Testarea Omg Partea III

  • View
    60

  • Download
    2

Embed Size (px)

DESCRIPTION

ORGANISME MODIFICATE GENETIC

Text of Testarea Omg Partea III

  • 12.7. METODE ANALITICE UTILIZATE N CADRUL TEST?RII OMGTipurile de metode utilizate n mod curent pentru testarea OMG, precum si avantajele ?i

    dezavantajele celor mai utilizate dintre acestea sunt prezentate in tabelele de mai jos.

    Caracteristicile metodelor bazate pe analiza ADN-ului ?i proteinelorCaracteristica Met. bazate pe analiza proteinelor Met. bazate pe analiza ADN-

    ului

    ??urin?? n utilizare ?Medie pentru ELISA?Testele rapide sunt extrem deexpeditive

    ?Metodele bazate pe PCRprezint? o dificultate mai marepentru operator

    Complexitate tehnologic? ?Medie pentu ELISA?Foarte simpl? pentru testele rapide

    ?nalt?, mai ales pentru real-timePCR ?i microarray

    Durat? ?1-2 zile pentru ELISA; n cazulkiturilor comerciale timpul deexecu?ie este de doar c?teva ore?Cteva minute pentru testele rapide

    ?1-2 zile, n func?ie de modul ncare este conceput protocolulintegrat de testare

    Cost/prob? ? Redus ? Ridicat, n special pentru real-time PCR ?i microarray

    Versatilitate ? Anticorpii specifici sunt dificil desintetizat? n cazul ELISA se utilizeaz?aporape exclusiv kituri comerciale? n cazul testelor rapide seutilizeaz? exclusiv kituri comerciale

    ? Primeri ?i sondele sunt foarte??or de ob?inut? Ponderea cea mai mare o auprobabil protocoalele conceputen laborator? Sunt disponibile kituricomerciale ns? protocolale delucru pot fi foarte u?or modificatesau adaptate

    Utilizare pentru det.cantitative

    ? ELISA poate fi utilizat? ca metod?cantitativ?? Testele rapide au fost consideratemetode calitaitve; recent a fostintrodus primul sistem cantitativbazat pe utilizarea stripurilor

    Real-time PCR este cea maiperformant? metod? pentrutestarea cantitativ?

    Utilizare pe teren Posibil? n cazul testelor rapide. Nu este posibil?

    Aplicabilitate Poate fi analizat? o gam? larg? deproteine, dar metodele pot fi aplicate,n general, n cazul produselorproaspete ?i mai pu?in n cazul celorprocesate.

    Poate fi aplicat? chiar ?iproduselor intens procesate,moleculele de ADN fiind multmai stabile dect proteinele

    Specificitate Bun? Mai mare dect la cealalt?

  • 2O mare parte dintre probele care fac obiectul test?rilor OMG este reprezentat? de matricialimentare. Acestea se caracterizeaz? de obicei printr-un intens grad de procesare, n special sub influen?atemperaturilor ridicate (Endres, 2001). Datorit? faptului c? termostabilitatea ADN-ului este mai bun?dect a proteinelor (Anklam et al., 2002, n Taverniers et al., 2005; Gachet et al., 1999), reac?ia PCR estecea mai potivit? tehnic? pentru detec?ia, identificarea ?i cuantificarea OMG-urilor (Anklam et al., 2002, nAngonesi Brod et al., 2007; Taverniers et al., 2005; Berdal ?i Holst-Jensen, 2001).

    Aceast? tehnologie prezint? deci o sensibilitate, specificitate ?i eficien?? mai mare dect n cazultehnicilor bazate pe analiza proteinelor (Holst-Jensen et al., 2003, n Smith ?i Maxwell, 2007; Anklam etal., 2002, n Taverniers et al., 2005; Gachet et al., 1999).

    Metode disponibile pentru test?rile OMGSurse: Sisea et al. (2008); Tripathi (2005); Zafar et al. (2004); Ahmed (2002).

    Cat

    egor

    ii de

    met

    ode

    baza

    te p

    e:

    analiza fenotipica: biotesteleanaliza proteinelor (testele imunologice) Western blot

    ELISAlateral flow strips

    analiza ARN-ului (ex. NASBA)analiza AND-ului tehnici de hibridare Southern blot

    microarraytehnici de amplificare PCR clasic

    nested PCRconsensus PCRPCR multiplexreal-time PCR

    tehnici de secventieretehnici combinate (ex. PCR multiplex+microarray)

    alte principii cromatografiespectroscopiebiochipuri

    2.7.1. Detec?ia OMG-urilor cu ajutorul biotestelorDetec?ia OMG-urilor pe baza biotestelor este posibil? doar n cazul diferitelor tipuri de rezisten??

    (ex. la erbicide, insecte sau antibiotice) (Zafar et al., 2004).Testele de germinare presupun folosirea unor medii simple care con?in erbicidul sau antibioticul

    pentru care se testeaz? rezisten?a. n cazul n care erbicidul nu se adaug? n mediu, acesta va fi aplicat prinpulverizare asupra pl?ntu?elor. n condi?iile descrise, indivizii rezisten?i se vor dezvolta normal, fiindconsidera?i pozitivi din punct de vedere al prezen?ei transgenei.

    n cazul test?rii rezisten?ei la atacul insectelor, larvele speciilor ?int? sunt l?sate libere pentru a sehr?ni cu plantele provenite din lotul de semin?e testate. Se poate concluziona c? plantele sunt transgenicen cazul n care larvele nu supravie?uiesc testului.

    categorieSensibilitate Mai redus? dect cea a tehnicilor

    bazate pe analiza ADN-ului, nspecial n cazul matricilor procesate

    Cea mai mare sensibilitate oprezint? real-time PCR-ul

  • 3Aceste teste sunt u?or de aplicat, nu necesit? dotare special?, sunt relativ ieftine, dar necesit? timp?i se pot folosi doar n cazul loturilor de semin?e germinabile sau plantelor care produc astfel de semin?e.Trebuie de asemenea s? se aib? n vedere c? propriet??ile germinative pot determina ob?inerea unorrezultate eronate, iar zigo?ia caracterului transgenic nu poate fi stabilit?.

    2.7.2. Detec?ia OMG-urilor prin analiza proteinelorDintre metodele bazate pe analiza proteinelor, doar cele imunologice sunt folosite n practica

    test?rii OMG. Acestea au la baz? interac?iunea anticorp-antigen, proteina rezultat? n urma expresieitransgenei n organismul gazd? reprezentnd antigenul.

    Teoretic, testele imunologice pot fi utilizate pentru o larg? varietate de molecule ?int?. n practic?ns?, exist? trei limite majore ale acestor metode:? necesitatea prezen?ei n proba analizat? a proteinelor cu structuri ter?iare ?i cuaternare intacte; de obicei,n cazul matricilor procesate intervine denaturarea proteinelor, condi?ia neputnd fi astfel satisf?cut?;? disponibilitatea anticorpilor specifici; ace?tia sunt mult mai greu de sintetizat comparativ cu primeriiutiliza?i n cadrul metodelor bazate pe analiza ADN-ului;? posibilitatea ca ADN-ul transgenic prezent n prob? s? nu fie exprimat uniform n timp ?i n toateorganele plantei.

    Datorit? primului dezavantaj men?ionat, metodele de testare imunologice se pot utiliza, ngeneral, doar n cazul probelor proaspete sau cu grad redus de procesare (Zafar et al., 2004), iar nanalizele de rutin? se utilizeaz? exclusiv kituri comerciale.

    Exist? dou? formate ale imunotestelor, ELISA ?i teste rapide de tipul stripurilor (lateral flowstrips), care difer? n principal prin gradul de complexitate ?i performan?a rezultatelor, cele dou?caracteristici fiind invers propor?ionale.

    Tehnica ELISA este utilizat?, n general, pentru detec?ie calitativ? sau stabilirea nivelului deexpresie proteic?. Principiul ELISA cu cea mai larg? aplicabilitate n testarea OMG, sandwich ELISA,utilizeaz? un anticorp de captur?, imobilizat pe o suprafa?? solid?, ?i un anticorp de detec?ie marcat. Dac?proteina de interes (antigenul) este prezent? n extractul testat, aceasta va fi legat? de anticorpii care??ptu?esc pere?ii godeului de analiz?. Urmeaz? apoi legarea la protein? a celui de-al doilea set deanticorpi.

    n urma unei reac?ii enzimatice de culoare, anticorpii marca?i coloreaz? mediul de reac?ie, fiindastfel indicat?? ?i prezen?a proteinei transgenice. De?i ELISA poate fi utilizat? pentru cuantificare(Corbisier et al., 2005; Querci et al., 2005), n practic?, aplica?iile n aceast? direc?ie sunt foarte restrnse.Corbisier et al. (2005), Querci et al. (2005) ?i Eyquem (2004) au descris ?i demonstrat modul de utilizarea kitului GMO Food Ingredient Testing (noua denumire GMOChek RUR Soya Test) produs de StrategicDiagnostics (http://www.sdix.com) ?i validat de JRC pentru cuantificarea proteinei EPSPS n diferitefrac?iuni alimentare de soia (Lipp et al., 2002, n Corbisier et al., 2005, ?i Strategic Diagnostics, 2004) ?ialimente u?or procesate, dar nerecomndat pentru detec?ia proteinei de interes n stare denaturat?. Acestaeste probail ?i motivul pentru care rezultatele au fost negative n cazul probelor tratate termic latemperaturi ridicate (Corbisier et al., 2005).

    Stave (1999) afirm? c? detec?ia proteinelor denaturate este posibil? utiliznd anticorpiimonoclonali, dar cuantificarea r?mne n continuare foarte dificil? n cazul alimentelor procesate (Debodeet al., 2007).

    Sandwich ELISAPrincipiul metodei sandwich ELISA.Stripurile reprezint? o form? simplificat? a testului ELISA, care nlocuie?te godeurile cu

    membrane nitrocelulozice (stripul propriu-zis) n care sunt ncorpora?i anticorpi dubli, specifici proteineianalizate ?i marca?i cu un reactiv colorat.

    Testarea se face prin introducerea stripului ntr-un recipient ce con?ine extract din plantaanalizat?. Dac? proteina de interes este prezent?, aceasta va fi legat? de anticorpii specifici marca?i.

  • 4Complexul migreaz? apoi, prin capilaritate, de-a lungul membranei nitrocelulozice poroase. Pe direc?ia demigrare sunt plasate dou? zone de captur?, una pentru structurile anticorp-antigen, iar cealalt? pentruanticorpii marca?i liberi. Prezen?a celei de a doua linii (controlul pozitiv) pe membran? indic? o prob?negativ?, iar prezen?a ambelor linii indic? un rezultat pozitiv. Acest sistem ofer? rezultate calitative ndoar cteva minute, testele fiind considerate ieftine, u?or de efectuat ?i foarte potrivite pentru etapa descreening (Van Duijn et al., 2002, n Van den Bulcke et al., 2005), domeniu n care ?i-au g?sit o larg?aplicabilitate, spre deosebire de ELISA. Dup? cum s-a men?ionat mai sus, EnviroLogix a introdus recentsistemul QuickScan care, n combina?ie cu stripurile clasice, poate oferi rezultate cantitative n cazulanalizei loturilor de boabe/semin?e (Envirologix, 2009).

    Principalii produc?tori de kituri imunologice destinate test?rii OMG sunt:EviroLogix (http://envirologix.com/artman/publish/index.shtml), Strategic Diagnostics, Romer Labs(http://www.romerlabs.com/romer.htm) ?i Agdia (http://www.agdia.com).

    2.7.3