Tenzidi i njihov utjecaj na - Univerzitet u Tuzli Tenzidi i njihov utjecaj na interakciju nanočestica i ćelija Dr.sci.ph. Vera Kerleta-Tuzović, doc. Kolegij: Farmaceutska tehnologija

Tenzidi i njihov utjecaj na

interakciju nanočestica i ćelija

Dr.sci.ph. Vera Kerleta-Tuzović, doc.

Kolegij: Farmaceutska tehnologija

Univerzitet u Tuzli, Farmaceutski fakultet

1

Uvod – Struktura predavanja

• Tenzidi

• Nanočestice

• Ćelijska kultura

• Korištene metode

• Rezultati

• Zaključak

2

Dr.sci.ph.Vera Kerleta-Tuzović, doc. Tenzidi i njihov utjecaj na interakciju nanočestica i ćelija

Uvod - Tenzidi

• Spojevi koji smanjuju površinsku napetost između

dvije faze

• Surface active agent – surfactant, engl.

• Površinski aktivne supstance

• Javljaju se u velikom broju jedinjenja

• Sprječavaju nastanak pjene

• Služe kao:

– V/O i O/V emulgatori

– Povezivači

– Sredstva za pranje

3


Uvod - Tenzidi

• Posjeduju u svojoj hemijskoj strukturi lipofilne kao i

hidrofilne grupe

• Ako je raspored elektrona takav da izaziva jak električni

dipolni momenat, takve polarne grupe pokazuju afinitet ka

polarnim tekućinama, naročito ka vodi te odatle dolazi

njihov hidrofilni kakakter

• Lipofilne grupe imaju raspored elektrona takav da ne

doprinose dipolnom momentu te grade apolarni kraj

molekule, i iz tog razloga imaju afinitet prema organskim

rastvaračima

• Spojevi koji su slični i vodenim i uljnim fazama se

karakterišu kao ambifilni

4


Uvod - Tenzidi

• Tenzidi u vodi - pokazuju orjentaciju na površini:

– hidrofilni kraj ide u vodu

– lipofilni se u ovom slučaju okreće prema zraku.

– Ova adsorpcija na površinu izaziva efekat sniženja

površinske napetosti, i efekat je u početku najbolje

vidljiv

– Po dostignuću određene koncentracije tenzida (CMC)

pad se zaustavlja i tada počinje gradnja micela

5


Uvod - Tenzidi

• CMC – critical micelle concentration, engl.

• Definiše se kao koncentracija tenzida iznad koje se formiraju

micele i sva dodatna količina tenzida dodana u sistem prelazi

u micele

• Važna karakteristika svakog tenzida

• Nakon dostizanja CMC, površinska napetost ostaje relativno

konstantna (u odnosu na početak dodavanja tenzida)

6


Uvod - Tenzidi


• Vrijednost CMC je drugačija za svaki tenzid

• Vrijednost CMC za neki tenzid u datom medijumu ovisi o:

– temperaturi,

– pritisku i

– prisustvu odnosno koncentraciji drugih površinski aktivnih supstanci i

elektrolita

• Micele se formiraju samo IZNAD date temperature (critical

micelle temperature)

7


Uvod - Tenzidi


• Dodavanjem tenzida, oni smanjuju površinsku napetost

redajući se na površini i orjentišući lipofilni/hidrofilni dio

molekule

• Kada tenzid „okupira“ najveći dio kontaktne površine,

počinje formiranje micela

• Daljim dodatkom tenzida raste broj micela u sistemu

• Formiranje micela u sistemu ne isključuje pojavu monomera

tenzida u tečnosti!

8


Uvod - Tenzidi

• HLB vrijednost – (hydrophilic-lipophilic balance)

• nudi mogućnost da se tenzidi prema njihovim ambifilnim

osobinama označe i tako lakše nađu primjenu

• govori o hidrofilnom i lipofilnom balasu molekule

• niži HLB broj su lipofilne supstance

• veće HLB vrijednosti imaju supstance hidrofilnog karaktera

9


Uvod - Tenzidi


• Računa se kao HLB= 20 (Mh/M) (Griffin-ov metod)

(odnos molekularne mase hidrofilnog dijela prema molekularnoj

masi cijele molekule) ili

HLB= 20 (1-Mo/M)

(ako računamo preko udjela mase hidrofobnog dijela)

• Skala ide od 1-20 (tako npr . Tween® 20 ima HLB 16,7 -> hidrofilni dio

molekule iznosi 83,5%)

10


Uvod - Tenzidi


• HLB se koristi za neionogene tenzide mada i tu ima

odstupanja

• za ionogene tenzide se koriste eksperimentalne metode (npr.

Na-laurilsulfat pokazuje HLB 40, što znači da hidrofilni dio nosi

200% molekule što naravno nema logike, te se ovdje govori o

prividnoj HLB vrijednosti)

11


Uvod - Tenzidi


– < 10 : Lipid soluble (water insoluble)

– > 10 : Water soluble (lipid insoluble)

– 4 to 8: anti-foaming agent

– 7 to 11: W/O (water in oil) emulsifier

– 11 to 14: wetting agent

– 12 to 15: detergent

– 12 to 16: O/W (oil in water) emulsifier

– 16 to 20: solubiliser or hydrotrope

12


Uvod - Tenzidi


– < 10 : Lipid soluble (water insoluble)

– > 10 : Water soluble (lipid insoluble)

– 4 to 8: anti-foaming agent

– 7 to 11: W/O (water in oil) emulsifier

– 11 to 14: wetting agent

– 12 to 15: detergent

– 12 to 16: O/W (oil in water) emulsifier

– 16 to 20: solubiliser or hydrotrope

13


Uvod - Tenzidi

Podjela tenzida

• Ionogeni (anionaktivni tj. anionski i kationaktivni tj.

kationski)

• Neionogeni (neionski) tzv. niotenzidi

• Amfoterni tenzidi

• Praškasti emulgatori

• Kvaziemulgatori

14


Uvod - Tenzidi

Podjela tenzida

• Ionogeni:

• Anionaktivni emulgatori, disociraju u vodenom miljeu, a

odgovoran je anion:

– Sapuni i sapunasti oblici (alkalni sapuni, metalni sapuni, amino sapuni,

ester sumporne kiseline, soli zučnih kiselina, arapska guma)

• Kationaktivni su kvarterni amonium spojevi, kod kojih je

aktivan kation.

– Nazivaju se invertni sapuni ili kationski sapuni ali se ne koriste za

čišćenje, nego za dezinfekciju jer na pH 9 pokazuju jake dezinficirajuće

osobine

15


Uvod - Tenzidi

Podjela tenzida

• Neionogeni, neionski tenzidi, ne grade ione u vodenom

mediju, za razliku od ionogenih,

• Imaju prednosti u odnosu na ionogene te se u farmaciji sve

vise koriste

• Njihova aktivnost je prilično neovisna od temperature.

– Najstariji farmaceutski korišten je pčelinji vosak.

– Tu su još i više masne kiseline i sterinalkoholi, ester masne kiseline

polioksietilena, -makrogol glicerina, -saharoze, -poliglicerola te

polioksipropilen-polioksietilen blokpolimeri, blok-kopolimeri sa

hidrofobnom sredinom i hidrofilnim krajevima

16


Uvod - Tenzidi

Podjela tenzida

• Amfoterni emulgatori – amfolitički tenzidi, amfotenzidi, koji

pokazuju i katione i anione u molekuli, te pokazuju jedan ili

drugi karakter.

– Tu spadaju proteini (COOH i OH grupe, te NH2 i NH-grupe) žumanjka,

želatine, kazeina.

– Većinom su O/V emulgatori, nisu upotrebljivi u farmaciji, podliježu

kontaminaciji.

17


Uvod - Tenzidi

Podjela tenzida

• Mješoviti emulgatori – miješanjem 2 ista emulgatora njihovo

dejstvo se pojačava

• Netopivi emulgatori su čvrste, praškaste supstance koje

kuglice emulzije oblože praškom i na taj način sprječavaju da

se kuglice stope te tako stabiliziraju emulziju.

18


Uvod - Tenzidi

Korišteni tenzidi:

- Pluronic F68

- Tween 20

- Tween 80

19


Uvod - Tenzidi

Korišteni tenzidi: Pluronic F68

• Poloxameri (pluronici, synperonici, koliphori)

• Triblok kopolimeri

• Dva hidrofilna lanca polioksietilena na krajevima i u sredini

hidrofobni poliokipropilen

• Variranjem dužine lanca hidrofilnih dijelova, mijenja se

molekularna masa a time djelimično i njihove osobine

20


Uvod - Tenzidi

Korišteni tenzidi: Pluronic F68

• Poloxameri – generički naziv daje slovo P imenu

• Uz “P” idu i tri broja

• Prve dvije znamenke x100 daju prosječnu molekularnu masu

polioksipropilena

• Treća znamenka x10 daje procentualni udio polioksietilena

• Npr: P407

• Uz Pluronic i Synperonic kodiranje ide prvo sa slovom (F-

čvrsto, L – tečno, P – pasta) i uz dva ili tri broja: prvi (ili prva

dva ako se radi o tri broja) x300 daju prosječnu masu i zadnji

x10 daje udio polioksietilena

• Npr: L61

21


Uvod - Tenzidi

Korišteni tenzidi: Pluronic F68 – upotreba

• radi amfifilne strukture – pogodni za industriju, kozmetiku i

lijekove

• Poboljšava mješivost dvije nemješive supstance

• Kod ispitivanja za drug delivery . Pokazalo se da

senzibiliziraju karcinome otporne na lijekove prema

kemoterapiji

• U medijima za uzgoj ćelija dovode do smanjenja sila

opterećenja što vodi manjem opterećenju integriteta stanica

22


Uvod - Tenzidi

Korišteni tenzidi: Pluronic F68 – biološki efekti

• Utvrđeno je da neki od pluronic-a nisu inertni nosači aktivne

supstance kako se to ranije smatralo

• Imaju efekat na biološke sisteme

• Ugrađuju se u ćelijske membrane i utiču na mikroviskoznost

• Veći efekat na ćelije pokazuju kao monomeri nego kao

micele

• Imaju veći afinitet prema karcinomskim ćelijama nego

prema zdravim

23


Uvod - Tenzidi

Korišteni tenzidi: Pluronic F68 – biološki efekti na

karcinomske ćelije

• Imaju veći afinitet prema karcinomskim ćelijama

• Imaju efekta na MDR protein (multi drug resistance) –

inhibiraju taj sistem

• Inhibiraju proizvodnju ATP

• I još dosta drugih efekata...

24


Uvod - Tenzidi

Korišteni tenzidi: Polysorbate 20

• Polisorbat 20 ili Tween 20 ili Alkest TW 20

• Relativno netoksičan

• HLB oko 16.7 (hidrofilno)

• Koristi se kao deterdžent u domaćinstvima, naučnim i

farmakološkim primjenama

• SZO je ograničila uzimanje polioksietilen-sorbitan-estera na

0-25mg/kg tjelesne mase

25


Uvod - Tenzidi

Korišteni tenzidi: Polysorbate 20 – upotreba u nauci

• Kao agens za pranje kod testova (ELISA, imunoeseji, itd.)

– sprječava nespecifično vezivanje

• Za zasićavanje vezivnih mjesta na površini

• Za stabiliziranje proteina

• Za liziranje ćelija sisara u koncentraciji 0,05 – 0,5% u

kombinaciji sa drugim deterdžentima, solima i aditivima

26


Uvod - Tenzidi


• Nejonski tenzid

• Viskoznost 425 mPa

• HLB 15

• pH 5% rastvora u vodi je 5-7

• CMC 1,2 x 10-5 mol/l u vodi pri 25ºC

27


Uvod - Tenzidi


• Koristi se u hrani kao emulgator (u EU odobren

kao E 433)

• Hemijski i biološki inertan

• U farmaciji se koristi za inaktiviranje virusa u

krvnim-preparatima

• Jedna od rijetkih površinski-aktivnih supstanci koja

je parenteralno podnošljiva

28


Nanočestice

• Paul Ehrlich (1854 – 1915) je prvi imao ideju „magičnog

zrna“ (engl. magic bullet) koje bi aktivnu supstancu nosilo

direkt do bolesnog tkiva

• Ovo je i danas motivacija naučnicima – pronaći ljekoviti

oblik koji bi aktivnu supstancu optimalno iskorištavao a

nus-pojave minimalizirao

• Problematika:

– Aktivnu supstancu dostaviti neoštećenu do mjesta djelovanja

– Aktivnu supstancu putem nosača ubaciti u ćeliju

– Kako „naciljati“ željeno tkivo

– Jednostavan razvoj nosača aktivne supstance

29


Nanosistemi

• Nanočestice

• Nanokapsule (nanosfere)

• Lipozomi

• Mikročestice

• Mikrosfere

30


Nanočestice

Nanosistemi

• Nanokapsule

• Nanočestice

• Ponašaju se kao jedinstvena tijela s obzirom na

transport i njihove osobine

• Klasifikacija prema veličini

– Fine čestice 100 – 2500 nm

– Ultrafine čestice (UFP) ili nanočestice 1 – 100 nm u prečniku

31


Nanočestice

• Nanočestice mogu ali ne moraju da pokažu osobine koje su

povezane sa njihovom veličinom

• Osobine su drastično drugačije od onih kod finih čestica ili

samog materijala od kojeg su napravljene

• Dosta molekula bi veličinom odgovarale veličini

nanočestica ali se individualne molekule ne nazivaju

nanočesticama

• Istraživanja nanočestica su intenzivna trenutno radi velikog

potencijala u njihovoj upotrebi (biomedicina, optičko i

električno polje interesa)

32


Nanočestice

• Sami materijal ima konstantne fizičke osobine, neovisno o

njegovoj veličini

• Na nano-skali se ove osobine znatno mijenjaju ovisno o

veličini čestica

• Smanjenjem veličine čestica površina materijala se znatno

povećava i postaje dominantna „veličina“ koja upravlja

osobinama

• Nanočestic eimaju interesantne optičke osobine (npr one

od zlata dobiju tamno crvenu boju koja ide i do crne, tope

se na znatno nižoj temp od polaznog materijala, itd)

33


Nanočestice

• Suspenzije nanočestica su moguće jer one interagiraju sa

rastvaračem, i na taj način prevazilaze razlike u gustoći što

bi dovelo do tonjenja ili plutanja čestica

• Njihova veličina diriguje njihovu snažnu difuziju naročito

kod pojačanih temperatura

• Zn-oxid ima puno jaču mogućnost blokiranja UV zraka

nego sam taj materijal u komadu – zato se često koristi u

pripremi losiona za sunčanje

34


Nanočestice

• Metode izrade

• Najčešća je sol-gel

• Polimeru otopljenom u organskom rastvaraču se doda mala

količina hidrofilnog rastvora „aktivne supstance“ i

ultrazvukom rasprši

• To se doda u veću količinu hidrofilne tekućine koja sadrži

• Ultrazvukom (ili drugom metodom) se polimer rasprši na

sitne kapljice koje unutar sebe sadrže aktivnu supstancu

• Podešavanjem parametara se utiče na veličinu čestica

35


Nanočestice

• Termin „koloid“ se prvenstveno koristi da opiše

široki raspon mješavina čvrsto-tečno (i/ili tečno-

tečno)

• Koloidi sadrže sitne čvrste (i/ili tečne) čestice

raspršene u tečnom medijumu

• Termin je specifičan za veličinu individualnih

čestica koje su veće od atomskih veličina ali

dovoljno male da pokazuju Brown-ovo kretanje

• Ukoliko su veće tada se vode sedimentacijom i

gravitacijom

• Nanočestice, nanotubes, nanokristali, itd.

36


Nanočestice

• Pokrivanje površine čestica je krucijalno za

određivanje njihovih osobina

• Na taj način se može regulisati stabilnost, topivosti i

targeting nanočestica

• Tako se regulišu i biološke aplikacije nanočestica

• Mogu se funkcionalizirati za ciljane ćelije, za

izbjegavanje imunog sistema, itd...

37


Nanočestice

Karakterizacija nanočestica:

• Neophodna radi razumjevanja i kontrole sinteze i

aplikacije nanočestica

• Postoji širok spektar metoda:

– TEM, SEM electronic microscopy

– AFM atomic force microscopy

– DLS dynamic light scattering

– XPS x-ray photoelectron spectroscopy

– FTIR Fourier transform infrared spectroscopy

– NMR Nuclear magnetic resonance

38


Nanočestice


• DLS dynamic light scattering ili Quasi elastic light

scaterring

• Jedna od najpopularnijih metoda

• Može da mjeri do 1nm čestice

• Koristi se za emulzije, micele, polimere, proteine,

nanočestice ili koloide

• Osnovni princip: uzorak je obasjan laserskom

zrakom i fluktuacije osciliranja odbijene zrake se

mjere pod poznatim uglom brzim fotonskim

detektorom

39


Nanočestice


• DLS dynamic light scattering ili Quasi elastic light

scaterring

40


Ćelijske kulture

• Ćelijska kultura je kompleksan proces gdje ćelije bivaju

uzgajane pod strogo utvrđenim uslovima van njihovog

prirodnog ambijenta (van organizma)

• Ćelijske kulture mogu porijeklom biti od životinja,

čovjeka, , biljaka, gljivica, virusa, mikroba, bakterija

• Istorijski razvoj i metode za uzgoj ćelijskih kultura su

vezane za one kulture tkiva i kulture organa

• Sredinom 1900-tih je životinjska ćelijska kultura postala

uobičajena tehnika

• Izolacija ćelija se radi iz tkiva ex vivo

• Uzgajaju se u medijumu za uzgoj ili medijumu za rast

kultura

41


Ćelijske kulture

• Imortaliztirane ćelijske kulture imaju sposobnost samostalnog

neograničenog rasta

• Tu osobinu ili posjeduju ili se učine potrebne modifikacije ćelija da bi

postale takve

• Ćelije se uzgajaju u inkubatorimana 37C sa određenim sadržajem zraka

(5% CO2)

• Uslovi variraju ovisno o ćelijskom tipu

• Sastav medijuma za rast varira kao i pH, sadržaj glukoze, faktora rasta i

prisustva drugih nutrijenata

• Faktori rasta se uzimaju iz seruma životinjske krvi najčešće (npr FBS

fetal bovine serum)

• Komplikacija uzgoja je potencijalna kontaminacija kulture sa virusima ili

prionima ili gljivicama

• Manipulisanje se radi na sterilnim stolovima sa laminarnim protokom

zraka

42


Ćelijske kulture

• Monolayeri – adherentne kulture

• Ćelijske kulture u suspenziji (mogu doseći veću gustoću od

adherentnih linija)

• Tripsinizacija

• Diferencijacija ćelija

• Izmjena medija (pH promjena, boja kao indikator)

• Posude za uzgoj (microcarrier ili flask)

• Gustoća za uzgoj (broj ćelija po ml medijuma)

• Pasažiranje ćelija

43


Ćelijske kulture

Pasažiranje ćelija

• Poznato kao dijeljenje ili subkultivisanje ćelija

• Prenos malog broja ćelija u novi flask – nova ćelijska kultura

• Prethodi mu ili tripsiniranje ili struganje ćelija sa površine ili

kod suspenzije je samo uzimanje određene zapremine

44


Documents

Tenzidi i njihov utjecaj na - Univerzitet u Tuzli Tenzidi i njihov utjecaj na interakciju nanočestica i ćelija Dr.sci.ph. Vera Kerleta-Tuzović, doc. Kolegij: Farmaceutska tehnologija