Terapia celular na silicose murina experimentallivros01.livrosgratis.com.br/cp065057.pdf · anatomia patológica (HUCFF). No tempo em que eu sonhava com o dia que publicaria um artigo

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Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas

Terapia celular na silicose murina experimental

Túlio Galvão Ventura

Orientadora> Profª. Christina Maeda Takiya

2007

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Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas

Orientador: Profª. Drª. Christina Maeda Takiya

Rio de Janeiro Agosto / 2007

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Orientador: Profª. Drª. Christina Maeda Takiya

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas.

Examinadores:

_____________________________________________ Profª. Drº. Robson Coutinho _________________________________________ Profª. Drª. Maria Isabel Doria Rossi _________________________________________ Profª. Drª. Tatiana Coelho Sampaio _________________________________________ Profª. Drª. Luiz Eurico Nasciutti (Revisor e Membro suplente) _________________________________________ Profº. Drº. Célio Geraldo Freire de Lima (Membro suplente) Profº. Drº. Vivaldo Moura Neto (Coordenador do curso de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas

Rio de Janeiro Agosto / 2007

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Ventura, Túlio

Terapia celular na silicose murina experimental / Túlio Galvçao Ventura. Rio de Janeiro, 2007. 156 p.

Dissertação – (Mestrado em Ciências Morfológicas) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, 2007. Orientador: Christina Maeda Takiya 1. Silicose. 2. fibrose pulmonar. 3. células tronco. 4. medula óssea. – Teses. I. Takiya, Christina Maeda (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Pós-Graduação em Ciências Morfológicas. III. Título.

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Ao amigo Bruno Loureiro Leite Costa, (in memorian)

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AGRADECIMENTOS

Agradeço à Deus, pois só ELE mesmo pra saber os dias e noites de tensão

passados por mim, momentos em que a ELE recorri e fui sempre prontamente

atendido.

Depois, só posso agredecer e dedicar todo o esforço desse trabalho aos meus

pais, Nilton e Mª Teresa, que desde sempre se sacrificaram para que eu e

Diana, minha irmã, pudessemos ter a oportunidade de estudar e chegarmos

até aqui. Agradeço e ofereço à eles porque me deram tudo que tenho de valor

na vida: caráter, dignidade, honestidade e orgulho de pertencer a essa família,

que “enverga, enverga, mas não quebra nunca!!” AMO VOCÊS!!!

À minha irmã, pela amizade, apesar das diferenças e pela paciência nas horas

de me acudir com alguns artigos. Valeu Di!! OBS: Daqi à pouco é você hein!!

Á Professora Christina Takiya, que acompanho desde 1998, quando ingressei

na iniciação científica no laboratório de microscopia do departamento de

anatomia patológica (HUCFF). No tempo em que eu sonhava com o dia que

publicaria um artigo com o famoso “cols...”

Á Sonia Oliveira Souza, com quem aprendi boa parte do pouco que sei hoje.

Pela paciência nos tempos da anatomia patológica, quando dava os primeiros

passos nas histoquímicas, imunohistoquímicas e afins. E, a cima de tudo, pelo

carinho que dedicou a todos os alunos enquanto estávamos por lá.

Ao amigo, irmão, cumpadre e chefe (rsrs), França, pelo companheirismo desde

os idos de faculdade, passando pela IC na patologia, pelos anos que se

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seguiram ao término da graduação e, enfim, na UNISUAM, nossa casa

atualmente. Pelas oportunidades que me proporcionou e pela confiança. Mas,

a cima de tudo, pela amizade. Valeu çafran!! Pedro e Bino irmão!!!!

Ao irmão Marcelo Charlão, que já dividiu comigo muitos momentos

inesquecíveis, fossem eles bons ou ruins. Não me importava e não me importa

quantos mais virão, bons ou ruins, o que importa é a certeza de que estaremos

juntos mais uma vez em todos eles. Agradeço pela amizade incondicional e

pela torcida para que tudo desse certo sempre. Irmão, obrigado por tudo!!

Aos amigos da “firma” (Gi, Paulinha, Peninha, de menor, Doc, Rê, Cris, Dara e

Raquel), por existerem... Não há como dizer muito, nós sabemos o valor dessa

amizade, mútua, sincera, verdadeira e ETERNA.

À amiga Mariana Catta-Pretta, pela ajuda, que foi o ponta-pé inicial para que

tudo começasse, enfim, a dar certo. Mas principalmente, pela amizade sincera,

pelas palavras de incentivo, pela prestatividade e pela certeza de que posso

contar sempre com essa amizade.

Aos professores Fernando Guimarães e Sara Menezes, a quem devoto

profunda admiração, por serem os responsáveis pelo dispertar científico e por

serem referência de fisioterapeutas e da fisioterapia.

Ao mestrando Leonardo Monção, que foi uma pessoa fundamental para a

concretização dessa dissertação. Foi companheiro nas horas que precisei, nas

noites até tarde no laboratório fazendo experimentos e principalmente nos dias

em que, na minha ausência em virtude do trabalho, estava sempre me

ajudando para adiantar as coisas quando possível.

Ao amigo Bernardo Oliveira Pascarelli, pessoa extraordinária que tive o prazer

de conhecer e felizmente estreitar os laços nos últimos tempos. Agradeço

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desde os tempos em que ainda era técnico do laboratório, mas principalmente

pelos papos e desabafos, seja por problemas referentes ao laboratório, ou por

questões pessoais. B, você é, sem dúvidas, “o cara”!!!

À amiga Priscila Frazão pela força e palavras de consolo quando tudo parecia

piorar ainda mais. Era porque você me entendia muito bem né Pri!? E ao mais

novo amigo (quem diria... rsrs) Alex Balduino, que teve uma participação

significativa (p < 0,05) nessa reta final.

Ao profº Drº Januário Lima pelas sílicas instiladas, BALs colhidos e etc. Pela

força e palavras de incentivo durante esses anos. Valeu Janúúúú!!!!!!

Ao profº Drº Leandro Miranda Alves que precisava se paramentar todo para

manipular os meus camundongos e transplantar as minhas células “na veia da

cauda” dos animais. Pela disponibilidade, sempre que solicitado, para ajudar,

dar opniões e conselhos, assim como para ensinar e passar sua experiência de

laboratório. Valeu pacotão!!!

Ao Profº Felipe Leite, a quem devo muito desse trabalho e a quem tenho como

referência de jovem pesquisador. Agradeço imensamente pela ajuda sempre

muito prestativa e solidária, seja na realização de experimentos ou em

esclarecimentos referentes às minhas dificuldades na compreesão de

determinados temas de biologia molecular, imunologia, etc.

Aos alunos de outros laboratórios, Èlen (bioquímica), Eliene (tec. Conjuntivo -

HU), Léo HP (prol. e dif. celular), Fabrício (biofísica), que mesmo em meio aos

seus compromissos, disponibilizaram-se a ajudar quando foi necessário.

Aos técnicos do biotério, Roberto e Silvio, que apesar de serem a prova viva da

existência da teoria da relatividade, contribuíram com realização desse

trabalho.

ix

Aos companheiros de laboratório Luis e Silvânia, que estiveram sempre

torcendo por mim diante das dificuldades e que também compartilharam

momentos de descontração com muitas risadas. Na maioria das vezes

proporcionadas por mim mesmo!! Não esquecendo da Vivian que também

contribuiu bastante nas ajudas em imunos das mais variadas possíveis sempre

que eu solicitava sua ajuda. Muito obrigado Vivi!!

Ao Profª. Drª. Luiz Eurico Nasciutti pela ajuda de grande valia para a

finalização do trabalho, desde a defesa de projeto (já tardia), passando pela

revisão da dissertação (em cima da hora), até a banca de defesa. Demonstrou-

se sempre solícito e compreensivo com minhas dificuldades de tempo.

À “meninas” do departamento, Tânia, Graça, Ednia e Goreth, pela força e

incentivo. Obrigado meninas!!

Agradeço aos amigos e colegas de trabalho da UNISUAM - unidade Campo

Grande, pela força e compreensão nos momentos de ausência, por vezes

necessária para maior dedicação no laboratório. Seria impossível concluir essa

dissertação se não fosse o companheirismo de todos.

Agradeço especialmente aos grandes amigos Manoel Gueddes, José Cláudio

(Morgan Freeman) e Suely Mota pela amizade sincera, pelos papos e boas

(muitas!!) risadas, garantidas quando estamos juntos!! Foram responsáveis

pela maioria dos poucos momentos de descontração que tive ao longo dos

últimos meses. Adoro vocês porque são doidos assim como eu!! rs Obrigado

por tudo!!

Aos professores Daniel e Arapuan Motta, representando a UNISUAM, casa

que hoje, com orgulho, faço parte e dedico meus dias para contribuir

positivamente para o sucesso de todos nós. À eles, agradeço não só a

x

oportunidade e confiança, mas também a amizade que vem se afirmando a

cada dia. Valeu!!!!!!!

Enfim, agradeço a minha namorada Érika, por toda a ajuda e dedicação

durante os últimos meses. Agradeço pelas estatísticas, pelas planilhas no

Excel, pelas correções textuais, pelas sugestões, conselhos, por tudo. Foram

muito importantes para mim, assim como era importante perceber sua

preocupação para que tudo desse certo. Mas agradeço principalmente por ter

superado (seja lá como for... rs) esse período de privações o qual precisei me

submeter comprometendo meu (nosso) dia-a-dia.

Bom, gostaria de terminar oferecendo o resultado desse trabalho a uma

pessoa que não está mais entre nós, mas que se estivesse por aqui teria

torcido por mim, teria sofrido comigo e agora estaria vibrando também junto

comigo. Porque sempre foi assim, sempre dividimos as alegrias e

compartlhamos as tristezas, às vezes um pouco mais de longe, mas sempre

com muita sinceridade na amizade que houve (HÀ!!!!) entre nós, independente

de tempo e distância. Nobrux queria muito que estivesse aqui meu irmãozinho

e por isso estou um pouco triste, mas te conheço e sei que deve estar brigando

comigo por causa disso. Sei que está feliz por eu ter conseguido. Por isso,

hoje, emocionado, como sempre quando me dirijo a você, ofereço essa vitória

a nossa amizade. Um abraço cheio de saudade do teu amigo...

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RESUMO

Silicose é uma desordem crônica do parênquima pulmonar causada pela inalação prolongada de sílica, levando a uma inflamação crônica e fibrose. Tem sido demonstrado que células derivadas da medula óssea podem migrar para o pulmão e participar do reparo do tecido pulmonar, possibilitando novas formas de intervenções nas desordens pulmonares que cursam com dano da função respiratória. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do transplante de células mononucleares derivadas da medula óssea (BMMC) no reparo do parênquima pulmonar no modelo de silicose murina. Camundongos C57 / BL 6 receberam instilação intratraqueal de sílica em dose única ou salina e após 40 dias foram sacrificados ou tratados com as BMMC e sacrificados após 30 dias. Como grupos controle, camundongos foram instilados com sílica ou salina estéril, sendo sacrificados após 70 dias e animais normais foram tratados ou não com BMMC e sacrificados após 30 dias. O lavado broncoalveolar (BAL) foi recolhido para análise da celularidade e fragmentos do pulmão foram fixados e processados para estudo histológico, imunohistoquímico, histomorfométrico e bioquímico. Os macrófagos imunoreativos para F4/80, positivos para a lectina griffonia simplicifolia e a apoptose, evidenciada pela técnica do TUNEL, foram quantificados, assim como a expressão da proteína alfa actina de músculo liso (α-sma). A deposição de colágeno nos nódulos e septos alveolares foi quantificada através de cortes histológicos corados pelo picro-sirius. Os animais normais e submetidos à instilação de salina tratados ou não, não apresentaram alterações importantes da arquitetura pulmonar, enquanto os animais silicóticos cursaram com infiltrado inflamatório, lesão pulmonar intersticial e nódulos parenquimatosos. Não houve diferença significativa na contagem diferencial das células mononucleares e polimorfonucleares no BAL após o tratamento com BMMC, entretanto, a celularidade total aumentou. No tecido, verificou-se que os nódulos dos animais tratados eram maiores, exibindo maior número de células apoptóticas, porém sem modificação do número total de células. Os macrófagos foram positivos para a Griffonia no interior dos nódulos e fora deles, mas após o tratamento se mostravam diminuídos em quantidade. Raros macrófagos F4/80+ foram evidenciados no interior dos nódulos, enquanto nos septos alveolares se mostravam reativos, havendo aumento dessa população nos septos alveolares de animais tratados. Não houve diferença na quantidade de silica livre no interior dos nódulos após o tratamento com BMMC. Além disso, houve redução da deposição de colágeno nos animais tratados com BMMC de aproximadamente duas e três vezes nos nódulos e septos alveolares, respectivamente, porém sem modificação na expressão de α-sma. Não houve modificação da atividade da mieloperoxidase nos animais tratados, porém a atividade da LDH se mostrou

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maior. Nossos resultados parecem indicar que as BMMC são capazes de levar a atenuação da fibrose induzida pela instilação de sílica sem modificar a expressão de α-sma, assim como modular a expressão da griffonia simplicifolia no pulmão, o que sugere sua atuação na atenuação do processo de remodelamento induzido pela agressão das partículas se sílica no parênquima pulmonar.

xiii

ABSTRACT

Silicosis is a chronic interstitial lung disorder caused by prolonged inhalation of crystalline silica particles leading to a chonic inflammatory process and fibrosis. Many studies have been shown that bone marrow derived cells can home in to the lung and participate in pulmonary repair, enabling new types of interventions for pulmonary disorders that culminate in fibrosis and respiratory disfunction. The aim of the present study was evaluate the effects of mononuclear bone marrow derived cells (BMMC) transplant on lung tissue repair and remodeling in silicosis murine model. C57/BL 6 mice received a single dose of silica (20 mg/ 200 µL sterile saline) or saline (50µL) by intratracheal injection. After 40 days animals were killed or treated with BMMC and killed 30 days following the graft. In controls groups, mice received silica or sterile saline and were sacrificed after 70 days. In other group, normal animals were treated with BMMC or not and killed after 30 days. Bronchoalveolar lavage (BAL) was performed to evaluate lung inflammation (total and differential cell counts) and lung samples were fixed and processed for histological, immunohistochemical (F4/80 and α-smooth muscle actin - α-SMa antigens), histochemical (Griffonia simpliciflolia) studies and TUNEL assay. Collagen deposition both in granulomas and alveolar septa was assessed using picro-sirius technique. All quantitative/statistical analyses were done using Image Pro®4.0 and Prisma®, respectively. The normal and saline animals treated or not did not present significant changes in pulmonary structure, while silicotic ones developed inflammatory infiltrate, interstitial lung injury and parenchymatous nodules. There were not significant differences on mononuclear and polymorfonuclear cells differential counts after BMMC transplant (p>0,05), although, total count was increased (p<0,05). Treated animals showed nodules which were greater than controls and exhibited a increased number of apoptotic cells inside nodules (p<0.05). Seventy days silica animals (SIL 70) showed a great number of Griffonia lectin+ macrophages both inside and outside nodules, but their numbers were diminished after BMMC graft (p<0.05). F4/80+ cells were rare into the nodules, but their numbers increased inside alveolar septae of BMMC treated animals (p<0,05). Silica free particles inside granulomas did not change after BMMC graft (p>0.05). In addition, collagen content decreases about two times into the nodules and three times on alveolar septa after BMMC graft (p<0.05), without α-SMa expression alteration (p>0.05). The myeloperoxidase activity assay showed no difference (p>0.05), but the LDH measurement was increased in SIL+BMMC group (p<0.05). Our findings suggest that treatment with BMMC attenuates silica induced fibrosis without modification of α-SMa expression pattern. BMMC

xiv

transplant also modulates Griffonia lung expression, suggesting their participation on attenuation of silica induced lung remodeling.

xv

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS........................................................................................vi RESUMO..........................................................................................................xi ABSTRACT......................................................................................................xiii SUMÁRIO........................................................................................................xv LISTA DE ILUSTRAÇÕES E DE TABELAS....................................................xvii LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS...........................................................xix INTRODUÇÃO.................................................................................................01 REVISÃO DA LITERATURA

1.A PARTICULA DE SÍLICA.......................................................................04 2. A SILICOSE............................................................................................05 2.1. Macrófagos Alveolares.........................................................................07 2.2. Participação de outros tipos celulares na silicose................................12 2.3. Inflamação versus Silicose...................................................................15 2.4. Lesão Induzida por ROS......................................................................17 2.5. Lesão e proliferação das celulas epiteliais alveolares e apoptose...................................................................................................19 3. CÉLULAS – TRONCO.............................................................................21 3.1. Células - tronco embrionárias...............................................................23 3.2. Células - tronco adultas........................................................................23 3.3. Células - Tronco Adultas da Medula Óssea.........................................26 3.4. Mobilização das Células Derivadas da Medula Óssea........................33 4. APLICAÇÕES..........................................................................................37 5. CÉLULAS - TRONCO PULMONARES...................................................39 5.1. Reparo do tecido pulmonar..................................................................43 5.2.Utilização terapêutica das células - tronco no tecido pulmonar.....................................................................................................44

OBJETIVOS GERAIS......................................................................................47 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................47 MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................49

1. ANIMAIS E PROTOCOLO EXPERIMENTAL..........................................49 1.1. Indução da silicose...............................................................................49

1.2. Procedimento cirúrgico.........................................................................49 1.3. Protocolo Experimental.........................................................................49 2. OBTENÇÃO E TRANSPLANTE DE CÉLULAS MONONUCLEARES DERIVADAS DE MEDULA ÓSSEA.............................................................51 3. LAVADO BRONCOALVEOLAR (BAL) E CITOCENTRIFUGADO...........52 4. PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO......................................................53 5. ANÁLISE HISTOLÓGICA........................................................................54

5.1. Histopatologia.......................................................................................54

xvi

5.2. Detecção e quantificação dos macrófagos pulmonares através da marcação de radicais carboidráticos............................................................55 5.3. Detecção e quantificação dos macrófagos pulmonares através de imunomarcação para a glicoproteína F4/80.................................................56 5.4. Imunodetecção para a protína actina alfa de músculo liso...................58 5.5. Detecção e quantificação das células apoptóticas................................59 5.6. Histoquímica para detecção de fibras colágenas e quantificação do conteúdo de colágeno..................................................................................60 5.7. Visualização e quantificação da sílica livre nos nódulos silicóticos......61 5.8. Quantificação da celularidade no interior dos nódulos silicóticos........61 6. ANÁLISE MORFOMÉTRICA E ESTEREOLÓGICA DOS NÓDULOS SILICÓTICOS..............................................................................................62 6.1. Morfometria para obtenção do perimetro dos nódulos silicóticos.........62 6.2. Estereologia para obtenção da densidade volumétrica dos nódulos silicóticos......................................................................................................62 7. DETECÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA MIELOPEROXIDASE (MPO) NO OMOGENATO ULMONAR....................................................................63 8. ENSAIO BIOQUÍMICO PARA ANÁLISE DA ATIVIDADE DA ENZIMA LACTATO DESIDROGENASE (LDH).........................................................64 9.ANÁLISEESTATÍSTICA...........................................................................65

RESULTADOS..................................................................................................66 1.ANÁLISE DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (BAL)...............................66 2.ANÁLISE MORFOLÓGICA.......................................................................68 3. ANÁLISE MORFOMÉTRICA E ESTEREOLOGICA DOS NÓDULOS SILICÓTICOS...............................................................................................79 3.1. Morfometria para obtenção do perimetro dos nódulos silicóticos.........79 3.2. Estereologia para obtenção da densidade volumétrica dos nódulos.........................................................................................................81 4. QUANTIFICAÇÃO DA CELULARIDADE NO INTERIOR DOS NÓDULOS...................................................................................................82 5. DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS MACRÓFAGOS PULMONARES 5.1. Lectina Bandeiracea Griffonia Simplicifolia...........................................83 5.2. Glicoproteína de superfície macrofágica F4/80.....................................86 6. QUANTIFICAÇÃO DA SÍLICA LIVRE......................................................88 7. IMUNODETECÇÃO PARA A PROTEÍNA ACTINA ALFA DE MÚSCULO LISO.............................................................................................................90 8.DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DAS CÉLULAS APOPTÓTICAS........92 9.DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA TRAMA COLAGÊNICA................94 10. ENSAIO BIOQUÍMICO PARA ANÁLISE DA ATIVIDADE DA ENZIMA LACTATO DESIDROGENASE (LDH).........................................................97 11. DETECÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA MIELOPEROXIDASE (MPO) NO HOMOGENATO PULMONAR..............................................................98

DISCUSSÃO...................................................................................................100 CONCLUSÕES...............................................................................................117 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................119

xvii

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1: Nódulos silicóticos...............................................................................06 FIGURA 2: Comunicação entre as celulas inflamatórias e suas interações com células epiteliais e fibroblastos...............................................................................14 FIGURA 3: Estresse oxidativo causado pela elevada produção de espécies reativas de oxigênio na silicose..............................................................................19 FIGURA 4: Características básicas das células-tronco..........................................22 FIGURA 5: Caracterização e localização de diferentes células tronco específicas de tecido.................................................................................................................25 FIGURA 6: Comprometimento das células tronco vs plasticidade das células-tronco......................................................................................................................26 FIGURA 7: Transdiferenciação das células tronco hematopoéticas......................28 FIGURA 8: Sub divisão do pulmão de camundongos em regiões proximal e distal e distribuição das células tronco pulmonares.........................................................41 FIGURA 9: Análise do lavado broncoalveolar. Contagem da celularidade total....67 FIGURA 10 – Contagem diferencial das células presentes no BAL......................68 FIGURA 11: Arquitetura pulmonar dos animais normais salina evidenciada pela coloração de hematoxilina e eeosina......................................................................69 FIGURA 12: Arquitetura pulmonar nos animais após 40 dias de silica evidenciada pela coloração de hematoxilina e eeosina.............................................................71 FIGURA 13: Detalhe do interior de um granuloma no pulmão de animais após 40 dias de sílica evidenciada pela coloração de hematoxilina e eosina............................................................ ..................................................... ..72 FIGURA 14: Arquitetura pulmonar nos animais após 70 dias de silica evidenciada pela coloração de hematoxilina e eeosina..............................................................74 FIGURA 15: Arquitetura pulmonar nos animais silicóticos que receberam as BMMC evidenciada pela coloração de hematoxilina e eeosina..............................76 FIGGURA 16: Fotomicrografia dos nódulos silicóticos dos animais tratados com BMMC e dos animais não tratados evidenciados pela coloração de hematoxilina e eeosina...................................................................................................................77 FIGURA 17: Detalhe do interior do granuloma no pulmão de animais após 70 dias de sílica e de animais que receberam o transplante com as BMMC evidenciado pela coloração de hematoxilina e eosina................................................................78 FIGURA 18: Representação gráfica da quantidade de nódulos silicóticos grandes e pequenos nos três grupos analisados.................................................................80 FIGURA 19: Representação gráfica da histomorfometria da área dos nódulos silicóticos em µm2...................................................................................................81 FIGURA 20: Representação gráfica da densidade volumétrica dos nódulos silicóticos.................................................................................................................82

xviii

FIGURA 21: Representação gráfica da celularidade no interior dos nódulos silicóticos.................................................................................................................83 FIGURA 22: Histoquímica dos macrófagos para detecção da lectina Griffonia e quantificação dessa população celular.................................................85 FIGURA 23: Histoquímica dos macrófagos para detecção da glicoproteína F4/80 e quantificação dessa população celular...................................................................87 FIGURA 24: Visualização da sílica livre com microscópio de polarlzação e quantificação da sílica............................................................................................89 FIGURA 25: Imunodetecção da proteína alfa actina de músculo liso (α-SMa) e representação gráfica da quantificação da proteína..............................................91 FIGURA 26: Detecção e quantificação das células apoptóticas...........................93 FIGURA 27: Detecção e quantificação do conteúdo de colágeno........................96 FIGURA 28: Atividade da enzima LDH..................................................................97 FIGURA 29: Atividade da enzima MPO.................................................................99

xix

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

µm Micrômetro mg Miligrama mL Mililitro AGM Região embrionária aorta, gônada, mesonefro AM Macrófago Alveolar (alveolar macrophage) BAL Lavado broncoalveolar (bronchoalveolar lavage) BALT Tecido linfóide associado aos brônquios BMMC Células mononucleares derivadas da medula óssea (boné

marrow derived mononuclear cells) BSA Soro de Albumina Bovina BSS CINC (Cytokine-Induced-Neutrophil-Chemoattractant) c-kit Receptor de Superfície de Progenitores Hematopoiéticos CSF Fator Estimulador de Colônias DAB Diaminobenzidina DMEM Dulbecco Modified Eagle Médium DNA Ácido Desoxiribonucléico DP Desvio padrão EPC células progenitoras endoteliais (endothelial progenitor cell) FACS Fluorescence Activated Cell Sorting Fc Porção da Imunoglobulina Responsável pela Ligação do

Anticorpo aos Receptores nas Células e ao Componente C1q do Complemento

GFP Protína verde fluorescente (green fluorescent protein) GM-CSF Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Macrófagos H2O2 Peróxido de Hidrogênio H2SO4 Ácido Sulfúrico HCl Ácido Clorídrico HE Hematoxilina e eosina HGF Fator de crescimento de hepatócitos HSC Célula tronco hematopoética (hematopoietic stem cell) IFN-γ Interferon gama Ig Imunoglobulina IL-1 Interleucina 1 IL- 4 Interleucina 4 IL- 10 Interleucina 10 IT Instilação intratraquel LDH Lactato desidrogenase LPS Lipopolisacarídeo

xx

LTB-4 Leucotrieno B-4 MAF Fator ativador de macrófago (macrophage - activating factor) MIF Fator inibidor de migração de macrófagos (macrophage –

migration – inhibition factor) MEC Matriz Extracelular MCP Proteína quimiotática de macrófago/monócito MIP Proteína Inibitória de Macrófago MMPs Metaloproteinases de Matriz MMP-2 Metaloproteinase de Matriz 2 MMP-9 Metaloproteinase de Matriz 9 MPO Mieloperoxidase MSC Célula tronco mesenquimal (mesenchymal stem cell) NO2 Óxido nítrico OPD o-fenileno dianisidina PBS Tampão Fosfato-Salina PGE Prostaglandina E RNAm Ácido Ribonucléico Mensageiro RNS Espécies reativas de nitrogênio ROS Espécies reativas de oxigênio SiO2 Sílica SMa Actina de músculo liso TGF- β Fator Transformador de Crescimento Beta TIMP-1 Inibidor Tecidual da Metaloproteinase de Matriz do tipo 1 TNF- α Fator de Necrose Tumoral Alfa

1

INTRODUÇÃO

Silicose é uma desordem fibrótica crônica do parênquima pulmonar,

causada pela inalação prolongada de partículas de sílica (Silicosis and Silicate

Disease Committee, 1988), caracterizando - se pelo acúmulo de células

mesenquimais, bem como pela grande produção de colágeno (Davis, 1986;

Zhang & Phan, 1996). A agressão se autoperpetua devido ao fato da sílica

persistir no espaço aéreo, ativando continuamente populações celulares

recrutadas mesmo após uma única administração desse agente (Dale et al,

2004).

A sílica (SiO2), principal componente da crosta terrestre, é

freqüentemente encontrada na poeira formada durante o processamento de

minerais ou materiais rochosos quando cortados, perfurados, triturados ou

escavados. (Harley & Vallyathan, 1996).

A silicose apresenta uma grande prevalência em profissionais de

fundição, pedreira e mineradoras, sendo talvez uma das doenças ocupacionais

de maior morbidade e mortalidade no mundo (Goldsmith, 1994). Os efeitos da

exposição à partícula de sílica, são conhecidos, provavelmente, desde os

tempos bíblicos, quando a mineração e a fundição de metais preciosos, a

produção de vidro e o corte de pedras, já produziam doenças relacionadas às

partículas de poeira nos pulmões. Durante o renascimento, essas doenças

ocorridas entre os mineradores e outros tipos de trabalhadores, estiveram

2

ligadas à origem e à fundamentação da medicina ocupacional e toxicologia

(Goldsmith, 1994).

Medidas de higiene industrial que controlam a concentração de

partículas de poeira carregadas pelo ar obtiveram sucesso na redução da

prevalência e gravidade da silicose em muitas indústrias, entretanto, a silicose

ainda permanece como um problema comum de saúde em todo o mundo.

Muitos casos, entretanto, ainda surgem na Europa e nos EUA, tornando

a silicose uma das principais ameaças aos trabalhadores de paises

desenvolvidos (NIOSH, 2002; INAIL, 2001). No Brasil, existem estudos sobre

os trabalhadores expostos à sílica mostrando uma tendência de aumento em

termos absolutos de 1.470 mil homens expostos, no período entre 1985 e

2001, para mais de 2 milhões de trabalhadores considerados definitivamente

expostos (Ribeiro, 2004)

Além disso, o estudo da silicose torna-se fundamental uma vez que

muitos casos estão relacionados com o aparecimento de outras doenças como

câncer pulmonar, falência renal e desordens do sistema imune (NIOSH, 2002).

As partículas de sílica alcançam o interior dos alvéolos pulmonares,

podendo então entrar em contato com macrófagos residentes que estão

intimamente associados ao epitélio alveolar (Brody et al, 1982). Acredita-se que

os macrófagos alveolares sejam as células-chave durante o processo inicial na

patogênese dessa doença, tornando-se ativados após fagocitar a sílica.

Produzem então, diversas citocinas e outros mediadores que podem aumentar

a lesão tecidual, promover o acúmulo de neutrófilos e linfócitos e estimular a

proliferação do fibroblasto com deposição de matriz extracelular alterada

(Davis, 1986; Davis & Gemsa, 1996)

3

Não há nenhuma terapia efetiva para reverter ou retardar o curso da

doença fibrótica (Schwartz, 1993). Entretanto, recentes estudos têm

demonstrado que células-tronco derivadas de medula óssea podem modular a

inflamação pulmonar e participar do processo de reparo do tecido pulmonar

(Ortiz et al2007; Shigemura et al, 2006; Ishizawa et al, 2004; Yamada et al,

2004; Ortiz et al, 2003; Krause et al, 2001) levantando a possibilidade de que

terapias celulares possam ser desenvolvidas para uma efetiva intervenção nas

doenças pulmonares.

Sendo assim, o objetivo deste trabalho é o de avaliar a participação das

células mononucleares derivadas da medula óssea no curso da doença

silicótica, bem como no processo de reparo do pulmão silicótico em

camundongos.

4

REVISÃO DA LITERATURA

1. A partícula de sílica

A partícula de sílica pertence a um grupo muito comum de minerais e

pode se apresentar na forma não cristalina (amorfa) ou na forma cristalina

(Ross et al, 1993). Embora a sílica amorfa seja biologicamente menos ativa

que a sílica cristalina, grandes quantidades desse material também podem

levar a lesão pulmonar. Sendo assim, a forma cristalina da sílica representa

maior importância na patogênese da silicose, revelando a importância da sua

forma e propriedades de superfície no desenvolvimento da doença (Robbins &

Cotran, 2006). Existem sete tipos de sílica cristalina conhecidos, onde o

QUARTZO é o mais comum deles.

A sílica (quartzo) é uma partícula compacta com uma razão

comprimento / diâmetro menor que 3:1. Sua geometria e dimensões

determinam sua deposição e a cinética do “clearance”, reatividade biológica e

dissolução no pulmão. Entretanto, suas propriedades químicas e de superfície,

incluindo: absorção, reações de oxidação / redução, bem como a sua carga,

também desempenham papéis importantes na biopersistência, respostas

celulares e patogênese (Veblen & Wylie. 1993; Hochella, 1993).

A superfície da partícula de sílica tem importância fundamental na

patogenicidade da silicose. As partículas recém-fraturadas são mais tóxicas

aos macrófagos alveolares do que partículas mais antigas (Vallyathan et al,

5

1988) provavelmente porque há um aumento do potencial redox, uma vez que

a superfície recém-fraturada é altamente reativa com Hidrogênio, Oxigênio,

Carbono e às vezes Nitrogênio (Hochella, 1993).

Outro fator importante é se a superfície da partícula encontra-se livre,

uma vez que existe uma tendência de outros minerais aderirem ou mesmo

interagirem quimicamente com a superfície da partícula de sílica. Tourmann e

Kaufmann (1994) mostraram que apenas 1 a 2% das partículas de quartzo

obtidas de pulmões de mineradores de carvão, apresentavam superfície livre

de outros componentes. Esse processo de “oclusão” da superfície da sílica

pode ser responsável pelos índices relativamente baixos de silicose

observados em trabalhadores com co-exposição à sílica e outras partículas.

A principal via para a entrada da sílica no organismo é a inalação. A

deposição dentro do trato respiratório é determinada pelo tamanho da partícula.

Partículas com diâmetro acima de 15µm ficam depositadas na porção externa

do nariz, partículas entre 10 e 15µm de diâmetro ficam depositadas nas fossas

nasais e faringe. Com o decréscimo do tamanho, as partículas podem penetrar

mais profundamente nos pulmões. As partículas entre 5 e 10µm alcançam as

vias aéreas superiores (traquéia e brônquios), enquanto partículas menores

que 5µm (0,5 - 5µm) de diâmetro alcançam bronquíolos terminais e alvéolos

(NIOSH 1993 ; Warheit et al, 1992).

2. A Silicose

As alterações patológicas conseqüentes à exposição da sílica estão bem

descritas em humanos (Ziskind et al, 1976) e em modelos animais (Allison et al,

1966; Burns et al, 1980). A deposição de partículas de sílica nos pulmões, tanto

6

de seres humanos como de animais experimentais, causa falência respiratória

devido à conseqüente reação fibrótica. A silicose se inicia com um processo

inflamatório destrutivo ao tecido, seguido de reparo tecidual, que leva a fibrose

(Mossman & Churg, 1998; Fujimura, 2000).

A lesão é caracterizada pela presença dos nódulos silicóticos (FIGURA

1). Estes são formados por agregados de linfócitos e macrófagos associados à

partícula de sílica, que se arranjam em torno de uma região central de

colágeno. Essas lesões nodulares apresentam aspectos que se assemelham

com granulomas, sugerindo que essa doença seja mediada por uma sub

população de linfócitos T CD4 de resposta Th-1 (Garside & Mowat. 1995;

Seder & Paul, 1994). Com o tempo, ocorre proliferação localizada e

progressiva de fibroblastos e deposição de grande quantidade de colágeno. O

colágeno central torna-se concêntrico e as células inflamatórias periféricas

diminuem (Mossman & Churg, 1998). Com a evolução da doença, os nódulos

coalescem e colapsam uns aos outros, destruindo progressivamente o tecido

pulmonar adjacente (Davis, 1986).

FIGURA 1- Esquema

mostrando a partícula

de sílica no interior dos

macrófagos e a

formação dos nóulos

Silicóticos (Retirado de

RRuubbiinn,, && FFaarrbbeerr,, 11999944))..

7

Macrófagos residentes nos espaços alveolares, além daqueles

recrutados para esta área, demonstram íntimo contato com a sílica durante a

sua deposição e também durante o período que a partícula permanece no

pulmão (Davis, 1986). Após a exposição, a sílica alcança inicialmente a

superfície alveolar e mais tarde aparecem preferencialmente nas bifurcações

dos ductos alveolares (Brody et al, 1982) aonde são fagocitadas por

macrófagos alveolares, que se tornam ativados e liberam mediadores

inflamatórios como os intermediários reativos de oxigênio, metabólitos do ácido

aracdônico, citocinas e quimiocinas (Mossman & Churg, 1998; Fujimura, 2000).

Embora a interação direta entre a sílica e os macrófagos alveolares seja

extremamente importante, muitos macrófagos não contêm a sílica no seu

interior sugerindo que haja um ciclo de amplificação da resposta, onde os

macrófagos com sílica produzem citocinas que atraem e ativam linfócitos e

então estes linfócitos produzem mediadores adicionais que atraem e ativam

uma população secundária de macrófagos (Brody et al, 1982).

2.1. Macrófagos Alveolares

Os macrófagos representam a população mais abundante do sistema de

fagócitos mononucleares e estão presentes em todos os órgãos e tecidos

(Rutherford, et al1993; Witsell & Schook, 1991). As células desse sistema têm

origem a partir de precursores comuns na medula ósseos, que migram para os

tecidos e órgãos periféricos, onde se diferenciam em células especializadas

(Rutherford, et al1993).

8

No pulmão, diferentes compartimentos abrigam duas populações

distintas de macrófagos, os macrófagos intersticiais, localizados no tecidos

conectivo e os macrófagos alveolares, localizados nos espaços aéreos (Brain,

1992; Lehnert, 1992), apresentando características funcionais e bioquímicas

diferentes (Fathi et al, 2001: Ferrari-Lacraz et al, 2001; Viksman et al, 2002).

No tecido pulmonar normal, os macrófagos alveolares são considerados

o estágio final do desenvolvimento dos monócitos sanguíneos, indicando que

os macrófagos intersticiais estão num estágio intermediário na maturação dos

macrófagos alveolares (Holt et al, 1982; Blas van Oud Alblas & Van Furth,

1982). Sendo assim, algumas evidências sugerem que o tecido pulmonar

proporciona um ambiente para a maturação dos monócitos sanguíneos antes

da sua chegada ao espaço alveolar (Holt et al, 1982). Entretanto, em função do

contato direto com os componentes da matriz extracelular, a liberação de

mediadores ou enzimas pelos macrófagos intersticiais tem efeitos biológicos e

patológicos maiores quando comparados com os macrófagos alveolares no

interior dos alvéolos (Debra et al; 2001).

Os macrófagos encontrados nos alvéolos estão localizados na interface

entre o ar e o tecido pulmonar, sendo, portanto, os únicos macrófagos do

organismo expostos ao ar. Por isso, representam a primeira linha de defesa

contra agentes inalados, microorganismos e toxinas (Nicod, 1999; Zhang, et

al2000 A e B). Eles possuem alto potencial fagocítico, representando mais de

90% das células do lavado broncoalveolar (BAL) no indivíduo normal

(Reynolds,1987; Daniele et al, 1977).

Os macrófagos possuem ampla variedade de receptores de membrana,

através dos quais interagem com um grande número de moléculas (Sibille &

9

Reynolds, 1990; Fels & Cohn, 1986; Koren & Becker, 1992). Três grupos de

receptores desempenham importante papel durante a fagocitose: (a)

receptores Fc, que incluem três receptores (FcyRI, FcyRII e FcyRIII) para a

porção Fc da imunoglobulina (Ig) G (Anderson & Looney, 1986; Naegel, et al:

1984), além de receptores para IgE (Melewicz, et al; 1982) e IgA (Gauldie, et al;

1983); (b) receptores do sistema complemento (CR1, CR3 e CR4) (Myones,

et al; 1988; Wright, et al; 1983) e (c) receptores de lectinas (PNA, UEA-1,

BSL 1, SAI) (Meyer, et al; 1993).

A fagocitose nos macrófagos alveolares é diferente das que acontecem

nas outras partes do organismo, uma vez que, nos alvéolos, eles são expostos

a partículas que não desencadeiam resposta imunológica. Sendo assim, os

macrófagos alveolares realizam a fagocitose por um mecanismo denominado

“fagocitose independente de opsonina”, distinto dos demais, uma vez que

acontece na ausência do sangue.(Ralph & Joseph, 1986).

Na silicose, glicoproteínas de superfície denominadas receptores

scavenger (SR) classe A (SRA), desempenham papel importante no

reconhecimento e captura da sílica durante a fagocitose independente de

opsonina (Krieger, 1997).

Muitos trabalhos vêm apontando especialmente para dois SRAs

expressados pelos macrófagos alveolares: o SRA I/II e um receptor, descrito

mais recentemente, denominado MARCO (“macrophage receptor with

collagenous structure”). Animais deficientes para SR-AI/II e MARCO mostraram

uma maior resposta inflamatória a partículas inaladas e mostraram-se mais

suscetíveis à pneumonia bacteriana (Arredouani et al, 2004 e 2006), reforçando

10

o importante papel desses receptores na defesa pulmonar contra agentes

exógenos.

Existe, ainda, na superfície dos macrófagos, receptores para citocinas

que promovem sua ativação, como a INTERLEUCINA (IL) 1; o FATOR DE

NECROSE TUMORAL (TNF), podendo atuar de maneira autócrina, uma vez

que também é sintetizada por macrófagos e o INTERFERON - GAMA (IFN-γ),

principal citocina ativadora de macrófago (Lohmann-Matthes, et al; 1994).

Outros receptores são específicos para citocinas que promovem sua

desativação como IL-4 e IL-10 (Sone et al; 1992). O CSF-1 e GM-CSF (fator

estimulador de colônia para macrófagos e granulócitos) também interagem com

os macrófagos através de receptores de superfície celular (Kreipe et al;1990).

Outros marcadores de superfície presentes nos macrófagos pulmonares

estão associados a outras funções, como diferenciação e adesão. Dentre elas

as glicoproteínas de membrana da família das integrinas estão presentes e são

importantes para a migração dos macrófagos e para o contato célula-célula

(Albert, et al;1992; Montefort & Holgate, 1991; Striz, et al, 1992). A

glicoproteína F4/80 é considerada um dos mais específicos marcadores de

superfície em macrófagos de camundongos (Austyn & Gordon, 1981; Morris et

al, 1991). A sua expressão é regulada de acordo com o estado fisiológico da

célula. Além disso, sua expressão é menor nos precursores (monócitos

sanguíneos) em relação aos seus correspondentes maduros (Gordon et al,

1992). Ezekowitz e colaboradores (1981) mostraram que a expressão da

molécula F4/80 em macrófagos isolados de animais infectados com bacilo de

Calmette-Guérin, é menor do que em macrófagos de animais normais.

11

O recrutamento de macrófagos alveolares e intersticiais ocorre por dois

mecanismos: (1) atração quimiotática de monócitos sanguíneos e (2)

replicação local no tecido pulmonar.

Muitas evidências indicam que monócitos sanguíneos derivados da

medula óssea migram para os alvéolos em condições normais e durante a

inflamação (Godleski & Brain, 1972; Blusse & van Furth, 1979; Thomas et al,

1976; Blusse et al, 1983). Foi verificado tanto em modelos animais quanto em

humanos que macrófagos provenientes de transplante de medula óssea foram

capazes de restabelecer a população dos alvéolos no pulmão que recebeu o

transplante.

Evidências da replicação in situ são suportadas por experimentos

utilizando modelos de inflamação com carbono em camundongos

leucopênicos. Após a instilação do carbono os animais não responderam com

um influxo precoce de monócitos, mas sim com proliferação local, levando a

um aumento nessa população celular (Evans et al; 1986, Shami et al, 1986).

Estudos com macrófagos alveolares em cultura estimulados com fator

estimulador de colônia (CSF) evidenciaram proliferação da população

macrofágica (Chen et al, 1988; Golde et al, 1974).

Adamson e Bowden (1980) demonstraram, também através da

administração de carbono em camundongos, que há uma resposta bifásica

durante a inflamação pulmonar, com precoce influxo de monócitos e

proliferação dos macrófagos em períodos mais tardios, comprovando desta

forma que o aumento no número de macrófagos alveolares, principalmente

durante a inflamação, decorre tanto do recrutamento de monócitos sanguíneos,

quanto da proliferação local dessas células.

12

.A resposta inflamatória às partículas inaladas na região dos alvéolos

pulmonares pode ser prejudicial às trocas gasosas podendo levar também a

lesão do parênquima pulmonar. Partículas grandes (diâmetro >10µm) são

removidas pelas defesas de vias aéreas superiores, enquanto partículas

menores (entre 2 e 10µm de diâmetro) são depositadas na superfície dos

alvéolos (Riley, 1959), caracterizando, portanto, a grande importância da

presença dessas células nos espaços alveolares.

2.2. Participação de outros tipos celulares na silicose

Embora os macrófagos alveolares sejam considerados as células-chave

na patogênese da silicose, outros tipos celulares do sistema imune, como os

neutrófilos (Quinlan et al, 1995; Velan et al, 1993) e os linfócitos T (Davis et al,

1993; Veblen & Wylie. 1993), encontrados no lavado bronco-alveolar e/ou no

interstício pulmonar, também estão envolvidos no desenvolvimento da fibrose.

Diversas interações entre essas células efetoras e suas células alvo, incluindo

células epiteliais alveolares e bronquiolares e fibroblastos, podem direcionar a

patogênese e a progressão da doença.

Os linfócitos apresentam estreita proximidade com os macrófagos no

desenvolvimento dos nódulos silicóticos. Estão presentes no tecido pulmonar,

no BALT (bronchial-associated lymphoid tissue) (Davis et al, 1993) e no lavado

bronco-alveolar, onde se encontram aumentados em modelos animais e em

humanos (Callis et al, 1985; Christman et al, 1985). Os macrófagos modulam e

ativam os linfócitos, que por sua vez amplificam a resposta estimulando esses

macrófagos (Nathan et al, 1980; Unanue, 1980). A população mais expressiva

13

na silicose são os linfócitos T CD 4+ (Struhar et al, 1989 (A); Sjostrand et al,

1991; Kumar, 1989).

A interleucina IL-1, produzida por macrófagos, estimula os linfócitos T

CD 4 a secretarem IL-2, induzindo a proliferação de uma população ativada de

linfócitos T CD 4. Essa população pode secretar vários mediadores que alteram

substancialmente as funções dos macrófagos, como: MAF (macrophage -

activating factor), MIF (macrophage – migration – inhibition factor) e INF-γ

(interferon gamma) (Davis, 1986). A produção de INF-γ está aumentada nos

pulmões silicóticos (Davis et al, 2000). Esta citocina é reconhecida como a

mais importante na ativação de macrófagos característica da silicose (Piguet et

al, 1990; Struhar & Harbeck, 1989B). Além disso, aumentam a produção e os

efeitos do TNF-α e de outras citocinas derivadas de macrófagos, que

estimulam a proliferação de fibroblastos e síntese de colágeno (Young, 1996;

Billiau, 1996)

Outra célula importante na silicose são os neutrófilos e, embora

apareçam em pouca quantidade circundando os nódulos silicóticos, são

comuns no interstício pulmonar e no lavado bronco-alveolar em modelos

animais de silicose (Callis et al, 1985; Davis et al, 1981; Reiser et al, 1983),

aparecendo imediatamente após a lesão. O recrutamento de neutrófilos para

os pulmões durante a silicose, ocorre pela liberação de substâncias

quimiotáticas liberadas pelos macrófagos (MIP e CINC, por exemplo), bem

como pela secreção de LTB-4 (leucotrieno B-4) (Martin et al, 1984; Merrill et al,

1980; Reynolds, 1983).

Os neutrófilos são importantes na patogênese da silicose pela sua

potente habilidade em causar lesão tecidual no pulmão, uma vez que seus

14

produtos de secreção (colagenase e elastase, por exemplo) degradam

especificamente os componentes da matriz extracelular. Além disso, os

neutrófilos podem gerar espécies reativas de oxigênio, levando a lesão celular

e tecidual (Snider, 1983). Trabalhos anteriores mostraram que uma breve

exposição à sílica induziu a um continuado influxo de neutrófilos e um

sustentado aumento da inflamação e citotoxidade (Warheit et al, 1991).

A FIGURA 2 a baixo esquematiza a inter-relação entre as principais

células envolvidas na patogênese da silicose.

FIGURA 2. Comunicação entre os diversos tipos celulares envolvidos na inflamação e suas interações com células epiteliais e fibroblastos após a exposição à partículas minerais (Retirado de Mossman e Churg, 1998).

2.3. Inflamação versus Silicose

A fibrose pulmonar está freqüentemente associada a um processo

inflamatório, que precede ou coexiste com a proliferação de fibroblastos e

deposição de proteínas de matriz extracelular (Gross & Hunninghake, 2001),

AM- macrófago alveolar IM- macrófago intersticial F- fibroblasto ROS- espécies reativas de oxigênio RNS- espécies reativas de nitrogênio TNF- fator de necrose tumoral IL-1- interleucina-1 MIP- proteína inflamatória do

15

sendo a inflamação, portanto, a principal responsável pelo desenvolvimento da

fibrose pulmonar.

A inflamação persistente, caracterizada por um acúmulo de macrófagos,

neutrófilos e linfócitos, causa a liberação de oxidantes e enzimas degradativas

capazes de induzir a injúria pulmonar e lesão no DNA (Atzori et al, 2004;

Pardo et al, 2003). As células inflamatórias pulmonares também produzem

fatores (Vanhee et al, 1994), citocinas (Rom, 1991) e quimiocinas (Driscoll et al,

1993) que amplificam e mantém a alveolite e os fibroblastos ativados.

Alguns desses mediadores, como citocinas e fatores de crescimento pró

- inflamatórios produzidos em excesso (TNF-α, IL-1 e TGF-β por exemplo),

podem estimular a atividade de fibroblastos na fibrose pulmonar (Zhang et al,

1993; Piguet et al, 1990).

O TGF (Transforming Growth Factor) -β, um dos produtos de secreção

dos macrófagos, é uma citocina pró-fibrótica e encontra-se aumentado em

granulomas silicóticos (Williams et al, 1993; Jagirdar et al, 1996; Mariani et al,

1996) Alem de apresentar atividade quimiotática para monócitos e neutrófilos, a

secreção de TGF-β pelos macrófagos pode estimular a expressão de genes de

proteínas da matriz extracelular (como colágeno e fibronectina) pelos

fibroblastos (Broekelmann et al, 1991), participando de maneira importante da

fibrogênese na silicose.

TNF-α (Tumor Necrosis Factor alfa) e IL (interleucin) -1 são mediadores

importantes da inflamação e também estão presentes em muitos modelos

experimentais de fibrose pulmonar. Davis e colaboradores (1998A)

demonstraram que o aumento na produção de TNF- α e IL-1 ocorre no interior

das lesões silicóticas e no BALT. Esses mediadores parecem ter uma

16

participação principalmente no início da doença, uma vez que estão

precocemente aumentados em modelos de silicose, precedendo a inflamação e

a fibrose (Driscoll et al, 1995). Além disso, macrófagos alveolares apresentam

aumento da expressão do RNAm e liberação de TNF- α e IL-1, aspecto

demonstrado em pacientes com asbestose e fibrose pulmonar idiopática e

ambas as citocinas induzem o aumento na expressão de colágeno e

fibronectina (Zhang et al, 1993).

IL-1 participa da inflamação pulmonar estimulando a produção de

citocinas e a expressão de moléculas de adesão (Driscoll, 1996B). Trabalhos

recentes indicam que o número e o tamanho dos granulomas induzidos pela

sílica estão muito diminuídos em animais knockout para IL-1 (Srivastava et al,

2002).

A exposição a vários tipos de partículas induz a produção de TNF- α em

pulmões de ratos (Driscoll, 1994B) e o TNF-α, por sua vez, estimula a

expressão de MIP-2 (Macrophage inflammatory protein 2) e CINC (Cytokine-

Induced-Neutrophil-Chemoattractant) (Driscoll, 1993 e 1994A), que fazem parte

da família de citocinas inflamatórias e imunomoduladoras com potente

atividade quimiotática para neutrófilos, sendo, portanto, mediadores

importantes do recrutamento de células inflamatórias na resposta a lesão

tecidual. Piguet e colaboradores (1993 e 1994) mostraram que a neutralização

de TNF e de IL-1 após indução de fibrose pulmonar pela sílica, previne ou

melhora a silicose experimental

Entretanto, apesar do importante papel da inflamação na fibrogênese,

algumas evidencias sugerem que a inflamação não está necessariamente

17

relacionada à resposta fibrótica e que vias patogênicas adicionais podem ser

responsáveis pelo desenvolvimento da resposta fibrótica no pulmão.

Alguns trabalhos mostram que a inflamação no pulmão não é sempre

seguida de doença fibrótica (Adamson et al, 1992; Huaux et al, 1998; Munger

et al, 1999) e outros, que o controle da inflamação não está sempre associado

com a redução da fibrose (Tanino et al, 2002; Sakamoto et al, 2002).

A participação da IL-10 na patogênese da silicose possivelmente

confirma essas hipóteses. Apesar de apresentar uma ação anti - inflamatória

(Standiford et al, 1995 e 1996; Greenberger et al, 1995), essa interleucina

parece participar de um expressivo aumento da fibrose nessa doença (Barbarin

et al, 2005) Além disso, estudos anteriores realizados com animais IL-10 -/-

mostram uma redução na fibrose induzida pela sílica (Huaux et al, 1998),

sugerindo uma ação pró-fibrótica, possivelmente pela sua habilidade em causar

um “upregulation” na expressão de TGF-α em macrófagos alveolares, bem

como um “downregulation” na produção de PGE2 em macrófagos e fibroblastos

(Barbarin et al, 2004).

2.4. Lesão Induzida por ROS

O desenvolvimento de lesão celular, proliferação, apoptose e

fibrogênese, parecem estar relacionadas a uma severa e persistente resposta

inflamatória, observada em muitos modelos animais. A participação de ROS

(reactive oxygen species) nesses eventos tem sido intensamente estudada.

A partícula de sílica pode levar a formação espontânea de ROS em

solução aquosa (Vallyathan et al, 1988) ou após ter sido fagocitada. O

18

processo ocorre quando reações envolvendo peróxido de hidrogênio e

superóxido resultam na formação do potente radical hidroxil (Schapira et al,

1995). Outra via para formação ROS pela sílica ocorre através do “burst”

oxidativo, quando a partícula é fagocitada pelos macrófagos alveolares ou por

outros tipos celulares, como células epiteliais alveolares e fibroblastos (Churg,

1996)

Além disso, determinadas partículas mais fibrogênicas causam uma fagocitose

ineficaz e um aumento mais prolongado na liberação de ROS (Mossman et al,

1989; Hansen & Mossman, 1987).

Como resultado do recrutamento e ativação de macrófagos alveolares e

leucócitos polimorfonucleares, a elevada produção de ROS pode levar a lesão

oxidativa do parênquima pulmonar. Em resposta a este estresse oxidativo e

lesão tecidual, macrófagos alveolares e células epiteliais alveolares podem ser

estimuladas a produzirem fatores de crescimento e mediadores fibrogênicos,

resultando em ativação de fibroblastos e fibrose pulmonar (Vallyathan et al,

1998; Castranova & Vallyathan, 2000; Fubini & Hubbard, 2003)

Embora as espécies reativas de oxigênio sejam classicamente

consideradas como causadores de lesão em diversos tipos celulares, os efeitos

dos oxidantes são complexos, induzindo a fagocitose de variados tipos de

partículas (Churg, 1996), induzindo a peroxidação lipídica (Guo et al, 1995;

Petruska, et al, 1990), estimulação da cascata de sinalização celular e da

transcrição de fatores (Janssen et al, 1995, Zanella et al, 1996; Jimenez et al,

1997), alem de induzir a liberação de inúmeras citocinas. Um esquema

resumido dos efeitos relacionados ao estresse oxidativo pode ser visto na

FIGURA 3

19

FIGURA 3- A silicose resulta de um ciclo envolvendo lesão celular, produção de oxidantes, inflamação e fibrose. A elevada produção de espécies reativas de oxigênio aparece como resultado do recrutamento e ativação de macrófagos alveolares e neutrófilos, levando ao chamado ESTRESSE OXIDATIVO e causando lesão no parênquima pulmonar. (Retirado de Castranova, 2004). 2.5. Lesão e proliferação das celulas epiteliais alveolares e apoptose

Lesão tecidual e anormalidade do epitélio respiratório estão presentes

na silicose. A resposta que leva a essas alterações é chamada de

“silicoproteinose” (Buechner & Ansari, 1969) devido a sua semelhança

histológica com a proteinose alveolar. Os espaços aéreos são preenchidos por

exsudato, lipoproteínas e lipídeos semelhantes a surfactante, células

inflamatórias e muitas células epiteliais alveolares do tipo II. Essas alterações

sugerem que durante a lesão silicótica ocorre injúria do epitélio respiratório,

exsudação de proteínas do soro, resposta inflamatória e reparo com hiperplasia

das células do tipo II. (Davis, 1986).

A lesão das células epiteliais alveolares do tipo I aparece como um

evento precoce na silicose e é acompanhada de subseqüente hiperplasia e

hipertrofia das células epiteliais alveolares do tipo II (Lesur et al, 1995).

20

Portanto, o aumento na proliferação das células epiteliais, observados em

roedores após inalação de partículas fibrogênicas (BeruBe et al, 1996; Dixon et

al, 1995; Donaldson et al, 1995), é crucial para o processo do reparo e

regeneração.

A proliferação parece ocorrer inicialmente nos sítios onde as partículas

inaladas se acumulam e, posteriormente, em sítios mais distantes, onde essas

partículas são translocadas com o tempo. Além disso, citocinas mitogênicas

podem mediar os eventos de sinalização que levam a replicação em regiões

mais remotas (Sekhon et al, 1995; Janssen et al, 1997). Sendo assim, a

proliferação de células epiteliais, bem como de fibroblastos, tem início após

ativação de genes intermediários que regulam a inflamação e proliferação

(Janssen et al, 1995; Angel & Karin, 1991).

A elevada expressão desses genes também está relacionada com o

desenvolvimento da apoptose, como demonstrado por Iyer e Hamilton (1996)

em macrófagos alveolares humanos após exposição à sílica. A apoptose das

células epiteliais no pulmão parece ser a principal via de remoção das células

epiteliais alveolares do tipo II em proliferação (Bardales et al, 1996).

Estudos recentes têm demonstrado que o engajamento do FasL pode

deflagrar tanto a apoptose celular, quanto uma inflamação aguda (Miwa et al,

1998; Tsutsui et al, 1999). Sendo assim, foi demonstrado que a apoptose

induzida pela sílica tem efeito pró-inflamatório, uma vez que a utilização de um

inibidor de caspase leva a diminuição no acúmulo de neutrófilos, bem como a

diminuição do conteúdo de colágeno (Borges et al, 2002), sugerindo uma

importante participação da apoptose na inflamação pulmonar.

21

Além disso, também foi demonstrado que camundongos gld (generalized

lymphoproliferative disease) deficientes para Fas ligante (FasL) expostos à

sílica não desenvolvem a doença e que os macrófagos pulmonares não entram

em apoptose em resposta a silicose (Borges et al, 2001). Entretanto, nos

animais selvagens, a exposição à sílica induziu a expressão de FasL em

macrófagos pulmonares. Os resultados indicam que na silicose a expressão de

FasL é induzida após a lesão causada pela sílica, resultando na apoptose dos

macrófagos (Borges et al, 2001). Portanto, sugere-se que a interação constante

dos macrófagos com as partículas de sílica induz a apoptose dos macrófagos

mediada por FasL.

3. Células - tronco

As células-tronco são definidas como células clonogênicas (que tem

capacidade de proliferação e formação de colônias) com potencial de auto -

renovação produção de células-tronco filhas com idêntico potencial) e

capacidade de se diferenciarem em múltiplas linhagens celulares (Weissman,

2000A). Estas células são capazes de manter, gerar e substituir células

terminalmente diferenciadas nos seus tecidos específicos como conseqüência

da renovação fisiológica de células ou de lesão tecidual devido a alguma

agressão (Slack, 2000). A FIGURA 4 sintetiza a atuação das células-tronco:

22

FIGURA 4- Características básicas das células-tronco. As células-tronco se auto-renovam indefinidamente e produzem células intermediárias que dão origem às linhagens terminalmente diferenciadas. Retirado de Griffiths, 2005.

Possivelmente, a expressão dos genes que conferem as características

de uma célula-tronco não está suficientemente elevada para ser detectada.

(Ramalho-Santos et al, 2002; Fortunel et al, 2003; Ivanova et al, 2002).

Entretanto, têm sido propostos alguns mecanismos moleculares importantes e

que estão envolvidos na manutenção das características das células-tronco

embrionárias e adultas presentes em células maduras. Sendo assim, Passegue

e colaboradores (2003) demonstraram que Hox gene, Notch, Sonic hedgehog,

e vias de sinalização do Wnt estão caracteristicamente ativos nas células-

tronco. Além disso, uma característica importante das células-tronco é a falta

do encurtamento telomérico e a apoptose. Células-tronco hematopoéticas

contém uma maior atividade da telomerase do que células cancerígenas

(Morrison & Weissman, 1994) e a proteína anti apoptótica BCL-2 se apresenta

aumentada nessas células (Jaiswal et al, 2003). A manutenção das populações

23

de células-tronco também é controlada pela sua localização e ambiente

químico (nicho), onde as células-tronco mantêm contato com a matriz, com

outras células e com citocinas e fatores de crescimento. (Watt & Hogan, 2000;

Fuchs at al. 2004).

3.1. Células - tronco embrionárias

Células - tronco embrionárias são células pluripotentes derivadas da

massa celular interna do blastocísto. Essas células diferenciam-se em todas as

linhagens celulares in vivo e em muitos tipos celulares in vitro (Jiang at al,

2002). Células - tronco embrionárias humanas foram isoladas pela primeira vez

em 1998 por Thomson e colaboradores (1998), enquanto as Células - tronco

embrionárias murinas foram isoladas pela primeira vez em 1981 por Evans e

Kaufman (1981).

3.2. Células - tronco adultas

Também existem células - tronco na maioria dos tecidos (Weissman,

2000 (B); Gage, 2000; Pittenger at al. 1999). Comparadas com as células -

tronco embrionárias, as células - tronco específicas dos tecidos possuem

menor capacidade de auto-renovação e, embora possam diferenciar-se em

múltiplas linhagens, não são pluripotentes.

Entretanto, a utilização terapêutica das células-tronco adultas elimina as

questões éticas envolvidas na utilização de células-tronco embrionárias, além

de apresentar, ainda, vantagens adicionais, como: evitar problemas com

24

rejeição imunológica, uma vez que são isoladas do próprio paciente em

tratamento e reduzir o risco de formação neoplásica, verificado em alta

freqüência quando animais adultos compatíveis recebem células embrionárias

(Smith, 2001; Martin, 1980).

Alguns órgãos como na pele, sangue e intestino, que estão em

constante auto-renovação durante a vida, contém células-tronco adultas que

são morfologicamente não-especializadas, possuem relativamente baixa

velocidade de divisão e estão topograficamente restritas a regiões

denominadas “nichos”, que regulam seu comportamento (Fuchs et al, 2004;

Lanza, 2006).

Muitas células-tronco adultas já estão caracterizadas e localizadas,

como demonstrado na FIGURA 5 a baixo:

25

FIGURA 5 – Diferentes tipos de células - tronco adultas e suas distribuições. (Retirado de Körbling, & Zeev Estrov. 2003).

Acreditava-se que as células - tronco específicas dos tecidos pudessem

se diferenciar apenas em células do seu tecido de origem, porém, dados

recentes sugerem que essas células podem se diferenciar em outras linhagens

CÉLULAS TRONCO

LOCALIZAÇÃO TECIDUAL

Células estromais derivadas de tecido adiposo Tecido adiposo subcutâneo

Células tronco hematpoiéticas

Medula óssea, sangue periférico e

células sanguíneas linfohematopoiéticas

Células tronco mesenquimais

(estromais)

Medula óssea, sangue periférico, osso, cartilagem, tendão, tecido

adiposo, músculo, estroma medular, células nervosas

Células tronco nervosas

Células ependimais, astrócitos (zona sub

ventricular) do sistema nervoso central, neurônios e oligodendrócitos

Células tronco hepáticas

Dentro ou próximo dos ductos biliares terminais (canais de Hering), células ovais que subsequentemente geram

hepatócitos e células ductais

Células tronco pancreáticas

Nas ilhotas de Langerhans, células

nestina-positivas, células ovais, células ductais e células Beta

Células tronco músculo –

esqueléticas

Fibras músculo - esqueléticas

Células tronco da pele (queratinócitos)

Camada Basal da epiderme, bulge

zone dos folículos capilares

Células tronco epiteliais do pulmão

Células mucosecretoras e células basais da traquéia, células de clara

bronquiolares, pneumócitos alveolares do tipo II

Células tronco do epitélio intestinal

Células Epiteliais localizadas ao redor da base de cada cripta, células de

Paneth, enterócitos, células caliciformes, células entero-endócrinas

das vilosidades

26

celulares além daquelas do seu tecido de origem (Krause at al. 2001; Gussoni

at al. 1999; Orlic at al. 2001; Asahara at al. 1999; Theise at al. 2000; Brazelton

at al, 2000), um processo denominado “PLASTICIDADE DE

DESENVOLVIMENTO” (ver FIGURA 6)

Comprometimento Plasticidade

FIGURA 6- Esquema mostrando o comprometimento com uma linhagem específica vs plasticidade das células-tronco. As células-tronco não são restritas a uma linhagem pré-determinada. Retirado de Griffiths et al, 2005.

3.3. Células - Tronco Adultas da Medula Óssea

A medula óssea pós-natal de mamíferos possui duas principais

populações de células troco / progenitoras, que fazem parte de linhagens

separadas e apresentam propriedades biológicas distintas: a) CÉLULAS -

TRONCO HEMATOPOÉTICAS (Weissman, 2000B) e b) CÉLULAS - TRONCO

ESTROMAIS. (Friedenstein et al, 1966; Bianco et al, 1998). A existência de

células - tronco de diversas linhagens e fenótipos celulares, incluindo o sistema

estromal da medula óssea, fazem da medula o único órgão conhecido no qual

dois tipos diferentes e separado de células - tronco e sistemas de tecidos

dependentes, não apenas coexistem, mas cooperam funcionalmente (Bianco et

al, 2001).

27

a) CÉLULAS - TRONCO HEMATOPOÉTICAS (HSC): células

multipotentes, com capacidade clonogênica e de auto–renovação, não-

comprometidas com nenhuma linhagem e que expressam, em camundongos,

marcadores específicos em sua superfície, tais como Sca-1 e c-kit (Morrison &

Weissman, 1994; Goodell, et al, 1996; Pearce et al, 2004).

As células - tronco hematopoéticas foram as primeiras células-tronco

caracterizadas e isoladas e as primeiras a serem utilizadas clinicamente. Elas

têm origem no saco vitelino e na região denominada de AGM (aorta, gonada,

mesonefro) durante o desenvolvimento embrionário (Cumano et al, 2001;

Baron, 2003). Entretanto, sua proliferação e diferenciação ocorrem nos órgãos

hematopoéticos (fígado fetal, medula óssea, timo e baço), os quais

proporcionam o microambiente necessário para a auto - renovação e

diferenciação em múltiplas linhagens celulares.

Tem sido mostrado, tanto em estudos com animais ou em humanos que

as células - tronco hematopoéticas são capazes de produzir muitos tipos

celulares, possivelmente por um processo de transdiferenciação direta (Herzog

et al, 2003).

Entretanto, permanece incerto o que determina o destino das HSC (auto-

renovação ou comprometimento com a diferenciação), ou ainda, o que controla

em quais tipos celulares as HSC ou os precursores hematopoéticos

multipotentes irão se desenvolver (Raff, 2003). (Ver FIGURA 7)

28

FIGURA 7- Esquema mostrando a possibilidade de transdiferenciação das células-tronco hematopoéticas gerando vários tipos celulares. Retirado de Griffiths et al, 2005.

b) CÉLULAS - TRONCO ESTROMAIS: as células estromais da medula

são estabelecidas na cavidade medular em desenvolvimento, depois da

formação do colar ósseo, mas antes do início da hematopoese (Bianco &

Gehron, 2000). Estas células podem dar origem a todos os principais tecidos

esqueléticos, como cartilagem, osso, tecido adiposo e tecido fibroso

(Friedenstein et al, 1966 e 1968; Owen & Friedenstein, 1988), além de

possuírem um papel fundamental na formação do microambiente

hematopoético (Owen & Friedenstein, 1988).

Na medula óssea, a hematopoese ocorre sobre a influência desse

microambiente, apropriado para a maturação, diferenciação e proliferação das

células hematopoéticas (Muguruma et al, 2006 e Tocci & Forte, 2003), e que

consiste nas células do estroma derivado de células pluripotentes não-

hematopoiéticas denominadas CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS (MSC)

(Gotherstrom et al, 2003; Bianco et al, 2001; Pittenger et al, 1999; Deans &

29

Moseley, 2000), descritas pela primeira vez em 1970 por Friedenstein e

colaboradores (Friedenstein et al, 1970).

Devine e colaboradores (2003) sugeriram que as MSC de primatas

direcionam-se para vários órgãos não-hematopoéticos, podendo apresentar

capacidade de proliferação no interior desses tecidos. Com isso, uma

distribuição sistêmica de MSC torna-se uma interessante estratégia não-

invasiva para administração de células com grande potencial para aplicações

clínicas (Bianco et al, 2001; Koc et al, 2002).

Trabalhos envolvendo pesquisas ortopédicas sugerem a existência de

células-tronco mesenquimais de medula óssea, que podem dar origem a

adipócitos, condrócitos, osteoblastos e estroma de suporte hematopoético

(Caplan, 1991; Prockop, 1997). Além disso, algumas evidencias também

mostram que essas células podem, quando induzidas, sofrer diferenciações

dando origem a células com características de mesoderma, neuroectoderma e

endoderma (Gregory et al, 2005; Bianco et al, 2001; Jiang et al, 2002).

Estudos in vitro e in vivo indicam a capacidade de diferenciação das

MSC em músculo (Wakitani et al, 1995), precursores neurais (Woodbury et al,

2000; Kopen et al, 1999), cardiomiócitos (Pittenger & Martin, 2004; Toma et al,

2002; Kawada et al, 2004) e outros tipos celulares (Pereira et al, 1998; Liechty

et al, 2000), caracterizando um alto grau de plasticidade dessas células.

Anjos-Afonso e colaboradores (2004) mostraram que, após infusão

sistêmica em animais irradiados de uma população enriquecida de MSC houve

a incorporação destas células em diversos tecidos. Os resultados desse

trabalho mostraram que elas foram capazes de formar hepatócitos, células

30

tubulares renais, células epiteliais bronquiolares, miofibras de tecido conectivo

e células miofibroblasto-símile.

A prevalência das células-tronco mesenquimais diminui com a idade. Na

medula de um recém-nascido, uma MSC pode ser encontrada em 10.000

células nucleadas da medula, enquanto na medula óssea adulta, essa relação

diminui drasticamente para uma MSC em 250.000 células nucleadas da

medula (Caplan, 1994).

Muitos estudos são realizados na tentativa de caracterizar um ou mais

marcadores específicos para identificação e classificação das células estromais

/ mesenquimais (Bruder & Caplan, 1989 (B); Simmons & Torok-Storb, 1991;

Haynesworth et al, 1992; Joyner et al, 1997). Alguns trabalhos mostram um

anticorpo monoclonal, o Stro-1, expressado por essas células (Grothos et al,

1994). Dennis e colaboradores (2002), apresentaram células derivadas de

diversas linhagens, inclusive estroma de suporte hematopoético, a partir de

células de medula positivas para Stro-1. Entretanto, existe uma parcela de

células hematopoéticas que também expressam baixos níveis desse marcador

(Grothos et al, 1994). Sendo assim, uma população “pura” de células-tronco

mesenquimais multipotentes, que possam ser isoladas da medula, permanece

indefinida.

Pelo fato de haver pouca matriz extracelular na medula, uma separação

mecânica suave é capaz de dissociar células do estroma e células

hematopoéticas. Quando essas células são plaqueadas em baixa densidade,

as células estromais de medula óssea aderem rapidamente e podem ser

facilmente separadas das células hematopoéticas não-aderentes através de

repetidas lavagens (Bianco et al, 2001).

31

Outros órgãos e tecidos adultos também podem ser uma fonte para as

MSC, incluindo a cavidade pleural, baço, timo, cavidade peritoneal, nódulos

linfáticos, tecido adiposo, músculo e encéfalo (Friedenstein et al, 1970; Metcalf,

1972; Jiang et al, 2002(A); Zuk et al, 2001; Aust et al, 2004). Alguns trabalhos

também obtiveram sucesso na obtenção de MSC a partir de sangue de cordão

umbilical (Tondreau et al, 2005; Campagnoli et al, 2002; Naruse et al, 2004).

Os resultados mostram que o sangue fetal no primeiro trimestre contém mais

MSC do que sangue fetal no segundo e terceiro trimestres (Campagnoli et al,

2001).

da Silva Meirelles e colaboradores (2006) mostraram que células com

características de MSC podem ser isoladas e propagadas in vitro a partir de

diferentes órgãos e tecidos (cérebro, baço, fígado, rim, pulmão, medula óssea,

músculo, timo e pâncreas) como resultado de suas localizações perivasculares.

Os autores sugerem que as MSC são um reservatório de células não-

diferenciadas para suprir as demandas celulares do tecido a que elas

pertencem, adquirindo características fenotípicas locais. Quando necessário

(durante a lesão tecidual, por exemplo), após os sinais provenientes do

microambiente, estas células originam progenitores comprometidos, que

gradualmente integram-se ao tecido (da Silva Meirelles et al, 2006). Os autores

não descartam a existência de células-tronco específicas dos tecidos, porém,

sugerem, ainda, que as MSC nos diferentes tecidos poderia se comportar como

estas.

MSC provenientes de outras fontes apresentam muitas características

em comum com as MSC derivadas da medula óssea, entretanto, algumas

diferenças entre elas podem ser observadas no que se refere aos fenótipos e

32

habilidade na proliferação e diferenciação (He et al, 2007; da Silva Meirelles et

al, 2006).

Sendo assim, até o presente momento, esses tecidos e órgãos

adicionais, ou o sangue periférico não podem servir como fonte segura para

MSC. A medula óssea é a fonte mais rica e mais segura dessas células (He et

al, 2007).

Além das células - tronco hematopoéticas e células - tronco estromais,

Asahara e colaboradores (1997) demonstraram a existência de CÉLULAS

PROGENITORAS ENDOTELIAIS (EPCs) derivadas da medula óssea, que

participam na formação de novos vasos após a lesão. Estudos iniciais

identificaram as EPCs pelo padrão de expressão de seus marcadores de

superfície (VEGFR2, AC133, CXCR4, CD34, c-Kit) e pela ausência de

marcadores de linhagens hematopoéticas mais comprometidas (lin-)

(Hirashima et al, 1999; Peichev et al, 2000). EPCs derivadas de humanos têm

sido isoladas de populações CD34+/lin- ou CD34+/VEGFR2+ sendo

administradas em camundongos e diferenciando-se em células endoteliais

associadas com veias que expressam o marcador endotelial PCAM (Platelet

endothelial cell adhesion molecule) ou o fator de von Willebrand (vWF) (Raffi &

Lyden, 2003).

Essas células são capazes de migrar da circulação periférica até os

sítios de neovascularização e se diferenciarem em células endoteliais in situ.

Esses achados são consistentes com o conceito de vasculogênese, um

mecanismo que, anteriormente, acreditava-se ser restrito ao desenvolvimento

dos vasos sanguíneos em embriões (Risau & Flamme, 1995). A habilidade das

EPCs em promover revascularização de tecidos lesados ou isquêmicos tem

33

sido adotada em ensaios com humanos para tratar isquemia (Young et al,

2002; Hristov et al, 2004; Dimmeler et al, 2005).

3.4. Mobilização das Células Derivadas da Medula Óssea

Durante a regeneração e o processo de reparo em diversos órgãos, a

lesão tecidual leva a um importante aumento na secreção de quimiocinas,

citocinas e enzimas proteolíticas, apresentando grande impacto no

repovoamento e migração das células tronco da medula óssea para a

circulação (Cottler-Fox et al, 2003). Além disso, células derivadas da medula

óssea, quando administradas terapeuticamente, podem migrar e fazer homing

nos sítios de crescimento tecidual e reparo, potencializando a regeneração

tecidual. Como exemplos desta migração e homing das células-tronco e

progenitoras temos lesões induzidas no coração em modelo de doença

isquêmica (Kucia et al, 2004 (A); Barbash et al; 2003), no cérebro (Jin et al,

2005) e no rim (Tögel et al, 2005).

O fator derivado de estroma (SDF) -1, também chamado CXCL12, é

uma quimiocina que exerce importante quimioatração sobre progenitores

hematopoéticos através de seu receptor específico CXCR4 (Aiuti et al, 1997;

Zou et al, 1998). Ao contrário da maior parte das quimiocinas, que são

seletivamente induzidas por determinados estímulos, o SDF-1 está expresso

na maioria dos órgãos, embora já esteja descrito que ocorra um aumento na

sua expressão após a agressão tecidual ou lesão do DNA (Pillarisette & Gupta,

2001; Ponomaryov et al, 2000). Quando células derivadas da medula óssea

são transplantadas, a interação SDF-1/CXCR4 é essencial para o homing

34

dessas células para a medula óssea (Peled et al, 1999), além de estar

envolvida no recrutamento de inúmeros tipos celulares (células mesenquimais

derivadas da medula óssea, progenitores hematopoéticos, células tronco

neurais e progenitores endoteliais) para os sítios de lesão, participando do

reparo do tecido lesado (Kollet et al, 2001; Imitola et al, 2004; Yamaguchi et al,

2003; Abbott et al, 2004)

Robert e colaboradores (2004) demonstraram que o receptor CXCR4 é

expresso na superfície de células derivadas do estroma de medula óssea

(MSCs) em cultura, porém que sua maior expressão é intracelular. Este estudo

mostrou que, apesar da baixa expressão de CXCR4 na superfície celular, a

presença de SDF-1 foi capaz de gerar significativa migração das células

estromais em todas as culturas. Hung e colaboradores (2007) mostraram

recentemente que o receptor CXCR4 está super expresso nas MSCs após sua

exposição à hipóxia, sugerindo que essa super expressão tenha potencializado

a migração das MSCs expostas à hipóxia em resposta à quimiocina SDF-1. Um

estudo onde células tronco multipotentes isoladas da pele (“dermal multipotent

cells” – DMCs) foram transplantadas em ratos irradiados com doses subletais,

mostrou um aumento na expressão de SDF-1 na medula óssea dos animais

irradiados e um aumento de três vezes na quantidade de DMCs na medula

óssea desses animais. Entretanto, quando as DMCs foram associadas a um

antagonista do receptor CXCR4 (AMD 3100) antes do transplante, o seu

recrutamento foi significativamente diminuído, sugerindo que a interação SDF-

1/CXCR4 participe do recrutamento das DMCs transplantadas para a medula

óssea irradiada (Zong et al, 2006).

35

Togel e colaboradores (2005) demonstraram que o SDF-1 está expresso

em rins normais e super expressos após indução da lesão isquêmica, levando

à falência renal aguda. Os autores mostraram uma inversão nos gradientes

normais de SDF-1 da medula óssea para o sangue periférico resultando na

mobilização de células CD34+ e também um recrutamento de células derivadas

da medula óssea expressando CXCR4 para o rim que sofreu lesão isquêmica.

Os resultados desse estudo sugerem que o tecido renal lesado pela isquemia

inicia o reparo através do recrutamento de células extrínsecas via aumento na

expressão de SDF-1, que leva à mobilização e homming de células CXCR4 /

CD34+. Resultados semelhantes também foram encontrados em animais

submetidos à instilação intratraqueal de bleomicina (Xu et al, 2007). Nesse

estudo, níveis elevados de SDF-1 foram encontrados no BAL e no sangue

circulante, acompanhado por aumento na expressão de CXCR4 no pulmão,

enquanto na medula óssea houve diminuição das células CXCR4+ com

aumento simultâneo nos níveis de SDF-1. Além disso, o estudo demonstrou,

através de ensaios in vitro e in vivo, que após administração de um antagonista

de CXCR4, houve um bloqueio no efeito quimiotático para células derivadas da

medula óssea. Em conjunto, os resultados desses autores apontam para a

importância do eixo SDF-1/CXCR4 no recrutamento de células derivadas da

medula óssea na lesão pulmonar.

No pulmão, a interação entre SDF-1 e seu receptor CXCR4 também está

associada ao extravasamento dos fibrócitos, que podem estar envolvidos na

fibrose pulmonar (Phillips et al, 2004). Os fibrócitos foram descritos por Bucala

e colaboradores (1994) como células circulantes que expressam CD34

(marcador de célula tronco hematopoética), CD45 (molécula de superfície

36

celular comum aos leucócitos) e colágeno tipo I. Apesar de expressarem CD45,

são morfologicamente diferentes dos leucócitos. Além disso, os fibrócitos

também expressam marcadores importantes de fibroblastos, como vimentina,

colágeno III e fibronectina.(Quan et al, 2004; Abe et al, 2001; Zong et al, 2006),

além das moléculas de adesão CD11b e CD18 .

Phillips e colaboradores (2004) identificaram a presença de fibrócitos

(células CD45+Col+CXCR4+) circulantes em camundongos e em humanos, que

migraram para o pulmão durante a fibrose pulmonar. No modelo de fibrose

pulmonar murina induzida pela bleomicina, esses autores demonstraram

grande deposição de matriz extracelular e um importante infiltrado de fibrócitos,

bem como a presença de SDF-1 no pulmão dos animais que receberam a

bleomicina. Quando o SDF-1 foi inibido observou-se uma redução na migração

de fibrócitos para o pulmão e uma diminuição da fibrose pulmonar.

Além do SDF-1, tem sido demonstrado que o fator de crescimento de

hepatócitos (HGF) também participa de maneira importante na mobilização de

células derivadas da medula óssea.

Esses dados em conjunto corroboram a hipótese de que a interação

SDF-1/CXCR4 desempenha importante papel na mobilização das células

derivadas da medula óssea tanto para a medula como para os sítios de lesão

tecidual após sua utilização terapêutica.

HGF é uma quimiocina que exerce conhecida regulação na proliferação

e diferenciação de células tronco / progenitoras hematopoéticas (Nishino et al,

1995), bem como na estimulação da angiogênese (Ding et al, 2003). A sua

atividade é mediada pela ligação com seu receptor c-met.

37

Ishizawa e colaboradores (2004) mostraram que o HGF induziu a

mobilização de células progenitoras endoteliais provenientes da medula óssea

para o pulmão de camundongos com lesão induzida pela elastase, favorecendo

a regeneração e a proliferação de células endoteliais (Son et al, 2006).

Neuss e colaboradores (2004), utilizando um modelo de reparação in

vitro, utilizando células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs),

demonstraram a produção de HGF e a expressão de c-met pelas hMSCs.

Quando analisado o efeito da quimioatração, foi verificado um aumento na

migração dessas células para o local da “lesão”, provocando o repovoamento

dessa área. Mais recentemente, Son e colaboradores (2006) também

identificaram, na superfície de células mesenquimais derivadas da medula

óssea, a presença do receptor c-met, que foi capaz de induzir a migração

dessas células em resposta ao HGF. Além disso, quando foi utilizado um

antagonista do receptor c-met (K-252a), houve uma significativa inibição da

migração.

Esses e outros resultados (Kucia et al, 2004; Ono et al, 1997) sugerem

que, assim como a interação SDF-1/CXCR4, a quimioatração induzida pelo

HGF pode direcionar células derivadas da medula óssea para regiões

localizadas nos sítios de lesão que contenham essa quimiocina.

4. Aplicações

Com o conhecimento adquirido acerca de células - tronco derivadas da

medula óssea, foi possível desenvolver protocolos variados utilizando

diferentes tipos de células - tronco em diferentes tecidos do organismo, tanto

em animais experimentais, como em humanos.

38

Estudos iniciais in vivo foram realizados utilizando células não

selecionadas derivadas de medula óssea. Após o transplante dessas células

em animais experimentais, evidenciou-se que as células formaram tecidos não

- linfohematopoiéticos, como fibras musculares (Ferrari et al, 1998), hepatócitos

(Petersen et al, 1999), microglia e astroglia (Eglitis & Mezey, 1997), bem como

tecido neural (Brazelton et al, 2000).

Bons resultados têm sido observados em Inúmeros ensaios clínicos e

experimentais utilizando células - tronco derivadas de medula óssea como

terapia para muitas doenças.

Ueki e colaboradores (1999) demonstram inibição da fibrinogênese e

apoptose bem como a resolução da fibrose hepática utilizando células - tronco

derivadas do sangue periférico em ratos com cirrose. Mezey e colaboradores

(2000) e Brazelton e colaboradores (2000) conseguiram gerar células

expressando marcadores neurais em camundongos com a utilização de células

de medula óssea. Otani e colaboradores (2002) e Grant e colaboradores

(2002), demonstraram experimentalmente uma melhora da angiogênese na

retinopatia isquêmica com a utilização de células - tronco hematopoiéticas

derivadas de medula óssea. Ainda em 2002, Gussoni e colaboradores

realizaram um ensaio clínico utilizando células de medula óssea em pacientes

com distrofia muscular de Duchenne, restituindo parcialmente a expressão de

distrofina no músculo afetado. Masuya e colaboradores (2003) utilizando

células - tronco hematopoiéticas, conseguiram gerar células mesangiais

glomerulares em doenças renais envolvendo tecido mesangial glomerular.

Perin e colaboradores (2003) e Tse e colaboradores (2003) utilizaram células -

tronco derivadas de medula óssea em pacientes com cardiopatia isquêmica e

39

mostraram uma significativa melhora na função e perfusão miocárdica. Em

2004, Soares e colaboradores mostraram diminuição de células inflamatórias e

possivelmente um remodelamento do tecido lesado, como conseqüência da

regeneração dos miócitos e reabsorção da fibrose intersticial em animais

infectados com T. Cruzi.

Mais recentemente, células derivadas da medula óssea foram

administradas por infusão intracoronariana em pacientes com doença cardíaca

isquêmica crônica mostrando uma melhora significativa na função ventricular

esquerda (Assmus et al, 2006).

Outros resultados também indicam melhoras dos sinais clínicos na

degeneração da estrutura dentária (Shi et al, 2005) e no acidente vascular

encefálico (Bang et al, 2005), além de apresentar uma importante remissão em

pacientes com doenças auto-imunes, como a artrite reumatóide refratária e

esclerose múltipla (Sykes & Nikolic, 2005). Nakamizo e colaboradores (2006)

mostraram evidências de que MSC humanas derivadas da medula óssea

migram para os gliomas após administração intra-arterial e intracarniana,

fortalecendo a hipótese de que MSC humanas auxiliam na formação do

estroma tumoral e na remodelação tecidual (Studeny et al, 2002; Körbling &

Zeev Estrov, 2003) e sugerindo que essas células podem ser usadas nos

tratamentos dos tumores cerebrais (Nakamizo et al, 2005).

5. Células - tronco pulmonares

O parênquima pulmonar é difícil de ser estudado e o “turnover” das

células epiteliais alveolares é pouco conhecido. Entretanto, o transplante de

40

células pluripotentes circulantes parece ocorrer mais freqüentemente no

parênquima pulmonar do que em outros tecidos (Krause et al, 2001)

A clássica subdivisão do pulmão em regiões com suas próprias células-

tronco tem sido reforçada nos últimos anos. Em camundongos, as células-

tronco da região proximal da traquéia residem nos ductos das glândulas

submucosas (Borthwick et al, 2001; Engelhardt et al, 1995), enquanto na região

de brônquios e bronquíolos são provenientes de células que expressam uma

proteína específica das células de Clara e estão localizadas próximos aos

corpos neuroendócrinos (Hong et al, 2001) e junções dos ductos bronco-

alveolares (Giangreco et al, 2002). A FIGURA 8 ilustra a subdivisão do pulmão

em regiões proximal e distal:

41

FIGURA 8- Localização dos principais tipos de células-tronco distribuídas ao longo do eixo crânio-caudal no pulmão de camundongos. A região proximal apresenta células ciliadas, células de Clara (nos ductos das glândulas submucosas) e células basais (traquéia). As regiões distais apresentam células de Clara (corpos neuroendócrinos nos brônquios distais e bronquíolos ou nas junções dos ductos broncoalveolares) e pneumócitos tipo II. Retirado de Rawlins & Hogan. 2006.

Sendo assim, as células da traquéia (células basais), brônquios,

bronquíolos, células de Clara e alvéolos (pnemócitos do tipo II) permanecem

ainda como a primeira reserva de células-tronco, funcionando como reservas

locais de linhagens celulares que podem responder rapidamente ás lesões.

(Otto et al, 2002).

Linhagens celulares distintas das vias aéreas (traquéia e brônquios) e da

periferia do pulmão (bronquíolos, ácinos e alvéolos), estão bem estabelecidas

antes da formação do broto pulmonar definitivo (Perl et al, 2002). Estudos com

42

embriões de camundongos mostraram que os precursores de toda a periferia

do pulmão limitavam-se a poucas células ao longo dos tubos brônquicos bem

como na forma de aglomerados de células nas extremidades distais dos

bronquíolos e brotos laterais. O endoderma passa, então, por processos

precisamente regulados, incluindo a morfogênese e vascularização da árvore

brônquica, originando um órgão capaz de realizar troca gasosa (Chuang &

McMahon, 2003; Jeffery & Hislop, 2003). Estudos clássicos mostraram que o

fenótipo de célula epitelial produzido nesta fase precoce foi determinado pela

liberação local de membros da família do fator de crescimento de fibroblastos

(FGF) pelo mesênquima (Shannon & Hyatt, 2004).

No homem, o alvéolo se desenvolve por volta da 28º semana de

gestação e a multiplicação dos alvéolos pulmonares. resulta na formação de

um total de cerca de 300 milhões de alvéolos por volta dos 2-4 anos de idade

(Jeffery & Hislop, 2003). O epitélio alveolar adulto consiste nas células do tipo I

e II, que ocupam cerca de 95% e 4%, respectivamente, dos aproximados 70m2

de superfície de troca gasosa, apesar de constituírem apenas 8% e 15% do

total de células encontradas no tecido pulmonar (Griffiths et al, 2005).

As células do tipo I apresentam pouco citoplasma para permitir as trocas

gasosas, podendo alcançar um diâmetro de 100µ. Tal fato torna essas células

mais vulneráveis às lesões, e dificultam o seu isolamento para estudos in vitro.

Sabe-se hoje que entre as funções das células do tipo I incluem-se o transporte

de água e íons, defesa e supressão tumoral (Dahlin et al, 2004).

Estudos antigos sugerem que as células do tipo I são derivadas das

células do tipo II após diversos tipos de lesões pulmonares (Adamson &

Bowden, 1974; Evans, 1975; Kapanci et al, 1969) e durante o desenvolvimento

43

do pulmão (Adamson & Bowden, 1974). Embora, muitos estudos ainda

suportem o importante papel dos pneumócitos do tipo II residentes no tecido

pulmonar na restauração da lesão alveolar (Mason, 2006; Bishop et al, 2004;

Warburton et al, 1998; Magdaleno et al, 1998), pouco se sabe sobre a

participação de células circulantes derivadas da medula óssea no processo de

reparo do tecido pulmonar.

Atualmente não há testes in vivo eficazes para avaliar o potencial das

células pulmonares. Entretanto, dois sistemas ex vivo têm sido utilizados para

examinar o potencial regenerativo das células epiteliais pulmonares: 1) o

modelo de xenotransplante de traquéia em ratos e 2) cultura de células in vitro

(Rawlins & Hogan, 2006). Os resultados indicam a existência tanto de células

multipotentes como de células progenitoras comprometidas com linhagem

(Engelhardt et al, 1995) e também levantam possíveis evidências de que

células basais da traquéia sejam células-tronco in vivo (Schoch et al, 2004) e

que as células localizadas nas junções dos ductos broncoalveolares sejam

multipotentes (Khoor et al, 1994).

5.1. Reparo do tecido pulmonar

As células epiteliais que compõem as vias aéreas estão expostas

constantemente à patógenos e agentes tóxicos do ambiente. E, embora a

renovação celular no pulmão seja lenta, ele é capaz de responder rápida e

efetivamente às lesões celulares e à produção local de citocinas (Rawlins &

Hogan, 2006). Os modelos experimentais de lesão pulmonar mostram

freqüentemente a existência de células-tronco no pulmão adulto, entretanto,

44

evidências indicam que a renovação celular e o reparo das regiões proximais

(traquéia e brônquios principais) e distais (brônquios distais, bronquíolos e

alvéolos) do pulmão, envolvem diferentes tipos celulares (Rawlins & Hogan,

2006).

Na região proximal do pulmão, existem evidências de que as células

basais da traquéia e brônquios principais ajam como células-tronco durante o

reparo das células de Clara destruídas pela naftalina (Hong et al, 2004 A e B).

Por outro lado, na região distal do pulmão, onde não existem células basais, a

população de células de Clara destruídas parecem ser restabelecidas pela

proliferação e auto-renovação de um número reduzido das células resistentes

que sobreviveram à lesão induzida pela naftalina. Estas células estão

localizadas próximas aos corpos neuroendócrinos nos brônquios distais e

bronquíolos ou nas junções dos ductos broncoalveolares (Hong et al, 2001).

Outros modelos de lesão, que levam a destruição seletiva das células

ciliadas (inalação de NO2 e ozônio) ou das células epiteliais do tipo I

(administração da bleomicina) também podem ser aplicados para uma

avaliação mais ampla do reparo pulmonar (Rawlins & Hogan, 2006).Os

resultados sugerem que as células ciliadas podem ser regeneradas pelas

células de Clara, enquanto as células do tipo II dão origem a novas células do

tipo I (Aso et al, 1976; Barth & Muller, 1999; Evans et al, 1975 e 1986)

5.2. Utilização terapêutica das células - tronco no tecido pulmonar

Os mecanismos de renovação celular e reparo do pulmão em resposta a

uma agressão não estão bem definidos. Entretanto, é um consenso que os

45

pneumócitos do tipo II, entre outras funções, proliferam e regeneram os

pneumócitos do tipo I (Adamson & Bowden, 1974). Krause e colaboradores

(2001) demonstraram que células - tronco derivadas de medula óssea foram

capazes de restabelecer o potencial de gerar várias linhagens celulares não

linfohematopoiéticas, incluindo o tecido pulmonar com epitélio brônquico e

pneumócitos do tipo II em camundongos irradiados que receberam o

transplante de células - tronco. Nesse trabalho a quantidade de pneumócitos

derivados do transplante de células da medula foi significativamente maior do

que em outras regiões de células epiteliais (trato gastro - intestinal, ductos

biliares, pele e folículos capilares). Darrell e colaboradores (2001)

demonstraram pela primeira vez que células de medula óssea submetidas a

determinadas condições experimentais, podem servir como progenitores de

pneumócitos do tipo I em camundongos com injuria pulmonar induzida pela

bleomicina. Ortiz e colaboradores (2003) demonstraram que a administração

de células-tronco mesenquimais em camundongos após instilação intratraqueal

de bleomicina protege o tecido pulmonar da lesão induzida pela droga, com

significativa redução da inflamação, deposição de colágeno e ativação de

metaloproteinases (MMPs). Outros resultados, ainda, mostram que células

progenitoras da medula óssea podem se diferenciar em células epiteliais

alveolares e células endoteliais após administração intranasal de LPS (Yamada

et al, 2004) ou no enfisema induzido pelo ácido retinóico (Ishizawa et al, 2004).

Um estudo em humanos, utilizando hibridização in situ para detecção do

cromossoma Y, verificou, em homens que receberam pulmões transplantados

de mulheres, que células derivadas da medula óssea do receptor foram

46

encontradas nos pulmões transplantados e participaram da repopulação do

pulmão e diferenciação em células epiteliais pulmonares (Albera, et al, 2005).

Wang e colaboradores (2005) demonstraram que células mesenquimais

derivadas de medula óssea (MSC), quando cultivadas juntamente com células

epiteliais pulmonares isoladas de pacientes com fibrose cística (AEC-CF),

foram capazes de expressar marcadores específicos de células epiteliais (CK-

18), além de apresentarem morfologia epitélio-simile. Os autores também

mostraram que MSC isoladas dos pacientes com CF, após correção do gene

CFRT (regulador de condutância transmembrana) e co-cultivados com AEC-

CF, foram capazes de secretar maiores quantidades de Cl em resposta ao

tratamento com cAMP em relação às MSC que não tiveram a correção do

CFRT.

Um estudo utilizando um modelo animal de enfisema pulmonar revelou

que a utilização de células estromais pluripotentes derivadas de tecido adiposo

combinada com a cirurgia de redução de volume pulmonar, resultou na

melhora da regeneração alveolar e vascular, bem como na melhora da função

pulmonar (Shigemura et al, 2006).

47

OBJETIVOS GERAIS

O objetivo deste trabalho foi avaliar a participação das células

mononucleares derivadas de medula óssea (BMMC) no processo de reparo e

remodelamento do parênquima pulmonar de animais silicóticos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1- Estabelecer o modelo de silicose experimental murina através da instilação

intratraqueal de sílica em dose única.

2- Analisar as alterações morfológicas induzidas no parênquima pulmonar de

animais silicóticos e após o transplante de células mononucleares da

medula óssea.

3- Analisar o perímetro dos nódulos silicóticos e sua densidade volumétrica

nos animais silicóticos e nos animais silicóticos que receberam o

transplante de células mononucleares da medula óssea.

4- Avaliar a população macrofágica nos animais silicóticos e após o

transplante de células mononucleares da medula óssea.

48

5- Avaliar a expressão da proteína proteína actina alfa de músculo liso (α-

SMa) em animais silicóticos e após o transplante de células mononucleares

da medula óssea.

6- Avaliar a modificação do processo inflamatório pulmonar através da análise

do lavado broncoalveolar na silicose experimental.

7- Analisar a participação dos neutrófilos na lesão pulmonar induzida pela

silicose.

8- Avaliar a atividade da enzima desidrogenase lática (LDH) pulmonar em

animais silicóticos e após terapia por células mononucleares da medula

óssea.

9- Avaliar o grau de apoptose e a sua modulação em animais silicóticos e após

terapia por células mononucleares da medula óssea.

10- Analisar o conteúdo de colágeno presente nos nódulos e nos septos

alveolares em animais silicóticos e após o transplante de células

mononucleares da medula óssea.

11- Avaliar a quantidade de sílica livre no interior dos nódulos em animais

silicóticos e após o transplante de células mononucleares da medula óssea.

49

MATERIAL E MÉTODOS

1. Animais e Protocolo Experimental

1.1. Indução da silicose

Foram utilizados camundongos C57/BL6 de ambos os sexos, com 8 –

12 semanas de idade e peso aproximado de 20 a 30 g. A silicose foi induzida

através da instilação de sílica (SiO2 Sigma, S-5631, 99% pura, com partículas

de tamanho variando entre 0,5 e 10 µm, cerca de 80% entre 1 e 5 µm), por via

intra-traqueal, em dose única (20 mg/mL), diluída em 50 µL de salina estéril.

1.2. Procedimento cirúrgico

Os animais foram anestesiados com ketamina (35mg/Kg) e xilazina

(9mg/Kg) via intraperitoneal e após abertura dos planos superficiais, a traquéia

foi exposta e a sílica foi introduzida através de seringa de insulina, sendo que

após a instilação, a pele e tecido celular subcutâneo foram suturados com fio

de nylon 4-0.

1.3. Protocolo Experimental

Após 40 dias da instilação de sílica, os animais foram sacrificados

(GRUPO SIL 40d) ou receberam o transplante de medula óssea, sendo

sacrificados após 30 dias do transplante (GRUPO SIL + BMMC). Um grupo de

50

camundongos foi instilado com salina estéril (50 µL) e após 40 dias os animais

foram sacrificados (GRUPO SAL 40d) ou receberam o transplante de medula

óssea, sendo sacrificados após 30 dias do transplante (GRUPO SAL + BMMC).

Como grupos controle, camundongos C57/BL6 foram instilados com

sílica ou salina estéril (50 µL), sendo sacrificados após 70 dias (GRUPOS SIL

70d e SAL 70d). Em outro grupo, animais normais foram tratados ou não com

células mononucleares da medula óssea e sacrificados após 30 dias (GRUPOS

NORMAL e N + BMMC). Para cada grupo foram utilizados 5 animais (n = 5). O

esquema a baixo ilustra o desenho experimental supracitado, sintetizando os

grupos utilizados, bem com os tempos de evolução da doença e de sacrífício

dos animais.

51

2. Obtenção e transplante de células mononucleares derivadas

de medula óssea

Foram utilizados camundongos isogênicos C57/BL06 como fonte de

medula óssea para obtenção das células mononucleares. As células

mononucleares de medula óssea foram obtidas através da técnica do

"flushing”. Para isso, os fêmures dos camundongos foram dissecados,

retiraram-se os restos musculares e as epífises foram cortadas. Seguiu-se o

Instilação intratraqueal de sílica ou salina

Sílica

Salina

GRUPOS 40 dias

GRUPOS 70 dias

SIL 40d

SAL 40d

SIL 70d

SIL+ BMMC

SAL+ BMMC

SAL 70d

Obtenção e transplante das BMMC

N+BMMC

NORMAL

52

"flushing" da cavidade medular utilizando-se o meio Dulbecco Modified Eagle

Médium (DMEM) ou Tampão Fosfato-Salina (PBS). A suspensão celular foi

mecanicamente dissociada e submetida à separação por gradiente de

densidade utilizando o Ficoll-Paque TM Plus (Amersham Biosciences /17-1440-

03) a 1,077g/cm3, 30 minutos, a 1500 rpm, em temperatura ambiente. As

células de baixa densidade (mononucleares) foram utilizadas no ensaio. As

células recuperadas foram lavadas em PBS por três vezes e ressuspendidas

em PBS. Em seguida, o número de células foi contado em câmara neubauer e

estas foram separadas em seringas de 1 mL, na concentração de 1 x 106

células/200 microlitros de salina.

As células mononucleares foram transplantadas utilizando-se como via

de inoculação a veia da cauda.

3. Lavado broncoalveolar (BAL) e citocentrifugado

Os animais foram colocados em decúbito ventral, a pele e toda camada

muscular adjacente à traquéia removida. Uma cânula de polietileno foi inserida

na traquéia e um volume de 3mL de solução salina (PBS pH 7.4) à 37o C +

heparina (10 UI / mL) instilado e aspirado 3 vezes (1mL / cada) em cada

animal.

O material obtido do lavado bronco-alveolar (BAL) apresentava uma

fração líquida (sobrenadante) e outra sólida (células), após centrifugação (1500

RPM durante 5 minutos a 4ºC).

O sedimento foi ressuspendido em volume final de 500 µl de solução

salina contendo 3% de soro fetal bovino (PBS 3% SFB). Estas alíquotas foram

53

transferidas para tubos específicos para serem utilizados no citômetro de fluxo.

As amostras foram adquiridas em sua totalidade no aparelho, utilizando o

software Cell Quest. A quantificação das células também foi realizada no

citômetro, através deste mesmo software. O número total de células foi definido

em 0,5 ml e calculado para ser demonstrado em uma concentração de

células/ml. Além do número total de células, o “Cell Quest” oferece outras

ferramentas de análise qualitativa das células, como sua distribuição quanto ao

tamanho e granulosidade das células analisadas (dado não-mostrado). Cada

grupo de animais foi analisado individualmente, ou seja, o número total das

células foi determinado especificamente para cada um dos animais utilizados

na realização deste estudo.

Os citocentrifugados foram obtidos em citocentrífuga (Citospin da marca

Incibras, Brasil) a uma rotação de 47 X g por 5 min. Após a fixação com

metanol as lâminas foram coradas pelo método de May – Grunwald – Giemsa.

A contagem diferencial foi feita em microscópio de campo claro (Eclipse E800,

Nikon) com objetiva de 40x e ocular de 10X de aumento, capturando-se

campos totalizando 200 células.

4. Processamento histológico

Para o sacrifício dos animais, estes foram sacrificados por secção

medular após anestesia com ketamina (35mg/Kg) e xilazina (9mg/Kg). A

traquéia foi exposta, como previamente descrito e oclluída ao final da

expiração. Esta manobra tem por finalidade manter o volume de reserva

expiratório e do volume residual, mantendo assim a capacidade residual

54

funcional. Os alvéolos não ficam colapsados, nem hiperinsuflados. O pulmão

direito foi coletado para análise bioquímica conforme a subseqüente descrição.

O pulmão esquerdo foi fixado em formol tamponado a 10% e processado em

séries crescentes de etanol e banhos de xileno. Em seguida o material foi

impregnado em parafina. Cortes de 5 µm de tecido pulmonar foram obtidos e

corados pela Hematoxilina-Eosina (HE).

5. Análise histológica

5.1. Histopatologia

Para a análise histopatológica foram utilizados cortes de 5 µm de tecido

pulmonar corados pela Hematoxilina-Eosina (HE). O infiltrado inflamatório, as

formações de tecido linfóide associadas aos brônquios (BALT), a estrutura

arquitetônica pulmonar e a presença de sílica livre foram então analisados em

microscópio de campo claro (Eclipse E800, Nikon).

Após a desparafinização e hidratação do material com três banhos de

xilol e álcoois decrescentes (100 / 95 / 70%) e banhos em água destilada

respectivamente, os cortes foram colocados na hematoxilina de Harris por 8

minutos e posteriormente lavados em água corrente por 5 minutos,

diferenciados em água ácida 1% e lavados novammente em água corrente por

5 minutos. Após 1 banho em água destilada, os cortes foram colocados na

eosina Y por 40 segundos, seguindo-se 3 banhos rápidos em água acética a

1% e 3 banhos rápidos em água destilada. As lâminas foram desidratadas em

banhos de álcoois e xilenos, sendo então montadas em Entellan®

55

5.2. Detecção e quantificação dos macrófagos pulmonares através da

marcação de radicais carboidráticos.

A fim de analisar e quantificar os macrófagos pulmonares ativados foi

utlizada a técnica histoquímica para a detecção da lectina Bandeiracea

Griffonia Simplicifolia isoagglutin. A lectina Griffonia é especifica para radicais

carboidráticos de superfície macrofágica (resíduos α-D galactose) que estão

associados de maneira mais específica com macrófagos ativados. Após a

desparafinização e hidratação do material com três banhos de xilol e álcoois

decrescentes (100 / 95 / 70%) e banhos em água destilada respectivamente, os

resíduos aldeídicos foram inibidas pelo bórax 5 % por 20 minutos, seguindo-se

a inibição da peroxidase endógena com H2O2 3% (Reagen) em metanol por 20

minutos e banhos seguidos de tampão PBS pH 7.4 por 5 minutos cada.

Realizou-se o bloqueio das ligações inespecíficas com PBS - BSA 3% por uma

hora. Após este procedimento, as lâminas foram incubadas com a lectina

Bandeiracea Griffonia Simplicifolia conjugada à biotina (Vector Laboratories,

EUA) em câmara úmida na concentração de 1:100 em PBS-BSA 1% + Solução

traço de metais, contendo Cloreto de Cálcio, Cloreto de Magnésio, Cloreto de

Manganês + Azida de Sódio durante a noite a 4°C. No dia seguinte, após

alcançar a temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas em PBS pH 7.4 -

Tween 20 0,25%, incubadas com a estreptavidina - Peroxidase (Sigma) diluída

1:30 em PBS por 40 minutos e revelada pela AEC (DAKO). Após duas

lavagens com água destilada por 5 minutos, as lâminas foram contracoradas

com Hematoxilina de Mayer (diluída 1:3) e montadas em meio aquoso

(Aquatex, Merck).

56

Foram capturados 15 campos utilizando a objetiva de 40X e ocular de

10X, por animal, dentro e fora dos nódulos silicóticos em microscópio de campo

claro (Nikon Eclipse E800) acoplado à camera digital (Evolution VF -

MediaCybernetics). As imagens foram analisadas utilizando-se o programa

Image - Pro® Plus (Versão 4.5.1 – Media Cybernetics, USA)

5.3. Detecção e quantificação dos macrófagos pulmonares através de

imunomarcação para a glicoproteína F4/80.

F4/80 é uma glicoproteína encontrada na superfície de macrófagos

murinos, sendo considerada um dos marcadores mais específicos para esse

tipo celular. (Austyn & Gordon, 1981; Morris et al, 1991). Os macrófagos

positivos para a glicoproteína F4/80 puderam ser detectados a partir de cortes

parafinados de 5 µm submetidos à técnica imunohistoquímica utilizando um

anticorpo dirigido contra esse receptor de superfície celular. Após a

desparafinização e hidratação do material com três banhos de xilol e álcoois

decrescentes (100 / 95 / 70%), respectivamente, os resíduos aldeídicos foram

inibidas pelo Cloreto de amônio 50mM em PBS pH 8,0 em dois banhos de 15

minutos. Após duas lavagens em PBS pH 7,4 a peroxidase endógena foi

inibida com H2O2 3% (Reagen) em metanol por 20 minutos, seguindo-se de

dois banhos de tampão PBS pH 7.4 por 5 minutos cada. As lâminas foram

colocadas por 15 minutos em PBS pH 7,4 previamente aquecido na estufa a

40º. Após esse período, os cortes histológicos forma incubados com solução

de tripsina a 0,2% em PBS (Tripsina tablets, Sigma, USA), em câmara úmida,

ambos previamente aquecidos, permanecendo na estufa por 20 minutos.

57

Depois de três lavagens de 5 minutos cada em PBS, seguiu-se o bloqueio das

ligações inespecíficas com PBS-BSA10% / Leite molico 8% (1:1) por uma hora.

Após este procedimento, as lâminas foram incubadas com o anticorpo F4/80

(rat / anti-mouse MCA497 Serotec, USA) em câmara úmida na concentração

de 1:50 em PBS/BSA 3% - Triton 0,1% - Tween 0,05%, permanecendo até o

próximo dia.

No dia seguinte, após alcançar a temperatura ambiente, as lâminas

foram lavadas 2 vezes em Tampão PBS pH 7.4 e 1 vez em PBS - Tween

0,25%, por 5 minutos cada e incubadas com o anticorpo secundário anti-rat IgG

(Vector) na concentração de 1:30 por uma hora. Ao final desse período e após

duas lavagens com PBS - Tween 0,25%, foi incubada a estreptavidina -

Peroxidase (Sigma) diluída 1:30 em PBS por 1 hora e as lâminas foram

reveladas com DAB (DAB líquida, DAKO, Carpinteria, CA, USA) por 10 a 15

minutos. Após 2 lavagens com tampão PBS pH 7.4 - Tween 20 0,25% por 5

minutos e 1 lavagem em água destilada por 10 minutos, as lâminas foram

contracoradas com Hematoxilina diluída de Harris e montadas em Entellan®

(Merck). Como controles negativos cortes histológicos foram incubados com

soro não imune de rato.

Foram capturados 15 campos por animal em microscópio de campo

claro (Nikon Eclipse E800) com a objetiva de 40X acoplado à camera digital

(Evolution VF - MediaCybernetics). As imagens foram analisadas utilizando-se

o programa Image - Pro® Plus (Versão 4.5.1 – Media Cybernetics, USA).

58

5.4. Imunodetecção para a proteína actina alfa de músculo liso

Para avaliar a expressão da proteína actina alfa de músculo liso (α-SMa)

foi utilizada a técnica de imunohistoquímica com anticorpo dirigido contra essa

proteína (α-SMa - Dako).


xilol e álcoois decrescentes (100 / 95 / 70%), respectivamente, foram feitas

lavagem com água destila (um banho por 10 minutos) e tampão PBS, pH 7.4

(três banhos por 5 minutos). Os resíduos aldeídicos foram inibidos com bórax 5

% por 20 minutos. Depois foi feita a inibição da peroxidase endógena com H2O2

3% (Reagen) em metanol por 15 minutos e banhos seguidos de tampão

Fosfato pH 7.4 por 5 minutos. A recuperação antigênica foi realizada através de

calor, utilizando tampão citrato pH 6,0 em panela vapor a 95° C por 20 minutos.

Após lavagens com tampão PBS, pH 7.4 seguiu-se o bloqueio das reações

inespecíficas com PBS - BSA 10% : leite molico 8% por uma hora.

O anticorpo monoclonal feito em camundongo foi biotinilado utilizando-

se o kit de biotinilação (DAKO Kit (ARKTM) HRP – K3955), segundo as

indicações do fabricante e diluído numa concentração de 1:30 em PBS - BSA

1% e posteriormente incubado nas lâminas em câmara úmida permanecendo

durante o período da noite.

No dia seguinte, após alcançar a temperatura ambiente, as lâminas

foram lavadas três vezes por 5 minutos em tampão fosfato pH 7.4 - Tween 20

0,25%, incubadas com estreptavidina - Peroxidase (Sigma) diluída 1:30 em

PBS por 40 minutos e revelada com DAB (DAB líquida, DAKO, Carpinteria, CA,

USA) por 10 a 15 minutos. Após uma lavagem com tampão fosfato pH 7.4 -

59

Tween 20 0,25% por 5 minutos e três lavagens em água destilada por 5

minutos, as lâminas foram contracoradas com Hematoxilina de Harris e

montadas em Entellan® (Merck).

5.5. Detecção e quantificação das células apoptóticas

As células apoptóticas foram detectadas utilizando-se o kit ApopTag

peroxidase in situ (Chemicon).


xilol e álcoois decrescentes (100 / 95 / 70%), respectivamente, as lâminas

foram lavadas 1 vez em PBS pH 7,4 por 5 minutos, seguindo-se o pré-

tratamento das amostras utilizando o calor. Para isso, as lâminas foram

colocadas em tampão citrato 10 mM pH 6,0 e levadas ao microondas por 3

minutos, procedimento que foi repetido por 3 vezes. Após duas lavagens em

água destilada, a peroxidase endógena foi inibida com H2O2 3% (Reagen) em

metanol por 5 minutos e lavadas posteriormente 2 vezes em PBS pH 7,4 por 5

minutos cada. As lâminas foram incubadas com o tampão de equilíbrio por 5

minutos e em seguida incubadas com enzima TdT working strenght (tampão de

reação + enzima TdT) por 1 hora, ambas em câmara úmida a temperatura

ambiente. Após esse período, as lâminas foram incubadas com o tampão de

parada por 10 minutos e lavadas 3 vezes em PBS pH 7,4 por 1 minuto cada. O

bloqueio das ligações inespecíficas do anticorpo com o tecido foi realizado com

PBS-BSA 5% por 30 minutos. Após este procedimento, as lâminas foram

incubadas com o anticorpo Anti-DIGOXIGENINA – PEROXIDASE (Chemicon)

por 30 minutos em câmara úmida a temperatura ambiente. Ao final desse

60

período e após duas lavagens de 5 minutos com PBS - Tween 0,25%, as

lâminas foram reveladas com DAB (DAB líquida, DAKO, Carpinteria, CA, USA)

por 10 a 15 minutos. Após 2 lavagens com tampão PBS pH 7.4 - Tween 20

0,25% por 5 minutos e 1 lavagem em água destilada por 10 minutos, as

lâminas foram contracoradas com Hematoxilina diluída de Harris e montadas

em Entellan® (Merck).

Foram capturadas 15 campos por animal em microscópio de campo

claro (Nikon Eclipse E800) no aumento de 400X acoplado à camera digital

(Evolution VF - MediaCybernetics). As imagens foram analisadas utilizando-se

o programa Image - Pro® Plus (Versão 4.5.1 – Media Cybernetics, USA).

5.6. Histoquímica para detecção de fibras colágenas e quantificação do

conteúdo de colágeno.

A trama colagênica dos granulomas foi observada através da coloração

pelo Sirius red modificado para microscopia confocal (DOLBER & SPACH,

1993).


xilol e álcoois decrescentes (100 / 95 / 70%), as lâminas foram lavadas em

água destilada por 10 min e colocadas na solução de ácido fosfomolíbdico por

1 min. Depois, o ácido fosfomolíbdico foi desprezado e as lâminas

permaneceram imersas em solução de picrosirius por 90 minutos. Após esse

período as lâminas foram retiradas do corante, lavadas em ácido clorídrico

0,01N durante 2 minutos e posteriormente em álcool a 70% por 45 segundos.

Seguiu-se a desidratação e a clarificação dos cortes histológicos em banhos de

61

álcoois e xilol, respectivamente, e posteriormente as lâminas foram montadas

em Entellan® (Merck).

Foram capturados 15 campos nos septos alveolares e 15 campos nos

nódulos silicóticos por animal em microscópio de campo claro (Nikon Eclipse

E800) com a objetiva de 40X acoplado à camera digital (Evolution VF -

MediaCybernetics). As imagens foram analisadas utilizando-se o programa

Image - Pro® Plus (Versão 4.5.1 – Media Cybernetics, USA).

5.7. Visualização e quantificação da sílica livre nos nódulos silicóticos

A sílica livre presente nos nódulos silicóticos foi visualizada em cortes

histológicos corados com hematoxilina e eosina. Para isso, foi utilizado um

microscópio Zeiss (axoplan) associado a dois polaróides cruzados em 90º. A

sílica, que é um material birrefringente, pode ser detectada com brilho máximo

quando está a um ângulo de 45º em relação aos polaróides.

A aquisição das imagens (15 campos por animal) foi feita com uma

câmera digital (Evolution MP, MediaCybernetics) refrigerada com a objetiva de

40X acoplada ao microscópio (Zeiss, axoplan) e analizadas utilizando-se o

programa Image - Pro® Plus (Versão 4.5.1 – Media Cybernetics, USA).

5.8. Quantificação da celularidade no interior dos nódulos silicóticos

Os cortes histológicos foram corados com a hematoxilina - eosina e

montadas em Entellan®. Foram capturados 15 campos no interior dos nódulos

por animal em microscópio de campo claro (Nikon Eclipse E800) com a objetiva

62

de 40X acoplado à camera digital (Evolution VF - MediaCybernetics). Todas as

células do campo foram contadas.

6. Análise morfométrica e estereológica dos nódulos silicóticos

Para as análises morfométricas e estereológicas um sistema de vídeo

microscopia foi utilizado com uma câmera digital (Evolution VF-

MediaCybernetics) acoplada ao computador. Para ambas as análises utilizou-

se como ferramenta o software Image - Pro® Plus (Versão 4.5.1 – Media

Cybernetics, USA)

6.1. Morfometria para obtenção do perimetro dos nódulos silicóticos

Os nódulos silicóticos foram fotografados no microscópio NIKON Eclipse

E800, com a objetiva de 40 X e digitalizadas. A quantificação do perímetro dos

nódulos foi feita através do sistema de contorno de estruturas, utilizando o

sistema de análise de imagens IMAGE PROPLUS. Resultados obtido em µm2

6.2. Estereologia para obtenção da densidade volumétrica dos nódulos

silicóticos

A densidade de volume (Vv) mede a ocupação relativa do volume de

uma estrutura no volume teste, obedecendo à lei básica da estereologia

(Mandarim-de-Lacerda, CA. Métodos Quantitativos em Morfologia, EDUERJ,

1995), onde:

63

Pp / Pt = Ap / At = Lp / Lt = Vp / Vt

Pp = pontos parciais Lp = linhas parciais

Pt = pontos totais Lt = linhas totais

Ap = Área parcial Vp = volume parcial

At = área total Vt = volume total

Para isto, uma grade teste contendo 35 pontos foi projetada sobre a

imagem a ser analisada e os pontos que tocavam os nódulos eram contados.

O VV foi estimado para os nódulos silicoticos da seguinte forma:

VV[nódulos] = PP[nódulos] / PT

7. Detecção da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) no

homogenato pulmonar

A determinação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) foi

avaliada como previamente descrita (Schneider & Issekutz, 1996).

Decorrido o tempo de experimentação, os animais foram sacrificados e

parte do pulmão foi macerado em uma solução de PBS-Triton X100 0,1%. Os

homogenatos obtidos foram centrifugados por 10 minutos a 10.000 g a 4º C.

Foram recolhidos 50µL do sobrenadante adicionando-se a ele uma solução

com 0,5 µg / mL de o-fenileno dianisidina (OPD) e H2O2 a 30% (µL / mL) em

tampão Citrato pH= 5,6. A reação foi interrompida com solução 2 M de ácido

sulfúrico (H2SO4). Após 20 minutos realizou-se a leitura a em leitor de ELISA

em 492nm de comprimento de onda.

Para todos os grupos foi realizado o controle da reação, onde os

reagentes foram adicionados somente a uma solução de PBS-Triton 0.1%

64

8. Ensaio bioquímico para análise da atividade da enzima

lactato desidrogenase (LDH)

O pulmão direito foi macerado em uma solução de PBS-Triton X100

0,1% e os homogenatos obtidos foram centrifugados a 720g, a 3o C durante 10

minutos.

A reação mede a oxidação do NADH no espectrofotômetro (GBC 920)

em um volume final de 1mL a 37oC. A atividade enzimática foi calculada

utilizando o coeficiente de extinção molar do NADH (6,22M) em 340nm. Em

cada cubeta foram colocados cerca de 100µg do homogenato do tecido

pulmonar (sobrenadante do homogenato total), onde a reação foi disparada

com a adição de piruvato.

A oxidação do NADH foi acompanhada por 1minuto e 30 segundos, e a

regressão linear feita a partir da fase linear do espectro obtido. O controle

consistia no meio de reação sem piruvato, durante 3 minutos, sendo o último

minuto utilizado como controle do experimento.

Reação: piruvato + NADH lactato + NAD+

Meio de Reação: 10mM tris-HCl (pH 7,5); 200�M NADH; 100�g de

homogenato de pulmão; piruvato 1Mm.

65

9. Análise estatística:

As variáveis foram analisadas descritivamente, sendo submetidas a um

teste de normalidade. As variáveis que apresentaram distribuição normal foram

analisadas pelos testes paramétricos T DE STUDENT, para amostras

independentes (two tailed). Para a comparação de mais de dois grupos, foi

utilizado o teste ONE WAY ANOVA e quando obtido o efeito principal foi

empregado pós-teste de Tukey. Para a análise de variáveis que não

apresentaram distribuição normal, foram utilizados os testes não paramétricos

KRUSKAL-WALLIS e MANN-WHITNEY para análise de dois grupos e análise

de mais de dois grupos, respectivamente. Em todas as análises realizadas foi

admitido como significativo 1 (um) asterisco para p < 0,05 (*), 2 (dois)

asteriscos para p < 0,01 (**) e 3 (três) asteriscos para p < 0,001 (***).

66

RESULTADOS

1. Análise do lavado broncoalveolar (BAL)

A fim de se avaliar a resposta inflamatória em nosso modelo

experimental analisamos o lavado broncoalveolar (BAL) através de uma

contagem total e diferencial das células mononucleares e dos neutrófilos.

Observamos um aumento significativo da celularidade total (p<0.0001) tanto no

grupo SIL 70d, quanto no grupo SIL+BM em relação aos animais dos grupos

SAL 70d, N + BMMC e SAL + BMMC (FIGURA 9). Esse aumento foi

significativamente maior (p<0,05) no grupo que recebeu o tratamento com as

células mononucleares derivadas da medula óssea (7 x 106 ± 2,5) em relação

ao grupo se BMMC m o tratamento (5 x 106 ± 1,4). Nos animais controles (SAL

70d e SAL+BMMC) não houve significativa diferença na celularidade total em

relação aos animais normais que receberam ou não as BMMC (FIGURA 9).

67

FIGURA 9: Contagem das células totais presentes no lavado broncoalveolar (BAL). Os animais silicóticos tratados e não tratados apresentaram aumento no número total de células em relação aos animais controles (salina e normal com e sem BMMC). O grupo SIL+BMMC apresentou aumento significativo (p<0,0001) em relação ao grupo SIL 70d.

Apesar do aumento significativo na celularidade total, observado nos

animais tratados em relação aos não tratados, quando avaliamos a contagem

diferencial das células mononucleares e dos neutrófilos, não houve diferença

(p>0,05) entre esses grupos (FIGURAS 10 A e B). Entretanto, podemos

observar um aumento sugestivo de ambas as populações celulares

(mononucleares e neutrófilos) após o tratamento com as células de medula

óssea.

Contagem total decélulas no BAL

NORMAL

N + BMMC

SAL 70d

SAL+BMMC

SIL 70

d

SIL+ BMMC

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

1000

000

cels

*

68

MONONUCLEARES

N + BMMC

NORMAL

SAL 70d

SAL + B

MMC

SIL 70

d

SIL + B

MMC0.0

2.5

5.0

7.5

%

FIGURA 10: Contagem diferencial das células presentes no BAL (percentual de neutrófilos e de células mononucleares em relação ao número total). Tanto os neutrófilos como as células mononucleares encontravam-se aumentadas nos animais silicóticos tratados com BMMC e não tratados. Não houve diferença significativa entre os grupos SIL 70d e SIL+BMMC.

2. Análise morfológica

Os animais normais apresentavam estrutura pulmonar preservada

(FIGURA 11 A) com raros macrófagos alveolares presentes nos espaços

aéreos Os animais submetidos à instilação de salina 70 dias exibiam

arquitetura pulmonar preservada exibindo somente discreto edema perivascular

(FIGURA 11B) e raros macrófagos alveolares situados nos espaços aéreos

Após o transplante de células mononucleares da medula óssea (30 dias), tanto

nos animais normais (FIGURA 11 C) e naqueles submetidos à instilação de

salina (FIGURA 11 D), não se observou modificação da estrutura

parenquimatosa pulmonar exceto pela presença de alguns macrófagos

alveolares nos espaços aéreos, edema perivascular e, por vezes, discreto

infiltrado linfocitário ao redor de brônquios (aspecto não mostrado).

PMN

N + BMMC

NORMAL

SAL 70d

SAL + B

MMC

SIL 70

d

SIL + B

MMC0

1

2

%

A B

69

FIGURA 11: Arquitetura pulmonar dos animais normais submetidos à instilação com salina evidenciada pela coloração de hematoxilina e eosina. Animais normais apresentando estrutura pulmonar preservada (A); discreto edema perivascular (seta) nos animais instilados com salina (70d) (B); edema perivascular em animais normais (C) e salina (D) que receberam as BMMCs. BARRAS: A, B e C- 100µm; D- 200µm

70

Após 40 dias da instilação de sílica, os animais apaesentavam estruturas

nodulares (granulomas) tamanhos variados no parênquima pulmonar por vezes

situados na parede de brônquios (FIGURA 12 A e B), constituídos

principalmente por células mononucleares (macrófagos) e raros

polimorfonucleares (FIGURA 12 C e FIGURA 13), sendo evidenciado no centro

dos nódulos, debris celulares, partículas de sílica não fagocitadas. Corpos

apoptóticos eram evidentes dentro dos nódulos e nos espaços aéreos vizinhos

aos granulomas notava-se por vezes zonas de colapso ou hiperinsuflação dos

alvéolos (FIGURA 12 D). Os septos alveolares se apresentavam por vezes

discretamente espessados pela presença de células inflamatórias (alveolite) e

o epitélio brônquico se mostrava hiperplásico (FIGURA 12 C e D).

71

FIGURA 12: Arquitetura pulmonar nos animais após 40 dias de silica evidenciada pela coloração de hematoxilina e eosina. Presença de granulomas dispersos no parênquima pulmonar (setas) (A). Granuloma peribrônquico (seta) (B); Detalhe de um granuloma peribrônquico evidenciando presença predominante de células mononucleares (seta) e hiperplasia do epitélio brônquico (+) (C). Septos alveolares espessados contendo células inflamatórias – alveolite (*) e espaços aéreos hiperinsuflados (+) (D). BARRAS: A- 200µm; B, C e D- 100µm

+

*

+

72

FIGURA 13: Detalhe do interior de um granuloma no pulmão de animais após 40 dias de sílica evidenciada pela coloração de hematoxilina e eosina. Presença principalmente de células mononucleares (setas) e polimorfonucleares (poucos). BARRA: 30µm

73

Nos animais com 70 dias de sílica observou-se que as estruturas

nodulares eram maiores que as observadas nos animais SIL 40d (FIGURA 14

A). Na periferia dos nódulos eram evidentes agregados linfocíticos,

eventualmente localizados na parede de brônquios (FIGURA 14 A). Os nódulos

eram, por vezes confluentes, constituídos por macrófagos e linfócitos, sendo

evidenciado algumas áreas centrais hialinas devido a presença de debris

celulares, partículas de sílica não fagocitadas (FIGURA 14 B) e

polimorfonucleares e mononucleares na periferia (FIGURA 14 C e D). Nos

espaços aéreos vizinhos, notava-se também zonas de colapso ou

hiperinsuflação e presença de grandes macrófagos alveolares principalmente

nos alvéolos vizinhos aos nódulos. Os septos alveolares se apresentavam por

vezes discretamente espessados pela presença de células inflamatórias

(alveolite) havendo também hiperplasia do epitélio brônquico.

74

FIGURA 14: Arquitetura pulmonar dos animais após 70 dias de silica evidenciada pela coloração de hematoxilina e eosina. Granulomas (nódulos) grandes com área central clara, menos celular (+), agregados linfocíticos periféricos aos nódulos (seta) (A). Detalhe do granuloma evidenciando área periférica bastante celular (*) e centro claro, contendo debris celulares e sílica livre (+) (B). Maior aumento do nódulo demonstrando área central contendo debris celulares. Na periferia dos nódulos observa-se polimorfonucleares (setas) (C). Detalhe dos tipos celulares presentes na zona periférica – mononucleares (setas) entremeados por polimorfonucleares (cabeça de seta) (D). BARRAS: A- 200µm; B- 100µm; C- 50 µm; D- 30 µm.

+

+ *

+

75

Após o tratamento com células mononucleares da medula óssea, notou-

se que os nódulos ainda exibiam uma heterogeneidade no tamanho (FIGURA

15 A; B; C e D), mas aqueles nódulos maiores pareciam ainda maiores que os

vistos nos animais SIL 70 (FIGURA 16 A; B; C e D). Os nódulos dos animais

que receberam o transplante com as BMMC pareciam mais celulares e os

macrófagos observados nesses animais (FIGURA 17 C e D). pareciam maiores

que os vistos nos animais não tratados (FIGURA 17 A e B).

76

FIGURA 15: Arquitetura pulmonar nos animais silicóticos que receberam as BMMC evidenciada pela coloração de hematoxilina e eeosina. Granulomas parenquimatosos (A; B; C e D). BARRAS: A e C- 100 µm; B- 50 µm; D- 30 µm

77

FIGURA 16: Fotomicrografia dos nódulos silicóticos dos animais tratados com BMMC e dos animais não tratados evidenciados pela coloração de hematoxilina e eeosina. Nódulos silicóticos presentes nos animais controles SIL 70d (A e B) apresentando menor área que os nódulos observados nos animais SIL+BMMC (C e D). BARRAS A, B, C e D: 100 µm.

78

FIGURA 17: Detalhe do interior do granuloma no pulmão de animais após 70 dias de sílica e de animais que receberam o transplante com as BMMC evidenciado pela coloração de hematoxilina e eosina. Presença de macrófagos maiores, com citoplasma mais eosinofílico nos animais tratados (B) em relação aos macrófagos presentes nos animais controle SIL 70d (A). Barras 30 µm.

79

3. Análise morfométrica e estereológica dos nódulos silicóticos

Durante a análise histopatológica, foi observado um aumento no

tamanho dos nódulos silicóticos nos animais tratados com as células

mononucleares em relação aos animais que não receberam as células. Para

comprovar esses dados, utilizou-se cortes parafinados de 5 µm corados pela

hematoxilina e eosina com o objetivo de analisar a área e o volume desses

nódulos.

3.1. Morfometria para obtenção do perímetro dos nódulos silicóticos

Durante a aferição dos perímetros, foi observado uma grande variação

entre os tamanhos dos nódulos. Nos grupos Sil+BMMC e Sil 70d observou-se

que aproximadamente a metade dos nódulos era menor que 105 µm2. Sendo

assim, foi adotado este valor como ponto de corte para a separação dos grupos

em duas classes: nódulos grandes, >105 µm2, e nódulos pequenos, < 105 µm2

(FIGURA18), comparando os tamanhos dos nódulos entre os animais tratados

e não tratados para cada uma das classes.

80

FIGURA 18: Representação gráfica da quantidade de nódulos silicóticos grandes e pequenos nos três grupos analisados. Os nódulos pequenos (<100.000) foram mais observados no grupo SIL 40d, enquanto os nódulos grandes (>100.000) estavam distribuidos de forma sememlhante entre os grupos SIL 70d e SIL+BMMC

Não houve diferença estatisticamente significativa quando comparados

os nódulos pequenos entre o grupo SIL + BMMC (27506µm2 ± 20811) e Sil

70 d (56812µm2 ± 25155). Entretanto, quando os nódulos grandes foram

comparados, os resultados mostraram que o grupo SIL + BMMC apresentou

nódulos com áreas maiores (t= 0.8969; df= 56; p= 0,0025) (FIGURA19).

81

SIL 40d SIL 70d SIL + BMMC0

100000

200000

300000

400000

MORFOMETRIA

**

Tam

anho

dos

nód

ulos

(µm

2 )>

1000

.000

FIGURA 19: Representação gráfica da histomorfometria da área dos nódulos silicóticos em µm2. Aumento da área dos nódulos silicóticos no grupo tratado (SIL+BMMC) em relação ao grupo sem tratamento (SIL 70d)

3.2. Estereologia para obtenção da densidade volumétrica dos nódulos

Com o objetivo de avaliar qual o volume do pulmão é ocupado pelos

nódulos após a indução da doença e do tratamento com as células

mononucleares, foi determinada a densidade volumétrica dos nódulos

silicóticos.

Os resultados obtidos mostraram que no grupo 70d, o volume médio

ocupado pelos nódulos correspondia a 12,9% (DP= 0,045) do pulmão,

enquanto o grupo SIL + BMMC apresentou um volume de 13,6% (DP= 0,04)

do pulmão ocupado pelos nódulos. Essa diferença representou um aumento

estatisticamente significativo de 5,4%, quando comparado com o grupo 70d

(FIGURA 20). O grupo 40d apresentou 7,3% (DP= 0,043) do volume

82

pulmonar ocupado pelos nódulos, um valor 73% menor que o grupo Sil 70d

e 83% menor que o grupo SIL + BMMC (FIGURA 20).

FIGURA 20: Representação gráfica da densidade volumétrica dos nódulos silicóticos. O grupo tratado com as células mononucleares (Sil + BMMC) apresentou um aumento de 5,4% do volume pulmonar ocupado pelos nódulos em relação ao grupo não tratado (Sili 70d), enquanto o volume ocupado pelos nódulos nos animais com 40 dias de sílica (Sil 40d) correspondeu a 7.3% dos pulmões.

4. Quantificação da celularidade no interior dos nódulos

Os resultados obtidos com a quantificação das células presentes no

interior dos nódulos revelaram que o número de células não diferiu quando

foram comparados os animais dos grupos silicótico e os animais que

receberam o transplante de células mononucleares derivadas da medula óssea

(75 ± 15 e 74 ± 17, respectivamente) (FIGURA 21)

83

CELULARIDADE NOSNÓDULOS SILICÓTICOS

SIL 70d SIL+BMMC0

25

50

75

100Q

uant

idad

e de

cel

s(n

ódul

os)

FIGURA 21: Representação gráfica da celularidade no interior dos nódulos silicóticos entre os animais tratados e não tratados. Não houve diferença sinificativa entre os dois grupos examinados.

5. Detecção e quantificação dos macrófagos pulmonares

A partir da detecção de resíduos carboidráticos na superfície dos

macrófagos pela lectina Bandeiracea Griffonia Simplicifolia e imunomarcação

da glicoproteína F4/80, essas células puderam ser quantificadas utilizando-se

um programa analisador de imagens.

5.1. Lectina Bandeiracea Griffonia Simplicifolia

A histoquímica para a lectina Griffonia biotinilada demonstrou que nos

animais silicóticos 70 dias houve reatividade para esta lectina nos macrófagos

presentes nos nódulos, como visto na FIGURA 22 A, em animal com 70 dias de

instilação. Os macrófagos alveolares presentes nas proximidades dos nódulos

84

e em alvéolos distantes também se mostravam reativos, assim como os

macrófagos intersticiais. Após o tratamento também foi verificado a presença

de macrófagos reativos dentro dos nódulos e fora destes (FIGURA 22 B).

Animais normais exibiam raros macrófagos alveolares que se mostravam

positivos para esta lectina, porém somente com marcação leve na superfície

celular (FIGURA 22 D). Animais instilados com salina que receberam

tratamento exibiam alguns macrófagos alveolares em maior quantidade que os

animais normais com uma reatividade mais intensa (FIGURA 22 C e D)

Os macrófagos foram quantificados dentro dos nódulos e nos septos

alveolares. Houve uma diminuição significativa do número de macrófagos nos

animais que receberam o transplante com as células mononucleares quando

comparados com os animais controles, tanto nos nódulos (12,4 ± 7 para 6 ±

4,4) (FIGURA 22 E), como nos septos alveolares (5 ± 4 para 3 ± 2) (FIGURA

22 F).

O grupo controle (SIL 70d) não apresentou diferenças significativas na

quantidade de macrófagos em relação ao grupo Sil 40d presentes nos nódulos

(15 ± 11) ou nos septos alveolares (6 ± 3,7) (FIGURA 22 E e F).

85

FIGURA 22: Detecção histoquímica da lectina Griffonia evidenviando a presença de macrófagos ativados e quantificação dessa população celular. Macrófagos ativados marcados pela Griffonia (setas) no interior dos nódulos silicóticos dos animais após 70 dias da instilação com a sílica (A) e nos animais tratados (B); fraca marcação para os macrófagos nos animais SAL+BMMC (C) e nos animais normais (D). Representação gráfica da quantificação de macrófagos nos nódulos (E) e nos septos (F), mostrando diminuição dessas células positivas para a lectina nos animais que receberam as células da medula. BARRAS: A, B, C e D- 100 µm

86

5.2. Glicoproteína de superfície macrofágica F4/80

Os macrófagos apresentaram fraca positividade para este antígeno

dentro dos nódulos (FIGURA 23 D), mostrando-se fortemente positivos nos

septos alveolares e espaços aéreos (FIGURA 23 A, B e C). A histomorfometria

mostrou que o número de macrófagos positivos para F4/80 foi maior (p<0.001)

nos grupos SIL 70d (10,6 ± 5,4) (FIGURA 23 B) e SIL + BMMC (15,7 ± 5)

(FIGURA 23 C e D), quando comparado com o grupo SIL 40d (5,6 ± 3,4)

(FIGURA 23 A). A diferença observada entre o grupo não tratado e o tratado

também representa um aumento significativo (10,5 ± 5,4 para 15,7 ± 5) no

número de macrófagos (p<0,0001).

87

FIGURA 23: Detecção imunohistoquímica da glicoproteína F4/80 evidenciando os macrófagos e quantificação dessa população celular. Os macrófagos apresentaram forte reatividade nos septos alveolares (setas) em todos os animais silicóticos, SIL 40d (A), SIL 70d (B) e SIL+BMMC (C), mas foram pouco reativos (setas) ou negativos no interior dos nódulos(D). Representação gráfica (E) da quantificação dos macrófagos mostrando o aumento dessa população nos animais tratados com as BMMC. BARRAS: A ;B; C e D- 30 µm.

88

6. Quantificação da sílica livre

A sílica é um material birrefringente e por isso pode ser detectada com

poloradóides associados a um microscópio FIGURA 24 (B, D e F). A partir

disso, podemos quantificar a sílica livre nos nódulos silicóticos. Os resultados

nos mostraram que houve uma diminuição significativa na quantidade de sílica

livre no interior dos nódulos dos animais do grupo SIL+BMMC (2 ± 1) (FIGURA

24 F). em relação ao grupo SIL 40d (2,7 ± 1,2) (FIGURA 24 B). Quando

comparados os animais tratados com seus respectivos controles (SIL 70d)

(FIGURA 24 D), também podemos observar uma tendencia para a diminuição

da sílica livre (2,4 ± 1 para 1,7 ± 1) (FIGURA 24 G).

89

FIGURA 24: Visualização da sílica livre com microscópio de polarlzação e quantificação da sílica. Coloração com hematoxilina e eosina das amostras dos grupos SIL 40d (A), SIL 70d (C) e SIL+BMMC (E) e respectivas imagens polarizadas (B, D e F) evidenciando a sílica livre no parênquima pulmonar. Representação gráfica da quantificação da sílica livre nos nódulos (G) mostrando uma diminuição estatística entre os grupois SIL 40d e SIL+BMMC. BARRAS: A, B, C e D-30 µm

90

7. Imunodetecção para a proteína actina alfa de músculo liso

A imunohistoquímica com anticorpo dirigido contra a proteína actina alfa

de músculo liso (α-SMa) nos permitiu avaliar se havia modificação do padrão

de expressão desta proteína nos pulmões silicóticos tratados em comparação

com os animais silicóticos.

A imunoexpressão da α-SMa era visualizada como uma rede de células,

algumas delas configurando a parede de neovasos (FIGURA 25.A, B e C). Este

achado parece indicar a presença de pericitos

Os animais sacrificados com 70 dias após a exposição à sílica

apresentaram um aumento na área positiva para α-SMa (8,8% ± 0.1 para o

grupo SIL 70d e 7,4% ± 0,8 para o grupo SIL+BMMC) (FIGURA 25.B e C) em

comparação com os animais sacrificados após 40 dias (3% ± 0,01) (FIGURA

25.A). Entretanto, quando comparamos os animais silicóticos tratados e não

tratados, não observamos diferença significativa na imunomarcação para α-

SMa (FIGURA 25 D).

91

FIGURA 25: Imunodetecção da proteína alfa actina de músculo liso (α-SMa) e quantificação da proteína. Localização da α-SMa (setas) na parede de vasos intranodulares dos animais SIL 40d (A), SIL 70d (B) e SIL+BMMC (C). Representação gráfica da quantificação da área positiva para α-SMa (D), demonstrando aumento nos animais dos grupos SIL 70d e SIL+BMMC, sem diferença estatística entre os animais tratados e não tratados. BARRAS: A, B e C- 30 µm

92

8. Detecção e quantificação das células apoptóticas

A células apoptóticas foram quantificadas a partir da detecção do DNA

fragmentado através do kit ApopTag peroxidase in situ. Os resultados

revelaram um aumento significativo (p<0,0001) na porcentagem de células

apoptóticas encontradas nos animais do grupo SIL + BMMC (7,5% ± 0,05)

(FIGURA 26 B e D) em relação aos animais do grupo SIL 70d (3,2% ± 0,02)

(FIGURA 26 A e D).

93

FIGURA 26: Detecção e quantificação das células apoptóticas no interior dos granulomas dos animais silicóticos após 70 dias de instilação com a sílica tratados e não tratados com as BMMC. Células apoptóticas (setas) nos grupos SIL 70d (A) e SIL+BMMC (B). Controle negativo da reação (C). Representação gráfica do percentual de células apoptóticas (D) aumentado no grupo SIL + BMMC. BARRAS: A, B e C- 30 µm

94

9. Detecção e quantificação da trama colagênica

A partir da técnica histoquímica para marcação de fibras colágenas pelo

corante Picrosirius red, podemos detectar e quantifificar o colágeno presente

nos nódulos e nos septos alveolares (FIGURA 27 A, B, C e D). Os resultados

revelaram que os animais do grupo SIL+BMMC apresentaram uma diminuição

significativa do conteúdo de colágeno, tanto nos nódulos (p < 0,0015) como

nos septos (p < 0,0001), quando comparados com os animais controle.

Quando analisamos o conteúdo de colágeno nos nódulos dos animais

com 70 dias de sílica (FIGURA 27 C), observamos um aumento de

aproximadamente duas vezes do que foi observado nos animais SIL 40d

(FIGURA 27 B) (26 ± 11 para 46 ± 9,6), como demonstrado na FIGURA 26 F.

Por outro lado, os animais com o mesmo tempo de evolução da doença, mas

que receberam as células derivadas da medula óssea (FIGURA 27 D),

demonstraram um conteúdo de colágeno (20 ± 5) inferior à metade do

conteúdo encontrado no grupo controle SIL 70d (46 ± 9,5), retornando a

valores próximos aos observados no momento do transplante (40d) com as

células mononucleares de medula óssea (26 ± 11) (FIGURA 27 F). Padrão

similar foi observado quando o conteúdo de colágeno foi analisado nos septos

alveolares. Entretanto, a diferença entre o grupo SIL+BMMC e seu controle

(SIL 70d) foi ainda maior, representando uma redução de aproximadamente

três vezes do observado no grupo SIL 70d (34 ± 10 para 12 ± 9) (FIGURA 27

E). Vale ressaltar que os animais controle (SAL 70d) apresentaram importante

conteúdo de colágeno nos septos alveolares (FIGURA 27 E), tal fato pode ter

95

ocorrido por aluns fatores que devem ser considerados, como a contaminação

da sílica no momento da instilação ou mesmo pela infecção dos animais

durante o tempo que permaneceram no biotério.

96

FIGURA 27: Detecção da trama colagênica e quantificação do conteúdo de colágeno. Distribuição das fibras colágenas na parede de brônquios do animal controle após 40 dias de instilação com salina (A). Deposição do colágeno nos nódulos silicóticos evidenciada em vermelho pela técnica histoquímica de picro sirius red nos animais SIL 40d (B), SIL 70d (C) e SIL+BMMC (D). Representação gráfica evidenciando menor conteúdo de colágeno nos animais do grupo SIL+BMMC em relação aos grupos SIL 70d nos septos (E) e nos nódulos (F). BARRAS: A, B, C e D- 100 µm

97

10. Ensaio bioquímico para análise da atividade da enzima

lactato desidrogenase (LDH)

A análise da atividade da LDH mostrou que não houve diferenças (p >

0,05) entre os grupos SIL 40d (1,4 ± 0,2) e SIL70d (1,4 ± 0,3). Entretanto, uma

diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) pôde ser observada quando

comparados os animais que receberam o transplante com as células e os seus

respectivos controles (SIL 70d). Observando-se um aumento (1,4 ± 0,3 para

1,8 ± 0,1) nos animais tratados com as células mononucleares (FIGURA 28).

FIGURA 28: Atividade da enzima LDH. Aumento da atividade enzimática nos animais tratados com as células mononucleares (Sil + BMMC) em relação aos demais grupos

LDH

SIL 40d SIL 70d SIL + BMMC0

1

2

Ativ

idad

e LD

Hm

mol

NA

DH

oxid

ada/

mg

prot

eìna

*

98

11. Detecção da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) no

homogenato pulmonar.

O conteúdo de neutrófilos no parênquima pulmonar foi avaliado a partir do

homogenato do tecido pulmonar através da medida da atividade da enzima

mieloperoxidase (MPO). Os resultados indicam que a inflamação induzida pela

exposição à sílica leva um aumento da atividade enzimática tanto no grupo SIL

70d como no grupo SIL + BMMC. Por outro lado, o transplante com as células

mononucleares não induziu a um maior aumento na atividade da MPO, uma

vez que não houve diferença significativa entre esses grupos (p>0,05).

FIGURA 29.

99

FIGURA 29: Atividade da enzima mieloperoxidase nos homogenatos do tecido pulmonar. Os animais silicóticos tratados e não tratados apresentam aumento significativo na atividade da MPO em relação aos animais normais. Quando comparado os dois grupos expostos à sílica, entretanto, não houve diferença na atividade enzimática.

MIELOPEROXIDASE

NORMAL

N + BMMC

SIL 70

d

SIL + B

MMC0.00

0.05

0.10

0.15A

tivid

ade

MPO

100

DISCUSSÃO

Para avaliar o efeito do transplante das células mononucleares

derivadas da medula óssea (BMMC) no processo de reparo e remodelamento

do parênquima pulmonar, utilizamos o modelo de agressão pulmonar induzida

pela instilação intratraqueal de sílica (Morgan et al, 1980; Lugano et al, 1982;

Gross et al, 1984; Allison et al, 1966; Burns et al, 1980).

Os modelos animais de silicose reproduzem a seqüência de eventos da

silicose humana (Reiser et al, 1982 e 1983; Kumar, 1989; Ohtsuka et al, 1995;

Gossart et al, 1996; Mariani et al, 1996; Weirich et al, 1996; Huaux et al, 1998 e

1999; Davis et al, 1999; Arras et al, 2001; Borges et al, 2001; Adamson et al,

1998; Piguet et al, 1994; Hubbard et al, 1989) e têm sido utilizados para a

compreensão dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos na doença.

Em camundongos, verificou-se que, dependendo da cepa, há algumas

diferenças, resultando em lesão tecidual maior ou menor, compatível com a

silicose. Callis e colaboradores (1985) avaliaram as alterações inflamatórias e

fibróticas induzidas pela instilação intratraqueal de sílica em seis diferentes

cepas de camundongos (DBA/2; Balb/c; C57BL/6; C57BL/10; C3H/He e

CBA/J). As cepas DBA/2, Balb/c, As cepas C57BL/6 e C57BL/10

demonstraram maior inflamação e fibrose em relação às outras utilizadas

nesse estudo. A grande variabilidade nas respostas inflamatória e fibrótica das

diferentes cepas sugerem que o sistema imune exerça um importante papel na

modulação da inflamação e deposição de colágeno durante a silicose. Ohtsuka

101

e colaboradores (1995), compararam a resposta inflamatória e fibrótica nas

cepas C57BL/6 e C3H/He e mostraram que os animais da cepa C57BL/6 são

mais susceptíveis à exposição da sílica. Esses animais apresentaram, tanto na

fase aguda como na fase crônica, uma maior produção e secreção de TNF-α,

importante citocina pró-inflamatória implicada na patogenia da silicose (Davis et

al, 1998(A); 1990; Piguet et al, 1990).

No nosso estudo, utilizamos camundongos C57BL/6 que receberam

dose única de 20mg de sílica. Os animais cursaram com importante infiltrado

inflamatório, lesão pulmonar intersticial e presença de nódulos

parenquimatosos. Assim como descrito na literatura, as estruturas nodulares

observadas nos animais de nosso experimento eram constituídas por células

inflamatórias mononucleares, com predominância de macrófagos (Fujimura et

al, 2000; Mossman & Churg, 1998, Davis & Gemsa. 1996), além de leucócitos

polimorfonucleares (Quinlan et al, 1995; Velan et al, 1993; Davis et al, 1981;

Reiser et al, 1983) e agregados linfocíticos na periferia dos nódulos, por vezes

localizados na parede de brônquios, formando o tecido linfóide associado aos

brônquios (BALT), já descritas como estruturas presentes no parênquima

pulmonar durante o curso da doença (Davis et al, 1993; Kumar et al, 1989;

Struhar et al, 1989). O processo inflamatório avaliado pelo percentual e pela

contagem total de células do lavado broncoalveolar não diferiu daquele descrito

na literatura, havendo aumento no número de células totais, como observado

também por Ohtsuka e colaboradores (1995) após 28 dias de sílica e Davis e

colaboradores (1999), onde a contagem total de células presentes no BAL

aumentou duas vezes após duas semanas e três vezes após 16 semanas. No

nosso estudo, o aumento no número de células totais no BAL resultou

102

principalmente do aumento percentual de células mononucleares, também visto

por Davis e colaboradores (1998B e 1999) e células polimorfonucleares, como

já demonstrado anteriormente (Davis et al, 1998B; Adamson & Bowden, 1984).

Sabe-se que muitas citocinas participarem da patogênese da silicose,

entre elas podem ser destacadas a IL-1 β e o TNF-α, que exercem papel

fundamental na fibrogênese e no recrutamento de células inflamatórias (Davis

et al, 1998A e 1993; Mossman & Churg, 1998; Piguet et al, 1990). Srivastava e

colaboradores (2002) demonstraram uma relação entre o desenvolvimento dos

nódulos silicóticos e citocinas pró-inflamatórias. Utilizando animais

nocauteados para a interleucina-1β (IL-/-) expostos à sílica, os autores

observaram uma diminuição significativa no tamanho dos nódulos silicóticos,

que foi acompanhada da incapacidade desses animais em desenvolverem

resposta inflamatória. Os resultados desse estudo sugerem a participação

desta interleucina no recrutamento de células inflamatórias durante a formação

dos nódulos silicóticos. Ohtsuka e colaboradores (1995), observaram uma

maior resposta inflamatória e fibrótica em animais de diferentes cepas após a

exposição à sílica e atribuíram esses resultados a maior produção e secreção

de TNF-α apresentada por esses animais, tanto na fase aguda (2 dias após a

instilação de sílica), como na fase crônica (28 dias após a instilação de sílica).

Além disso, tem sido demonstrada a importância da quimiocina SDF-1

na quimioatração de progenitores hematopoéticos através da interação com

seu receptor CXCR4 (Aiuti et al, 1997; Zou et al, 1998). O eixo SDF-1/CXCR4

também está envolvido no recrutamento de células mesenquimais derivadas da

medula óssea e de progenitores endoteliais para os sítios de lesão,

103

participando do reparo do tecido lesado (Imitola et al, 2004; Abbott et al, 2004;

Yamaguchi et al, 2003; Kollet et al, 2001).

No nosso estudo, observamos que o grupo SIL+BMMC evidenciava o

mesmo padrão de resposta tecidual que os animais silicóticos não tratados,

porém, nesses animais, foi evidenciado que os nódulos parenquimatosos

apresentavam áreas maiores, ocupando um maior volume pulmonar. Uma vez

que, na análise descritiva, esses nódulos se mostravam aparentemente mais

celulares, o aumento da área dos nódulos parenquimatosos poderia ser

explicado pelo maior recrutamento celular acarretado pela instilação de células

da medula óssea. Além disso, foi demonstrado recentemente que o mesmo tipo

celular utilizado no nosso modelo, quando submetido a condições de hipóxia

em cultura, expressa genes envolvidos com uma resposta pró-inflamatória e

quimiotática, incluindo o gene da IL-1α (Ohnishi et al, 2007). Entretanto, os

nossos resultados mostraram que não houve diferença na celularidade

presente nos nódulos dos animais que receberam o transplante, indicando que

o aumento na área dos nódulos não foi decorrente do aumento na quantidade

de células para essa região, muito embora esses resultados possam não ter

sido significativos pela nossa amostragem. Portanto, se não houve modificação

do número de células nos nódulos, o aumento dessas estruturas pode ter sido

conseqüente a um infiltrado de células que, do ponto de vista morfológico, são

aparentemente maiores nos animais que receberam a infusão de células

mononucleares da medula óssea. Quanto ao significado do maior tamanho

celular, ela pode estar relacionada com um maior metabolismo celular tendo

em vista que o nível de LDH no homogenato pulmonar é maior que o visto nos

animais silicóticos.

104

As principais células encontradas nos nódulos silicóticos dos animais

tratados e não tratados, foram os macrófagos. Acredita-se que essas células

sejam a célula-chave na silicose, uma vez que macrófagos residentes nos

espaços alveolares, além de uma população adicional recrutada para esta

região, demonstram íntimo contato com a sílica durante a sua deposição, bem

como durante o período em que a partícula permanece no pulmão (Davis,

1986). Após a fagocitose da sílica, os macrófagos tornam-se ativados, atraindo

neutrófilos, que por sua vez promovem alveolite e destruição tecidual

(Mossman & Churg, 1998; Fujimura, 2000).

Para verificar a modulação dessa população celular após o transplante

com as células mononucleares de medula óssea, utilizamos o anticorpo dirigido

contra a glicoproteína F4/80. Esse anticorpo foi descrito por Austyn & Gordon

(1981), que demonstraram sua especificidade para camundongos. Os autores

observaram que o anticorpo mostrou-se reativo para macrófagos de diferentes

regiões, como a cavidade peritoneal, pulmão, baço, timo, além de monócitos

sanguíneos e macrófagos derivados de precursores de medula óssea em

cultura. Em nossos experimentos, verificamos que todos os grupos de animais

silicóticos apresentaram macrófagos positivos para a molécula F4/80,

entretanto, os macrófagos intragranulomatosos apresentaram-se fracamente

reativos ou negativos. Esses achados são consistentes com os de Ezekowitz &

Gordon (1982), onde macrófagos peritoneais ativados pelo BCG (bacilo de

Calmette-Guérin) apresentaram diminuição de 50-80% na expressão desse

receptor, enquanto os níveis de Mac-1 permaneceram estáveis. Uma possível

explicação para os nossos achados, seria a presença de uma nova população

de macrófagos recrutados para o sítio de lesão (nódulos) durante a inflamação,

105

uma vez que se sabe que macrófagos menos maduros expressam níveis

menores de F4/80 e de outros marcadores de superfície (Hirsch et al, 1981).

Com isso, o aumento da população F4/80+ nos animais do grupo SIL+ BMMC,

favorece a hipótese do recrutamento de células progenitoras para os nódulos

silicóticos após o transplante. Além disso, uma vez que os macrófagos estão

envolvidos de maneira importante no clearance da partícula de sílica

depositada no tecido pulmonar através da fagocitose da sílica (Brody et al,

1982; Davis, 1986), o aumento das células F4/80+ presentes nos septos

alveolares dos animais que receberam o transplante com as BMMC, sugere a

presença de macrófagos maduros nessa região, que podem estar migrando

para o interstício, transportando a partícula de sílica fagocitada. No interstício,

os macrófagos podem atingir os vasos linfáticos e posteriormente os

linfonodos, como proposto por Harmsen e colaboradores (1985) e Lee e

colaboradores (1981) como uma das possíveis vias de clearance da sílica.

Outras vias também já foram propostas com relação ao destino das partículas

de sílica. Lee & Kelly (1993) demonstraram que os macrófagos alveolares

deslocam-se para o tecido linfóide associado aos brônquios (BALT), seguindo

para os vasos linfáticos peribrônquicos ou para as vias aéreas, com

subseqüente clearance pelo sistema mucociliar. Já foi demonstrado que o

BALT é o maior sítio de retenção de macrófagos alveolares nos pulmões (Lee

et al, 1986; Brundelet et al, 1965; Green, 1971).

Para avaliar se os macrófagos pouco reativos / negativos para F4/80

estariam ativados, utilizamos a técnica de histoquímica para detecção da

lectina Griffonia simplicifolia isoagglutinin. Muitos ligantes para lectinas estão

expressos na superfície de macrófagos, incluído os macrófagos alveolares

106

(Saunders et al, 1987; Christiansen et al, 1988; Kreipe et al, 1986), o que

possibilita a utilização das lectinas na identificação de diferentes sub-

populações de macrófagos (Meyer et al, 1993). Além disso, sabe-se que um

importante aspecto das alterações funcionais dos macrófagos durante a sua

resposta metabólica está relacionado com a sua ativação, diferenciando-os de

seus equivalentes normais (Morland & Kaplan, 1977). A lectina Griffonia liga-se

especificamente a resíduos α-D galactose (Maddox et al, 1982), radicais

carboidráticos presentes na superfície de macrófagos, que estão associados de

maneira mais específica com macrófagos ativados (Tabor et al, 1989). Esses

achados são consistentes com os de Maddox e colaboradores (1982), que

demonstraram reatividade para esta lectina somente em macrófagos ativados,

utilizando macrófagos peritoneais em cultura. Outros autores (Sorokin & Hoyt,

1992), demonstraram que macrófagos alveolares de ratos também se

mostraram reativos para a Griffonia durante o desenvolvimento, o que não foi

demonstrado na fase pós-natal. No nosso estudo, observamos que os animais

do grupo SIL+BMMC apresentaram macrófagos positivos para Griffonia no

interior dos nódulos e nos septos alveolares, entretanto em ambas as regiões o

número de macrófagos positivos foi menor nos animais do grupo SIL+BMMC

em relação ao grupo SIL 70d.

Em conjunto, os achados indicam que nos animais do grupo SIL+BMMC,

a maior quantidade de macrófagos positivos para F4/80, porém com menor

positividade para a Griffonia nos septos alveolares, sugere que esses

macrófagos, após a fagocitose da sílica nos nódulos, onde se encontram

ativados, migram para o interstício em direção aos linfáticos, promovendo o

clearance da sílica e durante esse processo perde sua ativação. Embora, nos

107

nossos experimentos, a sílica livre encontrada nos nódulos silicóticos dos

animais tratados não tenha apresentado diferença estatisticamente significativa

em relação aos seus controles (SIL 70d), houve uma tendência importante para

sua diminuição, o que seria consistente com a nossa hipótese.

No interior dos nódulos, os achados também indicam que, apesar de

negativos para F4/80, os macrófagos encontram-se ativados, embora em

menor número nos animais que receberam o transplante com as células de

medula. Esses resultados estão em concordância com aqueles encontrados

nos septos alveolares, suportando a hipótese de que esta população tenha sido

a responsável pela translocação das partículas de sílica para o interstício septal

e posteriormente para os linfonodos drenantes, o que também estaria de

acordo com a tendência na diminuição da quantidade de sílica livre no interior

dos nódulos silicóticos dos animais tratados. Por outro lado, esses macrófagos

intranodulares podem ter sido alvo de morte por apoptose durante o período

examinado, levando a um menor número dessa subpopulação. Essa hipótese é

consistente com alguns estudos onde foi demonstrado que a interação entre os

macrófagos e as partículas de sílica induz a apoptose dessas células pela via

Fas/FasL (Borges et al, 2001 e 2002).

A patogênese da silicose depende do mecanismo de morte do

macrófago, se por necrose e/ou apoptose. Embora já tenha sido demonstrado

que a sílica causa morte celular por necrose (Carter & Driscoll, 2001: Porter et

al, 2002), existem evidencias de que a sílica também possa levar a apoptose

através da ativação de caspase. A participação da caspase na inflamação e na

apoptose induzida pela sílica tem sido investigada em experimentos in vitro e in

vivo, em macrófagos humanos (Iyer et al, 1996) e murinos (Sarih et al, 1993).

108

Iyer & Holian (1997), utilizando um inibidor específico de caspase 3,

confirmaram a participação dessa enzima na apoptose induzida pela sílica em

macrófagos alveolares humanos. Além disso, também foi demonstrado que a

atividade da caspase é mediada pela interação entre a partícula de sílica e o

receptor scavenger (SR) de classe A (SR-A). Essa interação foi capaz de

promover apoptose de uma linhagem de macrófagos alveolares murinos (Chao

et at, 2001). Outros autores, entretanto, descreveram que a ativação da

caspase também pode ser induzida pela formação de espécies reativas de

oxigênio (ROS) levando a apoptose de macrófagos alveolares (Shen et al,

2001; Fubini & Hubbard, 2003). Shen e colaboradores (2001) mostraram que a

utilização de agentes antioxidantes levou a uma diminuição nos níveis de ROS

e à inibição da ativação de caspase 3, protegendo o tecido pulmonar da

apoptose induzida pela sílica. Nesse estudo, foi observado que a ativação da

caspase 3 e a fragmentação do DNA foram precedidas por um aumento na

formação de ROS, sugerindo que o estresse oxidativo possa atuar como um

fator indutor da apoptose de macrófagos alveolares induzida pela sílica. Outros

autores demonstram a participação da via Fas/FasL na indução da apoptose

após exposição à sílica (Borges et al, 2001 e 2002). Os macrófagos

apoptóticos liberam fatores quimiotáticos para neutrófilos, que por sua vez

podem fagocitar células mortas e perpetuar a resposta inflamatória. O conjunto

desses experimentos sugere um papel importante do mecanismo de apoptose

na patogênese da silicose, participando, seja da resolução da inflamação

através da eliminação das células lesadas, seja na perpetuação do processo

inflamatório por exercer quimiotaxia e atrair mais macrófagos alveolares para

as vias aéreas (Thibodeau et al, 2003),

109

Borges e colaboradores (2002) mostraram que há um aumento na

quantidade de células apoptóticas do infiltrado inflamatório presente no

parênquima pulmonar de camundongos expostos à sílica. Entretanto, no

presente estudo, observamos que os animais silicóticos tratados com as

BMMC apresentaram maior índice de apoptose das células inflamatórias em

relação ao grupo controle. O aumento da apoptose no grupo SIL+BMMC pode

ter sido conseqüente ao possível aumento na expressão do gene da IL-1 nas

células mononucleares de medula (Ohnishi et al, 2007) transplantadas nos

animais silicóticos, uma vez que Srivastava e colaboradores (2002)

demonstraram que a apoptose induzida pela sílica depende da liberação de NO

(óxido nítrico), que é mediada pela IL-1. A relação entre IL-1 e apoptose já foi

demonstrada em células glomerulares (Yokoo & Kitamura, 1997), células

pancreáticas (Ankarcrona et al, 1994) e fibroblastos (Zhang et al, 1997), após

resposta inflamatória induzida por lesão.

Sabe-se que na silicose há grande influxo de neutrófilos para os sítios de

lesão, que ocorre em resposta aos fatores liberados pelos macrófagos ativados

após a fagocitose da partícula de sílica (Mossman & Churg, 1998; Fugimura,

2000). O recrutamento de neutrófilos para um determinado tecido após a

inflamação pode ser determinado pela detecção da atividade da enzima

mieloperoxidase (MPO), que está presente nos seus grânulos e é específica

desse tipo celular (Schneider & Issekutz, 1996). Muitos estudos têm utilizado

esse método para avaliar o aumento ou diminuição na quantidade de

neutrófilos após a resposta inflamatória (Cuzzocrea et al, 1999; Guo et al,

2002). O influxo de neutrófilos leva a uma importante citotoxicidade, que cursa

com alveolíte, destruição do tecido conectivo (Fugimura, 2000) e conseqüente

110

aumento nos níveis da enzima lactato desidrogenase (LDH) (Zhang, 2000C). A

atividade da LDH é amplamente utilizada para avaliar o grau de lesão tecidual

em estudos in vitro e in vivo (Hubbs et at, 2001; Johnston et al, 2000; Grant,

1992). No nosso estudo, a análise dessa enzima revelou que houve um

aumento na sua atividade quando comparado o grupo tratado (SIL + BMMC)

com seu respectivo controle (SIL 70d). Uma vez que no nosso experimento foi

verificada a atividade desta enzima a partir do homogenato do pulmão, não

podemos inferir com certeza a sua origem. Ela poderia ter sido liberada de

dentro das células quando da preparação do ensaio devido a um aumento do

metabolismo celular das populações presentes no pulmão silicótico tratado,

mas também poderia ter sido originada do meio extracelular, uma vez haver

evidencias de que há atividade de destruição celular mesmo após meses da

instilação de sílica (Porter et al, 2002; Johnston et al, 2000; Davis et al, 1998B).

Entretanto, a atividade da MPO não diferiu entre os grupos tratado e não

tratado, indicando que não houve maior influxo de neutrófilos nos animais que

receberam o transplante com as BMMC. Esses achados favorecem a

possibilidade de que o aumento nos níveis de LDH tenha sido conseqüente ao

aumento do metabolismo das células pulmonares dos animais tratados, uma

vez que provavelmente não tenha ocorrido por maior citotoxicidade induzida

pelos neutrófilos.

A medula óssea é um importante reservatório de células tronco /

progenitoras e muitos estudos têm demonstrado que células derivadas da

medula óssea migram para o pulmão após a lesão tecidual, podendo se

diferenciar em células epiteliais alveolares (Albera et al, 2005; Ortiz et al, 2003;

Krause et al, 2001; Kotton et al, 2001), participando do processo de reparo do

111

tecido pulmonar (Shigemura et al. 2006; Ishizawa et al. 2004 e Krause et al.

2001)

No nosso estudo, foi utilizada a fração de células mononucleares da

medula óssea (BMMC). As BMMC têm sido amplamente utilizadas em modelos

animais e em ensaios clínicos em humanos, principalmente na medicina

cardiovascular (Florian et al, 2007; Lunde et al, 2006; Perin et al, 2004; Strauer

et al, 2002), promovendo angiogênese através da liberação de fatores

angiogênicos e estimulação de progenitores endoteliais (Kamihata et al, 2001;

Imada et al, 2005; Walter et al, 2005; Li et al, 2005; Zentilin et al, 2006).

No tecido pulmonar, Yuhgetsu e colaboradores (2006) demonstraram

que o transplante autólogo de células mononucleares através dos brônquios

principais de coelhos, foi capaz de promover uma melhora funcional

significativa do enfisema induzido pela elastase. Abe e colaboradores (2003)

transplantaram células mononucleares derivadas da medula óssea de

camundongos transgênicos que expressavam GFP (green fluorescent protein)

em camundongos irradiados e não irradiados. Os resultados mostraram que,

no pulmão dos animais irradiados, 45% das células foram derivadas dos

animais doadores (GFP).

Além do efeito terapêutico das células mononucleares derivadas da

medula, tem sido demonstrado que esta fração de células da medula óssea

contém uma sub-população denominada células - tronco mesenquimais

(MSCs) (Ohnishi et al, 2007). As MSCs podem se diferenciar em múltiplas

linhagens originando diferentes tecidos (Pountos & Giannoudis, 2005; Pittenger

et al, 1999) e parecem participar do reparo do tecido pulmonar (Ortiz et al,

2003; Yamada et al, 2004).

112

Após administração sistêmica em camundongos irradiados, as MSC

foram capazes de originar hepatócitos, células tubulares renais, células

epiteliais bronquiolares, miofibras de tecido conectivo e células com

características miofibroblásticas (Anjos-Afonso et al, 2004). Wang e

colaboradores (2005) também demonstraram que as MSC apresentarem

marcadores específicos de células epiteliais (CK-18) e morfologia epitélio-simile

quando cultivadas juntamente com células epiteliais pulmonares isoladas de

pacientes com fibrose cística.

No pulmão, foi demonstrado que a administração de MSC em

camundongos após instilação intratraqueal de BLM protege o tecido pulmonar

da lesão induzida pela droga, com significativa redução da inflamação,

deposição de colágeno e ativação de metaloproteinases (Ortiz et al, 2003).

Estudos recentes vêm abordando a complexa relação entre lesão

pulmonar e o reparo, indicando a existência de células progenitoras que podem

ser mobilizadas para a circulação, denominadas de fibrócitos

(colágeno+/vimentina+/CD34+), que, ao chegar nos sítios de lesão pulmonar,

são capazes de extravasar para o pulmão e participar do reparo tecidual em

conjunto com as células mesenquimais pulmonares residentes (Schmidt et al,

2003; Phillips et al, 2004). Em outros estudos, foi demonstrado que, após

migrarem para os sítios de lesão, essas células podem se diferenciar em

miofibroblastos (Phillips et al, 2004; Metz, 2003; Abe et al, 2001; Bucala et al,

1994).

Os miofibroblastos estão associados com os processos

fibroproliferativos, como ocorre na fibrose renal e pulmonar. São importantes

fontes de citocinas e de componentes da matriz extracelular (MEC), que são

113

fundamentais para o desenvolvimento da fibrose (Kuhn & Mac Donald, 1991;

Skalli et al, 1989; Desmouliere, 1995). As doenças fibróticas características do

pulmão apresentam miofibroblastos ativados que expressam alfa-actina de

músculo liso (α-SMa) (Kuhn & MacDonald, 1993; Zhang et al, 1994B), um

importante marcador desse tipo celular (Gabbiani et al, 1981). Na fibrose

pulmonar induzida pela bleomicina (BLM), por exemplo, foi demonstrado que

ocorre aumento no número de miofibroblastos (Vyalov et al, 1993; Woodcock-

Mitchell et al, 1984) expressando α-SMa e alguns estudos indicam que esses

miofibroblastos são os responsáveis pelo aumento na produção de colágeno

durante a fibrose induzida pela BLM (Zhang et al, 1994 A e B). Na doença

granulomatosa induzida pela sílica, Mariani e colaboradores (1996)

demonstraram que as células responsáveis pelo aumento na expressão de

procolágeno do tipo I foram negativas para α-SMa. Nesse estudo, a

imunomarcação para α-SMa indicou que a instilação de sílica teve um pequeno

ou nenhum efeito sobre o número de células expressando essa proteína. Em

outro estudo, os mesmos autores demonstraram que no interior dos nódulos

silicóticos houve aumento nos níveis de TNF-α secretado por macrófagos,

atribuindo a inibição do gene da proteína α-SMa a ação do TNF-α (Mariani et

al, 1999). Com isso, os autores sugerem que a fibrose desenvolvida no interior

dos nódulos silicóticos não depende de células que expressam α-SMa

(miofibroblastos).

No nosso estudo houve aumento na expressão da α-SMa observado

tanto nos animais SIL+BMMC, como nos animais SIL 70d em relação ao

animais do grupo SIL 40d. As células imunoreativas para a α-Sma parecem

estar relacionadas à parede de vasos neoformados, presentes dentro dos

114

granulomas silicóticos e não a células miofibroblásticas como vistas em outros

modelos de fibrose (Kuhn & MacDonald, 1993; Zhang et al, 1994B), estando

em concordância com os achados de Mariani e colaboradores (1996). É bem

conhecido o fato de alguns tipos de formações granulomatosas podem

apresentar vasos em seu interior (Russo et al, 2005; Walsh et al, 1997; Van de

Vijver et al, 2006). Na silicose, até onde pudemos verificar, não há relatos

sobre angiogênese no interior dos granulomas. Para ratificação desta hipótese

seria necessária a investigação por meio de marcadores endoteliais e de

fatores pró-angiogênicos da presença de um aumento do número de vasos

durante o desenvolvimento da silicose, aspecto a ser desenvolvido

posteriormente.

Sabe-se que a silicose tem início com um processo inflamatório

destrutivo ao tecido, levando ao reparo tecidual e fibrose como resultado do

acúmulo de células mesenquimais e grande produção e deposição de

colágeno, que se organiza centralmente aos agregados de linfócitos e

macrófagos (Mossman et al. 1998; Fujimura, 2000; Davis, 1986; Zhang & Phan,

1996). Com a evolução da doença, citocinas derivadas de macrófagos, como

TNF-α (Young, 1996; Billiau, 1996), TGF-β (Broekelmann et al. 1991) e IL-1

(Zhang et al. 1993) estimulam a proliferação progressiva local de fibroblastos e

o aumento na deposição de colágeno, que se torna concêntrico (Mossman et

al1998). MMP-9 e MMP-2, bem como outras MMPs, participam do processo de

remodelamento do tecido pulmonar, onde é necessário um balanço entre a

síntese a degradação dos componentes de matriz extracelular (Ward &

Hunninghake, 1998). Entretanto, a exposição à partícula de sílica leva a um

exagerado remodelamento, com aumento na degradação da matriz lesada e

115

aumento na síntese de colágeno, levando a uma progressiva resposta fibrótica.

Nesse contexto, vários autores já demonstraram que durante a silicose ocorre

um aumento nos níveis tanto de MMP-2 como de MMP-9 (Scabilloni et al,

2005; Yatera et al, 2001; Pardo et al, 1999; Perez-Ramos et al, 1999) como

resultado do processo fibrótico.

No nosso estudo, foi observada uma diminuição importante do conteúdo

de colágeno, tanto no interior dos nódulos silicóticos como nos septos

alveolares dos animais que receberam as BMMC. Além disso, também

observamos que essa diminuição não foi acompanhada de uma alteração na

expressão de α-SMa intranodular nesses animais. Esses achados corroboram

a hipótese de que na silicose a população de células ativadas no interior dos

nódulos não requer células com características de miofibroblastos, ao contrário

de outras doenças fibróticas do pulmão (Mariani et al, 1996).

A diminuição no conteúdo de colágeno, observada nos animais do

grupo SIL+ BMMC, é consistente com os achados de Ortiz e colaboradores

(2003), que demonstraram em camundongos expostos à BLM (14 dias), uma

redução importante na deposição de colágeno após o transplante de MSC

realizado concomitante à exposição da droga. Além disso, os autores também

encontraram redução na expressão das MMP (metaloproteinases) -2 e MMP-9.

A diminuição dessas MMPs também foi associada a redução no conteúdo de

colágeno nas áreas de infarto do miocárdio induzido em ratos que receberam

células derivadas da medula óssea (MSC) sacrificados após 6 semanas do

transplante (Wang et al, 2006). Os autores sugeriram que a redução do

remodelamento ventricular após o transplante com MSC foi mediada pela

diminuição na expressão das MMPs. Além disso, Xu e colaboradores (2005),

116

demonstraram que MSC transplantadas em ratos após infarto do miocárdio

atenuou o remodelamento da MEC. Nesse estudo, os autores encontraram

diminuição na expressão de colágeno tipo I e III, bem como nas expressões de

MMP-1 e TIMP-1

O conjunto de nossos resultados sugere que a diminuição do conteúdo

de colágeno nos animais silicóticos que receberam a medula óssea pode

representar um efeito protetor no tecido pulmonar, indicando que esses animais

apresentam um aspecto de ativação ou incremento do remodelamento tecidual.

Isto poderia ser benéfico se estas modificações forem realmente levar a

destruição das formações granulomatosas para o retorno da arquitetura

pulmonar. Esta hipótese só poderá ser provada se mantivermos animais

silicóticos tratados e não tratados por pelo menos 90 dias e após esse período

verificar, por estudo histológico, se houve ou não retorno da arquitetura

pulmonar. Outra possibilidade é avaliar a função pulmonar por estudo da

mecânica ventilatória destes animais.

117

CONCLUSÕES

Nossos resultados demonstraram que a infusão sistêmica de células

mononucleares derivadas da medula óssea (BMMC) em animais silicóticos

parece não impedir o desenvolvimento dos granulomas, porém sugere uma

proteção da lesão induzida pela sílica no tecido pulmonar, pela importante

diminuição do conteúdo de colágeno depositado durante o reparo tecidual.

Nossos resultados sugerem que na fibrose induzida pela silicose, as

células responsáveis pela síntese de colágeno não expressam a proteína

alfa actina de músculo liso e que a infusão sistêmica de células


não modifica a expressão desta proteína.



parece modular a inflamação pulmonar levando ao aumento da celularidade

vista no BAL sem modificação da contagem diferencial celular quando

comparados com os animais silicóticos (SIL 70)

Nossos resultados sugerem que a infusão sistêmica de células


modula os granulomas silicóticos que se tornam significativamente maiores,

118

sem aumento da celularidade ou de sílica livre e com aumento do número

de células apoptóticas. Estes resultados corroboram o achado histológico

de que os macrófagos intranodulares são maiores que os vistos nos animais

não tratados e, portanto, podem ser os responsáveis pelo aumento do

volume destas estruturas.

Nossos resultados sugerem que a infusão sistêmica de células


modula a população macrofágica pulmonar havendo diminuição da

população Griffonia+ tanto intranodular quanto septal e com aumento da

população macrofágica F4/80+ septal.



parece não modificar o padrão de infiltração de células polimorfonucleares

no parênquima pulmonar nos animais tratados, como observado na análise

da atividade da mieloperoxidase.

Nossos resultados sugerem que a infusão sistêmica de BMMC em

animais silicóticos leva a aumento da atividade do LDH.

119

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abbott JD, Huang Y, Liu D, Hickey R, Krause DS, Giordano FJ, 2004. Stromal cell-derived factor-1alpha plays a critical role in stem cell recruitment to the heart after myocardial infarction but is not sufficient to induce homing in the absence of injury. Circulation, Nov 23;110(21):3300-5. Abe R, Donnelly SC, Peng T, Bucala R, Metz CN, 2001. Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites. J. Immunol. 166:7556–7562. Abe, S; G. Lauby; C. Boyer; SI, Rennard; JG, Sharp, 2003. Transplanted BM and BM side population cells contribute progeny to the lung and liver in irradiated mice. Cytotherapy, Dec 5(6): 523 – 33 Adamson IYR & Bowden DH, 1980. Role of monocytes and interstitial cells in the generation of alveolar macrophages. II. Kinetic studies after carbon loading. Lab Invest; 42: 518–524. Adamson IYR, Prieditis H, Bowden DH, 1992. Instillation of Chemotactic Factor to Silica-Injected Lungs Lowers Interstitial Particle Content and Reduces Pulmonary Fibrosis. Am J Pathol 141:319-326. Adamson, IY & Bowden DH. 1974; The type 2 cell as progenitor of alveolar epithelial regeneration. A cytodynamic study in mice after exposure to oxygen.. Lab Invest 30: 35-42 Adamson, IY & Prieditis H, 1998. Silica deposition in the lung during epithelial injury potentiates fibrosis and increases particle translocation to lymph nodes. Exp. Lung Res. 24:293-306. Aiuti A, Webb IJ, Bleul C, 1997. The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34 hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34 progenitors to peripheral blood. J Exp Med;185:111–120.

120

Albera C, Polak JM, Janes S, Griffiths MJ, Alison MR, Wright NA, Navaratnarasah S, Poulsom R, Jeffery R, Fisher C, Burke M, Bishop AE, 2005. Repopulation of human pulmonary epithelium by bone marrow cells: a potential means to promote repair. Tissue Eng, 11:1115-1121. Albert RK, Embree LJ, McFeely JE, Hickstein DD, 1992. Expression and function of β2-integrins on alveolar macrophages from human and nonhuman primates. Am Rev Respir Dis; 7: 182–189. Allison AC, Harington JS, Birbeck M, 1966 An examination of the cytotoxic effects of sílica on macrophages. J Exp Med 124: 141- 54 Anderson CL & Looney RL, 1986. Human leucocyte IgE Fc receptors. Immunol Today; 7: 264–271. Angel, P. & M. Karin, 1991. The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell proliferation and transformation. Biochim Biophys Acta 1072:129–157. Anjos-Afonso F, Siapati EK, Bonnet D. 2004. In vivo contribution of murine mesenchymal stem cells into multiple cell-types under minimal damage conditions J Cell Sci. 117(Pt 23):5655-5664. Arras, M; Huaux, F; Vink, A; Delos, M; Coutelier, JP; Many, MC; Barbarin, V; Renauld, JC; Lison D, 2001. Interleukin-9 reduces lung fibrosis and type 2 immune polarization induced by silica particles in a murine model. Am J Respir Cell Mol Biol. 24:368-375. Arredouani M, Yang Z, Ning Y, Qin G, Soininen R, Tryggvason K, Kobzik L. 2004. The scavenger receptor MARCO is required for lung defense against pneumococcal pneumonia and inhaled particles. J. Exp. Med. 200:267–272. Arredouani MS, Yang Z, Imrich A, Ning Y, Qin G, Kobzik L, 2006. The macrophage scavenger receptor SR-AI/II and lung defense against pneumococci and particles. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35:474–478. Asahara, T., Masuda, H; Takahashi, T; Kalka, C; Pastore, C; Silver, M; Kearne, M; Magner, M; Isner, J; 1999. Bone Marrow Origin of Endothelial Progenitor Cells Responsible for Postnatal Vasculogenesis in Physiological and Pathological Neovascularization. Circ. Res 85: 221 - 228.

121

Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, Van der Zee R, Li T, Witzenbichler B, Schatteman G, Isner JM. 1997. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science;275:964– 967 Aso, Y, Yoneda, K. Kikkawa, Y. 1976. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab. Invest. 35: 558-568. Assmus B, Honold J, Schachinger V, Britten MB, Fischer-Rasokat U, Lehmann R, Teupe C, Pistorius K, Martin H, Abolmaali ND, Tonn T, Dimmeler S, Zeiher AM. 2006. Transcoronary transplantation of progenitor cells after myocardial infarction. N Engl J Med. 355:1222-32 Atzori L, Chua F, Dunsmore SE, Willis D, Barbarisi M, McAnulty RJ, Laurent G. J., 2004 Attenuation of bleomycin induced pulmonary fibrosis in mice using the heme oxygenase inhibitor Zn-deuteroporphyrin IX-2,4-bisethylene glycol. Thorax 59:217-223. Aust L, Devlin B, Foster SJ, Halvorsen YD, Hicok K, du Laney T, Sen A, Willingmyre GD, Gimble JM., 2004. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy 6:7–14. Austyn JM & Gordon S, 1981. Expression of the macrophage-specific antigen F4/80 during differentiation of mouse bone marrow cells in culture. J Exp Med. Sep 1;154(3):713-25. Bang OY, Lee JS, Lee PH, Lee G: 2005. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients. Ann Neurol 57:874-882 Barbarin V, Arras M, Misson P, Delos M, McGarry B, Phan SH, Lison D, Huaux F., 2004. Characterization of the effect of interleukin-10 on silica-induced lung fibrosis in mice Am J Respir Cell Mol Biol. 31:78-85 Barbarin V, Nihoul A, Misson P, Arras M, Delos M, Leclercq I, Lison D, Huaux F, 2005. The role of pro- and anti-inflammatory responses in silica-induced lung fibrosis. Respir Res. 6:112 Barbash IM, Chouraqui P, Baron J, Feinberg MS, Etzion S, 2003. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation 108: 863–868.

122

Bardales, RH., SS. Xie, RF. Schaefer, SM. Hsu. 1996. Apoptosis is a major pathway responsible for the resolution of type II pneumocytes in acute lung injury. Am. J. Pathol. 149:845–852. Baron MH. 2003. Embryonic origins of mammalian hematopoiesis Exp. Hematol. 31: 1160-69 Barth, PJ & Muller, B. 1999. Effects of nitrogen dioxide exposure on Clara Effects of nitrogen dioxide exposure on Clara cell proliferation and morphology. Pathol Res Pract., 195(7): 487-93. BeruBe, K. A., T. R. Quinlan, G. Moulton, D. Hemenway, P. O’Shaughnessy, P. Vacek, and B. T. Mossman. 1996. Comparative proliferative and histopathologic changes in rat lungs after inhalation of chrysotile or crocidolite asbestos. Toxicol. Appl. Pharmacol. 137:67–74 Bianco P & Gehron Robey P., 2000. Marrow stroma stem cells. J Clin Invest 105: 1663-68 Bianco, P., FD Cancedda, M Riminucci, R Cancedda. 1998. Bone formation via cartilage models: the "borderline" chondrocyte. Matrix Biol, 17: 185-92. Bianco, P; Riminucci, M; Gronthos, S; Robey, PG. 2001. Bone Marrow Stromal Stem Cell: Nature, biology and potential Applications. Stem Cells 19:180-192 Billiau, A. 1996. Interferon-gamma: biology and role in pathogenesis. Adv. Biol. 54, 407–413. Blas van Oud Alblas & A., Van Furth, R, 1982. The origin of pulmonary macrophages. Immunobiology 161, 186–192 Blusse van Oud Albas A, van der Linden-Schrever B, van Furth R. 1983. Origin and kinetics of pulmonary macrophages during an inflammatory reaction induced by intraalveolar administration of aerosolized heat-killed BCG. Am Rev Respir Dis; 128: 276–281. Blusse van Oud Albas A, van Furth R. 1979. Origin, kinetics and characteristics of pulmonary macrophages in the normal steady-state. J Exp Med; 149: 1504 – 1518.

123

Borges VM, Falcao H, Leite-Junior JH, Alvim L, Teixeira GP, Russo M, Nobrega AF, Lopes MF, Rocco PM, Davidson WF, Linden R, Yagita H, Zin WA, DosReis GA., 2001. Fas ligand triggers pulmonary silicosis J Exp Med. 194:155-64 Borges VM, Lopes MF, Falcao H, Leite-Junior JH, Rocco PR, Davidson WF, Linden R, Zin WA, Dos Reis GA, 2002. Apoptosis underlies immunopathogenic mechanisms in acute silicosis Am J Respir Cell Mol Biol.27:78-84 Borthwick DW, Shahbazian M, Krantz QT, Dorin JR, Randell SH. 2001. Evidence for stem-cell niches in the tracheal epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol. 24: 662–670. Brain JD, 1992 Mechanisms, measurement, and significance of lung macrophage function. Environ. Health Perspect. 97, 5–10. Brazelton, T. R., Fabio M. V. Rossi, Gilmor I. Keshet, Helen M. Blau, 2000. From Marrow to Brain: Expression of Neuronal Phenotypes in Adult Mice. Science 290: 1775 - 1779. Brody ARM, Roe MW, Evans JN, Davis GS, 1982. Deposition and translocation of inhaled silica in rats. Lab Invest 47: 533-542. Broekelmann TJ; A H, Liper; T V, Colby. J A, Mac Donald, 1991. Transforming growth factor beta 1 is present at sites of extracellular matrix gene expression in human pulmonary fibrosis. Proc Natl Acad Sci USA 88: 6642-6646 Bruder, SP & Caplan, AI. 1989 (B). Discrete stages within the osteogenic lineage are revealed by alterations in the cell surface architecture of embryonic bone cells. Connect Tissue Res,20: 73-79 . Brundelet, P.J. 1965. Experimental study of the dust-clearance mechanism of the lung. I. Histological study in rats of the intra-pulmonary bronchial route of elimination. Acta Scand suppl. 175:1-35. Bucala R, Spiegel LA, Chesney J, Hogan M, Cerami A, 1994. Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair. Mol Med, Nov;1(1):71-81

124

Buechner, H. A. & Ansari, A. 1969. Acute silico-proteinosis. A new pathologic variant of acute silicosis in sandblasters, characterized by histologic features resembling alveolar proteinosis. Dis Chest. Apr;55(4):274-8 Burns CA, Zarkower A, Ferguson FG, 1980. Murine immunological and histological changes in response to chronic silica exposure. Environ Res. Apr; 21(2): 298-307 Callis AH, Sohnle PG, Mandel GS, Wiessner J, Mandel NS, 1985. Kinetics of inflammatory and fibrotic pulmonary changes in a murine model of silicosis J Lab Clin Med. May;105(5):547-53. Campagnoli C, Bellantuono I, Kumar S, Fairbairn LJ, Roberts I, Fisk NM. 2002. High transduction efficiency of circulating first trimester fetal mesenchymal stem cells: potential targets for in utero ex vivo gene therapy. BJOG,109: 952–954. Campagnoli C, Roberts IA, Kumar S, Bennett PR, Bellantuono I, Fisk NM. 2001. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. Blood 98:2396 –2402. Caplan, AI., 1991. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 284: 143-47 Carter, J. M & Driscoll, K. E, 2001. The role of inflammation, oxidative stress, and proliferation in silica-induced lung disease: A species comparison. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 20(Suppl. 1), 33–43. Castranova, V. & Vallyathan, V., 2000. Silicosis and coal workers’ pneumoconiosis. Environ. Health Perspect. 108(Suppl. 4):675– 684. Castranova, V., 2004 Signaling pathways controlling the production of inflammatory mediators in response to crystalline silica exposure: role of reactive oxygen/nitrogen species. Free Radic Biol Med. Oct 1;37(7):916-25 Chao, S.K.; Hamilton, R.F.; Pfau, J.C.; Holian, A. 2001. Cell surface regulation of silica-induced apoptosis by the SR-A scavenger receptor in a murine lung macrophage cell line (MH-S). Toxicol Appl Pharmacol. 174:10-6. Chen BDM, Mueller M, Chou TH, 1988. Role of GM-CSF in the regulation of murine alveolar macrophage proliferation and differentiation. J Immunol; 141: 139–144.

125

Christiansen NP. & Skubitz KM, 1988. Identification of the major lectin-binding surface proteins of human neutrophils and alveolar macrophages. Blood, Jun;71(6):1624-32 Christman JW, Emerson RJ, Graham WG, Davis GS.,1985. Mineral dust and cell recovery from the bronchoalveolar lavage of healthy Vermont granite workers. Am Rev Respir Dis. Aug;132(2):393-9. Chuang PT & McMahon AP. 2003. Branching morphogenesis of the lung:new molecular insights into an old problem. Trends Cell Biol 13: 86-91 Churg, A., 1996. The uptake of mineral particles by pulmonary epithelial cells. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154:1124–114 Cottler-Fox MH, Lapidot T, Petit I, 2003. Stem cell mobilization. Hematology.:419-437. Cumano, A., JC Ferraz, M Klaine, JP Di Santo,I Godin. 2001. Intraembryonic, but not yolk sac hematopoietic precursors, isolated before circulation, provide long-term multilineage reconstitution. Immunity 15: 477-85 Cuzzocrea S; L. Sautebin, G. De Sarro, G. Constantino, L. Rombola, E. Mazzon, A. Ialenti, A, De Sarrop, G. Ciliberto; M. Di Rosa, 1999. Role of IL-6 in the pleurisy and lung injury caused by carrageenan. J. Immunol. 163:5094-5104. da Silva Meirelles L, Chagastelles PC, Nardi NB, 2006. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci.119:2204-2213. Dahlin K, Mager EM, Allen L, Tigue Z, Goodglick L, Wadehra M, Dobbs L. 2004. Identification of genes differentially expressed in rat alveolar type I cells. Am J Respir Cell Mol Biol 31: 309–16. Dale P. W., Hubbs AF, Mercer R, Robinson VA, Ramsey D, McLaurin J, Khan A, Battelli L, Brumbaugh K, Teass A, Castranova V., 2004. Progression of lung inflammation and damage in rats after cessation of silica inhalation. Toxicol Sci. Jun;79(2):370-80 Daniele RP, Dauber JH, Altose ND, Rowlands DT, Gorenberg DJ, 1977. Lymphocyte studies in asymptomatic cigarette smokers: a comparison between lung and peripheral blood. Am Rev Respir Dis; 116: 997– 1005.

126

Davis GS, Leslie KO, Hemenway DR, 1998 (B). Silicosis in mice: effects of dose, time, and genetic strain. J Environ Pathol Toxicol Oncol, 17(2):81-97. Davis GS, Leslie KO, Schwars JE, Pfeiffer LM, Hill – Eubanks L, Hemenway DR. 1993. Altered Patterns of Lung Lymphocyte accumulation in silicosis in cytokine-sufficient (C3H/ HeN) and cytokine – deficient (C3H/ HeJ - LPSd) mice. Chest 103: 120-121 Davis GS., Hemenway DR, Evans JN, Lapenas DJ, Brody AR. 1981. Alveolar macrophage stimulation and population changes in silica-exposed rats. Chest. Jul;80(1 Suppl):8-10 Davis, GS, 1986. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses. Lung 164:139–154 Davis, GS, Linda M. Pfeiffer, David R. Hemenway, 2000. Interferon Production by Specific Lung Lymphocyte Phenotypes in Silicosis in Mice Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. Vol. 22, pp. 491–501 Davis, GS, LM. Pfeiffer, DR. Hemenway. 1998 (A). Persistent overexpression of interleukin-1b and tumor necrosis factor-α in murine silicosis. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 17:99–114. Davis, GS; D. Gemsa. 1996. Immunopathogenesis of silicosis. In Immunopathology of Lung Disease, 1st ed. R. L. Kradin and B. W. S. Robinson, editors. Butterworth-Heinemann, Boston 445–467. Davis, GS; Pfeiffer, LM; Hemenway DR, 1999. Expansion of interferon-gamma producing lung lymphocytes in mouse silicosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 20:813-824. Deans RJ & Moseley AB. 2000. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp Hematol 28:875-8 84. Debra L. Laskin, Barry Weinberger; Jeffrey D. Laskin, 2001. Functional heterogeneity in liver and lung macrophages. J. Leukoc. Biol. 70: 163–170 Dennis, JE; Carbillet, JP, Caplan, A., 2002. The STRO-1 + marrow cell population is multipotential. Cell Tissues Organs 170: 73-82

127

Desmouliere A, 1995. Factors influencing myofibroblast differentiation during wound healing and fibrosis. Cell Biol. Int. 19 (5) 471–476. Devine, S. M., Cobbs, C., Jennings, M., Bartholomew, A. Hoffman, R. 2003. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates. Blood 101, 2999- 3001. Dimmeler S, Zeiher AM, Schneider MD. 2005. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J Clin Invest;115:572–583. Ding S, Merkulova-Rainon T, Han ZC, 2003. HGF receptor up-regulation contributes to the angiogenic phenotype of human endothelial cells and promotes angiogenesis in vitro. Blood, 101:4816–4822. Dixon, D., A. D. Bowser, A. Badgett, J. K. Haseman, A. R. Brody. 1995. Incorporation of bromodeoxyuridine (BrdU) in the bronchiolar- alveolar regions of the lungs following two inhalation exposures to chrysotile asbestos in strain A/J mice. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 14:205–213. Donaldson, KDM. Brown, BG. Miller, AR. Brody, 1995. Bromodeoxyuridine (BRDU) uptake in the lungs of rats inhaling amosite asbestos or vitreous fibres at equal airborne fibre concentrations. Exp Toxicol Pathol. May;47(2-3):207-11 Driscoll KE, Hassenbein DG, Carter J, Poynter J, Asquith TN, Grant RA, Whitten J, Purdon MP, Takigiku R 1993. Macrophage inflammatory proteins 1 and 2: expression by rat alveolar macrophages, fibroblasts, and epithelial cells and in rat lung after mineral dust exposure. Am J Respir Cell Mol Biol, 8:311-318. Driscoll, K. E. 1996 (B) The role of interleukin-1 and tumor necrosis factora in the lung’s response to silica. In: Castranova V.; Vallyathan V.; Wallace W. E., eds. Silica and silica-induced lung diseases. Boca Raton (FL): CRC Press;:163– 184. Driscoll, K.E. 1994 (A). Macrophage inflammatory protems: biology and role in pulmonary inflammation. Exp. Lung Res. 20, 473-489. Driscoll, K.E., Maurer. J.K., Hassenbein, D., Carter, J.. Janssen, Y.M.W., Mossman, B.T., Osier, M. Oberdorster, G. 1994 (B). Contributron of macrophage-derived cytokines and cytokine networks to mineral dust-induced lung inflammation. In: D. Dungworth. U. Mohr. J. Mauderly and G. Oberdorster (Eds.). Toxic and

128

Carcinogenic Effects of Solid Particles in the Respiratory Tract. ILSI Press, Washmgton. pp. 177-190. Driscoll, KE, DG. Hassenbein, JM. Carter, SL. Kunkel, TR. Quinlan, BT. Mossman. 1995. TNF- α and increased chemokine expression in rat lung after particle exposure. Toxicol. Lett. 82–83:483–489. Eglitis, MA. & Éva Mezey., 1997. Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 4080 - 4085. Engelhardt JF, Schlossberg H, Yankaskas JR, Dudus L. 1995. Progenitor cells of the adult human airway involved in submucosal gland development. Development 121: 2031–46. Evans M, Shami SG, Martinet M, 1986. Enhanced proliferation of pulmonary alveolar macrophages after carbon instillation in mice depleted of blood monocytes by strontium. Lab Invest; 54: 154–159. Evans MJ, Cabral LJ, Stephens RJ, Freeman G. 1975. Transformation of alveolar type 2 cells to type 1 cells following exposure to NO2. Exp Mol Pathol 22: 142–50. Evans MJ, Shami SG, Cabral-Anderson LJ, Dekker NP, 1986. Role of nonciliated cells in renewal of the bronchial epithelium of rats exposed to NO2. Am. J. Pathol. 123, 126-133. Evans, MJ. & Kaufman, MH 1981., Establishment in culture of pluripotential cells in mice Nature 292:154-56 Ezekowitz, AB & Gordon S, 1982. Down-regulation of mannosyl receptor-mediated endocytosis and antigen F4/80 in bacillus Calmette-Guerin-activated mouse macrophages. Role of T lymphocytes and lymphokines.J Exp Med. Jun 1;155(6):1623-37. Ezekowitz, R.A., J. Austyn, P.D. Stahl; S. Gordon, 1981. Surface properties of bacillus Calmette-Guerin-activated mouse macrophages. Reduced expression of mannose-specific endocytosis, Fc receptors, and antigen F4/80 accompanies induction of Ia. J. Exp. Med. 154:60–76.

129

Fathi M, Johansson A, LundborgM, Orre L, Skold CM, Camner P, 2001. Functional and morphological differences between human alveolar and interstitial macrophages. Exp Mol Pathol 70:77–82. Fels AOS & Cohn ZA. 1986. The alveolar macrophage. J Appl Physiol; 60: 353–369. Ferrari, G., Gabriella Cusella-, De Angelis, Marcello Coletta, Egle Paolucci, Anna Stornaiuolo, Giulio Cossu, and Fulvio Mavilio. 1998. Muscle Regeneration by Bone Marrow-Derived Myogenic Progenitors. Science 279: 1528 – 1530 Ferrari-Lacraz S, Nicod LP, Chicheportiche R, Welgus HG, Dayer JM, 2001. Human lung tissue macrophages, but not alveolar macrophages, express matrix metalloproteinases after direct contact with activated T lymphocytes. Am J Respir Cell Mol Biol; 24:442–51. Florian H. Seeger, Torsten Tonn, Nicola Krzossok, Andreas M. Zeiher, Stefanie Dimmeler, 2007. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. Eur Heart J, 28: 766–772 Fortunel NO, Otu HH, Ng HH, 2003. Comment on “Stemness”: transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells” and “a stem cell molecular signature”. Science 302: 393 Friedenstein AJ, Chailakhjan RK, Lalykina KS. 1970. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet. 3:393– 403. Friedenstein, AJ., KV Petrakova, AI Kurolesova, GP Frolova. 1968. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation; 6: 230-247 Friedenstein, AJ; Piatetzky-Shapiro, Petrakova, KV,. 1966. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J Embryol Exp Morphol 16: 381-390. Fubini B & Hubbard A, 2003. Reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) generation by silica in inflammation and fibrosis. Free Radic. Biol. Med., 34: 1507-1516. Fuchs E, Tumbar T, Guasch G. 2004. Socializing with the neighbors: stem cells and their niche. Cell 116: 769–778.

130

Fujimura, N. 2000. Pathology and pathophysiology of pneumoconiosis. Curr. Opin. Pulmon. Med. 6:140–144. Gabbiani G, Schmid E, Winter S, Chaponnier C, de Ckhastonay C, Vandekerckhove J, Weber K, Franke WW, 1981. Vascular smooth muscle cells differ from other smooth muscle cells: predominance of vimentin filaments and a specific alpha-type actin. Proc Natl Acad Sci U S A, Jan;78(1):298-302. Gage, F. H., 2000. Mammalian Neural Stem Cells. Science 287: 1433 - 1438. Garside, P. & AM. Mowat. 1995. Polarization of Th-cell responses: a phylogenetic consequence of nonspecific immune defence? Immunol. Today 16:220–223. Gauldie J, Richards C, Lamontagne L, 1983. Fc receptors for IgA and other immunoglobulins on resident and activated alveolar macrophages. Mol Immunol; 20: 1029– 1037. Giangreco A, Reynolds SD, Stripp BR. 2002. Terminal bronchioles harbor a unique airway stem cell population that localizes to the bronchoalveolar duct junction. Am J Pathol. 161: 173–82. Godleski J. & Brain JD, 1972. The origin of alveolar macrophages in mouse radiation chimaeras. J Exp Med; 136: 630–643. Golde DW, Byers LA, Finley TN, 1974. Proliferative capacity of human alveolar macrophages. Nature; 247: 373–375. Goldsmith DF. Health effects of silica dust exposure. The Western Consortium for Public Health Reviews in Mineralogy and Geochemistry, Jan 1994; 29: 545 – 606 Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS, Mulligan RC. 1996. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med 183:1797–806 Gordon, S., L. Lawson, S. Rabinowitz, P.R. Crocker, L. Morris; V.H. Perry 1992. Antigen markers of macrophage differentiation in murine tissues. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181:1–37.

131

Gossart S, Cambon C, Orfila C, Séguélas MH, Lepert JC, Rami J, Carré P, Pipy B, 1996. Reactive oxygen intermediates as regulators of TNF-alpha production in rat lung inflammation induced by silica. J Immunol. Feb 15;156(4):1540-8 Gotherstrom C, Ringden O, Westgren M, Tammik C, Le Blanc. 2003. Immunomodulatory effects of human foetal liver-derived mesenchymal stem cells. Bone Marrow Transplant. 32:265-272 Grant, MB ., WS May, S Caballero, GA Brown, SM Guthrie, RN Mames, BJ Byrne, T Vaught, PE Spoerri, AB Peck, EW Scott. 2002. Adult hematopoietic stem cells provide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization. Nat Med 8: 607-12. Grant, RL., Yao, C, Gabaldon D, Acosta D, 1992. Evaluation of surfactant cytotoxicity potential by primary cultures of ocular tissues. Characterization of rabbit corneal epithelial cells and initial injury and delayed toxicity studies. Toxicology 76, 153}176. Green, GM. 1971. Alveolobronchiolar transport: observations and hypothesis of a pathway. Chest. May; 59: Suppl:1S-2S Greenberger, M. J., R. M. Strieter, S. L. Kunkel, J. M. Danforth, R. E. Goodman, T. J. Standiford. 1995. Neutralization of IL-10 increases survival in a murine model of Klebsiella pneumonia. J. Immunol. 155:722–729. Gregory CA, Prockop DJ, Spees JL. 2005. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: molecular control of expansion and differentiation. Exp Cell Res. 306:330 –335. Griffiths MJ, Bonnet D, Janes SM. 2005. Stem cells of the alveolar epithelium. Lancet 366: 249–260 Gross KB, White HJ, Smiler KL, 1984. Functional and morphologic changes in the lungs after a single intratracheal instillation of silica. Am Rev Respir Dis. May;129 (5):833-9 Gross TJ, Hunninghake GW: 2001 Idiopathic pulmonary fibrosis. N Engl J Med, 345:517-525.

132

Grothos, S; Graves, SE; Otha, S. 1994. STRO-1 fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors. Blood 84:4164-4173 Guo, RF, N. Riedemann, I. Laudes, V. Sarma, R. Kunkel, K. Dilley, J. Paulauskis, P. Ward, 2002. Altered neutrophil trafficking during sepsis. J. Immunol. 169:307-314. Guo, WX., GH. Li, SQ. Zheng, ZN. Lin. 1995. Effects of silica on serum phospholipid, lipid peroxide and morphological characteristics of rat lung. Biomed. Environ. Sci. 8:169–175 Gussoni, E.,Bennett, RR; Muskiewicz, KR; Meyerrose, T; Nolta, JA; Gilgoff, I; Stein, J; Chan, YM; Lidov, HG; Bönnemann, C; von Moers, A; Morris, GE; den Dunnen, JT; Chamberlain, JS; Kunkel, LM; Weinberg, K; 2002. Long-term persistence of donor nuclei in a Duchenne muscular dystrophy patient receiving bone marrow transplantation. J. Clin. Invest 110: 807 - 814. Gussoni, E., Y Soneoka, CD Strickland, EA Buzney, MK Khan, AF Flint, LM Kunkel, RC Mulligan. 1999. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. Nature 6751: 390-394. Hansen, K, BT. Mossman. 1987. Generation of superoxide (O2) from alveolar macrophages exposed to asbestiform and nonfibrous particles. Cancer Res. 47:1681–1686. Harley RA, Vallyathan V. 1996. History of silicosis. In: Castranova V, Vallyathan V, Wallace WE, eds. Silica and sílica-induced lung diseases. Boca Raton, Florida: CRC Press, 7–13. Harmsen, AG; Muggenburg, BA; Snipes, MB; Bice, DE, 1985. The role of macrophages in particle translocation from lungs to lymph nodes. Science. 230:1277-1280. Haynesworth, SE; Baber, MA; Caplan, AI., 1992. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies. Bone 13: 69-80. He Q, Wan C, Li G. 2007. Concise review: multipotent mesenchymal stromal cells in blood. Stem Cells 25: 69-77.

133

Herzog EL, Chai L, Krause DS. 2003. Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood 102: 3483–3493. Hirashima M, Kataoka H, Nishikawa S, Matsuyoshi, Norihisa, Nishikawa SI. 1999. Maturation of embyronic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood;4:1253–1263. Hochella, MD, Jr. 1993. Surface chemistry, structure, and reactivity of hazardous mineral dust. In G. D. Guthrie, Jr; BT. Mossman, editors Health Effects of Mineral Dusts. Reviews in Mineralogy,Vol. 28. Mineralogical Society of America, Washington, DC 275–308. Holt, PG., Warner, LA., Papadimitriou, JM, 1982. Alveolar macrophages: functional heterogeneity within macrophage populations from rat lung. J Exp Biol Med Sci. Dec; 60 (6): 607-18 Hong KU, Reynolds SD, Giangreco A, Hurley CM, Stripp BR. 2001. Clara cell secretory protein-expressing cells of the airway neuroepithelial body microenvironment include a label-retaining subset and are critical for epithelial renewal after progenitor cell depletion. Am J Respir Cell Mol Biol 24: 671–681. Hong, KU, Reynolds, S. D., Watkins, S., Fuchs, E; Stripp, BR, 2004 (A). Basal cells are a multipotent progenitor capable of renewing the bronchial epithelium. Am. J. Pathol 164: 577-588. Hong, KU, Reynolds, SD, Watkins, S, Fuchs, E; Stripp, BR, 2004 (B). In vivo differentiation potential of tracheal basal cells: evidence for multipotent and unipotent subpopulations. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol 286: 643-649. Hristov M & Weber C. 2004. Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance. J Cell Mol Med;8:498–508 Huaux F, Louahed J, Hudspith B, Meredith C, Delos M, Renauld JC Lison D,1998. Role of interleukin-10 (IL-10) in the lung response to silica in mice. Am J Respir Cell Mol Biol, 18:51-59. Huaux, F; Lardot, C; Arras, M; Delos, M; Many, MC; Coutelier, JP; Buchet, JP; Renauld, JC; Lison D, 1999. Lung fibrosis induced by silica particles in NMRI mice is associated with an upregulation of the p40 subunit of interleukin-12 and Th2 manifestations. Am J Resp Cell Mol Biol. 20:561-572.

134

Hubbard AK, 1989. Role for T lymphocytes in silica-induced pulmonary inflammation. Lab Invest, Jul;61(1):46-52. Hubbs AF, Minhas NS, Jones W, Greskevitch M, Battelli LA, Porter DW, Goldsmith WT, Frazer D, Landsittel DP, Ma JY, Barger M, Hill K, Schwegler-Berry D, Robinson VA, Castranova V, 2001. Comparative pulmonary toxicity of 6 abrasive blasting agents. Toxicol Sci, May;61(1):135-43. Hung SC, Pochampally RR, Hsu SC, Sanchez C, Chen SC, Spees J, Prockop DJ, 2007. Short-Term Exposure of Multipotent Stromal Cells to Low Oxygen Increases their Expression of CX3CR1 and CXCR4 and their Engraftment In Vivo. PLoS ONE, May 2;2: e416. Imada T, Tatsumi T, Mori Y, Nishiue T, Yoshida M, Masaki H, Okigaki M, Kojima H, Nozawa Y, Nishiwaki Y, Nitta N, Iwasaka T, Matsubara H, 2005. Targeted delivery of bone marrow mononuclear cells by ultrasound destruction of microbubbles induces both angiogenesis and arteriogenesis response. Arterioscler Thromb Vasc Biol. Oct;25(10):2128-34. Imitola J, Raddassi K, Park KI, Mueller FJ, Nieto M, Teng YD, Frenkel D, Li J, Sidman RL, Walsh CA, Snyder EY, Khoury SJ, 2004. Directed migration of neural stem cells to sites of CNS injury by the stromal cell-derived factor 1alpha/CXC chemokine receptor 4 pathway. Proc Natl Acad Sci U S A, Dec 28;101(52):18117-22. INAIL - Istituto Nazionale per l’Assicurazione contro gli Infortuni sul Lavoro. 2001. Rapporto Annuale 2000. Rome. Ishizawa K, Kubo, H; Yamada, M; Kobayashi, S; Suzuki, T; Mizuno, S; Nakamura, T; Sasaki, H; 2004. Hepatocyte growth factor induces angiogenesis in injured lungs through mobilizing endothelial progenitor cells. Biochem Biophys Res Commun, 324; 276–280 Ishizawa K, Kubo H, Yamada M, Kobayashi S, Numasaki M, Ueda S, Suzuki T, Sasaki H. 2004. Bone marrow-derived cells contribute to lung regeneration after elastase-induced pulmonary emphysema. FEBS Lett. Jan 2;556(1-3):249-52. Ivanova NB, Dimos JT, Schaniel C, Hackney JA, Moore KA, Lemischka IR. 2002. A stem cell molecular signature. Science 298: 601–604.

135

Iyer, R & Holian, A, 1997. Involvement of the ICE family of proteases in silica-induced apoptosis in human alveolar macrophages. Am. J. Physiol. Iyer, R., Hamilton, R. F., Li, L, Holian, 1996. Silica-induced apoptosis mediated via scavenger receptor in human alveolar macrophages. Toxicol. Appl. Pharmacol. 141, 84–92. Jagirdar, J., R. Begin, A. Dufresne, S. Goswami, T. C. Lee, W. N. Rom. 1996. Transforming growth factor-beta (TGF-b) in silicosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154(4, Part 1):1076–1081. Jaiswal S, Traver D, Miyamoto T, Akashi K, Lagasse E, Weissman IL. 2003 Expression of BCR/ABL and BCL-2 in myeloid progenitors leads to myeloid leukemias. Proc Natl Acad Sci USA 100: 1002–07. Janssen, YMW., A. Barchowsky, M. Treadwell, K. E. Driscoll, B. T. Mossman. 1995. Asbestos induces nuclear factor kB (NF-kB) DNA-binding activity and NF-kB-dependent gene expression in tracheal epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:8458–8462 Janssen, YMW., KE. Driscoll, B. Howard, T. R. Quinlan, M. Treadwell, A. Barchowsky, B. T. Mossman. 1997. Asbestos causes translocation of p65 protein and increases NF-kB DNA binding activity in rat lung epithelial and pleural mesothelial cells. Am. J. Pathol. 151:389–401. Jeffery PK. & Hislop AA. 2003. Embryology and growth. In: Gibson GJ, Geddes DM, Costabel U, Sterk PJ, Corrin B, eds. Respiratory medicine. London: WB Saunders, 51–63. Jiang Y, Vaessen B, Lenvik T, Blackstad M, Reyes M, Verfaillie CM. 2002 (A). Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. Exp Hematol. Aug;30(8):896-904. Jimenez, L. A., C. Zanella, H. Fung, Y. M. W. Janssen, P. Vacek, C. Charland, J. Goldberg, B. T. Mossman. 1997. Role of extracellular signal-regulated protein kinases in apoptosis by asbestos and H2O2. Am. J. Physiol. 273:L1029–L1035. Jin K, Sun Y, Xie L, Mao XO, Childs J, 2005. Comparison of ischemiadirected migration of neural precursor cells after intrastriatal, intraventricular, or intravenous transplantation in the rat. Neurobiol Dis 18: 366–374.

136

Johnston CJ, Driscoll KE, Finkelstein JN, Baggs R, O'Reilly MA, Carter J, Gelein R, Oberdorster G, 2000. Pulmonary chemokine and mutagenic responses in rats after subchronic inhalation of amorphous and crystalline silica. Toxicol Sci, Aug;56(2):405-13. Joyner, CJ ; Bennett, A, Triffitt, JT., 1997. Identification and enrichment of human osteoprogenitor cells by using differentiation stage-specific monoclonal antibodies. Bone, Jul; 21(1): 1-6 Justesen J, Stenderup K, Eriksen EF, Kassem M, 2002. Maintenance of osteoblastic and adipocytic differentiation potential with age and osteoporosis in human marrow stromal cell cultures. Calcif Tissue Int, 71(1):36-44. Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T, Fujiyama S, Tsutsumi Y, Ozono R, Masaki H, Mori Y, Iba O, Tateishi E, Kosaki A, Shintani S, Murohara T, Imaizumi T, Iwasaka T, 2001. Implantation of autologous bone marrow mononuclearcells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side-supply of angioblasts, angiogenic ligands and cytokines. Circulation, 104:1046 –1052. Kapanci Y, Weibel ER, Kaplan HP, Robinson FR. 1969. Pathogenesis and reversibility of the pulmonary lesions of oxygen toxicity in monkeys, II: ultrastructural and morphometric studies. Lab Invest 20: 101–18. Kawada H, Fujita J, Kinjo K, Matsuzaki Y, Tsuma M, Miyatake H, Muguruma Y, Tsuboi K, Itabashi Y, Ikeda Y, Ogawa S, Okano H, Hotta T, Ando K, Fukuda K.. 2004. Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Blood. Dec 1;104(12):3581-7 Khoor, A., Stahlman, M. T., Gray, M. E. Whitsett, J. A. 1994. Temporalspatial distribution of SP-B and SP-C proteins and mRNAs in developing respiratory epithelium of human lung. J. Histochem. Cytochem. 42, 1187-1199. Koc, ON & Lazarus, HM. 2002. Mesenchymal stem cells, heading into the clinic. Bone Marrow Transplant. 27, 235-239. Kollet O, Spiegel A, Peled A, Petit I, Byk T, Hershkoviz R, Guetta E, Barkai G, Nagler A, Lapidot T, 2001. Rapid and efficient homing of human CD34(+)CD38(-/low)CXCR4(+) stem and progenitor cells to the bone marrow and spleen of NOD/SCID and NOD/SCID/B2m(null) mice. Blood, May 15;97(10):3283-91.

137

Kopen GC, Prockop DJ, Phinney DG. 1999. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proc Natl Acad Sci U S A.;96:10711-10716. Körbling, M & Zeev Estrov. 2003. Adult Stem Cells for Tissue Repair - A New Therapeutic Concept? N. Engl. J. Med., Aug; 349: 570 - 582. Koren HS & Becker S, 1992. Antimicrobial defense mechanisms. In: Parent RA, ed. Comprehensive Treatise on Pulmonary Toxicology. Boca Raton, FL, CRC Press; pp. 747–769. Kotton, DN., Bei Yang Ma, Wellington V. Cardoso, Elisabeth A. Sanderson, Ross S. Summer, Mary C. Williams, Alan Fine. 2001. Bone marrow-derived cells as progenitors of lung alveolar epithelium. Development, Dec; 128: 5181 - 5188. Krause, DS. ND Theise, MI Collector, O Henegariu, S Hwang, R Gardner, S Neutzel, SJ Sharkis. 2001. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell, May; 105(3): 369-77 Kreipe H, Radzun HJ, Heidorn K, Barth J, Kiemle-Kallee J, Petermann W, Gerdes J, Parwaresch MR, 1990. Proliferation, MCSF and M-CSF receptor expression of alveolar macrophages in active sarcoidosis. Lab Invest; 62: 697–703. Kreipe H, Radzun HJ, Schumacher U, Parwaresch MR, 1986. Lectin binding and surface glycoprotein pattern of human macrophage populations. Histochemistry. 86(2):201-6. Krieger M, 1997. The other side of scavenger receptors: pattern recognition for host defense. Curr Opin Lipidol. Oct;8(5):275-80. Review. Kucia M, Dawn B, Hunt G, Guo Y, Wysoczynski M, 2004 (A). Cells expressing early cardiac markers reside in the bone marrow and are mobilized into the peripheral blood after myocardial infarction. Circ Res 95: 1191–1199. Kucia M, Ratajczak J, Reca R, 2004. Tissue-specific muscle, neural and liver stem/progenitor cells reside in the bone marrow, respond to an SDF-1 gradient and are mobilized into peripheral blood during stress and tissue injury. Blood Cells Mol Dis, 32:52–57.

138

Kuhn C. & MacDonald JA, 1991. The role of the myofibroblast in pulmonary fibrosis. Am. J. Pathol. 138: 1257. Kumar RK, 1989. Quantitative immunohistologic assessement of lymphocyte populations in the pulmonary inflammatory response to intratracheal silica. Am J Pathol. 135:605-614. Lanza, R. 2006. Essentials of Stem Cell Biology. New York: Academic Press. Lee, K.P.; Henry III, N.W.; Trochimowicz, H.J.; Reinhardt, CF, 1986. Pulmonary response to impaired lung clearance in rats following excessive TiO2 dust deposition. Environ Research 40:115-20. Lee, KP & Kelly, DP, 1993. Translocation of particle-laden alveolar macrophages and intra-alveolar granuloma formation in rats exposed to Ludox colloidal amorphous silica by inhalation. Toxicology 77:205-232. Lee, KP. Barras, CE, Griffith, FD, Waritz, RS, 1981. Pulmonary response and transmigration of inorganic fibers by inhalation exposure. Am J Pathol. 102:814-822. Lehnert, BE, 1992. Pulmonary and thoracic macrophage subpopulations and clearance of particles from the lung. Environ. Health Perspect. Jul; 97: 17-46. Lesur, O., T. Bouhadiba, B. Melloni, A. Cantin, J. A. Whitsett, R. Begin. 1995. Alterations of surfactant lipid turnover in silicosis: evidence of a role for surfactant-associated protein A (SP-A). Int. J. Exp. Pathol. 76:287–298. Li TS, Hayashi M, Ito H, Furutani A, Murata T, Matsuzaki M, Hamano K, 2005. Regeneration of infarcted myocardium by intramyocardial implantation of ex vivo transforming growth factor-beta-preprogrammed bone marrow stem cells. Circulation. May 17;111(19):2438-45. Liechty KW, MacKenzie TC, Shaaban AF, 2000. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep. Nat Med.; 6: 1282-1286. Lohmann-Matthes, M-L. Steinmüller, C. Franke-Ullmann, G, 1994. Pulmonary macrophages. Eur Respir J, 7, 1678–1689

139

Lugano EM, Dauber JH, Daniele RP,1982. Acute experimental silicosis. Lung morphology, histology, and macrophage chemotaxin secretion. Am J Pathol. Oct;109(1):27-36 Lunde K, Solheim S, Aakhus S, Arnesen H, Abdelnoor M, Egeland T, Endresen K, Ilebekk A, Mangschau A, Fjeld JG, Smith HJ, Taraldsrud E, Grogaard HK, Bjornerheim R, Brekke M, Muller C, Hopp E, Ragnarsson A, Brinchmann JE, Forfang K, 2006. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med, 355:1199–1209. Maddox DE, Shibata S, Goldstein IJ, 1982. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A, Jan;79(1):166-70 Mariani, TJ; Arikan, MC; Pierce, RA. 1999. Fibroblast Tropoelastin and α-Smooth-Muscle Actin Expression Are Repressed by Particulate-Activated Macrophage–Derived Tumor Necrosis Factora in Experimental Silicosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 21:185–192. Mariani, TJ; Roby, JD; Mecham, RP; Parks, WC; Crouch, E; Pierce RA, 1996. Localization of type I procollagen gene expression in silica-induced granulomatous lung disease and implication of transforming growth factor-β as a mediator of fibrosis. Am J Pathol 148:151-164. Martin GR., 1980 . Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis. Science. Aug 15;209(4458):768-76. Martin TR, Altman LC, Albert RK, Henderson WR. 1984 Leukotriene B4 production by the human alveolar macrophage: a potential mechanism for amplifying inflammation in the lung. Am Rev Respir Dis. Jan;129(1):106-11. Masuya, M., Christopher J. Drake, Paul A. Fleming, Christopher M. Reilly, Haiqun Zeng, William D. Hill, Angeline Martin-Studdard, David C. Hess, Makio Ogawa. 2003. Hematopoietic origin of glomerular mesangial cells. Blood, Mar; 101: 2215 - 2218. Melewicz FM, Kline LE, Cohen AB, Spiegelberg HE. 1982. Characterization of the IgG Fc receptors for IgE on human alveolar macrophage. Clin Exp Immunol; 49: 364–370.

140

Merrill WW, Naegel GP, Matthay RA, Reynolds HY. 1980 Alveolar macrophage-derived chemotactic factor: kinetics of in vitro production and partial characterization J Clin Invest. Feb;65(2):268-76 Metcalf D. 1972. Formation in agar of fibroblast-like colonies by cells from the mouse pleural cavity and other sources. J Cell Physiol. 80: 409–419. Metz CN, 2003. Fibrocytes: a unique cell population implicated in wound healing. Cell. Mol. Life Sci. 60:1342–1350. Meyer KC, Powers C, Rosenthal N, Auerbach R, 1993. Alveolar macrophage surface carbohydrate expression is altered in interstitial lung disease as determined by lectin-binding profiles. Am Rev Respir Dis. Nov;148(5):1325-34 Mezey E, Chandross KJ, Harta G, Maki RA, McKercher SR. 2000. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science. Dec 1;290(5497):1779-82 Miwa, K., M. Asano, R. Horai, Y. Iwakura, S. Nagata, T. Suda. 1998. Caspase 1-independent IL-1 beta release and inflammation induced by the apoptosis inducer Fas ligand. Nat. Med. 4:1287–1292. Montefort S, Holgate ST, 1991. Adhesion molecules and their role in inflammation. Respir Med; 85: 91–99. Morgan A, Moores SR, Holmes A, Evans JC, Evans NH, Black A, 1980. The effect of quartz, administered by intratracheal instillation, on the rat lung. The cellular response. Environ Res. Jun;22(1):1-12. Morland, B & Kaplan, G 1977. Macrophage activation in vivo and in vitro. Exp Cell Res108: 279. Morris, L., C.F. Graham; S. Gordon. 1991. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. Jun;112(2):517-26. Morrison SJ & Weissman IL. 1994. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity; 1: 661–73.

141

Mossman, B.T., K. Hansen, J. Marsh, M.E. Brew, S. Hills, M. Bergeron, J. Petruska. 1989. Mechanisms of fiber-induced superoxide release from alveolar macrophages and induction of superoxide dismutase in the lungs of rats inhaling crocidolite. IARC Sci Publ.(90):81-92 Mossman, B.T; A. Churg. 1998. Mechanisms in the pathogenesis of asbestosis and silicosis. Am. J. Respir. Crit.Care Med. 157:1666–1680 Muguruma Y, Yahata T, Miyatake H, Sato T, Uno T, Itoh J, Kato S, Ito M, Hotta T, Ando K. 2006. Reconstitution of the functional human hematopoietic microenvironment derived from human mesenchymal stem cells in the murine bone marrow compartment Blood. Mar 1;107(5):1878-87. Munger JS, Huang X, Kawakatsu H, Griffiths MJ, Dalton SL, Wu J, Pittet JF, Kaminski N, Garat C, Matthay MA, Rifkin DB, Sheppard D, 1999 The integrin alpha v beta 6 binds and activates latent TGF beta 1: a mechanism for regulating pulmonary inflammation and fibrosis. Cell, 96:319-328. Myones BL, Dalzell JG, Hogg N, Ross GD, 1988. Neutrophil and monocyte surface p150.95 has iC3b receptor activity resembling CR3. J Clin Invest; 82: 640–649. Naegel GP, Young RK, Reynolds HY, 1984. Receptors of human IgG subclasses on human alveolar macrophages. Am Rev Respir Dis; 129: 413–418. Nakamizo A, Marini F, Amano T, Khan A, Studeny M, Gumin J, Chen J, Hentschel S, Vecil G, Dembinski J, Andreeff M, Lang FF. 2005. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas Cancer Res. Apr 15;65(8):3307-18 Naruse K, Urabe K, Mukaida T, Ueno T, Migishima F, Oikawa A, Mikuni-Takagaki Y, Itoman M. 2004. Spontaneous differentiation of mesenchymal stem cells obtained from fetal rat circulation. Bone, 35:850–858. Nathan C.F., Murray, H.W., Cohn, Z.A, 1980 The macrophage as an effector cell. N Engj J Med 303: 622 – 626 Neil D T, O Henegariu, J Grove, J Jagirdar, PN Kao, JM Crawford, S Badve, R Saxena, DS Krause, 2002. Radiation pneumonitis in mice: a severe injury model for pneumocyte engraftment from bone marrow. Exp Hematol, Nov 30(11): 1333-8

142

Neuss S, Becher E, Woltje M, 2004. Functional expression of HGF and HGF receptor/c-met in adult human mesenchymal stem cells suggests a role in cell mobilization, tissue repair, and wound healing. STEM CELLS, ;22:405– 414. Nicod LP, 1999. Pulmonary defence mechanisms. Respiration 66, 2–11. NIOSH, 1993 - National Institute for Occupational Safety and Health. NIOSH, 2002. Hazard Review: Health effects of occupational exposure to respirable crystalline silica. DHHS–NIOSH publication 2002-129. Cincinnati, OH: National Institute for Occupational Safety and Health. Nishino T, Hisha H, Nishino N, 1995. Hepatocyte growth factor as a hematopoietic regulator. Blood, 85:3093–3100. Ohnishi S, Yasuda T, Kitamura S, Nagaya N, 2007. Effect of Hypoxia on Gene Expression of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells and Mononuclear Cells. Stem Cells, 25:1166–1177

Ohtsuka Y, Munakata M, Ukita H, Takahashi T, Satoh A, Homma Y, Kawakami Y, 1995. Increased susceptibility to silicosis and TNF-α production in C57BL/6j mice. Am J Respir Crit Care Med 152:2144-2149. Ono K, Matsumori A, Shioi T, 1997. Enhanced expression of hepatocyte growth factor/c-met by myocardial ischemia and reperfusion in a rat model. Circulation, 95:2552–2558. Orlic, D., J Kajstura, S Chimenti, I Jakoniuk, SM Anderson, B Li, J Pickel, R McKay, B Nadal-Ginard, DM Bodine, A Leri, P Anversa, 2001. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature, Apr; 410(6829): 701-5. Ortiz, LA., Frederica Gambelli, Christine McBride, Dina Gaupp, Melody Baddoo, Naftali Kaminski, Donald G. Phinney. 2003. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA, Jul; 100: 8407 - 8411. Otani, A., K Kinder, K Ewalt, FJ Otero, P Schimmel, M Friedlander. 2002. Bone marrow-derived stem cells target retinal astrocytes and can promote or inhibit retinal angiogenesis. Nat Med, Sep; 8(9): 1004-10.

143

Otto, WR, 2002. Lung epithelial stem cells J Pathol 197: 527–535 Owen, M; AJ Friedenstein. 1988. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Found Symp, Jan; 136: 42-60. Pardo A, Perez-Ramos J, Segura-Valdez L, Ramirez R, Selman M, 1999. Expression and localization of TIMP-1, TIMP-2, MMP-13, MMP-2, and MMP-9 in early and advanced experimental lung silicosis. Ann N Y Acad Sci. Jun 30;878:587-9. Pardo A, Ruiz V, Arreola JL, Ramirez R, Cisneros-Lira J, Gaxiola M, Barrios R, Kala SV, Lieberman MW, Selman M: 2003 Bleomycin-induced pulmonary fibrosis is attenuated in gamma-glutamyl transpeptidase-deficient mice. Am J Respir Crit Care Med, 167:925-932. Passegue E, Jamieson CH, Ailles LE, Weissman IL. 2003. Normal and leukemic hematopoiesis: are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? Proc Natl Acad Sci USA; 100 (suppl 1): 11842–49. Pearce DJ, Ridler CM, Simpson C, Bonnet D. 2004. Multiparameter analysis of murine bone marrow side population cells. Blood; 103: 2541–46. Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D, Zhu Z, Lane WJ, Williams M, Oz MC, Hicklin DJ, Witte L, Moore MAS, Rafii S. 2000. Expression of VEGFR-2 and AC 133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of funcitonal endothelial precursors. Blood;95:952–958. Peled A, Petit I, Kollet O, Magid M, Ponomaryov T, Byk T, Nagler A, Ben-Hur H, Many A, Shultz L, Lider O, Alon R, Zipori D, Lapidot T, 1999. Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4. Science, Feb 5;283(5403):845-8. Pereira RF, O'Hara MD, Laptev AV, Halford KW, Pollard MD, Class R, Simon D, Livezey K, Prockop DJ. 1998. Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesis imperfecta. Proc Natl Acad Sci U S A. 95:1142-1147. Perez-Ramos J, de Lourdes Segura-Valdez M, Vanda B, Selman M, Pardo A, 1999 . Matrix metalloproteinases 2, 9, and 13, and tissue inhibitors of

144

metalloproteinases 1 and 2 in experimental lung silicosis. Am J Respir Crit Care Med. Oct;160(4):1274-82. Perin EC, Dohmann HFR, Borojevic R, Silva SA, Sousa ALS, Mesquita CT, Rossi MID, Carvalho AC, Dutra HS, Dohmann HJF, Silva GV, Belém L, Vivacqua R, Rangel FOD, Esporcatte R, Geng YG, Vaughn WK, Assad JAR, Mesquita ET, Willerson JT, 2003. Transendocardial, Autologous Bone Marrow Cell Transplantation for Severe, Chronic Ischemic Heart Failure. Circulation, May; 107: 2294 – 2302 Perl AK, Wert SE, Nagy A, Lobe CG, Whitsett JA. 2002. Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation of the lung. Proc Natl Acad Sci USA; 99: 10482–87. Petersen, E., W.C. Bowen, K.D. Patrene, W.M. Mars, A.K. Sullivan, N. Murase, S. S. Boggs, J. S. Greenberger, J. P. Goff. 1999. Bone Marrow as a Potential Source of Hepatic Oval Cells. Science, May; 284: 1168 - 1170. Petruska, J.M., S.H.Y. Wong, F.W. Sunderman, Jr. B.T. Mossman. 1990. Detection of lipid peroxidation in lung and in bronchoalveolar lavage cells and fluid. Free Radic. Biol. Med. 9:51–58. Phillips RJ, Burdick MD, Hong K, Lutz MA, Murray LA, Xue YY, Belperio JA, Keane MP, Strieter RM, 2004. Circulating fibrocytes traffic to the lungs in response to CXCL12 and mediate fibrosis. J. Clin. Invest, Aug;114(3):438-46 Piguet, P. F; C. Vesin. 1994. Treatment by human recombinant soluble TNF receptor of pulmonary fibrosis induced by bleomycin or silica in mice. Eur. Respir. J. 7:515–518. Piguet, P.F., C. Vesin, G.E. Grau; R.C. Thompson. 1993. Interleukin – 1 receptor antagonist (IL-1ra) prevents or cures pulmonary fibrosis elicited in mice by bleomycin or silica. Cytokine 5:57–61 Piguet, PF, MA. Collart, GE. Grau, AP. Sappino, P. Vassalli. 1990. Requirement of tumour necrosis factor for development of silica-induced pulmonary fibrosis. Nature 344:245–247. Pillarisette & Gupta, 2001. Cloning and relative expression analysis of rat stromal cell derived factor-1 (SDF-1)1: SDF-1 alpha mRNA is selectively induced in rat model of myocardial infarction. Inflammation, Oct;25(5):293-300

145

Pittenger MF, Martin BJ. 2004. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res.;95:9-20. Pittenger, MF., Alastair M. Mackay, Stephen C. Beck, Rama K. Jaiswal, Robin Douglas, Joseph D. Mosca, Mark A. Moorman, Donald W. Simonetti, Stewart Craig, Daniel R. Marshak. 1999. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science, Apr; 284: 143 - 147. Ponomaryov T, Peled A, Petit I, Taichman RS, Habler L, Sandbank J, Arenzana-Seisdedos F, Magerus A, Caruz A, Fujii N, Nagler A, Lahav M, Szyper-Kravitz M, Zipori D, Lapidot T, 2000. Induction of the chemokine stromal-derived factor-1 following DNA damage improves human stem cell function. J Clin Invest. Dec;106(11):1331-9. Porter, DW, Ye, J, Ma, J, Barger, M, Robinson, VA, Ramsey, D, McLaurin, J, Khan, A, Landsittel, D, Teass A, 2002. Time course of pulmonary response of rats to inhalation of crystalline silica: NF-kappa B activation, inflammation, cytokine production, and damage. Inhal. Toxicol. 14, 349–367. Pountos I. & Giannoudis PV, 2005. Biology of mesenchymal stem cells. Injury, 36 Suppl 3:S8-S12. Prockop, DJ., 1997 Marrow stromal cells as stem for nonhematopoietic tissues. Science, 276: 71-74 Quan TE, Cowper S, Wu SP, Bockenstedt LK, Bucala R, 2004. Circulating fibrocytes: collagen- secreting cells of the peripheral blood. Int. J. Biochem. Cell Biol. 36:598–606. Quinlan, T. R., K. A. BeruBe, J. P. Marsh, Y. M. W. Janssen, P. Taishi, K. O. Leslie, D. Hemenway, P. T. O’Shaughnessy, P. Vacek, B. T. Mossman. 1995. Patterns of inflammation, cell proliferation and related gene expression in lung after inhalation of chrysotile asbestos. Am. J. Pathol. 147:728–739. Raff, M. 2003. Adult stem cell plasticity: fact or artifact? Annu Rev Cell Dev Biol.19:1-22 Raffi S & Lyden D. 2003. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Med;9:702–712.

146

Ramalho-Santos M, Yoon S, Matsuzaki Y, Mulligan RC, Melton DA. 2002. “Stemness”: transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells. Science; 298: 597–600. Rawlins EL. & Hogan BL. 2006. Epithelial stem cells of the lung: privileged few or opportunities for many? Development. Jul;133(13):2455-65. Reiser, KM; Haschek, WM; Hesterberg, TW; Last JA, 1983. Experimental silicosis. II. Long term effects of intratracheally instilled quartz on collagen metabolism and morphologic characteristics of rat lungs. Am J Pathol 110:30-41 Reiser, KM; Hesterberg, TW; Haschek, WM; Last JA, 1982. Experimental silicosis. I. Acute effects of intratracheally instilled quartz on collagen metabolism and morphologic characteristics of rat lungs. Am J Pathol. 107:175-185. Reynolds HY. 1987. Bronchoalveolar lavage (state of art). Am Rev Respir Dis; 135: 250–263. Reynolds, HY., 1983 Lung inflammation: role of endogenous chemotactic factors in attracting polymorphonuclear granulocytes. Am Rev Respir Dis. Feb;127(2):S16-25. Ribeiro F.S.N., 2004 Exposição ocupacional à sílica no Brasil: tendência temporal, 1985 a 2001.Tese de doutorado apresentada ao Departamento de Epidemiologia da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo. SP Riely, RL, 1959. Protective measures; reasonable or ritualistic. Nurs Outlook. Jan;7(1):38-9. Risau W & Flamme I. 1995. Vasculogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol;11:73–91 Robert F. Wynn, Claire A. Hart, Carla Corradi-Perini, Liam O’Neill, Caroline A. Evans, J. Ed Wraith, Leslie J. Fairbairn, Ilaria Bellantuono, 2004. A small proportion of mesenchymal stem cells strongly expresses functionally active CXCR4 receptor capable of promoting migration to bone marrow. Blood. 104:2643-2645 Rom WN: 1991 Relationship of inflammatory cell cytokines to disease severity in individuals with occupational inorganic dust exposure. Am J Ind Med, 19:15-27.

147

Ross, M. P., R. P. Nolan, A. M. Langer, W. C. Cooper. 1993. Health effects of mineral dusts other than asbestos. In G. D. Guthrie, Jr. and B. T. Mossman, editors. Health Effects of Mineral Dusts. Reviews in Mineralogy, Vol. 28. Mineralogical Society of America, Washington, DC. 361–409. Russo, A; Russo, G; Peticca, M; Pietropaolo, C; Di Rosa, M; Iuvone, T, 2005. Inhibition of granuloma-associated angiogenesis by controlling mast cell mediator release: role of mast cell protease-5. Brit J Pharmacol, 145:24–33 Rutherford MS, Witsell A, Schook LB, 1993. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J Leukoc Biol; 53:602–18. Sakamoto H, Zhao LH, Jain F, Kradin, R., 2002. IL-12p40(-/-) mice treated with intratracheal bleomycin exhibit decreased pulmonary inflammation and increased fibrosis. Exp Mol Pathol, 72:1-9. Sarih, M., Souvannavong, V., Brown, S. C., Adam A, 1993. Silica induces apoptosis in macrophages and the release of IL-1 and IL-1. J. Leukoc.Biol. 54, 407–413. Saunders GC, Steinkamp JA, Lehnert BE, 1987. Flow cytometric analyses of lectin binding to rat alveolar macrophages. Cytometry, Nov;8(6):602-11. Schapira, R.M., A.J. Ghio, R.M. Effros, J. Morrisey, U.A. Almagro, C.A. Dawson, A. D. Hacker. 1995. Hydroxyl radical production and lung injury in the rat following silica or titanium dioxide instillation in vivo. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12:220–226. Schneider, T & Issekutz AC, 1996. Quantitation of eosinophil and neutrophil infiltration into rat lung by specific assays for eosinophil peroxidase and myeloperoxidase Application in a Brown Norway rat model of allergic pulmonary inflammation. J Immunol Methods, 198:1 – 14 Schoch KG, Lori A, Burns KA, Eldred T, Olsen JC, Randell SH. 2004. A subset of mouse tracheal epithelial basal cells generates large colonies in vitro. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 286, L631-L642. Schwartz, M. I. 1993. Interstitial pulmonary fibrosis. In W. N. Kelley, editor. Textbook of Internal Medicine. J. P. Lippincott Co., Philadelphia.1902–1905

148

Seder, RA. & WE, Paul. 1994. Acquisition of lymphokine-producing phenotype by CD41 T cells. Annu. Rev. Immunol. 12:635–673. Sekhon, H., J. Wright; A. Churg. 1995. Effects of cigarette smoke and asbestos on airway, vascular and mesothelial cell proliferation. Int. J. Exp. Pathol. 76:411–418. Shami SG, Martinez LA, Evans MJ. 1986. The role of migrating inflammatory cells in proliferation of lung interstitium and epithelium. Chest; 89(Suppl.): 170–173 Shannon JM. & Hyatt BA, 2004. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol; 66: 625–45. Shen, H. M., Zhang, Z., Zhang, Q. F, Ong, C. N, 2001. Reactive oxygen species and caspase activation mediate silica-induced apoptosis in alveolar macrophages. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 280, L10–L17. Shi S, Bartold PM, Miura M, Seo BM, Robey PG, Gronthos S: 2005. The efficacy of mesenchymal stem cells to regenerate and repair dental structures. Orthod Craniofac Res. 8:191-199. Shigemura N, Okumura M, Mizuno S, Imanishi Y, Matsuyama A, Shiono H, Nakamura T, Sawa Y. 2006. Lung tissue engineering technique with adipose stromal cells improves surgical outcome for pulmonary emphysema. Am J Respir Crit Care Med. Dec 1;174(11):1199-205. Sibille Y. & Reynolds HY. 1990. Macrophages and polymorphonuclear neutrophils in lung defense and injury. Am Rev Respir Dis; 141: 471–501 Silicosis and Silicate Disease Committee, 1988. Diseases associated with exposure to silica and nonfibrous silicate minerals. Arch Pathol Lab Med 112: 673–720, Simmons, PJ. & Torok-Storb, (A), 1991. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1. Blood, Jul; 78: 55 - 62. Simmons, PJ. & Torok-Storb, (B), 1991. CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow. Blood, Dec 78: 2848 – 2853

149

Sjostrand, M., P.M. Absher, D.R. Hemenway, L. Trombley, L.C. Baldor., 1991. Comparison of lung alveolar and tissue cells in silica-induced inflammation. Am. Rev. Respir. Dis. 143:47–52. Skalli O, W. Schurch, T. Seemayer, R. Lagace, D. Montandon, B. Pittet, G. Gabbiani, 1989. Myofibroblasts from diverse pathologic settings are heterogeneous in their content of actin isoforms and intermediate filament proteins Lab. Invest. 60 (2) 275–285. Slack, J.M.W. 2000. Stem Cells in Epithelial Tissues Science, Feb 287: 1431 - 1433. Smith AG. 2001. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol.;17:435-62 Snider GL. 1983. Interstitial pulmonary fibrosis--which cell is the culprit? Am Rev Respir Dis. May;127(5):535-9 Soares MB, Lima RS, Rocha LL, Takyia CM, Pontes-de-Carvalho L, de Carvalho AC, Ribeiro-dos-Santos R, 2004. Transplanted bone marrow cells repair heart tissue and reduce myocarditis in chronic chagasic mice. Am J Pathol. Feb;164(2):441-7. Son BR, Marquez-Curtis LA, Kucia M, Wysoczynski M, Turner AR, Ratajczak J, Ratajczak MZ, Janowska-Wieczorek A, 2006. Migration of bone marrow and cord blood mesenchymal stem cells in vitro is regulated by stromal-derived factor-1-CXCR4 and hepatocyte growth Factor-c-met Axes and Involves Matrix Metalloproteinases. Stem Cells, 24:1254–1264 Sone S, Yanagawa H, Nishioka Y, 1992. Interleukin-4 as a potent down-regulator for human alveolar macrophages capable of producing tumour necrosis factor and interleukin-1. Eur Respir J, 5: 67–72. Sorokin SP & Hoyt RF Jr, 1992. Macrophage development: I. Rationale for using Griffonia simplicifolia isolectin B4 as a marker for the line. Anat Rec. Apr ;232(4):520-6 Srivastava, K. D.; Rom, W. N.; Jagirdar, T.; Yie, T.-A.; Gordon, T.; Tchou-Wong, L.-M. 2002. Critical role of interleukin-1a and nitric oxide synthase in silica-induced inflammation and apoptosis in mice. Am. J. Crit. Care Med. 165:527–533.

150

Standiford, T.J., R.M. Strieter, N.W. Lukacs, S.L. Kunkel. 1995. Neutralization of IL-10 increases lethality in endotoxemia: cooperative effects of macrophage inflammatory protein-2 and tumor necrosis factor. J. Immunol. 155:2222–2229. Standiford, T.J., S.L. Kunkel, M.J. Greenberger, L.L. Laichalk, R.M. Strieter. 1996. Expression and regulation of chemokines in bacterial pneumonia. J. Leukoc. Biol. 59:24–28. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Kostering M, Hernandez A, Sorg RV, Kogler G, Wernet P, 2002. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation, 106:1913–1918. Striz I, Wang YM, Kalaycioglu O, Costabel U, 1992. Expression of alveolar macrophage adhesion molecules in pulmonary sarcoidosis. Chest; 102: 882–886. Struhar, D & RJ. Harbeck. 1989 (B). Anti-Ia antibodies inhibit the spontaneous secretion of IL-1 from silicotic rat alveolar macrophages. Immunol. Lett. 23:31–34. Struhar, D., R.J. Harbeck, R.J. Mason. 1989 (A). Lymphocyte populations in lung tissue, bronchoalveolar lavage fluid, and peripheral blood in rats at various times during the development of silicosis. Am. Rev. Respir. Dis. 139:28–32. Studeny M, Marini FC, Champlin RE, Zompetta C, Fidler IJ, Andreeff M. 2002. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-h delivery into tumors. Cancer Res.62:3603–8. Sykes M. & Nikolic B. 2005. Treatment of severe autoimmune disease by stem-cell transplantation. Nature435:620-7. Tabor DR, Larry CH, Jacobs RF, 1989. Differential induction of macrophage GSIB4-binding activity. J Leukoc Biol. May;45(5):452-7. Tanino Y, Makita H, Miyamoto K, Betsuyaku T, Ohtsuka Y, Nishihira J, Nishimura M, 2002. Role of macrophage migration inhibitory factor in bleomycin-induced lung injury and fibrosis in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 283:L156-L162.

151

Theise, ND,. S Badve, R Saxena, O Henegariu, S Sell, JM Crawford, DS Krause. 2000. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation. Hepatology, Jan; 31(1): 235-40 Thibodeau M, Giardina C, Hubbard AK, 2003. Silica-induced caspase activation in mouse alveolar macrophages is dependent upon mitochondrial integrity and aspartic proteolysis. Toxicol Sci. Nov;76(1):91-101. Thomas ED, Ramberg RE, Sale GE, Sparkes RS, Golde DW. 1976. Direct evidence for bone marrow origin of the alveolar macrophage in man. Science; 192: 1016–1018. Thomson, JA: Itskovitz-Elder, J; Shapiro, SS: Waknitz, MA; Swiergiel, JJ., 1998. Embryonic stem cells lines derived from human blastocysts. Science 282: 1145-47 Tocci A. & Forte L. 2003. Mesenchymal stem cell: use and perspectives Hematol J., 4(2):92-6. Togel F, Isaac J, Hu Z, Weiss K, Westenfelder C, 2005. Renal SDF-1 signals mobilization and homing of CXCR4-positive cells to the kidney after ischemic injury. Kidney Int. May;67(5):1772-84. Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ, Kessler PD. 2002. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation.;105:93-98. Tondreau T, Meuleman N, Delforge A, Dejeneffe M, Leroy R, Massy M, Mortier C, Bron D, Lagneaux L., 2005. Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized peripheral blood and cord blood: proliferation, Oct4 expression, and plasticity. Stem Cells. 23:1105–1112. Tourmann, J; R. Kaufmann. 1994. Biopersistence of the mineral matter of coal mine dusts in silicotic human lungs: is there a preferential release of iron? Environ. Health Perspect. 102 (Suppl. 5): 265–268 Tse, HE., YL Kwong, JK Chan, G Lo, CL Ho, CP Lau. 2003. Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation. Lancet, Jan; 361(9351): 47-9.

152

Tsutsui H, Kayagaki N, Kuida K, Nakano H, Hayashi N, Takeda K, Matsui K, Kashiwamura S, Hada T, Akira S, Yagita H, Okamura H, Nakanishi K, 1999. Caspase-1-independent, Fas/Fas ligand-mediated IL-18 secretion from macrophages causes acute liver injury in mice. Immunity 11:359–367. Ueki, Y Kaneda, H Tsutsui, K Nakanishi, Y Sawa, R Morishita, K Matsumoto, T Nakamura, H Takahashi, E Okamoto, J Fujimoto. 1999. Hepatocyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats. Nat Med, Feb; 5(2): 226-30. Unanue, E. R, 1980. Cooperation between mononuclear phagocytes and lymphocytes in immunity. N Engl J Med, Oct 23;303(17):977-8 Vallyathan, V., X. Shi, N. S. Dalal, W. Irr, V. Castranova. 1988. Generation of free radicals from freshly fractured silica dust: potential role in acute silica-induced injury. Am. Rev. Respir. Dis. 138:1213–1219. Van de Vijver, KK; Colpaert, CG; Jacobs, W; Kuypers, K; Hokke, CH; Deelder, M; Van Marcka, EA, 2006. The host’s genetic background determines the extent of angiogenesis induced by schistosome egg antigens. Acta Tropica, 99: 243–251 Vanhee D, Gosset P, Wallaert B, Voisin C, Tonnel AB: 1994 Mechanisms of fibrosis in coal workers' pneumoconiosis. Increased production of platelet derived growth factor, insulin- like growth factor type I, and transforming growth factor beta and relationship to disease severity. Am J Respir Crit Care Méd , 150:1049-1055. Veblen, DR & AG. Wylie. 1993. Mineralogy of amphiboles and 1:1 layer silicates. In G. D. Guthrie, Jr. and B. T. Mossman, editors. Health Effects of Mineral Dusts. Reviews in Mineralogy, Vol. 28. Mineralogical Society of America, Washington, DC. 61–138. Velan, G. M., R. K. Kumar, D. D. Cohen. 1993. Pulmonary inflammation and fibrosis following subacute inhalational exposure to silica: determinants of progression. Pathology 25:282–290. Viksman MY, Bochner BS, Peebles RS, Schleimer RP, Liu MC. 2002. Expression of activation markers on alveolar macrophages in allergic asthmatics after endobronchial or whole-lung allergen challenge. Clin Immunol, 104:77–85.

153

Vyalov SL, Gabbiani G, Kapanci Y, 1993. Rat alveolar myofibroblasts acquire a-smooth muscle actin expression during bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am J Pathol, 143:1754-1765 Wakitani S, Saito T, Caplan AI. 1995. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve.18:1417-1426. Walsh DA, Hu DE, Wharton J, Catravas JD, Blake DR, Fan TP, 1997. Sequential development of angiotensin receptors and angiotensin I converting enzyme during angiogenesis in the rat subcutaneous sponge granuloma. Brit J Pharmacol, 120: 1302 ± 1311. Walter DH, Haendeler J, Reinhold J, Rochwalsky U, Seeger F, Honold J, Hoffmann J, Urbich C, Lehmann R, Arenzana-Seisdesdos F, Aicher A, Heeschen C, Fichtlscherer S, Zeiher AM, Dimmeler S, 2005. Impaired CXCR4 signaling contributes to the reduced neovascularization capacity of endothelial progenitor cells from patients with coronary artery disease. Circ Res. Nov 25;97(11):1142-51. Wang, J; Luo, R; Zhang, X; Xie, X; Hu, X; He, A; Chen, J; Li, J, 2005. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with perindopril treatment attenuates infarction remodelling in a rat model of acute myocardial infarction. J Zhejiang Univ SCIENCE B, 7(8): 641-647 Ward PA & Hunninghake GW, 1998. Lung inflammation and fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. Apr;157: S123-129. Warheit D. B., Kellar KA, Hartsky MA. 1992 Pulmonary cellular effects in rats following aerosol exposures to ultrafine Kevlar aramid fibrils: evidence for biodegradability of inhaled fibrils. Toxicol Appl Pharmacol. Oct;116(2):225-39. Warheit, D.B., Carakostas, MC., Hartsky, MA., Hansen, J. F., 1991. Development of a short-term inhalation bioassay to assess pulmonary toxicity of inhaled particles: comparisons of pulmonary responses to carbonyl iron and silica. Toxicol. AppI. Pharmacol. 107, 350 Watt FM. & Hogan BL. 2000. Out of Eden: stem cells and their niches. Science; 287: 1427–30.

154

Weirich, U; Friemann, J; Rehn, B; Henkelüdecke, U; Lammers, T; Sorg, C; Bruch, J; Gleichmann E, 1996. Silicotic lymph node reactions in mice: genetic differences, correlation with macrophage markers, and independence from T lymphocytes. J Leukoc Biol 59:178-188. Weissman, I. L., 2000 (A). Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell, Jan;100(1): 157-68 Weissman, I. L., 2000 (B). Translating Stem and Progenitor Cell Biology to the Clinic: Barriers and Opportunities Science, Feb, 287: 1442 - 1446. Williams, A.O., K.C. Flanders, U. Saffiotti, 1993. Immunohistochemical localization of transforming growth factor-beta 1 in rats with experimental silicosis, alveolar type II hyperplasia, and lung cancer. Am. J. Pathol. 142:1831–1840 Witsell AL. & Schook LB, 1991. Macrophage heterogeneity occurs through a developmental mechanism. Proc Natl Acad Sci USA; 88:1963–7. Woodcock-Mitchell J, Adler KB, Low RB, 1984. Immunohistochemical identification of cell types in normal and bleomycin-induced fibrotic rat lung. Am Rev Resp Dis, 130:910-916 Wright SD, Craigmyle L, Silverstein SC, 1983. Fibronectin and serum amyloid P stimulate C3b and C3b-mediated phagocytosis in cultured monocytes. J Exp Med; 158: 1338–1346. Xu J, Mora A, Shim H, Stecenko A, Brigham KL, Rojas M, 2007. Role of the SDF-1/CXCR4 Axis in the Pathogenesis of Lung Injury and Fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. Sep;37 (3): 291-299. Xu, X; Xu, Z; Xu, Y; Cui, G, 2005. Effects of mesenchymal stem cell transplantation on extracellular matrix after myocardial infarction in rats. Coron. Artery Dis., 16(4): 245-255. Yamada M, Kubo H, Kobayashi S, Ishizawa K, Numasaki M, Ueda S, Suzuki T, Sasaki H. 2004. Bone marrow-derived progenitor cells are important for lung repair after lipopolysaccharide-induced lung injury. J Immunol 172: 1266.

155

Yamaguchi J, Kusano KF, Masuo O, Kawamoto A, Silver M, Murasawa S, Bosch-Marce M, Mas Abbott uda H, Losordo DW, Isner JM, Asahara T, 2003. Stromal cell-derived factor-1 effects on ex vivo expanded endothelial progenitor cell recruitment for ischemic neovascularization. Circulation, Mar 11;107(9):1322-8. Young PP, Hofling AA, Sands MS. 2002. VEGF increases engraftment of bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs) into vasculature of newborn murine recipients. Proc Natl Acad Sci, USA;99:11951–11956. Yatera K, Morimoto Y, Kim HN, Yamato H, Tanaka I, Kido M, 2001 . Increased expression of matrix metalloproteinase in Clara cell-ablated mice inhaling crystalline silica. Environ Health Perspect. Aug;109(8):795-9. Yokoo T, Kitamura M, 1997. IL-1 depresses expression of the 70 kD heat shock protein and sensitizes glomerular cells to oxidant-initiated apoptosis. J Immunol, 159:2886–2892. Young, H. A. 1996. Regulation of interferon-gamma gene expression. J. Interferon Cytokine Res. 16:563–568. Yuhgetsu, H; Ohno, Y; Funaguchi, N; Asai, T; Sawada, M; Takemura, G; Minatoguchi, S; Fujiwara, H; Fujiwara T, 2006. Beneficial Effects of Autologous Bone Marrow Mononuclear Cell Transplantation Against Elastase-Induced Emphysema in Rabbits. Exp Lung Res, Oct 32(9): 413-26 Zanella, CL, J. Posada, T. R. Tritton, B. T. Mossman. 1996. Asbestos causes stimulation of the extracellular signal-regulated kinase 1 mitogen-activated protein kinase cascade after phosphorylation of the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 56:5334–5338. Zentilin L, Tafuro S, Zacchigna S, Arsic N, Pattarini L, Sinigaglia M, Giacca M, 2006. Bone marrow mononuclear cells are recruited to the sites of VEGF-induced neovascularization but are not incorporated into the newly formed vessels. Blood. May 1;107(9):3546-54. Zhang HY, Gharaee-Kermani M, Phan SH, 1997. Regulation of lung fibroblast alpha-smooth muscle actin expression, contractile phenotype, and apoptosis by IL-1beta. J Immunol, 158:1392–1399. Zhang K, Gharaee-Kermani M, McGarry B, Phan SH, 1994 (A). In situ hybridization analysis of rat lung al(l) and a2(l) collagen gene expression in

156

pulmonary fibrosis induced by endotracheal bleomycin injection. Lab Invest, 70:192-202 Zhang K, Rekhter MD, Gordon D, Phan SH, 1994 (B). Myofibroblasts and their role in lung collagen gene expression during pulmonary fibrosis. A combined immunohistochemical and in situ hybridization study. Am J Pathol, 145:114-125 Zhang K. & Phan SH, 1996. Cytokines and pulmonary fibrosis. Biol Signals, Jul; 5: 232-9. Zhang Z, Shen HM, Zhang QF, Ong CN, 2000 (C). Involvement of Oxidative Stress in Crystalline Silica-Induced Cytotoxicity and Genotoxicity in Rat Alveolar Macrophages. Environ Res, Section A, 82: 245-252 Zhang, P., Summer, W. R., Bagby, G. J., Nelson, S. 2000 (B) Alveolar macrophages. In The Lung: Scientific Foundations (R. G. Crystal and J. B. West, eds.), New York, Raven Press, Zhang, P., Summer, W.R., Bagby, G.J., Nelson, S, 2000 (A) Innate immunity and pulmonary host defense. Immunol. Rev. 173, 39–51 Zhang, Y., T.C. Lee, B. Guillemin, M.C. Yu, W.N. Rom. 1993. Enhanced IL-1 beta and tumor necrosis factor-a release and messenger RNA expression in macrophages from idiopathic pulmonary fibrosis or after asbestos exposure. J. Immunol. 150:4188–4196. Ziskind M, Jones RN, Weill H, 1976. Silicosis: state of the art. Am Rev Respir Dis 113: 643. Zong ZW, Cheng TM, Su YP, Ran XZ, Li N, Ai GP, Xu H, 2006. Crucial role of SDF-1/CXCR4 interaction in the recruitment of transplanted dermal multipotent cells to sublethally irradiated bone marrow. J Radiat Res (Tokyo), Nov;47(3-4):287-93 Zou YR, Kottmann AH, Kuroda M, 1998. Function of the chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development. Nature;393:595–599. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH. 2001. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng, 7: 211–228.

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Terapia celular na silicose murina experimentallivros01.livrosgratis.com.br/cp065057.pdf · anatomia patológica (HUCFF). No tempo em que eu sonhava com o dia que publicaria um artigo