Tehnike Izolacije i Prociscavanja Proteina (PMFST)

Embed Size (px)

DESCRIPTION

prezentacija

Citation preview

  • 1Sveuilite u SplituPrirodoslovno-matematiki fakultet

    Odjel za kemiju

    prof. dr. sc. Maja Pavela-Vrani

    Preparativne i analitike metode Metode koje se temelje na razliitoj topljivosti Kromatografske metode Elektroforeza Ultracentrifugiranje

    Spektrometrija masa

    2

    Spektrometrija masa MALDI-MS (Mass Assisted Laser Desorption/Ionisation) ESI-MS (Electrospray Ionisation)

    Metode za odreivanje trodimenzionalne strukture proteina Rendgenska strukturna analiza NMR (Nuklearna Magnetska Rezonancija)

  • 2Izvor proteina:tkivo ili stanine kulture (Escherichia coli, kvasac)

    3

    sterilna klupa (laminar)

    Rad sa staninim kulturama u sterilnim uvjetima

    Uzgoj staninih kulturau hranjivom tekuem mediju

    Termostatirana tresilica Fermentor ili bioreaktor

    4pri stalnoj temperaturi

    ,u kontroliranim uvjetima:

    temperatura, pH, protok kisika

  • 3Taloenje centrifugiranjemOdvajanje organela od tekueg medija pri poveanojgravitacijskoj sili

    poslije

    supernatanttalog

    rotor

    prije

    5

    rotacija

    Centrifugiranje u gradijentu gustoegradijentsaharoze uzorak

    utracentri-fuguranje

    6

    Razdvajanje sedimentacijom kroz gradijent guste tvari razdvajanjena osnovu plutanja uzrokovanog uzgonom (neovisno o veliini iobliku), do postizanja ravnotee gustoe estica i gustoe otopine

  • 4Priprava staninog ekstraktaRazbijanje stanica i centrifugiranje

    Enzimska razgradnjarazgradnja lizozimom (G+) permeabilizacija vanjske membrane (G-)

    Mehaniko razbijanjetrenjem u tarioniku ili mljevenjem u

    homogenizatoru

    lt k ( ik t )

    7

    ultrazvukom (sonikator)suspenzija stanica se uz hlaenjeviekratno izlae zvunim valovimavisoke frekvencije

    naglom promjenom tlakaprea po French-u

    IsoljavanjeOdvajanje proteina na temelju razlike u topljivosti

    Dodatkom zasiene otopineamonijeva sulfata slabe vodikoveveze izmeu proteina i vode:proteini se taloe

    Proteini se mogu odvojiti od Topl

    jivos

    t pro

    tein

    a

    isoljavanjeotapanje

    8

    Proteini se mogu odvojiti odsupernatanta centrifugiranjem

    T

    Koncentracija soli

    Nakon taloenja amonijevim sulfatom trebaukloniti viak iona

  • 5Odvajanje proteina od malih molekula (manje od 15 000 Da) i ionaDijaliza

    crijevo za dijalizu(polupropusna membrana)

    koncentriranaotopina

    9

    p

    pufer

    poetak dijalize ravnoteakraj dijalize

    Gel-filtracijaRazdvajanje na osnovu veliine estica

    porozna polimernazrnca (matriks)

    male molekulezadravaju se

    u porama zrnaca

    uzorakproteina

    Primjena proiavanje proteina odreivanje molekulske

    mase odsoljavanje

    10

    velike molekuleprolaze izmeu

    zrnaca

    smjer protoka

    proteina

    polimernigel

  • 6Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC)Ureaj za kromatografsko razdvajanje i proiavanje proteina

    11

    Kromatografija na ionskom izmjenjivauRazdvajanje proteina na osnovu razliitog naboja

    pufer niskeionske jakosti

    pufer visokeionske jakosti

    niska visokakonc. konc.soli soli

    ncen

    trac

    ija p

    rote

    ina

    smjesaproteina

    12

    frakcije

    broj frakcije, ilivolumen otapala

    Kon

  • 7Nepokretna (stacionarna) faza ionskog izmjenjivaa(matriks)

    Karboksimetil (CM) skupina

    Kationski izmjenjiva:negativno nabijena polimerna zrnca

    A i ki i j ji

    celulozaili

    agaroza

    pozitivno nabijeni proteiniveu se za negativno

    nabijena polimerna zrnca

    Kationski izmjenjiva

    13 Dietilaminoetil (DEAE) skupina

    celulozaili

    agaroza

    Anionski izmjenjiva:pozitivno nabijena polimerna zrnca

    Vezani protein ispire se (eluira)rastuom koncentracijom soli

    negativno nabijeniproteini prolaze

    Afinitetna kromatografijaRazdvajanje proteina na osnovu afiniteta prema specifinimkemijskim skupinama (ligandima)

    ciljni protein

    ligandligand vezanna matriks

    smjesaproteina Interakcije

    enzim-inhibitorhormon-receptorantitijelo-antigenprotein-ugljikohidratenzim-koenzimmetaloprotein-ion metala

    14

    krutinosa

    Protein se ispire s koloneistiskivanjem s visokomkoncentracijom liganda

    ciljni proteinvee se na

    ligand

  • 8Odreivanje koncentracije proteina po Bradfordu

    badarni pravac

    t iApso

    rban

    cija

    (595

    nm

    )na

    15 Rastua koncentracija proteinaspektrofotometrijsko odreivanje koncentracije proteinamjerenje apsorbancije kod 595 nmbadarni pravac: albumin goveeg seruma (BSA)

    mg proteinaA

    Aktivnost enzima

    spektrofotometrijskim mjerenjem promjene absorbancije UV ili vidljive svjetlosti u jedinici vremena

    fluorimetrijskim mjerenjem promjene fluorescencije u jedinici vremena

    UV/VIS spektrometar Fluorimetar

    16

  • 9Elektroforetske tehnikeRazdvajanje temeljem razliite pokretljivosti nabijenih estica u elektrinom polju

    Vrste nosaa za elektroforezu papir celuloza acetat

    k b i l

    papir

    pufer

    17

    krobni gel agarozni gel poliakrilamidni gel

    mjestonanoenja

    uzorka

    pozitivniioni

    negativniioni

    SDS-PAGESodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

    Koristi se najee u analitike svrheDikontinuirana denaturirajua elektroforeza

    18

  • 10

    Polimerizacija akrilamida

    akrilamid metilen-bisakrilamidpersulfat

    sulfatni radikal

    akrilamid monomerje kancerogen

    19

    (zapoinje polimerizaciju)

    poliakrilamidniporozni gel

    Vinilna polimerizacijamonomera akrilamida

    Unakrsno povezivanjedodatkom metilen-bisakrilamida

    Priprema uzorka proteina za SDS- PAGE

    merkaptoetanoldenaturira protein

    SDS SDS ( t ij d d il lf t)

    20

    SDS

    SDS se vee naprotein u omjeru1 SDS na 1,4aminokiseline

    svi proteini imaju isti omjernaboja i mase

    aminokiselina:SDS = 2:1

    SDS (natrijev dodecilsulfat) detergent

    [CH3(CH2)10CH2OSO3-]Na+

  • 11

    Razdvajanje proteina u poliakrilamidnom gelu(SDS - PAGE)

    smjer

    smjesamakro-molekula

    elektroforeza

    uzorak

    gel

    katodajaice pufer

    21

    jelektroforeze

    porozni gelanoda

    pufer

    Razdvajanje proteina na temelju molekulske mase

    Proteinske vrpce postaju vidljive bojanjem

    Bojanje bojomCoomassie brilliant blue

    Bojanje srebrom(vea osjetljivost)

    22

  • 12

    Odreivanje molekulske mase proteina s SDS-PAGEOdreivanje molekulske mase proteinapomuu SDS-PAGE

    apoferitin

    katalaza (tetramer)amilaza

    katalaza (dimer)

    lb i olek

    ulsk

    a m

    asa

    1,000,000

    100,000

    Mr66,200

    29,000

    23Marker

    poznate MrUzorak

    nepoznate Mr

    albumin goveeg seruma

    Retencijsko vrijeme (min)

    Mo

    10,00023 25 27 29 31

    14,300

    Praenje izolacije i proiavanja proteinapomou gel elektroforeze

    1. stanini ekstrakt2. isoljavanje3 kromatografija na ionskom

    24

    3. kromatografija na ionskomizmjenjivau

    4. gel filtracija5. afinitetna kromatografija

  • 13

    Dvodimenzionalna elektroforezaRazdvajanje proteina slinih svojstava

    smjer protoka otapala A

    razdvajanje uprisutnosti otapala B

    ishodite

    smjer

    25

    razdvajanjeuzastopnomprimjenom

    otapala A i B

    protokaotapala

    B

    razdvajanje uprisutnosti otapala A

    Izoelektrino fokusiranjeRazdvajanje proteina u gradijentu pH

    niski pH visoki pH

    26Protein se kree u gradijentu pH do toke

    u kojoj pH odgovara izoelektrinom pH proteina

    niski pH visoki pH

  • 14

    Western blotPrijenos razdvojenih vrpci proteina s gela na membranu i detekcija

    preslik nanitrocelulozi

    vezanjeprimarnogprotutijela

    vezanjeenzimski-vezanog

    sekundarnogprotutijela

    imunoblot

    27

    gel koji sadriprotein Enzimski kataliziranompretvorbom supstrata u

    obojeni produkt proteinskavrpca postaje vidljiva

    SDS-PAGE Western blot

    28

  • 15

    Aminokiselinski sastav proteina

    Elucijski profil proteinskog hidrolizata

    29

    Elucijski profil standardnih aminokiselina

    Elucijski volumen

    Edmanova odgradnjaOdreivanje slijeda aminokiselina u polipeptidnom lancu

    fenil-izotiocijanat

    obiljeavanje N-terminalneaminokiseline

    30

    odgradnja

    PTH-alanin

    peptid skraen za jednuaminokiselinu

  • 16

    HPLC (High pressure liquid chromatography)Razdvajanje aminokiselina, peptida i malih molekula pod visokim pritiskom

    31

    MALDI- MS(Mass Assisted Laser Desorption/Ionisation)

    ionizacijaproteinskog

    uzorka elektrinopoljeubrzava

    ione

    32

    Kristalizacija proteina s matricom kojaima maksimum apsorpcije na valnoj

    duljini laseramatriksproteinuzorak

    detektorcijev proleta

    laserska zraka

  • 17

    Nuklearna magnetska rezonancija (NMR)

    Kemijski pomak (ppm)

    nerg

    ija

    ener

    gija

    Prijelaz izmeuspinskih stanja

    daje liniju uNMR spektru

    Razlika uenergiji

    33 Kemijski pomak (ppm)

    Jakost magnetskog polja

    zraenje

    en

    Difrakcija rendgenskih zraka na kristalu proteina

    IzvorX-zraka

    X-zraka

    34

    Kristal

    Difrakcijska slika

  • 18

    Od difrakcijske slike do kristalne strukture

    35

    Difrakcijska slika Elektronska gustoa 3D struktura

    3D-struktura aktivnog mjesta

    36