TESTY IMMUNOLOGICZNETESTY IMMUNOLOGICZNE

Istnieje wiele odmian testów immunologicznych;• wszystkie polegają na zajściu reakcji wiązania się antygenu ze swoistymi(rozpoznającymi go) przeciwciałami,• różnią się natomiast sposobem wykrywania tej reakcji.

Testy immunologiczne pośredniewykrywają immunoglobuliny, któreuprzednio związały się ze swoistymantygenem.

Opierają się one na na założeniu, że jeśliorganizm kręgowca zetknął się z konkretnymantygenem, to w surowicy tego organizmubędą się znajdywały swoiste wobec tegoantygenu przeciwciała. Ponieważimmunoglobuliny jako takie mają właściwościimmunogenne (wywołują odpowiedźimmunologiczną), można uzyskać swoisteprzeciwciała skierowane wobecimmunoglobulin innego gatunku.

Charakteryzują się większą czułością, gdyżwykorzystują naturalną zdolność układuimmunologicznego - amplifikację sygnału, jakidociera do układu immunologicznego wpostaci antygenu.

BEZPOŚREDNIEBEZPOŚREDNIE POŚREDNIEPOŚREDNIE

Testy immunologiczne bezpośredniewykrywają określony antygen przy pomocyznakowanych przeciwciał.

Antygeny wirusowe czy bakteryjne występują jednakczęsto w ustroju w bardzo niewielkiej ilości, któraznalazła by się poniżej progu detekcji. Z tego względuczęsto stosuje się testy immunologiczne pośredniewykrywające immunoglobuliny, które uprzedniozwiązały się ze swoistym antygenem.

AglutynacjaHemaglutynacjaPrecypitacjaOdczyn wiązania dopełniacza

Testy immunoenzymatyczne Testy immunofluorescencyjne IFATesty radioimmunologiczne RIA

Ag + Ab Ag + Ab WYNIK WYNIK Ag + Ab + AbAg + Ab + Ab22 WYNIK WYNIK

TESTY SEROLOGICZNETESTY SEROLOGICZNE

REAKCJA PRECYPITACJIREAKCJA PRECYPITACJI

Stężenie antygenu

Ilość

spre

cypi

tow

anyc

h p

rzec

iwci

ał

Nadmiar antygenu

Strefa równowagi

Nadmiar przeciwciał

Zachodzi pomiędzy przeciwciałami a rozpuszczalnym antygenemnp. białkiem, wyizolowanym polisacharydem bakterii itp.

Wszystkie testy przeprowadza się w obecności roztworu elektrolitów.

Precypitacja probówkowa

Przeciwciała

W miejscu wytrącania się kompleksówimmunologicznych pojawia się opalizującyprążek

Rozpuszczalnyantygen

PRECYPITACJA W ŻELUPRECYPITACJA W ŻELU

Reakcja dyfuzji radialnej wg Manciniego• służy do ilościowej oceny antygenu

• przeciwciała unieruchomione są w żelu agarowym, antygen dyfunduje

Reakcja podwójnej dyfuzji wg Ouchterlony’ego• dyfundują cząsteczki antygenu i przeciwciała

Miejsce naniesieniaroztworu antygenu

Poleprecypitacji

Miejsce naniesieniaroztworu antygenu

Miejsce naniesieniaroztworu przeciwciał

Poleprecypitacji

Pole precypitacji jest wprost proporcjonalnedo stężenia antygenu.

Znane stężenia antygenu x?

a b c x stęż

enie

ant

ygen

u

średnicax

Żel agarowyzawierający określonerozcieńczenie przeciwciał

24 h

REAKCJA PODWÓJNEJ DYFUZJI WG OUCHTERLONY’EGOREAKCJA PODWÓJNEJ DYFUZJI WG OUCHTERLONY’EGO

Pozwala określić czy badane antygeny zawierają identyczne, wspólne, czy też różnedeterminanty antygenowe.

Przeciwciała swoiste wobecokreślonego antygenu

Badanyantygen

Znanyantygen

A

A

A B + C

Szybkość dyfuzji antygenu w żelu zależy od jego wielkości(jest odwrotnie proporcjonalna do masy cząsteczki).

A

Łukprecypitacji

Przeciwciałaanty-A

Antygeny zawierają różnedeterminanty antygenowe

Antygeny zawierają identyczne determinanty antygenowe

Przeciwciałaanty-A i anty-B

A B

Antygeny zawierają wspólną determinantę antygenową

A + B

anty-B

Przeciwciałaanty-A i anty-B

anty-B

Antygeny zawierają różnedeterminanty antygenowe

Przeciwciałaanty-A, anty-B i anty-C

anty-B

anty-C

TESTY SEROLOGICZNETESTY SEROLOGICZNE

AGLUTYNACJAAGLUTYNACJA

Najbardziej efektywnymi aglutyninami są IgM.Aby doszło do porównywalnej aglutynacji antygenu z przeciwciałami IgG,potrzeba 100 lub nawet 1000 razy więcej cząsteczek IgG.

Zachodzi pomiędzy przeciwciałami a upostaciowanym antygenem.Reakcję można zaobserwować w postaci „kłaczków”.

Antygen może znajdować się na powierzchni komórek bakteryjnych, eukariotycznychlub być związany z cząstkami lateksu.

Bakteria

Przeciwciała IgM wiążą się z epitopamibakterii

HEMAGLUTYNACJAHEMAGLUTYNACJA

Erytrocyty w roztworze soli fizjologicznej tworzą zawiesinę pojedynczych komórek -nie zlepiają się. Powierzchnia jest erytrocytu naładowana ujemnie (ze względu naobecność reszt kwasu sjalowego w błonie komórkowej) i otoczona warstwą kationów.

Erytrocyty, które stosuje się w testach aglutynacji specjalnie przygotowuje się: np.traktuje się je kwasem taninowym, a następnie inkubuje z antygenem, który adsorbujesię na ich powierzchni.

Erytrocyty opłaszczone antygem często nazywa się krwinkami „uczulonymi”.

Jeśli w badanej surowicy znajdująsię przeciwciała swoiste wobec tegoantygenu, dochodzi do aglutynacjierytrocytów.

Jeśli badana surowica nie zawieraprzeciwciał swoistych wobec tegoantygenu, nie dochodzi do aglutynacjierytrocytów.

krwinkiopadająna dno

Testy wykorzystujące zjawisko hemaglutynacji:

• odczyn biernej hemaglutynacji

• test hamowania hemaglutynacji

• test Coombsa (odczyn antyglobulinowy)

stosuje się do oznaczania grupy Rh

http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/titration/fig1.html

Odczyn biernej hemaglutynacji wykorzystuje się do określania mianaprzeciwciał.

ODCZYN BIERNEJ HEMAGLUTYNACJIODCZYN BIERNEJ HEMAGLUTYNACJI

Miano przeciwciał - rozcieńczenie, przyjakim nastąpiła hemaglutynacja -wynosi 1:80

1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 K

aglutynacja brak aglutynacji

Kolejne rozcieńczenia surowicy

Miano przeciwciał w surowicywyznacza dodatnia reakcjaantygen-przeciwciało uzyskanaz najwyższym rozcieńczeniemsurowicy

W przypadku niektórych chorób np. zakaźnych i autoimmunizacyjnych określeniemiana przeciwciał w surowicy może mieć wartość diagnostyczną!Np. podwyższenie miana może wskazywać na aktywny proces chorobowy.Obecnie do oznaczenia miana przeciwciała stosuje się inne, nowocześniejsze metody.

SEROKONWERSJA - pojawienie sięw organizmie przeciwciał skierowanychprzeciwko określonemu antygenowi.

Zmiana statusu serologicznego osoby zujemnego do dodatniego.

Typowe dla zakażeń HIV, HBV.

Poziomprzeciwciał

czas

Poziomdetekcji

zakażenie

- - - - + + + +

Pacjentseronegatywny

Pacjentseropozytywny

TEST HAMOWANIA HEMAGLUTYNACJITEST HAMOWANIA HEMAGLUTYNACJI

Białka niektórych wirusów mają zdolność do zlepiania erytrocytów.

Niektóre hemaglutyninywirusowe

• hemaglutynina wirusagrypy

• hemaglutynina wirusaodry, świnki i różyczki

erytrocyty wirusy aglutynacja erytrocytów

Właściwość ta nie ma nic wspólnego z reakcjami serologicznymi,jest jednak wykorzystywana w diagnostyce - w teście hamowaniahemaglutynacji.

Erytrocyty przeciwciała wirusy nie dochodzi doneutralizujące wirusy aglutynacji erytrocytów

AGLUTYNACJA KULECZEK LATEKSOWYCHAGLUTYNACJA KULECZEK LATEKSOWYCH

Komercyjne testy aglutynacji wykorzystują kuleczki lateksu opłaszczoneantygenem lub przeciwciałami.

Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymaziepacjenta obecność antygenu.

Kuleczki opłaszczone są przeciwciałamiswoistymi wobec wykrywanegoantygenu.

Wynik pozytywny: aglutynacja

Wynik negatywny: brak antygenu = brakaglutynacji

lateks

antgen

Test aglutynacji bezpośredniej

Wykrywanie czynnikareumatoidalnego w surowicypacjenta z podejrzeniemreumatoidalnego zapaleniastawów

Kuleczki lateksu opłaszczone sąprzeciwciałami IgGskierowanymi przeciwczynnikowi reumatoidalnemu.

aglutynacja

brak aglutynacji

Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymaziepacjenta obecność swoistych przeciwciał.

Kuleczki opłaszczone są określonymantygenem.

Wynik pozytywny: aglutynacja

Wynik negatywny: brak swoistychprzeciwciał = brak aglutynacji

Test aglutynacji pośredniej

wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi:

TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNETESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE

CDC/Dr. William Cherry

Test immunoflurescencyjny. Bakterie Legionella pneumophila

Cząsteczki barwnika przyłączone są do cząsteczek immunoglobulin kowalencyjnie(poprzez grupy aminowe lizyny).

FITC

izotiocyjanian tetrametylorodaminy,po wzbudzeniu emituje kolor czerwonyTRITC

izotiocyjanian fluoresceiny,po wzbudzeniu emituje kolor zielony

bakteria

przeciwciała znakowanefluorescencyjnie

Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymaziepacjenta obecność antygenu/ bakterii.

Wynik pozytywny: fluorescencjaobserwowana pod mikroskopemfluorescencyjnym

Wynik negatywny: brak antygenu = brakfluorescencji

Test immunofluorescencyjny bezpośredni

TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNETESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE

Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie pacjenta przy pomocy znakowanychfluorescencyjnie przeciwciał immunoglobuliny, które uprzednio związały się zeswoistym antygenem. Charakteryzują się większą czułością.

Wynik pozytywny: fluorescencja obserwowana pod mikroskopem fluorescencyjnym

Wynik negatywny: brak przeciwciał = brak fluorescencji

Test immunofluorescencyjny pośredni

Diagnostyka kiły Wykrywanie autoprzeciwciałprzeciwjądrowych

(układowe schorzenia autoimmunizacyjne)

Dodajemy surowicę pacjenta

www.primer.ru/std/gallery_std/ treponema.htm

Dodajemy przeciwciałaznakowane fluorescencyjnie

przepłukujemy

T. pallidum Skrawektkanki

Krętek kiłyJądrokomórkowe

https://courses.stu.qmul.ac.uk/smd/kb/pathology/funmedpics/pathtes2.htm

ANA testJeśli pacjentbył/jest zakażonykiła, obserwuje sięświecenie krętków

Przeciwciałapacjenta

Przeciwciałapacjenta

TESTY IMMUNOENZYMATYCZNETESTY IMMUNOENZYMATYCZNE

wykorzystują reakcje enzymatyczne do uwidocznienia reakcjiimmunologicznej.Cząsteczki enzymu związane są kowalencyjnie z przeciwciałami lub z biotyną.

Po dodaniu do próbki substratu - chromogenu, enzym przekształca go w barwnyprodukt. W miejscu związania się przeciwciał pojawia się kolorowy precypitat.

Testy immunoenzymatyczne charakteryzują się większą czułością niż testy immunofluorescencyjne,ponieważ jedna cząsteczka enzymu związana z przeciwciałami może katalizować powstanie wielucząsteczek produktu.

Najczęściej stosowane enzymy:

• peroksydaza chrzanowa

• alkaliczna fosfataza

chromogen

kolorowyprecypitat

Najczęściej stosowane substraty:

• DAB

• AEC

• 4-chloro-1-naftol

Aby zwiększyć czułość reakcji immunoenzymatycznej można stosować przeciwciałaznakowane awidyną (białko jaja kurzego) lub streptawidyną (białko Streptomycesgriseus), które wykazuje silne powinowactwo do biotyny (witamina H). Enzymemznakuje się wówczas biotynę.

immunoglobulinaz cząsteczką enzymu

wykrywają antygen in situ (w tkankach) - testy immunohistochemiczne

wykrywają antygen lub przeciwciała w roztworze - test ELISA