Testarea Omg Partea III

Embed Size (px)

DESCRIPTION

ORGANISME MODIFICATE GENETIC

Text of Testarea Omg Partea III

  • 12.7. METODE ANALITICE UTILIZATE N CADRUL TEST?RII OMGTipurile de metode utilizate n mod curent pentru testarea OMG, precum si avantajele ?i

    dezavantajele celor mai utilizate dintre acestea sunt prezentate in tabelele de mai jos.

    Caracteristicile metodelor bazate pe analiza ADN-ului ?i proteinelorCaracteristica Met. bazate pe analiza proteinelor Met. bazate pe analiza ADN-

    ului

    ??urin?? n utilizare ?Medie pentru ELISA?Testele rapide sunt extrem deexpeditive

    ?Metodele bazate pe PCRprezint? o dificultate mai marepentru operator

    Complexitate tehnologic? ?Medie pentu ELISA?Foarte simpl? pentru testele rapide

    ?nalt?, mai ales pentru real-timePCR ?i microarray

    Durat? ?1-2 zile pentru ELISA; n cazulkiturilor comerciale timpul deexecu?ie este de doar c?teva ore?Cteva minute pentru testele rapide

    ?1-2 zile, n func?ie de modul ncare este conceput protocolulintegrat de testare

    Cost/prob? ? Redus ? Ridicat, n special pentru real-time PCR ?i microarray

    Versatilitate ? Anticorpii specifici sunt dificil desintetizat? n cazul ELISA se utilizeaz?aporape exclusiv kituri comerciale? n cazul testelor rapide seutilizeaz? exclusiv kituri comerciale

    ? Primeri ?i sondele sunt foarte??or de ob?inut? Ponderea cea mai mare o auprobabil protocoalele conceputen laborator? Sunt disponibile kituricomerciale ns? protocolale delucru pot fi foarte u?or modificatesau adaptate

    Utilizare pentru det.cantitative

    ? ELISA poate fi utilizat? ca metod?cantitativ?? Testele rapide au fost consideratemetode calitaitve; recent a fostintrodus primul sistem cantitativbazat pe utilizarea stripurilor

    Real-time PCR este cea maiperformant? metod? pentrutestarea cantitativ?

    Utilizare pe teren Posibil? n cazul testelor rapide. Nu este posibil?

    Aplicabilitate Poate fi analizat? o gam? larg? deproteine, dar metodele pot fi aplicate,n general, n cazul produselorproaspete ?i mai pu?in n cazul celorprocesate.

    Poate fi aplicat? chiar ?iproduselor intens procesate,moleculele de ADN fiind multmai stabile dect proteinele

    Specificitate Bun? Mai mare dect la cealalt?

  • 2O mare parte dintre probele care fac obiectul test?rilor OMG este reprezentat? de matricialimentare. Acestea se caracterizeaz? de obicei printr-un intens grad de procesare, n special sub influen?atemperaturilor ridicate (Endres, 2001). Datorit? faptului c? termostabilitatea ADN-ului este mai bun?dect a proteinelor (Anklam et al., 2002, n Taverniers et al., 2005; Gachet et al., 1999), reac?ia PCR estecea mai potivit? tehnic? pentru detec?ia, identificarea ?i cuantificarea OMG-urilor (Anklam et al., 2002, nAngonesi Brod et al., 2007; Taverniers et al., 2005; Berdal ?i Holst-Jensen, 2001).

    Aceast? tehnologie prezint? deci o sensibilitate, specificitate ?i eficien?? mai mare dect n cazultehnicilor bazate pe analiza proteinelor (Holst-Jensen et al., 2003, n Smith ?i Maxwell, 2007; Anklam etal., 2002, n Taverniers et al., 2005; Gachet et al., 1999).

    Metode disponibile pentru test?rile OMGSurse: Sisea et al. (2008); Tripathi (2005); Zafar et al. (2004); Ahmed (2002).

    Cat

    egor

    ii de

    met

    ode

    baza

    te p

    e:

    analiza fenotipica: biotesteleanaliza proteinelor (testele imunologice) Western blot

    ELISAlateral flow strips

    analiza ARN-ului (ex. NASBA)analiza AND-ului tehnici de hibridare Southern blot

    microarraytehnici de amplificare PCR clasic

    nested PCRconsensus PCRPCR multiplexreal-time PCR

    tehnici de secventieretehnici combinate (ex. PCR multiplex+microarray)

    alte principii cromatografiespectroscopiebiochipuri

    2.7.1. Detec?ia OMG-urilor cu ajutorul biotestelorDetec?ia OMG-urilor pe baza biotestelor este posibil? doar n cazul diferitelor tipuri de rezisten??

    (ex. la erbicide, insecte sau antibiotice) (Zafar et al., 2004).Testele de germinare presupun folosirea unor medii simple care con?in erbicidul sau antibioticul

    pentru care se testeaz? rezisten?a. n cazul n care erbicidul nu se adaug? n mediu, acesta va fi aplicat prinpulverizare asupra pl?ntu?elor. n condi?iile descrise, indivizii rezisten?i se vor dezvolta normal, fiindconsidera?i pozitivi din punct de vedere al prezen?ei transgenei.

    n cazul test?rii rezisten?ei la atacul insectelor, larvele speciilor ?int? sunt l?sate libere pentru a sehr?ni cu plantele provenite din lotul de semin?e testate. Se poate concluziona c? plantele sunt transgenicen cazul n care larvele nu supravie?uiesc testului.

    categorieSensibilitate Mai redus? dect cea a tehnicilor

    bazate pe analiza ADN-ului, nspecial n cazul matricilor procesate

    Cea mai mare sensibilitate oprezint? real-time PCR-ul

  • 3Aceste teste sunt u?or de aplicat, nu necesit? dotare special?, sunt relativ ieftine, dar necesit? timp?i se pot folosi doar n cazul loturilor de semin?e germinabile sau plantelor care produc astfel de semin?e.Trebuie de asemenea s? se aib? n vedere c? propriet??ile germinative pot determina ob?inerea unorrezultate eronate, iar zigo?ia caracterului transgenic nu poate fi stabilit?.

    2.7.2. Detec?ia OMG-urilor prin analiza proteinelorDintre metodele bazate pe analiza proteinelor, doar cele imunologice sunt folosite n practica

    test?rii OMG. Acestea au la baz? interac?iunea anticorp-antigen, proteina rezultat? n urma expresieitransgenei n organismul gazd? reprezentnd antigenul.

    Teoretic, testele imunologice pot fi utilizate pentru o larg? varietate de molecule ?int?. n practic?ns?, exist? trei limite majore ale acestor metode:? necesitatea prezen?ei n proba analizat? a proteinelor cu structuri ter?iare ?i cuaternare intacte; de obicei,n cazul matricilor procesate intervine denaturarea proteinelor, condi?ia neputnd fi astfel satisf?cut?;? disponibilitatea anticorpilor specifici; ace?tia sunt mult mai greu de sintetizat comparativ cu primeriiutiliza?i n cadrul metodelor bazate pe analiza ADN-ului;? posibilitatea ca ADN-ul transgenic prezent n prob? s? nu fie exprimat uniform n timp ?i n toateorganele plantei.

    Datorit? primului dezavantaj men?ionat, metodele de testare imunologice se pot utiliza, ngeneral, doar n cazul probelor proaspete sau cu grad redus de procesare (Zafar et al., 2004), iar nanalizele de rutin? se utilizeaz? exclusiv kituri comerciale.

    Exist? dou? formate ale imunotestelor, ELISA ?i teste rapide de tipul stripurilor (lateral flowstrips), care difer? n principal prin gradul de complexitate ?i performan?a rezultatelor, cele dou?caracteristici fiind invers propor?ionale.

    Tehnica ELISA este utilizat?, n general, pentru detec?ie calitativ? sau stabilirea nivelului deexpresie proteic?. Principiul ELISA cu cea mai larg? aplicabilitate n testarea OMG, sandwich ELISA,utilizeaz? un anticorp de captur?, imobilizat pe o suprafa?? solid?, ?i un anticorp de detec?ie marcat. Dac?proteina de interes (antigenul) este prezent? n extractul testat, aceasta va fi legat? de anticorpii care??ptu?esc pere?ii godeului de analiz?. Urmeaz? apoi legarea la protein? a celui de-al doilea set deanticorpi.

    n urma unei reac?ii enzimatice de culoare, anticorpii marca?i coloreaz? mediul de reac?ie, fiindastfel indicat?? ?i prezen?a proteinei transgenice. De?i ELISA poate fi utilizat? pentru cuantificare(Corbisier et al., 2005; Querci et al., 2005), n practic?, aplica?iile n aceast? direc?ie sunt foarte restrnse.Corbisier et al. (2005), Querci et al. (2005) ?i Eyquem (2004) au descris ?i demonstrat modul de utilizarea kitului GMO Food Ingredient Testing (noua denumire GMOChek RUR Soya Test) produs de StrategicDiagnostics (http://www.sdix.com) ?i validat de JRC pentru cuantificarea proteinei EPSPS n diferitefrac?iuni alimentare de soia (Lipp et al., 2002, n Corbisier et al., 2005, ?i Strategic Diagnostics, 2004) ?ialimente u?or procesate, dar nerecomndat pentru detec?ia proteinei de interes n stare denaturat?. Acestaeste probail ?i motivul pentru care rezultatele au fost negative n cazul probelor tratate termic latemperaturi ridicate (Corbisier et al., 2005).

    Stave (1999) afirm? c? detec?ia proteinelor denaturate este posibil? utiliznd anticorpiimonoclonali, dar cuantificarea r?mne n continuare foarte dificil? n cazul alimentelor procesate (Debodeet al., 2007).

    Sandwich ELISAPrincipiul metodei sandwich ELISA.Stripurile reprezint? o form? simplificat? a testului ELISA, care nlocuie?te godeurile cu

    membrane nitrocelulozice (stripul propriu-zis) n care sunt ncorpora?i anticorpi dubli, specifici proteineianalizate ?i marca?i cu un reactiv colorat.

    Testarea se face prin introducerea stripului ntr-un recipient ce con?ine extract din plantaanalizat?. Dac? proteina de interes este prezent?, aceasta va fi legat? de anticorpii specifici marca?i.

  • 4Complexul migreaz? apoi, prin capilaritate, de-a lungul membranei nitrocelulozice poroase. Pe direc?ia demigrare sunt plasate dou? zone de captur?, una pentru structurile anticorp-antigen, iar cealalt? pentruanticorpii marca?i liberi. Prezen?a celei de a doua linii (controlul pozitiv) pe membran? indic? o prob?negativ?, iar prezen?a ambelor linii indic? un rezultat pozitiv. Acest sistem ofer? rezultate calitative ndoar cteva minute, testele fiind considerate ieftine, u?or de efectuat ?i foarte potrivite pentru etapa descreening (Van Duijn et al., 2002, n Van den Bulcke et al., 2005), domeniu n care ?i-au g?sit o larg?aplicabilitate, spre deosebire de ELISA. Dup? cum s-a men?ionat mai sus, EnviroLogix a introdus recentsistemul QuickScan care, n combina?ie cu stripurile clasice, poate oferi rezultate cantitative n cazulanalizei loturilor de boabe/semin?e (Envirologix, 2009).

    Principalii produc?tori de kituri imunologice destinate test?rii OMG sunt:EviroLogix (http://envirologix.com/artman/publish/index.shtml), Strategic Diagnostics, Romer Labs(http://www.romerlabs.com/romer.htm) ?i Agdia (http://www.agdia.com).

    2.7.3. Testarea OMG bazat? pe analiza ADN-uluiReac?ia PCR clasic???i real-timeReac?ia PCR permite amplificarea selectiv?, ntr-un num?r foarte mare de copii, a unei secven?e

    ADN prezent? ntr-o propor?ie relativ redus? n cadrul unui amestec complex de fragmente ADN (Zafar etal., 2004). Analiza produ?ilor rezulta?i prin amplificare, n cadrul unei reac?ii PCR clasie, permiteformularea unei concluzii calitative (da sau nu) asupra prezen?ei OMG-urilor n proba testat?. npractic?, evaluarea ampliconilor se face, n general, prin separare electroforetic? n gel de agaroz?,marcare cu EtBr, vizualizare n preze?a luminii UV ?i compararea cu probe standard. Pentru ob?inereainforma?iilor cantitative referitoare la con?inutul de acizi nucleici este utilizat? tehnica real-time PCR.Caracteristicile acestor dou? metode, precum ?i particularit??ile care trebuie avute n vedere n contextulanalizelor OMG, vor fi prezentate n subcapitolele urm?toare.

    MicroarrayNum?rul evenimentelor de transformare la plantele de cultur? este n continu? cre?tere,

    diversificndu-se totodat?? ?i elementele genetice utilizate. Ca urmare, metodologia de detec?ie ?iidentificare folosit? n prezent se va confrunta cu o serie de probleme esen?iale. Spre exemplu,screeningul nu va mai fi posibil utiliznd doar un num?r redus (1-3) de reac?ii PCR (Xu et al., 2006). nacest context, o metodologie care s? permit? identificarea rapid? a tuturor elementelor necesare esteamplificarea PCR multiplex. Un inconvenient care apare ns? n acest caz este faptul c? metodaconven?ional? de confirmare a produ?ilor PCR (i.e. electroforeza) este mai dificil de aplicat (Demekea etal., 2002, n Xu et al., 2006; Permingeat et al., 2002; Matsuoka et al., 2002), alternativa fiind reprezentat?de microarray. Astfel, amplificarea PCR multiplex amplificarea concomitent? a mai multor secven?e?int? combinat? cu detec?ia microarray reprezint? cel mai bun candidat pentru o strategie eficient?,capabil? s? acopere o gam? ct mai larg? de secven?e ?int?? ?i care s? permit? identificarea u?oar? asecven?elor amplificate.

    Un sistem microarray include mai multe zone de reac?ie (spoturi) alc?tuite din sonde (fragmente)oligonucleotidice specifice, fiind astfel posibil? detec?ia simultan? a unui num?r foarte mare de secven?ede interes. Majoritatea aplica?iilor microarray sunt destinate analizelor de expresie genic?, identifc?riipolimorfismelor ?i genotip?rii.

    Tehnologia microarray, inclus? n clasa microsistemelor analitice, deriv? din blottinguri ?iutilizeaz? principiul clasic al hibrid?rii moleculare ntre dou? fragmente complementare. ADN-ulgenomic este izolat din proba analizat?? ?i amplificat prin PCR, iar ulterior ampliconii hibrideaz? sondeoligonucleotidice (Xu et al., 2006) ata?ate pe suporturile microscopice solide (cipuri) de sticl?, materialplastic sau silicon (Deisingh ?i Badrie, 2005). n sistemul clasic, num?rul sondelor este foarte mare, chiarde ordinul zecilor de mii, determinarea se face n urma unor reac?ii fluorimetrice sau colorimetrice, iaranaliza datelor este foarte complex?. Acest sistem permite realizarea unor economii de timp, men?inndns? ridicate precizia, specificitatea ?i reproductibilitatea (Deisingh ?i Badrie, 2005).

  • 5Reac?iile multiplex combinate cu detec?ia microarray permit determinarea simultan? a prezen?eisau absen?ei unui set mare de secven?e de interes (Xu et al., 2006; Lauter, 2001, n Deisingh ?i Badrie2005), oferind posibilitatea realiz?rii ntr-o singur? etap?, a detec?iei taxonilor, screeningului, precum ?iidentificarea evenimentelor de transformare. Cipurile ADN reprezint? probabil ?i cea mai eficient?modalitate de identificare precis? a evenimentelor de transformare care includ mai multe inserturi(stacked events) datorit? posibilit??ii de detec?ie concomitente a unui mare num?r de secven?e genice.

    Primul kit de detec?ie a OMG-urilor cu ajutorul cipurilor a fost creat de GeneScan(http://www.genescan.de/en.aspx). Un alt exemplu din aceast? categorie este DualChip GMO Kit V2.0,produs de Eppendorf (http://www.eppendorf.com/ int/?l=1&action=start). Acest kit permite testareacalitativ? simultan? pentru mai multe elemente genetice comune sau specifice diferitelor PMG-uri(Eppendorf, 2008). Aplica?ia presupune executarea a trei seturi de amplific?ri PCR multiplex (un setpentru identificarea taxonilor, care include ?apte reac?ii; un set pentru screening OMG, care includedetec?ia a 12 elemente; un set pentru identificarea OMG-urilor, care include detec?ia a 11 elemente) ?i oreac?ie de control a contamin?rii cu CaMV, urmat? de hibridarea ampliconilor marca?i (primerii utiliza?ipentru amplificare sunt biotinila?i) pe un singur cip ADN care con?ine sonde complementare acestora.Ampliconii sunt detecta?i colorimetric utiliznd principiul Silverquant, patentat de Eppendorf.

    Alte modele pentu detec?ia OMG-urilor utiliznd tehnica microarray au fostdescrise de Engel et al. (2006), Moens et al. (2005), Xu et al. (2006), Germini et al. (2004) ?i Rudi et al.(2003).

    PCR-ELISAO alt? metodologie cu capacitate mare de procesare ?i poten?ial pentru automatizare este PCR-

    ELISA (Brunnert et al., 2001, n Deisingh ?i Badrie, 2005), tehnic? ce are la baz? hibridarea specific? cuo sond? marcat? cu digoxigenin? (format ELISA) a unui produs PCR biotinilat ?i imobilizat. Detec?ia areloc dup? reac?ia colorimetric? n care este implicat? digoxigenina.Aplica?iile de acest fel sunt ns? reduse ca num?r, fiind potrivite doar pentru etapa de screening din cadrultest?rii OMG (ex. Vollenhofer et al., 1999, n Deisingh ?i Badrie, 2005, sau Petit et al., 2003). R-Biofarm(http://www.r-biopharm.com/index.php?) ofer? un astfel de kit comercial pentru detec?ia promotorului35S ?i a terminatorului nos (SureFood GMO 35S/NOS Screening) n diferite tipuri de probe (vezi R-Biofarm, 2009).

    2.7.4. Alte principii de analiz? a OMG-urilorn cazul n care compozi?ia sau structura ingredientelor derivate din PMG-uri (ex. acizi gra?i sau

    trigliceride) este modificat?, metode bazate pe cromatografie pot fi utilizate pentru detec?ia diferen?elordin profilul compozi?iei chimice (Anklam et al., 2002, n Huang ?i Pan, 2005; Zafar et al., 2004). Aceast?posibilitate a fost demonstrat? prin analiza uleiurilor ob?inute din rapi?a MG. Asfel, pentru investigareaamprentei trigliceridelor a fost utilizat? cromatografia lichid? de nalt? performan?? (high performanceliquid cromatography/HPLC) ?i ionizarea chimic? la presiune atmosferic? combinat? cu spectrometria demas? (atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry/APCI-MS), iar cuantificarea s-a f?cutcu un detector cu ionizare n flac??? (flame ionization detector/FID).

    Utiliznd spectroscopia NIR (near infrared), se pot detecta anumite modific?ri genetice carealtereaz? structura morfologic? a plantelor, f??? ns? a modifica n mod semnificativ con?inutul deproteine ?i uleiuri (ex. soia RR) (Anklam et al., 2002, n Huang ?i Pan, 2005; Zafar et al., 2004).Posibilitatea identific?rii unui con?inut redus de OMG-uri este ns? limitat?, ca ?i n cazul metodelorcromatografice.

    Alte metode de analiz? OMG, majoritatea aflate n faz? experimental? sau utilizate la scar? foarteredus?, sunt descrise de Obeid et al. (2004) ?i Garcia-Canas et al. (2004) (electroforeza capilar? cuplat?cu fluorescen?? indus? de laser), Jastrzebska et al. (2003) (wavelength-dispersive X-rayfluorescence/WDXRF), Moens et al. (2005), Mannelli et al. (2003a; 2003b) ?i Feriotto et al. (2003; 2002)(biosenzori/biocipuri) (Deisingh ?i Badrie, 2005; Huang ?i Pan, 2005).

  • 62.8. TESTAREA OMG CALITATIV? BAZAT? PE TEHNICA PCR2.8.1. Utilizarea reac?iei PCR n cadrul test?rii OMG

    Crearea reac?iei n lan? a polimerazei, de c?tre Mullis ?i colaboratorii s?i, n 1983, a revolu?ionatramurile moleculare ale biologiei ?i medicinei (Saiki et al. 1988, n Somma ?i Querci, 2004b), nainte deapari?ia acestei tehnici putnd fi ob?inute doar cantit??i infime dintr-un fragment ?int? de ADN. Reac?iaPCR permite amplificarea enzimatic? in vitro a unei regiuni specifice de ADN, localizat? ntre dou?secven?e ADN cunoscute, f?cnd astfel posibil? multiplicarea unei singure copii a fragmentului de interesn peste un milion de copii, n doar cteva ore. Tehnica PCR este esen?ial? pentru multe procedee deanaliz? molecular?: clonarea unor fragmente specifice de ADN, detec?ia ?i identificarea genelor nvederea diagnostic?rii sau investig?rii criminalistice, analiza modelelor de expresie genic?. n ultimii ani,reac?ia PCR a f?cut posibil? ini?ierea cercet?rilor n domenii noi ca: controlul autenticit??ii produseloralimentare, monitorizarea OMG-urilor, evaluarea comtamin?rii microbiologice.

    Testele calitative ofer? informa?ii referitoare la prezen?a/absen?a ADN-ului de interes din probaanalizat?. Testarea OMG calitativ? const?, de obicei, n parcurgerea mai multor etape analitice, fiecarecorespunznd unei amplific?ri PCR. Prima dintre acestea presupune detec?ia ADN-ului specific taxonuluidin care deriv? OMG-ul analizat, secven?a ?int? apar?innd n acest caz unei gene caracteristice speciei(gen? de referin??) respective. Aceast? analiz? are rolul dea elimina posibilitatea ob?inerii unor rezultate fals negative ce pot apare n cazul n care extractul de ADNnu are parametri corespunz?tori pentru amplificare. Conceptual, etapa trebuie inclus? n metodologia deevaluare a caracteristicilor ADN-ului, al?turi de alte analize specifice.

    Urmeaz? apoi screeningul, etap? n care se realizeaz? identificarea probelor ce con?in materialMG. Se face astfel o triere a probelor, fiind eliminate din etapele ulterioare ale procesului analitic cele???? con?inut transgenic. Screeningul este necesar mai ales n cazul probelor despre care nu exist?informa?ii suficiente referitoare la con?inut (i.e. taxoni/ingrediente, evenimente de transformare). Chiardac? aceste informa?ii sunt disponibile, efectuarea screeningului poate fi totu?i benefic?, putnd oferiindicii referitoare la prezen?a unor evenimente de transformare nea?teptate. ?intele pentru amplificarecorespund secven?elor celor mai frecvent utilizate elemente transgenice (ex. promotorul 35S, ternimatorulnos sau gene marker pentru selec?ie).

    n final, probele identificate pozitiv n cea de-a doua etap? vor fi testate n vederea determin?riiprecise a OMG-urilor pe care acestea le con?in, amplificnd regiuni specifice fiec?rui eveniment detransformare.

    n continuare vor fi prezentate caracteristicile metodologiei PCR ?i va fi descrismodul n care aceasta este utilizat? pentru testarea calitativ? a con?inutului MG.2.8.2. Structura ?i modul de replicare a ADN-ului

    Pentru o mai bun? n?elegere a principiilor ?i aplica?iilor PCR, structura ?i modul de replicare alacidului dezoxiribonucleic (ADN) sunt descrise n continuare, dup? Somma ?i Querci (2004b). Moleculade ADN este constituit? din dou? catene complementare, r?sucite ?i antiparalele. Fiecare dintre cele dou?catene este alc?tuit? din unit??i denumite nucleotide, unite ntre ele prin leg?turi de hidrogen. Structuraare un aspect helical cu r?sucire spre dreapta ?i este purt?toarea informa?iei genetice codificat? n secven?anucleotidelor. n celulele eucariote, nucleul con?ine cea mai mare parte a ADN-ului care reprezint? ADN-ul nuclear sau cromozomal. ADN-ul cromozomal este separat de restul celulei (citoplasma) printr-omembran? nuclear? dubl?. Pe lng? acest tip de ADN, n celulele eucariote se g?se?te ?i ADNextracromozomal, localizat la nivelul unora dintre organitele celulare (ex. mitocondrii sau cloroplaste).

    Nucleotidele, considerate elementele structurale esen?iale ale ADN-ului, sunt denumite ?idezoxinucleozid trifosfa?i (deoxynucleosid thriphpsphates/dNTPs) ?i sunt de patru feluri:? dezoxiadenozin trifosfat (deoxyadenosin triphosphate/dATP) sau adenina;? dezoxiguanozin trifosfat (deoxyguanosin triphosphate/dGTP) sau guanina;? dezoxitimidin trifosfat (deoxytimidin triphosphate/dTTP) sau timina;? dezoxicitidin trifosfat (deoxycitidin triphosphate/dCTP) sau citozina.

  • 7O nucleotid? este alc?tuit? din trei componente principale: o baz? azotat? purinic? (adenin?/Asau guanin?/G) sau pirimidinic? (citozin?/C sau timin?/T), o molecul? de zahar (dezoxiriboz?) ?i ogrupare fosfat. Baza azotat? este legat? de atomul de carbon 1 al moleculei de zahar printr-o leg?tur?glicozidic?, iar gruparea fosfat este legat? de atomul de carbon 5 printr-o leg?tur? diesteric?.

    Nucleotidele formeaz? o caten? de ADN prin legarea grup?rii fosfat a unei nucleotide cu grupareahidroxil a nucleotidei precedente. Aceasta nseamn? c? nucleotidele noi sunt ata?ate ntotdeauna la cap?tul3 al lan?ului.

    Exceptnd unele virusuri, ADN-ul este dublu-catenar, iar cele dou? catene sunt perfectcomplementare, alipindu-se foarte precis una la cealalt?. Fiecare baz? din cadrul unei catene estecomplementar? unui singur tip de baz? de pe catena opus?, formnd astfel o pereche de baze (pb): A estentotdeauna complementar? cu T, unindu-se prin dou? leg?turi de hidrogen; C este ntotdeaun? legat? deG prin intermediul a trei leg?turi de hidrogen. Astfel, cele dou? lan?uri nucleotidice sunt complementare,fiecare putnd servi ca matri?? pentru sinteza celuilalt. Bazele azotate formeaz? un nucleu hidrofob ninteriorul dublului helix, zaharurile ?i grup?rile fosfat (n form? anionic?) constituind stratul extern,hidrofil, al moleculei.

    Informa?ia genetic? complet? care define?te structura ?i func?ia unui organism este codificat? subforma (macro)moleculei de ADN. Cele trei procese responsabile de transmiterea informa?iei genetice ndescenden?? sunt:? replicarea ADN-ul dublu-catenar este duplicat pentru ob?inerea a dou? molecule identice;? transcrip?ia un segment de ADN care constituie o gen? este citit ?i transcris ntr-o secven??monocatenar? de ARN, denumit ARN mesager (ARNm); aceste molecule trec apoi din nucleu ncitoplasm?, suferind o serie de transform?ri;? transla?ia sintetizarea unei secven?e de aminoacizi pe baza moleculei de ARNm; secven?a deaminoacizi astfel constituit? reprezint? o protein?.

    Replicarea ADN-ului in vivo este procesul care st? la baza amplific?rii PCR. n timpul replic?rii,molecula de ADN se despiralizeaz?, cele dou? catene se separ???i fiecare dintre acestea devine o matri??pentru sinteza unei catene complementare noi. La finalul procesului de replicare, fiecare molecul? dublu-catenar?, compus? dintr-o caten? de ADN nou???i una veche, constituie o copie exact? a moleculei dublu-catenare ini?iale.

    n cadrul acestui proces sunt implicate mai multe enzime, ca: topoizomeraza ?i helicaza,(responsabile pentru despiralizarea ADN-ului), ADN polimeraza III (direct responsabil? de sinteza noiicatene ADN), primaza (sintetizeaz? o structur? oligonucleotidic? primerul ARN pe catena matri??),RNaza H (ndep?rteaz? primerul ARN), ADN polimeraza I (completeaz? por?iunea r?mas? liber? n urmaprimerului ARN). ADN polimeraza III ?i desf??oar? activitatea de-a lungul catenei matri??, alipindnucleotide libere la nucleotidele deja existente, pe baz? de complementaritate. Nucleotidele ad?ugateformeaz? leg?turi covalente (fosfodiesterice) cu nucleotidele aceleia?i catene, iar unirea cu nucleotidelecomplementare ale celeilalte catene este asigurat? prin intermediul unor leg?turi de hidrogen.

    ADN polimeraza are capacitatea de a ad?uga nucleotide libere doar la cap?tul 3 al unei cateneADN. De aceea, n mod conven?ional, ADN polimeraza ac?ioneaz? de la cap?tul 5 spre cap?tul 3 alcatenei matri??. n func?ie de direc?ia de replicare a moleculei de ADN (i.e. direc?ia de despiralizare ?idenaturare a dublului helix), una dintre catene (denumit? leading) este sintetizat? continuu, iar cealalt?(denumit? lagging) este sintetizat? n fragmente (denumite Okazaki). Ulterior sintezei noilor catene,ligazele catalizez? formarea unei leg?turi ntre eventualele grup?ri adiacente de nucleotide (ex.fragmentele Okazaki, n cazul moleculei formate pe baza catenei lagging, sau secven?ele ob?inute dup?eliminarea primerului ARN ?i umplerea golului r?mas n urma acestuia, n cazul moleculelor formate pebaza ambelor catene ini?iale).

    2.8.3. Principiul reac?iei PCRReac?ia PCR are la baz? mecanismul de replicare in vivo a ADN-ului ?i este utilizat? pentru

    amplificarea unei secven?e ?int? de ADN ntr-un num?r mare de copii (Kubista et al., 2006), fiind

  • 8considerat? un fotocopiator molecular (Dalgleish, 2007) sau o metodologie de xeroxare a ADN-ului(NCHGR,1992).

    Pentru ca amplificarea s? aib? loc, sunt necesare urm?toarele componente principale: doi primerioligonucleotidici care flancheaz? secven?a ADN ?int?, nucleotide libere, o polimeraz? termostabil?, ionide magneziu, o solu?ie tampon ce are rol de mediu de reac?ie. Reac?ia se desf??oar? n cadrul unui ciclurepetitiv de temperaturi.

    In prima etap? a amplific?rii PCR, temperatura nalt? are rolul de a separa cateneledublului helixde ADN. Temperatura este apoi cobort? pentru a facilita alipirea (hibridarea molecular?) primeriloroligonucleotidici la secven?a ?int?. n ultima etap?, temperatura are o valoare optim? pentru activitateapolimerazei care extinde primerii prin alipirea unor noi nucleotide, n prezen?a ionilor de Mg. n contextulamplific?rii PCR, cele trei etape constituie un ciclu individual denumit, de obicei, ciclu/pas PCR (PCRcycle/step). Dup? fiecare ciclu, catenele de ADN nou sintetizate servesc ca matri?e n ciclul urm?tor.Principalul produs al acestei reac?ii exponen?iale este un segment dublu catenar de ADN a c?rui termina?iicorespund capetelor 5 ale primerilor oligonucleotidici.

    Lungimea produsului de amplificare (amplicon) este dat? de distan?a dintre cei doi primeri.Produ?ii ciclului ini?ial de amplificare sunt ns? reprezenta?i de molecule de ADN de m?rimi diferite, a??ror lungimi pot dep??i pe cea determinat? de siturile de alipire a celor doi primeri. n ciclul doi, acestemolecule (produ?ii primului ciclu de amplificare) genereaz? catene de ADN de lungime definit? care sevor acumula exponen?ial n continuare, formnd produ?ii de reac?ie dominan?i. Num?rul final de copii (N)ale secven?ei ?int?, rezultat n urma amplific?rii poate fi exprimat prin urm?toarea rela?ie:

    N =(2n - 2n)x N0 (1)unde n reprezint? num?rul de cicluri, 2n exprim? produsul ob?inut dup? primul ciclu ?i produ?ii culungime nedefinit? ob?inu?i dup? al doilea ciclu, care pot fi neglija?i, iar N0 num?rul ini?ial de copii alesecven?ei ?int? (Somma ?i Querci, 2004b). Teoretic, dup? 20 cicluri PCR vom avea o amplificare de 220ori a ADN ?int?, dac? eficien?a de amplificare este de 100% n fiecare ciclu.

    n practica ns?, eficien?a de amplificare variaz?. Astfel, cantitatea teoretic? de produs ob?inut sepoate exprima prin ecua?ia: N =(1+ E)n x N0 (2)unde E reprezint? eficien?a de amplificare (Kubista et al., 2006).

    n continuare sunt descrise cele trei etape ale reac?iei PCR, dup? Sambrook et al. (1989) cita?i deSomma ?i Querci (2004b).

    n prima etap?, catena dubl? este denaturat? dnd na?tere ADN-ului monocatenar.Procesul trebuie s? fie complet deoarece catenele separate doar par?ial se vor realipi odat? cu

    sc?derea temperaturii, iar primerii nu vor putea ac?iona (Kubista et al., 2006).Separarea catenelor complementare se face odat? cu cre?terea temperaturii, prin ruperea

    leg?turilor de hidrogen. Pragul de temperatur? maxim este de 92-96 C, nivel la care se consider? c?reac?ia este complet???i ntreg ADN-ul dublu-catenar s-a denaturat. Nivelul temperaturii la care jum?tatedin ADN-ul dublu-catenar se g?se?te sub form? monocatenar? se nume?te temperatur? de denaturare(melting temperature/Tm) ?i este un parametru utilizat la designul primerilor ?i al protocoalelor deamplificare. Tipul de solvent, concentra?ia s?rurilor ?i pH-ul influen?eaz? procesul de denaturare. Deexemplu, n mediu de reac?ie cu con?inut redus de s?ruri, pH ridicat ?i n prezen?a solven?ilor organici (ex.formaldehid?), Tm are valoare mai redus?. Propor?ia C/G este un alt factor important care influen?eaz?Tm, aceast? valoare fiind mai mare n cazul structurilor de ADN cu con?inut mai mare de C/G.

    Temperatura ridicat? corespunz?toare etapei de denaturare asigur? de asemenea stopareareac?iilor enzimatice (ex. cele ini?iate n ciclul anterior).

    Alipirea (hibridarea) catenelor de ADN are loc odat? cu sc?derea treptat? a nivelului detemperatur?. Acest principiu st?? ?i la baza ata??rii primerilor la siturile complementare care flancheaz?secven?a ?int?. n aceast? etap?, ntre primerii prezen?i n mediul de reac?ie ?i ADN-ul matri??monocatenar leg?turile se formeaz???i se rup n mod constant. Cu ct aceste leg?turi sunt mai stabile (ex.primerii care se potrivesc perfect pe secven?a matri?? de ADN), cu att vor rezista mai mult, permi?nd

  • 9ADN polimerazei s? ?i desf??oare mai u?or activitatea. Dup? ata?area ctorva nucleotide, leg?turile devinfoarte puternice.

    Temperatura necesar? pentru alipirea primerilor depinde n principal de caracteristicile acestora.Teoretic, aceasta este cu cteva grade mai mic? dect Tm, ceea ce asigur? formarea unor structuri stabiledoar ntre primeri ?i fragmentele ?int? ntre care exist? un grad mare de omologie (complementaritate)(Kubista et al., 2006).

    Ultima etap? presupune extinderea primerilor de-a lungul secven?ei ?int? prin ad?ugarea unornucleotide libere de c?tre ADN polimeraz? (frecvent Taq AND polimeraza), n prezen?a Mg2+. Bazelecomplementare secven?ei ?int? sunt ata?ate n continuarea primerului, la cap?tul 3 al acestuia (reamintim?? polimeraza adaug? nucleotide n direc?ia 5-3, citind secven?a ?int? de la 3 la 5). Temperatura optim?de func?ionare a Taq ADN polimerazei este de aproximativ 72 C, acest nivel fiind utilizat n majoritateaprotocoalelor PCR (Kubista et al., 2006). De asemenea, pentru majoritatea experimentelor PCR, durata de30-45 secunde a acestei etape asigur? extensia complet? a fragmentului de interes, fiind necesar uninterval de timp mai lung n cazul n care lungimea secven?ei ?int? dep????te 1000 pb.

    2.8.4. Instrumentele ?i componentele necesare reac?iilor PCRDou? mari inova?ii au permis automatizarea procesului de amplificare PCR (Somma ?i Querci,

    2004b):? introducerea ADN polimerazelor termostabile, care nu sunt inactivate la temperaturi ridicate;

    astfel, cantitatea de ADN polimeraz? repartizat? ini?ial poate ac?iona de-a lungul mai multor cicluri PCR;? crearea unor blocuri de temperatur? a c?ror nivel termic poate fi crescut sau cobort rapid, n

    mod automatizat; un astfel de instrument poart? denumirea de thermal cycler sau ma?in? PCR.Parametrii ciclurilor de temperatur???i reactivii utiliza?i sunt factori critici pentru succesul reac?iei

    PCR, cele mai importante elemente care trebuie avute n vedere n acest context fiind secven?a ?int? deADN, primerii, polimeraza, solu?ia tampon, ionii de Mg, nucleotidele libere ?i num?rul ciclurilor deamplificare.

    Secven?a ?int?Teoretic, amplificarea PCR se poate desf??ura dac? exist? cel pu?in o copie intact? a secven?ei

    ?int? (Kubista et al., 2006), fiind ns? necesar un num?r mai mare de copii pentru ca detec?ia produsuluide amplificare s? fie posibil?. M?rimea acestei secven?e poate fi cuprins? ntre 0,1 (sau chiar mai pu?in ncazul amplific?rilor real-time PCR) ?i pn? la cteva kilobaze. Cantitatea total? de ADN utilizat? n modobi?nuit pentru PCR este de 0,05-10 ?g. De?i o prob? nu trebuie s? fie nalt purificat?, cum se impune ncazul altor aplica?ii (ex. secven?iere), eliminarea unor contaminan?i, ca polizaharide, polifenoli, lipide,heparin?, agen?i de chelatizare ai Mg2+, formalin? sau detergen?i, este esen?ial? pentru buna desf??urare aprocesului de amplificare.

    PrimeriiO component? foarte important? a reac?iei PCR este reprezentat? de primeri.Secven?a acestora influen?eaz? pozi?ia ?i lungimea produsului de amplificare, temperatura de

    alipire ?i cantitatea de produs ob?inut (Innis ?i Gelfand, 1994, n Somma ?i Querci, 2004b). Proiectareanecorespunz?toare a primerilor determin? ob?inerea unor cantit??i reduse de produs de amplificare doritsau chiar lipsa acestuia. Elementele importante pentru construierea primerilor sunt: lungimea, temperaturade alipire, gradul de omologie cu alte secven?e dect cea pe care dorim s? o amplific?m, gradul decomplementaritate dintre secven?elor primerilor, con?inutul G/C, secven?ele polipirimidinice (T, C) saupolipurinice (A, G), secven?a de la cap?tul 3 (Somma ?i Querci, 2004b).

    Lungimea primerilor este cuprins? de obicei ntre 16 ?i 30 nucleotide, iar cu ct aceasta este maimare, cu att alipirea (hibridarea) se realizeaz? mai greu (temperatura de alipire este mai ridicat?),specificitatea reac?iei cre?te (cu ct secven?a este mai lung?, cu att probabilitatea existen?ei unor secven?esimilare scade), iar cantitatea de produs acumulat se reduce.

    Temperatura de alipire O reac?ie PCR necesit? utilizarea unor primeri cu temperaturi de alipire(hibridare) similare. Dac? cele dou? temperaturi sunt foarte diferite, amplificarea nu se va desf??uracorespunz?tor deoarece primerul cu temperatur? de hibridare mai ridicat? se poate alipi nespecific dac?

  • 10

    nivelul de temperatur? este optim pentru cel?lalt primer, iar acesta din urm? nu va r?mne alipit latemperatura specific? primului primer, care este prea ridicat?. n practic? temperatura de alipire sedetermin? pornind de la temperatura de denaturare (Tm) men?ionat? anterior. Aceasta se poate calculautiliznd diferite formule, cea mai simpl? fiind cea conceput? de Wallace: Tm=2(A+ T)+4(G+ C) (3)unde: A, T, G, C reprezint? numarul de baze ale primerului. Aceast? formul? ofer? o valoareaproximativ?, dar destul de precis? n cazul primerilor de 18-24 baze. Rela?ia existent? ntre temperaturade alipire ?i cea de denaturare reprezint? una dintre a?anumitele black boxes ale reac?iei PCR. Regulageneral acceptat? este utilizarea unei temperaturi ini?iale de alipire cu 5 C mai mic? dect temperatura dedenaturare. De cele mai multe ori aceast? valoare nu este ns? optim?, fiind necesar? determinareaempiric? a temperaturii optime de alipire.

    Secven?a primerilor Primerii trebuie astfel ale?i nct s? aib? o secven?? complementar? unic?,cel pu?in pentru taxonul analizat, ceea ce confer? specificitate reac?iei. Dup? cum s-a men?ionat anterior,specificitatea primerilor este influen?at?? ?i de lungime, num?rul siturilor de alipire fiind mult mai micpentru un primer de 24 baze comparativ cu unul de 15 baze.

    Fiecare primer trebuie astfel proiectat nct s? nu con?in? secve?e omoloage mai lungi de treibaze, aceastea putnd cauza apari?ia unor structuri dublu-catenare de tip ac de - p?r ce mpiedic?alipirea corect?. O alt? eroare de proiectare este prezen?a regiunilor omoloage n cadrul primerilor utiliza?in aceea?i reac?ie, rezultatul fiind sporirea primer-dimerilor.

    Alipirea cap?tului 3 al primerilor este esen?ial? deoarece aceasta este partea n care polimerazava ad?uga nucleotide libere pentru sinteza noii catene. Este recomandat? includerea ct mai multor baze G?i C n aceast? regiune, prezen?a lor favoriznd o hibridare mai stabil?.

    Regiunile poli-G sau poli-C cresc probabilitatea alipirii nespecifice, iar regiunile poli-T sau poli-A sunt instabile din punct de vedere al leg?turilor complexului primer-secven??? ?int?. Cu toate acestea,trebuie evitat? nl???uirea mai multor baze de acela?i fel.

    Ideal, succesiunea nucleotidelor n cadul secven?ei primerilor trebuie s? fie ntmpl?toare, G/C s?reprezinte 50%, iar totalul bazelor s? fie de aproximativ 20. n aceast? situa?ie, Tm va fi cuprins? ntre 56?i 62 C.

    Designul primerilor se realizeaz? cu software-uri speciale, ca Primer Express, distribuit deApplied Biosystems, sau Primer3 care poate fi accesat liber (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Acesteasunt astfel concepute nc?t s? ia n considerare toate principiile amintite anterior, referitoare lacaracteristicile intrinseci ale primerului.

    Specificitatea poate fi apoi evaluat? teoretic prin determinarea omologiei secven?elor primerilorcu secven?e genomice din diverse baze de date (ex. GenBank,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html), utiliznd software-uri de tip BLAST (basic localalignment search tool) (ex. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi).

    Concentra?ia primerilor Oligonucleotidele sunt utilizate de obicei n concentra?ii de 1 ?M,suficiente pentru 30 cicluri de amplificare. Prezen?a unor concentra?ii mai mari poate cauza amplificareaunor secven?e nedorite. Dac? ns? concentra?ia primerilor n mediul de reac?ie este redus?, eficien?areac?iei PCR va sc?dea.

    ADN polimerazaMetoda conceput? de Mullis utiliza o ADN polimeraz? termosensibil?, fiind necesar? ad?ugarea

    enzimei n mediul de reac?ie naintea fiec?rei etape de extensie.Introducerea ADN polimerazelor stabile la temperaturi ridicate a u?urat mult metodologia de

    lucru, ad?ugarea enzimei dup? fiecare etap? de denaturare nemaifiind necesar?. Prima ADN polimeraz?termostabil? utilizat? a fost Taq ADN polimeraza, provenit? de la bacteria Thermus aquaticus caretr?ie?te n izvoarele termale din Yellowstone National Park, SUA, la temperaturi de aproximativ 85 C(Saiki et al., 1988, n Somma ?i Querci, 2004b).

    Datorit? mediului din care provine, Taq ADN polimeraza func?ioneaz? optim la o temperatur? de70-80 C ?i este, probabil, cea mai utilizat? polimeraz? n aplica?iile PCR.

  • 11

    Exist???i alte tipuri disponibile (ex. Pfu ADN polimeraza, provenit? de la Pyrococcus furiosus) ?ide asemenea diverse companii produc?toare pun la dispozi?ie o multitudine de versiuni ale aceleia?ienzime, modificate ?i optimizate pentru diferite aplica?ii (ex. n cazul Taq ADN polimerazei: Taq DNAPolymerase ?i HotStar Taq DNA Polymerase de la Qiagen, Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase de laFermentas, TaqDNA Polymerase nativ???i recombinant?, Platinum TaqDNA Polymerase de la Invitrogen,AmpliTaq DNA Polymerase ?i AmpliTaq Gold DNA Polymerase de la Applied Biosystems, GoTaq FlexiDNA Polymerase de la Promega).

    Nucleotidele libereNucleotidele libere reprezint? elementele de baz? pentru sinteza ADN-ului.Concentra?ia acestora trebuie s? fie cuprins? ntre 20 ?i 200 ?M pentru fiecare din cele patru

    tipuri, n propor?ii echivalente, pentru a reduce erorile de ncorporare n moleculele nou sintetizate (Inniset al., 1988, n Somma ?i Querci, 2004b). Nucleotide nalt purificate sunt furnizate ?i utilizate ca stocuri,de obicei n amestec.

    Solu?ia tampon ?i ionii de MgDe?i nu particip? direct la desf??urarea reac?iei de polimerizare, prezen?a unei solu?ii tampon n mediul deamplificare este indispensabil?, aceasta avnd rolul de a asigura un mediu optim, din punct de vederechimic, pentru activitatea ?i stabilitatea ADN polimerazei. Compozi?ia solu?iei tampon este optimizat?pentru enzima c?reia i este destinat?, cei doi reactivi fiind comercializa?i sub form? de pachet. Cele maiutilizate solu?ii tampon con?in 10 mM Tris, pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5-2,5 mM MgCl2. Acestorcomponente li se mai pot ad?uga ?i alte substan?e, ca PVP, BSA sau glicerol, adjuvan?i ce au rolul de ambun????i modul n care decurge amplificarea.

    Prezen?a cationilor divalen?i de Mg este de asemenea esen?ial? pentru desf??uarea amplific?rii,concentra?ia optim? determinndu-se empiric pentru fiecare protocol n parte. Ace?tia se reg?sesc subform? de s?ruri (de obicei MgCl2) concentra?ia final? fiind cuprins?, n general, ntre 0,5 ?i 5,0 mM. Ioniide Mg ndeplinesc urm?toarele roluri:? formeaz? un complex solubil cu nucleotidele, esen?ial pentru ncorporarea acestora n catena de ADN;? stimuleaz? activitatea polimerazei;? ridic? temperatura de denaturare a complexului primer-secven????int?, conferindu-i stabilitate.

    n general, o concentra?ie redus? de Mg2+ are ca rezultat acumularea n cantit??i reduse aprodusului de reac?ie, n timp ce concentra?ia ridicat? de Mg2+ favorizeaz? acumularea produ?ilornespecifici. Pentru ca ionii de Mg s? fie activi n timpul reac?iei, trebuie evitat? prezen?a n solu?ia ADN aunor cantit??i ridicate de agen?i de chelatizare (ex. EDTA) sau gup?ri ionice nc?rcate negativ (ex. fosfa?i).

    Num?rul ciclurilor de amplificareNum?rul ciclurilor necesare pentru producerea unei cantit??i detectabile de amplicon depinde n

    principal de concentra?ia ini?ial? a secven?ei de ADN ?int?. Pentru amplificarea a 50 copii, Innis ?iGelfand (1990) recomand? 40-45 cicluri PCR, n timp ce doar 25-30 cicluri sunt suficiente pentruamplificarea a 3x105 molecule (Somma ?i Querci, 2004b). Aceast? dispropor?ionalitate se datoreaz?efectului de plafonare (platou), care implic? modificarea ratei de acumulare a produsului PCR n ultimelecicluri ale amplific?rii. Plafonarea este cauzat? de degradarea reactivilor (ex. enzime sau nucleotide),consumarea acestora (ex. primeri n cazul produ?ilor scur?i sau nucleotide n cazul produ?ilor lungi) saude concuren?a produ?ilor nespecifici pentru reactivi. Datorit? acestui fenomen, m?rirea num?rului decicluri peste anumie valori nu reprezint? o solu?ie.

    De aceea, n cazul n care produsul de interes nu este ob?inut dup? 30-40 cicluri PCR serecomand? efectuarea unei reamplific?ri, utiliznd o parte (i.e. aproximativ 1 ?l) din produsul deamplificare ?i un nou amestec de reac?ie.

    2.8.5. Reac?ii PCR specializatePe lng? reac?ia PCR tipic?, descris? anterior, au fost create variante destinate unor aplica?ii

    specifice: nested PCR, touch-down PCR, real-time PCR (rt-PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR),consensus PCR, PCR multiplex, colony PCR, hot-start PCR, inverse PCR, PCR RAPD, PCR AFLP etc.

  • 12

    Unele metodologii de testare OMG calitativ? sunt bazate pe protocoale nested PCR, n timp cereal-time PCR este tehnica cea mai utilizat? pentru cuantificarea acizilor nucleici. Reac?iile multiplex potfi utilizate att n etapa de analiz? calitativ?, ct ?i n cea de cuantificare.

    n continuare sunt descrise principiile metodei nested PCR ?i a reac?iilor multiplex.Nested PCRUn experiment de tip nested PCR presupune utilizarea unui set de primeri localizat ntre al?i doi

    primeri pereche, de-a lungul aceluia?i fragment de ADN. ntr-o prim? reac?ie se realizeaz? amplificareacu primerii externi, urmat? de amplificarea cu ceilal?i doi primeri (Somma ?i Querci, 2004b). Deoarecefragmentul mai lung, amplificat n prima etap?, este utilizat ca matri?? n cadrul celei de-a doua reac?ii,metoda se caracterizeaz? printr-o mare sensibilitate ?i specificitate (Zimmermann et al., 1998, nAngonesi Brod et al., 2007; Somma ?i Querci, 2004b). Sensibilitatea cre?te datorit? reamplific?rii regiuniide interes, iar sporirea specificit??ii se bazeaz? pe probabilitatea extrem de redus? ca eventualelefragmente amplificate nespecific n prima etap? s? fie amplificate nespecific ?i n cea de-a doua reac?ie. Adoua reac?ie poate fi considerat? o strategie de confirmare a identit??ii produsului PCR. Sensibilitatea??rit? a acestei tehnici este ns? susceptibil? poten?ialelor contamin?ri care pot apare n timpul execut?riiprotoculului. Trebuie deci acordat? o aten?ie deosebit? acestui aspect, mai ales n cazul laboratoarelor detestare.

    Aceast? tehnic? a fost foarte apreciat? pentru avantajele pe care le prezint?, majoritatea primerilorconcepu?i la sfr?itul anilor 1990 pentru detec?ia OMG-urilor fiind inclu?i n astfel de protocoale. O mareparte dintre ace?tia sunt utiliza?i ?i ast?zi n practica test?rii OMG. Singurul neajuns al acestei abord?rieste reprezentat de necesitatea execut?rii a dou? reac?ii de amplificare, ceea ce nseamn? un consumsuplimentar de timp ?i materiale.

    PCR multiplexPCR-ul clasic presupune utilizarea unei singure perechi de primeri n cadrul unei reac?ii, avnd ca

    rezultat ob?inerea unui singur amplicon specific. n cadrul unei reac?ii PCR multiplex sunt utilizate maimulte perechi de primeri, fiind amplificate simultan mai multe secve?e ?int?. Acest tip de aplica?ie s-adezvoltat n ultimii ani, mai ales dup? introducerea unor noi tipuri de polimeraze (Germini et al., 2004).Prezen?a mai multor perechi de primeri n acela?i mediu de reac?ie determin? sporirea probabilit??ii deapari?ie a hibrid?rilor nespecifice ?i a construc?iilor primer-dimer, amplificarea preferen?ial? afragmentelor de ADN mai scurte (Atlas ?i Bey, 1994, n Somma ?i Querci, 2004b), precum ?i reducerealimitelor de detec?ie (Germini et al., 2004), f?cnd destul de dificil? optimizarea protocoalelor de acesttip. Cu toate aceastea, metoda genereaz? mult mai mult? informa?ie, ntr-un timp mai scurt ?i cu costurimai reduse dect amplific?rile PCR clasice (singleplex) (Germini et al., 2004).

    Perechile de primeri trebuie s? aib? temperaturi de alipire ct mai apropiate. Este de asemeneanecesar ca lungimea fragmentelor amplificate s? fie similar?, cele mai scurte fiind amplificatepreferen?ial. n ceea ce prive?te validarea teoretic? a secven?elor primerilor, aceast? poate fi f?cut? cuajutorul unor software-uri ca Oligos (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm), iarefectele eficien?elor diferite de amplificare pot fi compensate prin ajustarea empiric? a concentra?iilorprimerilor. Utilizarea solu?iilor tampon cu aditivi speciali reduc de asemenea problemele generate deprezen?a unui num?r mai mare de primeri.

    Alte surse reprezentative pentru aceast? tem? sunt Zhang et al. (2007), Engel et al., (2006), Fotiet al. (2006), Xu et al. (2006), Forte et al. (2005), Onishi et al. (2005), Hernndez et al. (2004a, 2004b,2003) ?i Matsuoka et al. (2002).

    2.8.6. Identificarea contamin?rii, validarea ?i interpretarea rezultatelorReac?ia PCR are o larg? aplicabilitate n practica ?tiin?ific?, fiind utilizat? ca tehnic? analitic? sau

    preg?titoare. Datorit? sensibilit??ii metodei, contaminarea cu ADN, chiar ?i n cantit??i foarte reduse,poate duce la ob?inerea unor rezultate incorecte. Acest aspect trebuie s? constituie ngrijorarea principal?n cadrul laboratoarelor de testare (Querci et al., 2005). Este de aceea necesar ca setarea reac?iei s? sedesf??oare ntr-un mediu lipsit de ampliconi proveni?i din alte reac?ii PCR, ADN rezultat din preg?tireaprobelor anterioare sau substan?e rezultate n urma proceselor de decontaminare (Somma ?i Querci,

  • 13

    2004b). Primele dou? tipuri de agen?i produc contaminare de tip carry-over, determinnd apari?iarezultatelor fals pozitive, iar a treia categorie constituie substan?e inhibitoare ce favorizeaz? ob?inerearezultatelor fals negative. Un alt tip de erori care trebuie evitat este contaminarea ntre probe analizate nparalel (contaminare ncruci?at?/cross-over contamination), care determin? de asemenea apari?ia unorrezultate fals pozitive.

    Existen?a spa?iilor de lucru separate fizic, dotate cu echipament dedicat, reduce risculcontamin?rii, iar respectarea strict? a normelor de decontaminare este o condi?ie esen?ial? pentrureducerea ratei de apari?ie a rezultatelor fals pozitive. Roth et al. (1997), cita?i de Somma ?i Querci(2004b), recomand? de asemenea ndeplinirea anumitor cerin?e de rutin? referitoare la organizarea ?idesf??urarea activit??ilor, menite s? asigure men?inerea unui mediu adecvat de lucru pentru orice sistemde analiz? care are la baz? reac?ia PCR, indiferent de num?rul probelor procesate.

    Sursele poten?iale de contaminare pot fi u?or ntlnite n laborator (ex. probele analizate,personalul, instala?ia de aer condi?ionat, echipamentele sau reactivii), motiv pentru care este necesar?utilizarea probelor de control, pozitive ?i negative. Acestea sunt necesare pentru a eviden?ia prezen?acontaminan?ilor, dac? ace?tia exist?? ?i pentru a evalua (valida) corectitudinea rezultatelor ob?inute.Probele de control pentru analize OMG, specifice nc? din etapa de preg?tirea a probelor ?i pn? la cea decuantificare, sunt prezentate n continuare conform SR EN ISO 24276:2006:? prob? de control pentru mediul de lucru (environmental control/E); utilizarea acestui tip de control esterecomandat? ncepnd cu etapa de preg?tire (omogenizare) a probei ?i are rolul de a identifica prezen?acontaminan?ilor n mediul de lucru (ex. aerul din labortor); proba const? dintr-un tub con?innd ap? liber?de acizi nucleici, care este l?sat deschis n mediul de lucru pe tot parcusul procesului de analiz?;? prob? neutr? de control a extrac?iei (extraction blank/B); controlul are caracter obligatoriu, ncepnd cuetapa de extrac?ie a ADN-ului; n acest tip de prob?, materialul biologic este nlocuit cu ap? liber? de acizinucleici, urm?rindu-se evaluarea prezen?ei/absen?ei contamin?rii ncruci?ate n timpul etapei de extrac?ie;n fiecare serie de extrac?ii trebuie inclus? cel pu?in o astfel de prob? de control;? prob? pozitiv? de control a extrac?iei (positive extraction control/P) este de asemenea obligatoriencepnd cu etapa de extrac?ie; indic? dac? reactivii utiliza?i pentru extrac?ie func?ioneaz? corespunz?tor?i dac? extrac?ia a fost executat? n mod corect; n acest scop se utilizeaz? o prob? care con?ine n modsigur fragmentul de interes; aceast? prob? trebuie utilizat? periodic, precum ?i la schimbarea stocului desolu?ii de lucru;? prob? pozitiv? de control pentru ADN-ul ?int? (positive DNA target control/C+); controlul esteobligatoriu, ncepnd cu etapa PCR, pentru a verifica eficien?a procedurii de amplificare a secven?ei ?int?;proba de control este constituit? din ADN extras dintr-un MRC pentru secven?a de interes sau dintr-oprob? cunoscut? pozitiv?; acest tip de prob? poate fi nlocuit? sau poate nlocui proba pozitiv? de controla extrac?iei (P);? prob? negativ? de control pentru ADN-ul ?int? (negative DNA target control/C-); acest tip de controlare caracter obligatoriu ncepnd cu etapa de amplificare a ADN-ului; demonstreaz? capacitateaprocedurii de a nu produce rezultate fals pozitive n lipsa secven?ei ?int?, utilizarea fiind ns? justificat?doar n etapa de validare a metodei; proba se ob?ine dintr-un MRC care nu con?ine secven?a de interes saudintr-o prob? cunoscut? negativ?;? prob? de control a reactivilor (amplification reagent control/NTC); utilizarea acestei probe de controleste necesar? din etapa PCR; are rolul de a verifica contaminarea cu acizi nucleici a reactivilor utiliza?ipentru PCR; poate fi nlocuit? de proba neutr? de control a extrac?iei; proba de control include to?ireactivii necesari, mai pu?in extractul de ADN care este nlocuit de un volum corespunz?tor de ap? liber?de acizi nucleici;? prob? de control a inhibi?iei reac?iei PCR (PCR inhibition control/I); se utilizeaz? ncepnd cu etapa deamplificare, avnd rolul de a confirma absen?a/prezen?a inhibitorilor ce pot afecta eficien?a amplific?rii;controlul inhibi?iei poate fi f?cut prin analiza real-time PCR a unei dilu?ii seriale a extractului; o alt?strategie o reprezint? utilizarea unui control extern, ntnlnit n literatura de specialitate sub denumireaspike; n aceast? situa?ie, extractul analizat este amestecat cu o solu?ie pozitiv? pentru secven?a de

  • 14

    interes, care reprezint? practic controlul pozitiv extern; uneori, controlul pozitiv extern poate fi ad?ugatnaninte de extrac?ie, caz n care este reprezentat de o matrice (ex. f?in?).

    Interpretarea rezultatelor test?rii OMG calitative se face pe baza profilului ob?inut prin separareaelectroforetic? a produ?ilor PCR. M?rimea ampliconilor separa?i este estimat? cu ajutorul unei solu?ii deADN standard (DNA marker, DNA ladder) care con?ine fragmente de m?rimi cunoscute. n cazul n careprofilul electroforetic al probei prezint? o band? a c?rei m?rime este aproximativ cea a?teptat?, se poateconcluziona c? banda este cea c?utat?, iar proba este pozitiv?. Validarea rezultatelor presupunendeplinirea urm?toarelor condi?ii:? proba de control pentru mediul de lucru (E), proba neutr? de control a extrac?iei (B), proba negativ? decontrol pentru ADN-ul ?int? (C-) ?i proba de control a reactivilor (NTC) nu trebuie s? prezinte bandaspecific? corespunz?toare ampliconului pe care dorim s?-l detect?m; pot fi prezente benzi scurtecorespunz?toare structurilor primeri-dimer;? proba pozitiv? de control a extrac?iei (P), proba pozitiv? de control pentru ADN-ul ?int? (C+) ?i probade control a inhibi?iei reac?iei PCR (I) trebuie s? prezinte banda corespunz?toare secven?ei ?int? pe caredorim s? o detect?m;? repeti?iile corespunz?toare aceleia?i probe trebuie s? prezinte rezultate identice.

    n cazul n care exist? neconcordan?e ntre probele de control, analiza trebuie considerat?neconcludent? (SR EN ISO 24276:2006).

    Un aspect important, care reiese ?i din cele prezentate anterior, este faptul c? o parte din probelede control, n special cele pozitive, pot fi reprezentate de materiale de referin?? (certificate). Utilizareamaterialelor de referin?? constituie o parte esen?ial? a procedurilor de control al calit??ii. Trebuie re?inut c?n scopul valid?rii rezultatelor nregistrate, utilizarea probelor de control ?i a materialelor de referin?? esteindispensabil? (el et al., 2006; Querci et al., 2005).

    n cazul n care specificul experimentelor impune o confirmare foarte precis? a rezultatelorob?inute prin electroforez?, se pot aplica diferite metode, ca: analiza de restric?ie a produ?ilor PCR,Southern blotting-ul, secven?ierea produ?ilor PCR cea mai sigur? cale de confirmare a autenticit??iiacestora.

    2.9. TESTAREA OMG CANTITATIV? BAZAT? PE TEHNICA REAL-TIMEPCR2.9.1. Introducerea analizei real-time PCR

    Caracterul cantitativ al metodei real-time PCR este conferit de posibilitatea stabilirii unei corela?iidirecte ntre cantitatea produsului de amplificare acumulat ?i num?rul ini?ial de copii ale moleculei ?int?(Weighardt, 2004). Particularit??ile reac?iei PCR conven?ionale nu permit realizarea unei astfel decorela?ii, principala cauz? fiind eficien?a defectuoas? a amplific?rii, care nu este constant? ntre diferitelereac?ii, dar mai ales ntre ciclurile aceleia?i reac?ii (Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004). Aceast? limit?a fost dep??it? n 1992, de c?tre Higuchi ?i colaboratorii s?i, care au ini?iat analiza cineticii reac?iei deamplificare prin crearea metodei real-time PCR, capabil? s? detecteze produ?ii de amplificare odat? cuformarea ?i acumularea acestora (Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004). Sistemul de analiz? n timp realfolosea EtBr pentru detec?ia ADN-ului ?i un thermal cycler adaptat s? iradieze mediul de reac?ie culumin? UV ?i s? nregistreze fluorescen?a emis? de fluorocrom. Excita?ia moleculelor de EtBr ?inregistrarea fluorescen?ei se realizau la sfr?itul fiec?rui ciclu de amplificare, dup? etapa de extensie.Valoarea intensit??ii fluorescente nregistrate ?i num?rul ciclurilor PCR au fost introduse ntr-un graficcare a oferit o imagine a procesului de amplificare, prezentnd acumularea produsului de amplificare nfunc?ie de timp.

    Metodologia real-time PCR utilizat? ast?zi este o mbun????ire a tehnicii ini?iale create de Higuchiet al. ?i reprezint? cea mai performant? strategie de cuantificare a acizilor nucleici (Cankar et al., 2006;Miraglia et al., 2004, ?i Anklam et al., 2002, n Engel et al., 2006; Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004;Alary et al., 2002). Pe lng? precizia cuantific?rii, a crescut ?i capacitatea de analiz?, iar inciden?a erorilor?i a rezultatelor fals pozitive este mult redus? (Cankar et al., 2006; Alary et al., 2002). Deoarece

  • 15

    amplificarea ?i detec?ia sunt combinate ntr-o singur? analiz? (sistem nchis), riscul de contaminare estede asemenea redus. Tehnica este utilizat? n special pentru detec?ia patogenilor, analiza expresiei genice,analiza polimorfismului determinat de o singur? nucleotid? (single nucleotide polymorphism/SNP),analiza abera?iilor cromozomiale etc. Real-time PCR este de asemenea cea mai utilizat?? ?i mai precis?metod? de cuantificare a con?inutului MG al diferitelor materii prime sau procesate de origine vegetal?destinate consumului alimentar al oamenilor sau animalelor (Cankar et al., 2006; SR EN SO 21570:2006,Kubista at al., 2006; Deisingh ?i Badrie, 2005).2.9.2. Principiul real-time PCR

    Tehnica real-time PCR utilizeaz? primeri specifici pentru amplificarea secven?ei ?int?, iar ntandem cu ace?tia, construc?ii oligonucleotidice speciale sau alte tipuri de molecule incluse n mediul dereac?ie indic? acumularea produsului PCR (Burns et al., 2004). Astfel, de-a lungul mai multor cicluri deamplificare, construc?iile oligonucleotidice care sunt de asemena specifice secven?ei ?int?, vor determinamodificarea semnificativ? a semnalului fluorescent (Burns et al., 2004). Detaliile referitoare la acestemolecule vor fi prezentate n subcapitolul 2.9.9.

    Teoretic, n cadrul amplific?rii, acumularea produ?ilor PCR se desf??oar? exponen?ial. n practic?ns?, reac?ia nu atinge niciodat? eficien?? maxim?. Mai mult, dup? 30-40 cicluri de amplificare intervinefenomenul de plafonare (Ahmed, 2002) care afecteaz? reac?iile n mod independent ?i diferit.

    n cadrul reac?iei PCR conven?ionale, determinarea este f?cut? ntr-un singur punct la sfar?itulamplific?rii (determinare end-point). De aceea propor?ionalitatea ntre cantitatea final? de ampliconi ?icea ini?ial? de copii ale secven?ei ?int? este redus?, nefiind posibil? cuantificarea. S-a demonstrat totu?iempiric, c? aceast? propor?ionalitate exist? n timpul fazei exponen?iale a amplific?rii, nainte s? intervin?plafonarea. Astfel, dac? se cunoa?te num?rul de cicluri necesare pentru atingerea unei anumiteconcentra?ii a moleculei ?int?, num?rul ini?ial de copii ale acesteia poate fi determinat cu precizie. Pentrucalcularea concentra?iei moleculei de interes ntr-o prob? necunoscut? este necesar? utilizarea unei curbede calibrare (denumit?? ?i curb? standard) (Burns et al., 2004) ob?inut? prin analiza unui set decalibratori (probe standard) (Taverniers et al., 2005) reprezentat de probe al c?ror num?r ini?ial de copiiale secven?ei ?int? este cunoscut.

    Att n cazul probelor standard, ct ?i al celor necunoscute, monitorizarea acumul?rii produ?ilorde reac?ie odat? cu desf??urarea amplific?rii se face prin nregistrarea emisiei fluorescente a unorsubstan?e speciale aflate n mediul de reac?ie.

    Este evident c? ntre semnalul fluorescent ?i cantitatea de ampliconi forma?i exist? o rela?ie depropor?ionalitate direct?, ambele crescnd odat? cu num?rul de cicluri de amplificare (Kubista et al.,2006; Grove, 1999, n Burns et al., 2004). Concentra?iile ini?iale ale moleculei ?int???i numerele ciclurilorPCR sunt apoi utilizate pentru construirea curbei standard care reprezint? de fapt o regresie liniar?(concentra?ia moleculei ?int? reprezint? varibila independent?, iar valoarea num?rul ciclurilor PCR estevariabila dependent?). Trebuie remarcat c? n ciclurile ini?iale semnalul generat este slab ?i nu poate fideosebit de semnalul de fond (background signal/fluorescence). Odat? cu acumularea unei cantita?i maimari de produs semnalul cre?te semnificativ, ridicndu-se deasupra celui de fond. Din acest momentacumularea produsului de amplificare este evident?, putndu-se face colectarea datelor pentru analizacantitativ?.2.9.3. Eficien?a amplific?rii n analizele real-time PCR

    Eficien?a reac?iei PCR este exprimat? ca rat? de amplificare a c?rei valoare teoretic? este 2, ceeace nseamn? c? num?rul de copii ale unui amplicon este dublat n fiecare ciclu PCR (Moens et al., 2005).n cazul unei eficien?e de 100%, raportul dintre num?rul ini?ial al copiilor secven?ei ?int? n dou? probediferite este dat de formula: N0A/N0B= 2(CTB-CTA) (4)unde N0A? ?i N0B reprezint? numerele ini?iale de molecule ?int? din probele A, respectiv B, iar CTA ?i CTBsunt valorile CT (cycle threshold) corespunz?toare acestora. Deocamdat?, valoarea CT trebuie n?eleas? caun interval de timp ce reprezint? un num?r de cicluri de amplificare. Dup? cum s-a men?ionat nsubcapitolele anterioare, semnalul fluorescent al unei probe este determinat de produsul de amplificare,

  • 16

    fiind direct propor?ional cu cantitatea acestuia. Astfel, presupunnd c? proba A atinge acela?i nivel alfluorescen?ei, respectiv pragul limit? (threshold value), cu patru cicluri mai trziu dect proba B, adic? arenevoie de patru cicluri de amplificare adi?ionale, putem conchide c? proba A con?inea ini?ial de 16 ori(2x2x2x2) mai pu?ine molecule ?int? dect proba B.Trebuie subliniat faptul c? semnalul probei cu mai pu?ine molecule va atinge mai trziu valoarea pragului,dup? parcurgerea mai multor cicluri de amplificare. n practic? ns?, reac?ia PCR nu este perfect?, fiindnecesar? introducerea n ecua?ia 4 a eficien?ei de amplificare (E):

    N0A/N0B=(1+E)(CTB-CTA) (5)Presupunnd c? reac?ia PCR are o eficien?? de 90%, valoare tipic? pentru probele biologice,

    diferen?a de patru cicluri ntre dou? curbe de amplificare reflect? un raport de (1 + 0,9)4 = 13 ntre valorileini?iale num?rului de copii ale secven?ei ?int? din probele A ?i B.

    n cazul unei singure probe, ecua?ia 5 devine: Nn/N0=(1+E)n (6)

    unde N0? ?i Nn reprezint? num?rul ini?ial de molecule ?int?, respectiv num?rul de molecule ?int? dup? ncicluri de amplificare.

    Pentru estimarea eficien?ei amplific?rii este utilizat? tot curba standard, amintit? n subcapitolulanterior. Aceasta este construit? ntr-un grafic n care sunt reprezentate valorile CT (ob?inute prinamplificare) aferente probelor standard n func?ie de logaritmul concentra?iei num?rului ini?ial de copii alesecven?ei ?int? sau logaritmul factorului de dilu?ie (Applied Biosystems, 2001). Pentru fiecare curb?standard este calculat?? ?i ecua?ia de regresie asociat? care descrie rela?ia dintre variabilele x (i.e.logaritumul concentra?iei secven?ei ?int?) ?i y (i.e. CT): y = M ? x +B (7)unde M este panta curbei standard (dreapta de regresie), iar B reprezint? intersec?ia dreptei de regresie cuaxa OY. Din ecua?ia de regresie reiese urm?toarea egalitate: CT = M ? log(N0) +B (8)n cazul unei probe cu o singur? copie a moleculei ?int? ecua?ia (8) devine: CT = M ? log(1) +B (9)

    Logaritmul din 1 este 0 indiferent de baz?, deci CT este egal cu B.Panta unei reac?ii poate fi utilizat? pentru a determina eficien?a reac?iei ?i exponentul/factorul

    amplific?rii (F): F=10-1/M (10) E=10-1/M -1 (11)2.9.4. Cuantificarea OMG-urilor

    Prin testarea OMG cantitativ? materialul transgenic dintr-o prob? nu poate fi exprimat dectprocentual, sub forma raportului dintre cantitatea de ADN MG ?i cea de ADN total corespunz?tortaxonului analizat (Vatilingom et al., 1999). Pentru fiecare prob? este astfel necesar? cuantificarea ADN-ului MG n paralel cu cea a ADN-ului specific taxonului (Burns et al., 2004; Hernndez et al., 2004b), aldoilea tip avnd rol de referin??. Strategia asigur? normalizarea intern? (normalizarea la nivelul probei),precum ?i normalizarea intra- ?i interdetermin?ri, deoarece ia n calcul posibila degradare a ADN-ului sauprezen?a inhibitorilor, factori care, teoretic, afecteaz? n egal? m?sur? cele dou? sisteme PCR. Totu?i,acest? ipotez? nu a fost demonstrat?.

    Secven?a de referin?? corespunde unei gene (denumit? endogen?) care trebuie s? ndeplineasc?urm?toarele condi?ii:? s? fie specific? taxonului;? s? fie prezent? print-o singur? copie la nivelul genomului haploid;? s? fie reprezentat? stabil n diferite linii ale aceleia?i specii;? s? aib? aceia?i parametri de amplificare ca secven?a transgenic?, cerin?? care depinde ns? foarte mult ?ide modul n care este conceput experimentul.

    Exist? cteva aspecte referitoare la modul de exprimare a con?inutului procentual de OMG-uri,care trebuie men?ionate. n primul rnd, prin Regulamentele 1829/2003 ?i 1830/2003 a fost stabilit pragul

  • 17

    con?inutului procentual de OMG-uri ce trebuie avut n vedere pentru aplicarea etichet?rii, respectiv 0,9%,la nivel de ingredient. Ini?ial, nu a fost ns? indicat? nicio unitate de m?sur? pentru acest prag,implementarea prevederilor legislative referitoare la etichetare fiind astfel problematic? (Moens et al.,2005). Ie?irea din acest impas s-a f?cut odat? cu introducerea Recomand?rii 2004/787/EC. Aceastadefine?te procentul de ADN MG ca fiind raportul dintre num?rul copiilor de ADN MG ?i num?rulcopiilor de ADN specific taxonului ?int?, calculat la nivel de genom haploid.

    Se face de asemenea precizarea c? procentul de ADN MG amintit anterior s? fie utilizat pentruexprimarea rezultatelor analizelor cantitative. n acest context, inconvenientul este determinat de naturacalibratorilor ?i a materialelor de referin?? utilizate pentru cuantificare, elemente care intervin nasigurarea trasabilit??ii ?i validarea metodelor. Mai multe considerente referitoare la toate aceste aspectevor fi prezentate ntr-unul dintre subcapitolele urm?toare (2.9.7).2.9.5. Analiza grafic? a datelor experimentale

    Odat? cu desf??urarea amplific?rii n cadrul unui sistem real-time PCR, semnalul fluorescent dinmediul de reac?ie este m?surat, iar pe baza acestor date se va realiza o reprezentare grafic? a acumul?riiprodu?ilor PCR n func?ie de num?rul ciclurilor de amplificare. Scala pentru fluorescen?? poate fi normal?sau logaritmic?, cea de-a doua facilitnd distingerea celor trei faze ale amplific?rii:? faza ini?ial?, n care intensitatea fluorescen?ei variz? foarte pu?in, corespunznd semnalului de fond;? faza liniar?, n care reac?ia se desf??oar? exponen?ial iar acumularea ampliconilor este evident?;? stadiul de platou (plafonare), n care rata amplific?rii se reduce considerabil.

    Pragul limit? reprezint? punctul de echivalen?? pentru toate reac?iile incluse ntr-o analiz?. Dup?Vatilingom et al. (1999), pragul limit? (definit de software) este punctul n care semnalul fluorescentdep????te de zece ori devia?ia standard a mediei intensit??ii m?surate ntre al treilea ?i al 15-lea ciclu. nacest moment, ntre valoarea CT ?i logaritmul concentra?iei moleculei ?int? exist? o rela?ie liniar? (Burnset al., 2004).

    n practic?, alegerea pragului limit? este f?cut? de c?tre operator, reprezentnd unul dintreelementele subiective al analizei real-time PCR. Punctul n care acesta este plasat trebuie ales foarte atent.

    n primul rnd trebuie s? fie situat n cadrul fazei exponen?iale ?i deasupra semnalului de fond. Pescal? logaritmic?, faza de cre?tere exponen?ial? apare sub forma unei drepte, n timp ce pe o scal? normal?corela?ia ntre rata de acumulare a ampliconilor ?i alura curbei este mai greu de f?cut. De asemenea,nivelul de pozi?ionare al pragului trebuie ales astfel nct, n acel punct, graficele probelor s? fie liniare ?iparalele, iar cele ale repeti?iilor s? coincid? ct mai mult.

    Dup? pozi?ionarea pragului limit?, software-ul calculeaz? automat valorile CT.Ciclul pragului limit? (CT) reprezint? ciclul PCR n care semnalul fluorescent generat prin

    amplificarea moleculei ?int? atinge pragul limit? definit de software sau de c?tre operator (Burns et al.,2004; Rott et al. 2004). Practic, CT reprezint? o valoare zecimal?, ce exprim? num?rul de cicluri PCR lacare curba de amplificare generat? de modificarea intensit??ii semnalului fluorescent intersecteaz? pragullimit? (Corbett Research, 2004; Vatilingom et al., 1999). Corela?ia dintre num?rul ini?ial de copii alesecven?ei ?int???i valoarea CT este urm?toarea: cu ct cantitatea ini?ial? de ADN ?int? este mai mare, cuatt produsul PCR se acumuleaz???i este detectat mai repede, iar valoarea CT este mai mic?.

    n continuare este generat? curba standard, n func?ie de datele atribuite probelor cunoscute(standarde/calibratori) incluse n experiment ?i de valorile CT determinate experimental. Limitele curbeitrebuie s? corespund? unui interval ct mai larg. Una dintre condi?iile de validare a rezultatelor este cavalorile CT corespunz?toare probelor necunoscute s? se ncadreze n intervalul dat de valorile CT aleprobelor standard.

    Dup? construirea curbei standard sunt calcula?i anumi?i parametri ai acesteia (ex. valoarea R2,panta curbei standard sau eficien?a amplific?rii) care ofer? informa?ii despre experiment ?i permitvalidarea rezultatelor ob?inute. n cazul n care parametri curbei standard sau celelalte elemente devalidare nu se ncadreaz? n limitele optime, rezultatele analizei nu trebuie valorificate.

    Valoarea R2, numit? coeficient de corela?ie, exprim? procentual m?sura n care rezultatelecorespund ipotezei statistice (Corbett Research, 2004). n contextul analizei cantitative, R2 indic?

  • 18

    propor?ia n care datele ob?inute corespund ipotezei conform c?reia valorile cunoscute introduse nexperiment formeaz? o linie de regresie (curba standard/trend line). Cu ct valoarea R2 este mai mare, cuatt standardele se vor ncadra mai bine pe aceea?i dreapt?. Cu alte cuvinte, coeficientul exprim?corectitudinea rezultatelor ob?inute, n sensul coresponden?ei valorilor teoretice ale num?rului ini?ial decopii ?int? din probele standard, cu cele determinate experimental. n practica analizelor real-time PCR, ovaloare mai mare de 0,98 este considerat? satisf???toare (ENGL, 2008; Rasmussen, 2001, n Taverniers etal., 2005). Trebuie re?inut faptul c? se pot ob?ine valori R2 bune chiar ?i n cazul unor curbe standardnecorespunz?toare, dac? nu a fost analizat un num?r suficient de puncte de calibrare. Cu alte cuvintevaloarea R2 va cre?te cu ct num?rul punctelor ce formeaz? curba standard este mai mic.

    Valorile ideale pentru panta curbei standard, M, exponentul amplific?ri, F, ?i eficien?a reac?iei, E,sunt -3,322, 2, respectiv 1. Acestea corespund dubl?rii num?rului de produ?i de amplificare n fiecareciclu, adic? unei eficien?e de amplificare de 100%. De asemenea intercep?ia, B, trebuie s? fie ct maiapropiat? de 40, valoare ce corespunde num?rului teoretic de cicluri necesare pentru amplificarea uneisingure copii a secven?ei ?int? (Rasmussen, 2001, n Taverniers et al., 2005).

    Ecua?iile: conc =10 (M ?CT + B ) (12) CT= M ?log(conc) + B (13)reprezint? dou? moduri de eviden?iere a leg?turii dintre valorile CT ?i concentra?iile ini?iale alemoleculelor ?int? (Corbett Research, 2004). Acestea sunt utilizate pentru determinarea concentra?ieiini?iale a secven?ei ?int? dintr-o prob? necunoscut? pe baza valorii CT determinate pentru respectivaprob?.

    Trebuie men?ionat c? n cazul probelor analizate n mai multe repeti?ii (cel pu?in dou?-trei fiindrecomandate), pentru calcularea concentra?iilor finale anumite softwareuri utilizeaz? media geometric?,nu pe cea aritmetic? (Corbett Research, 2004), datorit? naturii exponen?iale a reac?iei real-time PCR.Datele brute sunt exportate ntr-un fi?ier Excel, iar apoi, pentru determinarea procentului OMG, se aplic?formulele de calcul specifice metodei alese (metoda curbei standard sau metoda ?CT).2.9.6. Metode de calcul

    Cuantificarea relativ? a con?inutului MG este bazat? ntotdeauna pe analiza a dou? secven?e ?int?,una corespunz?toare transgenei, iar cealalt? specific? unei gene de referin??. Amplificarea celor dou?secven?e ?int? trebuie f?cut? n paralel, fie n reac?ii diferite (reac?ii simplex) fie n acela?i mediu dereac?ie (reac?ie duplex).

    Ca ?i n cazul altor metode de m?surare a concentra?iei analitului dintr-o prob?, n cadrul test?rilorOMG este necesar? utilizarea unor materiale cu propriet??i cunoscute, denumite standarde, materiale dereferin?? sau calibratori, n vederea construirii curbelor standard (de calibrare) cu ajutorul c?rora va fi apoideterminat con?inutul probelor necunoscute (Aberasturi et al., 2002, Liu, 2002, Rao et al., 2002, ?iPrichard, 2001, n Burns et al., 2004). Curbele standard sunt construite ntr-un sistem de dou? axeortogonale, axa 0Y corespunznd num?rului ciclurilor de amplificare, iar axa 0X varia?iei con?inutuluiini?ial de molecule ?int?. Practic, pe axa OX vor fi reprezentate valorile CT/?CT ob?inute n urma analizei,iar pe cealalt? logaritmul concentra?iei ini?iale a moleculei ?int? sau logaritmul factorului de dilu?ie.Probele standard sunt analizate n paralel cu probele necunoscute ?i cu cele de control, pentru fiecare fiinddeterminate valori CT sau ?CT, n func?ie de metoda de calcul utilizat?. Determinarea con?inutuluiini?ial al probelor necunoscute este f?cut? prin extrapolare utiliznd ecua?ia de regresie asociat? curbeistandard (Burns et al., 2004). Majoritatea modelelor de calcul utilizeaz? metoda celor mai mici p?tratepentru definirea rela?iei dintre variabila dependent???i cea independent? (Wikipedia, 2009n; Burns et al.,2004).

    Amplificarea probelor necunoscute ?i a calibratorilor trebuie s? se desf??oare n paralel, n cadrulaceluia?i experiment. n acest context este important? evaluarea eficien?ei de amplificare a fiec?rei probenecunoscute, comparativ cu cea a standardelor, aspect care este adesea ignorat sau considerat neglijabil(Rott et al., 2004). Cankar et al. (2006) afirm? c? pentru o precizie ct mai mare diferen?ele dintre celedou? tipuri de eficien?e trebuie s? fie ct mai reduse. Datele ob?inute de ace?ti autori au demonstrat c? cele

  • 19

    dou? eficien?e sunt de cele mai multe ori diferite, iar influen?a asupra rezultatului cuantific?rii poate fisemnificativ?. Orice strategie aplicat? cu scopul de a reduce aceste neajunsuri va determina n schimbcre?terea costurilor (Cankar et al., 2006), de aceea efectul eficien?elor de amplificare diferite este, ngeneral, trecut cu vederea.

    n ceea ce prive?te cuantificarea acizilor nucleici n general, modele matematice utlizate pentruprelucrarea datelor sunt numeroase ?i variate, n cazul test?rii OMG fiind aplicate ns? doar dou? metodede calcul (Cankar et al., 2006; Deisingh ?i Badrie, 2005; Applied Biosystems, 2001):? metoda ?CT ??CT method/approach), bazat? pe compararea valorilor CT n vederea detrmin?riicon?inutului OMG (%);? metoda curbei standard (standard curve method/approach), care presupune m?surarea cantit??ilorabsolute ale moleculelor ?int?, la nivel de echivalen?i genomici haploizi.

    Metoda ?CTn cazul metodei ?CT , pentru fiecare prob? inclus? n analiz? (standard, necunoscut?, control) se

    calculeaz? o valoare ?CT care reprezint? diferen?a ntre valoarea CT corespunz?toare transgenei ?ivaloarea CT corespunz?toare genei de referin?? (?CT = CTreferin?? - CTtransgen?), ambele determinate nurma amplific?rii. Pentru construirea curbei de calibrare datele probelor standard sunt introduse ntr-ungrafic care exprim? valorile ?CT n func?ie de logaritmul concentra?iei ini?iale a num?rului de copii alsecven?ei ?int? (Applied Biosystem, 2001). Con?inutul OMG (%) al probei necunoscute este apoi calculatcu ajutorul valorii ?CT, utiliznd ecua?ia de regresie asociat? curbei standard. Trebuie remarcat c? fiec?ruipunct de calibrare i corespunde o prob? standard separat?, cu o anumit? concentra?ie OMG. Metoda estedescris? n detaliu de c?tre Foti et al. (2006).

    Aceast? strategie de calcul implic? desf??urarea reac?iilor de amplificare n sistem duplex.Presupunerea inerent? acestei strategii este c? eficien?ele celor dou? sisteme de amplificare (de referin??,respectiv transgenic) sunt acelea?i, att n cazul unei probe date, ct ?i ntre diferitele tipuri de probe (ex.MRC-uri ?i matrici compozite sau intens procesate). Deoarece exist? diferen?e cel pu?in ntre tipurile deprobe analizate, aceast? supozi?ie este considerat? nepotrivit? n majoritatea situa?iilor (Cankar et al.,2006).

    Totu?i, o astfel de strategie este mai eficient? din punct de vedere economic ?i de asemenea nueste influen?at? de erorile de pipetare (Alary et al., 2002).

    Metoda curbelor standardAceast? metod? presupune exprimarea con?inutului procentual de material MG cu ajutorul unor

    valori absolute ob?inute n cadrul unui experiment real-time PCR. Cele dou? molecule de interes vor fiamplificate n sisteme simplex (Querci et al., 2005), fiecare prob? fiind deci prezent? n dou? reac?iiseparate, una specific? (primeri ?i sond?) transgenei, iar cealalt? genei de referin?? (Rott et al. 2004).

    Este astfel necesar? construirea a dou? curbe standard, cte una pentru fiecare secven????int?.Spre deosebire de strategia (metoda) anterioar?, n acest caz se utilizeaz? un singur calibrator (solu?ie cuconcentra?ie cunoscut? a moleculei de interes), punctele curbei standard reprezentnd dilu?ii seriale aleacestuia (Cankar et al., 2006). n acest fel, diferen?a dintre eficien?ele celor dou? reac?ii (sistemultransgenic, respectiv cel de referin??) este luat? n considerare nu se mai face presupunerea c? acesteasunt egale. Sunt considerate egale doar eficien?ele de amplificare ale standardului ?i probelor necunoscuteamplificate n paralel. Aceast? presupunere poate duce de asemenea la supra- sau subestimareacon?inutului MG deoarece, n majoritatea cazurilor, ntre cele dou? tipuri de matrici (i.e.standarde/calibratori ?i probe necunoscute) exist? diferen?e (Cankar et al., 2006). n cele mai multe dintreprotocoalele studiate, standardul utilizat a fost reprezentat de un MRC cu 2% sau 5% material transgenic.Cele dou? curbe de calibrare care redau rela?ia dintre valorile CT ?i logaritmul num?rului de copii almoleculei ?int?, sunt construite pe baza rezultatelor amplific?rii seriei de dilu?ii ob?inute din probastandard. Curbele standard sunt utilizate apoi pentru determinarea num?rului ini?ial de copii ale genei deinteres din proba necunoscut?, prin extrapolare, introducnd valorile CT ob?inute n ecua?iile asociateregresiei liniare a acestora (Tani et al., 2005; Corbett Research, 2004; Rott et al. 2004; Weighardt, 2004).

  • 20

    Valorile probelor analizate trebuie s? se ncadreze ntre limitele curbei standard, cele care ies n afaraacestor valori fiind eliminate datorit? erorilor care le pot fi asociate (Roche, 2006a; Weighardt, 2004).

    Procentul de material MG este determinat prin raportarea num?rului de copii ale transgenei lanum?rul de copii ale endogenei (Rott et al. 2004). Aceast? raportare permite normalizarea datelor,dep??indu-se eventulale neajunsuri determinate de calitatea diferit? a extractelor. Valoarea ob?inut? esterelativ?? ?i reprezint? con?inutul OMG al probei necuoscute exprimat ca num?r al copiilor de ADN MGraportat la num?rul copiilor de ADN specific taxonului ?int?, la nivelul genomului haploid.

    Pentru determinarea final? a con?inutului MG (%) au fost propuse ?i alte formule de calcul (ex.Tani et al., 2005).

    Un alt element men?ionat n literatura de specialitate (ex. Lee et al., 2006, sau Huang ?i Pan,2005) ca fiind necesar pentru calcularea con?inutului de ADN MG, este factorul de corec?ie. Acestaexprim? raportul dintre num?rul copiilor secven?ei transgenice ?i cel al endogenei, la nivelul genomuluihaploid al liniei transgenice analizate. n cazul evenimentului de transformare GTS 40-3-2, factorul decorec?ie are valoarea 1.

    2.9.7. Materialele de referin?? certificateMaterialele de referin?? certificate (MRC) reprezint? o categorie de probe foarte importante n

    cadrul test?rii OMG, fiind utilizate pentru controlul calit??ii sau validarea metodelor (IRMM, 2008a;Trapmann et al., 2007; Querci et al., 2005). n ceea ce prive?te test?rile cantitative, MRC-urile joac? unrol crucial, cel de calibratori ADN (Querci et al., 2005; Taverniers et al., 2005; Burns et al., 2004)necesari construirii curbelor standard. n aceast? situa?ie, variabila independent? necesar? construiriiacestor curbe cu ajutorul regresiei liniare, este reprezentat? de valoarea pentru care MRC-urile suntcertificate.

    Conform SR EN ISO 24276:2006 ?i Regulamentului 641/2004, MR-ul este un material sau osubstan?? ale c?rei propriet??i sunt suficient de omogene ?i stabile pentru a fi folosite la calibrarea unuiaparat, evaluarea unei metode sau atribuirea de valori altui material. MRC-urile reprezint? o clas? apartede MR-uri: MRC-ul este un MR nso?it de un certificat oficial care i atest? propriet??ile. n contextultest?rii OMG, se certific? o valoare ce reprezint? con?inutul de material derivat dintr-un anumit evenimentde transformare. Deoarece prin procedura de certificare se stabile?te trasabilitatea materialului la o unitatedin Sistemul Interna?ional, certificatul include ?i incertitudinea valorii m?surate, cu un anumit nivel dencredere care este de asemenea men?ionat (SR EN ISO 24276:2006; Regulamentul 641/2004).

    Utilizarea acestor materiale n cadrul analizelor reprezint? deci un element cheie pentruasigurarea calit??ii ?i validarea rezultatelor (Ahmed, 2002).

    Solu?iile de calibrare utilizate con?in fie ADN genomic (ADNg) fie secven?e de ADN plasmidial(ADNp), ambele tipuri prezentnd avantaje ?i limite. Un al treilea tip de calibratori este bazat peampliconi hibrizi, ce includ ambele secven??? ?int?. Utilizarea acestora n cadrul test?rilor OMG a fostdescris? de Pardigol et al. (2003) (Debode et al., 2007; Engel et al., 2005).

    Calibratorii utiliza?i n mod tradi?ional n practica test?rii OMG sunt cei pe baz? de ADNg, toateMRC-urile disponibile pn? nu demult ncadrndu-se n aceast? categorie.

    n ultima perioad? ns?, o serie de studii au promovat utilizarea solu?iilor pe baz? de ADNp (ex.Burns et al., 2006, Kunert et al., 2006, Kuribara et al., 2002, n Burns et al., 2006, Holst-Jensen ?i Berdal,2006, Lee et al., 2006, Lin et al., 2006, Toyota et al., 2006, Huang ?i Pan, 2005, Moens et al., 2005,Taverniers et al., 2005, Hernndez et al., 2004b, sau Taverniers et al., 2001), iar la sfr?itul anului 2007 afost introdus primul astfel de MRC. Principala diferen?? ntre cele dou? categorii este modul de exprimarea con?inutului relativ de material transgenic, n primul caz acesta reprezentnd un raport de mase, iar ncel de-al doilea un raport ntre numere de copii ale unor fragmente de ADN.

    Reticen?a fa?? de utilizarea moleculelor plasmidiale ca materiale de referin?? a avut ca principalargument lipsa comutabilit??ii (commutability). Aceast? proprietate se refer? la concordan?a dintrerezultatele ob?inute pentru acela?i m?surand n condi?ii diferite (i.e. secven?a ?int? n MRC-uri bazate peADNg, MRC-uri bazate pe ADNp, respectiv probe obi?nuite) (vezi ISO 17511, n Taverniers et al.,

  • 21

    2004). Cu alte cuvinte, s-a luat n calcul posibilitatea existen?ei unor diferen?e de amplificare ntrecalibratorii pe baz? de ADNg ?i cei pe baz? de ADNp, pe de o parte, precum ?i ntre calibratori ?i probeleobi?nuite (necunoscute), pe de alt? parte. Recent, mai mul?i autori (ex. Charels et al., 2007 ?i Mattarucchiet al., 2005, n el et al., 2008, Terry et al., 2002, n Burns ?i Valdivia, 2007, Lin et al., 2006, Moens etal., 2005, Taverniers et al., 2005, sau Taverniers et al., 2001) au demonstrat c? ntre cele dou? tipuri decalibratori nu exist? diferen?e semnificative, n unele cazuri rezultatele ob?inute utiliznd MRC-urile pebaz? de ADNp fiind chiar superioare (ex. Burns et al., 2006). Lucr?rile enumerate anterior prezint? deasemenea o serie de informa?ii referitoare la alte caracteristici ?i avantaje ale calibratorilor plasmidiali.Singurele MRC-uri disponibile n prezent pentru analizele OMG sunt cele produse de IRMM, existndmai multe tipuri. Acestea sunt prezentate n continuare conform IRMM (2009):? MRC-uri al c?ror con?inut procentual OMG este exprimat ca frac?ie de mas?; acestea sunt ob?inute prinamestecul materialului MG cu material nemodificat, n propor?ii corespunz?toare; n acest context prinmaterial se n?elege f?in?; astfel de MRC-uri sunt disponibile pentru evenimente de transformare la soia(Roundup Ready), porumb (Bt176, Bt11, MON810, GA21 etc.) ?i sfecl? de zah?r (H7-1);? MRC-uri al c?ror con?inut procentual OMG este exprimat ca frac?ie din num?rul de observa?ii; astfel deMRC-uri sunt disponibile pentru evenimente de transformare la cartof (EH92-527-1), bumbac (281-24-236 x 3006-210- 23) ?i soia (356043); n primul caz termenul observa?ii se refer? la tuberculi, iar pentrucelelalte dou? termenul observa?ii f?ce referire la semin?e; MRC-urile din aceast? categorie suntob?inute ca amestecuri de material OMG cu material nemodificat, n propor?ii corespunz?toare; prinmaterial se n?elege pudr? ob?inut? n urma m?cin?rii tuberculilor, respectiv semin?elor;? MRC-uri ce includ un calibrator independent pentru cuantificarea prin real-time PCR (con?inutul OMGprocentual este exprimat ca frac?ie din num?rul de copii ADNg), precum ?i o matrice separat?, pentrucontrolul calit??ii procedurii de m?surare a aceluia?i OMG (con?inutul este exprimat ca frac?ie de mas?)(IRMM, 2008a); deocamdat?, exist? un singur MRC de acest fel ERM-BF413d pentru evenimentulMON810;? MRC-uri al c?ror con?inut OMG (%) este exprimat ca frac?ie din num?rul de copii ADNp; exist? unsingur astfel de MRC ERM-AD413 pentru evenimentul MON810.n continuare sunt abordate c?teva probleme esen?iale n ceea ce prive?te disponibilitatea MRC-urilorpentru testarea OMG. n primul rnd, existen?a acestui tip de matrici pentru fiecare eveniment detransformare autorizat n UE, precum ?i pentru cele neautorizate, este considerat? de ENGL ca factoresen?ial pentru procesul de testare. De?i comparativ cu celelalte probleme acest deziderat este mult mai??or de realizat, MRCurile nu sunt nc? disponibile dect pentru un num?r redus de evenimente detransformare (vezi IRMM, 2009).

    Cel de-al doilea aspect se refer? disponibilitatea MRC-urilor adecvate din punct de vedere alcaracteristicilor matricei analizate (i.e. modul ?i gradul de procesare, con?inut) (Burns ?i Valdivia, 2007;Trapman ?i Emons, 2005). Pentru corectitudinea cuantific?rii prin real-time PCR este necesar ca probeleanalizate ?i standardele (calibratorii) s? prezinte propriet??i intrinseci asem???toare, ceea ce faciliteaz?comportarea similar? n timpul procesului PCR, din punct de vedere al ratelor de amplificare. Majoritateaexperimentelor cantitative consider? aceast? ipotez? adev?rat?, f??? ns? a o testa (Cankar et al., 2006;Rott et al., 2004). O serie de autori au eviden?iat diferen?e semnificative sub aspectul eficien?elor deamplificare, ntre matricile neprocesate ?i cele intens procesate (Moreano et al., 2005, n Burns ?iValdivia, 2007; Corbisier et al., 2005; Hols-Jemsen ?i Berdal, 2004), care au influen?at negativ exactitateadetermin?rilor (Cankar et al., 2006).

    Cu toate acestea, n contextul test?rii OMG, definirea caracteristicilor unei matrici alimentarereprezint? un exerci?iu dificil deoarece acela?i produs poate fi ob?inut prin procedee diferite, existndastfel deosebiri n privin?a substan?elor con?inute ?i deci a pretabilit??ii la analize (Cankar et al., 2006).Dup? Papazova et al. (2005) n Block et al. (2008), Allnut et al. (2006), Holst-Jensen et al. (2006), Moenset al. (2005) ?i Yoshimura et al. (2005a), modificat.

    O alt? problem? referitoare la utilizarea MRC-urilor este reprezentat? de exprimarea con?inutuluiOMG (Allnutt et al., 2006). Dup? cum s-a v?zut mai sus, conform Recomand?rii 2004/787/EC

  • 22

    exprimarea rezultatelor cantitative se face sub forma procentelor de ADN MG. Con?inutul MRC-uriloreste ns? exprimat, n majoritatea cazurilor, ca frac?ie de mas? sau num?r de observa?ii. n prima situa?ie,posibilitatea sporirii incertitudinii de m?surare apare datorit? ploidiei ?i zigo?iei diferite a ?esuturilorsemin?elor cuare sunt utilizate la ob?inerea MR