Caracterizarea hamsterului Sirian auriu batran comparativ cu cel tanar

3.1.1. Determinarea parametrilor biochimici circulanti

3.1.2. Evaluarea histologica a alterarilor structurale induse de imbatranire la

nivel glomerular

3.1.3. Evidentierea modificarilor ultrastructurale ale glomerulului renal

3.2. Implicarea senescentei celulare in imbatranirea la nivelul glomerulului renal

3.2.1. Evidentierea unor markeri de senescenta celulara in celulele

glomerulare renale la hamsterii batrani

3.2.2. Efectori ai programului de senescenta identificati la nivel glomerular

3.2.3. Aprecierea productiei de specii reactive de oxigen in cortexul renal;

rolul acestora in inducerea senescentei celulare

3.2.4. Rolul disfunctiei mitocondriale in inducerea senescentei celulare in

imbatranire

3.3. Cross-talk-ul molecular intre mecanismul autofagiei si cel al senescentei

celulare la nivelul glomerulului renal in imbatranire

3.3.1. Rolul stresului reticulului endoplasmatic in inducerea autofagiei in celulele

glomerulare de la hamsterul batran

3.3.2. Activarea autofagiei ca mecanism de reciclare a componentelor structurale

ale mitocondriilor disfunctionale

3.3.3. Modularea autofagiei ca raspuns la stresul energetic al celulelor glomerulare

in imbatranire

4. DISCUTII

5. CONCLUZII

II. Mecanisme moleculare ale senescentei celulare in hipertensiunea indusa cu

L-NAME

1. INTRODUCERE

2. METODOLOGIE EXPERIMENTALA

Determinarea glicemiei si colesterolemiei

Determinarea concentratiei de nitrati/nitriti

Activitatea enzimei de conversie a angiotensinei (ACE)

Masurarea presiunii arteriale

Procesarea organelor pentru microscopie optica

Coloratii histologice

Determinarea SA- β–Gal

Microscopie electronica

Determinarea productiei de anioni superoxid

Cuantificarea carbonililor proteici

Analiza Western-blot

Analiza statistica

3. REZULTATE

3.1. Caracterizarea hamsterului cu hipertensiune indusa in urma administrarii cronice

de L-NAME

3.1.1. Masurarea parametrilor hemodinamici si a greutatii corporale si renale

3.1.2.Evaluarea histologica a alterarilor structurale glomerulare induse de inhibarea

sintezei de NO la hamsterii hipertensivi si control

3.1.3. Aspecte electronomicroscopice ale ultrastructurii glomerulului renal de la

hamsterii cu hipertensiune indusa cu L-NAME

3.2. Mecanisme moleculare ale senescentei celulelor glomerulare asociate cu

inhibarea cronica a NO la nivelul glomerulilor hamsterilor hipertensivi

3.2.1.Cuantificarea productiei de specii reactive de oxigen la nivelul cortexului

renal al hamsterilor hipertensivi si control

3.2.2.Implicarea cailor de semnalizare intracelulara activate de ROS in senescenta

celulelor gomerulare

3.2.3. Identificarea celulelor senescente in glomerulii hamsterilor hipertensivi

3.2.4. Modificari ultrastructurale glomerulare posibil implicate in senescenta celulara

favorizata de inhibarea sintezei NO

4. DISCUTII

5. CONCLUZII

III. Implicarea efectului antioxidant al Zofenopril in restabilirea disfunctiilor

glomerulare induse de inhibarea cronica a sintezei de NO

1. INTRODUCERE

2. METODOLOGIE EXPERIMENTALA

Determinarea biochimica a parametrilor plasmatici

Determinarea activitatii enzimei de conversie a angiotensinei

Masurarea presiunii arteriale

Procesarea tesutului renal pentru microscopie

Coloratia histologica tricromica Masson

Microscopie electronica

Determinarea productiei de anioni superoxid

Cuantificarea carbonililor proteici

Analiza Western-blot

Determinarea concentratiei de glutation (in forma totala, redusa, oxidata)

Determinarea activitatii glutation peroxidazei

Analiza statistica

3. REZULTATE

3.1. Caracterizarea sobolanilor cu hipertensiune indusa prin administrarea cronica de

L-NAME tratati/netratati cu Zofenopril

3.1.1.Determinarea parametrilor hemodinamici, circulanti si a greutatii corporale

3.1.2. Evaluarea histologica a alterarilor structurale glomerulare la sobolanii cu

hipertensiune tratati/netratati cu Zofenopril

3.1.3. Aspecte electrono-microscopice ale glomerulilor renali de la sobolanii cu

hipertensiune tratati/netratati cu Zofenopril

3.2. Implicarea stresului oxidativ in alterarile renale aparute la sobolanii cu hipertensiune

tratati/netratati cu Zofenopril; efectul anti-oxidant al Zofenopril

3.2.1. Determinarea productiei de anioni superoxid in cortexul renal al sobolanilor

cu hipertensiune tratati/netratati cu Zofenopril

3.2.2. Evaluarea expresiei proteice a subunitatilor NADPH oxidazei in omogenatele

de cortex renal

3.2.3. Determinarea exprimarii proteice a subunitatilor factorului de transcriptie

NFkB implicat in stresul oxidativ intracelular

3.2.4. Determinarea concentratiei carbonililor proteici - marker de stres oxidativ

3.2.5. Evaluarea statusului oxidant / antioxidant in cortexul renal;

estimarea nivelelor de glutation si activitatea glutation peroxidazica

4. DISCUTII

5. CONCLUZII

CONCLUZII GENERALE

BIBLIOGRAFIE

LISTA LUCRARILOR PUBLICATE

IMPLICAREA IN PROIECTE DE CERCETARE

CUVINTE CHEIE

Cortex renal; Glomerul renal; Podocite; Celule mezangiale; Imbatranire fiziologica;

Hipertensiune arteriala; Senescenta celulara; Fenotip senescent; Ciclul celular; Stres

oxidativ; Specii reactive de oxigen (ROS, „reactive oxygen species”); Disfunctie

mitocondriala; Stresul reticulului endoplasmatic; Autofagie; β-galactozidaza lisozomala

asociata senescentei (SA-β-gal), L-NAME (“Nω-Nitro-L-arginine methyl ester

hydrochloride”); Zofenopril; Antioxidant

REZUMAT

Teza de doctorat „Mecanisme celulare si moleculare responsabile de

alterarile morfo-functionale ale glomerulului renal in imbatranire si hipertensiunea

arteriala” a urmarit identificarea unor noi mecanisme celulare si moleculare implicate in

dezvoltarea senescentei celulare la nivel glomerular in imbatranirea fiziologica si in

hipertensiunea arteriala. Lucrarea cuprinde doua parti: partea I „Stadiul actual al

cunostintelor” si partea a II-a „Contributii originale”.

In contextul cresterii accelerate a numarului persoanelor varstnice subiectul

abordat este de stringenta actualitate. In 2012, Organizatia Mondiala a Sanatatii a

estimat ca pana in 2050 proportia persoanelor trecute de 60 ani se va dubla comparativ

cu anul 2000. Co-morbiditatile asociate imbatranirii (hipertensiunea, ateroscleroza,

insuficienta cardiaca, etc.) sunt boli cronice pentru tratarea carora sistemul sanitar

trebuie sa aloce fonduri foarte mari. Descifrarea mecanismelor imbatranirii va contribui

la dezvoltarea unor strategii eficiente pentru cresterea calitatii vietii varstnicilor si

mentinerea lor in activitate, prin intarzierea aparitiei, sau diminuarea modificarilor

patologice celulare si tisulare ce apar cu inaintarea in varsta.

In imbatranirea fiziologica modificarile morfologice si functionale ale rinichilor

conduc la dezvoltarea insuficientei cronice renale. Acumularea celulelor senescente a

fost implicata in inducerea alterarilor tisulare in imbatranire si in afectiunile cronice care

o insotesc. Investigarea senescentei celulelor renale poate conduce catre o noua

abordare teraputica a fiziopatologiei imbatranirii la nivel renal. Recent prin

indepartarea celulelor senescente pozitive pentru proteina p16INK4a (marker recunoscut

de senescenta celulara) din tesuturi de la soareci cu fenotip progeroid, a fost intarziata

aparitia fenotipului asociat imbatranirii (Baker si colab., 2011). Aceste aspecte au

condus la ideea elaborarii unor strategii de „indepartare” a celulelor senescente din

tesuturi pentru restabilirea functiei acestor tesuturi.

Prima parte a tezei este structurata in trei capitole. In capitolul I sunt cuprinse

notiuni de anatomie si fiziologie renala, fiind prezentate structura si functia glomerulului

renal, respectiv arhitectura glomerulului renal si bariera de filtrare glomerulara, inclusiv

mecanismul ultrafiltrarii si rata de filtrare glomerulara, in conditii fiziologice normale.

Capitolul II prezinta modificarile patologice ale celulelor glomerulului renal si implicatiile

acestora in disfunctia glomerulara. Modificarea dimensiunii celulelor endoteliale

glomerulare, alterarea / pierderea fenotipului lor fenestrat, modificari ale glicocalixului,

sau alterari celulare datorate stresului de curgerea sangelui determina disfunctia

acestor celule, cu consecinte negative asupra filtrarii glomerulare. Deasemenea

disfunctia barierei de filtrare glomerulara este cauzata de modificarile structurale ale

membranei bazale glomerulare, de alterarile structurale si functionale ale podocitelor

(respectiv de hipertrofia acestor celule epiteliale viscerale, de fuzionarea pedicelelor lor,

sau de pierderea acestor celule) si de alterarile morfo-functionale ale regiunii

mezangiale (proliferarea, sau apoptoza celulelor mezangiale, hiperplazia mesangiala).

In capitolul II sunt evidentiate alterarile morfo-functionale ale glomerulilor renali in

imbatranire si hipertensiunea arteriala, cu referire la mecanismele afectate de

procesul imbatranirii in podocitele renale si in mezangiu. Plecand de la ipoteza ca in

procesul imbatranirii rinichiului una dintre cauzele modificarii arhitecturii membranei

bazale glomerulare si a alterarilor morfo-functionale ale podocitelor o reprezinta

acumularea de celule senescente la nivel renal, in capitolul III sunt prezentati markerii

si efectorii senescentei celulare, respectiv o serie de proteine implicate in semnalizarea

intracelulara implicata in aparitia fenotipului senescent. In acest capitol este subliniata

relevanta senescentei celulare in procesul imbatranirii fiziologice. In faza ei „timpurie”

senescenta celulara constituie un mecanism de protectie a celulelor impotriva

transformarii lor tumorale, insa exacerbarea fenotipului secretor asociat cu senescenta

celulara are impact negativ asupra celulelor din vecinatate, contribuind substantial la

morbiditatea asociata imbatranirii.

Partea a II-a, intitulata Contributii originale, cuprinde rezultatele originale

obtinute in trei studii care au vizat: 1) identificarea celulelor senescente in glomerulii

renali de la hamsteri Sirieni aurii de 24 de luni (considerati batrani), sau cu

hipertensiune arteriala (indusa experimental); 2) descifrarea unor mecanisme celulare si

moleculare implicate in inducerea senescentei celulare la nivelul glomerulilor renali;

3) ameliorarea efectelor stresului oxidativ la nivel cortical renal, prin administrarea de

Zofenopril sobolanilor cu hipertensiune arteriala indusa.

In primul studiu, numit „Mecanisme celulare si moleculare implicate in

senescenta celulara la nivelul glomerulului renal in imbatranire”, am urmarit

investigarea unor mecanisme moleculare implicate in inducerea senescentei celulare

in imbatranirea fiziologica, in perspectiva dezvoltarii unor noi strategii terapeutice

directionate catre intarzierea aparitiei bolilor renale cronice, in vederea cresterii calitatii

vietii populatiei varstnice. Ca model experimental animal am utilizat hamsterii sirieni

aurii in varsta de 24 luni (considerati batrani) si, respectiv, in varsta de 4 luni (tineri) de

la care am prelevat rinichii, la momentul sacrificarii. Cortexul renal a fost procesat

pentru: a) microscopie optica (sectiuni in parafina si criosectiuni) si microscopie

electronica, in vederea examinarii alterarilor structurale ale celulelor glomerulare in

imbatranire, a prezentei disfunctiei mitocondriale, a stresului reticulului endoplasmatic si

a autofagiei, b) evidentierea reactiei β-galactozidazei lisozomale asociata senescentei

(SA β-gal), cu activitate la pH 6, c) identificarea imunochimica a unor proteine de

interes, atat prin tehnica de western blotting cat si prin imunohistochimie (microscopie

de fluorescenta), d) estimarea productiei de specii reactive de oxigen si a efectelor

stresului oxidativ la nivelul proteinelor si a cailor de semnalizare intracelulara activate de

stres si implicate in modularea senescentei celulare.

Examinarea histologica a sectiunilor renale (coloratii: hematoxilina-eozina, PAS,

tricromica Masson, metenamin-argint) a relevat prezenta glomerulosclerozei focale si

segmentare, acumularea excesiva de colagen de tip IV si ingrosarea membranei bazale

la nivelul glomerulilor de la hamsterii batrani. Testarea activitatii SA β-gal la pH 6 a

dovedit prezenta celulelor senescente in vivo in glomerulii renali de la hamsterii batrani

(Fig. 1, stanga). In literatura de specialitate sunt putine datele care arata prezenta

celulelor senescente la nivel renal. Un al marker de senescenta unanim recunoscut il

reprezinta p16INK4a, o proteina inhibitoare a unor complexe ciclina - kinaza ciclin-

dependenta, a carei exprimare crescuta reflecta oprirea ireversibila a ciclului celular -

trasatura definitorie a senescentei celulare. Exprimarea crescuta a p16INK4a la nivel

renal la hamsterii batrani a fost pusa in evidenta atat prin Western blot cat si prin

microscopie de fluorescenta (Fig. 1, dreapta).

Fig.1. Celule senescente in

glomerulii renali la hamsteri

batrani. Coloratia albastra

indica celule pozitive pentru

SA β-gal activa la pH 6

(stanga). Celule p16INK4a-

pozitive sunt marcate cu

Alexa 488 (verde) (dreapta).

Celulele senescente se opresc ireversibil din proliferare si desi raman active

metabolic ele prezinta caracteristic aplatizarea, rezistenta la apoptoza si

tumorigeneza, alterarea profilului expresiei genice si secretia unor molecule bioactive

(citokine inflamatorii si chiar specii reactive de oxigen) (Passos si colab., 2010).

Exprimarea crescuta a p27Kip1 si p21Cip1, doi inhibitori de complexe ciclina - kinaza

dependenta de ciclina din clasa Cip/Kip ce actioneaza in faza G1 a ciclului celular,

blocand progresia ciclului catre faza S, a indicat oprirea ireversibila a ciclului celular

in faza G1 in celulele renale de la hamsterii batrani, sugerand prezenta celulelor

senescente. Totodata studiile de Western blot au indicat acumularea tisulara de CDK4

la nivelul cortexului renal la hamsterii batrani.

Senescenta celulara constituie un raspuns al celulei la diversi factori de stres ce

determina lezarea ADN-ul genomic, sau modificari post-translationale ale proteinelor, si

care activeaza caile de semnalizare mediate de ARF/p53/p21Cip1 si de p16INK4a/pRb.

Determinarea productiei de specii reactive de oxigen (ROS) in omogenatele de

cortex renal de la hamsteri batrani si tineri a aratat generarea crescuta de ROS in cazul

hamsterilor batrani, aceasta reprezentand un factor posibil responsabil de inducerea

senescentei celulare in glomerulii renali. Intensificarea stresului oxidativ la nivel renal la

hamsterii batrani poate fi o cauza a exprimarii proteice crescute a p53, un factor de

transcriere redox-senzitiv implicat in decizia celulei de a deveni senescenta.

O alta proteina identificata recent ca mediator al fenotipului senescent, datorita

rolului pe care il joaca in remodelarea cromatinei si in facilitarea accesului factorilor de

transcriptie la ADN-ul nuclear, este alarmina HMGB1 („high mobility group box 1”)

(Davalos si colab., 2013). Timpuriu in senescenta HMGB1 transloca din nucleu in

citosol, fiind secretata extracelular; atat translocarea HMGB1 din nucleu, cat si

redistributia sa in spatiul extracelular depind de activarea p53. Urmarind implicarea

HMGB1 in senescenta, am aratat ca la nivelul cortexului renal, la hamsterii batrani,

exprimarea HMGB1 scade (Fig. 2, stanga; western blot), iar in celulele glomerulare

HMGB1 transloca din nucleu in citosol (Fig. 2, dreapta; imunofluorescenta ).

HMGB1

tubulina

Tineri Batrani

Fig. 2. Expresia si localizarea HMGB1 in cortexul renal la hamsteri batrani

Exista o legatura cauzativa intre stresul oxidativ, disfunctia mitocondriala,

senescenta celulara si fenotipul imbatranirii (Velarde si colab., 2012). In cazul

hamsterilor Sirieni aurii batrani studiati am observat, prin examinarea electrono-

microscopica a celulelor din glomerulii renali, prezenta mitocondriilor disfunctionale, atat

in podocite (Fig. 3, stanga) cat si in celulele mezangiale (Fig. 3, dreapta).

Fig. 3. Aspecte electronomicroscopice ale glomerulilor renali de la hamsterii batrani:

podocite (stanga) si mezangiu (dreapta). Mitocondriile au criste dezorganizate, iar

matricea mitocondriala are densitate scazuta.

Disfunctia mitocondriala este cauza, dar si consecinta senescentei celulare, in

conditii de stres oxidativ crescut si de incapacitatea enzimelor antioxidante de a inlatura

ROS. Urmarind exprimarea proteinei mitocondriale MnSOD, cu rol defensiv impotriva

ROS, nu am observat diferente semnificative in expresia acestei enzime in

omogenatele de cortex renal de la hamsterii batrani vs. tineri, insa este posibil ca la

hamsterii batrani activitatea enzimatica a MnSOD sa fie scazuta, astfel incat enzima

este ineficienta in reducerea stresului oxidativ.

In podocitele si celulele mezangiale din glomerulii hamsterilor batrani am

evidentiat, prin microscopie electronica, prezenta lipofuscinei, un produs nedegradabil,

rezultat prin reticularea/agregarea proteinelor si a lipidelor peroxidate. Acumularea de

lipofuscina apare caracteristic in imbatranire. Mitocondriile disfunctionale, care

determina eliberarea de anioni hidroxil foarte reactivi, pot contribui la formarea

lipofuscinei. Prezenta numeroaselor mitocondrii care apar sever afectate structural

sugereaza o diminuare substrantiala a autofagiei / mitofagiei (care elimina in mod

normal mitocondriile distruse).

Functia mitocondriala este modulata de o serie de proteine. AMPKinaza,

considerata senzor al metabolismului energetic, are rol in in activarea biogenezei

mitocondriale, dar si in directionarea mitocondriilor disfunctionale catre degradarea prin

mitofagie (Hardie, 2011). Disfunctia mitocondriala si productia crescuta de ROS

determina cresterea AMP in celule, iar cresterea raportului AMP:ATP intracelular

activeaza AMPKinaza care regleaza procesele metabolice in sensul refacerii resursei

energetice intracelulare. Un rol al AMPkinazei in inducerea senescentei este sugerat si

de potentialul AMP kinazei de a activa supresorul tumoral p53, prin controlul nivelelor

exprimarii proteice si prin capacitatea de transactivare a acestuia. Expresia AMPKinazei

in cortexul hamsterilor batrani studiati a fost crescuta, comparativ cu cei tineri, sugerand

implicarea acestei kinaze in imbatranire si in inducerea senescentei celulare la nivel

glomerular.

Alte doua proteine investigate pentru implicarea lor in senescenta celulara si

imbatranirea tisulara au fost SIRT1 si Nampt. Activarea SIRT1 si a Nampt, si o

concentratie intracelulara optima de NAD+, au rol important in asigurarea longevitatii

organismelor. SIRT1 face parte dintr-o familie de deacetilaze ce utilizeaza ca substrat

NAD+, jucand un rol cheie in metabolismul celular si in reglarea multor procese celulare,

de la supravietuirea celulei la raspunsurile acesteia la diversi factori de stres. Analiza

Western blot pe care am efectuat-o pe omogenatele de cortex renal de la hamsterii

batrani si tineri a aratat ca expresia proteica a SIRT1 este de doua ori mai scazuta la

hamsterii batrani, fata de cei tineri, rezultat care se coreleaza cu stresul oxidativ crescut

si cu alterarea structurii mitocondriilor. Nampt, enzima responsabila de sinteza NAD+ in

celula, “redreseaza” biodisponibilitatea NAD+, avand efecte benefice asupra scaderii

NAD+ si a ATP. Determinarea expresiei Nampt in cortexul renal al hamsterilor luati in

studiu a aratat reducerea semnificativa a expresiei Nampt la hamsterii batrani,

comparativ cu cei tineri.

In concluzie rezultatele experimentelor pe care le-am efectuat pe rinichi de

hamsterii batrani si tineri au aratat ca:

in imbatranire apare glomeruloscleroza, initial caracterizata de hipertrofia

celulelor glomerulare, urmata apoi de ingosarea membranei bazale glomerulare, de

expansiunea moderata a matricei mezangiale si de atrofia ghemului capilar glomerular;

celulele glomerulare de la hamsterii batrani exprima markerii senescentei

celulare: SA-β galactozidaza activa la pH 6, cresterea exprimarii p16INK4a si oprirea

ireversibila a ciclului celular in faza G1, indusa de p27Kip1, cu acumulare tisulara de

CDK4;

cresterea nivelelor de specii reactive de oxigen generate in cortexul renal de la

hamsterii batrani poate fi asociata cu activarea caii de semnalizare intracelulara

mediata de p53/p21Cip1;

la inducerea si stabilizarea fenotipului senescent contribuie alarmina HMGB1;

acumularea de mitocondrii disfunctionale in celulele glomerulare renal la

hamsterii batrani poate contribui la formarea lipofuscinei si la instalarea fenotipului

senescent;

cresterea expresiei AMPKinazei, posibil datorita stresului oxidativ crescut, indica

un stres energetic asociat procesului de imbatranire; acest stres determina scaderea

expresiei SIRT1 si a Nampt la nivelul cortexului renal, la hamsterii batrani.

In cel de-al doilea studiu cuprins in teza, numit „Mecanisme moleculare ale

senescentei celulare asociate hipertensiunii indusa cu L-NAME”, am urmarit:

1) identificarea prezentei celulelor senescente la nivelul glomerulilor renali in

hipertensiune, afectiune caracterizata de stres oxidativ crescut si 2) mecanismele

intracelulare care intervin in inducerea fenotipului senescent in in vivo, in hipertensiune.

Hipertensiunea arteriala (HTA), considerata „ucigasul tacut (the silent killer)”, reprezinta

o problema majora de sanatate publica, afectand circa un miliard de persoane in

intreaga lume. Prezenta celulelor senescente in bolile glomerulare asociate HTA nu

este inca fundamentata, dar se presupune ca alterarea biodisponibilitatii oxidului nitric

(NO), implicata in patogenia hipertensiunii arteriale, contribuie la stresul oxidativ crescut

si la aparitia fenotipului senescent. Inhibarea cronica a sintazei NO cu analogi de L-

arginina precum L-NAME induce senescenta celulelor endoteliale in vitro, in timp ce in

vivo determina hipertensiune sistemica si arterioloscleroza (Zhong si colab., 2010).

Rolul NO in senescenta celulara nu este inca elucidat, iar raportarile din literatura

referitoare la acest subiect sunt foarte putine.

In experimentele intreprinse am utilizat un model experimental original:

hamsterul Sirian auriu cu hipertensiune indusa prin administrarea cronica de L-NAME

(un inhibitor al sintezei de NO. Grupul hamsterilor hipertensivi (HT) a fost constituit din

hamsteri masculi carora li s-a administrat L-NAME (45 mg/kg corp/zi; 200 l) prin gavaj,

timp de 35 saptamani, iar grupul de control a fost alcatuit din masculi de aceeasi varsta

cu cei din grupul HT (4 luni) care au primit zilnc 200 l ser fiziologic. Obiectivele

specifice ale studiului au fost: a) caracterizarea hemodinamica si a parametrilor

biochimici ai modelului experimental ales; b) evaluarea histologica a modificarilor induse

in glomerulii renali, dupa administrarea de L-NAME; c) evidentierea electrono-

microscopica a modificarilor ultrastructurale ale glomerulilor renali de la hamsterii luati in

studiu; d) identificarea celulelor senescente prin determinarea activitatii β-galactozidazei

lisozomale asociata senescentei (SA-β-gal), activa la pH6), la nivelul glomerulilor renali

de la hamsterii cu hipertensiune; e) estimarea productiei de specii reactive de oxigen la

nivelul cortexului renal prelevat de la hamsterii cu hipertensiune; f) evaluarea

modificarilor oxidative ale proteinelor din celulele glomerulare de la hamsterii cu

hipertensiune; g) cuantificarea exprimarii unor proteine din caile de semnalizare activate

de stres si implicate in inducerea senescentei celulare.

Rezultatele acestui studiu au aratat ca inhibarea cronica a sintezei de NO cu

analogul structural al L-argininei (L-NAME) induce hipertensiune arteriala (HTA)

hamsterilor Sirieni aurii. La nivel renal HTA apare insotita de glomeruloscleroza in

stadiu incipient, fara fibroza sau depuneri de tesut hialin si fara ingrosarea membranei

bazale glomerulare, insa insotita de colapsarea capilarelor glomerulare si de fuziunea

pedicelelor podocitelor. Determinarea productiei de anioni superoxid in omogenatele

de cortex renal de la hamsterii hipertensivi vs. control a indicat cresterea cu ~ 90% a

productiei de anioni superoxid la hamsterii hipertensivi fata de cei control. Stresul

oxidativ crescut contribuie la modificarea oxidativa a proteinelor, lipidelor si ADN-ului

celular. Continutul de carbonili proteici constituie un indicator al oxidarii proteinelor in

conditii de stres oxidativ. Proteinele carbonilate pot fi implicate in senescenta celulara,

fapt dovedit recent in cazul fibroblastilor senescenti (Baraibar si colab., 2012).

Determinarea spectrofotometrica a carbonililor proteici in cortexul renal al hamsterilor

hipertensivi vs. control a dovedit cresterea modificarilor oxidative ale proteinelor la nivel

renal in grupul hamsterilor hipertensivi. Cresterea productiei de anioni superoxid si

modificarea oxidativa, prin carbonilare a proteinelor din cortexul renal al hamsterilor

hipertensivi pot contribui la inducerea senescentei celulelor glomerulare. La nivelul

celulelor glomerulare ale hamsterilor hipertensivi au fost evidentiate celule senescente,

pozitive pentru activitatea SA β-galactozidazei (SA-β-gal) la pH6.

Activarea p53 si a proteinei substrat, p21Cip1 contribuie la arestul ciclului celular in

faza G1 si inducerea senescentei celulare. In cortexul renal al hamsterilor hipertensivi si

control expresia proteica a p53 a fost crescuta la hipertensivi cu ~ 150% comparativ cu

cei control. Cresterea Exprimarea p53, a p21Cip1 si a p27Kip1 in cortexul renal al

hamsterilor hipertensivi au fost gasite crescute, ceea ce sugereaza oprirea ireversibila a

ciclului celular in faza G1, o caracteristica a senescentei celulare. Deasemenea

activarea protein kinazei AKT in glomerulii hamsterilor hipertensivi poate determina

acumularea de p53 si p21Cip1, contribuind la inducerea si stabilizarea senescentei

celulare in celulele glomerulare renale.

Asadar acest studiu a aratat ca senescenta celulara este indusa la nivelul

celulelor glomerulare in conditiile inhibarii cronice a NO, posibil datorita stresului

oxidativ crescut care activeaza calea de semnalizare intracelulara mediata de

AKT/p53/p21Cip1.

Exploatarea farmacologica a moleculelor implicate in inducerea senescentei

celulare in hipertensiune la nivel glomerular ar putea sta la baza dezvoltarii unor noi

strategii terapeutice de abordare a hipertensiunii arteriale.

In cel de-al treilea studiu, intitulat „Implicarea efectului antioxidant al

Zofenopril in restabilirea disfunctiilor glomerulare induse de inhibarea cronica a

sintezei de NO” am urmarit mecanismele moleculare asociate actiunii antioxidante a

Zofenopril la nivelul glomerilor renali, intr-un model experimental de hipertensiune

arteriala indusa cu L-NAME la sobolani Wistar. Rinichii au un rol critic in mentinerea

presiunii sanguine in limite normale, iar cresterea tensiunii arteriale duce la boala

cronica renala. Stresul oxidativ crescut reprezinta un mediator cheie in agravarea

leziunilor renale asociate hipertensiunii. Sursa principala de ROS in rinichi este NADPH

oxidaza, enzima alcatuita din doua subunitati ancorate in membrana (gp91phox si

p22phox) si patru subunitati citoplasmatice (p40phox, p47phox, p67phox si NOX; Wiliams si

colab., 2007). In functie de nivelul de ROS sunt activati diferiti factori de transcriptie

redox-senzitivi. O cantitate semnificativa de ROS declanseaza un raspuns inflamator

prin activarea NFkB si AP-1 (Reuter si colab., 2010). Zofenoprilul, un inhibitor al

enzimei de conversie a angiotensinei, care blocheaza transformarea angiotensinei I in

angiotensina II si duce la scaderea presiunii sanguine, are capacitate de chelatare a

radicalilor liberi datorita unei grupari sulfhidril libere, ceea ce ii confera proprietati anti-

oxidante. In literatura de specialitate sunt putine datele referitoare la efectele Zofenopril

la nivel renal in conditii de stres oxidativ crescut. in acest studiu experimentele au fost

efectuate folosind sobolani Wistar, masculi, in varsta de 3 luni, grupati in: 1) HT, grupul

sobolanilor hipertensivi carora li s-a administrat L-NAME (50 mg/kg corp/zi) in apa de

baut timp de 12 saptamani; 2) HTZ, grupul sobolanilor hipertensivi care au primit

L-NAME (50 mg/kg corp/zi) 12 saptamani, iar in ultimele 4 saptamani de tratament li s-a

administrat, concomitent cu L-NAME, Zofenopril (15mg/kg corp/zi); si 3) C, grupul

control format din sobolani de aceeasi varsta cu cei din grupurile HT si HTZ, carora nu li

s-a administrat L-NAME sau Zofenopril. Am investigat: a) alterarile glomerulare induse

de administrarea cronica de L-NAME sobolanilor Wistar, b) productia de anioni

superoxid si expresia subunitatilor NADPH oxidazei - ca principala sursa de O2.- in

cortexul renal de la sobolanii hipertensivi, c) modificarile oxidative ale proteinelor, prin

cuantificarea nivelelor carbonililor proteici, d) expresia subunitatilor NF-kB modulate de

speciile reactive de oxigen, si e) nivelele de glutation redus (GSH) si oxidat, precum si

activitatea glutation peroxidazei (GPx) pentru aprecierea eficientei sistemului

antioxidant intracelular, raportul GSH/GSSG fiind un indicator sensibil al starii redox.

Rezultatele studiului nostru au aratat ca:

- Administrarea de L-NAME sobolanilor Wistar (grupul HT) a determinat: 1) cresterea

presiunii arteriale si a activitatii enzimei de conversie a angiotensinei; 2) modificari

ultrastructurale ale celulelor endoteliale si podocitelor din glomerulii sobolanilor HT

(inclusiv pierderea fenestrelor, pierderea sporadica a diafragmei de filtrare a podocitelor

si uneori fuziunea pedicelelor), modificari ce afecteaza proprietatile barierei de filtrare

glomerulara; 3) cresterea productiei de O2.- la nivelul cortexului renal de la sobolanii

HT; 4) cresterea stresului oxidativ, evidentiata prin nivelele crescute ale carbonililor

proteici - ca marker de oxidare a proteinelor si prin activarea NF-kB - ca si cale de

semnalizare intracelulara redox-senzitiva in cortexul renal al sobolanilor HT;

5) scaderea capacitatii antioxidante la nivelul cortexului renal de la sobolanii HT

apreciata pe baza scaderii GSH si a diminuarii activitatii GPx .

- Administrarea de Zofenopril sobolanilor cu hipertensiune indusa cu L-NAME a avut

efect benefic asupra modificarilor ultrastructurale si a determinat redresarea catorva

componente ale stresului oxidativ: concentratia de O2.-, expresia proteica a subunitatilor

NADP(H) oxidazei (p22phox, NOX1, p47phox, p67phox), exprimarea proteica subunitatilor

NFkB p50 si, respectiv p65, precum si reducerea carbonilarii proteinelor.

In concluzie Zofenopril administrat sobolanilor cu hipertensiune arteriala

indusa cu L-NAME are efecte renoprotectoare, contribuind la scaderea stresului oxidativ

local, respectiv la atenuarea modificarilor cauzate de acesta si restabilind capacitatea

antioxidanta a sistemului glutation/glutation peroxidaza la nivelul cortexului renal.

CONCLUZII GENERALE

Imbatranirea fiziologica determina modificarea morfologica si functionala a tuturor

organelor, inclusiv a rinichilor. In ultimul deceniu fenotipului imbatranirii a fost asociat

cu acumularea in tesuturi a celulelor senescente. Componentele secretate de celulele

senescente induc alterari ale structurii si functiei tesutului, contribuind astfel la disfunctia

tisulara asociata imbatranirii.

Rezultatele obtinute in studiile noastre au dovedit prezenta celulelor senescente

la nivelul glomerulului renal la hamsterii batrani si la hamsterii cu hipertensiune arteriala

indusa prin inhibarea cronica a sintezei oxidului nitric. Experimentele efectuate pe

cortex renal de la hamsterii batrani si de la hamsterii hipertensivi sugereaza ca

senescenta celulelor glomerulare este asociata disfunctiei mitocondriale si contribuie la

atenuarea, sau disfunctia autofagiei, in special la nivelul podocitelor. Datele obtinute de

noi dovedesc faptul ca stresul oxidativ si oprirea ireversibila a ciclului celular in faza G1

sunt doua dintre etapele cheie in inducerea senescentei celulare la nivelul glomerulului

renal, atat in imbatranire cat si in hipertensiune. Mecanismele moleculare care mediaza

aceste doua procese sunt diverse si depind de contextul in care sunt activate. Activarea

supresorului tumoral redox-senzitiv p53 joaca rol cheie in medierea semnalelor de

inducere a senescentei celulare in conditii de stres oxidativ crescut. Mecanismele

celulare si moleculare implicate in inducerea senescentei celulare in celulele

glomerulului renal in imbatranire si hipertensiune nu sunt complet descifrate, de aceea

studiile cuprinse in aceasta lucrare vin in sprijinul aspectelor existente in literatura de

specialitate care abordeaza acelasi subiect.

BIBLIOGRAFIE

Baker DJ, Wijshake T, Tchkonia T, LeBrasseur NK, Childs BG, van de Sluis B, Kirkland

JL, van Deursen JM (2011). Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays

ageing-associated disorders. Nature, 479: 232–236.

Passos JF, Nelson G, Wang C, Richter T, Simillion C, Proctor CJ, Miwa S, Olijslagers

S, Hallinan J, Wipat A, Saretzki G, Rudolph KL, Kirkwood TB, et al (2010). Feedback

between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Mol.

Syst. Biol., 6: 347.

Davalos AR, Kawahara M, Malhotra GK, Schaum N, Huang J, Ved U, Beausejour CM,

Coppe J-P, Rodier F and Campisi J (2013) p53-dependent release of Alarmin HMGB1

is a central mediator of senescent phenotypes JCB 201(4): 613-629

Velarde MC, Flynn JM, Day NU, Melov S, Campisi J (2012). Mitochondrial oxidative

stress caused by Sod2 deficiency promotes cellular senescence and aging phenotypes

in the skin. AGING, 4 (1): 3-12.

Hardie DG (2011). Amp-activated protein kinase: an energy sensor that regulates all

aspects of cell function. Genes Dev., 25: 1895–1908.

Zhong W, Zou G, Gu J, Zhang J (2010). L-arginine attenuates high glucose-accelerated

senescence in human umbilical vein endothelial cells. Diabetes Res. Clin. Pract., 89:

38-45

Williams HC, Griendling BS, Griendling KK (2007). NADPH oxidase inhibitors: new

antihypertensive agents? J. Cardiovasc. Pharmacol., 50 (1): 9 – 16

Reuter S, Gupta S, Chaturvedi M, Aggarwal B (2010). Oxidative stress, inflammation,

and cancer: How are they linked? Free Radical Biology and Medicine, 49 (11): 1603–

1616.

Baraibar MA, Liu L, Ahmed EK, Friguet B (2012) Protein oxidative damage at the

crossroads of cellular senescence, aging, and age-related diseases. Oxid Med Cell

Longev, 2012: 919832