TEST GENETICI NELLA INVESTIGAZIONE SU FRODI ALIMENTARI

Enrico Novelli

Dipartimento di Sanità Pubblica, Patologia Comparata e Igiene Veterinaria, Università degli Studi di Padova

Gli alimenti

NUTRIZIONALEenergeticaplasticaregolatrice

ORGANOLETTICOSENSORIALE

EDONISTICA

FUNZIONALENUTRACEUTICA

ETICA

RELIGIOSA

SICUREZZA

ECONOMICA

macrocomponentiacquaproteinegrassizuccheriminerali

Gli alimenti contengono

microcomponentivitamineantiossidantienzimicomposti azotati non proteicigas discioltiacidi nucleici

La produzione degli alimenti

MacellazioneMungituraPescaOvodeposizioneAlveareRaccolta

Produzioni primarie

StagionaturaFermentazioneCaseificazioneCotturaSterilizzazioneCongelazioneEssicazioneAcidificazione

Produzioni secondarie

tras

form

azio

ne

ConservazioneOrganolettica

Profonda e irreversibile modificazione delle proprietà chimico-fisiche dei macro e micro componenti

Acqua

evaporalegata

Proteine

denaturazioneproteolisi

Grassi

lipolisiossidazione

Minerali

stato di ossidazione

Zuccheri

caramellizzazioneprodotti di Maillard

Acidi nucleici

frammentazione

componente più stabile

trasformazioni

tempo

L’aspetto economico delle produzioni alimentari implica

Osservanza della legislazione alimentareConoscenze tecnicheProfessionalitàLealtà e trasparenza

Sicurezza alimentare

Sicurezza – Tracciabilità – Etichettatura (Reg. 178/2002)

Etichetta e trasparenza (Dir. 13/2000)

Etichetta e allergeni (Posizione comune 16/2003)

Etichettatura carne bovina (Reg. 1760/2000)

Carne e prodotti a base di carne

residui di sostanze (additivi tecnologici, farmaci, ormoni) la cui presenza è conseguente al mancato rispetto dei tempi di sospensione;uso fraudolento di promotori di crescita;aggiunta di sostanze in grado di liberare SO2 (solfiti, bisolfiti, metabisolfiti,ecc) alle carni macinate allo scopo di prolungarne la vita conservativa evitando la comparsa di imbrunimento;presenza di carni di specie diversa dal dichiarato;impiego di sostanze leganti o altri additivi non consentiti (coloranti, antimicrobici);

Alcuni frodi alimentari e le rispettive filiere

Fra i prodotti a base di carne frequente èla frode di falsificazione consistentenella vendita di prodotti generici, o

di normale qualità, per prodotti di alta qualità oaddirittura a denominazione di origine.

Formaggi formaggi ottenuti con latte in polvere ricostituito (in tutto o in parte);formaggi pecorini contenenti percentuali più o meno elevate di latte vaccino;mozzarelle di bufala contenenti percentuali più o meno elevate di latte vaccino;applicazione del marchio di tutela a formaggi comuni;

Latte tenore in grasso differente al dichiarato;trattamenti di risanamento non consentiti;latte ottenuto dalla ricostituzione del latte in polvere;aggiunta di sostanze a potere battericida;

Prodotti della pescavendita di prodotti non freschi per freschi;vendita di prodotti non rispondenti alla qualità richiesta (vendita di un prodotto di basso pregio per uno di alto pregio, esempio vendere pagro o pagello per dentice, totano per calamaro, ecc.);vendita di prodotto decongelato per fresco;Utilizzo fraudolento di sostanze igroscopiche

Miele aggiunta di zuccheri;vendita di un miele di una origine botanica diversa da quella dichiarata;vendita di mieli extracomunitari per mieli italiani senza la relativa dichiarazione in etichetta;

Olio olio extravergine contenente oli raffinati, sia di oliva che di semi;oli con tenori analitici non rispondenti ai requisiti previsti dai regolamenti comunitari;

Pasta uso di farine di grano tenero (compromette le qualità organolettiche della pasta);impiego di altri cereali meno costosi (e conseguente decadimento qualitativo);uso di semole di qualità scadente o avariate;aggiunta di coloranti o di additivi chimici per imitare le paste speciali o le paste all'uovo o per mascherare il tipo di sfarinato usato;

Riso varietà di pregio minore a quella indicata;miscela di diverse varietà;vendita di riso proveniente dall'estero come se fosse prodotto nazionale;

Nelle produzioni alimentarisi ragiona in termini di

Frutta everdura

Latte e carne

Prodotti ittici

Trasformazione

Magazzino

Distribuzione

Vendita al dettaglio

Preparazione domestica

Consumo

Partita

………..da un punto di vista strettamente tassonomico

FamigliaSpecie

Razza e Ceppo

Cernia

Tonno

Famiglie differenti

Sogliola (Solea vulgaris)

Passera pianuzza (Platichthys flesus flesus)

Famiglie differenti

Foto e testo tratti da: Enciclopedia illustrata delle SPECIE ITTICHE MARINE – Paolo Manzoni – I.G. DeAgostini

Sogliola (Solea vulgaris)

Sogliola dal porro (Solea lascaris)

Specie differenti

Foto e testo tratti da: Enciclopedia illustrata delle SPECIE ITTICHE MARINE – Paolo Manzoni – I.G. DeAgostini

Orata (Sparus aurata)

Salpa (Salpa salpa)

Generi differenti

Prodotto in filetto

Gli squali

Vertebra ciclospondila

spinaroli, gattuccio

Vertebra pseudoasterospondila

torpedini, squalo manzo

Vertebra asterospondila

smeriglio, palombi, pesce volpe, squalo elefante, verdesca, pesci martello

Vertebra tettospondila

razze, squadri

Gli squali

I controlli sono difficili…I controlli sono difficili…

GRANDI GRANDI QUANTITA’QUANTITA’ CONTROLLI CONTROLLI

DIFFICOLTOSIDIFFICOLTOSIGDOGDO

VENDITA DEL PESCE IN FILETTI, NON INTEROVENDITA DEL PESCE IN FILETTI, NON INTERO SPESSO SURGELATOSPESSO SURGELATO

D. M. 14 Gennaio 2005ALLEGATO

Elenco delle denominazioni in lingua italiana delle specie ittiche di interesse commerciale

Nr. Ordine Famiglia Genere e specieDenominazione

in lingua italiana

318 Pleuronectiformes Soleidae Buglossidium luteum Sogliola gialla

319 Pleuronectiformes Soleidae Dicologlossa cuneata Sogliola cuneata *

320 Pleuronectiformes Soleidae Microchirus ocellatus Sogliola occhiuta *

321 Pleuronectiformes Soleidae Microchirus variegatus Sogliola fasciata

322 Pleuronectiformes Soleidae Pegusa Kleini Sogliola turca

323 Pleuronectiformes Soleidae Pegusa macrophtalma Pegusa atlantica

324 Pleuronectiformes Soleidae Solea lascaris Sogliola dal porro *

325 Pleuronectiformes Soleidae Solea senegalensis Sogliola atlantica

326 Pleuronectiformes Soleidae Solea vulgaris Sogliola *

327 Pleuronectiformes Soleidae Synaptura spp. Sogliola oceanica

** Già presenti nel D.M. 27 Marzo 2002

Nell’attività di ispezione, vigilanza e controllo degli alimenti interessano

SpecieSessoEtàOriginePresenza di residui (biologici, chimici, fisici)Additivi non consentitiMicrorganismi patogeni

SospettoDeterminare se vi è stata una

sostituzione di specie

Conosco la tassonomia e dispongo di standard e sequenze

Cyt b mitocondrioPCR con primer universaliAnalisi del profilo di restrizione (RFLP)

Non ho alcuna informazione tassonomica

Cyt b mitocondrioPCR con primer universaliSequenziamentoConfronto con sequenze pubblicate

SospettoDeterminare se vi è stata una

sostituzione di specie

Conosco la tassonomia e dispongo di standard e sequenze

Cyt b mitocondrioPCR con primer universaliAnalisi del profilo di restrizione (RFLP)

Non ho alcuna informazione tassonomica

Cyt b mitocondrioPCR con primer universaliSequenziamentoConfronto con sequenze pubblicate

Mustelus asterias (M) palombo

Isurus oxyrinchus (I) smeriglio

Scyliorhinus canicula (S) gattuccio

Galeorhinus galeus (G) canesca

Squalus acanthias (Sa) spinarolo

Alopias superciliosus (A) squalo volpe

Prionace glauca (P) verdesca

Mustelus mustelus (M) palombo

M M I S G SaA P P

Marcatore di riferimento

Necessità di applicazione di tecniche più “potenti” per discriminare soggetti dello stesso genere

RAPD - AFLP

Citocromo b (359 bp)

Polimorfismo batteri del genere Bacillustecnica RAPD con primer da 10 bp

SospettoDeterminare se vi è stata una

sostituzione di specie

Conosco la tassonomia e dispongo di standard e sequenze

Cyt b mitocondrioPCR con primer universaliAnalisi del profilo di restrizione (RFLP)

Non ho alcuna informazione tassonomica

Cyt b mitocondrioPCR con primer universaliSequenziamentoConfronto con sequenze pubblicate

Totale concordanza fra la sequenza campione “PIPPO” e quella nota “PLUTO” identificato!

FREQUENZA DEGLI ALLERGENI ALIMENTARI(Popolazione colpita in occidente)

AlimentiFrequenza

(%)Pesce 16,3Uova 14,9Latte 13,8Crostacei 13,8Sedano 6,9Farina 4,8Frutta secca 4,7Mele 4,4Pesche 4,3Leguminose 3,8Patate 2,5Carne di maiale 1,3Banane 1,2Fragole 1,2Uva 1,1Yogurt 1,0Carne di pollo 0,9Melanzane 0,9Arance 0,9Carciofi 0,9

Allergia Intolleranza

Reazione immunitaria

Reazione metabolica

Allergeni alimentariResponsabili del 9% circa dei casi di shock anafilattico.

Nei bambini gli allergeni alimentari sono rappresentati essenzialmente dalla proteine del latte, dell’uovo e del pesce, nonché da alcuni vegetali (ad esempio dalle arachidi).

Negli adulti sono costituiti soprattutto da alimenti di origine vegetale.

Direttiva Europea 2003/89/CE

Gli ingredienti o le sostanze derivate dai seguenti allergeni alimentari – cereali contenenti glutine, crostacei, uovo, pesce, arachide, soia, latte, frutta con guscio, sedano, senape, semi di sesamo – utilizzati nella produzione alimentare e presenti nel prodotto finito devono essere obbligatoriamente segnalati in etichetta indipendentemente dalla quantità.

Alimenti compositi che ne possono contenere: prodotti di pasticceria e di gelateria, alcuni prodotti di salumeria (insaccati: salame, mortadella, etc.; prosciutto cotto, würstel, alcune margarine), prodotti di gastronomia (salse, creme e zuppe vegetali, alimenti preconfezionati o in scatola, etc.) Alimenti compositi che ne possono contenere: paste speciali, prodotti dolciari e di gelateria, cibi impanati e fritti, maionese e salse in genere, marsala all’uovo, etc.

Proteine del latte

Proteine dell’uovo

Mozzarella di bufala

Formaggio pecorino

Aggiunta fraudolenta dilatte vaccino

Danno economico (DOP)Rischio sanitario

AcidificazioneFilaturaSaleDisidratazione Tempo

Difficilmente applicabili tecniche immunoenzimatiche e elettroforetiche

Prodotti in taglio

Utilizzo di carne diversa da quella

dichiarata

Danno economico (DOP)Rischio sanitario

Aspetti etici e religiosiAcidificazioneSaleDisidratazionetempo

Difficilmente applicabili tecniche immunoenzimatiche e elettroforetiche

Insaccati

1 2 3 4 5 6 7 8

1e 2: Taq3 e 4: Hinf

Taq: taglia bufaloHinf: taglia bovino

191168

5,6,7 e 8: Taqmacinato di bovino (presenza di suino)

218141

5 bufalo6 bufalo7 bufalo e bovino8 bufalo e bovino

Limite di sensibilità 3-10% in funzione di

temperatura di cotturaconcentrazione salinaquantità d’acqua

RFLP

In alimenti compositi poligrana vi è la necessità di operare con oligonucleotidi specifici per la specie animale d’interesse

VantaggiElevata accuratezza e sensibilità

SvantaggiPossibilità di rilevare tracce di contaminazione accidentale (difficile interpretazione)

1 2 3 4 5 6 7 8

191168

218141

Sonda integra Sonda idrolizzata

Analisi dell’amplificato in tempo reale (Real Time) mediante misura della fluorescenza emessa da un frammento di una sonda

L’analisi molecolare “Real Time” ovvia agli inconvenienti/limiti di quella “End time”

Sensibilità (0,01% vs 0,001%)Limitato intervallo di linearità (< 2 Log)Bassa risoluzioneNon automatizzabileDiscriminazione basata sul peso molecolareUtilizzo di etidio bromuroObbligo di analisi post PCR

L’analisi “Real Time” oltre che qualitativa può essere quantitativa

Etichettatura degli alimenti contenenti ingredienti OGM > 0,9%(Reg. 1829/2003/CE)

Ricerca di allergeni negli alimenti

“Real Time” PCR

Ingrediente allergenico

Più rapido della “end time”Conoscenze e abilità tecnicheStrumentazione più complessa

Elevata sensibilità

Specifico

ELISA (immunoenzimatico)

RapidoFacile esecuzione

Strumentazione sempliceBuona sensibilità

Falsi negativiFalsi positivi

Proteina allergenica

Applicazioni in campo zootecnico

Emergenza BSE Relazioni con casi di malattia di Creutzfeldt-Jakob (nvCJD) nell’uomo

Bando all’uso di proteine derivate dai ruminanti (MBM) per l’alimentazione degli stessi

MBM (Meat and Bone Meal) ottenute con drastici trattamenti termici (130 °C – 2 bar – 20 min)

Impensabile o estremamente aleatorio l’utilizzo di tecniche immunoenzimatiche per la loro identificazione

1 2 3

1 e 3: DNA estratto da mangime2: DNA estratto da farina di carne

1 2

Carne in scatola

1: DNA estratto da gelatina2: DNA estratto da carne

1 2 3 4 5

Amplificato di DNA della specie bovina (farina animale) estratto da mangime

1: 3%

4: 0,125%

187 bp

5: 0,0625%

3: 0,5%

2: 1%

Concentrazione

Selezione genetica e disciplinari di produzione

La suinicoltura riveste un ruolo di primo piano nel settore agroalimentare italiano

mangimisticariproduzione e ingrassomacellazione trasformazione

Grande impegno gestionale e economicoper il miglioramento della qualità

genetica quantitativa (QTL)biotecnologie nutrizione e allevamento

La suinicoltura italiana presenta delle peculiarità che sono funzione dei prodotti di salumeria di alto pregio che la caratterizzano

Programma di selezione per l’eliminazione dei riproduttori potenzialmente PSE (miopatia essudativa)

La PSE ha la stessa base ereditaria dell’ipertermia maligna (MH), una sindrome che si manifesta in seguito al trattamento anestetico con alotano (singolo gene recessivo)

Le tecniche biomolecolari hanno permesso di individuare, nei soggetti portatori di MH, una mutazione nel gene che codifica la proteina che costituisce i canali che controllano l’eflusso di calcio durante la contrazione muscolare (Fujii et al., 1991)

Isolati tre genotipi nei confronti della sensibilità all’alotano Hal 1843™ potenzialmente PSE

CGC CGC

TGC UGC

DNA RNAmarginina

cisteina

NN non sensibile dominanteNn non sensibilenn sensibile recessivo

Restrizione dell’amplificato(74 bp) con Hin PI

La mutazione CGC TGC fa perdere il sito di restrizione per Hin PINn NN nn

744133

Eliminati, nei centri di riproduzione, i soggetti nn e Nn

Considerazioni conclusive

Chi produce e somministra alimenti deve garantire la sicurezza dei propri alimenti verso il consumatore (istituto dell’autocontrollo D. Lgs 155/97); il controllo ufficiale svolge funzione di supervisione, consulenza e verifica (D. Lgs 123/93)

Le tecniche di laboratorio biomolecolari si presentano come strumenti nuovi e efficaci a supportare l’attività di chi produce gli alimenti e di chi tutela la salute pubblica

Le potenzialità applicative sono vaste (controllo della specie animale o vegetale utilizzata fino all’identità dell’individuo)

Ci vuole chiarezza nella definizione degli obiettivi per la scelta degli strumenti più adatti alle finalità da perseguire (aspetti economici)