Test de detección de la Toxina A de Clostridium difficile

Estudiantes:Fabricio José Sevilla Acosta

Luis Benjamín Ramírez CisnerosKarla Coto Chinchilla

Jeffry Jiménez Delgado

CONTENIDO• INTRODUCCIÓN– Clostridium difficile y Colitis seudomembranosa– Toxinas A y B– Prueba de Citotoxicidad Celular

• TEST DE DETECCIÓN DE TOXINA A DE Clostridium difficile– Características– Fundamento– Metodología– Diagnóstico

INTRODUCCIÓN

Clostridium difficile

• Bacilo anaerobio Gram positivo.• Patógeno nosocomial.• Produce diarrea y colitis pseudomembranosa.• Asociado a antibióticos de gran espectro:

ampicilina y cefalosporinas.

Clostridium difficile

Figura 1. Clostridium difficile en tinción de Gram.

Clostridium difficile

Figura 2. Colonias de Clostridium difficile en Agar Sangre.

Clostridium difficile

Figura 3. Clostridium difficile en microscopía electrónica de barrido.

Colitis seudomembranosa

Figura 4. Colon con Colitis seudomembranosa debido a Clostridium difficile.

Toxinas

• Toxina A: – Secreción fluida, daño a mucosa e inflamación.

• Toxina B: – Más potente.– No es enterotóxica.

Prueba de Citotoxicidad celular• Fundamento: – Citotoxicidad: Interfiere en división celular.– Rojo neutro: Se acumula solo dentro de células

viables.• Método:– Se coloca la toxina y células en cultivo con rojo

neutro (células Vero). Se determina concentración de rojo neutro tras un tiempo.

• Características: – Determina Toxina B.– Tarda 48h.

TEST DE DETECCIÓN DE TOXINA A DE Clostridium difficile

Características

• Inmunoensayo rápido para detección cualitativa de la Toxina A de C. difficile en heces.

• Tarda 30min en dar Diagnóstico.

Fundamento de la prueba

• Anticuerpos monoclonales frente a la Toxina A de C. difficile unidos a partículas de látex color azul.

• Se determina mediante reacciones de tipo Antígeno- Anticuerpo que producen cambios de color.

METODOLOGÍA

Preparación de muestra

1. Añadir 1ml de diluyente de muestra a un tubo de micro-centrífuga (microtubo).

2. Añadir 100µl de heces líquidas o una porción de heces de 5mm de diámetro si son sólidas (dentro de 3h de su recogida).

3. Tapar el tubo y mezclar en “vortex” durante 10-15s.

4. Centrifugar a 13 500rpm por 10min.5. Utilizar sobrenadante como MUESTRA.

Equipo

Equipo

Metodología

1. Adición de 125µl de muestra a almohadilla absorbente en Ventana de Muestra.

− Anticuerpos monoclonales anti- Toxina A de ratón unidos a partículas azules de látex.

− Reacción Ag-Ac.

Metodología

2. Migración por capilaridad a la tira de prueba.

− Complejo Ag-Ac-Látex.− Anticuerpos monoclonales

de ratón unidos a látex azul y la muestra migran por tira de prueba.

Metodología

3. Ventana de resultados.

− Reacción complejo Ag-Ac-Látex y Anticuerpo fijado.

− Línea Azul.

Metodología

4. Ventana de control.− Muestra sigue migrando y

entra en contacto con anticuerpos de conejo anti-ratón y se forma una línea azul.

− Reacción complejo Ag-Ac-Látex y Anticuerpo Anti- Ratón.

− Indica que la prueba ha funcionado correctamente.

DIAGNÓSTICO

Diagnóstico• Consiste en demostrar la presencia de toxinas

de C. difficile en heces.• Se realiza siempre que un paciente tenga

diarrea asociada a uso de antibióticos.• Se realiza 30min después de colocada la

muestra.

Diagnóstico

* Puede haber diferencia entre el color en ventana de Control y Resultados.** Si no aparece la línea de Control se ensayará de nuevo.*** Si la línea no es azul en Resultados se considera negativa.

DEMOSTRACIÓN

GRACIAS