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FORMULACIÓN DE UN PROTOTIPO DE BIOFERTILIZANTE CON BASE EN Rhizobium sp.
DIEGO MAURICIO RIVERA BOTÍA
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Departamento de Farmacia
Maestría Ciencias Farmacéuticas
Bogotá, Colombia
2012
2
FORMULACIÓN DE UN PROTOTIPO DE BIOFERTILIZANTE CON BASE EN Rhizobium sp.
DIEGO MAURICIO RIVERA BOTÍA
Tesis presentada como requisito para optar al título de:
Magíster en Ciencias Farmacéuticas
Director:
M.Sc. Helber de Jesús Barbosa Barbosa
Codirector (a):
Ph.D. Ruth Rebeca Bonilla Buitrago
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Departamento de Farmacia
Maestría Ciencias Farmacéuticas
Bogotá, Colombia
2012
3
Yo nunca he dudado de Dios ni de mis
manos…
Maestro Antonio Bonilla
4
Agradecimientos
A Dios por permitirme tener la voluntad de seguir creciendo como persona y como
profesional…
A mi hermosa familia por ser el motor de mi existencia y la alegría de mi vida. En cada
momento se encuentran en mis pensamientos…
A mi amor Melissa Obando por ser lo más lindo de mi vida, mi fortaleza y la persona que
siempre ha estado en los momentos más difíciles de mi vida…
Al profesor Helber Barbosa Barbosa, por su acertada dirección de la investigación y por
siempre creer en mi y apoyarme en todos los sentidos…
A la Dra. Ruth Bonilla, por brindarme la oportunidad de seguir avanzando profesionalmente,
por su confianza, afecto y su linda familia que siempre han estado conmigo ofreciéndome
su más apreciado cariño.
A la Dra. Bibiana Vallejo por su valiosa asesoría en la utilización de polímeros…
A Daniel Rojas, Andrés Moreno y Sergio Pardo por su apoyo incondicional, aprecio y más
sincera amistad convirtiéndose en personas valiosas en mi vida…
A las Dras. Gloria Patricia Barrera, Cecilia Merkis, Stella Castro y Eliana Bianucci por su
valiosa asesoría y disposición en las microscopias electrónica de barrido y de transmisión.
A Plinio Sabogal, Jeisson Manrique, Julio Lara y todas las personas de Colorcón-Colombia
por su apoyo en el seguimiento de la investigación y aporte de equipos, personal
capacitado y excelente asistencia técnica.
A la Dra. Olga Lucía Ortíz de FMC Biopolymer por su contribución con los polímeros para la
investigación…
A Inés Roldan y Lady Molano por su ayuda desinteresada, entrega y energía para el logro
de este trabajo. Dios las proteja y las llene de mil bendiciones por el resto de su vida.
Y a todas las personas integrantes del Laboratorio de Microbiología de Suelos de Corpoica
que de alguna manera estuvieron involucradas en el desarrollo de la investigación y que en
este momento se me escapan de mi mente.
5
Contenido
.......................................................................................................................................................
..... Pág.
Lista de figuras ................................................................................................................................... 8
Lista de tablas ................................................................................................................................. 10
Lista de anexos ............................................................................................................................... 11
Lista de símbolos y abreviaturas .................................................................................................... 12
Resumen ......................................................................................................................................... 13
Introducción ..................................................................................................................................... 15
Justificación ..................................................................................................................................... 17
Capítulo I. Objetivos ..................................................................................................................... 19
Objetivo General ...................................................................................................... 19
Objetivos específicos ............................................................................................... 19
Capítulo II. Marco teórico ............................................................................................................. 20
2.1 Importancia de la fijación biológica de nitrógeno (FBN) en leguminosas ............ 20
2.2 Simbiosis Rhizobium-leguminosas ..................................................................... 22
2.3. Proceso de nodulación ...................................................................................... 25
2.4. Vehículos utilizados para la inmovilización de microorganismos ....................... 26
2.5 Formulaciones de inoculantes rizobianos ........................................................... 29
6
Capítulo III. Materiales y métodos .............................................................................................. 34
3.1 Localización del estudio ..................................................................................... 34
3.2 Microorganismo, medios y condiciones de cultivo ............................................... 34
3.3 Caracterización bioquímica e identificación molecular de la cepa G58 ............... 34
3.4 Caracterización de las actividades de promoción de crecimiento vegetal de la
cepa G58 ................................................................................................................. 37
3.5 Estudios de preformulación ................................................................................ 38
3.6 Evaluación en invernadero del efecto de los polímeros sobre la actividad
biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] ........................................... 40
3.7 Estudios de Formulación .................................................................................... 41
3.8 Técnicas microscópicas ..................................................................................... 42
3.9 Evaluación en invernadero del efecto de los prototipos de formulación sólida
sobre la actividad biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] .............. 43
Capítulo IV. Resultados y Discusión ......................................................................................... 45
4.1. Caracterización fenotípica, bioquímica y molecular de la cepa de Rhizobium
sp., G58 ................................................................................................................... 45
4.2. Caracterización de las actividades de promoción de crecimiento vegetal .......... 47
4.3. Estudios de preformulación ............................................................................... 48
4.4. Evaluación en invernadero del efecto de los tres polímeros seleccionados
sobre la actividad biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] .............. 57
4.5. Evaluación en invernadero del efecto de los prototipos de formulación sólidos
sobre la actividad biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] .............. 63
4.6. Evaluación de diferentes propiedades de los prototipos .................................... 67
Conclusiones ................................................................................................................................... 73
Recomendaciones .......................................................................................................................... 74
7
Bibliografía ....................................................................................................................................... 75
Anexos .............................................................................................. ¡Error! Marcador no definido.
8
Lista de figuras
Figura 1 Amplificación del 16S rDNA de la cepa G58 mediante electroforesis en gel de
agarosa al 2%. C5B: Cepa de referencia y MP: Marcador de peso molecular 1000 kb plus. ... 43
Figura 2 Árbol filogenético realizado mediante la amplificación del 16S rDNA. La
filogenia fue inferida por el método de Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) utilizando
el software Mega 5 (Tamura et al., 2011). Las distancias evolutivas se calcularon utilizando
el parámetro de Kimura 2-método (Kimura, 1980). Los números en los nodos representan
el porcentaje de bootstraping con 10000 repeticiones. La barra de escala =
0,02 sustituciones por sitio. ............................................................................................................. 45
Figura 3 Efecto de diferentes variables (A. pH; B. Temperatura; C. Consumo de glucosa y
producción de proteína; crecimiento en diferentes carbohidratos D. Manitol E. Glucosa F.
Sacarosa ......................................................................................................................................... 47
Figura 4 Efecto de ocho polímeros sobre la viabilidad de la cepa G58 durante dos meses
de evaluación .................................................................................................................................. 52
Figura 5 De izquierda a derecha. A. Formación de películas poliméricas, B. Permeabilidad
de los polímeros e C. Hinchamiento de los polímeros.… ............................................................. 54
Figura 6 Respuesta biológica del fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp], mediante la
implementación de polímeros con la cepa de Rhizobium sp., G58. ............................................ 56
Figura 7 Análisis de componentes principales de los tratamientos con polímeros. (A)
Diagrama de dispersión del análisis del experimento en invernadero con las componentes
PC1 y PC2; (B) Diagrama de dispersión del análisis del experimento en invernadero con
las componentes PC1 y PC3; y (C) Diagrama de dispersión del análisis del experimento en
invernadero con las componentes PC2 y PC3. Tratamientos y relación de símbolos: testigo
absoluto (), medio YM (), YM + alginato 1 (), YM + alginato 2 (), HPMC (). Cada
símbolo es el promedio de tres mediciones. ................................................................................. 60
Figura 8 Formulación de prototipos sólidos de biofertilizantes mediante lecho fluido y su
respuesta biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]. ............................................ 61
Figura 9 Análisis de componentes principales de los tratamientos con prototipos. (A)
Diagrama de dispersión del análisis del experimento en invernadero con las componentes
PC1 y PC2; (B) Diagrama de dispersión del análisis del experimento en invernadero con
las componentes PC1 y PC3. (C) Diagrama de dispersión del análisis del experimento en
invernaderos con las componentes PC2 y PC3. Tratamientos y relación de símbolos:
9
testigo absoluto (), medio YM líquido (), medio YM sólido (), YM + HPMC (), YM +
alginato 1 (Δ), YM + alginato 2 (). Cada símbolo es el promedio de tres mediciones. ............ 64
Figura 10 A. Liberación del principio activo (cepa Rhizobium sp., G58) y B. Porcentaje de
degradación de los prototipos de formulación, durante 5 días de evaluación. ............................ 67
Figura 11 A y B Microfotografía electrónica de barrido (R) Rhizobium sp. G58 superficie del
pellets; C y D Microfotografía electrónica de transmisión de la cepa de Rhizobium sp.G58.
Abreviaciones: Cuerpo de inclusión de PHB: Poli- β- hidroxibutirato, PC: Pared celular, MC:
Membrana celular, AC: Àcidocalcisomas, PF: Gránulos de polifosfato. C magnificación
20000 x, escala de barras representa 0,5 µm. D magdnificación 10000 x, escala de barras
representa 1,2 µm.. ......................................................................................................................... 69
10
Lista de tablas
Tabla 1 Iniciadores utilizados para la secuenciación del gen 16S rDNA de la cepa G58 .......... 35
Tabla 2 Tratamientos establecidos para determinar el efecto de los polímeros sobre la
actividad biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] .............................................. 39
Tabla 3 Tratamientos establecidos para determinar el efecto de los prototipos sólidos sobre
la actividad biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] .......................................... 42
Tabla 4 Caracterización de los polímeros utilizados para la inmovilización de la cepa G58 .... 49
Tabla 5 Caracterización de propiedades adicionales de los mejores polímeros
seleccionados .................................................................................................................................. 53
Tabla 6 Análisis de componentes principales-ACP del efecto de los polímeros sobre la
actividad simbiótica del Rhizobium sp. y la planta de fríjol cowpea. ............................................ 57
Tabla 7 Análisis de correlación entre las variables mediante componentes principales-ACP
con los políemros ............................................................................................................................ 58
Tabla 8 Análisis de componentes principales-ACP del efecto de los prototipos sobre la
actividad simbiótica del Rhizobium sp. y la planta de fríjol cowpea. ............................................ 62
Tabla 9 Evaluación de las capacidades de promoción de crecimiento en los prototipos de
formulación sólidos.......................................................................................................................... 66
11
Lista de anexos
Anexo 1 Medio de cultivo YMA (Vincent, 1970) ........................................................................... 93
Anexo 2 Solución de Hoagland (Hoagland y Arnon, 1950) ......................................................... 93
Anexo 3 Curva patrón biomasa seca de la cepa G58 ................................................................. 94
Anexo 4 Curva patrón proteína (Método de Bradford) ................................................................. 94
Anexo 5 Curva patrón azúcares totales (Método de Dubois) ...................................................... 94
Anexo 6 Curva patrón de fósforo (Método fosfomolibdeno) ........................................................ 95
Anexo 7 Curva patrón compuestos indólicos (AIA) ...................................................................... 95
Anexo 8 . Curva patrón de la actividad de reducción de acetileno (ARA) para bacterias
simbióticas ....................................................................................................................................... 96
Anexo 9 Análisis multivariado de los polímeros sobre la actividad simbiótica entre
Rhizobium sp., G58 y el fríjol cowpea ............................................................................................ 96
Anexo 10 Análisis multivariado de los prototipos sobre la actividad simbiótica entre
Rhizobium sp., G58 y el fríjol cowpea ........................................................................................... 98
12
Lista de símbolos y abreviaturas
DNA Ácido desoxiribonucleico
RNA Ácido ribonucleico
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
NCBI Centro nacional de información biotecnológica
FBN Fijación biológica de nitrógeno
UFC Unidades formadoras de colonia
AIA Ácido indol acético
ARA Actividad de reducción de acetileno
DO Densidad óptica
USP Farmacopea de los estados unidos
PEG Polietilenglicol
PVA Alcohol polivinílico
PVP Polivinilpirrolidona
HPMC Hidroxipropilmetilcelulosa
μg Microgramo
ml Mililitro
min Minuto
ng Nanogramo
nm Nanomol
rpm Revoluciones por minuto
mm Milimetro
13
Resumen
El desarrollo de nuevas formulaciones de rizobios con materiales poliméricos
mediante la aplicación de técnicas de recubrimiento, brinda grandes ventajas como la
de controlar la liberación del ingrediente activo, ofrecer protección frente a las
condiciones ambientales; además de permitir mantener viables las células
microbianas sin la pérdida de las capacidades metabólicas y fisiológicas. Por tal
razón, se propuso desarrollar un prototipo de formulación sólido, utilizando polímeros
como vehículo para evaluar su efecto sobre la actividad biológica entre la simbiosis
de Rhizobium sp. y fríjol cowpea en invernadero. Se realizaron inicialmente diversos
estudios para la caracterización molecular de la bacteria, así como los estudios de
preformulación para analizar la influencia de factores fisicoquímicos y el
comportamiento de los polímeros sobre la bacteria. Se evidenció que la cepa G58,
pertenece al género Rhizobium, lo anterior se realizó mediante la identificación
molecular a través de la amplificación del fragmento 16S rDNA presentando un 99%
de similitud. A su vez, se demostró un amplio rango de tolerancia de la bacteria a
diferentes pHs, temperatura y fuentes de carbono. De igual forma, se estableció
mediante el test de Tukey (P<0,05) la influencia negativa del polietilenglicol,
carbómero y alcohol polivinílico sobre la viabilidad celular del microorganismo;
obteniendo mejores resultados cuando fueron empleados dos polímeros de alginato
de sodio y la hidroxipropilmetilcelulosa. De un total de ocho polímeros estudiados
sólo los tres anteriormente citados fueron seleccionados y a los cuales se les
determinó la capacidad de formación de película, la permeabilidad y la capacidad de
hinchamiento como aspectos adicionales en la caracterización de los materiales
poliméricos. Mediante la utilización de la técnica de lecho fluidizado, se obtuvo los
prototipos de formulaciones sólidas y se cuantificó las actividades de promoción de
crecimiento sin presentar efectos negativos sobre sus capacidades biológicas. Una
vez realizados estos estudios, se procedió a evaluar mediante dos experimentos bajo
invernadero el efecto de las preparaciones poliméricas y los prototipos de formulación
sólidos, sobre la actividad simbiótica entre la cepa G58 y la planta de fríjol cowpea
[Vigna unguiculata (L.) Walp]. Finalmente, los resultados obtenidos mediante un análisis
multivariado de componentes principales mostraron que la aplicación de los polímeros bajo
las dos presentaciones no presentaron efectos negativos sobre la actividad de fijación
biológica de nitrógeno, mostrando mejores respuestas en los prototipos de formulaciones
sólidas, debido al proceso de recubrimiento, el cual permitió controlar la liberación de la
bacteria y cederla adecuadamente.
14
Palabras clave: Rhizobium sp., Polímeros, Fríjol Cowpea, Fijación biológica de nitrógeno,
prototipos, recubrimiento
Abstract
Development of new formulations of rhizobia with polymeric materials by implementing
coating techniques, provides great advantages because firstly controls the release of the
active ingredient, offering protection against environmental conditions and likewise, allow to
maintain viable microbial cells without loss of metabolic and physiological capabilities. For
this reason, was proposed to develop a solid formulation prototype using polymers as
vehicles to evaluate their effect on biological activity between the symbiosis Rhizobium sp.-
cowpea in the greenhouse. Was initially established several studies on molecular
characterization of the bacteria and preformulation of studies to analyze the influence
physicochemical factors and the behavior of polymers on the bacteria. It showed that strain
G58, belongs to the genus Rhizobium sp., the above was performed by amplification of 16S
rDNA fragment showing a 99% similarity. In turn, was demonstrated a wide range of
tolerance of the bacterium at different pHs, temperature and carbon sources. Similarly, was
established through the Tukey test (P <0.05) the negative influence of polyethylenglycol,
carbomer and polyvinyl alcohol on cellular viability of the microorganism; showing better
results when the two polymers used sodium alginate and hydroxypropylmethylcellulose.
Therefore, from a total of eight polymers were selected these last three, to which they
studied the ability of film formation, permeability and swelling as additional aspects in the
characterization of polymeric materials. In addition to this, was obtained through the fluidized
bed, the solid formulation prototypes, at them was quantified the growth promotion activities
without submitting negative effects on their biological capabilities. Once these studies were
conducted, proceeded to assess by greenhouse experiments two the effect of polymer
preparations and solid formulation prototypes on the symbiotic activity between the G58
strain and the cowpea plant [Vigna unguiculata (L.) Walp]. Finally, the results obtained by
multivariate analysis of principal components showed that the application of polymers in the
two presentations had no negative effects on the activity of biological nitrogen fixation,
showing responses better in the prototypes of solid formulations, due to the coating process,
which allowed control the release of the bacteria and transfer it appropriately.
Keywords: Rhizobium sp., Polymers, Cowpea bean, Biological nitrogen fixation,
prototypes, coating.
15
Introducción
En los últimos años, a medida que la agricultura avanza hacia el sostenimiento de la
alimentación mundial mediante la implementación de estrategias biotecnológicas
sostenibles, en Colombia se sigue empleando fertilizantes de síntesis química y
agroquímicos para mantener una alta producción agrícola, sin importar el gran deterioro
ocasionado a los agroecosistemas, evidenciándose esta problemática principalmente en la
capacidad productiva del suelo, productos agrícolas alterados, contaminación de fuentes
hídricas y problemas de salud presentados en la comunidad (Higa y Parr, 1994; Rojas y
Moreno, 2008).
Esta situación ha generado la tendencia hacia el desarrollo de tecnologías que involucran
el uso de diferentes microorganismos con potencial biofertilizante, enfocándose
principalmente hacia los rizobios que tienen la habilidad de establecer simbiosis con plantas
leguminosas contribuyendo en un alto porcentaje en la sustitución de fertilizantes mediante
un proceso de fijación biológica de nitrógeno (FBN). La aplicación de éstas tecnologías
tendrá un gran impacto medioambiental y social, gracias a la reducción de costos de los
fertilizantes nitrogenados de síntesis, equilibrio en el ecosistema y contribución a mejores
rendimientos en planta sin provocar deterioro de las capacidades productivas del suelo,
lixiviación y eutrofización de fuentes hídricas (Ben Rebah et al., 2007).
El empleo de fertilizantes biológicos ha crecido ostensiblemente en las dos últimas décadas
según lo reportado por Carvajal y Mera (2010). Por estas razones, la búsqueda
de vehículos alternativos para la inmovilización de microorganismos ha sido objeto de
intensa investigación científica. Con el fin de aumentar la efectividad de los inoculantes, su
eficiencia, reducir los costos de producción y los impactos ambientales, los materiales
poliméricos han sido una alternativa para ser incluidos en las formulaciones, (Ben Rebah
et al., 2007; Albareda et al., 2008; Dommergues et al., 1979; Jawson et al., 1989;
Denardin y Freire, 2000; Schuh, 2005; Deaker et al., 2007), ya sea para transportar el
ingrediente activo ó para protegerlo, en este caso particular el de formar parte de
formulaciones de tipo rizobios (Dommergues et al., 1979; Denardin y Freire, 2000; Sarr
et al., 2005; Bashan y Gonzales, 1999).
Por lo tanto, los polímeros juegan un papel importante como vehículos en formulaciones
basadas en microorganismos con potencial biofertilizante gracias a las propiedades que los
rigen, aportando soluciones innovadoras y de avance tecnológico que promuevan
beneficios sostenibles a nuevas posibilidades de integración de éstas sustancias con
sistemas biológicos. Por tal razón, el objetivo de esta investigación fue desarrollar un
16
prototipo de formulación, utilizando polímeros con la finalidad de estudiar nuevos soportes
para inoculantes basados en rizobios y que permitan mejorar su utilización con el propósito
de contribuir a la seguridad alimentaria.
17
Justificación
Son varias las especies de leguminosas comestibles que se siembran en Colombia,
concentrándose principalmente en la Región Andina y valles interandinos. Colombia es el
primer país productor de fríjol en la Zona Andina, con cerca de 130.000 hectáreas
sembradas en el año 2007. El aumento de la siembra de leguminosas ha incrementado en
los últimos tres años, ocupando el primer lugar el fríjol común (Phaseolus vulgaris L), con
133.720 hectáreas, mientras que en la Región Caribe, la importancia se enfoca
especialmente hacia el fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp], con 4.600 de hectáreas
sembradas (DNP 2010). Debido a la alta importación del fríjol, la demanda es más alta que
la oferta, por lo que se está incentivando la siembra de esa leguminosa en regiones
tropicales (MADR, 2010).
Se considera que los bajos contenidos de nitrógeno en los suelos de regiones tropicales es
uno de los factores que influyen negativamente sobre la producción forrajera. Además de
los elevados costos de los agroquímicos como fuente de nitrógeno, para lograr el máximo
rendimiento de los cultivos, los cuales los hace menos viables en su uso (Cuesta-Muñoz,
2005; Franco y Döbereiner, 1994). Cabe resaltar que de los nutrientes minerales, el
nitrógeno es el de mayor costo, el que consume mayor energía en su producción y
distribución; y potencialmente el más contaminante, siendo el factor más limitante en la
óptima producción de forraje. De igual manera, se ha evidenciado la baja eficiencia de
utilización de las fuentes nitrogenadas de síntesis (12-74%) en cultivos tropicales, lo cual
está asociado a elevada lixiviación y desnitrificación.
Ante esta situación se busca brindar soluciones aplicables a los problemas críticos que
afectan la productividad del forraje mediante la utilización de microorganismos diazotróficos
que contribuyan a la deficiencia de nitrógeno en el suelo. Basando las soluciones
principalmente en una problemática en la cual la fertilidad del suelo se ve afectada en
relación con la disponibilidad de nutrientes, donde la incorporación de microorganismos
simbióticos fijadores de nitrógeno con una aplicabilidad futura dentro de inoculantes
biológicos, se presenta como la solución más adecuada.
El uso de fertilizantes biológicos permitirá la sostenibilidad de los sistemas agropecuarios,
mitigando el efecto de la marcada estacionalidad en las precipitaciones de la zona,
aumentando la captura de carbono, reduciendo la emisión de gases que generan el efecto
invernadero, permitiendo la utilización de nuestra biodiversidad aún inexplorada,
disminuyendo los costos de producción, evitando la fuga de divisas en la compra de
agroquímicos y permitiendo que el sistema agropecuario de la región Caribe sea más
18
competitivo, sostenible y que contribuyan a mitigar el cambio climático del planeta (Acuña
et al., 2006).
La tendencia mundial en la utilización de materiales biodegradables como los polímeros,
constituye una alternativa prometedora, fundamentada en sus propiedades y
características que les permiten ser utilizados en el diseño de formulaciones de
bioproductos con fines sostenibles. Por esta razón, el empleo de polímeros como estrategia
de innovación tecnológica, encaminada al estudio del comportamiento de éstos materiales
con bacterias fijadoras de nitrógeno es de gran importancia para el país.
19
Capítulo I. Objetivos
Objetivo General
Formular un prototipo de biofertilizante con base en Rhizobium sp.
Objetivos específicos
1. Desarrollar estudios de preformulación con el fin de seleccionar polímeros
compatibles con Rhizobium sp.
2. Evaluar un prototipo de formulación utilizando como vehículo los polímeros
seleccionados con la bacteria Rhizobium sp.
3. Evaluar la eficacia del prototipo de formulación sobre el fríjol cowpea [Vigna
unguiculata (L.) Walp] a nivel de invernadero.
20
Capítulo II. Marco teórico
2.1 Importancia de la fijación biológica de nitrógeno (FBN) en leguminosas
La FBN es el proceso que transforma el nitrógeno atmosférico, que es inerte, en una forma
biológicamente útil siendo la principal forma de entrada en ecosistemas desérticos (Zahran,
2001). Químicamente, este es similar al proceso Haber-Bosch (N2 + 2H2 → 2NH3, 500ºC y
350 atm), que es el método comercial de la producción de amoniaco para fertilizantes
nitrogenados, consumiendo una gran cantidad de energía, estimándose que se necesitan
1,5 Kg. de combustible por cada Kg. de nitrógeno fijado. Lo anterior implica un alto costo
económico (Ndakidemi et al., 2006) y así mismo, el suministro de forma sintetiza en la
agricultura afecta considerablemente el suelo haciéndose insostenible por su continuo uso
reflejándose en bajos rendimientos en los cultivos (Mahecha, 2002; Angelini et al., 2011).
El proceso de FBN es utilizado en la naturaleza por diferentes géneros bacterianos. Las
plantas se benefician de este proceso cuando las bacterias mueren y liberan el nitrógeno al
suelo ó cuando las bacterias viven en estrecha asociación con las plantas (Willems,
2006). Resaltando principalmente esta asociación simbiótica, la cual se presenta en los
cultivos de leguminosas. Estos microorganismos, denominados rizobios, viven en los
nódulos de las plantas fijando el nitrógeno en forma de amonio, que es absorbido por las
plantas (Herridge et al., 2008; Angelini et al., 2011). Si bien existe una amplia gama de
organismos y asociaciones vegetales que son capaces de fijar N2 de la atmósfera, la
relación simbiótica entre rizobios y leguminosas es responsable de contribuir con la mayor
cantidad de nitrógeno fijado en especies agrícolas (Peoples et al., 1995; Chianu et al.,
2010). Las leguminosas de grano contribuyen con más de 20 millones de toneladas de N2
fijado a la agricultura de cada año (Herridge et al., 2008). Por lo tanto, la importancia de la
FBN como el principal mecanismo para el reciclaje de nitrógeno de la atmósfera a formas
disponibles en la biosfera no puede ser exagerada. La fijación de nitrógeno en la biosfera
se estima en unos 275 millones de Tm. anuales, de los cuales 30 corresponden a causas
naturales, 70 a fijación industrial y 175 al proceso de fijación biológica (Burns y Hardy,
1975), haciendo parte microorganismos diazotróficos de vida libre, asimbióticos y
simbióticos (Marín et al., 1999). Las entradas en los ecosistemas terrestres de FBN a partir
de la relación simbiótica entre leguminosas y sus rizobios es de 70.000.000 toneladas de
N2/ha/año (Brockwell et al., 1995). Esta cantidad puede aumentarse en la medida que la
población mundial se incremente y las fuentes naturales que suplen los fertilizantes
nitrogenados disminuyan.
21
El empleo elevado de fertilizantes nitrogenados representa una carga medioambiental, que
incluye la contaminación del aire, la lluvia ácida, contaminación del agua por nitrato, así
como eutrofización y reducción de la biodiversidad (Socolow, 1999). Las grandes
aplicaciones de fertilizantes nitrogenados para maximizar la producción en los países
desarrollados sólo exacerbarán estos problemas, mientras que en los países
subdesarrollados el alto costo y los problemas de distribución continuarán siendo las
limitantes. Esto indica que la fijación biológica del nitrógeno por microorganismos,
especialmente los de tipo simbióticos, proporcionan una alternativa económica, viable y
ecológicamente sana que pudiera contribuir a mitigar esta problemática de forma
sustentable (Sylvia et al., 2005).
Aproximadamente el 80% del nitrógeno fijado biológicamente en la agricultura, proviene de
la simbiosis entre las leguminosas y las especies de Rhizobium, Bradyrhizobium,
Sinorhizobium, Azorhizobium, Mesorhizobium y Allorhizobium (Vance, 1998). De esta unión
se forma, a nivel radicular, un órgano llamado nódulo dentro del cual se transforma el
nitrógeno (N2) del aire en amonio (NH4+), gracias a la acción de la enzima nitrogenasa
(Baca et al., 2000), que es una forma asimilable por las plantas.
Para el año 2025 se espera que la población mundial haya crecido hasta un 40%
(Mannion, 1998). Teniendo en cuenta que aproximadamente 11g de nitrógeno se
consumen por persona cada día (Frink et al., 1999) y que las leguminosas aportan hasta el
80% de las necesidades dietéticas (Singh et al., 2003) en la mayor parte de los trópicos y
subtrópicos, se necesitaría para entonces un incremento desmesurado en la producción
agrícola mundial con el fin de disminuir la brecha entre población humana y abastecimiento
de proteína (Rangel et al., 2004; Siddhuraju et al., 1996).
2.1.1 Fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]
La familia leguminosae son una de las plantas más cosmopolitas, debido a que alimenta
la mayoría de la población mundial (Lewis et al., 2005; Singh et al., 2003). El fríjol cowpea
es una leguminosa originaria de África, es un importante cultivo anual en las regiones
tropicales y subtropicales (Duke, 1981; Singh et al., 2003; Steele et al., 1985), que contiene
un abastecimiento significativo de proteínas importante en la dieta alimenticia para la
población de países en vía de desarrollo (Ramakrishnan et al., 2005). Es uno de los cultivos
más extensamente adaptados, versátiles y nutritivos. Y se cultiva en cerca de 7 millones de
hectáreas en regiones cálidas del mundo (Rachie, 1985).
22
Es ampliamente cultivada en diferentes climas y regiones geográficas de África, Asia y
América (Ehlers y Hall, 1997) y juega un papel importante en la economía local y la
agricultura sostenible. Presenta un amplio rango de hospederos de especies de rizobios
comparada con otras especies vegetales. El cultivo es tolerante a la baja fertilidad,
presentando altas tasas de fijación de nitrógeno (Elowad y Hall, 1987).
Según la FAO (2001), el 64% de la producción mundial de frijol en África occidental se
produce en aproximadamente 10 millones de hectáreas, donde es esencial para restaurar
la fertilidad del suelo en los sistemas de cultivo tradicionales. Sin embargo, la producción de
frijol en las zonas de sabana, y el Sahel de África Occidental, en particular, es insuficiente
para la seguridad alimentaria (Ehlers y Hall, 1997). Estos bajos rendimientos se comparan
con los registrados en América del Norte, en gran parte debido al déficit hídrico (Sarr et al.,
2001) y baja disponibilidad de fósforo (Summerfield et al., 1974).
Hoy en día, se hace más sostenible y abarca mayor preferencia, realizar combinaciones
entre leguminosas y gramíneas, debido a que la base constitutiva se enfoca en mantener la
fertilidad del suelo y la producción de carne de rumiantes (Walzl et al., 2011). Para mejorar
la calidad y el rendimiento del fríjol cowpea, la inoculación de rizobios seleccionados de la
comunidad nativa con una alta capacidad de nodulación y fijación de nitrógeno, se
convierte en una importante herramienta biotecnológica (Kremer y Peterson, 1983; Zilli et
al., 2004).
La especie de leguminosa tiene un alto potencial como abono verde. Puede ser
incorporado en el suelo de 8-10 semanas después de la siembra, y puede proporcionar el
equivalente de 80 kg/ha de N2 para un cultivo posterior. Las estimaciones de nitrógeno
fijado de fríjol a menudo van de 50 a más de 100 kg/ha. Así mismo, se puede obtener
excelente heno y ensilado en particular, para la utilización en cultivos mixtos de sorgo, frijol
y forraje ó mijo (Carvalho et al., 1998; Davis et al., 1991; Ehlers y Hall, 1997).
Se adapta a una amplia gama de suelos de arenas a suelos arcillosos pesados, bien
drenados, con una preferencia por suelos más ligeros que permiten un buen enraizamiento.
Crece así también en suelos de textura pesada fuertemente alcalinos. No tolera las
inundaciones extendidas o la salinidad. Crece desde el nivel del mar hasta los 1500 msnm,
dependiendo de la latitud (Carvalho et al., 1998; Davis et al., 1991; Ehlers y Hall, 1997).
2.2 Simbiosis Rhizobium-leguminosas
La mayor parte del amonio del proceso de fijación de nitrógeno es aportado por la simbiosis
Rhizobium-leguminosa (Newton, 2000; Zahran, 1999; Long, 1989; Pawlowski et al., 1996;
23
Fauvart y Michiels, 2008, Chang et al., 2009; Catherine et al., 2009, Herder y Parniske,
2009), que se inicia por la infección en leguminosas por bacterias (Rhizobium), lo que
resulta en la formación de nódulos de las raíces. Dentro de los nódulos, los rizobios se
encuentran como bacteroides, que realizan la fijación de nitrógeno: para hacer esto,
obtienen fuentes de carbono y la energía de la planta, en forma de ácidos dicarboxílicos
(Vance, 2000; Poole y Allaway, 2000). Se ha pensado que los bacteroides simplemente
proporcionan amonio a la planta. Sin embargo, se muestra que un proceso más complejo
“ciclo de los aminoácidos”, es esencial para la fijación simbiótica de nitrógeno
por Rhizobium sp., en los nódulos de guisantes. La planta proporciona los aminoácidos
para los bacteroides, que les permita cerrar su asimilación de amonio. A cambio, los
bacteroides actúan como orgánulos de plantas para el ciclo de los aminoácidos para la
síntesis de asparagina. La dependencia mutua de este cambio evita la simbiosis de ser
dominado por la planta, y proporciona una presión selectiva para la evolución de la
simbiosis (Lodwig et al., 2003).
Las etapas iniciales en la formación de nódulos requiere la expresión de genes de la
nodulación específica (nod) de rizobios que conduce a la síntesis de un grupo de moléculas
de señalización que inducen la morfogénesis de los nódulos. Dentro de los nódulos, la
forma de fijación de nitrógeno de rizobios, conocido como bacteroides, están rodeadas por
una membrana derivada del huésped llamado membrana peribacteroidal (MPB), que
controla el intercambio molecular entre el bacteroide y las leguminosas (Panter et al., 2000).
A estos grupos de bacteroides rodeados por la MPB se les llama simbiosomas (Brewin,
2003). El factor nod (genes) de Rhizobium es el responsable de la iniciación del nódulo que
es un lipoquitooligosacárido (LCO) y juega un papel fundamental en la inducción de
respuestas simbiótica del desarrollo en las legumbres, que conduce a la formación de
nódulos en las raíces de las leguminosas (Spaink, 1996; Rolfe et al., 2003).
En la simbiosis, la planta huésped tiene la información genética para la infección simbiótica
y para la nodulación. El papel de la bacteria es sólo el de disparar el proceso. Este proceso
de asociación simbiótica centra su importancia en dos aspectos fundamentales de la
relación rizobio-planta: la preinfección o atracción quimiotáctica de la bacteria por la planta
seguida de la inducción de cambios estructurales en los pelos radicales y la infección
donde la bacteria entra en el pelo y forma canales, recubiertos por nuevo material de pared
celular, que van ramificándose (Olivares y Barea, 1995). La simbiosis Rhizobium-
leguminosa tiene una enorme importancia ecológica y agronómica, y constituye una fuente
importante de nitrógeno, y por lo tanto desempeñan un papel esencial en la estructura de
los ecosistemas y la agricultura sostenible (Lindström et al., 2010).
24
La relación entre el nitrógeno absorbido desde el suelo y el proveniente de la simbiosis
varía con la especie de leguminosa, las condiciones ambientales y las características
genéticas del microsimbionte (Shabaev et al., 1996). En primera instancia, mientras se
genera el sistema nodular, la planta utiliza nitrógeno del suelo. Si hay mucho nitrógeno en
el ambiente de la raíz, el número de nódulos formados será menor (González, 2002). Las
plantas absorben el nitrógeno del suelo en forma de nitrato o amonio, donde el exceso de
nitrógeno en el suelo en forma de nitratos, tiene un efecto inhibitorio sobre la simbiosis en
todos los pasos, desde la infección, formación del nódulo y la fijación de N2 (Fernández,
2003). Así, el aporte global por FBN para las leguminosas es menor en suelos bien
provistos de nitrógeno que en aquéllos en que el nutriente es deficitario (González, 2002;
Pietrarelli et al., 2008).
2.2.1 Generalidades de Rhizobium sp.
La taxonomía de los rizobios, ha cambiado considerablemente en los últimos 20 años, con
el género Rhizobium, un miembro de α-Proteobacteria, ahora se divide en varios géneros.
El estudio de plantas promiscuas hospederas, dispersas geográficamente, ha sido fuente
de muchas especies nuevas y se espera que se produzca muchos más. Recientemente,
una serie de aislamientos se han registrado en los nódulos de las leguminosas, con
capacidad de fijación de nitrógeno, pero filogenéticamente se ubican fuera de los grupos
tradicionales de rizobios en α-proteobacterias. Nuevas líneas de simbiontes que presentan
la fijación de nitrógeno de leguminosas incluyen Blastobacter, Methylobacterium, Devosia,
Ochrobactrum y Phyllobacterium en α-proteobacterias y Burkholderia, Herbaspirrillum,
Ralstonia y Cupriavidus en β--proteobacteria (Willems, 2006; Lindström y Martínez-
Romero, 2007).
De la filogenia del 16S rDNA, está claro que Rhizobium y Agrobacterium están fuertemente
relacionadas y sus especies están entrelazadas (Young et al., 2003). Young et al. (2001)
propusieron la transferencia de todos estos taxones de Rhizobium. Se planteó unir a A.
radiobacter y A. tumefaciens en R. radiobacter; mientras que A. rhizogenes en R.
rhizogenes. Por otra parte, A. rubi y A. vitis se transfieren a Rhizobium, como especies
distintas y A. larrymoorei como R. larrymoorei (Young, 2004; Young et al., 2006).
Desde la década de los 80, con la introducción de características genéticas (ADN-ADN y
las hibridaciones ADN-rARN, catálogos rARN, secuenciación del rADN) una mayor
diversidad fue descubierta entre los rizobios y sus relaciones con otros grupos de bacterias
se hizo evidente. Esto condujo a un aumento gradual en el número de géneros. En
25
paralelo, también ha habido un aumento significativo en el número de especies
validamente publicadas con 48 especies de rizobios reconocidas (Willems, 2006).
Descripción microscópica y macroscópica: Bacilos de 0.5-1.0 X 1.2-3.0 µm. Gram
negativos. Móvil por flagelos perítricos. Las colonias son usualmente blancas o beige,
circulares convexas, semitraslúcidas u opacas, a veces mucoides, usualmente de 2-4 mm
de diámetro dentro de 3-5 días de incubación en medio YMA (Levadura-Manitol-Sales-
Agar). El crecimiento en un medio de carbohidratos es usualmente acompañado por
abundante cantidad de exopolisacáridos extracelulares. Desarrollan una pronunciada
turbidez de 2 a 3 días en caldo aireado ó agitado (Kuykendall et al., 2005).
Metabolismo: Aerobios, su temperatura óptima de crecimiento se encuentra entre 25 y 30
ºC; algunas especies pueden crecer a temperaturas de 40 ºC. El pH óptimo de crecimiento
está entre 6.0 y 7.0. Sin embargo, pueden predominar entre valores de 4.0 a 10.0. El
tiempo de generación de las cepas de Rhizobium sp. está entre 1.5-5.0 horas (Kuykendall
et al., 2005).
Es quimiorganoheterótrofo, utiliza un amplio rango de carbohidratos y sales de ácidos
orgánicos como única fuente de carbono, sin formación de gas. No son capaces de
metabolizar la celulosa y el almidón. Producen una reacción ácida en medio mineral que
contenga sales y manitol u otros carbohidratos. Las sales de amonio, de nitrato y la
mayoría de los aminoácidos pueden servir como fuente de nitrógeno. Algunas cepas
requieren factores de crecimiento como biotina, pantotenato ó ácido nicotínico. La peptona
es pobremente utilizada mientras que la caseína, el almidón y la quitina y el agar no son
hidrolizados (Kuykendall et al., 2005).
2.3. Proceso de nodulación
Este proceso se caracteriza por la atracción y reconocimiento entre la leguminosa y la
bacteria. El Rhizobium entra a la planta a través de los pelos radiculares, formando una
estructura llamada hilo de infección (Masson-Boivin et al., 2009), e infecta intracelularmente
a las células corticales de la raíz. Una vez dentro de la célula, las bacterias se diferencian
en bacteroides y comienza el proceso de la fijación de nitrógeno (Giles et al., 2008).
Durante los eventos iniciales de la interacción, se expresan los genes de las nodulinas
tempranas de la planta, que participan principalmente en el desarrollo o formación del
nódulo (Oldroyd et al., 2005). Cuando se da la unión de los rizobios a los pelos radicales, se
26
induce un cambio en la dirección de crecimiento apical, generándose una deformación y
curvatura de los pelos radicales o “curling” donde quedan atrapadas las bacterias. Se forma
un canal de infección por donde entran los rizobios al citoplasma de las células vegetales
por un mecanismo similar a la endocitosis (Carlson et al., 1994).
La simbiosis Rhizobium-leguminosa se inicia por los exudados de las raíces de plantas que
soportan el crecimiento de rizobios y expresión de los genes de nodulación. Entre
estos elementos los flavonoides (por ejemplo: luteolina, narigenina y genisteína) que
específicamente interactúan con proteínas bacteriana NodD activando la expresión de los
genes (nod), dando lugar a la formación y secreción de los factores de nodulación
(D'Haeze y Holsters, 2002).
Los factores Nod están constituidos por una estructura básica que consiste en oligómeros
de N-acetilglucosamida, unidos por un enlace β 1-4, con diversas sustituciones; al
interactuar con la planta, los factores Nod estimulan la división de las células vegetales
induciendo el enroscamiento de los pelos radiculares, dando lugar a las estructuras
conocidas como nódulos (Bordeleau y Prevost, 1994). Casi todos los rizobios tienen los
genes nodABC en común. NodC sintetiza los quitooligosacáridos; NodB y NodA, la
estructura base de deacetilato y N-acilato, respectivamente. Las modificaciones de la
estructura de los factores nod dependerá de los genes de nodulación de la cepa específica
que codifican las enzimas que sintetizan los precursores utilizados por transferasas (por
ejemplo: nodH, nodPQ y nodL). Los genes nodIJ son los responsables de la secreción de
los factores nod. Las diferencias en la estructura de los factores nod juegan un papel
importante en la especificidad del hospedador de cepas de rizobios (D'Haeze y Holsters,
2002)
2.4. Vehículos utilizados para la inmovilización de microorganismos
El portador más común de inoculantes para leguminosas rizobios utilizados en todo el
mundo es la turba (Denardin y Freire, 2000; Deaker et al., 2004). Este soporte presenta
cualidades apropiadas, tales como una buena protección para las células bacterianas
contra la desecación y la toxicidad de la semilla y en el suelo. Sin embargo, presenta
algunas desventajas como son: la composición, variables físicas y químicas, que pueden
influir en la uniformidad y la calidad de los productos (Halliday y Graham, 1978;
Paczkowsky y Berryhill, 1979), gastos de preparación, que consiste en la excavación, el
secado, la molienda, la neutralización, empaque y esterilización. Siendo, el proceso de
esterilización por rayos gama (γ) muy perjudicial, debido a que estos rayos chocan con los
átomos de los materiales biológicos, tales como proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos
27
nucleicos, provocando que estos átomos se ionicen y reciban daños directos. Entre estos
materiales biológicos, el ácido nucleico es el material más sensible a la radiación
ionizante a pesar de presentar el 1% en los componentes celulares (1%). Y la última
desventaja, es el rechazo por parte del agricultor a gran escala, debido principalmente
a una mayor complejidad en la inoculación y la abrasividad de la maquinaria de siembra.
En algunos países debido a políticas para la preservación de las zonas de humedales, la
explotación de la turba es controlada ó prohibida (Temprano et al., 2002). El pH de la turba
es otro factor importante en el crecimiento y mantenimiento celular. Las fuentes de turba
utilizada para la producción de inoculantes rizobianos son muy ácidas, lo que hace que sea
necesario para corregir el pH, emplear el carbonato de calcio o de magnesio (Deak et al.,
2004; Daza et al., 2000). Garantizar el mantenimiento de la humedad entre 40 y 50% es
esencial para la viabilidad celular y la proliferación rizobianas y cuando la turba es
previamente desecada a 100 ºC, la supervivencia de los rizobios se ve comprometida
debido al secado del material. El autoclave ó la esterilización con radiación gamma puede
causar la producción de sustancias tóxicas para las células rizobianas, la reducción de la
supervivencia celular, por lo tanto, la ineficacia de los inoculantes (Daza et al., 2000). Para
evitar estos problemas se requiere medidas adicionales en la producción de inoculantes, lo
que eleva el costo del producto final.
Varios materiales alternativos han sido objeto de evaluación para este fin como son: los
minerales (Daza et al., 2000), residuos industriales (Ben Rebah et al., 2002; Ben Rebah et
al., 2007), sustratos orgánicos (Raja Sekar y Karmegam, 2010; Hashemimajd et al., 2004;
Bachman y Metzger, 2008) polímeros naturales y sintéticos (Denardin y Freire,
2000; Fernandes Júnior et al., 2009) e inoculantes líquidos (Tittabutr et al., 2007; Albareda
et al., 2008). Para la cosecha de leguminosas los inoculantes líquidos se convierten en una
de las opciones más favorables para su aplicación en grandes plantaciones con el fin de
facilitar la siembra mecanizada (Lupway et al., 2005).
Varios polímeros naturales (agar, agarosa, alginato y quitosan) y polímeros sintéticos
(poliacrilamida, poliuretano y polietilenglicol) han utilizado con éxito para la inmovilización de
células (Chen y Lin, 1994; Song et al., 2005). Sin embargo, cada polímero tiene sus
inconvenientes, tales como la escasa resistencia mecánica y durabilidad, toxicidad para los
microorganismos, ó de alto costo (Wu y Wisecarver, 1992). El polímero sintético alcohol
polivinílico-PVA, no presenta toxicidad en microorganismos y es un material económico.
Además, tiene alta durabilidad en agua, lo que indica que el polímero es prometedor como
un material de inmovilización de células, en este caso para el tratamiento biológico de
aguas residuales (Takei et al., 2011).
28
La demanda de una alternativa a la turba resulta en un considerable trabajo experimental y
hasta la producción comercial de otros tipos de vehículos, tales como líquidos, liofilizado,
granulados y varios tipos de gomas. Sin embargo, los resultados en campo han sido
pobres en muchos casos, debido a la baja supervivencia durante el almacenamiento ó en
la semilla cuando se siembra en condiciones de estrés en el suelo (Denardin y Freire,
2000).
En países como Brasil, no se restringe el uso de cualquier material como vehículo para
inoculantes, siempre y cuando sean capaces de cumplir con las determinaciones técnicas
establecidas por el Ministerio de Agricultura, Ganadería y Abastecimiento –MAPA (Zilli et
al., 2010).
2.4.1 Exploración de polímeros como alternativa a la formulación de
biofertilizantes de nueva generación
Las prácticas biotecnológicas ofrecen una posible solución, de manera responsable, para
mejorar la producción agrícola, atendiendo a las nuevas tendencias ambientales,
impulsando el estudio de nuevas tecnologías, que permitan aumentar la producción
agrícola en el marco de una agricultura sostenible. Una alternativa interesante lo es
entonces la implementación de polímeros como nueva estrategia para la inmovilización de
microorganismos con potencial biofertilizante.
Desde el siglo pasado, el estudio de mezclas de polímeros ha recibido suficiente énfasis en
el área de ciencia de tecnología de los polímeros; estas mezclas tienen numerosas
aplicaciones en medicina, farmacia, industria del plástico, caucho, entre otros (Robeson,
1984). El desarrollo de mezclas de polímeros como materiales utilizables en muchas áreas
se vuelve una gran posibilidad para cumplir en un sólo componente, diversas aplicaciones
a un costo muy bajo (Soares y Oliveira, 2001). Koning et al. (1998) destacan la posibilidad
de utilizar mezclas de polímeros, como una herramienta en el desarrollo de la ingeniería de
materiales, desde la síntesis de nuevas moléculas con propiedades de interés.
Polímeros como la goma xantana y jataí han mostrado prometedores efectos como
vehículos en el transporte de microorganismos. Ambos son ampliamente utilizados como:
estabilizantes, emulsionantes y espesantes en áreas cosméticas, alimenticia, textiles, entre
otras (Sutherland, 1986).
Algunos polímeros como el alginato de sodio han sido probados como vehículos para la
inoculación de cepas de bacterias que promueven el crecimiento de las plantas, tales
como Azospirillum (Bashan et al., 2002), pocos estudios han evaluado el uso de la matriz
29
del polímero como un vehículo para la inmovilización de células rizobianas. En algunos
países como Nueva Zelanda, la polivinilpirrolidona (PVP) se utiliza como adhesivo para
inoculantes microbianos en las semillas (Lloyd, 1983).
Entre las mezclas de polímeros utilizados en las diversas áreas de la industria,
los polímeros biodegradables se destacan como materiales no contaminantes sobre el
medio ambiente (Rosa et al., 2001). Mezclas a base de carboximetilcelulosa (CMC) y el
almidón han sido estudiadas por Suvorov et al. (1999), obteniendo muy buenos resultados.
La mayoría de las mezclas de polímeros se encuentra parcial o totalmente inmiscibles,
debido a su alto peso molecular, formando en su mayoría mezclas heterogéneas, mezclas
en las que las características de los polímeros utilizados no siempre se cumplen (Koning et
al., 1998).
Como la mayoría de las mezclas de polímeros son inmiscibles, la compatibilidad de la
mezcla de polímero es de suma importancia para lograr la sinergia de las
propiedades. Para lograr la compatibilidad de las mezclas de polímeros, se utilizan agentes
compatibilizantes. Estos agentes son moléculas que actúan en la interfase de la mezcla, lo
que permite una mayor interacción, debido a su alta actividad con estos. Los agentes de
compatibilización pueden ser polímeros, copolímeros ó moléculas orgánicas de bajo peso
molecular con un montón de grupos reactivos, por ejemplo, carboxilo e hidroxilo (Koning et
al., 1998).
2.5 Formulaciones de inoculantes rizobianos
La formulación de inoculantes a partir de cepas de Rhizobium sp., es una tecnología que
puede lograr una alta productividad con la reducción o la exclusión total de fertilizantes
nitrogenados. Varios estudios han demostrado que la inoculación de cepas seleccionadas
de rizobios puede dar lugar a rendimientos iguales o superiores cuando se compara con la
adición de fertilizantes nitrogenados. Ferreira et al. (2000) demostraron, que la inoculación
del frijol común (Phaseolus vulgaris L), con cinco cepas de Rhizobium tropici, mostró la
productividad y el contenido de nitrógeno en las hojas y granos similares a los presentados
por los tratamientos que recibieron fertilizante nitrogenado a la siembra y cobertura.
En la actualidad, la gama de productos de inoculantes con diferentes modos de
aplicación están disponibles. Los inoculantes comerciales de Rhizobium sp., deben tener
un número adecuado de células activas, con frecuencia determinada por las regulaciones
de cada país (Soria et al., 2006).
30
2.5.1 Formulaciones líquidas
Una formulación líquida es ideal, por la facilidad en su preparación y manejo, además su
pureza puede confirmarse fácilmente. Las antiguas formulaciones de inoculante líquido se
venían comercializando de manera esporádica, debido a las dificultades que surgen en el
mantenimiento de cultivos biológicos de control después de su preparación y la obtención
de la licencia del fabricación (Brockwell, 1982). Los fabricantes se propusieron superar el
problema del deterioro de la concentración del inóculo, empleando la centrifugación,
colocándolo en recipientes de plástico para su congelación y posterior transporte a los
usuarios. Sin embargo, la corta vida útil y la necesidad de almacenar a bajas temperaturas
es una limitante para su uso (Stephens y Rask, 2000).
Brockwell y Bottomley (1995) han reportado que los inoculantes líquidos envasados en
botellas de dispensador, pueden ser usados como inoculantes de semillas ó para la
entrega directa en la siembra de éstas. Esta forma de inoculante líquido tiene ventajas para
su almacenamiento, aferrándose fuertemente a la cubierta de la semilla sin necesidad de
adhesivos, dando lugar a una buena nodulación y fijación de N2 comparables a lo que se
podría obtener con inoculantes a base de turba. Por otra parte, varios compuestos han sido
estudiados para la protección del inoculante, los cuales son adicionados con el fin de
prolongar la supervivencia de los rizobios después de la inoculación. Por ejemplo, el
polímero polivinilpirrolidona (PVP) que puede liberar compuestos tóxicos presentes en la
cubierta de la semilla. Además, tiene la capacidad de facilitar la unión de agua; sin
embargo, su secado es lento después de la aplicación del inoculante en la semilla. El
complejo FeEDTA y el glicerol son añadidos para complementar la fuente de hierro y
carbono a los rizobios. También, el glicerol puede proteger a las células sobre los efectos
de la desecación (Singleton et al., 2001).
Las formulaciones líquidas son enriquecidas con el uso de aditivos tales como: el
glicerol, goma arábiga ó polivinilpirrolidona. Estos aditivos pueden mejorar la calidad de los
inoculantes en varios aspectos como: una mayor adherencia del mismo a la semilla, el
producto se estabiliza e inactiva las toxinas solubles sobre la cubierta de la semilla y así
mismo, aumenta la supervivencia de Rhizobium, después de la exposición a las
condiciones ambientales. Las formulaciones líquidas son fáciles de aplicar a las semillas,
porque ellas pasan a través de la maquinaria de siembra, mostrando mejores
rendimiento en campo, accesibles para los pequeños productores, debido a que se
emplean materiales de bajo costo (Cuadrado et al., 2009).
31
2.5.2 Formulaciones sólidas
Liofilizados
Los rizobios liofilizados, han demostrado ser capaces de mantener un alto número de
células viables (por ejemplo 1 x 1012 UFC/g) hasta 24 meses (Herridge, 2008). Sin
embargo, son productos más costosos y el procedimiento de liofilización puede causar
serios problemas, como la desnaturalización de las proteínas sensibles y la muerte
celular de algunos microorganismos. Existen varios tipos de aditivos, tales como azúcares,
que se han utilizado para tratar de proteger los daños causados por el proceso de secado
mediante congelación (Pereira et al., 2002).
La liofilización es ampliamente usada para la conservación de los microorganismos
(Krumnow et al., 2009). El primer inoculante liofilizado fue producido por una empresa
australiana por un corto período en el año 1958 (Brockwell, 1982). McLeod y Roughley
(1961), encontraron que los cultivos liofilizados podrían proporcionar buena nodulación en
el campo, pero era probable que se limitara a las condiciones ambientales y la
supervivencia de los rizobios liofilizados en las semillas (Vincent, 1962).
Microencapsulación
La encapsulación de células vivas en un gel polimérico es una tecnología bien establecida
con grandes aplicaciones (Park y Chang, 2000). La matriz del gel permite que las
células permanezcan viables durante un largo tiempo. Varios estudios han utilizado
alginato como material de encapsulación que permite formar microesferas de forma
instantánea en presencia de cationes polivalentes que se unen a las unidades de ácido
gulurónico (Witter, 1996) en un sólo paso con una adecuada resistencia mecánica. Por otra
parte, las perlas de alginato formadas son capaces de atrapar un número suficiente de
bacterias (Fenice et al., 2000; Zohar-Perez et al., 2002). El uso de células encapsuladas
para aplicación sobre el medio ambiente tiene varias ventajas sobre las formulaciones en
donde las células se encuentra libres, presentando una mejor protección contra el estrés
biótico (Smit et al., 1996) y abiótico. Estas ventajas son: el efecto inhibidor de los
compuestos tóxicos (Cassidy et al., 1997), mejor supervivencia y mayor actividad fisiológica
de la bacteria (Weir et al., 1995), suministro de aditivos nutricionales encapsulados
(Trevor et al., 1993), aumento de la densidad celular y el crecimiento celular en diferentes
zonas aeróbica y anaeróbica de la encapsulación con el gel. Las nuevas tecnologías de
encapsulación presentan mejores posibilidades frente a la disyuntiva de otras
32
formulaciones, como son: la estabilidad, la liberación controlada, efectos sobre el medio
ambiente, biodegradación y rentabilidad.
La encapsulación de los rizobios en microesferas de Ca-alginato se ha propuesto
como un procedimiento para aumentar la resistencia al calor ya la desecación de las
bacterias atrapadas (AbdelGadir y Alexander, 1997). En este sentido, las células
microbianas se ha demostrado que se mantienen fisiológicamente activas después de
ser atrapado en los espacios intersticiales de este tipo de geles (Bashan, 1986). Esta
matriz de gel permite que las células viables permanezcan y mantengan su actividad
catalítica durante períodos más prolongados (Young et al., 2006).
Recubrimiento mediante lecho fluidizado
Este proceso hace parte de los métodos físicos empleados en la técnica de
microencapsulación. El sólido soporte utilizado en forma de “pellets”, es suspendido en una
corriente de aire y posteriormente se atomiza una solución del material de recubrimiento
(Anal y Sinhg, 2007; Yáñez et al., 2006).
Existen dos métodos generales para preparar los pellets, uno de ellos consiste en el
recubrimiento de gránulos que contienen el principio activo. Los núcleos pueden obtenerse,
a partir del principio activo, reduciéndolo al tamaño de partícula apropiado, sólo o en mezcla
con auxiliares y efectuando una granulación, por los métodos convencionales empleados.
Una vez obtenidos los núcleos, se recubren con películas que controlan la liberación del
principio activo (Lieberman y Lachman, 1982; Guarnizo, 2001).
El otro método para la obtención de los pellets es partiendo de la generación de los
núcleos. Para este caso, se utilizan como materiales de partida pequeños gránulos
(semillas) de azúcar o de otras sustancias inertes y se recubren con preparaciones
adhesivas que contienen el principio activo disuelto o disperso. Con el fin de controlar la
liberación del principio activo, los pellets son recubiertos con capas del material polimérico
(Lieberman y Lachman, 1982; Guarnizo, 2001), y dicho recubrimiento se puede efectuar
tanto en bombos de recubrimiento como en equipos de lecho fluidizado.
Para realizar un recubrimiento mediante lecho fluidizado, se utiliza un proceso conocido
como secado por aspersión (spray-drying), que tiene una alta tasa de producción y bajo
costo de operación; es una tecnología muy conocida en la industria alimentaria y
farmacéutica (Wen-Chian et al., 2002). Es uno de los métodos más comunes para
preparar complementos alimenticios estables y que ocupan pequeños volúmenes (Potter,
1980). Además, el secado por aspersión se utiliza para la preservación y la concentración
33
de microorganismos (Fu y Etzel, 1995; Teixeira et al., 1995; To y Etzel, 1997a,b). Además,
el uso de secado por aspersión ha sido reportado por varios investigadores para
preparar cultivos iniciadores que se utilizan para preparar productos lácteos fermentados o
se utilizan como adyuvantes para mejorar el sabor del queso (Johnson y Etzel, 1993;
Johnson et al., 1995; To y Etzel, 1997a,b).
Diferentes estudios han sido reportados sobre la utilización de secado por aspersión
por To y Etzel (1997b), Mary et al. (1993) y LiChari y Potter (1970), donde describen
la supervivencia de Bradyrhizobium japonicum, Brevibacterium y Salmonella
respectivamente.
34
Capítulo III. Materiales y métodos
3.1 Localización del estudio
Los experimentos de actividad biológica se llevaron a cabo en el Laboratorio de
Microbiología de Suelos y en los invernaderos del Centro de Biotecnología y Bioindustria
CBB-Corpoica (Mosquera). Los estudios de preformulación y formulación fueron realizados
en el Laboratorio de Polímeros adscrito al grupo de investigación en procesos de
transformación de materiales del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de
Colombia
3.2 Microorganismo, medios y condiciones de cultivo
La cepa G58 presuntiva de Rhizobium sp. fue provista por la Colección de
Microorganismos con Potencial Biofertilizante del Laboratorio de Microbiología de
Suelos de Corpoica. Esta fue aislada a partir de nódulos de la planta de fríjol
cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] en suelos de la Guajira, Colombia (datos no
publicados). La cepa fue mantenida y reactivada sobre medio de cultivo YM
(composición en g/L: manitol 10, extracto de levadura 0.5, K2HPO4 0.5, MgSO4 0.2,
NaCl 0.1; pH 6.8) a 4ºC y 28ºC, respectivamente. Cuando se requirió cultivo sólido se
suplementó el medio YM con 18 g/L de agar (YMA) y agitación de 150 rpm. La
descripción macroscópica de la cepa se determinó mediante el examen de células
cultivadas según los métodos descritos por Somasegaran y Hoben (1994).
3.3 Caracterización bioquímica e identificación molecular de la cepa G58
3.3.1 Identificación bioquímica
Las características bioquímicas de la bacteria se determinaron mediante el Kit API-
20NE (bioMérieux, Francia) que se utilizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La
prueba de oxidasa se realizó empleando el test Bactident® (Merck, USA). Los
resultados del test API20NE fueron comparados contra la base de datos apiweb
(bioMérieux, Francia). Las características microscópicas fueron analizadas mediante la
tinción de Gram.
35
3.3.2 Identificación molecular mediante la amplificación del 16S rDNA
Extracción de ADN genómico
La extracción de ADN genómico (gADN) se realizó utilizando el Wizard kit (Promega
Corporation, Madison, USA). El gADN extraído fue analizado de acuerdo a Sambrook y
Russell (2001) y cuantificado mediante el uso de espectrofotometría (NanoDrop, Thermo
Corporation).
Amplificación del gen 16S
Para la amplificación del 16S rDNA se utilizó la técnica de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando los cebadores 27F y 1492R descritos por Osborne et al.
(2005). Cada reacción de amplificación tuvo un volumen final de 50 μl. Las reacciones de
amplificación se realizaron en un Termociclador PTC 100 (MJ Research, USA). Los ciclos
de amplificación consistieron en una desnaturalización inicial a 94 ºC durante 3 min seguido
por 30 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 1 min, una etapa de anillamiento a 58 ºC
durante 1 min y una etapa de extensión a 72 ºC durante 2 min. Finalmente, una última
etapa de extensión a 72 ºC durante 5 minutos.
Purificación del producto de amplificación
Para la purificación de los fragmentos amplificados 32 μl de producto de PCR se mezclaron
con 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M (pH 5,5) y 2,5 volúmenes de etanol frío al
99,8%. La mezcla se incubó a 20 ºC durante la noche. Posteriormente la mezcla fue
centrifugada durante 30 minutos a 16.000 g a 4 ºC, donde el sobrenadante fue descartado.
Se añadieron 300 µl de etanol frío al 70% y la muestra se centrifugó durante 10 min a
16.000g y 4 ºC, y nuevamente se descartó el sobrenadante. El precipitado se mantuvo a
temperatura ambiente hasta que se secó completamente y luego se resuspendió en 20 μl
de H2O para PCR (Sambrook et al., 1989).
Secuenciación de los fragmentos
La secuenciación del gen 16S rDNA de la cepa se llevó a cabo en el Laboratorio de
Genoma Embrapa Agrobiología-Brasil empleando los cebadores descritos en la Tabla 1.
Para la reacción de secuenciación se utilizaron 200 ng de los productos purificados de
PCR, 1 µl de cada cebador 5,0 mM, 4,0 µl del kit "TE Dynamics Kit" (GE Healthcare) y agua
ultrapura (ultraPURETM, Invitrogen Co) hasta un volumen final de 10 µl. Las condiciones
para la reacción de secuenciación fueron: 25 ciclos de desnaturalización anillamiento y
extensión a 95 ºC durante 25 seg, 58 ºC durante 15 segundos, 60 ºC durante 1 minuto,
36
respectivamente. Después de marcar la reacción, las muestras fueron precipitadas por
adición de 1,0 µl de acetato de amonio 7,5 M y 27,5 µl de etanol y se incubaron a 4 ºC
durante la noche, después de la incubación se centrifugó a 3000 g por 45 minutos a 4 ºC, el
sobrenadante fue descartado y el pellet se lavó con 100 µl de etanol 70% y nuevamente
centrifugado a 3000 g durante 10 min a 4 ºC. Las muestras fueron secadas al aire y se
resuspendieron en 7,5 µl de buffer de secuenciación Mega BACE ("loading") y analizadas
en un secuenciador automático Mega BACE1000 (GE Healthcare). Las secuencias
contiguas se reunieron a partir de las secuencias directas y reversas con los programas
PHRED/PHRAP (Ewing et al., 1998; Ewing y Green, 1998) ó CAP3/CONSED (Gordon et
al., 1998; Huang y Madan, 1999) en un entorno Linux para el sector de bioinformática,
Embrapa Agrobiología.
Tabla 1. Iniciadores utilizados para la secuenciación del gen 16S rDNA de la cepa G58
Las secuencias obtenidas fueron comparadas con otras en la base de datos de
BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) del Centro Nacional de Información
Biotecnológica NCBI. Para la construcción del árbol filogenético se utilizó la
metodología Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987), las secuencias de interés fueron
extraídas de la base de datos de BLAST y se alinearon con la función ClustalW del
programa informático MEGA 5 (Tamura et al., 2011).
Iniciador Secuencia (5’ 3’) Referencia
27f AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
Osborne et al., 2005
1492R GGY TAC CTT GTT ACGA CTT Osborne et al., 2005
362F CTC CTA CGG GAG GCA GCA GTT GGG Menna et al., 2006
786F CGA AAG CGT GGG GAG CAA ACA GG Menna et al., 2006
RU6 ATG GCT GTC GTC AGC TCG Wang et al., 1996
U3 GWA TTA CCG CGG CKG CTG Wang et al., 1996
U2 TGC TGC CTC CCG TAG GAG Wang et al., 1996
1110R TTA GCA AGT AAG GAT ATG GGT Cho et al., 2006
37
3.4 Caracterización de las actividades de promoción de crecimiento vegetal de
la cepa G58
3.4.1 Fijación Biológica de nitrógeno
Las raíces noduladas e inoculadas con la cepa G58, fueron evaluadas para
determinar su capacidad de reducción de acetileno. Posteriormente, las raíces fueron
dispuestas en frascos herméticos a los cuales se les ajustó una atmósfera constituida por
90% aire y 10% acetileno, el cual se incubó durante 1 hora a 30 ± 2 °C (Hardy et al., 1968;
Meghvansi et al., 2010).
Pasado el tiempo de incubación, se midió la concentración de etileno inyectando 1 ml de la
atmósfera del frasco en un cromatógrafo de gases Perkin Elmer con detector de ionización
de llama (FID) y una columna Poropak N 200/300 mesh de 6 pies y 3 mm de diámetro. La
curva de calibración se realizó empleando etileno puro grado cromatográfico, la ecuación
Log10: Y= 0,145X + 0,548 con un R2= 0,997.
3.4.2 Cuantificación de compuestos indólicos mediante la técnica colorimétrica
de salkowsky
Después de la fermentación en oscuridad de la cepa G58 de Rhizobium sp. sobre medio K-
lactato durante 72 horas a 150 rpm, se centrifugó la suspensión a 10000 rpm por 10
minutos. Se tomó 1 ml del sobrenadante y se llevó a reacción con 1ml del reactivo de
Salkowsky modificado (7.9 M H2SO4 y 12 g/L FeCl3), y se incubó por 30 minutos en
completa oscuridad. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado, el control
correspondió a medio de cultivo no inoculado. Se determinó la absorbancia de cada tubo
en el espectrofotómetro (Genesy UV10, Thermo Corporation) a 540 nm, con los datos de
absorbancia se obtuvo el promedio de las réplicas y se reemplazaron los datos en la
ecuación de la recta de la curva patrón. La producción de índoles totales fue expresada en
μg relativos de AIA /ml (Carreño-López et al., 2000).
3.4.3 Cuantificación de la capacidad de solubilización de fosfato mediante la
técnica de azul de fosfomolibdeno
Una suspensión bacteriana estandarizada a DO600 = 0,500 en NaCl 0,85%, se uso para
inocular el medio de cultivo líquido Pikovskaya empleando 10% del volumen final
(Pikovskaya 1948), para el crecimiento de la cepa G58 durante 3 días a 150 rpm. Una
alícuota de 1,0 ml de cada frasco se centrifugó a 10000 rpm por 10 minutos y 500 μl del
38
sobrenadante se empleó para análisis (Fiske y Subbarow, 1925). La actividad enzimática
se determinó mediante la técnica de p-nitrofenil fosfato de acuerdo con la metodología
descrita por Tabatabai y Bremner (1969). El ensayo fue realizado por triplicado.
3.5 Estudios de preformulación
3.5.1 Evaluación del efecto de diferentes factores fisicoquímicos sobre el
crecimiento de la cepa G58
Se estudió el efecto de diferentes pHs sobre el crecimiento de la cepa G58 en medio
de cultivo YM bajo condiciones estándar (Somasegaran y Hoben, 1994). El rango de
evaluación de pH estuvo entre 4 – 9. El crecimiento se monitoreó, mediante
espectrofotometría a 600 nm, después de 40 horas de incubación. Se evaluó el efecto
de la temperatura sobre el crecimiento de G58 evaluando temperaturas dentro del rango
28-43 ºC (Somasegaran y Hoben, 1994). Finalmente, se investigó el efecto de tres fuentes
de carbono (manitol, glucosa y sacarosa) a diferentes concentraciones sobre el crecimiento
de la cepa G58. Para la determinación de azúcares totales en el medio de cultivo YM
modificado con glucosa se realizó la técnica descrita por Dubois et al. (1956). Estimando la
cantidad de azúcares espectrofotométricamente a 492 nm empleando una curva patrón
con glucosa como estándar, la cuantificación de proteínas se realizó siguiendo la
metodología descrita por Bradford (1976). Todos los experimentos fueron realizados por
triplicado.
3.5.2 Selección y caracterización fisicoquímica de los polímeros
Ocho materiales poliméricos fueron seleccionados: dos alginatos de sodio de diferente
peso molecular (FMC Biopolymer), hidroxipropilmetilcelulosa-HPMC (Colorcón), dos
polímeros de polietilenglicol (PEG) de diferente peso molecular, alcohol polivinílico-PVA,
polivinilpirrolidona-PVP y Carbómero 940 (Necardis S.A) (Jung et al., 1982; Deaker et al.,
2005). Estos fueron caracterizados estimando el grado de viscosidad, dispersión, pH,
aplicaciones biotecnológicas, costos y disponibilidad de cada uno en la región. Los
materiales poliméricos empleados cumplieron con las especificaciones establecidas por la
USP.
39
3.5.3 Selección de los polímeros con base en su efecto sobre la viabilidad
celular
El efecto de cada polímero sobre la viabilidad de la cepa G58 fue evaluado sobre medio de
cultivo YMA suplementado con la cantidad adecuada de cada uno de ellos. Se evaluaron
tres concentraciones de cada polímero a temperatura ambiente (18 ±2 ºC). Los materiales
poliméricos que presentaron mejores respuestas de compatibilidad con la bacteria
expresada en UFC/ml, fueron seleccionados para su posterior evaluación. Todos los
experimentos fueron realizados por triplicado
3.5.4 Determinación de propiedades adicionales de formación de película,
permeabilidad e hinchamiento de los tres polímeros compatibles con la cepa de
Rhizobium sp., G58
Formación de películas poliméricas mediante la técnica de casting
Las películas poliméricas se obtuvieron, a partir de la dispersión de los polímeros (Alginato
de sodio e Hidroxipropilmetilcelulosa) en agua destilada. Se utilizaron concentraciones de
los polímeros en un orden del 0,5%. Lo anterior, se realizó en condiciones ambientales
controladas y con 400 rpm de agitación empleando un agitador mecánico marca (RZR
2020 Heildoph). La preparación obtenida del polímero se agregó en moldes de vidrio de 15
x 15 cms de acuerdo a la metodología de casting (Bajdik et al., 2005; Arévalo et al., 2010),
la cual se dejó secar en la estufa a una temperatura de 60 ± 5 ºC.
Evaluación de permeabilidad de los polímeros mediante el método de agua
Se llevó a cabo siguiendo el procedimiento de la ASTM E96-95 (ASTM, 1995), utilizando el
Método de Agua. Se colocaron las películas previamente obtenidas en moldes de vidrio y
se colocaron 30 ml de agua destilada dentro del molde. Enseguida, al borde de la base del
molde de vidrio se agregó parafina y se tapó. Se pesó por completo el molde de vidrio y la
película y se colocó en el desecador. La información fue tomada cada 12 horas, con el fin
de realizar la medición de permeabilidad bajo condiciones ambientales de temperatura y
humedad controladas. Se registró el cambio de peso de este sistema a través del tiempo.
40
Prueba de Hinchamiento de los polímeros
Se colocaron películas poliméricas de 2x2 mm de diámetro sobre mallas de acero,
previamente pesadas y se realizaron las mediciones cada dos minutos en un buffer de
fosfatos a pH 6,8, condiciones similares al pH del suelo de donde fue aislada la bacteria. Se
calculó la cantidad de agua atrapada por la película cada dos minutos. El grado de
hinchamiento fue calculado a partir de la ecuación (Li et al., 1998) donde (Wt) es el peso de
la película al tiempo (t) y (Wo) es el peso de la película al tiempo cero.
Índice Hinchamiento = Wt –Wo/Wo (1)
3.6 Evaluación en invernadero del efecto de los polímeros sobre la actividad
biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]
Se emplearon semillas de fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L). Walp] provenientes de la
Estación Experimental Motilonia de Corpoica (Codazzi, Cesar). Para su desinfección se
sumergieron en etanol 70% durante 30 segundos, se lavaron tres veces con agua destilada
estéril; posteriormente, se colocaron en hipoclorito de sodio al 2% durante un minuto. Se
enjuagaron 10 veces con agua destilada estéril y se dejaron reposar por una hora en agua
destilada estéril para estimular la germinación. Después de este tiempo, se colocaron las
semillas en cajas de petri sobre medio Agar agua (15 g/L), se recubrieron con papel de
aluminio y se incubaron durante 4 días a 30 ºC. Las semillas pregerminadas, con
aproximadamente 20 mm de raíz emergente, fueron seleccionadas para los ensayos en
invernadero.
Los experimentos en invernadero (condiciones controladas) fueron establecidos bajo un
diseño experimental completamente al azar con cinco (5) tratamientos y 9 repeticiones,
para un total de 45 unidades experimentales (Tabla 2). Se empleó como sustrato
vermiculita y arena en una relación 2:1 (p/p), las cuales fueron tratadas mediante tres ciclos
de esterilización en tres días diferentes a una temperatura de 121ºC a 15 PSI, durante 15
minutos.
41
Tabla 2. Tratamientos establecidos para determinar el efecto de los polímeros sobre la actividad
biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]
Las plántulas de fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp], se inocularon con las
suspensión bacteriana adecuadas (DO600 = 0,5) junto con el polímero seleccionado
previamente a una relación de 1ml inoculante/60g semilla, y sembradas en las materas. Al
testigo absoluto se le adicionó agua destilada estéril en lugar de suspensión bacteriana.
Las plantas fueron regadas cada dos días empleando la solución nutritiva de Hoagland
descrita por Hoagland y Arnon (1950).
Las variables de evaluación fueron: longitud de raíz, longitud de parte aérea, número de
nódulos, biomasa de los nódulos, fijación biológica de nitrógeno (metodología descrita
anteriormente), peso fresco raíz, peso fresco parte aérea, peso seco raíz y peso seco parte
aérea, después de un periodo de 60 días bajo condiciones de invernadero a una
temperatura de 30 ± 2 ºC y una humedad relativa del 70%. El experimento fue regado con
agua estéril manteniendo capacidad de campo.
3.7 Estudios de Formulación
3.7.1 Obtención de los prototipos de formulación sólida mediante la técnica de
recubrimiento en lecho fluidizado
Se utilizó el equipo de lecho fluidizado de las instalaciones de Colorcón, sucursal Colombia.
Los ensayos partieron de la utilización de pellets de azúcar como soporte para el
recubrimiento de la cepa G58. Se seleccionaron los tres polímeros con los mejores
Tratamientos Descripción
T0: Testigo Absoluto Sin inoculación bacteriana
T1: Control líquido YM Inoculación Rhizobium sp., G58 (YM)
T2: Polímero 1 Inoculación líquida Rhizobium sp., G58 (YM) inmovilizada
T3: Polímero 2 Inoculación líquida Rhizobium sp., G58 (YM)
inmovilizada
T4: Polímero 3 Inoculación líquida Rhizobium sp., G58 (YM)
inmovilizada
42
resultados en los ensayos de compatibilidad realizados previamente, fijando las
concentraciones de los polímeros de acuerdo a las condiciones del proceso.
Para el proceso de recubrimiento, se utilizó una fermentación líquida en YM de la cepa G58
durante 24 horas, para ello se ajustó el inóculo inicial a una DO600 = 0,500. Posteriormente,
se realizó la determinación de la biomasa producida por medio de la técnica de recuento
(Doyle et al., 2000) en placa como control inicial del proceso. Adicionalmente, se dispersó el
polímero mediante un agitador mecánico marca (RZR 2020 Heildoph), el cual fue
mantenido a agitación constante hasta completa dispersión. Lo anterior fue agregado a la
fermentación de la bacteria para su aspersión en el lecho fluidizado.
Las condiciones del equipo, para el proceso fueron: un temperatura de entrada, ºTE ≤ 50
ºC; temperatura de salida, ºTs ≤ 35 ºC; carga de pellets de sacarosa 500 g tamaño de los
pellets malla 18/20; carga de la fermentación líquida, 500 ml; caudal de entrada, Qo ≤ 7
ml/min. Y se adecuó mediante un sistema de atomización tipo bottom spray para la
aspersión de la suspensión bacteriana.
Se analizó a los prototipos de formulación después de terminado el proceso de
recubrimiento, las actividades de producción de compuestos indólicos, solubilización de
fósforo y fijación biológica de nitrógeno.
3.7.2 Perfil de degradación y liberación de los prototipos de formulación sólida
Se realizaron perfiles de degradación del prototipo y liberación del principio activo del
prototipo en función del tiempo. Para ello, se dispuso de recipientes con suelo estéril. Se
agregó 10 g de cada uno de los prototipos sólidos en un recipiente con 100 gramos de
suelo bajo condiciones de esterilidad y se colocaron en un fitotrón a una temperatura de 30
± 2 ºC y una humedad relativa del 70%. Se establecieron cuatro tratamientos con tres
repeticiones por día; para un total de 60 recipientes durante los cinco días de evaluación.
3.8 Técnicas microscópicas
3.8.1 Microscopía electrónica de Barrido (SEM)
Mediante microscopía electrónica de barrido (FEI QUANTA 200) se realizó la visualización
microscópica de la formulación sólida que presentó los mejores resultados en las
43
instalaciones de la Universidad Nacional de Colombia, para analizar la presencia de las
células incorporadas en el recubrimiento mediante lecho fluidizado.
Se realizó el procesamiento de la muestra mediante la metalización en un Sputter SDC-050
de Marca (Balzers), en condiciones de prevacío (<10-1 torr) con argón como gas de ataque
(plasma) sobre una placa (cátodo) de oro-paladio (8:2)). La película se depositó sobre las
muestras (ánodo) a corriente de descarga de +/- 50mA y el espesor típico fue de +/- 200
nm. La muestra ya procesada fue visualizada en diferentes campos mediante el
microscopio de barrido permitiendo destacar la morfología del material y demás
propiedades de la misma.
3.8.2 Microscopía electrónica de Transmisión (TEM)
A partir de la muestra del prototipo de formulación fue realizado el protocolo para la
visualización de la bacteria, el cual se llevó a cabo en el equipo (Hitachi HU-12A) de las
instalaciones de la Fundación Santa Fe de Bogotá. La metodología se realizó de acuerdo a
lo descrito por (Bianucci et al., 2011). La muestra a evaluar consistió en el mejor prototipo
obtenido mediante lecho fluidizado, el cual fue centrifugado durante 10 min a 10.000 rpm a
4 ºC. La muestra se fijó por inmersión en glutaraldehído al 2,5% en 0,1 M tampón Sörensen
(pH 7,4) a 4 °C durante 2 horas, y postfijada en tetraóxido de osmio al 1% durante 1
h. Luego la muestra se deshidrató en concentraciones ascendentes de etanol (50-100%) y
se incluyó en resina. La resina se polimerizó durante 24 horas a 60 ºC. Secciones
ultradelgadas (grosor de 0,5 mm) se tiñeron con azul de toluidina. Secciones ultrafinas
(espesor, 70 nm) fueron doblemente teñidas con acetato de uranilo y citrato de
plomo (Jurado et al., 2007).
3.9 Evaluación en invernadero del efecto de los prototipos de formulación
sólida sobre la actividad biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]
El procedimiento para los prototipos fue llevado a cabo de acuerdo a las mismas
condiciones previamente descritas. Los experimentos en invernadero fueron establecidos
bajo un diseño experimental completamente al azar con seis tratamientos y nueve
repeticiones, para un total de 54 unidades experimentales (Tabla 3). El experimento se
realizó como previamente fue descrito.
44
Tabla 3. Tratamientos establecidos para determinar el efecto de los prototipos sólidos sobre la
actividad biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]
Tratamientos Descripción
T0: Testigo Absoluto Sin inoculación bacteriana
T1: Control líquido YM Inoculación Rhizobium sp., G58 (YM)
T2: Control Prototipo sólido YM Inoculación sólida Rhizobium sp., G58 (YM)
T3: Prototipo sólido 1 Inoculación sólida Rhizobium sp., G58 (YM)
T4: Prototipo sólido 2 Inoculación sólida Rhizobium sp., G58 (YM)
T5: Prototipo sólido 3 Inoculación sólida Rhizobium sp., G58 (YM)
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos empleados para la interpretación de los datos a nivel de laboratorio
se llevaron a cabo mediante un Análisis de Varianza (ANOVA) y Test HSD Tukey, con
un nivel de confianza del 95%. Los análisis fueron realizados empleado el software SAS 9.0
para Windows. La técnica de componentes principales se realizó empleando el software
Xlstat 2011 para Windows.
45
Capítulo IV. Resultados y Discusión
4.1. Caracterización fenotípica, bioquímica y molecular de la cepa de Rhizobium
sp., G58
Se realizó la caracterización fenotípica, bioquímica y molecular de la cepa G58 con el
objetivo de establecer sus características fisiológicas y morfológicas, además de su
identidad filogenética. Después de 72 h de incubación sobre medio de cultivo YMA se
observaron colonias de aproximadamente 5.0 mm de diámetro, con borde circular, liso,
y convexo, y con formación de moco blanco opaco. La reacción de Gram fue negativa. La
cepa G58 presentó reacción positiva a la hidrólisis de esculina, actividad ß-galactosidasa y
asimilación de glucosa, arabinosa, manosa, manitol, N-acetyl-glucosamina, maltosa, ácido
málico y gluconato, y actividad oxidasa. Además, se presentó reacción negativa para la
asimilación de la arginina, activdad gelatinasa, fermentación de glucosa, actividad ureasa, y
metabolismo del citrato, ácido cáprico y ácido fenil acético. Los resultados obtenidos con
respecto a la utilización de diferentes fuentes de carbono, reacciones enzimáticas y
procesos de fermentación confirmaron que la cepa G58 está relacionada en 96.1% con el
género Rhizobium –perfil bioquímico 1467764- (Sadowsky y Graham, 1998).
Con el objetivo de confirmar la identidad molecular de la cepa se realizó la amplificación por
PCR y se realizó la secuenciación del fragmento mediante 16S rDNA. Los resultados
mostraron que la cepa G58 amplificó la banda del tamaño esperado, aproximadamente
1500 pb (Figura 1).
Figura 1. Ámplificación del 16S rDNA de la cepa G58 mediante electroforesis en gel de agarosa al
2%. C5B: Cepa de referencia y MP: Marcador de peso molecular 1000 kb plus.
1650 pb
MP
1000 pb
46
La secuenciación del fragmento mostró que la cepa G58, se encuentra asociada con el
género Rhizobium sp., con un 99% de identidad; lo cual es consistente a los resultados
obtenidos mediante el test API 20 NE.
Por otra parte, el análisis de las secuencias obtenidas fue representado mediante la
construcción de un árbol filogenético y 18 secuencias de referencias fueron utilizadas a
partir del NCBI, de acuerdo a los porcentajes de similitud obtenidos en el análisis realizado
en BLAST (Figura 2). Sin embargo, para la identificación a nivel de especie de la cepa en
estudio; Gaunt et al. (2001) reportó la necesidad de utilizar diferentes cebadores como recA
y atpD que permitan acercarse aun más a la especie de Rhizobium sp. Por ejemplo,
autores como Laguerre et al. (2001) compararon mediante análisis filogenético la
correlación existente entre los genes nod, nif y la técnica del 16s rRNA para una mejor
clasificación de los rizobios encontrando una mayor resolución para la determinación de
especies en este género.
47
Figura 2. Árbol filogenético realizado mediante la amplificación del 16S rARN. La filogenia fue
inferida por el método de Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) utilizando el software Mega 5
(Tamura et al., 2011). Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el parámetro de Kimura 2-
método (Kimura, 1980). Los números en los nodos representan el porcentaje de bootstraping con
10000 repeticiones. La barra de escala = 0,02 sustituciones por sitio.
4.2. Caracterización de las actividades de promoción de crecimiento vegetal
Posterior a la identificación de la cepa G58, se realizó la caracterización de las actividades
de promoción de crecimiento vegetal de la bacteria, para esto se evaluaron la capacidad
para fijar nitrógeno atmosférico en simbiosis con la planta huésped, la capacidad para
48
solubilizar fosfatos insolubles y para sintetizar compuestos tipo indol. Los resultados
mostraron que, como era de esperarse, los nódulos formados a partir de la interacción
leguminosa-rizobio fueron activos y capaces de reducir acetileno a etileno empleando el
test de reducción de acetileno el cual proporciona un estimativo acerca de la capacidad de
una bacteria diazótrofa para reducir el nitrógeno molecular del aire a dos moléculas de
amonio. Nuestros resultados mostraron que los nódulos fueron capaces de fijar 1135 ±
1,07 C2H4 planta-1 h-. Figueiredo et al. (1999), reportaron actividades de reducción de
acetileno similares empleando cepas de Bradyrhizobium sp. nodulando Vigna unguiculata
(L.) Walp donde los resultados del test de reducción de acetileno mostraron una actividad
aproximada de 1121 y 1756 nmol C2H4 planta-1 h-1. De la misma manera, se evaluó la
capacidad de las cepas para producir compuestos indólicos. Este tipo de sustancias han
mostrado estar implicadas en la regulación de diferentes etapas y procesos fisiológicos en
plantas. Los resultados evidenciaron una capacidad intrínseca de la cepa G58 para
sintetizar este tipo de compuestos empleando L-triptófano como intermediario. La cepa
G58 crecida sobre medio K-lactato reportó una producción de 25,31 ± 1,03 µg/ml de
indoles después de tres días de incubación, estos resultados son similares a los reportados
por Ahemad y Khan (2011) quienes alcanzaron una producción de 32 µg ml−1 de indoles
para la cepa MRP1 de Rhizobium sp. Finalmente, se determinó la capacidad bacteriana
para hacer disponible el fósforo a partir de fuentes insolubles como el fosfato tricálcico. La
cepa G58 mostró una actividad de solubilización de 354.38 ± 0.005 µg PO4-3/ml después de
3 días de incubación. Esto representa una actividad solubilizadora importante puesto que
autores como Collavino et al. (2010) obtuvieron actividades de solubilización de fósforo
entre un rango de 100-300 µg P ml−1 para cepas de diversos géneros incluyendo algunos
rizobios. Rodríguez y Fraga (1999) sugieren que los géneros bacterianos con mayor
potencial para la solubilización de fósforo son Rhizobium, Pseudomonas y algunas cepas
de Bacillus, lo que es acorde a nuestros resultados.
4.3. Estudios de preformulación
4.3.1 Evaluación del efecto de diferentes factores fisicoquímicos sobre el
crecimiento de la cepa de G58
Se estimó el efecto de diferentes agentes fisicoquímicos sobre el crecimiento de la cepa
G58, con el objetivo de determinar si existen condiciones que afecten el crecimiento de la
bacteria. En particular, se evaluó la influencia del pH, temperatura y fuente de carbono
49
sobre el crecimiento celular. Los resultados obtenidos evidenciaron un efecto negativo de
pHs ácidos sobre el crecimiento de la cepa de Rhizobum sp. G58, observándose una
reducción drástica del crecimiento a pH 4 y 5.5 durante las primeras 20 horas. Por el
contrario, no se observaron diferencias significativas en el crecimiento de la cepa en pHs
cercanos a la neutralidad ó ligeramente alcalinos (Figura 3A). El pH suele alterar la
actividad y estructura de ciertas biomoléculas lo cual puede influir de forma drástica sobre
la actividad y viabilidad de las células. A pesar que las bacterias del género Rhizobium se
consideran ligeramente acidófilas, nuestros resultados mostraron lo contrario, lo que puede
estar asociado al suelo de donde fueron aislados (pH 7.5). En contraste, Cuadrado et al.
(2009), reportaron cepas de rizobios de crecimiento rápido capaces de crecer bien a pHs
entre 4 - 9 aislados del mismo cultivo en suelos del departamento de Bolívar, Colombia.
Con respecto al efecto de la temperatura sobre el crecimiento celular, no se observaron
cambios en la velocidad de crecimiento de la bacteria entre 28-43 ºC. Sin embargo, cuando
se expuso el microorganismo a una temperatura de 43 ºC fue posible observar una
disminución considerable en la densidad óptica del cultivo con respecto al control, lo que
podría ser indicativo de algún tipo de afectación al metabolismo normal de la bacteria
(Figura 3B). No obstante, Munévar y Wollum (1981) afirman que algunas cepas de rizobios
son capaces de crecer a temperaturas entre 27 y 45 ºC. Así mismo, Cuadrado et al. (2009),
corroboraron la tolerancia a altas temperaturas de microorganismos de este género
asociados a zonas tropicales.
Figura 3. Efecto de diferentes variables (A. pH; B. Temperatura; C. Consumo de glucosa y
producción de proteína; crecimiento en diferentes carbohidratos D. Manitol E. Glucosa F. Sacarosa.
Cada valor representa la media de tres réplicas. Diferente letra muestra diferencias estadísticas
50
significativas mediante el test de Tukey HSD (P < 0,05). Las barras de error representan la
desviación estándar.
Con base en los resultados de consumo de glucosa determinada por el método de Dubois
(Figura 3C), se observó que la bacteria consume aceleradamente la fuente de azúcar
durante las 10 primeras horas. Sin embargo, se aprecia un consumo lento después de las
12 horas, lo cual puede atribuirse al fenómeno de síntesis de exopolisacáridos presentado
en el medio de cultivo por la cepa de Rhizobium sp. G58. Además, se evidencia que una
cantidad de azúcar se encuentra en el medio, al final de la fermentación, motivo por el cual
se puede pensar que existe una producción de compuestos extracelulares asociadas en el
medio.
Se evaluaron tres fuentes de carbono a diferentes niveles, con el objetivo de determinar el
efecto de altas y bajas concentraciones y del tipo de azúcar sobre el crecimiento de la
bacteria. Los resultados evidenciaron que el desarrollo de las cepas durante las primeras
18 horas de incubación no fue afectado por las diferentes concentraciones de los azúcares
empleadas, demostrando que no hubo incidencia de la fuente de carbono sobre el
crecimiento celular. Adicionalmente, los resultados establecen una correlación entre la
cantidad y revelan un aumento en la viscosidad del medio (Figura 3D, E y F); que puede
presentarse posiblemente a la producción de compuestos poliméricos tal como lo reportan
lancheros, 2001 y Peña et al. (2007).
4.3.2 Selección y caracterización fisicoquímica de los polímeros
La selección de los polímeros se realizó con base a reportes en donde se evaluó su uso
sobre microorganismos de características similares (Denardin y Freire, 2000; Fernandes
Júnior et al., 2009; Chen y Lin, 1994; Song et al., 2005; Bashan et al., 2002; Trivedi y
Pandey, 2008). Los polímeros seleccionados fueron: alginato, hidroxipropilmetilcelulosa-
HPMC, Alcohol polivinílico-PVA, Polivinilprirrolidona-PVP, Carbómero y Polietilenglicol-
PEG. Se les evaluó viscosidad y pH, comparándose con la información obtenida en
literatura la cual fue reportada en la Tabla 4. Se evaluó el grado de dispersabilidad de los
polímeros en agua como solvente a las concentraciones reportadas y a dos niveles para
determinar su subsiguiente manejo.
51
Tabla 4. Caracterización de los polímeros utilizados para la inmovilización de la cepa G58
Polímero *Viscosidad
(cP) pH Características
Aplicaciones con microorganismos
Polietilenglicol 1 100 5,9 ± 0,03 Soluble en agua, agentes de
suspensión
Denardin y Freire, (2000);
Rojas y Moreno, (2008).
Polietilenglicol 2 250 5,7 ± 0,07 Propiedades adhesivas,
soluble en agua Temprano et al. (2002).
Alcohol polivinílico-PVA
280 4.2 ± 0,02 Propiedades estabilizantes Deaker et al. (2004); Kwon
et al. (2009).
Carbómero 12000*** 3.5 ± 0,01 Agentes de suspensión y
adhesivas Rojas y Moreno, (2008).
Alginato Sodio 1 100-300 6,9 ± 0,25 Estabilizante, viscosante Bashan et al. (2002); Young et al. (2006).
Alginato Sodio 2 600-900 6,7 ± 0,08 Aglutinante, estabilizante Yabur et al. (2007); Bashan y Gonzales,
(1999).
Hidroxipropimetil celulosa-HPMC
100 6,7 ± 0,03 Soluble en agua, Liberación
controlada
** Suvorova et al. (1999); Fernandes júnior et al.
(2009).
Polivinilpirrolidona-PVP < 100 6,5 ± 0,05 Soluble en agua, bioadhesividad
Haffez et al. (1991); Tittabutr et al. (2007)
*Viscosidad se midió empleando un viscosímetro (Brookfield DV-III Ultra, Brookfield Engineering Laboratories,
Inc., USA) y se utilizó la aguja Nº 2 a una temperatura de 25°C con una velocidad < 100 rpm, de acuerdo al
polímero. ** No se han empleado hidroxipropilmetilcelulosa de acuerdo a la revisión de literatura citada; sin
embargo, se han realizado trabajos con el polímero carboximetilcelulosa.*** Tomado de la literatura.
4.3.3 Selección de los polímeros con base en su efecto sobre la viabilidad
celular
Ocho polímeros fueron seleccionados con base en reportes que han demostrado sus
cualidades sobre el mantenimiento de la viabilidad celular. Con el objetivo de determinar la
compatibilidad de estos con la cepa G58, se evaluaron tres concentraciones de los
polímeros las cuales fueron escogidas de acuerdo a la literatura y propiedades reológicas
de los mismos (Tabla 4).
De los resultados obtenidos a partir de la prueba de compatibilidad, se pudo establecer que
los polímeros que más afectaron la viabilidad celular en la mayor concentración fueron:
PEG2 > PEG1 > PVA > Carbómero > PVP > HPMC > Alginato 1 > Alginato 2. De esta
manera, los polímeros Alginato 2, Alginato 1 y HPMC se seleccionaron para estudios
posteriores. Las pruebas de compatibilidad demostraron que los polímeros seleccionados
no disminuyeron la viabilidad en menos de una unidad logarítmica, lo que contrasta con los
52
resultados obtenidos con los polímeros de polietilenglicol (Figura 4A y B) que afectaron la
integridad de la bacteria disminuyendo en más de dos unidades logarítmicas su viabilidad.
Polímeros como el alginato de sodio, presentaron mejores resultados en la viabilidad de la
cepa de Rhizobium sp., G58 mostrando un efecto estadísticamente superior en
comparación con el testigo (Figura 4E y F). Estos resultados son contrarios a los reportados
por Tittabutr et al. (2007); quienes emplearon porcentajes < 0,5% de este polímero
presentando una disminución de la viabilidad celular de cepas de rizobios; sin embargo
este efecto fue dependiente del tipo de especie evaluada. Por lo tanto, es importante antes
de utilizar los polímeros, realizar una caracterización fisicoquímica con el fin de obtener
información que contribuya hacia el uso adecuada de estos materiales y su compatibilidad
con bacterias promotoras de crecimiento. Se ha demostrado en trabajados realizados por
Bashan et al. (2002) la implementación de alginatos para la inmovilización de bacterias
promotoras de crecimiento vegetal (PGPB), con múltiples beneficios en la agricultura,
destacándose como uno de los polímeros más compatibles con este tipo de bacterias al
protegerlas contra condiciones ambientales adversas (Yabur et al., 2007). Se puede inferir
que los alginatos empleados (Alginato 1 y 2), difieren notablemente en cuanto a la
conformación de su estructura química en bloques (Zimmermann et al., 2007), es decir,
presentan diferentes unidades monoméricas, por lo cual desempeñen diferentes funciones
de dureza ó flexibilidad dependiendo del tipo de bloque (M ó G) en su estructura. Sin
embargo, los dos polímeros empleados no mostraron diferencias significativas entre sí
sobre la viabilidad de la cepa de Rhizobium sp. G58 manifestando un comportamiento
similar en los dos casos (Figura 4E y F).
De la misma forma, el polímero hidroxipropilmetilcelulosa-HPMC en las tres
concentraciones evaluadas no presentó un efecto deletéreo sobre la viabilidad de la
bacteria, observándose diferencias significativas con el control sin emplear polímero en el
medio (Figura 4G). Cabe mencionar que la hidroxipropilmetilcelulosa es un derivado
semisintético de la celulosa con grupos metilo e hidroxipropilo y es utilizado para liberación
controlada de diferentes principios activos gracias a las propiedades reológicas que
presenta (Kiil y Dam-Johansen, 2003). Se podría inferir que este polímero brinda beneficios
como soporte de la bacteria en un mayor tiempo y además pueda participar como agentes
estabilizantes de suspensiones (Ansel et al., 2004).
Autores como Fernandes Júnior et al. (2009) demostraron las cualidades de los
derivados de la celulosa como es el caso de la carboximetilcelulosa-CMC, la cual
aportó óptimas condiciones para el sostenimiento de los rizobios en etapa de
almacenamiento. Estos resultados son atribuidos a las características químicas y
53
propiedades reológicas que la rigen (Rohr, 2007), siendo materiales novedosos para
la inmovilización de bacterias fijadoras de nitrógeno.
Con respecto a los polímeros de polietilenglicol (PEG) de diferentes pesos moleculares, se
presentó una pérdida de la viabilidad durante los dos meses en las tres concentraciones
evaluadas. Para el caso del control se presentó mejor respuesta en comparación con todos
los tratamientos que empleaban polietilenglicol (Figura 4A y B). Trabajos similares han sido
reportados por Denardin y Freire (2000) quienes utilizaron el polietilenglicol obteniendo baja
viabilidad posterior con cepas de Bradyrhizobium elkanii. Así mismo, trabajos realizados por
Bushby y Marshall (1977) confirman que el efecto del polietilenglicol depende del género de
rizobios. Mientras que trabajos reportados por Tittabutr et al. (2007) presentan resultados
opuestos a los expuestos en este estudio. Estos resultados sobre el efecto en la viabilidad
de algunos tipos de bacterias pueden ser atribuidos a la composición química del
polietilenglicol, el cual se utiliza en la industria farmacéutica como agentes de suspensión y
estabilizante, ejerciendo una actividad antibacteriana (Rowe et al., 2009). De igual manera,
autores como Zahran y Sprent (1986) afirman que el polietilenglicol (PEG) inhibe el número
de nódulos de la planta hasta un 50%, interfiriendo en el proceso de infección en los pelos
radicales de la planta de haba (Vicia Faba L). En este sentido, cabe resaltar la necesidad
de realizar estudios de los polímeros sobre la simbiosis rizobio-leguminosa para
fundamentar aun más los resultados, debido a que a nivel in vitro, los efectos del
polietilenglicol (PEG) sobre la viabilidad celular son contradictorios y no satisfacen la
totalidad de su efecto de forma integral.
El polímero de polivinilpirrolidona-PVP, presentó una respuesta favorable en la viabilidad
del microorganismo bajo las tres concentraciones evaluadas (Figura 4H). Estos resultados
son similares a los encontrados por Tittabutr et al. (2007) los cuales demostraron que
cuando emplearon PVP en concentraciones del 1 al 5% durante 6 meses no se presentó
pérdida de la viabilidad del microorganismo. Además, pudieron concluir que la respuesta de
este polímero estaba influenciada por el tipo de rizobios utilizado. En este contexto se
destaca el trabajo realizado por Denardin y Freire (2000) los cuales investigaron las
mezclas de diferentes gomas con dos polímeros sintéticos, la polivinilpirrolidona (PVP) y el
polietilenglicol (PEG). Los resultados de este estudio corroboran que las mezclas de dos
gomas con el PVP mostraron una alta tasa de supervivencia de las células de
Bradyrhizobium elkanii, mientras que se presentó un efecto sobre la viabilidad celular
cuando fue utilizado el polímero de polietilenglicol (PEG).
54
Figura 4. Efecto de ocho polímeros sobre la viabilidad de la cepa G58 durante dos meses de
evaluación. Cada valor representa la media de tres réplicas. Diferente letra muestra diferencias estadísticas
significativas mediante el test de Tukey HSD (P < 0,05). Las barras de error representan la desviación estándar.
55
4.3.4 Determinación de propiedades adicionales de formación de película,
permeabilidad e hinchamiento de los tres polímeros compatibles con la cepa de
Rhizobium sp. G58
De acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas de compatibilidad fueron
seleccionados los dos polímeros de alginato de sodio y la hidroxipropilmetilcelulosa y se
utilizaron a una concentración de 0,5% (p/v) en las siguientes evaluaciones, debido a que
no presentaron diferencias significativas en los tres niveles estudiados anteriormente y así
mismo, por las condiciones del proceso de recubrimiento mediante el lecho fluidizado.
Se establecieron propiedades físicas adicionales que nos permitieran relacionar la
efectividad de los polímeros al ser empleados directamente en la planta, por lo cual se
decidió evaluar los parámetros de hinchamiento, permeabilidad y formación de película
(Tabla 5). Lo anterior, es relevante para analizar las condiciones de liberación del principio
activo en las matrices poliméricas y correlacionar la eficiencia de su liberación con la
disposición de la bacteria en condiciones del suelo.
Tabla 5. Caracterización de propiedades adicionales de los mejores polímeros seleccionados
Polímero Película polimérica
método casting (mm)
Permeabilidad-WVT
(g/m² s) Índice de Hinchamiento-IH
HPMC 0,004 ± 0,02 0,0187 ± 0,23 1± 0,08
Alginato Na 1 0,002 ± 0,01 0,017 ± 0,001 0,2 ± 0,04
Alginato Na 2 0,003 ± 0,02 0,0198 ± 0,15 0,6 ± 0,01
* Se muestra la desviación estándar para cada uno de los valores obtenidos de las variables medidas
Los resultados encontrados para la prueba de formación de películas, evidencian la
producción de una película polimérica mediante el método de casting (Figura 5A);
demostrando la capacidad de estos polímeros para integrar a su matriz diferentes principios
activos de interés en las áreas farmacéuticas y aplicaciones biotecnológicas de liberación
controlada (Perioli et al., 2004; Trivedy y Pandey, 2008). De esta manera, se infiere que los
polímeros empleados bajo estas concentraciones manifestaron esta propiedad, por lo que
posiblemente pudieran proteger al microorganismo y cederlo gradualmente bajo ciertas
condiciones.
56
Con respecto a los resultados de permeabilidad, se evidenció que todos los polímeros
presentan algún grado de permeabilidad al vapor de agua (WVT). Sin embargo, las
películas obtenidas con alginato (Figura 5B), presentan la mayor capacidad de permeación,
seguida de la película de hidroxipropilmetilcelulosa. Los polímeros empleados permiten el
transporte eficiente de vapor de agua a través de su estructura (Perioli et al., 2004). Los
valores obtenidos son similares a los resultados reportados para permeabilidad de
membranas poliméricas (Fulzele et al., 2002, Villalobos et al., 2006; Akgharia et al., 2006;
Aungsupravate et al., 2008).
Figura 5. De izquierda a derecha. A. Formación de películas poliméricas, B. Permeabilidad de los
polímeros e C. Hinchamiento de los polímeros
Por otra parte, se estableció el índice de máxima cantidad de agua que los materiales
poliméricos estarían en capacidad de retener, antes de desintegrarse. Los resultados
demuestran uniformidad en el proceso de hinchamiento durante el tiempo evaluado,
información que se podría correlacionar en futuras formulaciones de liberación controlada
de los principios activos (Perioli et al., 2004).
La observación permitió evidenciar la rapidez con que las películas son capaces de
hincharse (es decir, retener agua sin perder la forma original) encontrándose que en 4
minutos de exposición, la pendiente de la curva de ganancia de peso disminuye
significativamente, como se observa en la figura 5C. Además, las películas tienden a
alcanzar un máximo de agua retenida y saturarse, punto que no fue posible evidenciar en
muchas de las películas debido a que durante el tiempo de la prueba perdieron su
integridad, posiblemente por contar con un espesor menor.
La capacidad de hinchamiento de una película polimérica está condicionada por el
equilibrio entre la acción de los grupos hidrófilos de la red (que estabilizan líquidos de bajo
peso molecular en los poros de la estructura) y la fuerza elástica de sus enlaces que se
opone al aumento de volumen. La hidroxipropilmetilcelulosa presentó el mayor efecto en la
57
retención de agua, posiblemente debido a que presenta mayores sustituyentes de carácter
hidrófilos (Perioli et al., 2004); seguido de los alginatos, que posiblemente pueden ser
atribuido a las características que tiene éste material de formar geles débiles, con menor
grado de entrecruzamiento y menor capacidad de retención de agua (Lieberman, 1989).
Así mismo, estos materiales han sido extensamente empleados en el área farmacéutica
para la liberación controlada de fármacos mediante su habilidad de formar geles y permitir
la cesión extendida por un periodo de tiempo (Andreopoulos y Tarantili, 2002; Ching et al.,
2008)
4.4. Evaluación en invernadero del efecto de los tres polímeros seleccionados
sobre la actividad biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]
La inmovilización de microorganismos mediante la utilización de agentes poliméricos ha
sido ampliamente estudiado (Denardin y Freire, 2000; Fernandes Júnior et al., 2009), hasta
el punto de convertirse en estrategia clave para la formulación de inoculantes basados en
este tipo de materiales y su implementación en cultivos de interés comercial (Bashan et al.,
2002). Es por esto, que autores como (Soares y Oliveira, 2001; Denardin y Freire, 2000),
reportan una mayor contribución de las propiedades que rigen los polímeros sin afectar la
viabilidad de bacterias simbióticas, resaltando su mejor permanencia en el suelo y su
contribución en óptimos rendimientos en la planta, procesos de nodulación y fijación
biológica de nitrógeno. Así mismo, al emplear polímeros se asegura mayor vida útil de
formulaciones basadas en microorganismos diazotróficos sin la pérdida de las capacidades
fisiológicas de las bacterias (Deaker et al., 2004).
Los resultados fueron obtenidos mediante el análisis multivariado de componentes
principales del efecto de los polímeros sobre la actividad biológica en fríjol cowpea (Figura
6). En total se tuvieron en cuenta 9 variables de respuesta (longitud de raíz, longitud de
parte aérea, número de nódulos, biomasa de los nódulos, fijación biológica de nitrógeno,
peso fresco raíz, peso fresco parte aérea, peso seco raíz y peso seco parte aérea), por lo
que se decidió reducir estadísticamente para tener un mejor análisis del experimento y
encontrar de una forma más robusta, la simplificación en el número de variables en un
porcentaje representativo del total del ensayo.
58
Figura 6. Respuesta biológica del fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp], mediante la
implementación de polímeros con la cepa de Rhizobium sp., G58. A. Montaje en invernadero de los
polímeros; B y C. Presencia de nódulos en las raíces de las plantas y D. Color rojizo del nódulo
(indicador de efectivo)
De acuerdo a esto, el análisis de componentes arrojó que las tres primeras componentes
explican un 89% de la variabilidad del experimento. Es decir, según el análisis e
interpretación de la información se observó que las variables que tenían una mayor
influencia en los resultados obtenidos se presentaban básicamente sobre el proceso de
simbiosis entre la cepa de Rhizobium sp., G58 y la planta de fríjol cowpea. De la variación,
el 48,8% pudo ser explicado por la primera componente principal (PC1), el 26,1% por la
segunda componente (PC2) y 15,46% por la tercera componente principal (PC3). De aquí,
la información contenida en las nueve variables de respuesta originales pudo ser resumida
en tres, las cuales recolectaron la mayor información del ensayo (Tabla 6).
El análisis de carga factorial obtenido mediante el análisis de componentes principales-
ACP, demuestra la influencia de cada una de las variables sobre las componentes
59
principales. Este análisis permitió correlacionar la primera componente principal (PC1) y
definirla como: el establecimiento de la simbiosis entre la bacteria en estudio Rhizobium sp.,
G58 y la planta de fríjol cowpea. Así mismo, la segunda componente (PC2) se centró
principalmente sobre el tamaño de la planta. Mientras que, la tercera componente (PC3) se
pudo correlacionar sobre el proceso de translocación de nutrientes en la planta (Tabla 6).
Tabla 6. Análisis de componentes principales-ACP del efecto de los polímeros sobre la actividad
simbiótica del Rhizobium sp. y la planta de fríjol cowpea.
Componente
Estadística
Eigenvalor
PC1 PC2 PC3
4,346 2,359 1,392
% de la varianza 48,289 26,217 15,464
% acumulativo 48,289 74,506 89,970
Carga factorial
Variables
Long. Raíz 0,938 -0,116 -0,122
Long. PA 0,530 0,615 0,419
N° Nódulos 0,955 -0,137 -0,012
ARA 0,981 -0,066 -0,041
Biomasa Nódulos 0,990 -0,038 0,052
PF. Raíz 0,094 0,935 -0,246
PF. Parte Aérea 0,175 -0,094 0,959
PS. Raíz 0,155 0,952 -0,135
PS. Parte Aérea -0,518 0,391 0,446
Por lo tanto, se describió la contribución de cada una de las componentes y su correlación
en el plano de componentes principales (Figura 7). Observando que cuando la componente
principal 1 (PC1) se encuentra al lado positivo del eje indica un aumento en el
establecimiento de la simbiosis entre la bacteria y la planta cuando fueron empleados los
tratamientos con alginato e hidroxipropilmetilcelulosa-HPMC. Lo anterior puede ser
atribuido a las aceleradas actividades metabólicas que intervienen en el proceso de
nodulación, por lo que requiere la expresión de genes de la nodulación específica (nod),
que conducen a la síntesis de un grupo de moléculas de señalización que inducen
la morfogénesis de los nódulos y la acumulación de nutrientes para dichos procesos
(Panter et al., 2000). Para el caso, de (PC2) cuando los tratamientos se encuentran al lado
negativo del eje indican una disminución en el tamaño de la planta. Y para el (PC3), cuando
está en el lado positivo implica que en la especie vegetal hay una mayor translocación de
nutrientes hacia la parte aérea desde las raíces para su nutrición mineral. Es por esto, que
cuando los rizobios fijan el nitrógeno de la atmósfera en las raíces mediante sus estructuras
60
especializadas llamadas nódulos, se transfieren los asimilados hacia toda la planta para su
crecimiento, siendo fuente de reserva para la acumulación de nutrientes y su posterior
transporte hacia el resto de la misma (Hirsch et al., 2001). De allí se podría inferir que el
tratamiento con el polímero alginato 1, pudo estimular la fijación biológica de nitrógeno
(FBN) y consecuentemente, el transporte efectivo de asimilados hacia el resto de la planta,
lo cual se ve reflejado en mayor contenido de biomasa seca y mayor tamaño en la parte
aérea; seguido de los tratamientos con HPMC y Alginato 2 respectivamente.
En el experimento fue posible observar que hubo una correlación positiva entre el número
de nódulos y la actividad de reducción de acetileno (P<0.05) (Tabla 7); lo cual puede ser
atribuido posiblemente a un mayor tamaño de los nódulos y coloración interna,
característica que indica la efectividad en la fijación biológica de nitrógeno. Sin embargo,
autores como Bécquer (2009) reportan que no existe una medida precisa que determine
una mayor fijación de nitrógeno con un mayor número de nódulos; debido a que en el suelo
se pueden encontrar cepas de rizobios altamente efectivas que pueden formar pocos
nódulos en las raíces de leguminosas presentando alta fijación.
Tabla 7. Análisis de correlación entre las variables mediante componentes principales-ACP con los
polímeros
Variables Long. Raíz
Long. PA
N° Nódulos
ARA Biomasa Nódulos
PF. Raíz PF. P.Aérea
PS. Raíz
PS. P.Aérea
Long. Raíz 1
Long. PA 0,345 1
N° Nódulos 0,909 0,333 1
ARA 0,924 0,407 0,992 1
Biomasa Nódulos
0,905 0,504 0,966 0,986 1
PF. Raíz 0,014 0,441 0,014 0,072 0,055 1
PF. P.Aérea 0,051 0,427 0,146 0,125 0,222 -0,306 1
PS. Raíz 0,045 0,639 -0,024 0,067 0,103 0,906 -0,159 1
PS. P.Aérea -0,516 -0,032 -0,409 -0,463 -0,479 0,307 0,228 0,126 1
Con base en los resultados obtenidos a partir del análisis de componentes principales, se
pudo concluir que el tratamiento YM + alginato 1 es el que permite un mejor
establecimiento de la simbiosis sin afectar el crecimiento de las plantas (Figura 7), de igual
manera favorece la translocación de nutrientes. Lo anterior pudo atribuirse a la estructura
del alginato utilizado y su baja viscosidad (Zimmermann et al., 2007). En las figuras de las
componentes se evidencia como las observaciones asociadas al tratamiento YM + alginato
1 se ubican en el cuadrante I del plano, lo que indica de acuerdo al análisis de las cargas
factoriales que presenta la mayor actividad biológica. En el caso del YM + alginato 2, este
61
permite una buena nodulación; sin embargo, presenta un efecto negativo sobre el
crecimiento de la planta, quizá esta respuesta se encuentre relacionada con su viscosidad;
por lo que se puede inferir que interviene en la entrada de algunos minerales esenciales los
cuales son necesarios para establecer ciertos procesos fisiológicos, igualmente es evidente
que puede interferir con la translocación de algunos nutrientes lo que confirmaría
parcialmente la hipótesis propuesta (Figura 7). Cuando se utilizó el alginato 2, este tipo de
polímero presenta un estructura más rígida y una alta viscosidad (Zimmermann et al.,
2007), por lo que pudo haber repercutido en una mejor respuesta. Estudios similares fueron
obtenidos por Rawsthorne y Summerfield (1984) encontrando mejores resultados en
fijación de nitrógeno y mayor peso seco de los nódulos cuando se empleó el alginato
(agrigel) en comparación con el tratamiento control.
Para el caso del control absoluto, fue posible evidenciar una cantidad de biomasa
considerable en las plantas de estudio sin el establecimiento de simbiosis lo cual sería
indicativo de un aumento en tamaño posiblemente como mecanismo de resistencia.
Autores como Filho et al. (2006) sugieren que cuando las plantas se encuentran estresadas
ya sea por una restricción del recurso hídrico, estas pueden acelerar el crecimiento y
madurez y reducir el periodo de acumulación de reservas, de tal manera que no presentan
un patrón normal de desarrollo y composición química.
Por otra parte, estudios similares han sido reportados por (Kohls et al., 1999) quienes
demostraron una mejor respuesta en la nodulación de la planta cuando emplearon
polímeros retenedores de agua con cepas de Frankia sp., presentando diferencias
significativas con los demás tratamientos.
62
Figura 7. Análisis de componentes principales de los tratamientos con polímeros. (A) Diagrama de
dispersión del análisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y PC2; (B)
Diagrama de dispersión del análisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y
PC3; y (C) Diagrama de dispersión del análisis del experimento en invernadero con las componentes
PC2 y PC3. Tratamientos y relación de símbolos: testigo absoluto (), medio YM (), YM + alginato 1
(), YM + alginato 2 (), YM + HPMC (). Cada símbolo es el promedio de tres mediciones.
63
4.5. Evaluación en invernadero del efecto de los prototipos de formulación
sólidos sobre la actividad biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata
(L.) Walp]
Por otra parte, se obtuvo el análisis de componentes principales para los prototipos de
formulación sólidos obtenidos mediante lecho fluido y su aplicación en la planta (Figura 8)
reduciendo el número de variables para una mejor interpretación de los resultados
obtenidos en invernadero.
Figura 8. Formulación de prototipos sólidos de biofertilizantes mediante lecho fluido y su respuesta
biológica en fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp]. A y B. Lecho fluidizado y pellets
respectivamente. C. Viabilidad celular de la cepa G58 y D. Establecimiento de la nodulación
utilizando los prototipos en planta
Con respecto a los prototipos de formulación sólida, el análisis multivariado obtenido explicó
un 84,5% de la variabilidad del experimento, que puede ser explicado mediante las tres
64
componentes principales. De la variación, el 40,67% pudo ser descrito por la primera
componente principal (PC1), el 30% por la segunda componente (PC2) y el 13,77% por la
tercera componente (PC3). De esta manera, el total del experimento fue reducido en tres
factores principales (Tabla 8).
El análisis de carga factorial permitió correlacionar la primera componente principal (PC1)
con la biomasa total de la planta de fríjol cowpea. Para la segunda componente (PC2)
implicó evidentemente el mecanismo simbiótico entre la bacteria en estudio Rhizobium sp.,
G58 y la planta. Y la tercera componente (PC3) demostró la correlación sobre el proceso
de translocación de nutrientes en la planta (Tabla 8).
Tabla 8. Análisis de componentes principales-ACP del efecto de los prototipos sobre la actividad
simbiótica del Rhizobium sp. y la planta de fríjol cowpea.
Componente
Estadística PC1 PC2 PC3
Eigenvalor 3,661 2,704 1,240
% de la varianza 40,679 40,679
30,049 13,772
% acumulativo 70,728 84,500
Carga factorial
Variables
Long. Raíz 0,405 -0,408 0,728
Long. PA 0,550 0,274 0,672
N° Nódulos 0,358 0,895 -0,014
ARA 0,593 0,645 -0,291
Biomasa Nódulos 0,360 0,847 0,075
PF. Raíz 0,777 -0,451 -0,358
PF. Parte Aérea 0,642 -0,510 -0,112
PS. Raíz 0,937 -0,176 -0,163
PS. Parte Aérea 0,832 -0,182 -0,014
De acuerdo a los resultados obtenidos se pudo observar que el tratamiento con el alginato
1 nuevamente arrojó los mejores resultados en cuanto al proceso de simbiosis y al proceso
de transporte de nutrientes a la planta, lo anterior se determinó en la figura de las
componentes, presentando un comportamiento positivo sobre el eje del plano (Figura 9). Lo
anterior pudo ser explicado, debido a un mayor desarrollo radical de la planta la cual fue
estimulada posiblemente por la liberación controlada del microorganismo en la formulación
sólida, permitiendo la extracción de mejor cantidad de nutrientes que pudieron ser
translocados a las plantas para su metabolismo y nutrición (Faiguenbaum, 2003). Sin
embargo, en cuanto a la biomasa de la planta, el tratamiento con alginato 1 no presentó
ningún aporte, manifestando su participación en la parte central izquierda (negativa) del
65
plano. Por el contrario, en el tratamiento con el testigo absoluto no se presentó el
establecimiento de la simbiosis; mientras que hubo una correlación entre la biomasa de la
planta y la translocación de nutrientes. Este comportamiento obtenido nuevamente en el
segundo ensayo pudo haberse presentado, a la condición de estrés en que se encontraba
la planta, por lo cual mostró una respuesta diferente, lo anterior ha sido referenciado por
autores como (Bray, 2004; Blum, 2005) quienes afirman que la planta puede establecer
algunas adaptaciones en respuesta a la deshidratación, lo que provoca cambios en la
expresión de proteínas y su metabolismo en condiciones de déficit de agua.
Ahora con respecto a los tratamientos de la bacteria en YM líquido, y en el prototipo sólido
sin polímero se observó baja nodulación y bajo aporte en biomasa de la planta en
comparación con los demás tratamientos, destacándose la necesidad de utilizar soportes
del tipo polimérico que puedan contribuir a un mejor sostenimiento de la bacteria sin afectar
su actividad biológica (Deaker et al., 2004). Por su parte, el tratamiento con HPMC, es
nuevamente evidente el efecto que presenta sobre el proceso de translocación de
nutrientes (Figura 9). Cabe mencionar que el polímero hidroxipropilmetilcelulosa–HPMC, es
un polímero sintético utilizado en la industria farmacéutica para la liberación controlada de
fármacos en el tiempo gracias a su matriz hidrofílica (Lee et al., 1999). Lo anterior, puede
estar asociado muy posiblemente a un efecto indirecto sobre la translocación de nutrientes
desde la raíz hacia la parte aérea de la planta, debido a su estructura, componentes
adicionales ó propiedades reológicas. Además, este polímero fue el que presentó un mayor
índice de hinchamiento por lo que posiblemente pudo influir sobre el transporte de
minerales en la planta y por ende la respuesta presentada. Sin embargo, su gran aporte se
realizó en el establecimiento de la simbiosis y biomasa en la planta al presentar excelente
nodulación; por lo que es recomendable realizar una evaluación en campo con el fin de
establecer si realmente hay un efecto del polímero sobre dicho proceso ó se pudieron
presentar otros factores externos que incidieron en el proceso de translocación de
nutrientes en la planta.
Es de suma importancia resaltar que debido a que las plantas no habían llegado a su etapa
final de floración, muy posiblemente se presentó un desbalance nutricional en cuanto a la
translocación de nutrientes en el experimento utilizando los prototipos sólidos, lo que se
evidencia de forma general en los resultados aquí expuestos.
Además, se pudo presentar un efecto de factores ambientales, debido principalmente a que
el cultivo de fríjol cowpea se establece en climas tropicales y las condiciones climáticas del
país por la ola invernal (temperatura, luz y humedad), no fueron las más adecuadas a pesar
de haberse realizado bajo invernadero; habiendo influido de modo indirecto y en
66
consecuencia incidir en sus procesos metabólicos como la respiración, transporte y
nodulación (Pérez y Torralba, 1997).
Figura 9. Análisis de componentes principales de los tratamientos con prototipos. (A) Diagrama de
dispersión del análisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y PC2; (B)
Diagrama de dispersión del análisis del experimento en invernadero con las componentes PC1 y
PC3. (C) Diagrama de dispersión del análisis del experimento en invernaderos con las componentes
67
PC2 y PC3. Tratamientos y relación de símbolos: testigo absoluto (), medio YM líquido (), medio
YM sólido (), YM + HPMC (), YM + alginato 1 (Δ), YM + alginato 2 ().Cada símbolo es el
promedio de tres mediciones.
4.6. Evaluación de diferentes propiedades de los prototipos
4.6.1 Evaluación de las actividades de promoción de crecimiento en los
prototipos de formulación
Se determinó las actividades de crecimiento de la cepa Rhizobium sp., G58 en los
prototipos formulados con el fin de establecer los posibles cambios efectuados mediante la
utilización de forma sólida de los prototipos de formulación. Los resultados obtenidos
permitieron evidenciar que en la actividad de reducción de acetileno (ARA) no se
presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los prototipos 2 y 3 utilizando
los polímeros de alginato con respecto al testigo. Sin embargo, el prototipo 1 de HPMC,
mostró diferencias apreciables en cuanto a la fijación biológica de nitrógeno en
comparación con todos los tratamientos especialmente con el control (Tabla 9). Es
importante resaltar que no se observó ningún efecto sobre la actividad de fijación biológica
de nitrógeno cuando la cepa de Rhizobium sp., G58 fue colocada bajo una formulación
sólida, demostrando que esta capacidad biológica no es alterada. Por lo tanto, se podría
pensar que la formulación sólida es capaz de liberar el principio activo (bacteria) para el
desarrollo del proceso de nodulación en la planta. Autores como Mary et al. (1993)
reportaron resultados similares a los obtenidos en este estudio, demostrando que el
proceso de secado por aspersión mediante el lecho fluido no induce cambios en la
habilidad de la cepa de Bradyrhizobium japonicum para la formación de nódulos y la fijación
de nitrógeno.
En el caso, de las dos variables de producción de compuestos indólicos (AIA) y porcentaje
de humedad, estas no mostraron cambios significativos en todos los tratamientos
evaluados. En contraste, estudios realizados por (Trivedy y Pandey, 2008) demostraron
que dentro de las rizobacterias promotoras de crecimiento, las Pseudomonas no
presentaron efectos en la capacidad de producción de hormonas auxínicas de tipo indólico,
así como la producción de sideróforos durante tres años de almacenamiento empleando
polímeros como el alginato.
68
Además, cuando se evaluó la capacidad de producción de fósforo (P) de los tres prototipos
de formulación sólidos, los resultados señalan que esta actividad biológica no fue afectada
después del proceso de secado por aspersión. Lo anterior es muy representativo, debido a
que algunas bacterias del género Rhizobium sp., contribuyen a mejores resultados cuando
la capacidad de solubilización de fósforo se encuentra presente, es decir, manifiesta
mejores rendimientos tanto en la movilización de fósforo como de diferentes minerales
esenciales en la planta en comparación si esta actividad está ausente (Abril et al., 2003;
Young et al., 2006).
Tabla 9. Evaluación de las capacidades de promoción de crecimiento en los prototipos de
formulación sólidos
Características
Prototipos ARA (nmol C2H4 /planta h-1
) AIA (µg/ml) P (µg PO4³/ml) %Humedad
Control Prototipos 978,49c*
19,86a ± 0,06 238,26
b ± 0,09 2,07
a ± 0,56
Prototipo 1 HPMC 1647,33a 20,71
a ± 0,05 289,17
ab ± 0,06 2,25
a ± 0,44
Prototipo 2 Alg Na 1 1211,13b 22,39
a ± 0,31 287,13
ab ± 0,11
2,36
a ± 0,21
Prototipo 3 Alg Na 2 1201,26b 20,24
a ± 0,01 309,79
a ± 0,42 2,20
a ± 0,13
*Cada valor representa la media de tres réplicas. Diferente letra representa diferencias estadísticas significativas
mediante el test de Tukey HSD (P < 0,05). El signo ± muestra la desviación estándar.
La implementación y aplicación de bacterias promotoras de crecimiento mediante el
proceso de encapsulación brinda grandes ventajas sobre el establecimiento de los
microorganismos, permitiendo su protección mediante la inmovilización en las matrices
poliméricas y a su vez mejorando la inoculación en el suelo (Cassidy et al., 1996). Por esta
razón, se reduce la competición microbiana, liberando gradualmente los microorganismos
encapsulados con el propósito de implantar una mejor colonización de las raíces en las
plantas bajo condiciones desfavorables (Bashan et al., 2002; Vassilev et al., 2001).
4.6.2 Perfiles de liberación y degradación de los prototipos bajo condiciones
controladas
Se realizaron los perfiles de liberación del activo en los prototipos de formulación sólidos
durante 5 días. Se presentaron diferencias significativas entre el prototipo control (bacteria
adherida a los pellets de azúcar) y los tratamientos empleando HPMC (prototipo 1) y
69
alginato 2 (prototipo 3). Los resultados obtenidos muestran una mayor liberación del
prototipo control y el alginato 1 (prototipo 2) en el tiempo (Figura 10A).
De acuerdo a esto, es posible inferir que existe una correlación entre el índice de liberación
de la bacteria con el porcentaje de degradación de los pellets para tener disponible el
microorganismo en el suelo. Trabajos similares han sido reportados por Bashan et al.
(2002) donde demostraron la degradación de las microesferas basadas en alginato de
sodio y leche descremada durante 15 días; mostrando un mejor comportamiento en el
desarrollo de la planta cuando se inmovilizó bajo este tipo de formulación. En contraste, se
observó una disminución de la viabilidad del microorganismo durante el tiempo cuando se
fueron degradando las microesferas.
Una vez analizada la viabilidad de la bacteria en condiciones semejantes a las del suelo, se
realizó un perfil de degradación de los prototipos evidenciando un 80% de degradación del
prototipo control, seguido de los prototipos con polímeros con un porcentaje del 60%,
evidenciando diferencias significativas en el proceso de degradación de los pellets durante
los 5 días de evaluación (Figura 10B).
70
Figura 10. A. Liberación del principio activo (cepa Rhizobium sp., G58) y B. Porcentaje de
degradación de los prototipos de formulación, durante 5 días de evaluación. Cada valor muestra la
media de tres réplicas. Diferente letra representa diferencias estadísticas significativas mediante el test de
Tukey HSD (P < 0,05). Las barras de error representan la desviación estándar.
De forma general, se evidenció una degradación más lenta de los prototipos empleando
polímeros, lo cual es provocado por la utilización de este tipo de materiales que contribuyen
a la liberación más controlada gracias a sus matrices poliméricas y propiedades reológicas
que los conforman (Bashan, 1999; Cassidy et al., 1996; Trivedy y Pandey, 2008).
4.6.3 Microscopía electrónica de barrido-SEM y de transmisión-TEM
Adicional a esto, se le realizó observaciones mediante microscopía electrónica de barrido
(SEM) y de transmisión (TEM) al prototipo “alginato 1”, el cual presentó mejores resultados
en actividad biológica entre la simbiosis rizobio-planta. Lo anterior se realizó con el objetivo
de identificar la presencia de la cepa de Rhizobium sp., G58 en la superficie de los pellets
bajo las formulaciones sólidas, empleando polímeros. Varios estudios han sido reportados
hacia la utilización de microscopias de alta gama en microorganismos diazotróficos (Berg et
al., 1979; Kabir et al., 1995; Bianucci et al., 2011) para la visualización de estructuras
representativas.
Los resultados obtenidos mediante microscopía electrónica de barrido permitieron
establecer la permanencia de la bacteria en la superficie de los pellets que presentaban la
incorporación de los polímeros mediante la técnica de recubrimiento en lecho fluidizado
(Figura 11A y B), demostrando la capacidad de resistencia de la bacteria sometida al estrés
de temperatura y del establecimiento de la bacteria mediante el recubrimiento realizado con
el polímero de alginato de sodio. Estudios relacionados han sido reportados por Boza et al.
(2004) donde evidenciaron la viabilidad de Beijerinckia sp. y su permanencia cuando fue
utilizado el proceso de secado por atomización, presentándose una adherencia del
microorganismo en la superficie de las micropartículas. En contraste, trabajos similares han
sido obtenidos por Young et al. (2006) donde demuestran la inmovilización de Bacillus
subtilis sobre la superficie de microesferas de alginato de baja viscosidad (500 m Pas)
mediante microscopia electrónica de barrido, lo cual evidencia que el microorganismo se
integra dentro de las matrices poliméricas inducidos debido al fenómeno de intercambio
iónico.
71
A B
Por esta razón, es de gran relevancia implementar técnicas de microscopía que permitan
establecer la participación de los materiales poliméricos con ingredientes activos de interés
biológico, como es el caso de microorganismos fijadores de nitrógeno y su contribución en
la generación de alternativas de desarrollo que permitan la inmovilización de bacterias para
su protección a condiciones ambientales adversas.
De la misma forma autores como Puente et al. (1999) han empleado microscopía
electrónica de barrido con el fin de identificar Azospirillum halopraeferans y Azospirillum
brasilense en la superficies de las raíces de plantas y de esta manera determinar su
contribución al proceso de colonización de las raíces mediante la formación de
microfibrillas.
Figura 11. A y B. Microfotografía electrónica de barrido (R) Rhizobium sp. G58 superficie del pellets;
C y D. Microfotografía electrónica de transmisión de la cepa de Rhizobium sp., G58. Abreviaciones:
Cuerpo de inclusión de PHB: Poli-β-hidroxibutirato, PC: Pared celular, MC: Membrana celular, AC:
Ácidocalcisomas, PF: Gránulos de polifosfato. C magnificación 20000 X, escala de barras representa
0,5 µm. D magnificación 10000 X, escala de barras representa 1,2 µm.
0,5 µm
PHB
PC
MC
1,2 µm
AC
PF
R
72
De igual forma, los resultados obtenidos mediante microscopía electrónica de transmisión,
reafirman la presencia de estructuras especializadas en el interior de la célula de
Rhizobium sp. G58 (Figura 11C y D). Lo anterior es muy representativo, debido a que se
puede argumentar que la bacteria se encuentra presente en los pellets recubiertos con los
polímeros, presentando características propias del género Rhizobium sp., como es la
formación de cuerpos de inclusión que corresponderían a gránulos de polihidroxibutirato
(Dazzo et al., 1984; Cevallos et al., 1996; Yang y Lin, 1998; Prell y Poole, 2006). De
manera que la producción de este tipo de compuestos de forma intracelular se estaría
formando principalmente cuando la bacteria se encuentra estresada debido a diferentes
condiciones ambientales severas (Stainer et al., 1992; Zevenhuizen, 1981). Tal es el caso,
de limitaciones fuertes por algún nutriente, exceso de fuentes carbonadas, por lo que la
bacteria induce la formación de PHB como fuente de reserva de carbono y energía (Reddy
et al., 2003; Khanna y Srivastava, 2006). El anterior resultado, se pudo haber presentado
en el proceso de recubrimiento, muy posiblemente a las condiciones del equipo que
permitieron que la bacteria presentara algún estrés evidenciando cambios en su morfología
bajo este tipo de formulación.
Por otra parte, el tamaño observado de la cepa de Rhzobium sp. G58, mediante
microscopía de transmisión es similar a lo reportado por autores como (Kuykendall et al.,
2005). Así mismo, se observó gránulos metacromáticos de polifosfato (Figura C) que son
polímeros lineales que actúan como depósitos de almacenamiento de fósforo y energía
para la formación de ATP; dando una ventaja competitiva sobre otros microorganismos que
no son capaces de acumular reservas internas (Serafim et al., 2002).
Además, se visualizó orgánulos electro-densos de acidocalcisomas ricos en calcio y fosfato
(Figura C) presentes en la bacteria G58, lo anterior se encuentra implicado en el
almacenamiento de fósforo y de diversos iones metálicos, el metabolismo del polifosfato, el
mantenimiento de pH intracelular, osmorregulación y la homeostasis del calcio (Docampo
et al. 2005; Seufferheld et al., 2011).
De igual manera, en estudios realizados por Bianucci et al. (2011), establecieron mediante
microscopía electrónica de transmisión la acumulación de cadmio intracelular por parte de
Bradyrhizobium sp. provocando alteraciones morfológicas, por lo cual la acumulación de
cadmio pudo ser reducida como respuesta al sistema primario de defensa del
microorganismo.
73
Conclusiones
La aplicación de polímeros en formulaciones de inoculantes reviste de gran importancia
actualmente como estrategia de innovación tecnológica encaminada hacia el
mantenimiento de los microorganismos y su estabilidad metabólica. Es por esto, que los
resultados obtenidos en la investigación permitieron establecer que los polímeros de
alginato de sodio e hidroxipropilmetilcelulosa fueron los que presentaron una mejor
respuesta sobre la viabilidad de la cepa de Rhizobium sp., sin efecto sobre las
capacidades fisiológicas de la bacteria. De igual manera, se determinó la influencia de los
polímeros sobre la actividad simbiótica evidenciando que bajo condiciones de invernadero
los resultados satisfacen las expectativas sobre el óptimo establecimiento de la simbiosis
entre la bacteria y la planta de fríjol cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] contribuyendo
efectivamente en el proceso de nodulación sin ningún efecto observado. En contraste, fue
interesante observar que cuando se aplicaron las formulaciones sólidas mediante el lecho
fluidizado, fue evidente un mayor efecto sobre el desarrollo de la planta y establecimiento
de la simbiosis con la formación de nódulos de mejores condiciones. De aquí, se concluye
que la implementación de una formulación sólida logró una mejor liberación de la bacteria
de forma prolongada en el tiempo, permitiendo que se llevara a cabo el proceso de
nodulación de forma efectiva. En resumen, se comprobó que las formulaciones empleando
polímeros como vehículos son una de las opciones más tangibles para la inmovilización de
microorganismos benéficos con miras a suplir las deficiencias de nitrógeno en los cultivos
de leguminosas.
74
Recomendaciones
Es indispensable utilizar técnicas moleculares más robustas ó prímers más específicos
que permitan identificar en mayor grado la especie bacteriana utilizada.
Se sugiere evaluar la actividad de la leghemoglobina con el objetivo de demostrar la
efectividad de los nódulos y su capacidad de indicar que se está fijando activamente el
nitrógeno por acción de la enzima nitrogenasa.
Determinar bajo condiciones de campo la capacidad de asociación y efectividad de la cepa
de Rhizobium sp. G58 en formulaciones con soportes poliméricos y el aporte en cuanto a
rendimientos de proteína en grano.
Potencializar las capacidades fisiológicas de la cepa de Rhizobium sp., G58 para su
utilización en formulaciones con aditivos poliméricos.
Marcar molecularmente la cepa de Rhizobium sp. G58 mediante la introducción de genes
reporteros gfp, que permitan determinar con exactitud que el proceso de nodulación es
mediado por la bacteria proveniente del prototipo de biofertilizante formulado.
Se sugiere realizar los estudios respectivo para el escalamiento del proceso, junto con el
análisis de costos involucrado.
75
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![Comparison between the reference [i]Rhizobium … · Common bean plants were inoculated with rhizobia strains: Rhizobium tropici CIAT899 or Rhizobium etli 12a3, ... +216 94120093](https://img.dokumen.tips/doc/110x75/5b915a7d09d3f26a278b6ea5/comparison-between-the-reference-irhizobium-common-bean-plants-were-inoculated.jpg)
