Tekniker, metoder och PEG

i

Nefelometrisk/turbidimetriska

analyser

Anders Larsson

KKF, Uppsala

2011

Turbidimetri

2011

Prov

Nefelometri

2011

Prov

Nefelometri/turbidimetri

2011

Prov

Prov

Prov

Prov

Nefelometri/turbidimetri

Små mängder antigen

2011

Prov Prov

Nefelometri/turbidimetri

Antigensöverskott

2011

Prov

Prov

Heidelberger-Kendall

Precipitering av komplex i lösning

(1-3 dygn, 37oC och 4oC)

2011

Mängd antigen

Grumlighet

Antigenet och antikroppens ursprung

påverkar kurvans form

2011

Mängd antigen

Grumlighet

Komplementaktivering påverkar

precipitatstorleken

2011

Mängd antigen

Grumlighet

Interferens av anti-IgG i provet

Orsaker:

RF

HAMA

Andra anti-IgG

Troligen mindre problem i nefelometri

än i t.ex. Sandwich immunoassays

2011

Tillsats av polymerer för att snabba på och

förstärka reaktionen (Hyaluronsyra,

dextran, Polyetylenglykol (PEG), etanol,

ammoniumsulfat)

2011

PEG

Fäller ”selektivt” immunkomplex i

intervallet <4% PEG 6000 om vi använder

fria antikroppar

Ju lägre PEG konc ju större komplex krävs

och ju tidigare når vi antigen excess

Inert

Billig

Atoxiskt

Ej brandfarligt

Ej temp beroende

Går göra koncentrerade PEG lösningar

Rening av antikroppar

Precipitation

Etanol (gammaglobulin)

40% amsulfat

12%PEG 6000

Jonbyteskromatografi

Affinitetskromatografi

T.ex. Protein A, G, L, T-gel

Varierande linjaritet inom

mätområdet

Kurvanpassningsproblem!

2011

Mängd antigen

Grumlighet

Mätområde

Varierande linjaritet inom

mätområdet

Kurvanpassningsproblem!

Hur kan vi kontrollera att vi inte råkar ut

för antigen excess?

Flesta proteiner har så liten

koncentrationsvariation att det inte är

något problem.

Exempel på problemanalyser

U-albumin

IgG, IgA, IgM

lätta kedjor

Mängd antigen

Grumlighet

Antigen excess kontroll 1

Tillsats av antigen

2011

Absorbans

700 nm

700 nm

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1 6 11 16 21 26 31

Point

Ab

s

CYSTC 0,81 mg/L CYSTC 3,02 mg/L CYSTC 6,98 mg/L

Antigen excess kontroll 2

Initiala absorbansförändringen

Sammanfattning PEG och vanliga

nefelometriska metoder

Vill vi ha snabba svar krävs någon form av

polymer när vi använder fria antikroppar

Oftast används PEG 6000 (numera 8000)

PEG skall helst inte fälla fritt IgG vilket

gör att PEG konc oftast är 3-4% i

reaktionsblandningen

Vad gäller för

partikelförstärkta metoder?

Teoretiskt bör PEG konc vara

lägre än de 3-4 % som används

för fria antikroppar

Ingen selektivitet med 4%PEG

Prov

Prov

2011

Partikelbaserade tester

Partiklarna bör vara små

Mindre diffusionsavstånd

Snabbare reaktion

Partikelbaserade tester

har ett bra antigen excess skydd

Tveksamt om PEG tillför något för antigen

excess

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

cystatin C concentration (mg/L)

delt

a a

bso

rban

ce

Kalibreringskurvor, Architect

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00

lot 1006401

220/45/3 kal 8,30

spädd med fys

buffert sp 25%

med PEG-fri buffert

lot 1006401

220/45/3 kal 8,30

spädd med fys

PEG-fri buffert

Partikelbaserade tester

PEG påverkar kurvformen

Tusen tack för uppmärksamheten

Anders Larsson

KKF, Uppsala

2011

Prov

Prov